本發(fā)明涉及含有通過配糖鍵與非糖化合物連接的糖基的化合物，具有涉及重樓皂苷VII，該化合物可用于制備抗肺癌的藥物。

背景技術(shù)：
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肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居于各類惡性腫瘤之首，已成為嚴(yán)重危害人類健康和生命的疾病之一。近年來，受各種因素的影響，全球各國肺癌的發(fā)病率和死亡率都明顯上升，而中國是世界上肺癌患者數(shù)量最多的國家。因此，尋求新的有效的肺癌治療藥物，進(jìn)一步提高臨床療效，己成為當(dāng)前迫切需要研究的問題。我國作為中草藥的聚集地，有著得天獨厚的優(yōu)勢，因此，從中草藥中尋找具有高效、低毒特點的抗腫瘤藥物是非常適宜的手段之一。

重樓(Rhizoma Paridis)是來源于百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖，在中醫(yī)中藥抗癌配方中的治療具有上千年的歷史,是抗癌中藥配方中的常用草藥。現(xiàn)代研究證明重樓的主要活性物質(zhì)是甾體皂苷，主要包括薯蕷皂苷和偏諾皂苷兩大類化合物，化合物重樓皂苷VII即是上述甾體皂苷中的一種，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式(Ⅰ)所示。

目前已發(fā)現(xiàn)重樓皂苷VII具有抗腫瘤、消炎、抑菌、止血等多種生物活性，但尚未見該化合物治療肺癌的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供重樓皂苷VII的新用途，即在制藥中的新應(yīng)用。

上述新用途實際上是，重樓皂苷VII在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述藥物由重樓皂苷VII和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，其中，重樓皂苷VII在藥物中的質(zhì)量百分含量為10％～50％。所述藥物可以是常見的口服制劑，如顆粒劑、片劑或膠囊劑。

本發(fā)明所述的重樓皂苷VII對肺癌細(xì)胞和動物移植瘤的生長具有良好的抑制作用，具體表現(xiàn)在：(1)在體外對A549和NCI-H1299肺癌細(xì)胞有很強(qiáng)的生長抑制作用；(2)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，并且對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白有明顯影響；(3)對體內(nèi)移植瘤有明顯的抑制作用。

附圖說明

圖1為重樓皂苷VII對肺癌細(xì)胞周期的阻滯情況的統(tǒng)計分析圖，圖的PVVII表示重樓皂苷VII。

圖2為重樓皂苷VII誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的統(tǒng)計分析圖，圖的PVVII表示重樓皂苷VII。

圖3為重樓皂苷VII對細(xì)胞凋亡和G2/M檢查點相關(guān)蛋白的影響的統(tǒng)計分析圖，圖的PVVII表示重樓皂苷VII。

具體實施方式

下述實施例1～5所用重樓皂苷VII購于成都曼斯特生物科技有限公司。

實施例1：重樓皂苷VII對體外肺癌細(xì)胞的抑制作用

取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，以3000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，棄去原有的培養(yǎng)基，然后按照設(shè)計的藥物濃度：重樓皂苷VII以0，0.78，1.56，3.12，6.25，12.5μM作用于A549和NCI-H1299細(xì)胞24，48，72h后停止培養(yǎng)；然后加入0.5mg/ml的MTT溶液，處理4h后，棄上清，最后加入150μl DMSO振蕩混勻，置于酶標(biāo)儀中測定其吸光度值(測定波長為570nm)。結(jié)果如表1所示，重樓皂苷VII可明顯抑制肺癌細(xì)胞A549和NCI-H1299的增殖，具有細(xì)胞毒作用，是一種腫瘤治療藥物(IC₅₀見表1)。

表1重樓皂苷VII對A549和NCI-H1299細(xì)胞的半數(shù)抑制率

實施例2：流式細(xì)胞儀分析重樓皂苷VII對肺癌細(xì)胞周期的影響情況

取對數(shù)生長期A549和NCI-H1299細(xì)胞，以2×10⁵/孔接種于六孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)基，加入重樓皂苷VII(0，1，2，4μM)，處理細(xì)胞24h后；用胰酶消化、收集細(xì)胞、離心、PBS清洗2次，再用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為75％乙醇溶液混懸細(xì)胞，密封保存后置于4℃冰箱過夜。次日，離心，PBS洗1次，接著每管細(xì)胞中加入500μl PBS溶液(含有25μlPI(1mg/ml)和0.5μl RNA酶(10mg/ml)，渦旋混勻，然后將細(xì)胞置于37℃避光孵育30min，充分混勻后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的分布情況，樣品于l h內(nèi)檢測完畢。結(jié)果如圖1所示，肺癌細(xì)胞經(jīng)重樓皂苷VII作用后，細(xì)胞的DNA的分布表現(xiàn)為G2/M期細(xì)胞比率增加。

實施例3：流式細(xì)胞儀檢測重樓皂苷VII的細(xì)胞凋亡情況

取對數(shù)生長期A549和NCI-H1299細(xì)胞，以2×10⁵/孔接種于六孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)基，加入重樓皂苷VII(0，1，2，4μM)處理細(xì)胞48h后，消化、收集細(xì)胞、離心、PBS清洗2次，倒掉上清液，用濾紙倒扣濾干；再用凋亡試劑盒中的l×Binding Buffer 100μl/Tube懸浮細(xì)胞，然后加入Annexin-FITC和PI各5μl/Tube，避光，室溫放置15min；最后再分別加入400μl/Tube的1×Binding Buffer，充分混勻后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況，樣品于1h內(nèi)檢測完畢。結(jié)果如圖2所示，肺癌細(xì)胞經(jīng)重樓皂苷VII作用后，細(xì)胞的凋亡率呈現(xiàn)劑量依賴性增加。

實施例4：Western blotting法檢測細(xì)胞凋亡和G2/M檢查點相關(guān)蛋白

重樓皂苷VII(0，1，2，4μM)I(0，0.5，1，2μM)分別與A549和NCI-H1299細(xì)胞共同孵育48h后，胰酶消化、收集細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，然后進(jìn)行蛋白定量。采用western blotting檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Fas，DR3，DR5，DcR3，PARP，Cleaved PARP，Cleaved Caspase-3，p53和phosphor-p53及G2/M檢查點相關(guān)蛋白Cyclin B1，p21Waf1/Cip1的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3所示，重樓皂苷VII能夠顯著性上調(diào)A549細(xì)胞中p53和p-p53的蛋白表達(dá)，下調(diào)了Cyclin B1和p21Waf1/Cip1的蛋白表達(dá)水平；而重樓皂苷VII能顯著性上調(diào)NCI-H1299細(xì)胞中p21Waf1/Cip1，下調(diào)Cyclin B1。另外，重樓皂苷VII上調(diào)A549和NCI-H1299 細(xì)胞中的Fas、DR3、DR5，PARP，Cleaved PARP和Cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平，降低DcR3的蛋白表達(dá)水平。

實施例5：建立裸鼠移植瘤模型研究重樓皂苷VII對移植瘤生長的影響

建立人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型：選用4到6周的雌性BALB/c nu/nu小鼠，將腫瘤細(xì)胞制成懸液，然后按照細(xì)胞數(shù)為2×10⁶/只接種于裸鼠的右側(cè)腋窩下。每周稱量2～3次體重和用游標(biāo)卡尺測量2～3次腫瘤的大小。然后按照以下公式計算腫瘤體積：Tumor Volume(TV)＝1/2×(L×W²)，其中L是腫瘤縱軸的長度，W是腫瘤橫軸的長度，并繪制裸鼠腫瘤的生長曲線。當(dāng)腫瘤的平均體積達(dá)到約100mm³時，將裸鼠隨機(jī)分為8個組，每組8只。按照如下方案給藥：空白對照組(0.9％生理鹽水)；重樓皂苷VII的高、中、低劑量組(4、3、2mg/kg)。裸鼠每周腹腔注射給藥5次，持續(xù)給藥4周。給藥結(jié)束后，處死裸鼠，然后取出腫瘤組織凍存于-80℃。部分腫瘤組織用RIPA裂解液裂解提取總蛋白，然后進(jìn)行蛋白定量。采用western blotting方法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白DR3，DR5，p53和G2/M檢查點相關(guān)蛋白Cyclin B1，p21Waf1/Cip1的表達(dá)情況。結(jié)果如下表2和圖3所示，重樓皂苷VII能夠顯著性抑制A549裸鼠移植瘤的生長，具有體內(nèi)抗腫瘤活性。

表2重樓皂苷VII處理4周后各組裸鼠體重變化、腫瘤體積生長曲線、腫瘤重量和抑瘤率(Mean±SD)