一種基于鐵蛋白/殼聚糖的天然色素分子包埋物的制備方法，屬于食品領(lǐng)域技術(shù)。

背景技術(shù)：

鐵蛋白是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中的天然鐵貯存蛋白。由于其特殊的中空結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的蛋白質(zhì)外殼，被廣泛用于金屬離子和有機(jī)小分子的載體。鐵蛋白外殼分子結(jié)構(gòu)保守，由24個(gè)亞基組成，且每?jī)蓚€(gè)亞基反向平行形成一組，構(gòu)成一個(gè)近似正八面體，成4-3-2重軸對(duì)稱中空的球狀分子，通常其內(nèi)徑約為8nm，外徑約為12nm，厚度約為2nm。一般來說，8nm的鐵蛋白內(nèi)部空腔可儲(chǔ)存約4500個(gè)三價(jià)鐵原子，以形成化合態(tài)的鐵核。由此可見，利用鐵蛋白在變性條件下(如低pH或高pH)的可逆自組裝特性，將其蛋白質(zhì)外殼作為納米材料，有足夠大的空間來裝載一些營(yíng)養(yǎng)小分子，也可以使小分子物質(zhì)免受外界干擾，提高其水溶性和穩(wěn)定性，具有很大的潛力。

天然色素是有天然資源獲得的食用色素，主要是從植物、動(dòng)物組織和微生物中提取的色素，其中植物類著色劑占多數(shù)。天然色素不僅具有給食品著色的作用，而且相當(dāng)部分天然色素具有生理活性。常見的天然色素有β-胡蘿卜素、葉黃素、葉綠色等。葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物中的天然脂溶性色素。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)證明植物中所含的天然葉黃素是一種性能優(yōu)異的抗氧化劑，在食品中加入一定量的葉黃素可預(yù)防細(xì)胞衰老和機(jī)體器官衰竭，同時(shí)還可預(yù)防老年人眼球視網(wǎng)膜黃斑退化引起的視力下降與失明。另外，葉黃素還可作為飼料添加劑用于家禽肉蛋的著色，同時(shí)也已在食品工業(yè)中用作著色與營(yíng)養(yǎng)保健劑；另一常見的天然色素蘆丁具有抗氧化及抗自由基作用，可用于心腦血管疾病、腫瘤、炎癥的治療，因此天然色素具有較廣的應(yīng)用前景。但大部分天然色素水溶性差，生物半衰期短，這兩個(gè)性質(zhì)限制了大部分天然色素在食品應(yīng)用及醫(yī)藥行業(yè)的生物利用率。鐵蛋白提供了一個(gè)很好的解決此問題的契機(jī)。將脂溶性天然色素分子(例如葉黃素)裝載進(jìn)入鐵蛋白內(nèi)部空腔中形成鐵蛋白-色素包埋物，這樣既可以保護(hù)天然色素免受外界干擾，又可以提高天然色素的水溶性和穩(wěn)定性，具有很大的應(yīng)用前景。

另外，鐵蛋白作為兩性物質(zhì)，其易與帶不同電荷的多糖進(jìn)行作用，發(fā)生復(fù)合凝集反應(yīng)。殼聚糖(Chitosan)作為自然界唯一帶陽(yáng)離子(游離-NH₃⁺)的天然氨基多糖，具有良好的生物相容性、安全性和低成本等特點(diǎn)，已經(jīng)成為藥物或食品功能組分包埋的理想材料。

以大豆鐵蛋白及殼聚糖作為原料，利用鐵蛋白的可逆自組裝性質(zhì)和蛋白-多糖相互作用制備出均勻分散的、納米級(jí)別的的鐵蛋白-殼聚糖-天然色素分子包埋物經(jīng)檢索在國(guó)內(nèi)外未見公開報(bào)道，本發(fā)明在國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道，在國(guó)內(nèi)外未見公開使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種基于鐵蛋白/殼聚糖的天然色素分子包埋物及其制備方法，以鐵蛋白為載體蛋白，殼聚糖為輔助劑，裝載穩(wěn)定性差的天然色素分子物質(zhì)。最終產(chǎn)品是一種由鐵蛋白/殼聚糖裝載天然色素分子的新型包埋物，既可以用作新型食品添加劑，也可以應(yīng)用于改善醫(yī)藥療效，還可以作為化妝品中的組成成分，包埋物分解后產(chǎn)生的鐵蛋白、殼聚糖和天然色素也具有一定的生物活性作用。本產(chǎn)品充分利用了鐵蛋白、殼聚糖和天然色素的功能，具有很高的實(shí)際應(yīng)用和推廣價(jià)值。

本發(fā)明提供了一種新型的包埋物的制備方法，包括以下步驟：將鐵蛋白溶液置于離心管中，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值變性，攪拌；取天然色素類物質(zhì)，溶于乙醇溶液；將多酚類乙醇溶液和上述鐵蛋白溶液混合，室溫?cái)嚢?，調(diào)節(jié)pH值復(fù)性，于4℃層析柜中攪拌，將上述溶液透析三次即得鐵蛋白色素包埋物。隨后將鐵蛋白色素包埋物與殼聚糖按一定比例混合，攪拌，靜制，于4℃層析柜中避光透析。

進(jìn)一步的，所述鐵蛋白溶液的濃度為2.0μM，其pH值為8左右。

進(jìn)一步的，用1M NaOH調(diào)節(jié)所述鐵蛋白溶液pH值至11.0左右。

進(jìn)一步的，室溫?cái)嚢枳冃缘蔫F蛋白溶液2h。

進(jìn)一步的，鐵蛋白和天然色素類溶液混合時(shí)的分子摩爾比為1∶200。

進(jìn)一步的，鐵蛋白和多酚類溶液混合室溫?cái)嚢?h。

進(jìn)一步的，用1M HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7.5-8.0復(fù)性。

進(jìn)一步的，復(fù)性后4℃層析柜中攪拌2h以上。

進(jìn)一步的，透析時(shí)使用的透析袋孔徑1000kDa。

進(jìn)一步的，透析時(shí)透析液：Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，50mM)。

進(jìn)一步的，在4℃層析柜中透析三次，每隔6小時(shí)換一次透析緩沖液。

進(jìn)一步的，殼聚糖：鐵蛋白色素包埋物的摩爾濃度比例為20∶1-40∶1

進(jìn)一步的，攪拌15分鐘，20℃靜置2h，

進(jìn)一步的，透析袋孔徑為10kDa，透析液為Mops緩沖液(pH 6.0，20mM)，4℃層析柜中避光透析四次，每隔8小時(shí)換一次透析緩沖液。

本產(chǎn)品的有益效果在于：作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的鐵蛋白可以作為一種新型的納米載體將脂溶性天然色素包埋到內(nèi)部空腔再結(jié)合殼聚糖可顯著提高脂溶性天然色素的水溶性，并且由于穩(wěn)定的蛋白質(zhì)外殼結(jié)構(gòu)可以將包埋到其內(nèi)部不穩(wěn)定的色素分子與外界復(fù)雜的食品組分隔絕開而提高色素的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。且此新型包埋物既可作為功能性食品添加劑及營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑使用，又大大提高了天然色素的生物利用率，廣泛用于食品、藥品、化妝品中，具有很高的實(shí)際應(yīng)用和推廣價(jià)值。

附圖說明

圖1為鐵蛋白-殼聚糖-天然色素分子包埋物的技術(shù)路線圖。

圖2為鐵蛋白-殼聚糖-天然色素分子包埋物(以葉黃素為例)的技術(shù)路線圖。

圖3為鐵蛋白-殼聚糖-天然色素分子包埋物(以蘆丁為例)的技術(shù)路線圖。

圖4為鐵蛋白-殼聚糖-葉黃素包埋物的電鏡圖。

圖5為鐵蛋白-殼聚糖-蘆丁包埋物的電鏡圖。

具體實(shí)施方式

本文將結(jié)合具體附圖詳細(xì)描述本發(fā)明具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)注意的是，下述實(shí)施例中描述的技術(shù)特征或者技術(shù)特征的組合不應(yīng)該被認(rèn)為是孤立的，它們可以被相互組合從而達(dá)到更好的技術(shù)效果。在下述實(shí)施例的附圖中，各附圖所出現(xiàn)的相同符號(hào)代表相同的特征或者部件，可應(yīng)用于不同的實(shí)施例中。

實(shí)施例1以葉黃素為例

準(zhǔn)確稱取20mg的葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶解在100ml無水乙醇中制備成濃度為351.6μM的母液，4℃避光保存待用。將5mL 2.0μM鐵蛋白溶液(pH 7.8，Tris緩沖液)置于10mL的離心管中。用1M NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至11.0左右，室溫?cái)嚢?h后，緩慢加入5.68mL葉黃素母液(4℃避光保存)使鐵蛋白∶葉黃素的分子摩爾比為1∶200，室溫?cái)嚢?h，使其充分混合。隨后用1M HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7.5-8.0，于4℃層析柜中攪拌2h以上。將復(fù)性后的溶液置于孔徑為1000kDa的透析袋中，使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，50mM)在4℃層析柜中避光透析三次，每隔6小時(shí)換一次透析緩沖液。由于葉黃素分子量大于鐵蛋白的通道孔徑(約為0.3nm)，從而使部分葉黃素包埋于鐵蛋白內(nèi)部空腔，游離的葉黃素則在透析過程中被除去。將透析完的溶液取出，用0.45um的親水性纖維素膜過濾澄清。最后將包埋有葉黃素的鐵蛋白質(zhì)溶液放置 在4℃條件下避光保存。隨后，將不同量的殼聚糖按比例添加入鐵蛋白-葉黃素包埋物(1.0μM，2.0mL，pH6.0)溶液中，使殼聚糖∶鐵蛋白-葉黃素包埋物的摩爾濃度比例為20∶1-40∶1，攪拌15分鐘使其充分作用，20℃靜置2h，然后，將反應(yīng)物的溶液置于孔徑為10kDa的透析袋中，使用Mops緩沖液(pH 6.0，20mM)在4℃層析柜中避光透析四次，每隔8小時(shí)換一次透析緩沖液，以除去未結(jié)合的殼聚糖，獲得鐵蛋白-殼聚糖-葉黃素包埋物，置于4℃下避光保存。

實(shí)施例2以蘆丁為例

準(zhǔn)確稱取20mg的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶解在80％無水乙醇中制備成濃度為323.0μM的母液，4℃避光保存待用。將5mL 2.0μM鐵蛋白溶液(pH 7.8，Tris緩沖液)置于10mL的離心管中。用1M NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至11.0左右，室溫?cái)嚢?h后，緩慢加入3.7mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液(4℃避光保存)使鐵蛋白∶蘆丁的分子摩爾比為1∶120，室溫?cái)嚢?h，使其充分混合。隨后用1M HCl調(diào)節(jié)溶液pH值至7.5-8.0，于4℃層析柜中攪拌2h以上。將復(fù)性后的溶液置于孔徑為1000kDa的透析袋中，使用Tris-HCl緩沖液(pH 7.5，50mM)在4℃層析柜中避光透析三次，每隔6小時(shí)換一次透析緩沖液。由于蘆丁分子量大于鐵蛋白的通道孔徑(約為0.3nm)，從而使部分蘆丁包埋于鐵蛋白內(nèi)部空腔，游離的蘆丁則在透析過程中被除去。將透析完的溶液取出，離心取上清液即可得到包埋有蘆丁的鐵蛋白溶液。隨后，將不同量的殼聚糖按比例添加入鐵蛋白-天然色素包埋物(1.0μM，2.0mL，pH 6.0)溶液中，使殼聚糖∶鐵蛋白-蘆丁包埋物的摩爾濃度比例為20∶1-40∶1，攪拌15分鐘使其充分作用，20℃靜置2h，然后，將反應(yīng)物的溶液置于孔徑為10kDa的透析袋中，使用Mops緩沖液(pH 6.0，20mM)在4℃層析柜中避光透析四次，每隔8小時(shí)換一次透析緩沖液，以除去未結(jié)合的殼聚糖，獲得鐵蛋白-殼聚糖-蘆丁包埋物，置于4℃下避光保存。

本發(fā)明提供了一種新型的包埋物的制備方法，作為一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的鐵蛋白可以作為一種新型的納米載體將脂溶性天然色素包埋到內(nèi)部空腔后再結(jié)合殼聚糖可顯著提高脂溶性天然色素的水溶性，并且由于穩(wěn)定的蛋白質(zhì)外殼結(jié)構(gòu)可以將包埋到其內(nèi)部不穩(wěn)定的色素分子與外界復(fù)雜的食品組分隔絕開而提高色素的熱穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性。鑒于此優(yōu)點(diǎn)，這一技術(shù)在醫(yī)藥、食品和化妝品中均具有廣闊的市場(chǎng)前景。

本文雖然已經(jīng)給出了本發(fā)明的一些實(shí)施例，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行改變。上述實(shí)施例只是實(shí)例性的，不應(yīng)以本文的實(shí)施例作為本發(fā)明權(quán)利范圍的限定。