本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領域,具體涉及一種結合IGF-1C結構域多肽的活性可注射殼聚糖水凝膠的制備方法,還涉及這類材料作為干細胞載體材料應用于組織損傷修復,增強干細胞的治療效果.
背景技術:
以干細胞為基礎的細胞療法可以為組織損傷治療提供前景。干細胞具有自我更新和多向分化能力,可以通過轉分化、旁分泌等方式參與腎臟修復。相比于藥物,干細胞治療組織損傷的一大優(yōu)勢在于其多樣化的治療作用可以靶向腎臟損傷病理生理學的多種機制;內源性動員或外源性輸注的干細胞歸巢到受損腎臟,一方面轉分化為腎臟細胞直接補充丟失的小管上皮細胞,另一方面可以發(fā)揮促進增殖、減少凋亡、促進血管新生、減少炎癥和調節(jié)免疫反應等作用。但是,使用外源性干細胞治療組織損傷的過程中,遞送形式是一個挑戰(zhàn)。直接將細胞注射到組織損傷部位,很難發(fā)生整體的整合。經(jīng)脈管系統(tǒng)注射細胞需要避免其被其他器官俘獲,而且需要細胞具有定向遷移的能力。但在之前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)將干細胞直接注射到缺血損傷部位,1周后僅有~1%的細胞存活。這可能與細胞處于局部惡劣(缺血缺氧、炎癥、缺乏基質保護)的損傷環(huán)境有關。最近的研究顯示生物支架材料作為細胞載體在調節(jié)移植細胞在受損腎臟中的細胞命運方面體現(xiàn)出優(yōu)勢。利用生物材料釋放的細胞外基質與移植細胞相互作用可以改善局部微環(huán)境,增強細胞的生物學作用,并加快組織的修復和再生。殼聚糖(CS)作為一種天然大分子化合物,具有較好的組織相容性、生物可降解性及豐富的生物學活性。以CS為基礎的多種類型支架材料已經(jīng)在組織工程領域顯示出重要的應用價值。同時,許多研究人員重視利用遞送生長因子來增加組織工程化基質的生物活性。由于蛋白具有免疫原性和生物活性丟失快的缺陷,越來越多的研究支持 使用具有生物學功能的模擬活性多肽(如RGD,QK,QHREDGS)來替代生長因子(如纖維粘連蛋白、血管內皮生長因子、血管生成素-1)的功能。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是一種強大的促有絲分裂和細胞存活的生長因子,其被認為在調控臨床腎病恢復中發(fā)揮關鍵作用。有趣的是,最近的研究發(fā)現(xiàn)C結構域(IGF-1C)是IGF-1蛋白的活性區(qū)域,并且已經(jīng)證明這一多肽可以促進角膜上皮傷口愈合。從這一點上來看,將活性多肽IGF-1C修飾于大分子生物支架材料可能實現(xiàn)載體對移植細胞特定功能的增強,從而為組織損傷修復提供新的視角。
技術實現(xiàn)要素:
本發(fā)明提供了一種殼聚糖水凝膠,其特征在于,所述殼聚糖水凝膠結合了胰島素樣生長因子C結構域多肽(IGF-1C)。
本發(fā)明的殼聚糖水凝膠既具備殼聚糖生物材料的物理和化學性能,也具有胰島素樣生長因子C結構域多肽的生物活性。
本發(fā)明提供了上述殼聚糖水凝膠的制備方法,其包括:(1)胰島素樣生長因子C結構域多肽通過化學反應共價鍵結合到殼聚糖分子上;或者,(2)胰島素樣生長因子C結構域多肽通過物理混合結合到殼聚糖中。
在本發(fā)明的制備方法中,所述化學反應是點擊化學反應和/或縮合反應。
本發(fā)明的殼聚糖水凝膠具有不同的釋放胰島素樣生長因子C結構域多肽的行為。
本發(fā)明的殼聚糖水凝膠通過結合胰島素樣生長因子C結構域多肽方式來調控所述胰島素樣生長因子C結構域多肽的釋放行為。
本發(fā)明的殼聚糖水凝膠具有可注射性。
本發(fā)明的殼聚糖水凝膠在制備治療組織損傷的干細胞載體中的應用。
干細胞包括:脂肪間充質干細胞、骨髓間充質干細胞、臍帶間充質干細胞、胎盤間充質干細胞、尿液來源干細胞、內皮祖細胞、心臟干細胞。
組織損傷包括腎臟損傷、心肌梗死以及皮膚缺損。
本發(fā)明提供一種結合IGF-1C多肽的生物活性殼聚糖水凝膠的制備方法。
1.IGF-1C結構域多肽的制備方法:
(1)第一個氨基酸的C端接枝在樹脂上,接載率為0.6毫摩爾/克。20%的哌啶溶于N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)用于脫除氨基的Fmoc保護基團;
(2)在縮合劑O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽(BTU)和催化劑N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)的共同作用下,下一個氨基酸的羧基與游離的氨基結合;重復以上步驟,多肽鏈會不斷增長;
(3)最后將分別將疊氮化的己酸或二元酸(丁二酸、己二酸、癸二酸)連接到多肽的氨基上;
(4)用一定體積的DMF反復沖洗連有多肽的樹脂(5分鐘,5次),之后再用DCM沖洗(1分鐘,3次);用三氟乙酸(TFA)處理干燥的樹脂,將多肽從樹脂上脫離,轉移進入TFA溶液;
(5)收集溶液旋干,得到濃縮溶液;用冰凍乙醚處理,離心,得到沉淀;
(6)將沉淀溶于二甲基亞砜(DMSO),使用高效液相色譜純化得到IGF-1C,及末端帶有疊氮或羧基的多肽產(chǎn)物IGF-1C-N3或IGF-1C-COOH。
2.通過點擊化學反應共價結合IGF-1C多肽的殼聚糖的制備方法:
碳二亞胺碳二亞胺鹽酸鹽催化下冰浴中反應24小時,從而通過酰胺化反應將炔基接枝到殼聚糖分子側基上,產(chǎn)物經(jīng)透析純化。第二步是通過點擊化學反應將碳二亞胺鹽酸鹽催化下冰浴中反應24小時,從而通過酰胺化反應將炔基接枝到殼聚糖分子側基上,產(chǎn)物經(jīng)透析純化。第二步是通過點擊化學反應將IGF-1C-N3與炔基化殼聚糖反應,采用無水硫酸銅、抗壞血酸鈉做催化劑,恒溫37℃攪拌反應24小時,產(chǎn)物經(jīng)水透析3天,冷凍干燥得CS-IGF-1C。
3.通過縮合反應共價結合IGF-1C多肽的殼聚糖的制備方法:
碳二亞胺碳二亞胺鹽酸鹽催化下冰浴中反應24小時,從而通過酰胺化反應將炔基接枝到殼聚糖分子側基上,產(chǎn)物經(jīng)透析純化。碳二亞胺鹽酸鹽催化下冰浴中反應24小時,從而通過酰胺化反應將炔基接枝到殼聚糖分子側基上,產(chǎn)物經(jīng)透析純化。
4.共價結合IGF-1C的殼聚糖水凝膠的制備:
(1)將CS-IGF-1C以一定濃度(質量體積分數(shù)1-5%)溶解在水中;
(2)β-甘油磷酸鈉(β-GP)溶液滴加到殼聚糖溶液中,冰水浴條件下攪拌0.5小時;
(3)混合溶液轉移至37℃恒溫箱中,即可見凝膠化;
(4)混合溶液中β-GP終濃度為0.005-0.05M。
5.物理混合IGF-1C的殼聚糖水凝膠的制備:
(1)將殼聚糖以一定濃度(質量體積分數(shù)1-5%)溶解到醋酸(1-3%)溶液中,室溫,過夜;
(2)調節(jié)溶液pH值至中性,加入一定比例的IGF-1C多肽(多肽質量分數(shù)1-5%),混合均勻;
(3)將β-甘油磷酸鈉(β-GP)溶液滴加到殼聚糖溶液中,冰水浴條件下攪拌0.5小時;
(5)混合溶液轉移至37℃恒溫箱中,5分鐘即可見凝膠化;
(6)混合溶液中β-GP終濃度為0.005-0.05摩爾/升。
本發(fā)明提供了利用結合IGF-1C多肽的活性水凝膠負載干細胞及細胞示蹤的方法。
1.脂肪間充質干細胞(ADSCs)提取與培養(yǎng)
(1)準備:將手術器械(彎頭鑷子2把,眼科剪2把)用紗布包好滅菌,后置于烘箱中烘干;無血清培養(yǎng)基(PS)一管;
(2)選取3~4只10周齡雄性小鼠,體重20克以上最佳,利用脫頸的方法將小鼠處死;
(3)用酒精均勻噴灑小鼠腿部以及腹部毛發(fā),用無菌的彎鑷 提起小鼠表皮,用無菌眼科剪小心分離小鼠皮膚和皮下肌肉組織;
(4)在小鼠大腿的根部有淡粉色的脂肪組織,用剪刀仔細剝離并剪下,置于無血清培養(yǎng)基中暫時保存;
(5)沿小鼠腹中線剪開小鼠的腹部肌肉層,打開其腹腔,在小鼠附睪附近,分布有兩大塊白色脂肪組織,輕輕剝離去其它組織并將脂肪組織剪下暫時保存在無血清培養(yǎng)基中;
(6)將盛有脂肪組織的離心管噴勻酒精充分消毒后,移入超凈臺中,將脂肪組織倒入無菌培養(yǎng)皿中,輕輕搖晃以洗滌脂肪組織;
(7)用無菌彎頭鑷將脂肪組織轉移至一個新的盛有無菌PBS的培養(yǎng)皿中,輕輕轉動培養(yǎng)皿洗滌脂肪組織。如此反復再洗滌脂肪組織3次。本步驟意在盡量去除小鼠毛發(fā)以及組織內的細菌;
(8)最后一遍洗滌后,將脂肪組織轉移至新培養(yǎng)皿中(無PBS),用無菌眼科剪將脂肪組織盡量剪碎(本步驟利于后期酶的消化);
(9)用無血清培養(yǎng)基重懸剪碎了的脂肪組織,轉移至50毫升離心管中,不加培養(yǎng)基使總體積達到35毫升,在1500轉/分的條件下離心5分鐘;
(10)離心后,將液體用離心管小心吸棄,保留漂浮在液面上及沉淀在底部的脂肪組織,后加入無菌的20毫升0.075%的Ⅰ型膠原酶溶液,用封口膜密封離心管,在37℃水浴搖床上消化1小時;
(11)消化結束后,補加培養(yǎng)基至總體積為45毫升,在1000轉/分鐘條件下離心5分鐘;
(12)棄掉上清,用45毫升的培養(yǎng)基再次洗滌細胞沉淀,后棄上清;
(13)用10毫升ADSCs培養(yǎng)基重懸細胞沉淀,并鋪于10厘米細胞培養(yǎng)盤中;
(14)鋪盤后第三天給細胞換半液,第四天換全液,以后每三天換一次全液,直至細胞長滿,此時的ADSCs即為原代(P0)細胞;
(15)ADSCs長至90%以上時可以傳代,傳代時先吸棄培養(yǎng)基,后用PBS清洗殘余的培養(yǎng)基,然后再加入2毫升胰酶-乙二胺四乙酸溶 液,細胞培養(yǎng)箱孵育4分鐘,用AD-MSCs培養(yǎng)基中和胰酶,于1000轉/分鐘離心,重懸沉淀后分盤。通常的傳代比例為1:3。
(16)ADSCs的凍存:將生長良好的P1代細胞,經(jīng)消化后,用PBS液洗滌2次,用凍存液(含90%的全血清+10%DMSO)重懸細胞,逐滴加入凍存管中,放入4℃冰箱預冷l0分鐘,隨后轉移至凍存盒中放置于-80℃冰箱凍存48小時以上,最后沉入液氮中長期保存。凍存細胞濃度為l-5×106/毫升。
(17)ADSCs的復蘇:將凍存細胞從液氮取出,置入37℃水浴中1-3分鐘,待細胞完全解凍,用DMEM培養(yǎng)液稀釋離心,棄上清,使沉淀重新懸浮于培養(yǎng)液中,按2×105/毫升接種于T75細胞培養(yǎng)瓶。
(18)ADSCs的表型鑒定:將P3的ADSCs按上述方法消化,離心后用PBS重懸計數(shù),后向每個炮彈管中分裝含有約15萬個細胞的細胞懸液;再次離心細胞(1000轉/分鐘),收集沉淀,用30微升的含有1%FBS的PBS重懸細胞沉淀,向各管中加入1微升的相應的流式抗體(CD45、CD31、CD44、CD29、CD90.2以及Sca-1),冰上孵育30分鐘,期間經(jīng)常輕晃炮彈管,以防細胞沉淀;染色結束后,每管中加入1毫升的PBS溶液充分混勻后離心;離心結束后棄上清,再次重復洗滌3次;最后一次洗滌結束棄上清后,用300微升的PBS重懸細胞,用流式網(wǎng)過濾后轉移至流式管中避光保存,24小時內上機分析;以進行任何染色的ADSCs進行空白對照,利用流式細胞儀分析各抗體的陽性百分率。
2.體內化學發(fā)光成像評價
(1)經(jīng)腹腔注射水合氯醛(4%,350毫克/千克)麻醉小鼠;
(2)向小鼠經(jīng)腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin(150毫克/千克);
(3)底物注射5分鐘后,將小鼠放入小動物活體成像系統(tǒng)暗箱內,擺放好體位(俯臥位),將其頭部對準暗箱內出氣孔;
(4)根據(jù)熒光信號強度調整曝光時間,一般為0.5-2分鐘,連續(xù)采集圖像直到信號強度開始下降;
(5)數(shù)據(jù)分析:使用Living Image軟件測定每只小鼠的熒光信號 強度,進行統(tǒng)計學分析。
本發(fā)明提供了一種利用活性水凝膠負載脂肪間充質干細胞治療缺血性腎臟損傷、心肌梗死以及皮膚缺損的方法。
1.急性腎臟損傷及細胞治療
(1)高壓消毒手術器械,使用醫(yī)用酒精消毒手術臺區(qū)域;
(2)經(jīng)腹腔注射水合氯醛(4%,350毫克/千克)麻醉小鼠,于背部中部、脊柱左側0.2厘米處縱行切開皮膚(0.8-1厘米),分離皮下結締組織,離斷背部肌肉進入腹腔,探查并暴露左腎,可見正常腎臟呈現(xiàn)鮮紅色;
(4)用尖鑷游離腎周脂肪及筋膜,向左側輕輕牽拉腎臟暴露腎蒂,使用微型血管夾略靠近腎臟夾閉腎蒂,約1分鐘可見腎臟出現(xiàn)淤血呈紫黑色;
(5)腎臟缺血期間,使用浸沾溫生理鹽水的紗布覆蓋切口并保持紗布濕潤,小鼠上方暖燈照射并保持加熱墊溫度(37℃)恒定;
(6)缺血40分鐘后移除血管夾,肉眼可見腎臟顏色即刻變?yōu)榧t色,使用4-0絲線逐層縫合肌層和皮膚關閉背部切口;
(7)將小鼠置于加熱墊上復溫,待蘇醒后放回飼養(yǎng)籠。
在腎臟缺血再灌注后(對于重度損傷模型,在對側腎臟切除術后),即刻行左腎內遞送細胞或水凝膠。
(8)使用鑷子將腎臟輕輕提拉到體外,用細棉條或紗布條包裹并固定腎臟,防止其掉回腹腔內;
(9)使用胰島素注射器(300微升規(guī)格)吸取輸送介質(PBS或水凝膠,30微升)負載的細胞(106ADSCs),于腎臟上極、中部和下極三個部位輕輕刺入腎臟實質(深度約3毫米),緩慢輕推注射器(10微升/部位),同時觀察小鼠的呼吸頻率;
(10)注射完成后,緩慢拔除注射器,同時使用棉球按壓進針處腎臟組織止血1分鐘。
2.治療心肌梗死模型(冠狀動脈左前降支永久結扎)建立及細胞-水凝膠移植:
(1)小鼠麻醉:用5%的異氟烷氣體預麻小鼠,用醫(yī)用膠帶固定小鼠的四肢和頭部于手術板上,剪開頸部氣管,氣管插管后接通麻醉呼吸機正壓通氣,調節(jié)異氟烷的含量約為1%-1.5%,呼吸頻率為120次/分鐘;
(2)胸部備皮,用醫(yī)用酒精和碘伏進行消毒;
(3)行胸廓切開術,于第四肋間處開胸并暴露心臟,仔細撕開心包膜暴露小鼠左心室前壁;
(4)左冠狀動脈起始端的下方距離左心耳約1毫米處,用7-0的縫合線結扎冠狀動脈左前降支(以結扎點下方心肌的顏色變淺發(fā)白或出現(xiàn)紫黑色且心電圖(electrocardiogram,ECG)檢測顯示心肌電ST段抬高為結扎成功的標志;
(5)結扎成功后于結扎位點左下、右下各1毫米處分別注射10微升生理鹽水、細胞生理鹽水懸液、水凝膠或凝膠-ADSCs復合物;
(6)關胸,縫合肌肉和皮膚,傷口用碘伏再次消毒,妥善飼養(yǎng)。
(7)假手術對照組:開胸,穿線不接扎不移植任何細胞或溶液,后關胸縫合肌肉。
3.真皮層全層皮膚損傷模型的建立及細胞-水凝膠移植:
(1)裸鼠腹腔內注射4%水合氯醛進行全身麻醉。
(2)麻醉效果滿意后,75%酒精消毒裸鼠背部皮膚3遍。
(3)用眼科剪剪除全層裸鼠皮膚及肉膜,暴露肌肉層,制備出面積為l.0平方厘米的皮膚缺損區(qū)域。
(4)IV3000無菌不透水傷口敷料覆蓋創(chuàng)面,貼膜邊緣用傷口粘合劑點附于裸鼠背部皮膚。
(5)術后裸鼠單籠飼養(yǎng),自第3天起每隔2天更換創(chuàng)面敷料。
(6)水凝膠-ADSCs以1×106/毫升的密度接種于水凝膠中,各個實驗組每只裸鼠注射200微升生理鹽水(不治療組)、細胞生理鹽水懸液(單純細胞組)、水凝膠-ADSCs(對照水凝膠與細胞組)、水凝膠。
(7)術后大體觀測及愈合曲線測定,每天觀察并記錄各組裸鼠的精神狀態(tài)、進食飲水情況、活動力、大小便情況。
(8)術后每隔2天(術后第3、6、9、l2天)麻醉后首先行活體成像檢測,然后去除傷口敷料、仔細清除創(chuàng)面滲出物、痂皮,觀察創(chuàng)面有無感染、創(chuàng)面愈合情況,并進行創(chuàng)面拍照同時以透明薄膜描印創(chuàng)面。
(9)拍照后,創(chuàng)面重新用IV3000無菌不透水傷口敷料貼膜覆蓋,貼膜邊緣用傷口粘合劑點附于裸鼠背部皮膚。使用Image J軟件分析各組術后第3、6、9、l2天殘留創(chuàng)面面積,并繪制愈合曲線。
本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果:
我們使用IGF-1C修飾的水凝膠負載ADSCs通過直接注射的方式移植到損傷組織,觀察到組織學和功能學的恢復。這種治療手段可以在早期顯著增強存活的組織細胞增殖,并在晚期通過結合IGF-1C的水凝膠與ADSCs的相互作用增加水凝膠注射區(qū)域和臨近部位的細胞增殖而建立有益的局部微環(huán)境;水凝膠和細胞的聯(lián)合移植還能夠通過抑制Bax表達而減少損傷后早期腎臟細胞凋亡。該水凝膠具有有效的治療作用、無毒副作用、損傷小、適合長期應用。
附圖說明
圖1表示天然人源胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的氨基酸序列以及本發(fā)明合成的C結構域多肽;
圖2表示通過點擊化學反應合成共價結合IGF-1C的殼聚糖(CS-IGF-1C)的步驟;
圖3表示不同濃度CS-IGF-1C水凝膠對于脂肪間充質干細胞體外活性的影響;
圖4A和B表示生物發(fā)光成像檢測CS-IGF-1C水凝膠對脂肪間充質干細胞體外增殖能力的影響;
本發(fā)明結合附圖和具體實施方式做進一步詳細說明。這些實施例用來更具體地闡述本發(fā)明,并且如所附權利要求書提出的本發(fā)明的范圍不限于實施例或受實施例的限制。
具體實施方式
實施例1:IGF-1C修飾殼聚糖(CS)獲得CS-IGF-1C的制備
IGF-1C多肽的固相合成
IGF-1C多肽通過成熟的固相合成(SPPS)步驟,使用2-chlorotrityl chloride樹脂和側鏈被tert-buty基團保護且氨基被Fmoc保護的氨基酸合成。步驟為:
1.第一個氨基酸的C端接枝在樹脂上,接載率為0.6毫摩爾/克。20%的哌啶溶于N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)用于脫除氨基的Fmoc保護基團;
2.在縮合劑小時BTU和催化劑DIPEA的共同作用下,下一個氨基酸的羧基與游離的氨基結合;重復以上步驟,多肽鏈會不斷增長;
3.疊氮化己酸的合成:6-溴己酸乙酯與疊氮化納在DMF中反應,之后用氫氧化鈉處理,得到疊氮化的己酸;
4.最后將上一步的疊氮化己酸用同樣的步驟連接到多肽的氨基上;
5.用一定體積的DMF反復沖洗連有多肽的樹脂(5分鐘,5次),之后再用DCM沖洗(1分鐘,3次);
6.用TFA處理干燥的樹脂,將多肽從樹脂上脫離,轉移進入TFA溶液;
7.收集溶液旋干,得到濃縮溶液;用冰凍乙醚處理,離心,得到沉淀;
8.將沉淀溶于DMSO,使用高效液相色譜純化得到帶疊氮的多肽產(chǎn)物。
炔基取代的殼聚糖(alkynyl-CS)的合成
1.將CS溶解于蒸餾水中,向其中加入戊炔酸,利用1摩爾/升鹽酸(HCL)和1摩爾/升氫氧化鈉(NaOH)溶液調節(jié)pH值使CS完全溶解;
2.將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,按照EDC:戊炔酸=3:1的比例)加入CS溶液中(每半個小時加1次,共3次),期間冰?。?/p>
3.在室溫中反應24小時;
4.對產(chǎn)物進行透析(5毫摩爾/升HCl和1wt%NaCl,2天;3毫摩爾/升HCl,1天;1毫摩爾/升HCl,2天;去離子水,3天,4℃);
5.凍干獲得終產(chǎn)物。
CS-IGF-1C的合成
利用點擊化學(“click”反應)合成CS-IGF-1C,步驟如下:
1.在氮氣保護條件下,用去離子水(10毫升)溶解炔基取代-CS。
2.點擊反應條件:IGF-1-N3:CuSO4:抗壞血酸鈉的進料摩爾比為1:0.2:0.4。
3.在37℃條件下,反應24小時;
4.使用去離子水透析3天;
5.通過凍干獲得CS-IGF-1C材料;
IGF-1是70個氨基酸組成的單鏈多肽,含A、B、C和D 4個結構域(圖1)。CS-IGF-1C是通過對IGF-1C-N3的疊氮和炔基化殼聚糖的炔烴進行點擊反應而合成的。首先,使用固相Fmoc-氨基酸化學法合成IGF-1的C結構域的序列(GYGSSSRRAPQT)。然后,利用縮合反應將6-疊氮基己酸連到C結構域的N-端獲得IGF-1C-N3(N3-GYGSSSRRAPQT)。而后,通過CS和4-戊炔酸的縮合反應合成炔基化殼聚糖。最后,利用點擊反應合成CS-IGF-1C復合物(圖2)。向CS-IGF-1C溶液中加入β-GP制備成可注射的水凝膠。利用FT-IR光譜儀檢測證明CS-IGF-1C復合物化學結構中具有alkynyl-CS所不具備的官能團結構。
實施例2:CS-IGF-1C水凝膠的制備及性能評價
CS-IGF-1C水凝膠的制備
(1)使用醋酸(0.1摩爾/升)溶解CS-IGF-1C(1.5%,w/v),室溫,過夜;
(2)使用蒸餾水在透析膜(截留分子量為8kDa–10kDa)中對CS溶液進行透析,1周,去除殘余的醋酸;
(3)通過凍干獲得CS-IGF-1C鹽酸鹽;
(4)將冰浴的β-GP溶液(2.29摩爾/升)滴加到CS溶液中,冰浴條件下攪拌0.5小時;
(5)混合溶液轉移至37℃恒溫箱中,5分鐘即可見凝膠化;
(6)混合溶液中β-GP終濃度為0.023摩爾/升,經(jīng)透析CS-IGF-1C/β-GP溶液的pH值為7.2。
掃描電子顯微鏡觀察水凝膠形貌
將水凝膠凍干后,放入干燥機中干燥24小時,使用場致發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察CS和CS-IGF-1C水凝膠的表面形態(tài)和多孔結構(加速電壓為10千伏,觀察前材料表面噴金處理)。
水凝膠流變學特性測試
(1)流變測試使用AR 2000ex(TA instrument)流變儀完成,使用25毫米不銹鋼平板圓盤夾具,夾具間隙400微米,溫度設定為25℃。每個樣品每次測試需要1毫升溶液。
(2)將CS溶液(含有0.023Mβ-GP,p小時值為7.2)和CS-IGF-1C溶液(含有0.023摩爾/升β-GP,p小時值為7.12)加入到流變儀中,在10℃-50℃的溫度范圍內測量樣品的流變學特性。
(3)測試并記錄水凝膠彈性模量(儲能模量)(G’)和粘性模量(損耗模量)(G”)隨溫度變化的改變情況,頻率為1弧度/秒。
(4)使用相位滯后(δ)來確定G’和G”相等時的成膠溫度。在恒定加熱速率(1℃/分鐘)的情況下改變溫度。
利用SEM觀察凍干水凝膠的形態(tài)特征,發(fā)現(xiàn)兩種水凝膠均具有均質互通的多孔網(wǎng)狀結構,孔徑大小為50微米-100微米,足夠用于干細胞遞送。比較兩種生物材料隨溫度變化的流變學性質。隨著溫度從10℃增至50℃,CS-IGF-1C/β-GP和CS/β-GP均顯示出儲能模量(G’)的顯著增加,提示從溶液狀態(tài)向凝膠狀態(tài)轉變的相變過程。CS-IGF-1C/β-GP的成膠溫度為35℃-36℃,與CS/β-GP相似,提示CS-IGF-1C/β-GP也適合于在正常體溫條件下,在體內原位成膠。
實施例3:CS-IGF-1C的生物相容性
CCK-8染色
我們將材料或水凝膠涂布于96孔板(5微升/孔),將孔板放置于溫箱(37℃)孵育30分鐘(而后直接使用或于4℃儲存)。一方面,為了評價不同濃度CS-IGF-1C材料對于細胞活性的影響,將材料按照1%、1.5%、3%、5%和10%的梯度涂布于孔板培養(yǎng)ADSCs,24小時后進行CCK-8染色。另一方面,為了比較CS-IGF-1C和CS水凝膠對于細胞增殖的影響,將兩種水凝膠(濃度為3%)涂布于孔板培養(yǎng)ADSCs,24小時后進行CCK-8染色。細胞均按照3×104/孔的濃度鋪盤(4孔/組)。具體染色方法如下:
1.配制CCK-8染色液(按照CCK-8原液:完全培養(yǎng)基=1:9進行稀釋);
2.吸出培養(yǎng)基;
3.每孔加入100微升染色液,將孔板放入溫箱(37℃)孵育4小時;
4.吸出上清(100微升)并轉移到新的孔板中;
5.使用酶標儀檢測(吸光度)OD 450值;
細胞活死染色
如前述方法在96孔板中涂布CS或CS-IGF-1C水凝膠,將ADSCs按照3×104/孔的濃度鋪盤(4孔/組)。在培養(yǎng)后不同時間點,進行活死染色評價細胞的活力。具體步驟為:
1.配制染色劑(按照1:1000稀釋):乙錠二聚體-1(Etidium Homodimer-1)和鈣綠素-AM(calcein-AM)各取1微升加入到1毫升基本培養(yǎng)基或PBS中。
2.吸去培養(yǎng)基,輕輕加入PBS洗滌(100微升,2次)。
3.每孔加入100微升染色劑,將孔板放入溫箱(37℃)孵育30分鐘。
4.直接置于倒置熒光顯微鏡下觀察,活細胞被鈣綠素-AM染成綠色,死細胞被乙錠二聚體-1染成紅色。拍照、計數(shù)活細胞所占比例并進行統(tǒng)計分析。
為了評價CS-IGF-1C材料的細胞相容性,按照濃度梯度將其涂布于孔板培養(yǎng)ADSCs,24小時后行CCK-8染色。發(fā)現(xiàn)3%濃度的材料組細胞的活性最優(yōu),且為普通培養(yǎng)條件下的3倍(p<0.05)。(圖3)。體外培養(yǎng)7天、14天、21天,各組活細胞比例均>80%。這說明體外長期培養(yǎng)情況下,CS-IGF-1C和CS水凝膠沒有細胞毒性。
實施例4:CS-IGF-1C水凝膠促進ADSCs體外增殖并增強其抗凋亡能力
體外細胞生物發(fā)光成像
1.使用P3代生長狀態(tài)良好的ADSCs,胰酶消化后使用α-MEM完全培養(yǎng)基重懸。
2.向不同條件(未處理、CS涂布、CS-IGF-1C涂布)預處理的96孔板的每個孔中分別加入一定濃度的(3000細胞/孔)細胞懸液。
3.將細胞置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),24小時后,棄上清,PBS洗1次。
4.向每個孔加入預先使用PBS溶液1:100稀釋的Fluc的底物(D-Luciferin)20微升覆蓋孔板底部。立即將孔板置入小動物活體成像系統(tǒng)暗箱內,曝光1秒鐘。
5.數(shù)據(jù)分析:使用Living Image軟件測定每孔細胞的熒光信號強度。
利用BLI技術評價水凝膠對于ADSCs增殖的影響,當ADSCs培養(yǎng)于CS-IGF-1C處理的孔板時,細胞增殖速度明顯高于其他培養(yǎng)條件(p<0.05)(圖4)。此外,使用實時定量RT-PCR檢測增殖相關基因表達情況,結果顯示相比于其他培養(yǎng)條件,在CS-IGF-1C涂布孔板上培養(yǎng)的ADSCs中IGF-1、HGF和EGF基因表達急劇上升(p<0.05)。在體外利用H2O2對在不同條件下(未涂布材料組、CS涂布組和CS-IGF-1C涂布組)培養(yǎng)的ADSCs誘導損傷,評價CS-IGF-1C水凝膠是否對凋亡細胞具有保護作用。使用BLI技術檢測細胞存活情況使用實時定量RT-PCR評價凋亡相關基因(Bax/Bad、Caspase-9/-3和Fas/Fasl)的表達水平。結果顯示,CS-IGF-1C水凝膠涂布組細胞凋亡明顯減輕,且凋亡基因的表達急劇降低(p<0.05)。
實施例5:CS-IGF-1C水凝膠促進ADSCs體內存活和增殖
對8-10周齡FVB雄性小鼠誘導單側急性腎臟缺血再灌注損傷。根據(jù)動物接受治療類型進行分組(每組30只):Sham組(假手術組,僅進行腎臟探查,不經(jīng)受損傷和治療);PBS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射30微升PBS);CS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射30微升CS水凝膠);ADSCs組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射溶于30微升PBS的106ADSCs);ADSCs/CS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射溶于30微升CS水凝膠的106ADSCs);ADSCs/CS-IGF-1C組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射溶于30微升CS-IGF-1C水凝膠的106ADSCs)。
急性腎臟損傷模型
急性腎臟損傷及細胞治療
(1)經(jīng)腹腔注射水合氯醛(4%,350毫克/千克)麻醉小鼠,于背部中部、脊柱左側0.2厘米處縱行切開皮膚(0.8-1厘米),分離皮下結締組織,離斷背部肌肉進入腹腔,探查并暴露左腎,可見正常腎臟呈現(xiàn)鮮紅色;
(2)用尖鑷游離腎周脂肪及筋膜,向左側輕輕牽拉腎臟暴露腎蒂,使用微型血管夾略靠近腎臟夾閉腎蒂,約1分鐘可見腎臟出現(xiàn)淤血呈紫黑色;
(3)腎臟缺血期間,使用浸沾溫生理鹽水的紗布覆蓋切口并保持紗布濕潤,小鼠上方暖燈照射并保持加熱墊溫度(37℃)恒定;
(4)缺血40分鐘后移除血管夾,肉眼可見腎臟顏色即刻變?yōu)榧t色,使用4-0絲線逐層縫合肌層和皮膚關閉背部切口;
(5)將小鼠置于加熱墊上復溫,待蘇醒后放回飼養(yǎng)籠。
重度腎臟損傷模型
(1)麻醉小鼠,并行左側腎臟缺血再灌注損傷,方法同上;
(2)缺血損傷期間,用同樣方式切開右側背部皮膚,分離皮下組織和肌肉,探查并暴露右腎;
(3)游離腎周組織后,使用尖鑷分離出右輸尿管,使用6- 0絲線(靠近腎臟)雙結結扎腎蒂,同時注意保護輸尿管,并切除腎臟;
(4)必要時,使用棉簽吸凈腹腔內血性滲出物,查無明顯出血逐層縫合。
在腎臟缺血再灌注后(對于重度損傷模型,在對側腎臟切除術后),即刻行左腎內遞送細胞或水凝膠。
細胞/水凝膠/PBS遞送方法
在腎臟缺血再灌注后(對于重度損傷模型,在對側腎臟切除術后),即刻行左腎內遞送細胞或水凝膠。
(1)使用鑷子將腎臟輕輕提拉到體外,用細棉條或紗布條包裹并固定腎臟;
(2)使用胰島素注射器(300微升規(guī)格)吸取輸送介質(PBS或水凝膠,30微升)負載的細胞(106ADSCs),于腎臟上極、中部和下極三個部位輕輕刺入腎臟實質(深度約3毫米),緩慢輕推注射器(10微升/部位),同時觀察小鼠的呼吸頻率;
(3)注射完成后,緩慢拔除注射器,同時使用棉球按壓進針處腎臟組織止血1分鐘。
為了評價腎臟功能學變化,我們對雄性FVB小鼠(每組10只)誘導重度腎臟損傷模型,即單側腎臟缺血再灌注損傷加對側腎臟切除術。
小動物活體生物發(fā)光成像
1.經(jīng)腹腔注射水合氯醛(4%,350毫克/千克)麻醉小鼠;
2.向小鼠經(jīng)腹腔注射螢火蟲熒光素酶底物D-Luciferin(150毫克/千克);
3.底物注射5分鐘后,將小鼠放入小動物活體成像系統(tǒng)暗箱內,擺放好體位(俯臥位),將其頭部對準暗箱內出氣孔;
4.根據(jù)熒光信號強度調整曝光時間,一般為0.5-2分鐘,連續(xù)采集圖像直到信號強度開始下降;
5.數(shù)據(jù)分析:使用Living Image軟件測定每只小鼠的熒光信號強度,進行統(tǒng)計學分析。
腎臟冰凍切片免疫染色
1.將切片從-20℃冰箱中取出,室溫放置30分鐘;
2.將切片放入(-20℃預冷30分鐘的)丙酮原液中固定10分鐘;
3.將切片置于空氣中干燥30分鐘;
4.使用PBS洗滌切片(5分鐘,2次);
5.破膜:0.1%Triton X-100,室溫,10分鐘;PBS洗滌,5分鐘,2次;
6.血清封閉,4℃,45分鐘;
7.加一抗,4℃,過夜;
8.次晨復溫,1小時;PBS洗滌,5分鐘,4次;
9.加二抗(避光),室溫,2小時;PBS洗滌,5分鐘,5次;
10.DAPI封片,熒光顯微鏡下觀察,拍照。
為了評價CS-IGF-1C促進細胞存活的作用,在損傷后不同時間點,利用BLI技術縱向追蹤注射到受損腎臟中ADSCsFluc-GFP的存活情況。結果顯示,在全部時間點,ADSCs/CS-IGF-1C組的信號顯著高于ADSCs/CS組(p<0.05)這說明與未修飾的CS水凝膠相比,CS-IGF-1C水凝膠更有利于改善局部遞送的細胞存活。此外,免疫染色的結果也證實了CS-IGF-1C水凝膠對移植細胞的保護作用。同時,免疫染色發(fā)現(xiàn)CS-IGF-1C水凝膠能夠促進ADSCs的增殖。
實施例6:CS-IGF-1C水凝膠增強ADSCs促血管新生作用
VEGF-R2轉基因小鼠評價血管新生
為了評價水凝膠能否增強細胞在體內促進血管新生作用,我們對VEGF-R2轉基因小鼠誘導急性缺血再灌注損傷并進行細胞治療(方法如前所述)。分組(每組6只):S小時am組(假手術組,僅進行腎臟探查,不經(jīng)受損傷和治療);PBS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射30微升PBS);CS組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射30微升CS水凝膠);ADSCs組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射溶于30微升PBS的106ADSCs);ADSCs/CS組 (經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射溶于30微升CS水凝膠的106ADSCs);ADSCs/CS-IGF-1C組(經(jīng)受腎臟損傷+腎內注射溶于30微升CS-IGF-1C水凝膠的106ADSCs)。移植的細胞為:從同品系野生型C57BL/6J分離培養(yǎng)的ADSCs。在損傷后不同時間點,使用BLI技術(方法如前所述)評價VEGF-R2基因的表達。
免疫染色方法見實施例5
為了闡明CS-IGF-1C水凝膠增強ADSCs促血管新生效應的機制,對表達VEGF-R2-Fluc轉基因小鼠誘導腎臟缺血損傷模型,接受同品系小鼠來源的ADSCs的移植治療(并根據(jù)治療方式進行分組)。損傷后不同時間點,使用BLI技術實時監(jiān)測血管生成,比較各種治療方式促進VEGF-R2基因表達的情況。結果顯示,接受ADSCs/CS-IGF-1C共同移植的小鼠腎臟VEGF-R2的表達顯著高于接受其他治療的動物(p<0.05)。細胞移植后3天,利用CD31染色評價腎臟血管新生情況,發(fā)現(xiàn)ADSCs/CS-IGF-1C組毛細血管數(shù)量顯著高于其他組(p<0.05)。此外,評價體外培養(yǎng)不同條件下,ADSCs中血管新生相關基因表達情況,發(fā)現(xiàn)CS-IGF-1C水凝膠處理能顯著上調基因的表達(p<0.05)。
實施例7:CS-IGF-1C和ADSCs共同移植增強腎臟細胞增殖并減少凋亡
免疫染色方法見實施例5
在損傷后3天,使用PCNA和TUNEL染色評價細胞聯(lián)合水凝膠治療對腎小管上皮細胞增殖和凋亡的影響。結果顯示,ADSCs/CS-IGF-1C共同移植能最大程度地增加腎臟小管上皮增殖細胞的數(shù)量并減少細胞凋亡(p<0.05)。
實施例8:CS-IGF-1C和ADSCs共同移植加速腎臟組織和功能學修復
過碘酸希夫(PAS)染色
1.脫蠟:二甲苯I、II,各10分鐘;風干,10分鐘;
2.至水:99%乙醇I、II,各5分鐘;95%、90%、80%乙醇,各5分鐘;
3.清水洗滌,5分鐘;
4.滴加高碘酸,氧化10分鐘。清水洗滌,5分鐘;
5.滴加Schiff液(1分鐘),目測變紅即終止;清水洗,2-3分鐘;
6.Harris蘇木素染核,2-3分鐘;清水洗,5分鐘;
7.鹽酸-乙醇分化1秒;清水洗,5分鐘;
8.脫水:70%、80%、90%、95%乙醇3秒,99%乙醇5分鐘,2次;風干5分鐘;
9.透明:二甲苯I、II,各5分鐘;風干,5鐘;
10.中性樹膠封片后顯微鏡下觀察,染色陽性物質呈紫紅色,細胞核為藍色。
腎臟功能學檢測
在腎臟重度損傷(單側40分鐘缺血再灌注損傷+對側腎臟切除)后,于不同時間點(2、4、7、10、14和28天)采集小鼠外周血行腎功能檢測(每組10只)。外周血的采集主要使用球后靜脈叢采血法,具體步驟如下:
1.使用水合氯醛(4%,350毫克/千克)經(jīng)腹腔注射麻醉小鼠;
2.左手拇指、食指壓迫小鼠一側眼眶后側皮膚暴露眼球;
3.右手持肝素化毛細吸管從眼眶側后方輕輕刺入,深度約4毫米,待吸管觸碰到眼眶骨質結構,轉動毛細吸管并前后游走輕刺骨壁,血液自毛細吸管流出;
4.使用EP管在毛細吸管另一端收集血液(約200微升)。
將收集的血液標本置于37℃溫箱中1小時,離心(1200轉/分鐘,5分鐘),收集血清標本送檢(或于-20℃保存)。使用生化自動分析儀檢測血清中BUN和血肌酐水平,以毫克/立方分米作為血清學指標的表示單位。
對損傷后3天的腎臟組織切片進行高碘酸-希夫(PAS)染色,并對腎小管的組織學表現(xiàn)進行半定量評分。結果顯示,ADSCs/CS-IGF- 1C共同移植能最大程度緩解管型形成、小管壞死和擴張、刷狀緣缺失等損傷表現(xiàn)。此外,對小鼠施加嚴重的AKI(左側40分鐘I/R損傷,同時行右側腎臟切除術)。在損傷后不同時間點,檢測血清尿素氮(BUN)和肌酐的水平。結果顯示,ADSCs/CS-IGF-1C共同移植能顯著加快腎臟功能學恢復。
實施例9:CS-IGF-1C水凝膠與ADSCs共同移植治療心肌梗死
冠狀動脈左前降支永久結扎建立及細胞-水凝膠移植:
(1)小鼠麻醉:用5%的異氟烷氣體預麻小鼠,用醫(yī)用膠帶固定小鼠的四肢和頭部于手術板上,剪開頸部氣管,氣管插管后接通麻醉呼吸機正壓通氣,調節(jié)異氟烷的含量約為1%-1.5%,呼吸頻率為120/分鐘;
(2)胸部備皮,用醫(yī)用酒精和碘伏進行消毒;
(3)行胸廓切開術,于第四肋間處開胸并暴露心臟,仔細撕開心包膜暴露小鼠左心室前壁;
(4)左冠狀動脈起始端的下方距離左心耳約1毫米處,用7-0的縫合線結扎冠狀動脈左前降支(以結扎點下方心肌的顏色變淺發(fā)白或出現(xiàn)紫黑色且心電圖(electrocardioram,ECG)檢測顯示心肌電ST段抬高為結扎成功的標志;
(5)結扎成功后于結扎位點左下、右下各1毫米處分別注射10微升生理鹽水、細胞生理鹽水懸液、水凝膠或凝膠-ADSCs復合物;
(6)關胸,縫合肌肉和皮膚,傷口用碘伏再次消毒,妥善飼養(yǎng)。
(7)假手術(sham)對照組:開胸,穿線不接扎不移植任何細胞或溶液,后關胸縫合肌肉。
此外,利用免疫染色、心臟超聲等手段評價心肌再生情況。
使用CS-IGF-1C水凝膠負載ADSCs局部注射受損心肌組織,結果顯示,CS-IGF-1C保護ADSCs的存活,增強其促進心肌細胞增殖、抗凋亡、以及刺激血管新生能力,改善心肌肥大并促進心臟功能和結構的恢 復,并減少心肌組織纖維化的發(fā)生。
實施例10:CS-IGF-1C水凝膠與ADSCs共同移植治療皮膚損傷
真皮層全層皮膚損傷模型的建立及細胞-水凝膠移植:
(1)裸鼠腹腔內注射4%水合氯醛進行全身麻醉。
(2)麻醉效果滿意后,75%酒精消毒裸鼠背部皮膚3遍。
(3)用眼科剪剪除全層裸鼠皮膚及肉膜,暴露肌肉層,制備出面積為l.0立方厘米的皮膚缺損區(qū)域。
(4)IV3000無菌不透水傷口敷料覆蓋創(chuàng)面,貼膜邊緣用傷口粘合劑點附于裸鼠背部皮膚。
(5)術后裸鼠單籠飼養(yǎng),自第3天起每隔2天更換創(chuàng)面敷料。
(6)水凝膠-ADSCs以1×106/毫升的密度接種于水凝膠中,各個實驗組每只裸鼠注射200微升生理鹽水(不治療組)、細胞生理鹽水懸液(單純細胞組)、水凝膠-ADSCs(對照水凝膠與細胞組)、水凝膠。
(7)術后大體觀測及愈合曲線測定,每天觀察并記錄各組裸鼠的精神狀態(tài)、進食飲水情況、活動力、大小便情況。
(8)術后每隔2天麻醉后首先行活體成像檢測,然后去除傷口敷料、仔細清除創(chuàng)面滲出物、痂皮,觀察創(chuàng)面有無感染、創(chuàng)面愈合情況,并進行創(chuàng)面拍照同時以透明薄膜描印創(chuàng)面。
(9)拍照后,創(chuàng)面重新用IV3000無菌不透水傷口敷料貼膜覆蓋,貼膜邊緣用傷口粘合劑點附于裸鼠背部皮膚。使用Image J軟件分析各組術后第3、6、9、l2天殘留創(chuàng)面面積,并繪制愈合曲線。
此外,利用免疫染色評價皮膚組織再生情況。
建立小鼠皮膚缺損模型,使用CS-IGF-1C水凝膠負載骨髓來源間充質干細胞(BMSCs)局部注射到皮膚缺損部位,CS-IGF-1C增強BMSCs的存活和增殖,并有利于BMSCs促進局部皮膚組織的修復,加快血管新生,并減少組織纖維化的發(fā)生。