本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，涉及通過抑制高血脂、脂肪肝、體重增加、二型糖尿病的標(biāo)志物miR-183的功能在預(yù)防和/或治療高血脂、脂肪肝、二型糖尿病和與這些疾病的癥狀相似的癥狀以及在降低體重中的應(yīng)用，一種抑制miR-183的功能的方法，一種基于miR-183的抑制劑、藥物組合物和試劑盒，以及他們在抑制miR-183的功能中的應(yīng)用，特別是在預(yù)防和/或治療高血脂、脂肪肝、二型糖尿病和與這些疾病的癥狀相似的癥狀以及在降低體重中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

能量攝入過剩是高血脂、脂肪肝和肥胖的最根本原因，而肥胖是公認(rèn)的二型糖尿病的誘因。已有的研究表明腦(下丘腦尤其重要)-腸胃中心軸對(duì)食欲、進(jìn)食和消化吸收以及糖、脂代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]，因而下丘腦-腸胃中基因表達(dá)的變化很可能是肥胖的最根本原因。而能量的攝入過剩會(huì)最先引起脂肪肝，繼而改變肝臟中基因的表達(dá)，造成脂代謝的失常,引起心血管疾病。此外，有研究表明腦-腸胃-肝中心軸對(duì)血糖代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用[2]，表明腦-腸胃-肝中心軸可能是治療高血脂、脂肪肝、肥胖和二型糖尿病的新靶器官系統(tǒng)[3]。

越來越多證據(jù)表明微RNA(microRNA，miRNA)在能量代謝調(diào)節(jié)中起著重要的作用[4]。微RNA是一類長度為16-25nt的非編碼RNA分子(www.mirbase.org)，能通過與靶基因部分互補(bǔ)配對(duì)來識(shí)別并沉默靶基因的RNA表達(dá)和/或蛋白表達(dá)。成熟的微RNA裝載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)上后，通過堿基配對(duì)來與靶基因mRNA 3'-UTR中的互補(bǔ)序列相結(jié)合，從而引發(fā)mRNA的降解和/或抑制其蛋白質(zhì)的翻譯。微RNA 5'端的第二位到第八位的核苷酸被稱為“核心序列”，這七個(gè)核苷酸與靶基因的互補(bǔ)配對(duì)是識(shí)別靶基因的關(guān)鍵，配對(duì)程度越高，結(jié)合和調(diào)節(jié)靶基因的可能性和能力越大。同時(shí)微RNA“核心序列”之外的其它序列與靶基因的互補(bǔ)配對(duì)也能增強(qiáng)其結(jié)合和調(diào)控靶基因的能力。正是由于微RNA是通過非完全配對(duì)來識(shí)別和調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，才使得一個(gè)微RNA能在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)不同程度地調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是開發(fā)基于微RNA的控制能量代謝的藥物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了抑制高血脂、脂肪肝、體重增加、二型糖尿病的標(biāo)志物miR-183的功能在預(yù)防和/或治療高血脂、脂肪肝、二型糖尿病和與這些疾病的癥狀相似的癥狀以及在降低體重中的應(yīng)用。

第二方面，本發(fā)明提供了一種抑制高血脂、脂肪肝、體重增加、二型糖尿病的標(biāo)志物miR-183的功能的方法，其中，該方法包括：將miR-183抑制劑與表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞接觸。

第三方面，本發(fā)明提供了一種miR-183抑制劑，其中，所述miR-183抑制劑為反義寡核苷酸，包括反義DNA和反義RNA，所述反義寡核苷酸與miR-183互補(bǔ)，且具有8-23個(gè)核苷酸的長度；或者所述miR-183抑制劑為miR-183前體的小干擾RNA。

第四方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中，該藥物組合物含有如上所述的miR-183抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。

第五方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括如上所述的miR-183抑制劑，可選的，所述試劑盒還包括藥學(xué)上可接受的載體。

第六方面，本發(fā)明還提供了如上所述的方法、如上所述的miR-183抑制劑、如上所述的藥物組合物和/或如上所述的試劑盒在抑制miR-183的功能中的應(yīng)用；特別是在預(yù)防和/或治療高血脂、脂肪肝、二型糖尿病和與這些疾病的癥狀相似的癥狀以及在降低體重中的應(yīng)用。

第七方面，本發(fā)明還提供了如上所述的miR-183抑制劑、如上所述的藥物組合物在制備用于抑制miR-183的功能的藥物中的應(yīng)用；特別是在制備用于預(yù)防和/或治療高血脂、脂肪肝、二型糖尿病和與這些疾病的癥狀相似的癥狀的藥物以及在制備用于降低體重的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過將miR-183抑制劑與表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞進(jìn)行接觸，能夠充分抑制miR-183的功能(包括抑制miR-183與其靶基因的結(jié)合或者降低miR-183的表達(dá)量，從而抑制miR-183的功能)，當(dāng)用于個(gè)體給藥時(shí)，能夠有效的預(yù)防和/或治療miR-183表達(dá)量升高所引起的疾病，例如，高血脂、脂肪肝、體重增加、二型糖尿病或與這些疾病的癥狀相似的癥狀。相比于傳統(tǒng)的單一降血脂或單一降血糖或單一減肥的藥物，本發(fā)明提供的療法能全面地調(diào)節(jié)食欲、消化吸收、糖、磷脂代謝，且為寡核苷酸；因而功效強(qiáng)大 且副作用小。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說明。

附圖說明

附圖是用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的具體實(shí)施方式一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是下丘腦、胃和肝中miR-183的表達(dá)水平圖，其中，在12月齡小鼠中miR-183的表達(dá)水平顯著高于2月齡的小鼠中的miR-183的表達(dá)水平。

圖2A是miR-183ASO劑量與其抑制miR-183的功能效應(yīng)的線性關(guān)系圖。

圖2B是miR-183ASO、隨機(jī)對(duì)照核苷酸、miR-183錯(cuò)配ASO在細(xì)胞水平上抑制miR-183的功能效應(yīng)的對(duì)比圖。

圖3A是分別注射miR-183ASO和PBS的小鼠隨時(shí)間體重變化的對(duì)比圖。

圖3B是分別注射miR-183ASO和PBS的小鼠隨時(shí)間體重增長速率的對(duì)比圖。

圖3C是分別注射兩個(gè)半月的miR-183ASO和PBS的小鼠的血糖濃度的對(duì)比圖。

圖4A是分別注射三個(gè)月的miR-183ASO和PBS的小鼠的腎、肝、附睪脂肪和胃的重量的對(duì)比圖。

圖4B是分別注射三個(gè)月的miR-183ASO和PBS的腎、肝、附睪脂肪和胃的重量相對(duì)體重的比例的對(duì)比圖。

圖5是分別注射三個(gè)月的miR-183ASO和PBS的小鼠血清中總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量的對(duì)比圖。

圖6是miR-183的siRNA和隨機(jī)對(duì)照RNA對(duì)miR-183表達(dá)影響的對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

以下對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

除非另有說明，本文中使用的科技術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的術(shù)語具有相同的含義。

本發(fā)明的發(fā)明人在研究的過程發(fā)現(xiàn)，相比于2月齡的小鼠，主控食欲、消化吸收和能量代謝的下丘腦-胃軸心中的miR-183在12月齡小鼠中是明顯上調(diào)的，且在肝臟中的 表達(dá)也是顯著上調(diào)的?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，發(fā)明人又利用TargetScanHuman(www.targetscan.org)算法預(yù)測了在脊椎動(dòng)物中保守的miR-183的靶基因，然后與KEGG通路對(duì)比發(fā)現(xiàn)，很多miR-183的靶基因富集在胃酸分泌、唾液分泌、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路和二型糖尿病信號(hào)通路(表1)。另有68個(gè)miR-183的靶基因位于MAPK信號(hào)通路中該通路參與了脂肪細(xì)胞分化、膽固醇運(yùn)輸、二型糖尿病[5，6]；有84個(gè)miR-183的靶基屬于調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、脂肪細(xì)胞分化的PI3K-Akt信號(hào)通路[5，7]；和26個(gè)miR-183的靶基位于與肥胖、糖尿病、肝病相關(guān)的TGF-beta信號(hào)通路[5，8，9]；以及34個(gè)miR-183的靶基位于調(diào)節(jié)血糖和代謝的GnRH signaling pathway[10](表1)。

表1

基于以上研究，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)miR-183可以作為高血脂、脂肪肝、體重增加和二型糖尿病的標(biāo)志物，并隨后證明了通過抑制miR-183的功能可以預(yù)防和/或治療高血脂、脂肪肝、二型糖尿病和與這些疾病的癥狀相似的癥狀以及降低體重。

因此，本發(fā)明提供了抑制高血脂、脂肪肝、體重增加和二型糖尿病的標(biāo)志物miR-183的功能在預(yù)防和/或治療以下疾病和/癥狀中的應(yīng)用：高血脂、脂肪肝、體重增加和二型糖尿病以及與這些疾病的癥狀相似的癥狀，一種miR-183抑制劑，通過該miR-183抑制劑以抑制miR-183的功能的方法，以及包括有miR-183抑制劑的藥物組合物和試劑盒，以 及他們在預(yù)防和/或治療高血脂、脂肪肝、二型糖尿病和與這些疾病的癥狀相似的癥狀以及在降低體重中的應(yīng)用。

方法

本發(fā)明提供了一種抑制高血脂、脂肪肝、體重增加和二型糖尿病的標(biāo)志物miR-183的功能的方法，其中，該方法包括：將miR-183抑制劑與表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞接觸。

在一種優(yōu)選的情況下，miR-183具有SEQ ID No：1(人和鼠的miR-183序列完全一致)(UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU)所示的核苷酸序列。

根據(jù)本發(fā)明，所述“抑制miR-183的功能”是指相比于不使用本發(fā)明方法處理的同種的表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中miR-183對(duì)其靶基因表達(dá)下調(diào)的程度，使用本發(fā)明處理的所述表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中miR-183對(duì)其靶基因表達(dá)下調(diào)的程度降低了至少0.5倍，通?？梢越档椭辽?倍，例如圖2A和圖2B。

本發(fā)明提供在體內(nèi)或體外表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中抑制miR-183功能的方法。術(shù)語“抑制miR-183的功能”是指用試劑通過直接或間接作用于miR-183而使得被miR-183調(diào)節(jié)的靶基因的表達(dá)量升高。其方法包括但不限于下列幾種：

1)小分子化合物

miR-183抑制劑包括但不局限于自然存在或人工合成的小分子化合物，這類小分子化合物直接作用于miR-183而使得被miR-183調(diào)節(jié)的靶基因的表達(dá)量升高，通常是分子量大于50且小于2500道爾頓的有機(jī)化合物。這類候選化合物擁有與蛋白質(zhì)，特別是氫鍵相互作用的功能基團(tuán)，且通常包含至少一種胺，羰基，羥基或羧基基團(tuán)。這些小分子miR-183抑制劑可以通過合適的篩選方法或其它方法被發(fā)現(xiàn)。

2)反義寡核苷酸

所述反義寡核苷酸能通過與靶miR-183的直接結(jié)合來抑制靶miR-183的功能，包括反義RNA和反義DNA。優(yōu)選的，所述反義寡核苷酸與miR-183互補(bǔ)，具有8-23個(gè)核苷酸的長度，并且具有與miR-183的2-8位核苷酸互補(bǔ)的序列。

如背景技術(shù)部分所述的，公知的，微RNA能通過與靶基因部分互補(bǔ)配對(duì)來識(shí)別并沉默靶基因的表達(dá)和/或翻譯，同理的，miR-183也能夠通過結(jié)合與其部分互補(bǔ)的核苷酸序列而競爭性抑制其自身的功能，從而上調(diào)miR-183的靶基因的表達(dá)。因此，本發(fā)明中，術(shù)語“互補(bǔ)”不僅包括完全互補(bǔ)，還包括部分互補(bǔ)，只要能夠和miR-183結(jié)合并抑制其 功能即可。

因此，所述反義寡核苷酸具有如下的核苷酸序列：

a)SEQ ID No：4所示的核苷酸序列(AGTGAATTCTACCAGTGCCATA)；

b)在SEQ ID No：4所示的核苷酸序列中經(jīng)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸且與miR-183互補(bǔ)的核苷酸序列。

當(dāng)在非完全互補(bǔ)的情況下，也即，當(dāng)所述反義寡核苷酸為通過在SEQ ID No：4所示的核苷酸序列中經(jīng)缺失、取代或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸得到的核苷酸序列的情況下，在互補(bǔ)核苷酸區(qū)域內(nèi)，所述反義寡核苷酸優(yōu)選該與miR-183至少具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的互補(bǔ)。更為優(yōu)選的，在miR-183的2-8為的核苷酸區(qū)域內(nèi)，所述反義寡核苷酸至多具有3個(gè)與miR-183錯(cuò)配的核苷酸。

如上所述的，在所述反義寡核苷酸與miR-183非完全互補(bǔ)的情況下，進(jìn)一步優(yōu)選的，與SEQ ID No：4相比，在長度上將至多有10個(gè)、9個(gè)、8個(gè)、7個(gè)、6個(gè)、5個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè)核苷酸的差別。

在一種優(yōu)選的情況下，與miR-183非完全互補(bǔ)的反義寡核苷酸具有SEQ ID No：5所述的核苷酸序列(AGTGAGCTCTACCAGTGGCATA)。

另外，本發(fā)明還包括對(duì)所述反義寡核苷酸進(jìn)行一些常規(guī)的修飾以改善所述反義寡核苷酸的穩(wěn)定性和活性，這些均屬于本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明需要指出的是，具有如上特性的完全或非完全互補(bǔ)的RNA也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。綜合考慮在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，本發(fā)明優(yōu)選所述反義寡核苷酸為DNA。

由于所述反義寡核苷酸能夠與miR-183互補(bǔ)(完全互補(bǔ)或部分互補(bǔ))，因此，當(dāng)所述反義寡核苷酸在體內(nèi)或體外與表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞接觸時(shí)，所述反義寡核苷酸能夠與miR-183進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，并抑制miR-183與其靶基因的結(jié)合(也即，抑制miR-183的活性)，從而打破了miR-183對(duì)其靶基因的沉默。

根據(jù)本發(fā)明，所述方法包括將有效量的和miR-183互補(bǔ)的反義寡核苷酸引入到表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中。其中，所述“有效量”根據(jù)表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞的不同而有所不同，并且呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)，如本發(fā)明下圖2A所示的，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)手段以及所達(dá)到的預(yù)期目的能夠容易的確定針對(duì)表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞的有效劑量。

當(dāng)所述接觸為體內(nèi)接觸時(shí)，可以通過常規(guī)的核酸給藥的方法將本發(fā)明的反義寡核苷 酸給藥至個(gè)體中。例如，可以使用如下的方法進(jìn)行所述反義寡核苷酸的給藥：所述反義寡核苷酸可以通過病毒感染、微注射、或者囊泡融合的方法進(jìn)行給藥，或者也可以通過射流注射的方法用于所述反義寡核苷酸的肌肉給藥。另外，也可以將所述反義寡核苷酸涂覆到金微粒上，然后通過粒子轟擊設(shè)備或“基因槍”等公知方法進(jìn)行經(jīng)皮給藥。這些均為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段，本發(fā)明在此不再一一贅述。

再者，還可以以表達(dá)載體的方法將所述反義寡核苷酸引入到表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中。這類表達(dá)載體具有位于鄰近啟動(dòng)子序列的便捷性限制位點(diǎn)以便于所述反義寡核苷酸的插入。其中，位于所述表達(dá)載體中的轉(zhuǎn)錄盒可以包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、靶基因或其片段和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。所述載體例如可以為但并不限于，質(zhì)粒，病毒等等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)際情況自行進(jìn)行選擇。

此外，所述反義寡核苷酸還可以通過呼吸道噴霧給藥的方式從而被引入到表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中，例如通過制備成噴霧制劑的方式給藥。

另外，所述反義寡核苷酸還可以通過口服給藥的方式從而被引入到表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中，例如通過制備成口服制劑的方式給藥，或是通過將所述反義寡核苷酸與食品混合的方式進(jìn)行口服給藥。

如上所述的個(gè)體可以為任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括但不限于：有蹄動(dòng)物，例如，牛，山羊，豬，綿羊等；嚙齒動(dòng)物，例如，倉鼠，小鼠，大鼠，兔；靈長類，例如，猴子，狒狒，人類等。

當(dāng)所述接觸為體外接觸時(shí)，可以通過將所述反義寡核苷酸或含有所述反義寡核苷酸的載體(例如，含有所述反義寡核苷酸的藥物)直接加入到培養(yǎng)有表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞的基質(zhì)中進(jìn)行接觸，并在常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)條件下對(duì)導(dǎo)入有所述反義寡核苷酸的表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

3)RNAi試劑

在代表性的實(shí)施例中，RNAi試劑靶向miR-183的前體分子(precursor of microRNA,pre-microRNA(人的序列)，如SEQ ID No：2所示，CCGCAGAGUGUGACUCCUGUUCUGUGUAUGGCACUGGUAGAAUUCACUGUGAACAGUCUCAGUCAGUGAAUUACCGAAGGGCCAUAAACAGAGCAGAGACAGAUCCACGA)，通過RNA干擾的機(jī)制來調(diào)節(jié)miR-183的表達(dá)，也即，間接抑制miR-183的功能。

本領(lǐng)域公知的是，RNA干擾(RNA interference,RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。而具體到本申請(qǐng)，本申請(qǐng)通過使用miR-183的前體分子的干擾RNA，對(duì)miR-183的前體分子造成基因沉默，從而降低了miR-183的前體分子的水平，由此，降低了由miR-183的前體分子轉(zhuǎn)變?yōu)榈某墒靘iR-183的水平，也即，抑制了miR-183的功能，從而升高miR-183靶基因的表達(dá)水平。

RNAi試劑可以是小的RNA分子，通常是一條理論上可以形成小發(fā)夾(small hairpin)結(jié)構(gòu)的單鏈脫氧寡核苷酸(shRNA)，其長度一般不會(huì)超過100個(gè)核苷酸，典型的不會(huì)超過75個(gè)核苷酸；或者是一條15-30bp的雙鏈脫氧寡核苷酸(siRNA)，最典型的是20-23bp，如本發(fā)明中的實(shí)施例5所描述的siRNA(如SEQ ID No：7所示的反義鏈和如SEQ ID No：8所示的正義鏈)。

在一些應(yīng)用中，RNAi試劑也可以是編碼shRNA或者siRNA的模板DNA。這些模板DNA可能存在于載體，比如質(zhì)粒載體或病毒載體等載體中；也可以不存在與載體中，只是一段編碼shRNA或者siRNA的模板DNA加一個(gè)控制其轉(zhuǎn)錄的常見啟動(dòng)子序列片段。

其中，所述RNAi試劑與表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞的接觸也可以為體內(nèi)接觸或是體外接觸。所述RNAi試劑的給藥方法可以參照如上對(duì)反義寡核苷酸的描述進(jìn)行，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明在此不再詳細(xì)贅述。

miR-183抑制劑

本發(fā)明還提供了miR-183抑制劑，所述miR-183抑制劑的具體類型可以為如上所述的小分子化合物、反義寡核苷酸和RNAi試劑中的至少一種，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明在此不再詳細(xì)贅述。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中，該藥物組合物含有如上所述的miR-183抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體。

在本發(fā)明的組合物中，作為活性成分的如上所述的miR-183抑制劑的含量可以在較大的范圍內(nèi)變化，例如，可以為0.01-99重量％，優(yōu)選的，可以為1-70重量％，更優(yōu)選的， 可以為5-30重量％。

根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物可以制備為本領(lǐng)域常規(guī)的各種劑型，本發(fā)明對(duì)此并沒有特別的限制，例如，可以配制成固體，半固體，液體或氣體形式的，例如，片劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉末、顆粒、軟膏、栓劑、注射劑、吸入劑、氣溶膠等等，本發(fā)明在此不再一一列舉。

因此，根據(jù)藥物劑型的不同也可以進(jìn)行多種形式的給藥，例如但不限于，口服給藥，經(jīng)頰給藥，直腸給藥，胃腸外給藥，腹膜內(nèi)給藥，呼吸道吸入給藥，皮內(nèi)給藥，經(jīng)皮給藥。

其中，所述藥學(xué)上可接受的載體可以根據(jù)劑型的不同而進(jìn)行不同的選擇，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。例如但不限于，所述藥學(xué)上可接受的載體可以為淀粉、膠質(zhì)、乳糖、葡萄糖、蔗糖、微晶纖維素、高嶺土、甘露醇、磷酸氫鈣、氯化鈉、海藻酸等等。

另外，還可以加入常規(guī)的添加劑如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。

另外，所述藥學(xué)上可接受的載體還可以包括能夠提高所述反義寡核苷酸靶向特定器官或組織或細(xì)胞的靶向試劑，所述靶向試劑例如可以為靶向肽，還可以包括能夠攜帶所述反義寡核苷酸更容易進(jìn)入表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞的穿膜試劑，例如穿膜肽，脂質(zhì)體，微囊泡和膜脂蛋白等。

根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物中還可以添加有調(diào)味劑，例如，薄荷、冬青油等等。另外，還可以在所述藥物組合物中添加著色劑以使所制備的劑型在外觀上具有一定的吸引力，或者與其他產(chǎn)品進(jìn)行區(qū)別。

根據(jù)本發(fā)明，所述反義寡核苷酸還可以與其他能夠起到類似作用的常規(guī)藥物進(jìn)行聯(lián)合以制備成聯(lián)合藥物組合物。

試劑盒

本發(fā)明提供了一種試劑盒，其中，所述試劑盒包括如上所述的反義寡核苷酸，可選的，所述試劑盒還包括額外的試劑，例如，如上所述的藥學(xué)上可接受的載體、調(diào)味劑和/或著色劑、增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、靶向試劑或穿膜試劑。

根據(jù)本發(fā)明，所述額外的試劑可以與所述反義寡核苷酸結(jié)合在一起存在于所述試劑盒中，或者也可以獨(dú)立的存放于所述試劑盒中，待使用時(shí)再進(jìn)行混合。

本發(fā)明的試劑盒中還可以包括有使用說明書，所述說明書的存在形式不受特別的限制，例如，可以為打印的紙質(zhì)形式，可以為CD的形式，或是為網(wǎng)址的形式，使用時(shí)通過互聯(lián)網(wǎng)獲取使用方法。

應(yīng)用

本發(fā)明提供了抑制高血脂、脂肪肝、體重增加和二型糖尿病的標(biāo)志物miR-183的功能在預(yù)防和/或治療以下至少一種疾病和/或癥狀中的應(yīng)用。

所述疾病和/或癥狀包括：高血脂、脂肪肝、體重增加和二型糖尿病以及與這些疾病的癥狀相似的癥狀。

特別的，所述應(yīng)用包括制備用于預(yù)防和/或治療以上任意一種疾病和/或癥狀的藥物和/或食品。其中，所述食品包括保健品。

本發(fā)明還提供了如上所述的miR-183抑制劑、如上所述的藥物組合物、如上的試劑盒和/或如上所述的方法在抑制miR-183的功能中的應(yīng)用。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述應(yīng)用包括預(yù)防和/或治療以上任意一種疾病和/或癥狀。

另外，本發(fā)明還提供了如上所述的miR-183抑制劑、如上所述的藥物組合物在制備用于降低miR-183量的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述藥物包括用于預(yù)防和/或治療以上任意一種疾病和/或癥狀的藥物和/或食品。其中，所述食品包括保健品。

根據(jù)本發(fā)明，所述治療是指受試者與由miR-183引起的疾病或狀態(tài)相關(guān)的癥狀的改善或完全消失，其中，廣泛的意義上的改善是指降低至少一個(gè)參數(shù)。具體到本申請(qǐng)，例如，可以為體重的減輕、血脂和/或血糖的降低和脂肪肝的改善等等。

治療的個(gè)體可以為任意被如上所述的癥狀所困擾的個(gè)體，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物。

根據(jù)本發(fā)明，所述“抑制miR-183的功能”是指相比于不使用本發(fā)明方法處理的同種的表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中miR-183對(duì)其靶基因表達(dá)下調(diào)的程度，使用本發(fā)明處理的所述表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中miR-183對(duì)其靶基因表達(dá)下調(diào)的程度降低了至少0.5倍，通常可以降低至少1倍，例如圖2A和圖2B。

所述藥物的給藥劑型以及成分可以參照如上的描述，本發(fā)明在此不再詳細(xì)贅述。

以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，

miR-183過表達(dá)載體

將SEQ ID No：3所示的(人的)miR-183基因(CCGCAGAGTGTGACTCCTGTTCTGTGTATGGCACTGGTAGAATTCACTGTGAACAGTCTCAGTCAGTGAATTACCGAAGGGCCATAAACAGAGCAGAGACAGATCCACGA)克隆至pCAG-GFP載體中，得到miR-183基因的過表達(dá)質(zhì)粒pCAG-miR-183-GFP。其中，SEQ ID No：3所示的miR-183基因的合成以及克隆由金斯瑞公司進(jìn)行。

miR-183感受載體(miR-183sensor vector)

miR-183感受載體是通過把兩個(gè)miR-183結(jié)合并調(diào)節(jié)的如SEQ ID No：11所示的靶點(diǎn)序列(TGGAAATGAGATCTTGTGCCATAGCTACGGTAAGGATTTTCAGTGCCATT)克隆到pGL3-SV40載體的火熒光素酶(Fire luciferase)基因3'下游的xbaI位點(diǎn)上而得到的，從而miR-183感受載體中火熒光素酶的表達(dá)就受miR-183的調(diào)節(jié)。

實(shí)施例1

本實(shí)施例用于說明2月齡的和12月齡小鼠中miR-183表達(dá)量的差異

(1)總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

野生型C57/Bl6雄性小鼠2月齡的和12月齡的各三只，頸椎脫臼處死后，各取500μl的血液，解剖取整個(gè)下丘腦和半個(gè)胃，以及200mg的肝、肌肉和附睪脂肪組織。加1ml的Trizol試劑(invitrogen)至血液中，并混勻。再分別加入200μl的Trizol試劑至下丘腦、胃、肝、肌肉和脂肪組織，然后用剪刀剪碎下丘腦、胃、肝、肌肉和脂肪組織，再用電動(dòng)勻漿器把這些組織研磨成碎末，之后按Trizol的說明書把整個(gè)組織中的總RNA提取出來。用無核酸酶的水溶解RNA，然后用Nanodrop 2000儀器測定RNA的260與280的比值，取比值大于1.8的樣本繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。之后用Qubit測定RNA的濃度后，用生物分析儀(bioanalyzer)檢測RNA的完整性，RNA完整性指數(shù)RIN要大于0.9。其中，為了確保每種組織或器官都能夠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可以設(shè)置多個(gè)重復(fù)進(jìn)行總RNA提取。

從各個(gè)樣本中取1μg的總RNA，利用flashPAGE篩分儀(Ambion)分離總RNA中的10-40nt的短RNA，然后用Illumina的試劑盒反轉(zhuǎn)錄制備微RNA的cDNA文庫，再在第二代測序儀上測定樣品中微RNA的表達(dá)水平。

結(jié)果顯示12月齡小鼠的下丘腦、胃和肝中miR-183的表達(dá)量比2個(gè)月齡小鼠中的表 達(dá)要高，即表明miR-183的表達(dá)量隨著年齡的增長而在下丘腦、胃和肝中升高，與體重的增長及肥胖呈正相關(guān)。

(2)定量PCR檢測miR-183的表達(dá)量

為了確認(rèn)miR-183在下丘腦、胃和肝中的表達(dá)量是隨著年齡的增長而升高的，用定量PCR檢測miR-183的表達(dá)量。從各個(gè)樣本中取1μg的總RNA，用Catch AllTM miRNA&mRNA RT-PCR試劑盒(Pengekiphen,Kunshan)反轉(zhuǎn)錄微RNA和mRNA的cDNA。用于檢測的引物有：如SEQ ID No：12所示的miR-183正向引物(5'-TATGGCACTGGTAGAATTCACT-3')；如SEQ ID No：13所示的U6正向引物(5'-CGCAAGGATGACACGCAAATTCG-3')；反向引物為試劑盒提供的通用引物。檢測的儀器為Bio-Rad公司的iQ5系統(tǒng)，試劑為TaKaRa公司的SYBR Green Mix。每個(gè)樣品同時(shí)檢測三個(gè)復(fù)孔，以U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔct方法計(jì)算miR-183在每個(gè)樣本中的表達(dá)水平。然后把2月齡小鼠各個(gè)臟器的miR-183的表達(dá)水平定為1，并計(jì)算12月齡小鼠中的miR-183相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果見圖1。

如圖1所示，主控食欲的下丘腦-胃中心軸的miR-183的表達(dá)量在12月齡小鼠中是明顯上調(diào)的，且miR-183在肝臟中的表達(dá)也是顯著上調(diào)的。定量PCR確認(rèn)12月齡小鼠的下丘腦、肝和胃中miR-183的表達(dá)量比2月齡小鼠中的表達(dá)分別高1.8、1.6和2.4倍。由此可以證明，miR-183的上調(diào)和體重增加以及脂肪肝的形成是相關(guān)的。其中，圖1中，**P<0.01，*p<0.05。

實(shí)施例2

本實(shí)施例用于說明反義寡核苷酸對(duì)miR-183的體外調(diào)節(jié)作用

將人胚腎細(xì)胞HEK-293T培養(yǎng)在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)箱恒定保持37℃和5％的CO₂。以每孔10萬個(gè)細(xì)胞的接種量將HEK-293T細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)體積為500μl。第二天用脂質(zhì)體2000(Invitrogen)按照說明書將如下表2的設(shè)置共轉(zhuǎn)染KEK-293細(xì)胞中，36小時(shí)后用雙熒光素酶分析儀(Promega)測量從miR-183感受載體中表達(dá)的熒光素酶的活力。每次設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

其中，各組別中，miR-183感受載體的轉(zhuǎn)入量以每孔計(jì)：miR-183感受載體500ng，pCAG-GFP空白載體20ng，miR-183過表達(dá)載體500ng，寡核苷酸配置成50μM的溶液。另外，當(dāng)轉(zhuǎn)入的寡核苷酸為miR-183ASO時(shí)，分別取0.5μl和1μl的50μM的寡核苷酸溶 液，加入到細(xì)胞培養(yǎng)液后其終濃度分別為0.05μM和0.1μM。以測定熒光素酶的活力，并以其為縱坐標(biāo)，miR-183ASO濃度為橫坐標(biāo)，繪制曲線。結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，miR-183ASO能抑制miR-183的功能。

由圖2A可以看出，共轉(zhuǎn)染miR-183感受載體、miR-183過表達(dá)載體和不同濃度的miR-183ASO，熒光素酶活力檢測結(jié)果表明miR-183ASO能抑制miR-183的功能，且有劑量效應(yīng)。

由圖2B可以看出，過表達(dá)miR-183能抑制miR-183感受載體的表達(dá)(左1柱與左2柱)；miR-183ASO和miR-183錯(cuò)配ASO能抑制miR-183的功能(左4柱和左5柱)，miR-183ASO的抑制效果要優(yōu)于miR-183錯(cuò)配ASO的，而隨機(jī)對(duì)照核苷酸不能抑制miR-183的功能(左3柱)，Data＝平均值±SEM；N＝3；***P<0.001，**P<0.01。并且，在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)miR-183能抑制miR-9感受載體中報(bào)告基因熒光素酶的表達(dá)水平至對(duì)照組的水平的46％，而當(dāng)共轉(zhuǎn)終濃度0.1μM的miR-183ASO時(shí)，能使miR-183感受載體中報(bào)告基因熒光素酶表達(dá)恢復(fù)至對(duì)照組水平的76％，即miR-183ASO能夠抑制miR-183功能的56％。

表2

實(shí)施例3

本實(shí)施例用于說明miR-183的反義寡核苷酸在體內(nèi)調(diào)節(jié)miR-183靶基因及其后續(xù)影響能量代謝的作用

將12周齡的體重差異少于10％的10只野生型C57/Bl6雄性小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)隨機(jī)分成兩組，飼養(yǎng)兩周后(飼喂20％的高脂飼料)，實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射3.5OD/100μl的miR-183ASO(溶于PBS種)，對(duì)照組小鼠注射100μl的溶劑PBS。第一周每隔三天注射一次，之后每兩周注射一次。每周稱量小鼠的體重，體重變化以及體重增長速率分別見圖3A和圖3B。

從注射開始的兩個(gè)半月后，測量小鼠的空腹血糖。早上9點(diǎn)，把小鼠的飼料拿開，饑餓6個(gè)小時(shí)后，剪尾取一滴血，然后用羅氏卓越型血糖儀(型號(hào)是ACCU-CHEK Performa)和卓越金銳血糖試紙測量血糖濃度，見圖3C。

從注射開始的三個(gè)月后，小鼠麻醉處死，從右心房取血，并解剖出和稱量胃、肝、附睪脂肪和腎的重量，結(jié)果見圖4A，相對(duì)體重的比例見圖4B。血液5000rpm離心15分鐘后取血清，用全自動(dòng)生化分析儀(日立7180)測量血清中總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量，見圖5。

由圖3可以看出，與對(duì)照組相比，靜脈注射miR-183的反義寡核苷酸(miR-183ASO)能抑制小鼠的體重增長(圖3A)和體重的增長速率(圖3B)。Data＝平均值±SD；N＝5；*P<0.05。靜脈注射miR-183的反義寡核苷酸(miR-183ASO)能降低高脂食物誘導(dǎo)的高血糖(圖3C)，Data＝平均值±SEM；N＝3；*P<0.05。

由圖4可以看出，與對(duì)照組相比，靜脈注射miR-183ASO能減少肝和胃的重量(圖4A)以及肝和胃的重量相對(duì)體重的比例(圖4B)；miR-183ASO對(duì)腎重量沒有影響(圖4B)。miR-183ASO還能減少血液中總膽固醇和甘油三脂的含量，但對(duì)高密度脂蛋白和低密度脂蛋白沒有影響(圖5)。Data＝平均值±SD；N＝5；*P<0.05；**P<0.01。

按照實(shí)施例1中的方法提取對(duì)比實(shí)驗(yàn)組和miR-183ASO注射組小鼠的下丘腦和胃的總RNA，經(jīng)二代測序并分析得知：與對(duì)比實(shí)驗(yàn)組相比，miR-183ASO注射組上調(diào)了參與糖脂代謝或二型糖尿病或肝病相關(guān)的PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、TGF-beta信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路中的很多基因(表3)。此外還上調(diào)了胃酸分泌、唾液分泌、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路和二型糖尿病信號(hào)通路中的很多基因(表3)。

表3

綜上所述，抑制miR-183的功能能夠減少體重的增長，這為肥胖的治療提供了新的思路。目前治療重度肥胖最好的方法是做胃繞道手術(shù)，這說明胃腸是治療肥胖的一個(gè)重要靶器官。而本申請(qǐng)證明了抑制miR-183的功能能夠減少胃的重量及其與體重的比例，并且影響胃酸和唾液的分泌來影響食物的消化吸收，因此，可以推斷出miR-183是一個(gè)治療肥胖的重要靶點(diǎn)。

已知甘油三脂和總膽固醇高會(huì)導(dǎo)致心血管疾病。這些數(shù)據(jù)表明抑制miR-183的功能能降低血液中甘油三脂和總膽固醇的濃度，從而減少高血脂引起的心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，另外，如前述的，抑制miR-183的功能可減少高脂食物誘導(dǎo)的肝重的增加，可知miR-183是一個(gè)治療高血脂和脂肪肝的重要靶點(diǎn)。

而且本發(fā)明的分子實(shí)驗(yàn)證明了miR-183在體內(nèi)調(diào)節(jié)了控制食欲、消化吸收、能量代謝、脂肪細(xì)胞分化信號(hào)通路中的很多基因，這闡明了miR-183反義核苷酸能降血脂、降血糖和抑制體重的分子機(jī)制。

實(shí)施例4

本實(shí)施例用于說明小干擾RNA(siRNA)對(duì)miR-183的體外調(diào)節(jié)作用

將人胚腎細(xì)胞HEK-293T培養(yǎng)在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)箱恒定保持37℃和5％的CO₂，培養(yǎng)體積為500μl。第二天用脂質(zhì)體2000(Invitrogen)按照說明書將miR-183siRNA(反義鏈SEQ ID No：7：5’AGACUGUUCACAGUGAAUUCU’3，正義鏈SEQ ID No：8：5’AGAAUUCACUGUGAACAGUCU’3，上海吉瑪合成，其中，在SEQ ID No：7和SEQ ID No：8的3’端均具有dTdT的結(jié)構(gòu))和隨機(jī)對(duì)照RNA(反義鏈SEQ ID No：9：5’CGUGACACGUUCGGAGAA’3；正義鏈SEQ ID No：10：5’UUCUCCGAACGUGUCACGU’3，上海吉瑪合成，其中，在SEQ ID No：9和SEQ ID No：10的3’端均具有dTdT的結(jié)構(gòu))分別轉(zhuǎn)染KEK-293至細(xì)胞中，36小時(shí)后用Trizol裂解細(xì)胞并抽提總RNA，然后用于實(shí)施例1相同的定量PCR試劑盒和引物檢測miR-183的表達(dá)量。每次設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果如圖6所示，***P<0.01。

結(jié)果顯示用miR-183siRNA能下調(diào)miR-183表達(dá)量的72％，由此可知，與miR-183的靶基因結(jié)合的miR-183的量也下調(diào)了72％，從而提升了靶基因的表達(dá)水平。可見，通過RNA干擾miR-183前體的方式也能夠成功抑制miR-183的功能。

總結(jié)

本發(fā)明通過將miR-183抑制劑(包括反義寡核苷酸以及干擾RNA)與在體內(nèi)或體外表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞進(jìn)行接觸，能夠充分抑制表達(dá)miR-183的靶細(xì)胞中miR-183的功能(反義寡核苷酸抑制miR-183與其靶基因的結(jié)合，干擾RNA能夠降低miR-183的表達(dá)量，從而抑制miR-183的功能)，當(dāng)用于個(gè)體給藥時(shí)，能夠有效的預(yù)防和/或治療miR-183量升高所引起的疾病，例如，高血脂、脂肪肝、體重增加和二型糖尿病。相比于傳統(tǒng)的單一降糖或單一降血脂或單一減肥的藥物，本發(fā)明提供的療法能全面地調(diào)節(jié)食欲、消化吸收、糖、脂代謝，且為寡核苷酸；因而功效強(qiáng)大且副作用小。為肥胖、脂肪肝、高血脂和二型糖尿病等疾病的治療提供了新方向，從而具有極高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型， 這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實(shí)施方式中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合。為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。

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