本發(fā)明涉及一種制備凍干人凝血酶的方法，具體地說，涉及一種含三步病毒滅活步驟的凍干人凝血酶的制備方法。
背景技術(shù)：
人凝血酶(human thrombin)是一種絲氨酸蛋白酶，分子量37KD，由1條3kD的輕鏈和另1條31kD的重鏈通過二硫鍵連接而成。其主要功能是將可溶性的纖維蛋白原水解成不溶性的纖維蛋白并通過激活凝血因子F.XIII使纖維蛋白交聯(lián)形成網(wǎng)狀從而起到止血的作用。
凝血酶(thrombin)可不經(jīng)過血液凝固的前期階段而直接使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白,使血液快速凝固、填塞出血點而達到止血目的。其可適用于各種原因引起的出血癥狀，如消化道、氣管、各種手術(shù)出血等。因此，隨著該藥臨床使用日漸廣泛，凝血酶的生產(chǎn)技術(shù)倍受關(guān)注。
國內(nèi)現(xiàn)有制備凍干人凝血酶的方法，其主要步驟是，以Cohn組分Ⅲ為原料，①經(jīng)PEG沉淀去除大部分雜蛋白，②S/D病毒滅活，③經(jīng)DEAE-Sephadex A-50樹脂吸附，到人凝血酶原，④超濾濃縮，⑤CaC12激活，及⑥人凝血酶經(jīng)SP-Sepharose FF柱層析純化及凍干得到目標物。
由上述技術(shù)方案可知，現(xiàn)有技術(shù)中實施了兩次純化步驟(即采用了兩次樹脂層析)，導(dǎo)致目標物(人凝血酶)的收率偏低(約為60萬IU/噸血漿)。此外，采用現(xiàn)有技術(shù)制得的凍干人凝血酶復(fù)溶后有混濁現(xiàn)象。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于，提供一種具有高收率及高品質(zhì)的凍干人凝血酶的制備方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足。
本發(fā)明所述的制備凍干人凝血酶的方法，包括如下步驟：
(1)以Cohn組分Ⅲ為原料，經(jīng)等電點沉淀法制得人凝血酶原的步驟；
(2)采用氯化鈣(CaCl2)激活由步驟(1)所制得的人凝血酶原，得到人凝血酶粗品的步驟；
(3)由人凝血酶粗品依次經(jīng)S/D病毒滅活及層析純化，得到“精制的人凝血酶”的步驟；
(4)由“精制的人凝血酶”依次經(jīng)超濾濃縮、添加穩(wěn)定劑、納米膜除病毒過濾、除菌過 濾、凍干和干熱步驟得到目標物(凍干人凝血酶)的步驟。
具體實施方式
在本發(fā)明一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述的步驟(1)具體包括如下步驟：
將1份Fr.Ⅲ沉淀(從低溫乙醇法血漿級分得到)，投入到7份～15份(更優(yōu)選8份～12份)的乙酸-乙酸鈉(HAc-NaAc)的緩沖液(pH值為5.00～5.50)中，在5℃～30℃條件下，攪拌2～4小時，得懸浮液；
在上述懸浮液中加入硅藻土，再攪拌30分鐘～60分鐘，在5℃～30℃條件下，壓濾(壓濾機進口壓力控制不大于0.15MPa)，收集的沉淀物即凝血酶原(棄去濾液)。
在本發(fā)明另一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述的步驟(2)具體包括如下步驟：
將1份由步驟(1)得到的沉淀物(凝血酶原)，投入到2份～6份的Tris-HCl緩沖液中(pH值為6.50～7.50)中，在5℃～30℃條件下，攪拌1-3小時，再加入0.5M的CaCl2水溶液，在10℃～30℃下，攪拌保溫4小時～10小時，得到人凝血酶粗品。
在本發(fā)明又一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(3)中所述的S/D病毒滅活，其主要步驟是：
在人凝血酶粗品中加入磷酸三丁酯(TNBP)，至0.3wt％，再加入Tween80至1wt％，在24℃～26℃下攪拌6小時。
在本發(fā)明又一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(3)中所述的純化，其主要步驟是：將經(jīng)S/D病毒滅活處理后的人凝血酶粗品與SP-Sephadex C-50陽離子交換樹脂(預(yù)先平衡好)混合，攪拌0.5小時～3.0小時(更優(yōu)選的攪拌時間為1小時～2小時)，過濾，收集樹脂；
用含0.10M～0.20M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(pH值為6.50-7.50)洗滌上述樹脂(去除雜蛋白)；再用含0.4M～1.0M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(pH值為6.50-7.50)洗脫上述樹脂，收集洗脫液并澄清過濾，得到“精制的人凝血酶”。
在本發(fā)明又一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(4)中所述的超濾濃縮及添加穩(wěn)定劑，其主要步驟是：采用3K～10K分子量超濾膜對“精制的人凝血酶”進行超濾，透析，并濃縮至合適的活力單位的人凝血酶溶液。并在該人凝血酶溶液中加入甘氨酸至1wt％～5wt％。
在本發(fā)明又一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(4)中所述的納米膜除病毒過濾，其主要步驟是：采用0.10μm的濾芯、并串聯(lián)DV20除病毒濾芯對經(jīng)超濾濃縮的“精制的人凝血酶”進行過濾。
在本發(fā)明又一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(4)中所述的除菌過濾，其主要步驟是：采用0.22μm的濾芯對經(jīng)超濾濃縮和納米膜除病毒過濾的“精制的人凝血酶”進行過濾。
在本發(fā)明又一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(4)中所述的凍干，其條件是：預(yù)凍及凍結(jié)時 間為4小時～8小時，升華干燥的時間為14小時～24小時，解析干燥時間為14小時～24小時，制品最高溫度為30℃。
在本發(fā)明又一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟(4)中所述的干熱，其主要步驟是：將經(jīng)超濾濃縮、納米膜除病毒過濾、除菌過濾和凍干工藝制得的“精制的人凝血酶”凍干粉在100℃水浴中加熱30分鐘(病毒滅活處理)。
由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明較現(xiàn)有技術(shù)而言，具有如下特點：
(1)用血制品生產(chǎn)中經(jīng)典的等電點沉淀法制備凝血酶原，工藝穩(wěn)定，操作簡單，成本低；
(2)用單純氯化鈣激活凝血酶原，避免引入動物源或人體組織器官制成的激酶，免除了產(chǎn)品受異源蛋白污染的風險；
(3)在激活過程中，懸浮液中加入的硅藻土，其多孔性所含的巨大比表面給激活反應(yīng)提供了大量的活化中心，使得激活過程快速、均勻；
(4)用壓濾法取代離心法,進行凝血酶原及凝血酶的收集,減少了蛋白剪切變性,有助于蛋白制劑的穩(wěn)定；
(5)用一步陽離子樹脂吸附純化凝血酶，處理周期短，蛋白變性少，有利于改善凍干粉復(fù)溶后的形態(tài)；
(6)用3K～10K分子量超濾膜透析濃縮凝血酶溶液，蛋白損失小，得率高；
(7)用三步病毒滅除方式保證了脂包膜病毒、非脂包膜病毒及細小病毒被徹底滅活或去除，保證了產(chǎn)品臨床使用的安全性；
(8)凍干粉復(fù)溶后澄清透明，幾無乳光，比現(xiàn)在市面上使用的乳光嚴重甚至混濁的凝血酶外觀有很大的改善。
(9)產(chǎn)品的收率可達500萬IU/噸血漿，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)。
下面通過實施例對本發(fā)明做進一步闡述，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容。因此，所舉之列并不限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1
步驟1，按稀釋比1：9，將Fr.Ⅲ沉淀1.0kg投入到9kg的HAc-NaAc緩沖液中(pH值為5.00，10℃)，勻速攪拌4小時，使其充分溶解，然后加入硅藻土攪拌30分鐘，后在同樣的溫度下壓濾，獲得凝血酶原沉淀約0.81kg。
步驟2，按稀釋比1：4，將0.81kg凝血酶原沉淀投入到3.24kg Tris-HCL緩沖液中(pH值為6.50，10℃)中，溫和攪拌4小時，使其充分溶解，得到均勻懸浮液；
步驟3，在上述懸浮液中加入0.5M的CaCL2溶液，在15℃下，保溫10小時，使凝血酶 原激活為凝血酶；
步驟4，以上激活后懸浮液中加入PEG溶液，攪拌1小時，后壓濾，收集上清液，然后用0.45μm濾芯進行澄清過濾，收集濾液5.2kg；
步驟5，濾液中加TNBP至0.3％,加入Tween80至1％，在24-26℃下攪拌6小時；
步驟6，在S/D滅活后溶液中加入預(yù)平衡好的SP-Sephadex C-50離子交換樹脂，緩慢攪拌2小時，然后用篩網(wǎng)過濾，收集樹脂；然后用含0.20M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液進行洗滌；再用含0.6M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集洗脫液1.4kg；
步驟7，用0.45μm濾芯進行澄清過濾，收集濾液1.36kg；
步驟8，將以上濾液接入5K分子量膜包超濾系統(tǒng)，預(yù)濃縮至約250g，用1.0kg注射用水透析，轉(zhuǎn)移并后洗超濾膜，得到凝血酶濃縮液275g，測得凝血酶活力712IU/ml；
步驟9，以上凝血酶濃縮液加入注射用水80克，然后加入甘氨酸7克作為穩(wěn)定劑，調(diào)PH6.95；得到362g凝血酶溶液，測得凝血酶活力為519IU/ml
步驟10，先用0.1μm濾芯過濾再用DV20濾膜進行除病毒過濾；得到332g濾液；
步驟11，用0.22μm的濾芯進行除菌過濾，按每瓶2.10-2.20克的裝量,分裝143瓶；
步驟12，凍干，預(yù)凍及凍結(jié)時間約4小時，升華干燥階段約20小時，解析干燥時間約14小時，制品最高溫度30℃，共計40小時，后停機，壓塞，出箱；
步驟13，將凍干粉制品放在水槽中加溫至沸騰(約100℃)，然后在沸騰狀態(tài)下保持30分鐘，后快速降溫至約30℃，取出，完成干熱病毒滅活過程。
所得產(chǎn)品的性質(zhì)及收率見表1.
實施例2
步驟1，按稀釋比1：9，將Fr.Ⅲ沉淀7.1kg投入到63.9kg HAc-NaAc緩沖液中(pH值為5.00，10℃)，勻速攪拌4小時，使其充分溶解；加入硅藻土攪拌30分鐘,然后在同樣的溫度下壓濾獲得凝血酶原沉淀約6.2kg。
步驟2，按稀釋比1：4，將6.2kg凝血酶原沉淀投入到24.8kg Tris-HCL緩沖液中(pH值為6.50，10℃)中，溫和攪拌4小時，使其充分溶解；
步驟3,4和5同實施例1，得到S/D滅活后溶液39.2kg；
步驟6，在S/D滅活后溶液中加入預(yù)平衡過的SP-Sephadex C-50離子交換樹脂，緩慢攪拌2小時，然后用篩網(wǎng)過濾，收集樹脂；然后用0.20M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液進行洗滌；再用0.6M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集洗脫液10.8kg；
步驟7，用0.45μm濾芯進行澄清過濾，收集濾液10.3kg；
步驟8，將以上濾液接入超濾系統(tǒng)，預(yù)濃縮至約1.5kg，用7.5kg注射用水透析，轉(zhuǎn)移并后洗超濾膜，得到凝血酶濃縮液1.21kg，測得凝血酶活力1013IU/ml；
步驟9，以上凝血酶濃縮液加入注射用水0.97千克(注射用水中事先加入甘氨酸45克溶解)，調(diào)pH值為6.97，得到2.23kg凝血酶溶液，測得凝血酶活力為542IU/ml
步驟10，用一只0.1μm濾芯串聯(lián)一只DV20濾芯進行除病毒過濾；得到2.17kg濾液；
步驟11，同實施例1；
步驟12，凍干，預(yù)凍及凍結(jié)時間約8小時，升華干燥階段約20小時，解析干燥時間約18小時，制品最高溫度28℃，共計46小時，后停機，壓塞，出箱；
步驟13，同實施例1。
所得產(chǎn)品的性質(zhì)及收率見表1.
實施例3
步驟1，按稀釋比1：15，將Fr.Ⅲ沉淀7.5kg投入到112.5kg HAc-NaAc緩沖液中(pH值為5.50，15℃)，勻速攪拌2小時，使其充分溶解；加入硅藻土攪拌30分鐘,然后壓濾獲得凝血酶原沉淀約5.6kg。
步驟2，按稀釋比1：5，將5.6kg凝血酶原沉淀投入到28kg Tris-HCL緩沖液中(pH值為7.50，30℃)中，溫和攪拌2小時，使其充分溶解；
步驟3，以上溶液中加入0.5M的CaCL2溶液，在30℃下，保溫5小時，使凝血酶原激活為凝血酶；
步驟4和5同實施例2。
步驟6，在S/D滅活后溶液中加入預(yù)平衡過的SP-Sephadex C-50離子交換樹脂，緩慢攪拌1小時，然后用篩網(wǎng)過濾，收集樹脂；然后用0.10M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液進行洗滌；再用1.0M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液進行洗脫，收集洗脫液9.5kg；
步驟7和8同實施例2，得到凝血酶濃縮液1.13kg，測得凝血酶活力1109IU/ml；
步驟9，以上凝血酶濃縮液加入注射用水1.15千克(注射用水中事先加入甘氨酸120克,溶解)，調(diào)pH值為7.45，得到2.45kg凝血酶溶液，測得凝血酶活力為531IU/ml。
步驟10和11同實施例2；
步驟12，冷凍干燥,預(yù)凍及凍結(jié)時間約8小時，升華干燥階段約24小時，解析干燥時間約16小時，共48小時，制品最高溫度30℃
步驟13，同實施例2。
所得產(chǎn)品的性質(zhì)及收率見表1.
表1.
注：#2015版藥典對人凝血酶凍干粉的要求：人凝血酶凍干粉的外觀：應(yīng)為白色、灰白色或淡黃色疏松體，無融化跡象。人凝血酶凍干粉的復(fù)溶液外觀：復(fù)溶后應(yīng)為無色、淡黃色或淡黃綠色澄明溶液，可帶輕微乳光。溶解時間@：小于或等于15分鐘。
@溶解時間，是指在20℃～25℃及不晃動條件下，溶解所需時間。
*對照物是指，按現(xiàn)有技術(shù)制備的人凝血酶凍干粉的市售品。