本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵工業(yè)過程的優(yōu)化調(diào)控方法，具體涉及一種降低美拉德反應(yīng)對(duì)微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵抑制作用的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1912年法國(guó)化學(xué)家路易斯﹒卡米拉﹒美拉德在實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)：羰基化合物（還原糖）的羰基可以與氨基化合物（氨基酸/多肽/蛋白質(zhì)）中的氨基發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)經(jīng)過一系列復(fù)雜歷程最終生成棕黑色的大分子物質(zhì)類黑素或稱擬黑素，該羰氨反應(yīng)又稱美拉德反應(yīng)。

經(jīng)過各國(guó)學(xué)者多年研究，目前公認(rèn)的美拉德反應(yīng)機(jī)理可分以下三個(gè)階段：

起始階段

還原糖與氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生縮合反應(yīng)，生成具有亞胺或甲亞胺特性基團(tuán)的有機(jī)化合物，即席夫堿；席夫堿環(huán)化生成氨基糖；氨基糖經(jīng)Amadori重排生成1-氨基-1-脫氧-2-酮糖。

中間階段

在酸性條件下，1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)1,2-烯醇化反應(yīng)，生成5-羥甲基糠醛；堿性條件下，1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)2,3-烯醇化反應(yīng)，生成還原酮類和脫氫還原酮類；1-氨基-1-脫氧-2-酮糖經(jīng)Strecker降解反應(yīng)生成Strecker醛類和吡嗪類等化合物。

最終階段

該階段反應(yīng)較為復(fù)雜，歷程尚未完全明確，大致是中間階段的產(chǎn)物與氨基化合物聚合反應(yīng)生成高分子結(jié)構(gòu)不明的類黑素，此外還有一系列中間體還原酮及揮發(fā)性雜環(huán)化合物生成。

有研究表明，美拉德反應(yīng)的反應(yīng)速率隨溫度的增長(zhǎng)呈現(xiàn)急劇升高的趨勢(shì)，且美拉德反應(yīng)部分中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物具有抑制微生物生長(zhǎng)的作用，因此在微生物發(fā)酵工業(yè)中為避免還原糖類碳源與氨基化合物類氮源在高溫下發(fā)生美拉德反應(yīng)，通常將碳源和氮源分開滅菌，待冷卻后再將其混合進(jìn)行微生物發(fā)酵，而該工藝手段通常存在滅菌能耗較高、設(shè)備投入成本較大的問題。同時(shí)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物還具有人們不需要的色澤和一定的致癌性，因此目前關(guān)于降低或抑制美拉德反應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，而在微生物發(fā)酵領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道較少。

CN1256032C公開了一種能減輕色變的大豆蛋白酶解方法，該方法要求在酶解罐中添加微量的氧化劑（H₂O₂）和還原劑（Na₂SO₃、Na₂S₂O₅和NaHSO₃）將大豆酶解生成的少量低聚糖的羰基轉(zhuǎn)化為羥基，以此抑制美拉德反應(yīng)。首先該方法不回收循環(huán)使用添加到體系的可溶性鹽，增加了生產(chǎn)成本；其次微生物發(fā)酵領(lǐng)域通常涉及高濃度還原糖-氨基化合物混合體系，因此該方法不適用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。

CN102888325A公開了一種發(fā)酵型棗酒的加工工藝，該方法在整個(gè)工藝流程中控制加工溫度最高不超過55℃，以達(dá)到抑制美拉德反應(yīng)并減少褐變發(fā)生。該方法無(wú)法應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域常用的121℃高溫濕熱滅菌操作，并且為避免后期發(fā)酵染菌而向體系中通入SO₂的方法不適用于細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)，同時(shí)因SO₂具有腐蝕性也相應(yīng)地增加了設(shè)備要求及成本。

CN104188006A公開了一種蕎麥提取物、抑制果汁褐變的方法、制備蘋果汁的方法，該方法先提取蕎麥中具有抗氧化作用的黃酮類化合物，再將該蕎麥提取物添加到混濁蘋果汁中進(jìn)行壓榨、濃縮處理，以此實(shí)現(xiàn)抑制果汁褐變的目的。該方法主要針對(duì)食品加工過程中的酶促褐變，且操作步驟多，設(shè)備成本高，添加的蕎麥提取物不與產(chǎn)品分離且不能循環(huán)使用，增加了產(chǎn)品成本。

綜上，在微生物發(fā)酵領(lǐng)域中，亟需尋找一種優(yōu)化調(diào)控方法，能夠在不改動(dòng)現(xiàn)有設(shè)備和高溫濕熱滅菌工藝的基礎(chǔ)上，經(jīng)濟(jì)、有效的降低美拉德反應(yīng)對(duì)微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵抑制作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中在微生物發(fā)酵領(lǐng)域缺乏切實(shí)有效的降低美拉德反應(yīng)對(duì)微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵抑制的問題，本發(fā)明為解決以還原糖為碳源、以氨基化合物為氮源的微生物發(fā)酵培養(yǎng)基在高溫濕熱滅菌過程中普遍發(fā)生的美拉德反應(yīng)抑制微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵的問題，提供一種利用烷基二元酯作為美拉德反應(yīng)抑制劑的方法，可以維持現(xiàn)有高溫濕熱滅菌工藝和設(shè)備，并省去培養(yǎng)基分消環(huán)節(jié)，從而滿足微生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)?jīng)濟(jì)、有效降低抑制微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵的美拉德反應(yīng)的需求。

本發(fā)明的技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種降低美拉德反應(yīng)對(duì)微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵抑制作用的方法，向配制好的培養(yǎng)基中加入烷基二元酯，培養(yǎng)基與烷基二元酯的混合比例為1:0.01~1，攪拌，滅菌，冷卻后停止攪拌，待體系分層，分出有機(jī)相，培養(yǎng)基用于發(fā)酵，所述烷基二元酯具有如下結(jié)構(gòu)通式：

（C_nH_2n+1）-OOC-（CH₂）_m-COO-（C_nH_2n+1）

其中，m、n均為整數(shù)，0≤m≤8，1≤n≤16。

進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基與烷基二元酯的混合比例優(yōu)選為1:0.08~0.15，可以保證降低美拉德反應(yīng)的效果，又能節(jié)省原料烷基二元酯，此外，所述烷基二元酯經(jīng)收集后可循環(huán)利用。

進(jìn)一步的，所述烷基二元酯優(yōu)選為密度大于水、沸點(diǎn)高于水的酯類，

更優(yōu)選為丙二酸二乙酯、丁二酸二乙酯和己二酸二甲酯的至少一種。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的方法更適用于大型發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基滅菌，可以在很大程度上節(jié)省工藝，在滅菌過程中保持?jǐn)嚢?，攪拌可以加?qiáng)發(fā)酵罐內(nèi)混合體系的動(dòng)量傳遞、質(zhì)量傳遞和熱量傳遞，同時(shí)也能使水-有機(jī)兩相充分混合達(dá)到或接近乳化狀態(tài)，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為10～800rpm，優(yōu)選為80~150rpm。另外，在滅菌結(jié)束后，待體系冷卻后再停止攪拌，防止冷卻前高溫下發(fā)生美拉德反應(yīng)，待體系分層后，密度大于水的烷基二元酯位于下層，通過發(fā)酵罐的出料口即可將烷基二元酯分離出來(lái)，而培養(yǎng)基可直接用于發(fā)酵。大大節(jié)省了滅菌工藝，降低染菌的風(fēng)險(xiǎn)。

進(jìn)一步的，所述滅菌為高溫濕熱滅菌，它更容易造成美拉德反應(yīng)，高溫濕熱滅菌是指用飽和水蒸氣、沸水或流通蒸汽進(jìn)行滅菌的方法，在50～135℃高溫濕熱滅菌1～1000min。例如現(xiàn)有技術(shù)中最常用的121℃、30min滅菌條件下更適用于采用本發(fā)明方法來(lái)降低美拉德反應(yīng)。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的培養(yǎng)基尤指糖濃度和氮濃度較高的培養(yǎng)基，且培養(yǎng)基中的碳源為還原糖，具有游離醛基、半縮醛羥基或游離羰基等基團(tuán)，選自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖、木糖或核糖中的至少一種；所述氮源為具有氨基的有機(jī)化合物，選自牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、豆粕和玉米漿中的至少一種。

在本發(fā)明的方法中，當(dāng)向培養(yǎng)基中添加烷基二元酯后，再將培養(yǎng)基混合進(jìn)行高溫濕熱滅菌處理，該培養(yǎng)基顏色明顯比不添加烷基二元酯而直接混合滅菌的培養(yǎng)基顏色淺。將滅菌培養(yǎng)基中的烷基二元酯分離除去后進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明微生物在烷基二元酯處理過的培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)指標(biāo)和發(fā)酵指標(biāo)都明顯優(yōu)于未經(jīng)烷基二元酯處理的培養(yǎng)基對(duì)照組。有研究表明美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物席夫堿、氨基糖、5-羥甲基糠醛以及最終產(chǎn)物類黑素具有抑制微生物生長(zhǎng)和發(fā)酵的作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果推斷本發(fā)明的作用機(jī)理如下：1、本發(fā)明所用的烷基二元酯為直鏈結(jié)構(gòu)，其中的羰基易與氨基化合物反應(yīng)，通過阻止還原糖與氨基化合物反應(yīng)來(lái)抑制美拉德反應(yīng)的發(fā)生；2、烷基二元酯與美拉德中間產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，通過減少美拉德反應(yīng)體系通量降低了美拉德最終產(chǎn)物的生成量；3、烷基二元酯與培養(yǎng)基混合可形成水-有機(jī)兩相體系，美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物因萃取作用而主要集中在烷基二元酯的有機(jī)相中，隨烷基二元酯的分離而被分離出培養(yǎng)基。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

1、烷基二元酯的加入能夠有效的降低體系中的美拉德反應(yīng)通量，并能通過萃取原理將美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物從體系中分離出去，處理后的培養(yǎng)基更適于微生物生長(zhǎng)與發(fā)酵，顯著地提高了培養(yǎng)基的每批次利用率，也提高了發(fā)酵經(jīng)濟(jì)性。

2、在還原糖類碳源與氨基化合物類氮源同時(shí)存在于培養(yǎng)基中時(shí)，相比于分消滅菌工藝，本發(fā)明的一次滅菌工藝使發(fā)酵設(shè)備建設(shè)成本降低了一半、滅菌能耗降低了一半，顯著地節(jié)省了設(shè)備建設(shè)和運(yùn)行成本。

3、靜置分層即可分離出體系的特點(diǎn)使烷基二元酯的分離成本可以忽略不計(jì)，同時(shí)可以循環(huán)使用分離出的烷基二元酯也使本發(fā)明的應(yīng)用成本大大降低。

綜上，本發(fā)明能夠提高培養(yǎng)基的每批次利用率，節(jié)省設(shè)備建設(shè)、運(yùn)行及應(yīng)用成本，滿足了微生物發(fā)酵領(lǐng)域?qū)?jīng)濟(jì)、有效的降低美拉德反應(yīng)對(duì)微生物生長(zhǎng)及發(fā)酵抑制作用的需求，具有良好的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例與比較例中使用的干酪乳桿菌為撫順石油化工研究院篩選培養(yǎng)的Lactobacillus casei FY-04菌株，現(xiàn)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；保藏編號(hào)：CGMCC No.3269。

實(shí)施例與比較例中使用的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖150g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸氫二氨2g/L、磷酸氫二鉀2g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L、吐溫80 1g/L。

實(shí)施例1

在發(fā)酵罐中配制好培養(yǎng)基后，按培養(yǎng)基體積的1%加入丙二酸二乙酯，設(shè)定發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，通入蒸汽將發(fā)酵罐溫度維持在121℃下30min以達(dá)到滅菌效果。滅菌結(jié)束后，將發(fā)酵罐溫度冷卻至42℃后停止攪拌，靜置20min后從發(fā)酵罐下出料口將有機(jī)相排出?；謴?fù)攪拌轉(zhuǎn)速100prm，按培養(yǎng)基體積10%接入干酪乳桿菌種子液，42℃度下發(fā)酵48h后取樣，用鉑-鈷比色法測(cè)定發(fā)酵液顏色，鉑-鈷比色法數(shù)值越小說明發(fā)酵液顏色越淺；用600nm處吸光度測(cè)定菌體濃度，OD₆₀₀越大說明菌體濃度越高；用液相色譜法測(cè)L-乳酸濃度。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1相比，實(shí)施例2按培養(yǎng)基體積的10%加入己二酸二甲酯，其他與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1相比，實(shí)施例3按培養(yǎng)基體積的100%加入丁二酸二乙酯，其他與實(shí)施例1相同。

比較例1

與實(shí)施例1相比，比較例不加入烷基二元酯，其他與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例與比較例的結(jié)果如表1所示。

表1. 實(shí)施例與比較例的發(fā)酵液色度及發(fā)酵結(jié)果