本發(fā)明涉及三氧化二砷領(lǐng)域，特別涉及大型藥用真菌對三氧化二砷的富集轉(zhuǎn)化的發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
砒霜性狀：該品為白色粉末，無臭，無味，能溶于水、乙醇、酸類及堿類。加熱則升散而發(fā)蒜臭。中文名稱三氧化二砷；亞砷酐；砒霜；白砒；亞砷酸酐。
砒霜的毒性很強，進入人體后能破壞某些細胞呼吸酶，使組織細胞不能獲得氧氣而死亡；還能強烈刺激胃腸粘膜，使粘膜潰爛、出血；亦可破壞血管，發(fā)生出血，破壞肝臟，嚴重的會因呼吸和循環(huán)衰竭而死。急性砷中毒癥狀表現(xiàn)為兩種：胃腸型，最為常見。發(fā)作時間隨量的大小及胃內(nèi)充盈程度而不同，快的15-30分鐘，慢的可4-5小時，一般為1小時左右。開始咽頭有灼熱感、口渴、惡心，接著出現(xiàn)劇烈腹疼與嘔吐，最初吐食物，繼之吐黃水，同時劇烈腹瀉，初為普通糞便，隨后呈米湯樣。尿量減少，體溫、血壓下降，虛脫、昏迷，最后因循環(huán)衰竭而死亡。神經(jīng)型，較為少見。如一次服用大量砷，可引起重度循環(huán)衰竭、血壓下降、脈搏快弱、呼吸淺表、中樞神經(jīng)麻痹。其癥狀為頭暈、頭疼，肌肉疼痛性痙攣，迅速不省人事，繼而呼吸麻痹，1小時內(nèi)可死亡。三氧化二砷中毒量為0.005-0.05g，致死量為0.1-0.2g。
隨著中醫(yī)理論得到了越來越廣泛的共識，中醫(yī)藥中使用砒霜治療一些腫瘤疾病，特別是急性脊髓白血病的實踐也得到了證實。這種血液疾病的患者，由于體內(nèi)遺傳因子突變而產(chǎn)生畸形蛋白質(zhì)，白血球的正常產(chǎn)生與死亡就會受到干擾。經(jīng)美國食品和藥物管理局證實，砷的三氧化合物能夠使得畸形蛋白質(zhì)產(chǎn)生自我消滅的能力，從而使白血球的生長恢復正常。一些醫(yī)生還認為，砷的三氧化合物對病人的副作用小于常規(guī)的化學療法。砷的三氧化合物已經(jīng)越來越多地被用于治療諸如淋巴癌、前列腺癌或子宮癌的臨床實踐。
三氧化二砷是傳統(tǒng)中藥砒霜中的主要成分。上世紀70年代，哈醫(yī)大一院中醫(yī)科和血液科的醫(yī)生創(chuàng)造性地將三氧化二砷應用于急性早幼粒細胞白血病(M3型)的患者，之后又拓展到經(jīng)維甲酸治療復發(fā)的M3型病例上，其完全緩解率突破90％以上。在此臨床報告的基礎(chǔ)上，上海陳竺、王振義等學者首次從分子生物學及基因水平揭示了三氧化二砷誘導早幼粒白血病細胞凋亡的機理。此后，全世界的學者開始將三氧化二砷引入肝癌、淋巴瘤等多種腫瘤的研究領(lǐng)域，取得了一項又一項科學成果。
兩年前，武漢市普愛醫(yī)院腫瘤科馮覺平、孔慶志教授等專家受到三氧化二砷治療血液病的啟發(fā)，用肺腺癌耐藥細胞系在體外進行對照試驗，發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可改善其耐藥狀況。課題組還從分子水平上探討了三氧化二砷對肺腺癌耐藥細胞的調(diào)節(jié)機制，這為擴大三氧化二砷臨床應用范圍，尋找高放低毒的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑，臨床合理治療肺癌，提高療效提供了新思路、新方法。
三氧化二砷（As203)被血液腫瘤學界公認為20世紀最重要的里程碑式的藥物之一。第11屆全國血液學會議上，我國學者再次賦予此藥物以新的內(nèi)涵——首次證實二氧化二砷對腫瘤干細胞有擊殺和消除作用。這一結(jié)果說明，在腫瘤干細胞研究領(lǐng)域，三氧化二砷已成為受關(guān)注程度最高的藥物，也是目前證據(jù)最為充分的能夠靶向誘導腫瘤干細胞凋亡的藥物。
專利三氧化二砷口服液及其生產(chǎn)方法，申請(專利)號CN200310118274.2，提供了一種三氧化二砷口服液的生產(chǎn)方法，它包括以下步驟：稱取三氧化二砷，置于無菌容器中，加入適量無菌注射用水，制成懸浮液；將懸浮液加熱攪拌至溶解，再加入適量單糖漿，制得溶液；用枸緣酸調(diào)溶液的pH值至3～5，分裝滅菌。提供了三氧化二砷口服液。
目前臨床用三氧化二砷靜脈注射用針劑及上述專利產(chǎn)品口服液，均限于將化學品二氧化二砷藥用，其巨大的毒性無法克服而缺乏安全性，用藥范圍小，使用條件受到限制，無法惠及廣大病患人群。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明是將三氧化二砷按一定的比例添加到一種新型基質(zhì)配方之中，采用藥用真菌靈芝、冬蟲夏草單菌株或多菌株進行固體培養(yǎng)發(fā)酵，將化學品三氧化二砷富集轉(zhuǎn)化為與靈芝和冬蟲夏草菌絲體蛋白合成的有機三氧化二砷。經(jīng)提取，濃縮，制粒，包裝等工序制成靈芝或冬蟲夏草三氧化二砷顆粒沖劑或靈芝、冬蟲夏草復合型三氧化二砷顆粒沖劑。其產(chǎn)品為降低三氧化二砷巨大的毒性，擴大臨床應用范圍，治療白血病，肝癌及肺癌等多種癌癥，為廣大病患者提供方便新的治療藥物。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：
1.0三氧化二砷藥用真菌基質(zhì)發(fā)酵：
1.1藥用菌株品種及來源：
品種：靈芝，川紫6號，冬蟲夏草，北蟲草。
引種來源：四川省農(nóng)科院土肥所菌種室。
1.2基質(zhì)配方：
骨粉30kg，麥粒20kg，谷殼48kg，石膏2kg，三氧化二砷10g，水100kg。
1.3發(fā)酵培養(yǎng)：
1.3.1配料，按上述基質(zhì)配方，充分攪拌均勻，待用。
1.3.2裝袋：使用耐高溫的聚乙烯袋，其規(guī)格為350*200，裝料松緊適度。
1.3.3滅菌：常規(guī)滅菌鍋滅菌，時間6小時，溫度100℃。
1.3.4無菌接種：采用自制接種箱接種。接種量：采用固體生產(chǎn)種按1∶20的比例，抽出接種棒，填上靈芝菌種或冬蟲夏草菌種或這兩種菌種的混合菌種，蓋上專用泡沫蓋。
1.3.5溫室培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度，靈芝菌株，25-30℃，.冬蟲夏草22-25℃，培養(yǎng)時間22-28天，溫室避光。溫室空氣流通。
1.3.6發(fā)酵基質(zhì)自然后熟：待基質(zhì)呈純白色，置于常溫20℃條件下，7至10天。
2.0培養(yǎng)物的提取：
2.1菌絲體自融，溫水浸提：按后熟的菌絲體5倍無菌溫水，浸泡2小時，過濾，濾渣待用。濾液濃縮，蒸汽壓力0.09，真空度0.08，蒸發(fā)溫度40-50℃，濃縮比重1.2，浸膏待用。
2.2熱回流超聲波抽提濃縮；將備用的濾渣提取，過濾，濃縮在熱回流超聲波提取濃縮器完成。工藝參數(shù)：罐內(nèi)壓力0.09MPa，夾層壓力0.3MPa，壓縮空氣壓力0.6MPa，提取溫度50-60℃，提取時間5-6小時，所獲得濃浸膏比為1.2.待用。
2.3醇沉、回收：將自融液、濃縮液一并加5倍75％乙醇浸提24小對，過濾，再濃縮至1.2浸膏，待用
2.4混合，制粒，干燥；該工藝采用系列沸騰一步制粒機完成，工藝參數(shù)是：蒸汽壓力是0.4MPa，溫度60℃，所制顆粒水份5％。
2.5包裝：采用鋁泊復合袋，10g/袋裝小袋，10袋/盒規(guī)格裝盒，得成品
2.7成品：為三氧化二砷靈芝顆粒沖劑，冬蟲夏草三氧化二砷顆粒沖劑或靈芝、冬章夏草三氧化二砷復合型顆粒沖劑。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的有益效果：
1本發(fā)明將中藥真菌，微量元素科學與與生物發(fā)酵工程技術(shù)交叉結(jié)合，形成一門新的醫(yī)藥科學及技術(shù)，為發(fā)現(xiàn)和研制中藥創(chuàng)藥物提供出一條新的途徑。
2經(jīng)靈芝、蟲草菌絲體富集轉(zhuǎn)化的三氧化二砷菌蛋白，其產(chǎn)品為降低三氧化二砷巨大的毒性，擴大臨床應用范圍，治療白血病，肝癌及肺癌等多種癌癥，為廣大病患者提供方便新的治療藥物。避免了常規(guī)的三氧化二砷靜脈注射的藥物風險及嚴格的施治條件。
3經(jīng)靈芝、蟲草菌絲體富集轉(zhuǎn)化的三氧化二砷菌蛋白，不僅充分具有三氧化二砷所具有的 藥用功能，同時具有靈芝補氣安神，冬蟲夏草補肺益腎的多種功能，其產(chǎn)品為擴大三氧化二砷臨床應用范圍，更加合理有效地治療白血病，肝癌及肺癌等多種癌癥患者。
具體實施方式
實施例1靈芝三氧化二砷顆粒沖劑的生產(chǎn)方法
1.0靈芝三氧化二砷藥用真菌基質(zhì)發(fā)酵：
1.1藥用菌株品種及來源：
品種：靈芝，川紫6號。
引種來源：四川省農(nóng)科院土肥所菌種室。
1.2基質(zhì)配方：
骨粉30kg，麥粒20kg，谷殼48kg，石膏2kg，三氧化二砷10g，水100kg。
1.3發(fā)酵培養(yǎng)：
1.3.1配料，按上述基質(zhì)配方，充分攪拌均勻，待用。
1.3.2裝袋：使用耐高溫的聚乙烯袋，其規(guī)格為350*200，裝料松緊適度。
1.3.3滅菌：常規(guī)滅菌鍋滅菌，時間6小時，溫度100℃。
1.3.4無菌接種：采用自制接種箱接種。接種量：采用靈芝固體生產(chǎn)種按1∶20的比例，抽出接種棒，填上靈芝菌種，蓋上專用泡沫蓋。
1.3.5溫室培養(yǎng)：培養(yǎng)溫度，25-30℃，培養(yǎng)時間22-28天，溫室避光。溫室空氣流通。
1.3.6發(fā)酵基質(zhì)自然后熟：待基質(zhì)呈純白色，置于常溫20℃條件下，7至10天，完成基質(zhì)的后熟。
2.0培養(yǎng)物的提取：
2.1菌絲體自融，溫水浸提：按后熟的菌絲體5倍無菌溫水，浸泡2小時，過濾，濾渣待用。濾液濃縮，蒸汽壓力0.09，真空度-0.08.蒸發(fā)溫度40-50℃，濃縮比重1.2，浸膏待用。
2.2熱回流超聲波抽提濃縮：將備用的濾渣提取，過濾，濃縮在熱回流超聲波提取濃縮器完成。工藝參數(shù)：罐內(nèi)壓力0.09MPa，夾層壓力0.3MPa，壓縮空氣壓力0.6MPa，提取溫度50-60℃，提取時間5-6小時，所獲得濃浸膏比為1.2，待用。工藝路線；將濾渣投入提取罐，加入5倍量的水。開啟提取罐直通夾層蒸治閥門，提取液加熱20-30分鐘后，用抽濾管將1/3提取液投入濃縮器。關(guān)閉提取罐直通夾層蒸汽，開啟加熱器閥門使液料濃縮。濃縮產(chǎn)生二次蒸汽，通過蒸發(fā)上升管送入提取罐，二次蒸汽繼續(xù)上升，經(jīng)冷凝器冷凝成冷凝液，回落到提取罐內(nèi)作新溶劑。提取液經(jīng)投入濃縮器，濃縮產(chǎn)生的二次蒸汽又送到提取罐，作熱原和新溶 劑，這樣形成的大回流提取，故濾渣的溶質(zhì)密度與溶劑中溶質(zhì)密度保持高梯度，濾渣中的溶液質(zhì)高速度溶出，直到完全溶出。此時提取液停止抽入濃縮器，濃縮出的二次蒸汽轉(zhuǎn)送冷卻器，濃縮繼續(xù)進行，直到濃縮至浸膏密度1.2，藥渣從出渣門排出，開直通夾層蒸汽，回收溶劑后，將渣排出。
2.3醇沉，回收；將自融液、濃縮液一并加5倍75％乙醇浸提24小時，過濾，再濃縮至1.2浸膏，待用。
2.4混合，制粒，干燥：該工藝采用系列沸騰一步制粒機完成，工藝路線是：按濃縮浸膏和水溶淀粉，1.2∶1的比例，加進粘結(jié)劑水溶淀粉，在沸騰床內(nèi)建立流態(tài)化過程，經(jīng)持制噴槍霧化噴至流化界面，物料凝聚成粒并干燥，揮發(fā)水分由風機排出。工藝參數(shù)是：蒸汽壓力是0.4MPa，溫度60℃，所制顆粒水份5％
2.5包裝：采用鋁泊復合袋，10g/袋裝小袋，40袋，盒規(guī)格裝盒，得成品
2.7成品：為三氧化二砷靈芝顆粒沖劑
實施例2冬蟲夏草三氧化二砷顆粒沖劑生產(chǎn)方法。
1.0冬蟲夏草三氧化二砷藥用真菌基質(zhì)發(fā)酵：
1.1藥用菌株品種及來源：
品種：冬蟲夏草，北蟲草。
引種來源：四川省農(nóng)科院土肥所菌種室。
1.2基質(zhì)配方：
按本發(fā)明基質(zhì)配方配料。
1.3發(fā)酵培養(yǎng)：溫室培養(yǎng)溫度22-25℃。
1.3.1-1.3.3參照實施例1實行。
1.3.1無菌接種：采用自制接種箱接種。接種量：采用冬蟲夏草固體生產(chǎn)種按1∶20的比例，抽出接種棒，填上冬蟲夏草菌種蓋上專用泡沫蓋
1.3.5-1.3.6參照實施例1實行。
2.0培養(yǎng)物的提?。?/p>
2.1-2.6參照實施例1實行
2.7成品：為冬蟲夏草三氧化二砷冬蟲夏草顆粒沖劑。
實施例3靈芝、冬蟲夏草二氧化二砷復合顆粒沖劑的生產(chǎn)方法
1.0靈芝、冬蟲夏草三氧化二砷基質(zhì)發(fā)酵：
1.1藥用菌株品種及來源：
品種：靈芝，川紫6號，冬蟲夏草，北蟲草。
引種來源：四川省農(nóng)科院土肥所菌種室。
1.2基質(zhì)配方：
按本發(fā)明基質(zhì)配方配料
1.3發(fā)酵培養(yǎng)：溫室培養(yǎng)溫度24-28℃。
1.3.1-1.3.3參照實施例1實行。
1.3.4無菌接種：采用自制接種箱接種。接種量：采用靈芝、冬蟲夏草固體生產(chǎn)種各50％混合均勻后按1∶20的比例，抽出接種棒，填上兩種混合菌種，蓋上專用泡沫蓋。
1.3.5-1.3.6參照實施例1實行。
2.0培養(yǎng)物的提?。?/p>
2.1-2.6參照實施例1實行。
2.7成品：為靈芝、冬蟲夏草復合型三氧化二砷顆粒沖劑。