本發(fā)明設(shè)計一種用于生物活性物質(zhì)包埋的海藻酸鹽微膠囊產(chǎn)品，具體的說是一種多巴胺接枝改性的海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊的制備及其在生物活性物質(zhì)包埋中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：微囊化技術(shù)相關(guān)材料和制備方法是目前的一個研究熱點,在細(xì)胞移植、藥物釋放和基因治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的臨床前研究中得到廣泛應(yīng)用(Wangetal.,2006)。在眾多的生物微膠囊中，特別是用于生物活性物質(zhì)包埋的微膠囊領(lǐng)域，海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊的使用較多。海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊包括海藻酸鈉-α-聚賴氨酸(alginate/α-polylysine)微膠囊(簡稱α-APA微膠囊)，海藻酸鈉-ε-聚賴氨酸(alginate/ε-polylysine)微膠囊(簡稱ε-APA微膠囊)和海藻酸鈉-殼聚糖(alginate/chitosan)微膠囊(簡稱ACA微膠囊)等。但是這些微膠囊在應(yīng)用中仍存在強度差，膨脹嚴(yán)重而導(dǎo)致的細(xì)胞泄露問題。特別是在生理環(huán)境和血漿環(huán)境中，微膠囊的機械強度差已經(jīng)成為限制其進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用的主要因素(Chenetal.,2014)。為了提高微膠囊的穩(wěn)定性，已經(jīng)有報道將共價化學(xué)鍵引入到微膠囊體系，用于提高微膠囊的強度(Chen,Ouyang,Lawuyi&Prakash,2006；Gattas-Asfura,Valdes,Celik&Stabler,2014)。但是涉及到的微囊制備方法復(fù)雜，耗時長，用到的化學(xué)分子和溶劑小分子具有潛在的細(xì)胞毒性，不適于活性物質(zhì)的包埋。技術(shù)實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明提出將多巴胺接枝在海藻酸鈉分子上并用于生物微膠囊的制備，發(fā)明了一種新型的多巴胺修飾的海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊產(chǎn)品。一方面多巴胺分子之間發(fā)生氧化聚合，另一方面多巴胺氧化后具有的醛基能夠和聚陽離子材料的氨基形成希夫堿反應(yīng)。在這兩方面因素的共同影響下，微膠囊的機械強度得到提高。整個過程反應(yīng)條件溫和可控，為生物活性物質(zhì)的包埋提供了可能。技術(shù)方案多巴胺接枝改性的海藻酸鹽-殼聚糖微膠囊，其特征在于微膠囊結(jié)構(gòu)分為微膠囊膜與內(nèi)核兩部分，其中微膠囊膜是由聚陽離子材料和海藻酸鹽形成的聚電解質(zhì)復(fù)合水凝膠膜。聚多巴胺被接枝在海藻酸鈉分子上，在微膠囊的膜上和內(nèi)核中存在。其中，微膠囊產(chǎn)品為粒徑100-1000微米的球形微膠囊；組成微膠囊的海藻酸鹽海藻酸鹽分子量10kDa-2000kDa；內(nèi)核中海藻酸鹽濃度在1-50g/L，內(nèi)核中細(xì)胞含量102-109個細(xì)胞/ml內(nèi)核體積，且活性保持90％以上。微膠囊產(chǎn)品中的多巴胺是通過共價鍵直接原位接枝到微膠囊中的海藻酸鈉分子上，反應(yīng)過程的結(jié)構(gòu)式為：其中，多巴胺分子在海藻酸鈉分子生的接枝率(每100個海藻酸鈉糖環(huán)接枝的多巴胺百分?jǐn)?shù))為1-100％或1-199％。微膠囊產(chǎn)品中殼聚糖及其衍生物材料的脫乙酰度50-100％，分子量為1kDa-500kDa。聚氨基酸分子量為10kDa-500kDa。聚氨基酸溶液的配制方法是：聚賴氨酸溶于生理鹽水，聚賴氨酸濃度為0.01-15g/L。所述的聚氨基酸包括α-聚賴氨酸，ε-聚賴氨酸，聚精氨酸，聚鳥氨酸和聚組氨酸。產(chǎn)品的具體制備步驟為：1)制備多巴胺共價接枝的海藻酸鹽，稱之為多巴胺修飾的海藻酸鹽；2)將步驟1)制備的多巴胺修飾的海藻酸鹽通過內(nèi)部凝膠化或外部凝膠化方法，制備成多巴胺修飾的海藻酸鹽凝膠微球，稱之為A微球，其中，海藻酸鹽凝膠為二價金屬鈣、鋇或鋅的海藻酸鹽水凝膠。3)將步驟2)中制備的凝膠微球浸入聚陽離子溶液中，微球與聚陽離子溶液體積比為1:1-1:40，反應(yīng)時間為1-60分鐘，反應(yīng)溫度在0-50℃，此時得到多巴胺修飾的海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊，稱之為B微球，取出用生理鹽水洗滌；其中，聚陽離子包括下述任意一種或兩種以上：聚氨基酸類中的聚賴氨酸、聚鳥氨酸、聚精氨酸、聚組氨酸，聚胺類中的聚乙烯亞胺、聚亞甲基胍、聚N乙烯基己內(nèi)酰胺、羧基-丙基-丙烯酰胺共聚物、DEAE-dextran、氨基聚乙二醇，殼聚糖。B微球也可浸入到海藻酸鹽溶液中，用于中和暴露在B微球表面的聚陽離子電荷，微球與海藻酸鹽溶液體積比為1:1-1:40，反應(yīng)時間為1-60分鐘，反應(yīng)溫度在0-50℃，此時得到表面中和的多巴胺修飾的海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊，稱之為B’微球，取出用生理鹽水洗滌。其中，海藻酸鹽溶液為海藻酸的鈉鹽或鉀鹽，或者多巴胺修飾的海藻酸的鈉鹽或鉀鹽。4)將步驟3)制備的多巴胺修飾的海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊“B微球”或“B’微球”浸入有機金屬螯合劑溶液中，液化微膠囊內(nèi)部的海藻酸鹽凝膠，微囊與有機金屬螯合劑溶液體積比范圍為1：1～1：40，反應(yīng)1-60分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內(nèi)部液態(tài)核心的多巴胺修飾的海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊，稱為C微球(B微球液化后)或C’微球(B’微球液化后)；其中，有機金屬螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)，氨基三乙酸(又稱次氮基三乙酸NTA)，二亞乙基三胺五乙酸及其鹽，檸檬酸(CA)、酒石酸(TA)和葡萄糖酸(GA)，羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)和二羥乙基甘氨酸(DEG)中的一種或兩種以上。5)將步驟2)或3)或4)得到的A微球、B微球或B’微球、C微球或C’微球轉(zhuǎn)移至pH＝7.4的緩沖溶液中，自然氧化0-500h。緩沖溶液中使用的緩沖對包括碳酸氫根、磷酸氫根和Hepes體系。其中，A微球氧化后得到的聚多巴胺海藻酸鹽凝膠微球，可通過步驟3)制備成聚多巴胺海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊。該微膠囊產(chǎn)品用于活細(xì)胞的包埋。所述活細(xì)胞為人或動物(老鼠、牛、豬等)來源的離體的胰島細(xì)胞、肝細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、甲狀旁腺細(xì)胞、腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞具有分泌生物活性物質(zhì)功能的細(xì)胞，細(xì)胞系細(xì)胞，基因工程細(xì)胞，干細(xì)胞或干細(xì)胞分化的各種細(xì)胞。該微膠囊產(chǎn)品用于蛋白多肽類的包埋。所述蛋白為纖維蛋白、球蛋白角蛋白、膠原蛋白、伴娘蛋白、肌紅蛋白中的一種或兩種以上，包括牛磺酸、谷胱甘肽、金屬硫蛋白、免疫球蛋白、生長激素、胰島素、肝素、干擾素、白細(xì)胞介素等。該微膠囊產(chǎn)品用于核酸類物質(zhì)的包埋。所述核酸為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)中的一種或兩種以上。該微膠囊產(chǎn)品用于酶的包埋。所述酶為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶、裂合酶、異構(gòu)酶和連接酶中的一種或兩種以上，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶、苯丙氨酸羥化酶、天門冬酰胺酶、葡萄糖淀粉酶等。本發(fā)明的有益效果：1.與傳統(tǒng)的海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊(APA微膠囊)和海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊(ACA微膠囊)相比，本發(fā)明的這種新型多巴胺接枝改性海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊產(chǎn)品，在體液環(huán)境中具有高穩(wěn)定性，不發(fā)生膨脹和破碎。2.多巴胺分子接枝在海藻酸鈉分子上的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，此外，由于多巴胺分子特有的粘附性質(zhì)，有利于細(xì)胞的貼附，還在一定程度上具有促進(jìn)貼壁細(xì)胞生長和代謝的作用。3.與其他利用共價化學(xué)方法提高微膠囊的機械強度的策略相比，本專利涉及到的材料合成和微囊制備方法簡單易行，反應(yīng)條件溫和可控，適用于活性物質(zhì)的包埋。附圖說明圖1為實施例1制備的海藻酸鈣凝膠、微囊以及模擬血漿處理過的微囊形態(tài)。(A)多巴胺修飾的海藻酸鈣膠珠(B)多巴胺修飾的海藻酸鈣-殼聚糖微膠囊(C)多巴胺修飾的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊經(jīng)過模擬血漿液處理。Chen,H.,Ouyang,W.,Lawuyi,B.,&Prakash,S.(2006).Genipincross-linkedalginate-chitosanmicrocapsules:Membranecharacterizationandoptimizationofcross-linkingreaction.Biomacromolecules,7(7),2091-2098.Chen,L.,Zhang,Y.,Li,S.,Wang,X.,Li,N.,Wang,Y.,Guo,X.,Zhao,S.,Yu,W.,Sun,G.,Liu,Y.,&Ma,X.(2014).Effectofplasmacomponentsonthestabilityandpermeabilityofmicrocapsule.JournalofBiomedicalMaterialsResearchPartA,102(7),2408-2416.Gattas-Asfura,K.,Valdes,M.,Celik,E.,&Stabler,C.(2014).Covalentlayer-by-layerassemblyofhyperbranchedpolymersonalginatemicrocapsulestoimpartstabilityandpermselectivity.JMaterChemBMaterBiolMed,2(46),8208-8219.Wang,W.,Liu,X.,Xie,Y.,Zhang,H.a.,Yu,W.,Xiong,Y.,Xie,W.,&Ma,X.(2006).Microencapsulationusingnaturalpolysaccharidesfordrugdeliveryandcellimplantation.JournalofMaterialsChemistry,16(32),3252-3267.具體實施方式為更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的實施方案不限于此。實施例11)制備海藻酸鈉溶液：2g海藻酸鈉溶于200ml去離子水，加MES2.132g，調(diào)節(jié)pH值至5.5左右。海藻酸鈉分子量320kDa，G/M比55/45。2)過濾1)溶液除雜質(zhì)。3)將可溶于水的碳二亞胺(EDC·HCl)1.936g，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)1.116g固體用加入步驟2)的海藻酸鈉溶液中，活化40分鐘。4)將多巴胺鹽酸鹽1.92g固體用加入步驟3)的海藻酸鈉溶液中，在氮氣保護(hù)下室溫反應(yīng)12小時。5)將400ml乙醇滴加入步驟4)的海藻酸鈉溶液中，得到沉淀出的海藻酸鈉固體。乙醇洗滌三次，收集產(chǎn)物。6)將步驟5)得到的產(chǎn)物真空干燥，得到多巴胺接枝的海藻酸鈉，接枝度26％。7)將6)制得的多巴胺接枝海藻酸鈉溶于生理鹽水中制備成15g/L的多巴胺接枝的海藻酸鈉溶液。8)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。9)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液。10)制備多巴胺接枝的海藻酸鈣水凝膠微球：將步驟7)制備的多巴胺接枝的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場下形成射流，液滴落入步驟10)配制的氯化鈣凝膠浴溶液中，固化30分鐘，即獲得多巴胺接枝海藻酸鈣水凝膠微球。11)將步驟10)制得的水凝膠微球置于pH7.4的Hepes緩沖體系中，每24小時更換新的Hepes緩沖液，共反應(yīng)72小時。12)制備多巴胺接枝海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將該半乳糖基海藻酸鈣水凝膠微球浸入步驟8)配制的α-聚賴氨酸溶液中，水凝膠微球與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成多巴胺接枝海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，顯微鏡下觀察，微囊粒徑450μm，球形度好，膜厚度10微米。13)將步驟12)制得的多巴胺接枝海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊0.1ml混入20ml生理鹽水，加入20顆粒徑為5mm的瑪瑙球，共同放置于三角瓶內(nèi)，在37度，170r/min條件下震蕩球磨24小時，微膠囊的完整率保持在95％以上，表明微膠囊具有良好的機械強度。14)將步驟12)制得的多巴胺接枝海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，按微膠囊：IgG＝1：20體積比放入FITC標(biāo)記的IgG(γ-免疫球蛋白)溶液中，振蕩孵育24小時，激光共聚焦顯微鏡下觀察，微囊內(nèi)沒有熒光信號，表明微膠囊保持良好的免疫隔離性能。比較例11)將海藻酸鈉溶于生理鹽水中制備成15g/L的溶液。2)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。3)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液。4)制備海藻酸鈣水凝膠微球：將步驟1)制備的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場下形成射流，液滴落入步驟3)配制的氯化鈣凝膠浴溶液中，固化30分鐘，即獲得海藻酸鈣水凝膠微球。5)制備多海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將該海藻酸鈣水凝膠微球浸入步驟2)配制的α-聚賴氨酸溶液中，水凝膠微球與α-聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，顯微鏡下觀察，微囊粒徑450微米，球形度好，膜厚度10微米。6)將步驟5)制得的海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊0.1ml與0.1ml混入20ml生理鹽水，加入20顆粒徑為5mm的瑪瑙球，共同放置于三角瓶內(nèi)，在37度，170r/min條件下震蕩球磨24小時，微膠囊的完整率保持在95％以上，表明微膠囊具有良好的機械強度。7)將步驟5)制得的海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，按微膠囊：IgG＝1：20體積比放入FITC標(biāo)記的IgG(γ-免疫球蛋白)溶液中，振蕩孵育24小時，激光共聚焦顯微鏡下觀察，微囊內(nèi)有明顯熒光信號，表明微膠囊的免疫隔離性能喪失。實施例21)制備海藻酸鈉溶液：2g海藻酸鈉溶于200ml去離子水，加MES2.132g，調(diào)節(jié)pH值至5.5左右。海藻酸鈉分子量320kDa，G/M比55/45。2)過濾1)溶液除雜質(zhì)。3)將EDC·HCl1.936g，NHS1.116g固體用加入步驟2)的海藻酸鈉溶液中，活化40分鐘。4)將多巴胺鹽酸鹽1.92g固體用加入步驟3)的海藻酸鈉溶液中，在氮氣保護(hù)下室溫反應(yīng)12小時。5)將400ml乙醇滴加入步驟4)的海藻酸鈉溶液中，得到沉淀出的海藻酸鈉固體。乙醇洗滌三次，收集產(chǎn)物。6)將步驟5)得到的產(chǎn)物真空干燥，得到多巴胺接枝的海藻酸鈉，接枝度26％。7)將6)制得的多巴胺接枝海藻酸鈉溶于生理鹽水中制備成15g/L的多巴胺接枝的海藻酸鈉溶液。8)制備殼聚糖溶液：將殼聚糖溶于pH為6.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，殼聚糖濃度為5g/L。其中，殼聚糖分子量45kDa。9)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液。10)制備多巴胺接枝的海藻酸鈣水凝膠微球：將步驟7)制備的多巴胺接枝的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場下形成射流，液滴落入步驟10)配制的氯化鈣凝膠浴溶液中，固化30分鐘，即獲得多巴胺接枝海藻酸鈣水凝膠微球。11)將步驟10)制得的水凝膠微球置于pH7.4的Hepes緩沖體系中，每24小時更換新的Hepes緩沖液，共反應(yīng)72小時。12)制備多巴胺接枝海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊：將該半乳糖基海藻酸鈣水凝膠微球浸入步驟8)配制的殼聚糖溶液中，水凝膠微球與殼聚糖溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成多巴胺接枝海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊，顯微鏡下觀察，微囊粒徑450μm，球形度好，膜厚度10微米。13)將步驟12)制得的多巴胺接枝海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊0.1ml與1ml模擬血漿液混合，震蕩24小時，微膠囊的球形度良好，未發(fā)生明顯的膨脹和破碎，表明微膠囊具有良好的血漿穩(wěn)定性。比較例21)將海藻酸鈉溶于生理鹽水中制備成15g/L的溶液。2)制備殼聚糖溶液：將殼聚糖溶于pH為6.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液，殼聚糖濃度為5g/L。其中，殼聚糖分子量45kDa。3)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液。4)制備海藻酸鈣水凝膠微球：將步驟1)制備的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場下形成射流，液滴落入步驟3)配制的氯化鈣凝膠浴溶液中，固化30分鐘，即獲得海藻酸鈣水凝膠微球。5)制備多海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊：將該海藻酸鈣水凝膠微球浸入步驟2)配制的殼聚糖溶液中，水凝膠微球與殼聚糖溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊，顯微鏡下觀察，微囊粒徑450微米，球形度好，膜厚度10微米。6)將步驟5)制得的海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊0.1ml與1ml模擬血漿液混合，震蕩24小時，微膠囊的粒徑膨脹至550微米，破碎率達(dá)到90％以上。實施例31)制備半多巴胺修飾海藻酸鈉溶液：多巴胺海藻酸溶于生理鹽水中制備成15g/L的半乳糖基海藻酸鈉溶液，無菌過濾。其中，多巴胺修飾海藻酸分子量為350kDa。2)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液，無菌過濾。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。3)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液，過濾除菌。4)制備包裹豬肝細(xì)胞的多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸包埋型水凝膠微球載體：取3mL多巴胺修飾海藻酸鈉溶液，加入6*10^6個大鼠原代肝細(xì)胞，混合均勻后，使用靜電液滴法制備包埋有豬肝細(xì)胞的水凝膠微球。5)制備包裹肝細(xì)胞的多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將包埋有豬肝細(xì)胞的多巴胺修飾海藻酸鈣包埋型水凝膠微球浸入步驟2)制備的α-聚賴氨酸溶液中，包埋型水凝膠微球與α-聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊。6)將包埋有豬肝細(xì)胞的多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊制備成體外人工肝系統(tǒng)，用于肝衰狗的動物模型，狗的肝衰癥狀得以糾正，血氨指標(biāo)恢復(fù)正常，該微膠囊在人工肝系統(tǒng)保持形態(tài)完整。實施例41)制備半多巴胺修飾海藻酸鈉溶液：多巴胺海藻酸溶于生理鹽水中制備成15g/L的半乳糖基海藻酸鈉溶液，無菌過濾。其中，多巴胺修飾海藻酸分子量為350kDa。2)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液，無菌過濾。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。3)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液，過濾除菌。4)制備包裹L-天門冬酰胺酶的多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸包埋型水凝膠微球載體：取3mL多巴胺修飾海藻酸鈉溶液，加入3mgL-天門冬酰胺酶，混合均勻后，使用靜電液滴法制備包埋有L-天門冬酰胺酶的水凝膠微球。5)制備包埋有L-天門冬酰胺酶的多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將包埋有L-天門冬酰胺酶的多巴胺修飾海藻酸鈣包埋型水凝膠微球浸入步驟2)制備的α-聚賴氨酸溶液中，包埋型水凝膠微球與α-聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊。6)將包埋有L-天門冬酰胺酶的多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊注射入患有淋巴肉瘤的小白鼠體內(nèi)，第69天后發(fā)現(xiàn)淋巴肉瘤增殖，而只注射生理鹽水的小白鼠，第20天后即發(fā)現(xiàn)淋巴肉瘤增殖，說明包埋有L-天門冬酰胺酶的多巴胺修飾海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊能在很長時間內(nèi)阻止淋巴肉瘤的生長。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3