本發(fā)明涉及一種山豆根多糖有效部位及其制備方法，屬于醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：山豆根為豆科植物越南槐(SophoratonkinensisGagnep)的干燥根和根莖，主要產(chǎn)于廣西、廣東、貴州等省，性味苦寒，歸肺經(jīng)。藥典記載山豆根具有清熱解毒，利咽喉，散腫痛的功效。山豆根的主要成分為：生物堿類、黃酮類、有機(jī)酸、皂苷和多糖類化合物。藥理實(shí)驗(yàn)表明，山豆根具有抗腫瘤、抗病毒、抗肝炎、抗心律失常等多方面藥理活性，且據(jù)研究報(bào)道其中所含的生物堿成分多為這些藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)代研究表明山豆根對肝炎治療效果顯著，如含山豆根總生物堿的制劑肝炎靈注射液經(jīng)長期臨床應(yīng)用顯示，能夠降低轉(zhuǎn)氨酶，提高機(jī)體免疫力，對慢性活動(dòng)性肝炎具有較好療效。比如中國專利CN85100392A公開了一種從植物山豆根中提取治療肝炎用藥的方法，中國專利CN1457778A公開了山豆根的口服制劑、制備方法及應(yīng)用。這些專利中所涉及到的均為山豆根中的主要次生代謝產(chǎn)物一生物堿類成分。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明：山豆根具有肝臟毒性，給予大鼠16g/kg山豆根水煎液可導(dǎo)致明顯的肝損傷，且其損傷機(jī)制與炎癥因子的作用和脂質(zhì)過氧化有關(guān)，與四氯化碳的肝毒性具有一定的相似性(中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，第19卷第18期，2013年9月，第293-296頁)。并且臨床前研究發(fā)現(xiàn)：山豆根既溶于水又溶于乙醇的總提取物(生物堿及黃酮類為主)給小鼠灌胃(25g/kg)，出現(xiàn)呼吸抑制、超大型震顫、抽搐等癥狀，甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡。因此，近期開始對山豆根非生物堿成分的活性進(jìn)行研究，例如：中國專利CN1306854A提出了一種山豆根的水提醇沉部位，具體制備方法是：取山豆根，用水浸泡后加熱提取，再經(jīng)0～3次熱水提取后，過濾，合并水提液，濃縮，加乙醇，取醇沉部分即得。”該專利指出山豆根中的水提醇沉物是以多糖等大分子物質(zhì)為主的為非生物堿部分；另外，該專利的實(shí)驗(yàn)表明：山豆根中的水提醇沉物可降低對CCL4所造成的急性肝損傷，可使大鼠死亡率由30％下降到10％，具有護(hù)肝和免疫調(diào)節(jié)作用。但至今未見關(guān)于山豆根多糖有效部位的急性毒性和肝臟毒性的研究報(bào)道及毒性降低后該部位的藥用價(jià)值的研究報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種急性毒性和肝臟毒性均很低、 且免疫增強(qiáng)活性顯著的山豆根多糖有效部位及其制備方法，以拓寬山豆根的臨床應(yīng)用。本發(fā)明所述的山豆根多糖有效部位，是對山豆根的水提液進(jìn)行醇沉后分級干燥得到，其中含有總多糖的質(zhì)量百分比≥65％，含有苦參堿的質(zhì)量百分比＜0.5％。作為優(yōu)選方案，所述山豆根多糖有效部位中含有總多糖的質(zhì)量百分比≥70％。作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述山豆根多糖有效部位中含有總多糖的質(zhì)量百分比≥85％。本發(fā)明所述的山豆根多糖有效部位的制備方法，包括如下具體步驟：a)取山豆根藥材，用水煎煮，制備山豆根水煎液；b)在75～80℃，對山豆根水煎液進(jìn)行減壓濃縮至濃度為1～2kg/L，然后在95～100℃下進(jìn)行常壓加熱1～2小時(shí)，再冷卻至室溫，制得山豆根水提液；c)向步驟b)所得山豆根水提液中加入體積分?jǐn)?shù)為90～100％的乙醇，邊加邊攪拌，至最終乙醇的體積分?jǐn)?shù)為75～85％，靜置，收集沉淀物；d)對所得沉淀物進(jìn)行分級減壓干燥：先在80±2℃下減壓干燥10～14小時(shí)，然后在75±2℃下減壓干燥至全干，即得所述山豆根多糖有效部位。作為優(yōu)選方案，所述山豆根水煎液的制備，包括如下操作：將山豆根藥材，加水浸泡后加熱到95～100℃，進(jìn)行1～3次煎煮，每次煎煮時(shí)間為0.5～1.5小時(shí)。作為優(yōu)選方案，每次煎煮，加水的重量為山豆根藥材重量的4～8倍。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著性有益效果：1、經(jīng)測試分析：本發(fā)明提供的山豆根多糖有效部位中含有總多糖的質(zhì)量百分比≥65％，苦參堿的質(zhì)量百分比＜0.5％；相對于現(xiàn)有的水提醇沉部位，本發(fā)明提供的山豆根多糖有效部位的急性毒性和肝臟毒性均發(fā)生了顯著降低，說明本發(fā)明通過控制苦參堿的含量，使得山豆根多糖有效部位的安全性得到了顯著性提高；2、經(jīng)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明提供的山豆根多糖有效部位具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，說明本發(fā)明通過合理控制山豆根多糖有效部位中的總多糖和苦參堿的含量，不僅明顯降低了毒性，而且同時(shí)具有顯著的免疫增強(qiáng)活性，相對于現(xiàn)有技術(shù)，取得了顯著性進(jìn)步和出乎意料的效果，對研究開發(fā)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的山豆根藥物制劑具有重要意義；3、另外，本發(fā)明的制備方法簡單，重復(fù)性好(不同批次制得的有效部位指紋圖譜相似度高達(dá)99％)，且得率可高達(dá)9.11％，適于規(guī)?；a(chǎn)，具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為實(shí)施例2所制備的不同批次樣品的指紋圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和對比例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1：山豆根多糖有效部位的制備a)取山豆根飲片8kg，用48kg水浸泡60min，然后加熱回流煎煮1h，煎煮液200目過濾，藥渣再加入48kg水加熱回流煎煮1h，煎煮液200目過濾，合并兩次濾液，得到山豆根水煎液；b)在75～80℃下，對山豆根水煎液進(jìn)行減壓濃縮至濃度為1.5kg/L，然后在98℃下進(jìn)行常壓加熱1.5小時(shí)，再冷卻至室溫，制得山豆根水提液；c)向步驟b)所得山豆根水提液中加入體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇，邊加邊攪拌，至最終乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80％，靜置，收集沉淀物；d)對所得沉淀物進(jìn)行分級減壓干燥：先在80℃下減壓干燥12小時(shí)，然后在75℃下減壓干燥至全干，即得所述山豆根多糖有效部位728.8g，產(chǎn)率為9.11％。采用苯酚—硫酸法，用分光光度法測定，以葡萄糖計(jì)，所述山豆根多糖有效部位中含糖量為88wt％。經(jīng)HPLC分析：所述山豆根多糖有效部位中含苦參堿(MT)的含量為0.46wt％，含氧化苦參堿(OMT)的含量為0.046wt％。實(shí)施例2：制備工藝的穩(wěn)定性考察按照實(shí)施例1的制備工藝，重復(fù)制備出三批次山豆根多糖有效部位，通過HPLC制作中藥指紋圖譜，對比不同批次樣本間的相似度。HPLC條件如下所示：實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1所示，圖中的R為實(shí)施例1樣品，S1、S2、S3分別為本實(shí)施例制備的批次1-3樣品，由圖1可見：樣品R、S1、S2、S3的指紋圖譜相似度達(dá)到99％，說明本發(fā)明的制備工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，有望進(jìn)行工業(yè)化大生產(chǎn)。對比例：山豆根水提醇沉部位的制備參照中國專利CN1306854A實(shí)施例1：稱取剪碎的山豆根8kg，用12倍劑量水浸泡過夜，加熱提取2h，傾出水液，趁熱離心(3000r/min，l0min)，藥渣繼續(xù)加10倍、8倍劑量水分別加熱提取1.5h、1h，各自傾出水液趁熱離心，將水液逆梯度濃縮至1：1(1g生藥相當(dāng)于1mL)，加入體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇使含醇量達(dá)80％，低溫靜置過夜后離心，沉淀加1：50熱水溶解后再離心，取水液加入體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇使醇量達(dá)80％，低溫靜置過夜后離心，沉淀加95％乙醇攪拌再離心，沉淀真空干燥(40℃)，得山豆根水提醇沉部位257.6g，產(chǎn)率為3.20％。采用苯酚—硫酸法，用分光光度法測定，以葡萄糖計(jì)，所述山豆根水提醇沉部位中含糖量為58wt％。經(jīng)HPLC分析：所述山豆根水提醇沉部位中含苦參堿(MT)的含量為0.65wt％，含氧化苦參堿(OMT)的含量為0.132wt％。一、毒性測試試驗(yàn)將實(shí)施例1制備的山豆根多糖有效部位和對比例制備的山豆根水提醇沉部位，分別作用于處理至5dpf(受精后5天)的野生型AB系斑馬魚，評價(jià)其急性毒性和肝臟毒性。用待測藥物處理一定階段的野生型AB系斑馬魚幼魚到5dpf，設(shè)置系列濃度，同時(shí)設(shè)置空白對照組，每個(gè)濃度均處理30尾斑馬魚。藥物處理期間，每天統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組的斑馬魚死亡數(shù)量并及時(shí)移除，通過OriginPro8.0軟件擬合濃度-致死曲線經(jīng)過曲線擬合，可以求得LC50、LC10，測試結(jié)果見表1～3所示。表1山豆根多糖有效部位誘發(fā)的斑馬魚死亡率(n＝30)濃度(μg/mL)用魚數(shù)(尾)死亡數(shù)(尾)死亡率(％)250030003000300035003013.340003026.7450030516.750003030100表2山豆根水提醇沉部位誘發(fā)的斑馬魚死亡率(n＝30)濃度(μg/mL)用魚數(shù)(尾)死亡數(shù)(尾)死亡率(％)60030008003013.31000302273.31200303010014003030100表3毒性比較結(jié)合表1至表3可見：誘發(fā)的斑馬魚100％死亡率需要的山豆根多糖有效部位的濃度(5000μg/mL)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于山豆根水提醇沉部位的濃度(1200μg/mL)，在急性毒性實(shí)驗(yàn)中，山豆根多糖有效部位的LC10和LC50值均為山豆根水提醇沉部位的LC10和LC50值的5倍，且在肝臟毒性實(shí)驗(yàn)中，山豆根多糖有效部位的LC10值也為山豆根水提醇沉部位的LC10值的5倍多；說明，本發(fā)明通過合理控制山豆根多糖有效部位中的苦參堿的含量，明顯降低了毒性，相對于現(xiàn)有技術(shù)，取得了顯著性進(jìn)步，對研究開發(fā)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的山豆根藥物制劑具有重要意義。二、對正常小鼠淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的體外試驗(yàn)通過觀察實(shí)施例1制備的山豆根多糖有效部位和對比例制備的山豆根水提醇沉部位，對絲裂原ConA誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響，研究其免疫調(diào)節(jié)作用。(1)脾淋巴細(xì)胞制備：BALB/C小鼠脫脊椎處死，無菌取其脾臟，制成單細(xì)胞懸液，去除紅細(xì)胞后，用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度；(2)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入淋巴細(xì)胞懸液4×105個(gè)/孔，50μLConA(終濃度5μg/mL)，取山豆根多糖有效部位和山豆根水提醇沉部位，分別配制成終濃度分別為100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL的給藥溶液；每個(gè)濃度三復(fù)孔，每孔總體積為200μL， 并設(shè)相應(yīng)的無ConA對照孔以及無藥物對照孔；37度，5％CO2，培養(yǎng)48小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束前8小時(shí)，每孔加入25μL3H-胸腺嘧啶核苷酸(10μCi/mL)；繼續(xù)培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；將細(xì)胞用細(xì)胞收集儀收集至玻璃纖維膜上，加入閃爍液后于Beta記數(shù)儀(MicroBetaTrilux,PerkinElmer)讀取摻入細(xì)胞DNA的3H-TdR量，以cpm值代表細(xì)胞增殖的情況，試驗(yàn)結(jié)果見表4所示。表4對ConA誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖作用的影響比較表中，與對照組比較，＊＊＊p<0.001。由表4可見：山豆根多糖有效部位組對ConA誘導(dǎo)的正常小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖作用較對照組具有顯著性，且具有濃度依賴性；說明，本發(fā)明的山豆根多糖有效部位能促進(jìn)ConA誘導(dǎo)的正常小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，對小鼠的細(xì)胞免疫功能具有顯著的增強(qiáng)作用。三、對免疫低下小鼠的體內(nèi)試驗(yàn)通過觀察實(shí)施例1制備的山豆根多糖有效部位和對比例制備的山豆根水提醇沉部位，對經(jīng)輻照所致免疫低下的小鼠模型的調(diào)節(jié)功能，研究其在整體動(dòng)物上的免疫增強(qiáng)作用。BALB/C小鼠體重在18-22g時(shí)候照射X光，照射條件3GRADE.照射時(shí)間三分鐘；照射后根據(jù)體重隨機(jī)分成5組，分別為：正常組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組；給藥兩周，用0.3％的CMC-Na助懸提取物使其濃度分別為25mg/kg，50mg/kg和100mg/kg。試驗(yàn)結(jié)果如下：(1)體征及體重在造模十五天后，模型小鼠表現(xiàn)出明顯的體重下降，毛色無光，倦怠少動(dòng)少食；而給藥組的各老鼠的上述癥狀相對于模型組來說均得到緩解和改善。給藥十五天后，模型組小鼠的體重與對照組相比，p<0.01，表明模型組與正常組有顯著性差異，說明造模成功。但各給藥組與模型組比較，p>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是都有體重 恢復(fù)的趨勢，詳細(xì)結(jié)果見表5所示。表5對免疫低下小鼠模型的體重影響表中，與模型組比較，＊＊p<0.01。由表5可見：山豆根多糖有效部位組對免疫低下小鼠模型的體重具有恢復(fù)作用，且作用效果略高于山豆根水提醇沉部位組。(2)免疫器官的大小形態(tài)以及胸腺脾指數(shù)將小鼠托頸椎處死，觀察脾臟大小并稱重，詳細(xì)結(jié)果見表6所示。表6對免疫低下小鼠脾臟重量的影響表中，與模型組比較，＊p<0.05，＊＊p<0.01。由表6可見：模型組脾臟較對照組小，并且p<0.01，說明造模成功；但山豆根多糖有效部位組和山豆根水提醇沉部位組與模型組相比有上升趨勢，尤其是山豆根多糖有效部位 的25mg/kg劑量組與模型組相比，p<0.05，具有顯著性差異，說明山豆根多糖有效部位的25mg/kg劑量組具有明顯的免疫增強(qiáng)作用。摘取小鼠的胸腺和脾臟用濾紙吸干殘血后測質(zhì)量，分別除以小鼠體質(zhì)量再乘以10，得到胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，詳細(xì)結(jié)果如表7所示。表7對免疫低下小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響表中，與模型組比較，＊p<0.05。由表7可見：模型組的胸腺脾指數(shù)較對照組，p<0.05，說明免疫低下模型造模成功；但山豆根多糖有效部位組和山豆根水提醇沉部位組在給藥后都能刺激小鼠脾臟胸腺質(zhì)量的增加，并且山豆根多糖有效部位組胸腺指數(shù)增加更為明顯，尤其25mg/kg山豆根多糖有效部位組的胸腺指數(shù)增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明本發(fā)明的山豆根多糖有效部位對免疫低下小鼠具有顯著免疫增強(qiáng)作用，且免疫增強(qiáng)作用明顯高于山豆根水提醇沉部位。四、ConA刺激小鼠脾臟細(xì)胞的增殖試驗(yàn)為了證實(shí)山豆根多糖有效部位和山豆根水提醇沉部位的免疫增強(qiáng)能力是否存在濃度依賴性，進(jìn)一步進(jìn)行ConA刺激小鼠脾臟細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)：給藥一小時(shí)后，將不同組別的小鼠脫頸椎處死；取出脾臟磨脾，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞4×105個(gè)/孔接種于96孔板中，同時(shí)加入ConA，使其終濃度為0.5μg/mL，每個(gè)樣品三復(fù)孔，每孔總體積為200μL；5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束前8h摻入0.25μCi3H-thymidine，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，將培養(yǎng)板凍存于-20℃冰箱；測定時(shí)將凍融的細(xì)胞用細(xì)胞收集儀收集至玻璃纖維膜上，加入閃爍液后于Beta計(jì)數(shù)儀讀取摻入細(xì)胞DNA的3H-thymidine，以cpm值代表細(xì)胞增殖情況；詳細(xì)結(jié)果如表8所示。表8體內(nèi)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表中，與模型組比較，＊p<0.05，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.001。由表8可見：山豆根多糖有效部位組和山豆根水提醇沉部位組兩組給藥組與模型組相比較均能提高脾臟中免疫細(xì)胞的增殖能力，且具有濃度依賴關(guān)系。結(jié)合表4至表8可見：本發(fā)明的山豆根多糖有效部位具有很好的免疫增強(qiáng)作用，并且其活性還優(yōu)于山豆根水提醇沉部位。綜上實(shí)驗(yàn)可見：本發(fā)明通過控制山豆根多糖有效部位中的總多糖和苦參堿的含量，不僅明顯降低了毒性，而且同時(shí)具有顯著的免疫增強(qiáng)活性，相對于現(xiàn)有技術(shù)，取得了顯著性進(jìn)步和出乎意料的效果，對研究開發(fā)具有臨床應(yīng)用價(jià)值的山豆根藥物制劑具有重要意義；并且，所述制備方法簡單、得率高、穩(wěn)定性好，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，對促進(jìn)山豆根的廣泛應(yīng)用具有。最后需要在此指出的是：以上僅是本發(fā)明的部分優(yōu)選實(shí)施例，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3