本發(fā)明屬于生化藥物領(lǐng)域，具體地，涉及膽提取物、其提取方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：因疾病所致的各種長(zhǎng)期難愈合的創(chuàng)面(潰瘍)是臨床外科的常見(jiàn)病，其使機(jī)體失去天然屏障，抑制機(jī)體免疫功能，同時(shí)還會(huì)引發(fā)其他疾病。此病癥發(fā)生率高、愈合困難，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。針對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行醫(yī)治，也就是創(chuàng)傷修復(fù)，是醫(yī)學(xué)界有待深入研究的重要課題之一。細(xì)胞生長(zhǎng)因子亦稱細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，是一類具有很強(qiáng)生理活性的多肽，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化起調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞生長(zhǎng)因子能刺激巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的生長(zhǎng)、具有增殖修復(fù)能力和抗炎能力，在防止疤痕組織增生、創(chuàng)傷愈合及修復(fù)中起關(guān)鍵作用。創(chuàng)傷愈合及修復(fù)是機(jī)體自身具有的重要功能，但是影響創(chuàng)傷愈合及修復(fù)的因素很多，如感染、生長(zhǎng)因子、局部營(yíng)養(yǎng)障礙等。在被損傷的局部組織中，細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度過(guò)低，造成創(chuàng)傷難以愈合。另外，一些創(chuàng)面中的分泌物很多，盡管用對(duì)癥抗生素進(jìn)行治療，但傷口愈合的情況仍然不理想。因此加入外源性的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)就顯得至關(guān)重要。九十年代以來(lái)，美國(guó)等國(guó)家對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)等細(xì)胞生長(zhǎng)因子在創(chuàng)傷修復(fù)中的作用進(jìn)行了長(zhǎng)期研究，并逐步向臨床應(yīng)用過(guò)渡，但至今尚未在臨床上普遍應(yīng)用。我國(guó)近些年來(lái)也開(kāi)展了這方面的研究工作。然而，目前國(guó)內(nèi)外在研究中所采用的生長(zhǎng)因子都是應(yīng)用基因重組技術(shù)而獲取，因而價(jià)格十分昂貴，例如EGF的售價(jià)達(dá)2000元/mg。此外，目前的研究均是就單一的生長(zhǎng)因子對(duì)創(chuàng)面的作用進(jìn)行觀察，而其效果也并不十分理想，并且存在著因單一生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞增生而引發(fā)細(xì)胞癌變的質(zhì)疑。為了克服這些問(wèn)題，提出了“分子組合”的概念，以達(dá)到共同參與 作用甚至是協(xié)同作用的效果。在天然的生物體中尋找并分離所需的創(chuàng)傷修復(fù)因子是解決問(wèn)題的可行途徑之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明從哺乳動(dòng)物的膽組織出發(fā)，通過(guò)簡(jiǎn)單的凍融、冷凍離心、微濾、超濾、反滲透、冷凍干燥等工藝，提取、分離并濃縮得到含有多種有效成分的膽提取物。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種膽提取物，其是含有膽囊多肽、粘蛋白多糖、細(xì)胞有絲分裂抑制因子、膽膜素、膽鹽、膽紅素、膽汁多肽、膽汁多糖、免疫球蛋白等多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞修復(fù)因子及抗炎因子的混合物。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種用于抑制皮膚炎癥的膽提取物。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種用于促進(jìn)創(chuàng)面組織生長(zhǎng)修復(fù)的膽提取物。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種用于防止疤痕組織增生的膽提取物。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種用于治療眼底出血的膽提取物。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種用于治療胃潰瘍和胃炎的膽提取物。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種制備具有多種細(xì)胞活性因子的膽提取物的方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種膽提取物，具有紅外IR特征峰譜：波數(shù)(cm-1)吸收度(％T)342711.39744292344.86043284858.75253163431.00506154052.03054144749.30502139736.9777137840.05586124158.28234109245.37468103642.0100196752.7504887468.1559453148.5042546946.89537。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述膽來(lái)自哺乳動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述膽來(lái)自牛、羊和豬。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種制備膽提取物的方法，包括如下步驟：1)在無(wú)菌條件下，從膽中取出膽汁以及任選的膽囊粘膜，進(jìn)行低溫高速離心，收集沉淀物，和/或2)在無(wú)菌條件下，從膽中取出膽囊以及任選的膽囊粘膜，進(jìn)行粉碎勻漿，得到勻漿液，進(jìn)行低溫高速離心，收集上清液，3)將步驟1)中的沉淀物和/或步驟2)中的上清液進(jìn)行微濾和超濾，收集濾液，4)將濾液進(jìn)行反滲透濃縮，得到濃縮物，即為膽提取物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述低溫高速離心是以3000-8000rpm/min，進(jìn)行20-40min。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，在步驟2)中進(jìn)一步包括在粉碎勻漿之前的反復(fù)凍融步驟。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述粉碎勻漿是以8000-14000rpm/min進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述微濾是在0.25-0.45μm的過(guò)濾器中進(jìn)行，所述超濾是在0.001-0.02μm的過(guò)濾器中進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，進(jìn)一步包括在濃縮后的干燥、凍干步驟。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種膽提取物在制備用于抑制皮膚炎癥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種膽提取物在制備用于促進(jìn)創(chuàng)面組織生長(zhǎng)修復(fù)的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述創(chuàng)面組織是糖尿病引發(fā)的皮膚潰瘍。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種膽提取物在制備用于防止疤痕組織增生的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種膽提取物在制備用于治療眼底出血的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種膽提取物在制備用于治療胃潰瘍和胃炎的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種皮膚外用藥物組合物，含有根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽提取物作為主要成為以及藥學(xué)上可接受的載體。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，所述的皮膚外用藥物組合物用于促進(jìn)創(chuàng)面組織生長(zhǎng)修復(fù)和防止疤痕組織增生。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種化妝品，含有所述膽提取物作為主要成分。本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種保健品，含有所述膽提取物作為主要成分。不希望局限于任何理論，但是本發(fā)明的膽提取物是創(chuàng)傷愈合修復(fù)的天然分子組合物，其是由膽囊多肽、粘蛋白多糖、細(xì)胞有絲分裂抑制因子、膽膜素、膽鹽、膽紅素、膽汁多肽、膽汁多糖、免疫球蛋白等組成，在功能上互補(bǔ)、協(xié)調(diào)，并且更重要的是具有組合的天然合理性和有效性。有如“集團(tuán)軍”作戰(zhàn)一樣，能達(dá)到明顯的治療效果，本發(fā)明的膽提取物刺激巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的生長(zhǎng)、分化增殖及創(chuàng)面肉芽組織生成和抗炎能力，還具有抑制疤痕組織增生的作用。本發(fā)明的膽提取物安全可靠，無(wú)毒副作用，無(wú)禁忌癥。用于臨床治療時(shí)所需費(fèi)用也很低廉。本發(fā)明的膽提取物采用簡(jiǎn)單的生化技術(shù)提取，不需要采用特殊的純化手段，不使用層析分離，更不需要基因重組，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，易于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，相比于單一類型的細(xì)胞因子，本發(fā)明的膽提取物對(duì)于炎癥的治療具有相對(duì)更高的效果。定義在本文中所用的術(shù)語(yǔ)“膽”是指獲自哺乳動(dòng)物的、去除了脂肪組織的全 膽組織，包括膽囊，膽囊粘膜以及膽汁。僅為了在本發(fā)明中進(jìn)行區(qū)別的目的，將膽囊與膽囊粘膜總稱為膽囊體。在本文中所用的術(shù)語(yǔ)“創(chuàng)傷”是指由于手術(shù)、燙傷、燒傷、咬傷以及其他原因造成的皮膚損害及創(chuàng)面組織不愈，疤痕組織增生，皮膚潰瘍，胃潰瘍和胃炎以及眼底出血等。附圖說(shuō)明圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的方法制備的膽提取物的紅外IR特征峰譜。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備：無(wú)菌操作間(臺(tái))、凍融機(jī)、高速勻漿機(jī)、低溫高速離心機(jī)、微濾器、超濾器、反滲透器、低溫冷凍干燥機(jī)、紅外分光光度計(jì)，高壓滅菌鍋等。實(shí)驗(yàn)原料：市售購(gòu)買的經(jīng)過(guò)檢疫的新鮮膽或冷凍儲(chǔ)存的膽。實(shí)驗(yàn)試劑：除非另有說(shuō)明，否則本發(fā)明中所用的試劑都是本領(lǐng)域常用且可市售購(gòu)買的。實(shí)施例1在4℃的無(wú)菌環(huán)境中，用生理鹽水反復(fù)沖洗新鮮的膽，然后用醫(yī)用剪刀剪開(kāi)一個(gè)小口取出膽汁，放入容器中，留下膽囊體備用。實(shí)施例2在4℃的無(wú)菌環(huán)境中，將實(shí)施例1中的膽囊體去掉脂肪組織，用生理鹽水沖洗，剝離膽囊粘膜并放入一容器中，另將去除膽囊粘膜的膽囊放入另一容器中備用。實(shí)施例3在4℃的無(wú)菌環(huán)境中，將在實(shí)施例1中制備的膽汁在低溫高速離心機(jī)上以8000rpm/min離心20min，收集沉淀物。實(shí)施例4在4℃的無(wú)菌環(huán)境中，將在實(shí)施例1中制備的膽汁以及在實(shí)施例2中制備的膽囊粘膜在低溫高速離心機(jī)上以8000rpm/min離心20min，收集沉淀物。實(shí)施例5在4℃的無(wú)菌環(huán)境中，將在實(shí)施例1中得到的膽囊體用剪刀剪碎成1-1.5cm的小塊，在高速勻漿機(jī)上以12000r/min進(jìn)行組織粉碎10次，每次5分鐘，之后，在低溫高速離心機(jī)上以4000rpm/min離心20min，收集上清液。額外地，在進(jìn)行組織粉碎勻漿之前，將在實(shí)施例1中得到的膽囊體首先在-20℃反復(fù)凍融5次，然后執(zhí)行上述步驟，收集上清液。實(shí)施例6在4℃的無(wú)菌環(huán)境中，將在實(shí)施例2中得到的膽囊用剪刀剪碎成1-1.5cm的小塊，在高速勻漿機(jī)上以12000r/min進(jìn)行組織粉碎10次，每次5分鐘，之后，在低溫高速離心機(jī)上以4000rpm/min離心20min，收集上清液。額外地，在進(jìn)行組織粉碎勻漿之前，將在實(shí)施例2中得到的膽囊首先在-20℃反復(fù)凍融5次，然后執(zhí)行上述步驟，收集上清液。實(shí)施例7將實(shí)施例3得到的沉淀物以1:10的比例加入去離子水溶解，用0.45μm微濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，去除不溶物。然后將濾液用0.02μm的超濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液。實(shí)施例8將實(shí)施例4得到的沉淀物以1:10的比例加入去離子水溶解，用0.45μm微濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，去除不溶物。然后將濾液用0.02μm的超濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液。實(shí)施例9將實(shí)施例5的上清液，用0.45μm微濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，去除不溶物。然后將濾液用0.02μm的超濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液。實(shí)施例10將實(shí)施例6的上清液，用0.45μm微濾器進(jìn)行過(guò)濾除菌，去除不溶物。然后將濾液用0.02μm的超濾器進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液。實(shí)施例11對(duì)于前述一個(gè)或多個(gè)或全部實(shí)施例中收集的濾液，利用反滲透器進(jìn)行過(guò)濾濃縮，收集濃縮物。實(shí)施例12額外地，對(duì)于實(shí)施例11得到的濃縮物進(jìn)一步在-60℃，真空度7.00pa下利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得到凍干粉。實(shí)施例13按照上述實(shí)施例1-12的方法，從膽汁、膽囊、膽囊粘膜制備本發(fā)明的膽提取物，所得膽提取物的具體來(lái)源在下表1的實(shí)驗(yàn)1-5中列出。表1膽汁膽囊膽囊粘膜實(shí)驗(yàn)1+--實(shí)驗(yàn)2+-+實(shí)驗(yàn)3-++實(shí)驗(yàn)4-+-實(shí)驗(yàn)5+++實(shí)施例14將制得的膽提取物干粉在水中溶解，得到膽提取物溶液。可分別將溶液稀釋成1-5％濃度，備用。實(shí)施例15將制得的膽提取物干粉以200mg為單位填充到醫(yī)藥領(lǐng)域可接受的成囊材料中，制備成膠囊劑，備用。實(shí)施例16膽提取物抑制皮膚慢性潰瘍?nèi)脒x患者20名，年齡最大81歲，最小15歲，平均年齡為53歲。瘡面最大12cm×8cm大小，最小0.5cm×0.5cm大小。其中下肢潰瘍患者7例，燒傷患者1例，結(jié)核性潰瘍患者2例，脈管炎患者3例，糖尿病壞死患者3例，瘺管患者2例，硬皮癥患者1例，乳腺癌術(shù)后患者1例。取濃度為2％的、在實(shí)驗(yàn)4中制備的膽提取物溶液，裝入噴射器制備成噴霧劑，噴涂入選患者的患處，每日1次，每次噴涂至患處完全被膽提取物溶液覆蓋。效果觀察：愈合15例，好轉(zhuǎn)3例，無(wú)效2例。創(chuàng)面平均愈合時(shí)間為16.8天。無(wú)效2例均為脈管炎患者。實(shí)施例17膽提取物促進(jìn)組織生長(zhǎng)入選患者7名，其中男性4名，女性3名。年齡最大63歲，最小42歲。其中，手術(shù)后傷口感染不愈患者4例，狗咬傷感染傷口不愈患者1例，截癱臥床褥瘡患者1例，組織炎癥傷口不愈患者1例。取濃度為5％的、在實(shí)驗(yàn)5中制備的膽提取物溶液，裝入噴射器制備成噴霧劑，噴涂入選患者的患處，每日1次，每次噴涂至患處完全被膽提取物溶液覆蓋。施用6-15天。結(jié)果顯示，手術(shù)后傷口感染不愈的4例患者全部愈合。組織炎癥傷口不愈1例患者的傷口愈合，狗咬傷感染傷口不愈1例患者的傷口愈合，截癱臥床褥瘡1例患者使用15天后肉芽組織生長(zhǎng)較快，基本愈合。實(shí)施例18膽提取物防止疤痕組織增生入選患者31名，其中男性21名，女性10名。年齡最小2歲，最大62歲?；颊邿隣C傷部位分布：創(chuàng)面位于下肢者14例，面部者2例，軀干者5例，上肢者10例。燒燙傷面積最小的0.5％，最大的5％。燒燙傷程度：淺Ⅱ° 創(chuàng)面3例，深Ⅱ°創(chuàng)面20例。取濃度為1％的、在實(shí)驗(yàn)3中制備的膽提取物溶液50ml，浸泡無(wú)菌紗布，清理創(chuàng)面后覆蓋入選患者的患處。每日換藥1次。觀察創(chuàng)面愈合、表皮生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示：治愈21例，好轉(zhuǎn)10例，無(wú)效0例。實(shí)施例19膽提取物治療眼底出血入選患者為4名男性。年齡最小35歲，最大58歲。表現(xiàn)為進(jìn)食刺激性食物后或受到身體其他不良狀況時(shí)，出現(xiàn)眼底出血情況，該癥狀可慢慢消失，但消失時(shí)間不確定。取濃度為5％的、在實(shí)驗(yàn)5中制備的膽提取物溶液制備水液。滴入入選患者的眼內(nèi)，每次2-3滴，每日2次。結(jié)果顯示，使用5天后癥狀消失者3例，好轉(zhuǎn)者1例。進(jìn)一步地，癥狀消失的3例在以后受到同樣的刺激下，眼底未再有出血現(xiàn)象。實(shí)施例20膽提取物治療胃炎及胃潰瘍?nèi)脒x患者55名，其中男性43名，女性12名。年齡分布最大72歲，最小20歲。經(jīng)醫(yī)學(xué)診斷，患者中萎縮性胃炎6例，淺表性胃炎及輕度胃潰瘍27例，反流性胃炎2例，飲酒或飲食辛辣刺激性食物引起胃痛者20例。取實(shí)施例15的膠囊劑，口服給予入選患者，每日2次，每次2-4粒。服用時(shí)間為3-120天。結(jié)果顯示，飲酒或飲食辛辣等刺激性食物造成胃痛發(fā)作的患者，在服用3天后癥狀消失的7例，5天后癥狀消失的6例，癥狀好轉(zhuǎn)的7例。淺表性胃炎及輕度胃潰瘍患者服用30天癥狀明顯好轉(zhuǎn)11例，好轉(zhuǎn)9例，效果不明顯7例，服用60天后癥狀明顯好轉(zhuǎn)16例，好轉(zhuǎn)6例，效果不明顯5例。反流性胃炎2例，服用后癥狀減輕，停用后復(fù)發(fā)，長(zhǎng)期服用可減輕癥狀。本發(fā)明的效果上面實(shí)施例僅僅是列舉了本發(fā)明膽提取物的治療效果，實(shí)驗(yàn)中，在上面實(shí)施例中公開(kāi)的范圍內(nèi)的原料、濃度、劑量對(duì)上述患者同樣具有治療效果。本發(fā)明采用簡(jiǎn)單的凍融、冷凍離心、微濾、超濾、反滲透、冷凍干燥等工藝，提取、分離并濃縮得到含有多種有效成分的膽提取物。本發(fā)明制備的膽提取物對(duì)各種皮膚創(chuàng)傷如手術(shù)創(chuàng)傷、燙傷、燒傷及潰瘍類皮膚損害，尤其是糖尿病引發(fā)的潰瘍有顯著治療效果。此外，本發(fā)明制備的膽提取物對(duì)胃潰瘍以及眼底出血也有明顯的治療效果。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3