本發(fā)明涉及腫瘤學(xué)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及SRPK1基因及其蛋白在胃癌檢測(cè)方面的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及SRPK1抑制劑在胃癌治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，其發(fā)病率和死亡率分別高居全部惡性腫瘤的第3位和第2位。由于胃癌起病隱匿，早期多無(wú)明顯癥狀，不易覺(jué)察，使得胃癌的早期發(fā)現(xiàn)非常困難。特別是在我國(guó)，超過(guò)80％的胃癌在確診時(shí)就已處于進(jìn)展期，預(yù)后很差，嚴(yán)重威脅著人們的生命健康(Leung WK,et al.Lancet Oncol.2008,Yang L.et al.World J Gastroenterol 2006)。

由此胃癌的診斷，尤其是早期診斷，是臨床診療和預(yù)后的關(guān)鍵。除了影像學(xué)檢查和內(nèi)鏡檢查之外，生物大分子腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)也是一種胃癌早期診斷的重要手段。目前臨床上常用的生物大分子腫瘤標(biāo)志物有：a.癌胚抗原(CEA)、糖蛋白類抗原(CA19-9、CA125)；b.胃蛋白酶原(PG)；c.端粒酶；d.骨橋蛋白(OPN)；e.胃癌抗原(MGAgs)。這些大分子胃癌標(biāo)志物的應(yīng)用提高了胃癌患者的檢出率，但早期診斷和指導(dǎo)個(gè)性化治療的分子分型診斷仍是我們面臨的極大挑戰(zhàn)，而發(fā)現(xiàn)靈敏度和特異性更高的新的腫瘤標(biāo)志物，是提高胃癌早期診斷水平的關(guān)鍵。

胃癌的治療在過(guò)去20年里取得了很大的進(jìn)展，目前以化療方面研究進(jìn)展最快?；熕幬锇ǚ蜞奏ゎ悺⒔z裂霉素類、蒽環(huán)類、鉑類、阿糖胞苷及亞硝脲類等。紫杉類(多西紫杉醇及紫杉醇)用于食道癌和胃癌療效確切，已使難治性胃癌(包括胃低分化腺癌、粘液腺癌和印戒細(xì)胞癌)患者的生存情況顯著改善。近年來(lái)靶向治療已成為治療癌癥的熱門手段。靶向治療是指具有特定目標(biāo)的高選擇性治療，包括器官靶向、細(xì)胞靶向和分子靶向。目前對(duì)胃癌的靶向治療研究較少，因此迫切需要尋找新的作用靶點(diǎn)，研究和開發(fā)胃癌特異的新藥物，以提高胃癌治療的特異性和有效性。

由此可見(jiàn)，目前迫切需要尋找具有高特異性和有效性的胃癌早期診斷標(biāo)志 物，并開發(fā)能夠靶向作用于胃癌，減少對(duì)正常組織與人體的傷害的新藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了特異性診斷胃癌的試劑以及治療胃癌的藥物和方法。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種SRPK1基因或其蛋白或其檢測(cè)試劑的用途，用于制備檢測(cè)胃癌和/或判斷胃癌易感性的試劑或試劑盒。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒包括：對(duì)SRPK1進(jìn)行定量檢測(cè)的試劑以及相應(yīng)的標(biāo)簽或說(shuō)明書。

在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書中記載了以下使用說(shuō)明：對(duì)SRPK1進(jìn)行定量檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果用于表征胃癌幾率高低。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括SRPK1的特異性引物、探針、抗體以及芯片。

在另一優(yōu)選例中，所述的SRPK1基因來(lái)源于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地來(lái)源于人、小鼠、大鼠。更佳地，來(lái)源于人。

在另一優(yōu)選例中，所述的特異性引物包括上游引物和下游引物：所述上游引物序列具有如SEQ ID NO:1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述的下游引物序列具有如SEQ ID NO:2所示的序列或其互補(bǔ)序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的芯片包括核酸芯片和蛋白質(zhì)芯片。

在另一優(yōu)選例中，所述的核酸芯片包括基片和點(diǎn)樣在基片上的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針，所述的癌癥相關(guān)基因的特異性寡核苷酸探針包括與SRPK1的特異性結(jié)合的探針。

在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白質(zhì)芯片包括基片和點(diǎn)樣在基片上的胃癌相關(guān)蛋白的特異性抗體，所述的胃癌相關(guān)蛋白的特異性抗體包括抗SRPK1的特異性抗體。

在另一優(yōu)選例中，當(dāng)檢測(cè)的樣本中SRPK1基因或蛋白的表達(dá)和/或活性高于正常樣本，則說(shuō)明該樣本的對(duì)象患有胃癌的易感性高于正常對(duì)象。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)胃癌的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測(cè)SRPK1的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書注明所述試劑盒用于檢測(cè)胃癌。

在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)試劑包括：特異性抗體和/或特異性引物。

在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書中注明以下內(nèi)容：

當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的SRPK1相對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量與癌旁組織的SRPK1相對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量之比>1，則提示該檢測(cè)對(duì)象患癌癥的幾率高于普通人群。

在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒用于檢測(cè)人胃組織樣品或血液樣品。

本發(fā)明的第三方面，提供了一種SRPK1抑制劑的用途，所述的抑制劑被用于制備抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的藥物，或用于制備治療胃癌的藥物。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括：SRPK1的抗體、SRPK1核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及SRPK1的活性抑制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑是siRNA或shRNA。

在另一優(yōu)選例中，所述的siRNA正義鏈具有如SEQ ID NO:5所示的序列，所述siRNA的反義鏈具有如SEQ ID NO:6所示的序列。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種藥物組合物，包括SRPK1抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。

在另一優(yōu)選例中，所述的SRPK1抑制劑包括SRPK1的抗體、SRPK1核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及SRPK1的活性抑制劑。

本發(fā)明的第五方面，提供了一種體外非治療性的抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的方法，包括步驟：在SRPK1抑制劑存在下，培養(yǎng)癌細(xì)胞，從而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括向癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加SRPK1抑制劑，從而抑制抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖。

本發(fā)明的第六方面，提供了一種篩選治療胃癌的候選化合物的方法，所述方法包括步驟：

(a)測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中SRPK1的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中SRPK1的表達(dá)量和/或活性；

其中，如果測(cè)試組中細(xì)胞的SRPK1的表達(dá)量和/或活性小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)SRPK1的表達(dá)和/或活性有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的SRPK1的表達(dá)量是通過(guò)RT-PCR檢測(cè)而得出的。

在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括步驟：

(b)對(duì)于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制作用；和/或進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)SRPK1基因是否有下調(diào)的作用。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中包括步驟：測(cè)試組中，胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察胃癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察胃癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，如果測(cè)試組中胃癌細(xì)胞的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。

本發(fā)明的第七方面，提供了一種抑制或治療胃癌的方法，包括步驟：給需要治療的對(duì)象(哺乳動(dòng)物)施用安全有效量的SRPK1抑制劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括：SRPK1蛋白的抗體、SRPK1的反義RNA、siRNA、shRNA以及SRPK1的活性抑制劑。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說(shuō)明

圖1A為實(shí)施例1中western blot檢測(cè)SRPK1蛋白在胃癌病人癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況示意圖，其中，“N”指癌旁組織，“C”指胃癌組織。圖片顯示12例代表性結(jié)果。病人的癌組織中SRPK1基因表達(dá)量高于相應(yīng)的癌旁組織。圖1B顯示了免疫組織化學(xué)手段檢測(cè)SRPK1蛋白在人胃癌臨床樣本中的表達(dá)。

圖2A顯示了SRPK1基因的cDNA序列(SEQ ID NO.:1)；圖2B顯示了SRPK1基因所編碼蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.:2)。

圖3A顯示了過(guò)表達(dá)SRPK1促進(jìn)胃癌細(xì)胞AGS和SGC7901的細(xì)胞生長(zhǎng)。Western圖示顯示SRPK1過(guò)表達(dá)情況。圖3B顯示了過(guò)表達(dá)SRPK1提高了胃癌細(xì)胞AGS在軟瓊脂中形成克隆的能力。

圖4A顯示了用RNA干擾技術(shù)敲低SRPK1在胃癌細(xì)胞株BGC-803、AGS和SGC7901中的表達(dá)后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢。Western圖示顯示SRPK1表達(dá)下調(diào)情況。圖4B顯示了在胃癌細(xì)胞NCI-N87中下調(diào)SRPK1蛋白表達(dá)減弱了該胃癌細(xì)胞株的平板克隆形成能力。圖4C顯示了在胃癌細(xì)胞BGC-803中下調(diào)SRPK1 蛋白表達(dá)減弱了該胃癌細(xì)胞株在軟瓊脂中形成克隆的能力。

圖5A顯示了過(guò)表達(dá)SRPK1的胃癌細(xì)胞SGC7901在裸鼠皮下具有更強(qiáng)的成瘤能力。無(wú)論在體積和腫瘤重量上SRPK1過(guò)表達(dá)組都比對(duì)照組大和重，同時(shí)兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5B顯示了敲低SRPK1表達(dá)嚴(yán)重減弱胃癌細(xì)胞MGC803在裸鼠皮下形成腫瘤的能力。無(wú)論在體積和腫瘤重量上SRPK1表達(dá)降低組組都比對(duì)照組小和輕，同時(shí)兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)，SRPK1在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)高于癌旁組織或正常組織，可作為胃癌檢測(cè)的標(biāo)志物用于檢測(cè)或輔助性檢測(cè)胃癌。此外，SRPK1的抑制劑可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)還證明，應(yīng)用SRPK1的特異抑制劑如干擾RNA(siRNA)、shRNA可以在體外明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和克隆形成能力，且可以影響體內(nèi)腫瘤的成瘤性。因此，使用SRPK1抑制劑來(lái)抑制SRPK1的功能，可以抑制體外和體內(nèi)的胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及成瘤能力，從而為胃癌的治療提供了新的途徑。

SRPK1蛋白和多核苷酸

SRPK1(Serine/Arginine Prote in Kinase 1)，是一種富含絲氨酸/精氨酸重復(fù)序列(Ser/Arg Repeats)的剪接因子蛋白激酶，位于人6號(hào)染色體短臂，全長(zhǎng)655個(gè)氨基酸，主要通過(guò)磷酸化RS蛋白調(diào)控mRNA的選擇性剪接。近年來(lái)，隨著對(duì)SRPK1研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)SRPK1在多種腫瘤組織中高表達(dá)并具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌以及非小細(xì)胞肺癌等，然而迄今，SRPK1在胃癌中的表達(dá)和功能仍不清楚。本發(fā)明首次闡述了SRPK1在胃癌中的表達(dá)情況并通過(guò)細(xì)胞生物學(xué)的研究手段證明SRPK1的表達(dá)同病人臨床病理參數(shù)相關(guān)，在體內(nèi)外促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增值，是一個(gè)潛在的致癌因子。

在本發(fā)明中，“本發(fā)明蛋白”、“本發(fā)明多肽”、“SRPK1蛋白”可互換使用，指SRPK1蛋白。應(yīng)理解，所述術(shù)語(yǔ)還包括SRPK1的活性片段和衍生物。

在本發(fā)明中，“本發(fā)明基因”、“本發(fā)明多核苷酸”、“SRPK1基因”指編碼SRPK1蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正義和反義核酸。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“SRPK1蛋白”、“SRPK1多肽”或“胃癌標(biāo)志物SRPK1”可互換使用，都指具有SRPK1氨基酸序列的蛋白或多肽。

SRPK1的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，該核苷酸序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。

如本文所用，“分離的SRPK1蛋白或多肽”是指SRPK1蛋白基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化SRPK1蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。

本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。

編碼SRPK1的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。

本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。

本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼SRPK1蛋白的多核苷酸。

本發(fā)明的人SRPK1核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組 法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。

此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。

應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。

本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或SRPK1蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。

通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的SRPK1蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟：

(1)用本發(fā)明的編碼人SRPK1蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；

(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；

(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人SRPK1編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。

此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。

包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于 轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。

宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。

用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl₂法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl₂。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。

獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。

在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。

抗體

本發(fā)明還包括對(duì)人SRPK1蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人SRPK1基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人SRPK1基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，將提純的人SRPK1基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人SRPK1蛋白或它的抗原的細(xì)胞也可以用來(lái)對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。

本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的 抗體片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。

本發(fā)明的抗體包括可以抑制SRPK1功能的抗體，也可以是不影響人SRPK1功能的抗體。每一類抗體都可以通過(guò)對(duì)人SRPK1基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人SRPK1基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的SRPK1基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以利用在原核細(xì)胞(如E.coli)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化SRPK1蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而得到。

可用于本發(fā)明的SRPK1抗體可以是抗人SRPK1蛋白抗體。本發(fā)明的抗人SRPK1蛋白抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人SRPK1蛋白。

抑制劑和藥物組合物

利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與SRPK1蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，尤其是抑制劑等。

本發(fā)明SRPK1蛋白的抑制劑(包括抗體、反義核酸以及其他抑制劑)，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可抑制SRPK1蛋白的表達(dá)和/或活性，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)：胃腸內(nèi)、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。

可用于本發(fā)明的抑制劑包括：SRPK1的抗體、SRPK1核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及SRPK1的活性抑制劑。其中，典型的SRPK1抑制劑為siRNA和shRNA。

可用于本發(fā)明的siRNA包括多種以SRPK1為靶點(diǎn)的siRNA，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)該靶點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)篩選，其中，一種優(yōu)選的siRNA包括如SEQ ID NO:5(正義鏈)和SEQ ID NO.:6(反義鏈)所示的序列。

典型地，將SRPK1基因作為制備胃癌治療藥物的靶點(diǎn)的技術(shù)方案包括以下方案：

1.化學(xué)合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對(duì)SRPK1基因序列，利用脂質(zhì)體包裹遞送至胃癌細(xì)胞內(nèi)干擾SRPK1基因的表達(dá)，觀察軟瓊脂克隆形成能 力、細(xì)胞增殖等細(xì)胞生物學(xué)特性的改變?？衫帽绢I(lǐng)域常規(guī)的方法來(lái)設(shè)計(jì)和合成特異性針對(duì)SRPK1的核酸序列(如siRNA)。

2.利用各種載體，包括DNA載體、慢病毒載體來(lái)干擾SRPK1基因的表達(dá)，達(dá)到體內(nèi)干擾SRPK1基因的效果，檢測(cè)它們對(duì)裸鼠皮下所成瘤體的治療效果，從而實(shí)現(xiàn)抑制胃癌增殖的目的。

3.獲得能夠特異性抑制SRPK1基因轉(zhuǎn)運(yùn)活性的多肽、單克隆抗體，達(dá)到抑制SRPK1活性的目的，從而現(xiàn)實(shí)抑制胃癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的目的。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明SRPK1抑制劑(如抗體、反義序列(如siRNA)、或抑制劑)以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克-10毫克/千克體重。

檢測(cè)方法和試劑盒

本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人SRPK1蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人SRPK1蛋白水平，可以用于診斷胃癌。

一種檢測(cè)樣品中是否存在SRPK1蛋白的方法是利用SRPK1蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括：將樣品與SRPK1蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在SRPK1蛋白。

SRPK1蛋白或其多核苷酸可用于SRPK1蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。抗SRPK1的抗體可以固定在蛋白質(zhì)芯片上，用于檢測(cè)樣品中的SRPK1蛋白。

本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)胃癌的試劑盒，它含有特異性擴(kuò)增SRPK1的引物對(duì)和/或SRPK1特異性抗體以及標(biāo)簽或說(shuō)明書。

其中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書注明以下內(nèi)容：當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的SRPK1相對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量與癌旁組織的SRPK1相對(duì)β-肌動(dòng)蛋白的mRNA表達(dá)量之比 >1，則提示該檢測(cè)對(duì)象患癌癥的幾率高于普通人群。

所述的試劑盒可用于檢測(cè)人胃組織樣品或血液樣品。

篩選方法

本發(fā)明還提供了基于SRPK1進(jìn)行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響(抑制)SRPK1表達(dá)或活性的化合物，然后對(duì)篩選出的化合物進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用。

其中，代表性的癌細(xì)胞包括為胃癌細(xì)胞。

一種優(yōu)選的篩選方法可基于SRPK1的mRNA的表達(dá)水平。具體步驟如下：

(a)測(cè)試組中，在細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察所述測(cè)試組的細(xì)胞中SRPK1的表達(dá)量和/或活性；在對(duì)照組中，在相同細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察對(duì)照組的所述細(xì)胞中SRPK1的表達(dá)量和/或活性；

如果測(cè)試組中細(xì)胞的SRPK1的表達(dá)量和/或活性小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)SRPK1的表達(dá)和/或活性有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。

其中，所述的SRPK1的表達(dá)量是通過(guò)RT-PCR檢測(cè)而得出的。

本篩選方法還可包括步驟：

(b)對(duì)于步驟(a)中獲得的候選化合物，進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的抑制作用；和/或進(jìn)一步測(cè)試其對(duì)SRPK1基因是否有下調(diào)的作用。

測(cè)試組中，胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中添加測(cè)試化合物，并觀察胃癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；在對(duì)照組中，在胃癌細(xì)胞的培養(yǎng)體系中不添加測(cè)試化合物，并觀察胃癌細(xì)胞的數(shù)量和/或生長(zhǎng)情況；其中，如果測(cè)試組中胃癌細(xì)胞的數(shù)量或生長(zhǎng)速度小于對(duì)照組，就表明該測(cè)試化合物是對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或增殖有抑制作用的治療胃癌的候選化合物。

本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明特異性針對(duì)SRPK1基因的小核糖核酸分子能夠抑制胃癌細(xì)胞體外的增殖和惡性以及抑制胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤性能，說(shuō)明SRPK1基因可用作制備胃癌治療藥物的靶基因。

本發(fā)明的有益效果

1.SRPK1的表達(dá)水平和活性水平可用作胃癌檢測(cè)的標(biāo)志物：SRPK1在胃癌組織或血清內(nèi)的高表達(dá)可以作為診斷胃癌的標(biāo)志物，其特異性、靈敏度高，操 作簡(jiǎn)便。

2.SRPK1抑制劑可以有效抑制胃癌細(xì)胞增殖，或作為治療胃癌的藥物。

以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

通用方法：

1臨床組織樣本的獲取

胃癌及癌旁組織取自手術(shù)治療的胃癌患者，在獲取樣本前均與患者簽訂了知情同意書。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取腫瘤原發(fā)灶及周圍5cm以外的癌旁組織，投入液氮中速凍并移至－80℃冰箱保存，運(yùn)輸時(shí)儲(chǔ)存于液氮中。癌與癌旁組織均通過(guò)病理專家做出最終診斷。

2組織及細(xì)胞RNA抽提

采用TRIzol Reagent(Invitrogen)試劑抽提RNA，具體操作如下：

(1)研缽、碾杵和勻漿器等器皿洗凈，分別再用ddH2O和DEPC H2O沖洗，然后在180℃烘箱中烘約4小時(shí)，以去除RNA酶；

(2)在研缽中加入適量液氮使之預(yù)冷，將組織從液氮中迅速取出，切取約50-100mg大小，在研缽中研磨成粉末；

(3)用刮匙將研磨好的組織粉末盡可能完全的移至無(wú)RNA酶的EP管中，EP管被預(yù)先加入適量體積(1ml)TRIzol試劑，充分勻漿；

(4)室溫放置5分鐘，按比例向離心管中加入氯仿(200μl/1ml TRIzol)，迅速劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，4℃，12000×g條件下離心15分鐘；

(5)將上層水相盡可能地轉(zhuǎn)移至新的無(wú)RNA酶的EP管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻5次，室溫靜置10分鐘，4℃，12000×g條件下離心10分鐘，此時(shí)可見(jiàn)RNA沉淀；

(6)將上清倒掉，加入75％乙醇(1ml/1ml TRIzol)，混勻，洗滌RNA，離心4℃，7500×g條件下離心5分鐘；

(7)棄上清，盡可能除盡殘留乙醇，沉淀自然干燥5-10min(注意切勿完全 干燥)；加入30-50μl DEPC H2O，吹吸幾次，溶解RNA沉淀；

(8)酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度及純度OD 260/280(1.8-2.0)；凝膠電泳觀察有無(wú)降解，－80℃保存。

(9)細(xì)胞株RNA抽提，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸取培養(yǎng)液，根據(jù)培養(yǎng)皿的面積加入相應(yīng)量的TRIzol試劑(1ml TRIzol/10cm2)裂解細(xì)胞，吹打幾次，將裂解下來(lái)的細(xì)胞收集至無(wú)RNA酶的EP管中，其余按照上述步驟4)-8)完成氯仿-異丙醇法分離純化RNA。

3RNA的逆轉(zhuǎn)錄

用M-MLV Reverse Transcriptase(Promega)逆轉(zhuǎn)錄，操作如下：

(1)在無(wú)核酸酶的EP管中加入以下組分：

置于PCR儀中，70℃，5分鐘，然后立即在冰上冷卻5min。

(2)在上述體系中再加入以下組分：

輕輕混勻后，置于PCR儀中，37℃，60min。

逆轉(zhuǎn)得到的cDNA置于4℃保存。

4實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)使用Premix Ex Taq^TM(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa Biotechnology Co.,Ltd.Dal ian,China)的反應(yīng)體系，利用Thermal Cycler Dice^TM Real Time System(TP800實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，TaKaRa) 進(jìn)行操作。定量PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度以80bp-150bp最為合適(可以延長(zhǎng)至300bp)。

反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件：

溶解曲線分析步驟：

95℃ 15sec

60℃ 30sec

95℃ 15sec

解離時(shí)間為4sec。

熒光本底信號(hào)和閾值采用儀器設(shè)置的默認(rèn)值，每次PCR反應(yīng)結(jié)束后會(huì)自動(dòng)生成，Ct值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值(基線熒光強(qiáng)度的10倍)時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；目的基因SRPK1每個(gè)模板做3個(gè)復(fù)管，得到的Ct值取平均值；SRPK1基因的Ct平均值減去相應(yīng)模板的內(nèi)參基因(β-actin)的Ct平均值，得到ΔCt。胃癌組的ΔCt減去相應(yīng)癌旁組織的ΔCt，得到ΔΔCt值，胃癌組和癌旁組中的SRPK1基因的倍數(shù)關(guān)系用2^-ΔΔCt表示。

5真核表達(dá)載體構(gòu)建

(1)模板：胃癌細(xì)胞AGS的cDNA文庫(kù)。

(2)真核表達(dá)載體的選擇：pcDNA^TM 3.1/myc-His(-)A，5522nucleotides。

(3)根據(jù)SRPK1mRNA(NM_003137.4)序列，結(jié)合表達(dá)載體pcDNA^TM3.1/myc-His(-)A的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，引物序列為Forward:5-actggaattcCCACCATGGAGCGGAAAGTGCTTGCG-3；Reverse:5- tccaAAGCTTGGAGTTAAGCCAAGGGTG-3。其中反向引物中SRPK1的終止密碼子被去除，使得SRPK1的C末端帶上c-myc和6xHis標(biāo)簽。利用高保真性DNA聚合酶PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase(TaKaRa)，以AGS細(xì)胞cDNA為模板擴(kuò)增基因SRPK1全長(zhǎng)開放讀碼框，50μl總反應(yīng)體系成分如下：

采用兩步PCR法(98℃，10sec；60℃，90sec)，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物大小約1.9kb，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小，割膠回收(膠純化試劑盒：MACHEREY-NAGEL)符合片段大小的PCR產(chǎn)物。

(1)EcoRI，HindⅢ(TaKaRa Biotechnology Inc.Dal ian，China)雙酶切回收PCR產(chǎn)物及載體質(zhì)粒pcDNA^TM 3.1/myc-His(-)A，酶切反應(yīng)體系如下：

37℃酶切反應(yīng)1小時(shí)；割膠回收酶切產(chǎn)物。

(2)連接：酶切回收的PCR產(chǎn)物與載體按照摩爾數(shù)比(4:1)的比例混合，DNA連接酶體系鏈接，體系中還包括2.5μl 4×SolutionⅠ(TaKaRa Code：D102A)，ddH2O補(bǔ)齊至10μl，16℃連接2h乃至過(guò)夜；

(3)轉(zhuǎn)化：取10μl連接產(chǎn)物與100μl感受態(tài)細(xì)菌(TOP10或DH5α)混合，冰上放置30min，42℃熱激90sec，立即置于冰上5min，加入800μl不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)30min，使菌體復(fù)蘇且擴(kuò)增一代，3000rpm離心2min，去除大部分上清，留50-100μl菌液，,輕輕吹 打沉淀混勻，然后均勻涂于有氨芐青霉素抗性(Amp+)的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。

(4)克隆鑒定：挑取經(jīng)過(guò)氨芐抗性篩選后生長(zhǎng)的菌落在加氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，抽取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定：取1-2μg小抽質(zhì)粒用EcoRI，HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段大小，載體pcDNA^TM 3.1/myc-His(-)A片段大小約5.5kb，SRPK1讀碼框片段大小約1968bp，符合大小的克隆送測(cè)序確認(rèn)插入片段序列的正確性。

6細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

(1)將不同種類的胃癌細(xì)胞根據(jù)其生長(zhǎng)特性按3-5×10³/100μl/孔計(jì)算細(xì)胞總量，充分消化細(xì)胞后，稀釋到所需濃度，接種于96孔板內(nèi)。每天每組三復(fù)孔，按5-7天接種細(xì)胞；

(2)待細(xì)胞基本貼壁后觀察細(xì)胞狀態(tài)和數(shù)目。用CCK-8顯色劑(Cell Counting Kit-8，DOJINDO，Japan)進(jìn)行顯色反應(yīng)，每100μl培養(yǎng)液加10μl CCK-8，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱放置孵育1h，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度，記錄，確定細(xì)胞實(shí)際的起始密度，作為生長(zhǎng)相對(duì)零點(diǎn)。

(3)每天或隔天半量換液，具體視實(shí)驗(yàn)要求而定；

(4)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，固定時(shí)間間隔測(cè)量，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；

一般測(cè)5至7天。待測(cè)定結(jié)束后，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Excel繪出圖表。

7細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

(1)轉(zhuǎn)染：采用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，過(guò)表達(dá)或沉默細(xì)胞中SRPK1基因的表達(dá)；

(2)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，于6孔板或35mm培養(yǎng)皿用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后消化計(jì)數(shù)，按一定數(shù)目接種至100mm培養(yǎng)皿(不同細(xì)胞株數(shù)目不同)，繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后依據(jù)細(xì)胞種類加入適當(dāng)濃度的G418(600-1000μg/ml)，以篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的細(xì)胞克??；

(3)培養(yǎng)2-3周，其間每隔3-5天更換新鮮培養(yǎng)液并加G418篩選，直至有肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞克隆形成；

(4)吸去培養(yǎng)皿內(nèi)的培液，1×PBS洗兩次，考馬斯亮藍(lán)R-250染色2h，用水輕輕沖洗后，再用考馬斯亮藍(lán)染色脫色液脫色30-60min；

(5)克隆形成染色結(jié)果拍照，按照相同的標(biāo)準(zhǔn)(細(xì)胞克隆大小)對(duì)每個(gè)培養(yǎng)皿上的細(xì)胞克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)。

8蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)

(1)蛋白樣品制備：培養(yǎng)的細(xì)胞吸去培養(yǎng)上清后，用預(yù)冷的1XPBS洗兩次，加入2×SDS裂解液(100mM Tris-Cl，pH＝6.8，4％SDS，20％甘油)，充分裂解后，沸水浴加熱10min，12000×g離心10min，上清轉(zhuǎn)移至新管中，BCA Protein Assay Kit對(duì)獲得的蛋白進(jìn)行定量，－80℃保存；

(2)蛋白電泳分離：在蛋白樣品加入適量含有200mM DTT的上樣緩沖液(loading buffer)，沸水浴加熱10min，稍作離心，SDS-PAGE蛋白凝膠電泳分離樣品；

(3)轉(zhuǎn)膜：將電泳膠、硝酸纖維膜、厚(薄)濾紙墊板浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中(24mM Tris，192mM甘氨酸，20％甲醇)平衡15-20min。按正極–1層厚濾紙墊板–硝酸纖維膜–電泳膠–2層薄濾紙墊板–負(fù)極的順序放好，濕轉(zhuǎn)儀(XCell SureLock^TM，invitrogen)30伏轉(zhuǎn)膜30-40min；

(4)封閉：5％脫脂奶粉/0.1％PBST作為封閉液，水平搖床，室溫封閉30min-2h；

(5)一抗：一抗用封閉液稀釋(參考抗體說(shuō)明書推薦濃度)，室溫孵育2h或者4℃孵育過(guò)夜，0.1％PBST洗三次，每次5min；

(6)二抗：熒光二抗用封閉液稀釋(1:1000)，室溫孵育30min，0.1％PBST洗三次，每次5min；

(7)掃膜：ODYSSEY紅外成像系統(tǒng)掃描硝酸纖維素膜，保存圖像。

9軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)

(1)分別配制1％和2％的低熔點(diǎn)Agarose(TaKaRa公司)，高溫高壓滅菌；

(2)配制2×DMEM培養(yǎng)液(2.5×DMEM，含20％FBS)；

(3)將37℃保溫的2％Agarose和2×DMEM培養(yǎng)液按相同體積混合，以每孔0.5ml加到24孔板中，置于4℃冰箱中，待凝固后使用；

(4)充分消化培養(yǎng)的細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，稀釋成相同濃度(3000-5000個(gè)/0.5ml)；

(5)將細(xì)胞懸液與37℃保溫的1％Agarose以相同體積混合，加到已經(jīng)鋪好 下層膠的24孔板中，每孔0.5ml，置于4℃冰箱10min；

(6)在凝固的軟瓊脂上加入0.2ml培養(yǎng)液，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)2-3周；

(7)顯微鏡下觀察每個(gè)孔里面細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)情況，計(jì)數(shù)，進(jìn)行分析。

10裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

所用小鼠為5-6周大小的雄性BLAB/c nu裸鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于南方模式動(dòng)物培養(yǎng)中心；

(1)取處理后的細(xì)胞，以相同數(shù)量接種于小鼠皮下(不同細(xì)胞種類接種數(shù)目不同)，為避免個(gè)體差異導(dǎo)致的誤差，同種細(xì)胞不同處理可左右對(duì)稱接種于同一只小鼠；

(2)待出現(xiàn)可見(jiàn)腫瘤后，每3天監(jiān)測(cè)腫瘤大小，游標(biāo)卡尺讀取腫瘤長(zhǎng)徑和短徑，按以下公式計(jì)算腫瘤體積：體積＝長(zhǎng)徑×短徑²；

(3)持續(xù)監(jiān)測(cè)約7-8次后，整理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)。

11抗體獲得和免疫檢測(cè)

(1)抗原蛋白獲得

從Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得人SRPK1基因的cDNA序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達(dá)載體中，表達(dá)SRPK1蛋白，并按基因工程表達(dá)產(chǎn)物的純化體系純化蛋白。

(2)抗體制備

可采用以下幾種方法制備抗體：

a細(xì)胞融合法：用上述制備的SRPK1蛋白免疫動(dòng)物(包括兔子、山羊等)，獲得脾臟細(xì)胞，再與骨髓瘤細(xì)胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。

b利用噬菌體表面展示庫(kù)，克隆免疫動(dòng)物的脾臟IgG可變區(qū)并表達(dá)成基因工程單克隆抗體。

c利用純化的蛋白免疫動(dòng)物，制備多抗血清。

(3)檢測(cè)

a用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學(xué)方法進(jìn)行胃癌的病理檢測(cè)，陰性信號(hào)為胃癌。

b取患者血清，用ELISA方法檢測(cè)，陰性反應(yīng)為胃癌可疑病人。

c將SRPK1抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。

實(shí)施例1：SRPK1在臨床樣本中的表達(dá)模式

通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)剪切因子激酶SRPK1在胃癌組織中明顯上調(diào)。在89對(duì)臨床樣本中，通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有66對(duì)樣本胃癌組織中SRPK1的表達(dá)明顯高于相應(yīng)的癌旁組織，上調(diào)率達(dá)到74.2％，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明p<0.01，說(shuō)明結(jié)果的可靠性。而選取了12對(duì)臨床樣本抽提組織蛋白，行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示SRPK1在8對(duì)樣本癌組織中顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織(圖1A)。圖1B顯示了選取的1對(duì)代表性臨床樣本中SRPK1的表達(dá)情況。

實(shí)施例2：過(guò)表達(dá)SRPK1基因抑制胃癌細(xì)胞的增殖

通過(guò)NCBI網(wǎng)上檢索，檢索到SRPK1的cDNA序列CCDS47415.1(SEQ ID NO.:1)(圖2A)以及其編碼的氨基酸序列NP_003128.3(SEQ ID NO.:2)(圖2B)。為了驗(yàn)證SRPK1在胃癌發(fā)生中的功能，首先構(gòu)建了其真核表達(dá)載體，將SRPK1的cDNA克隆進(jìn)pcDNA^TM 3.1/myc-His(-)A，轉(zhuǎn)染構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)入胃癌細(xì)胞后進(jìn)行western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SRPK1成功的表達(dá)(圖3A)。接下來(lái)的功能實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果表明，SRPK1的過(guò)量表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞AGS和SGC7901的增殖能力(圖3A)。用于構(gòu)建SRPK1真核表達(dá)載體的引物序列為Forward:actggaattcCCACCATGGAGCGGAAAGTGCTTGCG-3(SEQ ID NO.:3)；Reverse:5-tccaAAGCTTGGAGTTAAGCCAAGGGTG-3(SEQ ID NO.:4)。

實(shí)施例3：沉默SRPK1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證SRPK1的細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)功能，我們采取RNA干擾沉默其表達(dá)的方式檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況的變化。用于干擾SRPK1表達(dá)的siRNA由上海吉碼制藥有限公司合成，序列為：正義鏈5-GGUCAGUCAUUCAGUGAACAAdTdT-3(SEQ ID NO.:5)；反義鏈5-UUGUUCACUGAAUGACUGACCdTdT-3(SEQ ID NO.:6)。作為干擾對(duì)照的NC非特異性核苷酸序列為：正義鏈5-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3(SEQ ID NO.:7)；反義鏈5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3(SEQ ID NO.:8)。經(jīng)Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)顯示，人工合成的干擾siRNA能夠有效的下調(diào)SRPK1的表達(dá)水平(圖4A)，生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)也證明了SRPK1的下調(diào)能夠抑制 胃癌細(xì)胞BGC-803，AGS，SGC7901和NCI-N87的生長(zhǎng)和形成克隆的能力(圖4A，B)，有力的支持SRPK1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)論。

實(shí)施例4：SRPK1抑制胃癌細(xì)胞的惡性表征

軟瓊脂克隆形成能力是反映腫瘤細(xì)胞惡性程度的一個(gè)強(qiáng)有力的體外指標(biāo)。為了檢測(cè)SRPK1對(duì)胃癌細(xì)胞惡性程度的影響，根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選取了WRL-68作為SRPK1過(guò)表達(dá)的研究對(duì)象，選取了AGS細(xì)胞作為SRPK1過(guò)表達(dá)的研究對(duì)象，選取了MGC803為SRPK1敲低表達(dá)的研究對(duì)象。經(jīng)過(guò)對(duì)生長(zhǎng)在軟瓊脂中的細(xì)胞克隆數(shù)分析(圖3B和圖4C)，最終確定過(guò)表達(dá)SRPK1能夠有效促進(jìn)AGS細(xì)胞和沉默表達(dá)SRPK1能夠有效抑制MGC803細(xì)胞的惡性程度，表明SRPK1影響胃癌細(xì)胞的惡性。

實(shí)施例5：SRPK1影響胃癌細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤能力

體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)明確表明SRPK1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，接下來(lái)利用荷瘤裸鼠模型來(lái)研究SRPK1的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞裸鼠皮下成瘤能力的影響。

將1×10⁶個(gè)過(guò)表達(dá)SRPK1的SGC7901細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞對(duì)稱注射入裸鼠腹部皮下，觀察瘤體的生長(zhǎng)情況，并用游標(biāo)卡尺記錄下每隔3天的瘤體長(zhǎng)度和寬度。1個(gè)月后，殺死裸鼠取出瘤體稱重。結(jié)果表明SRPK1的過(guò)表達(dá)有效促進(jìn)SGC7901細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤能力(圖5A)。同樣，將2×10⁶個(gè)沉默表達(dá)SRPK1的MGC803細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞對(duì)稱注射入裸鼠腹部皮下，觀察瘤體生長(zhǎng)情況并記錄。最終的結(jié)果表明SRPK1的下調(diào)有效的抑制了MGC803細(xì)胞裸鼠皮下成瘤的能力(圖5B)。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)SRPK1基因在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且通過(guò)外源SRPK1基因過(guò)量表達(dá)可以顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，通過(guò)RNAi干擾內(nèi)源SRPK1表達(dá)可以明顯抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和在軟瓊脂中形成克??；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明SRPK1表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的成瘤能力。因此SRPK1基因及其表達(dá)產(chǎn)物可作為診斷胃癌的標(biāo)志物和用于胃癌治療的藥物靶點(diǎn)，使胃癌診斷更加準(zhǔn)確、快速?？傊?，本發(fā)明SRPK1基因及其用途為防治胃癌提供了新的治療靶點(diǎn)和有效新藥。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。