本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及天然藥物降糖領(lǐng)域，尤其涉及抑制α-葡萄糖苷酶作用及促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收的化合物及用途。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合征，系因胰島素分泌不足或胰島素作用受損引起機(jī)體糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂，臨床以高血糖為主要標(biāo)志。其表現(xiàn)為血液及尿液中葡萄糖濃度異常升高，血糖、尿糖過高時(shí)可出現(xiàn)典型的三高一少癥狀。久病可引起多系統(tǒng)損害，病情嚴(yán)重或應(yīng)激時(shí)可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。由于α-葡萄糖苷酶抑制劑可與α-葡萄糖苷酶上的碳水化合物的結(jié)合點(diǎn)相結(jié)合，其親和力遠(yuǎn)大于酶的正常底物，因此，當(dāng)與膳食一起進(jìn)食后，α-葡萄糖苷酶抑制劑可與小腸上皮細(xì)胞刷緣處的寡糖相競爭，占據(jù)α-葡萄糖苷酶上寡糖結(jié)合位點(diǎn)，使寡糖吸收受阻，減少寡糖在小腸上部的消化，未被消化的碳水化合物被運(yùn)送至小腸中下段及結(jié)腸，導(dǎo)致碳水化合物的消化吸收發(fā)生在整個(gè)小腸中，延緩和延長了餐后葡萄糖的吸收，從而降低餐后血糖增高。目前已經(jīng)被批準(zhǔn)為臨床治糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要有3種：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，他們都是含氮的生物堿。它們通過減少餐后血糖濃度從而減少蛋白糖基化，延遲或阻止腎、視網(wǎng)膜神經(jīng)病變發(fā)生以及缺血性心肌病的發(fā)展。文獻(xiàn)報(bào)道主要α-葡萄糖苷酶抑制劑有多糖、生物堿、苷類、多肽、糖苷類、黃酮類、皂苷和酚類等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供丁香亭在制備降糖組合物中的用途，本發(fā)明提供丁香亭制備抑制α-葡萄糖苷酶的組合物中的用途。本發(fā)明提供丁香亭在制備抑制α-葡萄糖苷酶的降糖組合物中的用途。本發(fā)明提供丁香亭在制備抑制α-葡萄糖苷酶的降糖組合物中的用途，其用量范圍是1-625-200μM。本發(fā)明提供丁香亭制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收的組合物中的用途。本發(fā)明提供丁香亭在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收的降糖組合物中的用途。本發(fā)明提供丁香亭在制備促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收的降糖組合物中的用途，其用量范圍是1-20μM。本發(fā)明提供丁香亭在制備抑制和促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收的降糖組合物中的用途。本發(fā)明提供丁香亭在制備降糖組合物中的用途，其制藥劑型是：片劑、膠囊劑、注射劑、凍干注射劑。藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的化合物及其組合物對α-葡萄糖苷酶具有較強(qiáng)的抑制作用、促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收作用。其中α-葡萄糖苷酶可以是來源于人、酵母、大米、芽胞桿菌的α-葡萄糖苷酶。本發(fā)明提供的化合物及其組合物具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制作用和促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖吸收作用，具有避免現(xiàn)有降糖藥物不良反應(yīng)的潛力，為其應(yīng)用提供了新的途徑。試驗(yàn)例1丁香亭的α-葡萄糖苷酶活性測試4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitropHenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG)是麥芽糖類似物。以pNPG為底物測定中草藥提取物或降糖活性成分對α-葡萄糖苷酶抑制活性大小，從中草藥中篩選強(qiáng)活性降糖活性因子是目前最常用、最經(jīng)典的篩選方法。α-葡萄糖苷酶加入酶反應(yīng)底物(pNPG)后，底物被酶催化分解為對硝基苯酚(PNP)和葡萄糖，PNP是一種有色物質(zhì)，在400nm左右有最大吸收，可以用酶標(biāo)儀測定。由于產(chǎn)物的量與樣品中被測物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺測得不同的OD值，由此得出樣品的抑制活性。通過對不同濃度抑制劑和相應(yīng)抑制率作回歸方程，可得半數(shù)抑制濃度(IC50)。試劑與耗材：α-葡萄糖苷酶(美國Sigma公司)、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(美國Sigma公司)、DMSO(美國Sigma公司)、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O(江蘇南京化學(xué)試劑有限公司)、96孔板(美國Coming公司)儀器：BioTek多功能酶標(biāo)儀、KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器、SPX智能型生化培養(yǎng)箱、Thermo十二通道移液器緩沖液配制：磷酸鹽緩沖液(PBS)取NaH2PO4·2H2O3.978g，Na2HPO4·12H2O8.771g，用1000ml蒸餾水定容，即得pH＝6.8，0.1mol/L磷酸緩沖液(PBS)。用酶標(biāo)儀進(jìn)行凝血酶抑制活性測試的一般步驟如下：于96孔板中依次加入50μL 磷酸鹽緩沖液(0.05mol/L)，40μLα-葡萄糖苷酶溶液(3.0U/ml)和10μL不同濃度的樣品溶液，在37℃條件下孵育半小時(shí)。然后加入100μLpNPG溶液(1.0mM)，再次反應(yīng)半小時(shí)后再405nm下測定反應(yīng)混合物隨時(shí)間變化的吸光度值。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，IC50值取其平均值。取阿卡波糖做為陽性對照。α-葡萄糖苷酶可以是來源于人、酵母、大米、芽胞桿菌的α-葡萄糖苷酶。抑制率(％)＝(Acontrol-Asample)/Acontrol×100本實(shí)驗(yàn)采取阿卡波糖為陽性對照，測得IC50值為93.91μM，如表1所示，2009年，LiYQ等用pNPG為底物體外篩選α-葡萄糖苷酶活性，測得阿卡波糖抑制率為91μM，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相近(LiYQetal，JAgricFoodChem.2009；57(24)：11463-8.)，證明測試體系可靠。表1：阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用濃度(μM)抑制率(％)SD6.256.5045053.56252412.514.990994.0727831.2526.031191.22119462.543.964362.12326212558.462961.06695825068.934520.42465250079.509931.831187100086.231130.92715本實(shí)驗(yàn)稱取丁香亭粉末溶于二甲基亞砜中，制成200mM的母液貯存，使用時(shí)稀釋1000倍，至終濃度為200μM，再依次稀釋至終濃度100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.125μM、1.625μM，測定α-葡萄糖苷酶抑制率。表2：丁香亭對α-葡萄糖苷酶的抑制作用濃度(μM)抑制率(％)SD1.6255.2924343.287353.1251.905930.8448756.255.7832312.20057612.58.3680981.1941622525.546012.4696435068.049084.02404110096.865033.92023720098.328082.320103數(shù)據(jù)處理使用GrapHPadPrism6.02軟件。丁香亭對α-葡萄糖苷酶的抑制曲線見圖1，IC50為36.81μM。附圖說明圖1：丁香亭的IC50曲線圖。圖2：丁香亭能促進(jìn)正常脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收利用圖1的坐標(biāo)的具體解釋圖1的橫坐標(biāo)的中文含義：丁香亭的濃度(μM)的對數(shù)值圖1的縱坐標(biāo)的中文含義：丁香亭的抑制百分?jǐn)?shù)，單位(％)圖2的坐標(biāo)的具體解釋圖2的橫坐標(biāo)的中文含義：給藥濃度(μM)圖2的縱坐標(biāo)的中文含義：葡萄糖的吸收量(mM)試驗(yàn)例2脂肪組織、肝臟、骨骼肌是利用葡萄糖的主要組織，脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收利用可有效降低血液中的葡萄糖，脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力是衡量藥物降糖作用的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)以二甲雙胍作為陽性藥，驗(yàn)證丁香亭能促進(jìn)正常脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收利用。試劑與耗材：二甲雙胍、HEPES、地塞米松、胰島素(美國Sigma公司)、牛血清白蛋白(BSA)(美國羅氏制藥有限公司)DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、葡萄糖、NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4·7H2O(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。儀器：thermo二氧化碳培養(yǎng)箱、BioTek多功能酶標(biāo)儀、SPX智能型生化培養(yǎng)箱緩沖液配制：KRHB緩沖液：Krebs-RingerpHospHate-HEPESbuffer：NaCl118mmol/L，KCl5mmol/L，CaCl21.3mmol/L，KH2PO41.2mmol/L，MgSO4·7H2O1.2mmol/L，HEPES30mmol/Land0.5％BSA，pH7.4。細(xì)胞株3T3-L1，前脂肪細(xì)胞，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。3T3-L1細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代1.培養(yǎng)條件：3T3-L1前脂肪細(xì)用含10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基復(fù)蘇傳代后，接種于75mL培養(yǎng)瓶，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。2.更換培養(yǎng)基：每1-2天以肉眼和倒置顯微鏡觀察脂肪細(xì)胞及培養(yǎng)基，若有特征性變化，例如pH降低，培養(yǎng)基顏色發(fā)生明顯改變，則要更換新鮮的培養(yǎng)基，再將脂肪細(xì)胞重新放入溫箱中培養(yǎng)。3.細(xì)胞傳代：接種后3-5天后，細(xì)胞單層密集生長至80％-90％融合時(shí)，用0.25％的胰蛋白酶消化至胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，立即倒胰酶，加入2mL的10％FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕柔的吹散并收集懸浮細(xì)胞，離心、重懸、計(jì)數(shù)、均勻的接種于新培養(yǎng)瓶中。3T3-L1細(xì)胞的凍存、復(fù)蘇1.細(xì)胞凍存：選用生長良好的脂肪細(xì)胞，致密度為80％-90％時(shí)凍存，在凍存前一天要更換新鮮的含10％FBS的高糖DMEM。用0.25％的胰蛋白酶把脂肪細(xì)胞消化并收集于離心管中，按濃度加入配制好的凍存液(DMEM∶FBS∶DMSO＝6∶3∶1)重懸，均勻分裝入無菌凍存管中，于-70℃中凍存。2.細(xì)胞復(fù)蘇：將凍存管從-70℃低溫冰箱中取出來，迅速投入37-38℃水浴中，輕搖使其在1min內(nèi)快速融化。然后加入10倍體積的10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基與之混合稀釋，低速離心收集懸浮細(xì)胞。加入適當(dāng)體積的用培養(yǎng)基稀釋，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。3T3-L1細(xì)胞的分化細(xì)胞分化：在3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長至細(xì)胞融合時(shí)，將10％FBS的高糖DMEM換成分化液(含0.5μM的IBMX，1M地塞米松，10μg/mL胰島素，10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)2d，更換新鮮分化液(含10μg/mL胰島素)再分化2d，隨后以含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2d更換一次培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化 8～12天后，待3T3-L1細(xì)胞呈成熟脂肪細(xì)胞表形即可用于試驗(yàn)。丁香亭對生理狀態(tài)下脂肪細(xì)胞糖消耗的影響選用生長狀態(tài)良好且分化好的脂肪細(xì)胞，以2×105cell/孔接種于48孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至80％-90％融合時(shí)，換用不含糖的KRHB液培養(yǎng)4h，使細(xì)胞同步化。PBS輕洗兩遍后，每孔加入200μLKRHB。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白組，丁香亭組(0.1、1、10、20μM)和Metformin(1mM)溫育30min后，加入葡萄糖(終濃度為11mM)于37℃繼續(xù)孵育4h。孵育4h后，用葡萄糖測定試劑盒測定加入葡萄糖4h后細(xì)胞上清液中剩余葡萄糖的含量，通過計(jì)算葡萄糖濃度差值即為脂肪細(xì)胞對葡萄糖的消耗量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GrapHPadPrism-6.02統(tǒng)計(jì)軟件(GrapHPadSoftware，USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和圖表處理。假手術(shù)與模型兩組均數(shù)比較采用雙尾t檢驗(yàn)，其余各組兩均數(shù)間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，以Dunnett’spost-hot檢驗(yàn)進(jìn)一步檢測組間顯著性差異。以P＜0.05作為具有顯著性差異，P＜0.001為具有非常顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收利用可有效降低血液中的葡萄糖，脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收能力是衡量藥物降糖作用的重要指標(biāo)。由圖2及表3可知，陽性藥二甲雙胍可顯著促進(jìn)脂肪細(xì)胞的葡萄糖吸收(P＜0.001)，說明模型穩(wěn)定可靠。由圖2和表3可知，丁香亭在1μM、10μM、20μM時(shí)可劑量依耐性地促進(jìn)脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收，與空白對照組比具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.001)。說明丁香亭在1-20μM時(shí)能促進(jìn)脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收，有很好的降糖作用。表3：丁香亭促進(jìn)脂肪細(xì)胞對葡萄糖的吸收具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種含有丁香亭的溶液：丁香亭2.0g，亞硫酸鈉4.0g，聚維酮10.0g，乙醇50ml，加水定容只1000mL；制備工藝：將丁香亭分散在乙醇中，亞硫酸鈉溶于水中，在超聲或攪拌條件下將拿硫酸鈉溶液逐漸加入丁香亭中，使成澄清透明溶液；加聚維酮，攪拌使溶劑，補(bǔ)加水定容至足量；經(jīng)0.22μM微孔濾膜過濾，分裝封口。實(shí)施例2一種含有丁香亭的溶液：丁香亭1.0g，煙酰胺2.0g，乙醇200ml，加水定容至1000ml；制備工藝：將丁香亭和煙酰胺溶于乙醇中，在超聲或攪拌下逐漸加入注射用水混勻使成澄清透明溶液；經(jīng)0.22μM微孔濾膜過濾，分裝封口。實(shí)施例3一種含有丁香亭的凍干粉：丁香亭2.0g，亞硫酸鈉4.0g，聚維酮10.0g，乙醇50ml，加水定容只1000mL；制備工藝：將丁香亭分散在乙醇中，亞硫酸鈉溶于水中，在超聲或攪拌條件下將拿硫酸鈉溶液逐漸加入丁香亭中，使成澄清透明溶液；加聚維酮，攪拌使溶劑，補(bǔ)加水定容至足量；經(jīng)0.22μM微孔濾膜過濾，冷凍干燥得到。實(shí)施例4一種含有丁香亭的凍干粉：丁香亭1.0g，煙酰胺2.0g，乙醇200ml，加水定容至1000ml；制備工藝：將丁香亭和煙酰胺溶于乙醇中，在超聲或攪拌下逐漸加入注射用水混勻使成澄清透明溶液；經(jīng)0.22μM微孔濾膜過濾，冷凍干燥得到。實(shí)施例5一種含有丁香亭的片劑：丁香亭20mg，淀粉88g，硬脂酸鎂3g；制備工藝：取丁香亭，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，壓片，即得。實(shí)施例6一種含有丁香亭的膠囊：丁香亭20mg，淀粉88g，硬脂酸鎂2g；制備工藝：取丁香亭，加淀粉、硬脂酸鎂混合均勻，制成顆粒，干燥，裝膠囊，即得。實(shí)施例7：一種含有丁香亭的軟膠囊：丁香亭20mg，大豆卵磷脂100g；制備工藝：取丁香亭，加大豆軟磷脂，膠體磨混勻，抽真空，壓制，即得軟膠囊。除上述實(shí)施外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3