本發(fā)明涉及喹啉類(lèi)物質(zhì)在治療甲狀腺、乳腺疾病中的應(yīng)用和方法，以及包含喹啉類(lèi)物質(zhì)的藥物組合物。

背景技術(shù)：

很多喹啉類(lèi)物質(zhì)是抗寄生蟲(chóng)劑、尤其是抗瘧劑。喹啉類(lèi)物質(zhì)在抗瘧之外的應(yīng)用，很多是以組合物形式進(jìn)行的。這類(lèi)組合物曾被應(yīng)用于治療多種疾病，例如痔瘡、鼻炎、血管瘤、面癱等。一般認(rèn)為，組合物中的其它組分(例如烏拉坦)不僅可以助溶，也在治療中起到某些藥效。因而，針對(duì)特定疾病的包含喹啉類(lèi)物質(zhì)的藥物組合物一直在研究之中。例如，中國(guó)專(zhuān)利87104056公開(kāi)了一種含鹽酸奎寧和二鹽酸奎寧的六組分組合物“痔全脫注射液”，用于脫除痔瘡及與痔瘡關(guān)聯(lián)的肛門(mén)裂、直腸息肉及乳頭纖維組織瘤。然而在該組合物中，喹啉類(lèi)物質(zhì)濃度大于0.47M，且含有烏拉坦。中國(guó)專(zhuān)利200910103187.7提供了一種九組分組合物用以治療痔瘡和腫瘤。該組合物中奎寧的濃度很小(小于0.05M)，而且也含有烏拉坦。由于烏拉坦的副作用較強(qiáng)，中國(guó)政府已限制甚至禁止這類(lèi)應(yīng)用。中國(guó)專(zhuān)利96110932披露了一種包含一鹽酸奎寧和安替匹林的組合物，其用于甲亢治療。然而，安替匹林副作用很強(qiáng)，在發(fā)達(dá)國(guó)家己被淘汰。

喹啉類(lèi)物質(zhì)在抗瘤方面的可能應(yīng)用曾經(jīng)受到過(guò)非常多關(guān)注?，F(xiàn)有技術(shù)提供了若干喹啉衍生物的抗瘤活性條件，例如以下申請(qǐng)?zhí)柕闹袊?guó)專(zhuān)利：87106996、200710119982.6、201210111920.1等，及以下綜述：王京等，喹啉衍生物的抗腫瘤活性研究進(jìn)展，World Notes on Antibiotics,2013,Vol.34,No.2,pp60-70。實(shí)際上，在以腫瘤細(xì)胞為模型的體外試驗(yàn)中，若干喹啉類(lèi)物質(zhì)與常規(guī)抗瘤藥物(例如5-氟嘧啶、阿霉素、紫衫醇等)的細(xì)胞半抑制濃度(IC₅₀)都在微摩爾每升(μMol/L)的水平上。按照通常的認(rèn)識(shí)，一個(gè)藥物的抗瘤效應(yīng)的濃度依賴性在IC₅₀之后隨濃度增加而減小。常規(guī)抗瘤藥物通常以比IC₅₀高出數(shù)倍的濃度(仍在微摩爾每升范圍內(nèi))注射于瘤體時(shí)，就顯示出抗瘤有效性。然而，即使我們把喹啉類(lèi)物質(zhì)(例如二鹽酸奎寧)的注射濃度提高約500倍(0.025M)，也沒(méi)有觀察到有效的抗瘤效果(抑瘤率小于40％)，未顯示出比現(xiàn)有抗瘤藥物明顯更高的藥效。現(xiàn)有技術(shù)中，其它奎寧類(lèi)藥物的抑瘤率也不高。近些年來(lái)，人們便不再把它們看作一種有競(jìng)爭(zhēng)力的抗瘤藥物，而是當(dāng)作抗瘤增活劑進(jìn)行研究。例如，第201310459568.5號(hào)中國(guó) 專(zhuān)利申請(qǐng)就是將奎寧與抗瘤藥物(長(zhǎng)春新堿類(lèi)藥物)聯(lián)用用以降低細(xì)胞的多藥耐藥性從而使抗瘤藥物達(dá)到較好藥效。

目前甲狀腺、乳腺疾病的治療，主要是手術(shù)、放射線治療和其它藥物的化療。手術(shù)對(duì)身體造成傷害，對(duì)某些影響美觀的乳腺和甲狀腺的傷害讓人沮喪，也使其變成一種痛苦的選擇。放射線治療的副作用也非常明顯?，F(xiàn)有化療基本上是全身用藥，有很高的全身性副作用風(fēng)險(xiǎn)。例如，現(xiàn)有抗瘤藥物在大范圍內(nèi)殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也殺傷了大量正常細(xì)胞，免疫系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，而且療效也并不令人滿意。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種與現(xiàn)有技術(shù)相比更為有效地冶療甲狀腺、乳腺疾病的藥物組合物以及治療方法。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，其提供一種用于治療甲狀腺、乳腺疾病的藥物組合物，其包含喹啉類(lèi)物質(zhì)和藥物學(xué)上可接受的賦形劑，且為適合于經(jīng)甲狀腺、乳腺疾病靶區(qū)給藥的劑型，其中在經(jīng)靶區(qū)給藥時(shí)所述藥物組合物中喹啉類(lèi)物質(zhì)的濃度為0.05-0.5M，優(yōu)選為0.1-0.4M、更優(yōu)選為0.1-0.3M。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，其提供喹啉類(lèi)物質(zhì)在治療甲狀腺、乳腺疾病中的應(yīng)用，其中所述喹啉類(lèi)物質(zhì)包含在藥物組合物中，所述藥物組合物包含藥物學(xué)可接受的賦形劑且為適合于經(jīng)靶區(qū)給藥的劑型，其中在靶區(qū)給藥時(shí)，所述藥物組合物中喹啉類(lèi)物質(zhì)的濃度為0.05-0.5M，優(yōu)選為0.1-0.4M、更優(yōu)選為0.1-0.3M。

根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，其提供一種治療甲狀腺、乳腺疾病的方法，其包括向有此需要的靶區(qū)給藥包含喹啉類(lèi)物質(zhì)和藥物學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物，其中所述藥物組合物為適合于經(jīng)靶區(qū)給藥的劑型，且在所述靶區(qū)給藥時(shí)，所述藥物組合物中喹啉類(lèi)物質(zhì)的濃度為0.05-0.5M，優(yōu)選為0.1-0.4M、更優(yōu)選為0.1-0.3M。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在靶區(qū)給藥時(shí)，所述藥物組合物的給藥體積不小于欲處理之體積的70％、優(yōu)選為不小于110％。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述藥物學(xué)上可接受的賦形劑包括水、水可混溶性有機(jī)溶劑或它們的混合物，其中所述水可混溶性有機(jī)溶劑包括以下之一種或多種：乙醇、丙二醇、PEG、異丙醇。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物不包含諸如烏拉坦和安替比林等因副作用較強(qiáng)而被禁止或者限制使用的藥物成分。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，除喹啉類(lèi)物質(zhì)和藥物學(xué)上可接受的賦形劑或載體外，所述組合物還可以進(jìn)一步包含止痛劑、其他抗腫瘤藥物和/或增效劑。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，所述甲狀腺、乳腺疾病包括乳腺癌、乳腺非惡性腫瘤、 乳腺非瘤腫大或非瘤增生、乳腺囊腫、甲狀腺癌、甲狀腺非惡性腫瘤、甲狀腺非瘤腫大或非瘤增生、甲狀腺囊腫、甲狀腺功能亢進(jìn)癥等。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：與現(xiàn)有的手術(shù)和放射線治療相比，顯示出同樣髙效卻更加友好的“治療-患者身體”關(guān)系(對(duì)身體擾動(dòng)更小)；與現(xiàn)有的全身用藥治療相比，可以在最小化的毒副作用下，顯著性地提高療效；與現(xiàn)有的局部用藥、尤其是硬化劑(例如無(wú)水乙醇)治療相比，與病變周?chē)M織間的相容性更高，且療效更好。

以下將參考附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更為詳細(xì)的說(shuō)明。

附圖說(shuō)明

圖1是二鹽酸奎寧注射劑的注射濃度-抑瘤率關(guān)系曲線，其中橫坐標(biāo)X為瘤區(qū)注射濃度(4×10^XμM)的指數(shù)(X)，而縱坐標(biāo)Y為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中測(cè)出的抑瘤率(Y％)。

圖2是伯氨喹注射劑的注射濃度-抑瘤率關(guān)系曲線，其中橫坐標(biāo)X為瘤區(qū)注射濃度(4×10^XμM)的指數(shù)(X)，而縱坐標(biāo)Y為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中測(cè)出的抑瘤率(Y％)。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的范圍中，術(shù)語(yǔ)“喹啉類(lèi)物質(zhì)”是指一種或多種含有喹啉環(huán)的喹啉衍生物，其優(yōu)選選自以下組中：氯喹(chloroquine)、羥氯喹啉、氨甲喹、氨酚喹、奎寧、硝喹、哌喹、伯氨喹(primaquine)、撲瘧喹、戊烷喹及其異構(gòu)體和藥物學(xué)上可接受的鹽。

對(duì)于奎寧而言，其異構(gòu)體例如可以是奎尼丁、辛可寧及辛可尼丁。

喹啉類(lèi)物質(zhì)的藥物學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽，如無(wú)機(jī)酸加成鹽和有機(jī)酸加成鹽。無(wú)機(jī)酸加成鹽的例子包括但不限于：氫鹵酸鹽(如鹽酸鹽(例如鹽酸奎寧)、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、二鹽酸鹽(例如二鹽酸奎寧)、二氫溴酸鹽、二氫碘酸鹽)、硫酸氫鹽、硫酸鹽、磷酸鹽(例如磷酸氯喹、磷酸哌喹、磷酸伯氨喹)，等等。有機(jī)酸加成鹽的例子包括但不限于：碳酸氫鹽或碳酸鹽、乙基碳酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、枸緣酸鹽或單寧酸鹽。

上述喹啉類(lèi)物質(zhì)可單獨(dú)使用，也可組合使用，例如鹽酸奎寧和其它喹啉衍生物的組合、二鹽酸奎寧和其它喹啉衍生物的組合物、伯氨喹和其它喹啉衍生物的組合物、氯喹和其它喹啉衍生物的組合物，等等。

在本發(fā)明的范圍中，藥物學(xué)上可接受的賦形劑(或者溶媒)可以是水、水可混溶性有機(jī)溶劑、或者包含水和水可混溶性有機(jī)溶劑的溶媒系統(tǒng)。水可混溶性有機(jī)溶劑包括以下之一種或多種：乙醇、丙二醇、聚乙二醇(PEG)、異丙醇。其中PEG可任選使用分子量小于600的PEG，例如PEG200、PEG300和PEG400 等。所述組合物不含烏拉坦和安替比林。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，除喹啉類(lèi)物質(zhì)和藥物學(xué)上可接受的賦形劑外，所述組合物還可以進(jìn)一步包含止痛劑。所述止痛劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適者，以減輕患者的疼痛感，例如苯甲醇、鹽酸普魯卡因、三氯叔丁醇、鹽酸利多卡等。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，除喹啉類(lèi)物質(zhì)和藥物學(xué)上可接受的賦形劑外，所述組合物還可以進(jìn)一步包含其他抗腫瘤藥物。所述抗腫瘤藥物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適者，以進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤活性，例如包括阿霉素、5-氟嘧啶、吉西他濱、順鉑、青蒿素及其衍生物等。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，除喹啉類(lèi)物質(zhì)和藥物學(xué)上可接受的賦形劑外，所述組合物還可以進(jìn)一步包含增效劑。所述增效劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適者，以進(jìn)一步增強(qiáng)治療甲狀腺、乳腺疾病的效果，例如包括硬化劑和增活劑。

所述硬化劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適者，加入它以促進(jìn)患病區(qū)內(nèi)腫大的壞死、縮小和纖維化，其例如可以是聚桂醇、魚(yú)肝油酸鈉、乙醇胺油酸酯、聚多卡醇和平陽(yáng)霉素等。

本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“增活劑”是指活性相比較小甚至基本上沒(méi)有(例如在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的抑瘤率小于40％)但可以用以增加其它藥物抗瘤活性的物質(zhì)，包括免疫佐劑。所述免疫佐劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意合適者，加入它以促進(jìn)患病區(qū)內(nèi)相關(guān)的有益于治療腫瘤的抗原的活動(dòng)，其例如可以是無(wú)機(jī)佐劑，如氫氧化鋁、明礬等；微生物及其產(chǎn)物如分枝桿菌(結(jié)核桿菌、卡介苗)、短小桿菌、百日咳桿菌、內(nèi)毒素、細(xì)菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸(雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、異丙肌苷等；油劑，如費(fèi)氏佐劑、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等；免疫刺激劑(卡介苗、棒狀桿菌、內(nèi)毒素、海藻糖、胸腺肽、OK432等)；細(xì)胞因子，如干擾素、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、趨化因子、胸腺素等；異種抗原，如滅活鏈球菌、人紅細(xì)胞膜抗原、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、腫瘤疫苗等。

術(shù)語(yǔ)“靶區(qū)給藥”是指是指將藥物直接加入到藥物靶點(diǎn)相對(duì)集中的局部區(qū)間內(nèi)。例如，當(dāng)疾病為腫大時(shí)，靶區(qū)即為包括腫塊及塊周的腫大區(qū)。當(dāng)腫塊為腫瘤時(shí)，靶區(qū)即為包括瘤體及瘤周的瘤區(qū)；當(dāng)腫塊為非瘤腫塊(或增生體)時(shí)，靶區(qū)即為包括腫塊(或增生體)及塊(或增生體)周的腫大區(qū)；當(dāng)腫塊為囊腫時(shí)，靶區(qū)即為囊。當(dāng)疾病為甲亢時(shí)，靶區(qū)即為甲狀腺。在靶區(qū)給藥時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物為適合于靶區(qū)給藥的劑型，例如可以是注射劑等，且喹啉類(lèi)物質(zhì)在該靶區(qū)給藥的藥物組合物中的濃度為0.05-0.5M(Mol/L)，優(yōu)選為0.1-0.4M，更優(yōu)選為0.1-0.3M。另外，在靶區(qū)給藥時(shí)，所述藥物組合物的給藥體積不小于欲處理之 體積的70％、優(yōu)選為不小于110％，以使包含喹啉類(lèi)物質(zhì)的藥物組合物能夠浸潤(rùn)靶點(diǎn)及其周?chē)鷧^(qū)域，實(shí)現(xiàn)更高的治療作用。當(dāng)疾病為腫大時(shí)，如果其腫塊(例如腫瘤、非瘤腫塊、囊)的體積足夠小，則該體積即為上述之欲處理之體積。對(duì)于腫塊較大的腫大和甲狀腺功能亢進(jìn)癥，則需分作多個(gè)部份分批用藥，則該部份體積即為上述之欲處理之體積。

用于本發(fā)明之應(yīng)用和方法中的經(jīng)瘤區(qū)給藥的藥物組合物，以注射劑為例，可按照以下方法來(lái)制備。

方法一：對(duì)于所需濃度在水溶濃度范圍內(nèi)的固相喹啉類(lèi)物質(zhì)，例如濃度小于0.35M的二鹽酸奎寧，以及任選存在的水可混溶性強(qiáng)的止痛劑、其他抗腫瘤藥物和/或增效劑，將他們直接加入注射用水即可獲得相應(yīng)的注射劑。

方法二：對(duì)于所需濃度在水溶濃度范圍之外的固相喹啉類(lèi)物質(zhì)，例如濃度大于0.15M的一鹽酸奎寧，以及任選存在的水可混溶性差的止痛劑、其他抗腫瘤藥物和/或增效劑，則先配制所需的溶媒系統(tǒng)(例如9％的乙醇溶液)，再將上述固體物質(zhì)加入該溶媒系統(tǒng)中，即可獲包含所需濃度的喹啉類(lèi)物質(zhì)的注射劑。

方法三：當(dāng)需加入難溶于水的止痛劑、其他抗腫瘤藥物和/或增效劑時(shí)，則例如可按以下方法來(lái)制備：

a.配制喹啉類(lèi)物質(zhì)水溶液，或配制所需溶媒系統(tǒng)與喹啉類(lèi)物質(zhì)的溶液；

b.配制所需溶媒系統(tǒng)與難溶于水的止痛劑、其他抗腫瘤藥物和/或增效劑的溶液；

c.將a和b配制的溶液進(jìn)行混合。

按上述這些方法，可制備各種包含喹啉類(lèi)物質(zhì)的注射劑。例如，不同注射劑中的變化包括：含不同的喹啉類(lèi)物質(zhì)，含不同濃度的喹啉類(lèi)物質(zhì)，含不同的水可混溶性有機(jī)溶劑，含不同濃度的水可混溶性有機(jī)溶劑，含不同種類(lèi)和濃度的止痛劑、其他抗腫瘤藥物和/或增效劑，等等。但無(wú)論如何變化，喹啉類(lèi)物質(zhì)在瘤區(qū)給藥的藥物組合物中的總濃度應(yīng)保持為0.05-0.5M(Mol/L)，優(yōu)選為0.1-0.4M，更優(yōu)選為0.1-0.3M。

如果存在，止痛劑的濃度為0-3％(重量)；其他抗腫瘤藥物的濃度為0-0.15M；增效劑的濃度為0-3％(重量)

當(dāng)然，本發(fā)明中所需的包含喹啉類(lèi)物質(zhì)(例如二鹽酸奎寧)的注射濃度也可通過(guò)稀釋高濃度喹啉類(lèi)物質(zhì)注射液(例如含25W/V％二鹽酸奎寧的注射液)來(lái)獲得。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包含喹啉類(lèi)物質(zhì)的藥物組合物在瘤區(qū)給藥之前也可以是固體粉末的形式，在給藥之前用相應(yīng)的溶媒復(fù)原即可。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，為增加喹啉類(lèi)物質(zhì)在給藥處的有效作用時(shí)間、提高其生物利用度，其例如可以摻入作為緩釋載體或基質(zhì)的微米粒子、納米粒子、膠束和 原位凝膠基質(zhì)中。

實(shí)施例

通過(guò)以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。

在以下實(shí)施例中，除非另有說(shuō)明，皮下移植瘤動(dòng)物試驗(yàn)按如下方式進(jìn)行。

動(dòng)物：SPF級(jí)裸鼠(BALB/C-Nude)，性別全部為雌性，分組時(shí)動(dòng)物約6～8周齡，體重為17.5-20.5g。

動(dòng)物接種和分組：體外培養(yǎng)受試腫瘤細(xì)胞，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，將所需數(shù)目的腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠的皮下。受試腫瘤細(xì)胞包括人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB231)和人甲狀腺癌細(xì)胞(SW579)。本發(fā)明的實(shí)施例中的研究方法和結(jié)果也適用于喹啉類(lèi)物質(zhì)對(duì)其有抗瘤活性的其它腫瘤細(xì)胞。待腫瘤長(zhǎng)至50-100mm³時(shí)，采用PEMS 3.2軟件(四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院編制)對(duì)受試動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組，分別為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和若干個(gè)藥物研究組，每組8只。

給藥：分組當(dāng)日開(kāi)始給藥，注射量由劑量和濃度確定。給藥次數(shù)為6次，給藥頻率為每?jī)商煲淮巍ｊ幮詫?duì)照組的注射物為相應(yīng)的溶媒。陽(yáng)性對(duì)照組注射的陽(yáng)性對(duì)照物選自上述現(xiàn)有抗瘤藥物，給藥方式和劑量均按所選藥物的慣例進(jìn)行(例如尾靜脈注射)。藥物研究組根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要注射不同種類(lèi)和濃度的研究藥物，除另有說(shuō)明均為瘤區(qū)注射。

觀察、測(cè)量和分析：

1)一般狀態(tài)：每天觀察1次，自給藥開(kāi)始至試驗(yàn)第28天，觀察指標(biāo)或內(nèi)容包括但不限于動(dòng)物給藥局部、外觀體征、一般行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、死亡等情況及其它異常表現(xiàn)。

2)體重：檢疫期測(cè)定1次，給藥前測(cè)定1次和給藥期每周測(cè)定2次。

3)攝食量：給藥期每周測(cè)定1次。

4)相對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制率：于給藥后第1、3、5、7、11、16、21、27天測(cè)量移植瘤大小。

腫瘤體積計(jì)算公式如下：TV＝l/2×a×b²，式中a表示腫瘤長(zhǎng)度，b表示腫瘤寬度。

相對(duì)腫瘤體積計(jì)算公式如下：RTV＝V_t/V₀，式中V₀為分組給藥當(dāng)天(即第一天)測(cè)量所得的腫瘤體積，V_t為每一次測(cè)量時(shí)的腫瘤體積。

相對(duì)腫瘤增殖率計(jì)算公式如下：T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100，式中：T_RTV為陽(yáng)性對(duì)照組或藥物研究組的RTV，C_RTV為陰性對(duì)照組的RTV。

藥物研究組的藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：T/C(％)>40為無(wú)活性，T/C(％)≤40(但是>15％)并經(jīng)方差分析與陰性對(duì)照組相比P<0.05為有活性(無(wú)優(yōu)選藥物學(xué)活性)， T/C(％)≤15并經(jīng)方差分析與陰性對(duì)照組相比P<0.05為有優(yōu)選藥物學(xué)活性。

5)腫瘤生長(zhǎng)抑制率(抑瘤率)測(cè)定：于第一次給藥后第28天進(jìn)行系統(tǒng)尸解,進(jìn)行瘤體稱(chēng)重。抑瘤率計(jì)算公式如下：抑瘤率％＝(TW-CW)/CW×100％，式中：TW為陽(yáng)性對(duì)照組或藥物研究組的平均瘤重；CW為陰性對(duì)照組的平均瘤重。

藥物研究組的藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：抑瘤率<40％為無(wú)活性，抑瘤率≥40％(但是<85％)并經(jīng)方差分析與陰性對(duì)照組相比P<0.05為有活性,抑瘤率≥85％并經(jīng)方差分析與陰性對(duì)照組相比P<0.05為有優(yōu)選藥物學(xué)活性。

在以下實(shí)施例中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均采用重復(fù)測(cè)量方差分析(Repeated Measures ANOVA)分別對(duì)指標(biāo)均數(shù)的組別差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。組別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)(P≤0.05)，采用最小顯著差異法對(duì)各組與陰性對(duì)照組間差異進(jìn)行比較。定量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(X±SEM)描述。當(dāng)LEVENE方差齊性檢驗(yàn)提示方差不齊時(shí)(P≤0.05)，采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)(M-W法)比較組間差異。所有的統(tǒng)計(jì)分析，均在SPSS for Windows 13.0軟件下完成。

實(shí)施例1：喹啉類(lèi)物質(zhì)注射劑的制備

表1

備注:+指的是除表中的組成外其余全是注射用水；

-指的是不含。

表1中，A2的制備方法如下：在室溫下，將0.2ml苯甲醇加入8.5ml注射用水中溶解，然后將758mg二鹽酸奎寧干粉加入該溶液中溶解，再加入注射用水使總體積達(dá)到10ml，混合均勻后分裝為2ml/瓶備用，便制得注射劑A2。

A3的制備方法如下：在室溫下，將0.2ml苯甲醇加入8.0ml注射用水中溶解，然后將758mg二鹽酸奎寧干粉加入該溶液中溶解，再加入1000mg聚多卡醇溶解，最后加入注射用水使總體積達(dá)到10ml，混合均勻后分裝為2ml/瓶備用，便制得注射劑A3。

A4的制備方法如下：在室溫下，將0.2ml苯甲醇加入8.0ml注射用水中溶解，然后將379mg二鹽酸奎寧干粉加入該溶液中溶解，再加入516mg磷酸氯喹溶解，最后加入注射用水使總體積達(dá)到10ml，混合均勻后分裝為2ml/瓶備用，便制得注射劑A4。

B2的制備方法如下：在室溫下，將0.9ml無(wú)水乙醇加入7.5ml注射用水中混勻，再將0.2ml苯甲醇加入其中溶解，然后將595mg一鹽酸奎寧干粉加入該溶液中溶解，再加入注射用水使總體積達(dá)到10ml，混合均勻后分裝為2ml/瓶備用，便制得注射劑B2。

B3的制備方法如下：在室溫下，將0.9ml無(wú)水乙醇加入7.5ml注射用水中混勻，再將0.2ml苯甲醇加入其中溶解，然后將595mg一鹽酸奎寧干粉加入該溶液中溶解，再加入1g聚多卡醇溶解，最后加入注射用水使總體積達(dá)到10ml，混合均勻后分裝為2ml/瓶備用，便制得注射劑B3。

未提及的制劑A1、A5、A6、B1、B4、C1、D1和F1都按照與上述類(lèi)似的方法進(jìn)行制備。

本發(fā)明中的所需的喹啉類(lèi)物質(zhì)(例如二鹽酸奎寧)的注射濃度，也可通過(guò)稀釋高濃度喹啉類(lèi)物質(zhì)(例如W/V百分比25％的二鹽酸奎寧)注射液來(lái)獲得。

實(shí)施例2：應(yīng)用的優(yōu)選條件研究

本發(fā)明的喹啉類(lèi)物質(zhì)在甲狀腺、乳腺疾病治療中的應(yīng)用的優(yōu)選條件，首先在抗瘤實(shí)驗(yàn)(體外抗癌細(xì)胞試驗(yàn)和移植瘤動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn))中進(jìn)行了研究。

在抗瘤實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照物通常為現(xiàn)有臨床藥物(例如順鉑、阿霉素、絲裂霉素、吉西他濱、5-氟嘧啶等)。它們的臨床意義在于低毒性高活性，例如在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出低毒性和可達(dá)75％的抑瘤率。術(shù)語(yǔ)“抗瘤活性”，有時(shí)又簡(jiǎn)稱(chēng)活性，是指與現(xiàn)有臨床藥物相比具有一定抗瘤類(lèi)似性的性質(zhì)。一種物質(zhì)如在體外實(shí)驗(yàn)中具有較低的半抑制濃度(簡(jiǎn)記為IC₅₀，通常在72小時(shí)抑制反應(yīng)中小于50μM)、或在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出較高的腫瘤生長(zhǎng)抑制率(簡(jiǎn)稱(chēng)抑瘤率，通常大于40％但小于75％)，便被認(rèn)為與現(xiàn)有臨床藥物有了類(lèi)似性，從而顯示出了抗瘤活性，該物質(zhì)也就被稱(chēng)作活性物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“活性條件”是指研究者提供的使某物質(zhì)顯示出其抗瘤活性的條件。例如，使喹啉類(lèi)物質(zhì)的抑瘤率從35％左右提高到75％左右的條件(用藥方式、劑量等)。

術(shù)語(yǔ)“優(yōu)選抗瘤活性”，有時(shí)又簡(jiǎn)稱(chēng)優(yōu)選活性，是指與現(xiàn)有臨床藥物相比具有更低毒性而明顯更高抗瘤活性的性質(zhì)。例如，優(yōu)選活性可以是指動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中以較小的副反應(yīng)代價(jià)(無(wú)毒性僅輕微副作用)顯示出明顯較大的抑瘤率(例如85％以上)。術(shù)語(yǔ)“優(yōu)選條件”是指研究者提供的可以使某物質(zhì)顯示出其優(yōu)選抗瘤活性的條件。術(shù)語(yǔ)“優(yōu)選物質(zhì)”是指不僅給出了抗瘤活性條件而且給出了優(yōu)選條件的物質(zhì)。

1).抗瘤活性研究

本發(fā)明中，半數(shù)有效濃度(簡(jiǎn)記為IC₅₀)即體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞存活率減少50％時(shí)的藥物濃度。本實(shí)驗(yàn)選用11株人癌細(xì)胞株，使用四氮唑鹽MTT還原法測(cè)定藥物的抗腫瘤作用。試驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照組和研究組。陰性對(duì)照組加等體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組為不同濃度(在μMol/l水平上)的常規(guī)化療藥物5-氟嘧啶。研究組組分別為以較高濃度母液稀釋而成的不同濃度的喹啉類(lèi)物質(zhì)溶液(在μMol/l水平上)。這些母液分別為實(shí)施例1制備的含0.25M一鹽酸奎寧、0.25M二鹽酸奎寧、0.15M奎寧、0.15M磷酸氯喹和0.1M伯氨喹的注射劑。

實(shí)驗(yàn)中，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁腫瘤細(xì)胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640培養(yǎng)基配成所需細(xì)胞濃度的懸液，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200μl，然后在37℃和5％CO₂中培養(yǎng)24h。研究組和陽(yáng)性對(duì)照組換新的含不同濃度被測(cè)樣品的培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組則換含等體積生理鹽水的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)平行孔，使終體積為200ul/孔，培養(yǎng)48小時(shí)。然后棄去上清液，每孔加入200μl新鮮配制的含0.2mg/ml MTT的無(wú)血清培養(yǎng)基.37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心棄上清，并加入200μl DMSO，用微型超聲振蕩器混勻后，在酶標(biāo)儀上以試 驗(yàn)波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為450nm測(cè)定光密度值。按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率％＝(1-OD實(shí)驗(yàn)/OD對(duì)照)×100％

以同一樣品不同濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制率作圖可得到劑量-效應(yīng)曲線，然后采用Logit法計(jì)算半數(shù)有效濃度(IC₅₀值)。通常IC₅₀的濃度小于100μM時(shí)，則判斷樣品在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷作用。表2為受試組合物對(duì)試驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞的IC₅₀,濃度值以組合物中的喹啉類(lèi)物質(zhì)濃度計(jì)?？偟膩?lái)說(shuō),它們都在μM的濃度水平,統(tǒng)計(jì)學(xué)上看不出明顯差別。而陽(yáng)性對(duì)照物的IC₅₀則在0.01-0.5μM之間。

表2

*：喹啉類(lèi)物質(zhì)的總濃度。

進(jìn)一步的試驗(yàn)還證實(shí)，本發(fā)明組合物中引入的濃度范圍內(nèi)的有機(jī)溶劑、止痛劑、增效劑對(duì)喹啉類(lèi)物質(zhì)的抗瘤活性并無(wú)負(fù)面作用。

2)用藥方式研究

試驗(yàn)動(dòng)物為荷乳腺癌細(xì)胞裸鼠,分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和藥物研究組。陰性對(duì)照組注射生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組注射常規(guī)抗瘤藥物阿霉素(4mg/kg)，藥物研究組注射二鹽酸奎寧溶液。當(dāng)尾靜脈注射小、中、大劑量的濃度為0.025M的二鹽酸奎寧水溶液時(shí)，雖然我們也作了一些技術(shù)上的改進(jìn),所獲結(jié)果仍和現(xiàn)有技術(shù)的結(jié)果一致，抑瘤率小于30％。而作為陽(yáng)性對(duì)照的阿霉素的抑瘤率卻達(dá)到50％。

當(dāng)我們把一種配制來(lái)稀釋備用的0.25M二鹽酸奎寧(含2％止痛劑)直接注射到動(dòng)物瘤體上時(shí),卻出現(xiàn)了出人意料的結(jié)果。盡管大家都知道靶區(qū)給藥可能改善全身用藥的效率(例如使抑瘤率有所提高,通常提高10-30％)，而我們的研究成果 卻把藥效提高到了不可思議的高度(可以提高90％以上)。相反，該組合物通過(guò)尾靜脈注射時(shí)，抑瘤率還是低于30％。

瘤區(qū)給藥不僅取決于藥效，也取決于其安全性。為此，我們比較了二鹽酸奎寧的動(dòng)物尾靜脈注射和瘤體注射的最大耐受劑量(Maximum telareted dose,MTO)，方法如下：

試驗(yàn)動(dòng)物為荷乳腺癌細(xì)胞裸鼠，隨機(jī)分組為尾靜脈注射不同劑量組(四個(gè)組)和瘤體注射不同劑量組(四組)，每個(gè)劑量組5只裸鼠，注射劑量均分別為250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg和400mg/kg。隔天給藥、連續(xù)五次。

試驗(yàn)中觀察祼鼠體重變化和生存情況，同時(shí)記錄具有明顯生理意義的毒性，如糠粃性皮屑、脫水、嗜睡、共濟(jì)失調(diào)和呼吸急促等。若出現(xiàn)小鼠體重下降>30％持續(xù)3天以上或因毒性死亡則停止試驗(yàn)藥物劑量增加，確定前一組劑量為最大耐受劑量，21天為試驗(yàn)觀察周期，第22天處死動(dòng)物，尸體解剖，肉眼觀察有無(wú)病變。尾靜脈注射中的MTO小于250mg/kg，而瘤體注射中的MTO可高達(dá)300mg/kg。使用同樣的劑量,瘤區(qū)注射看上去比靜脈注射的毒性還略小。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在一些其它腫瘤的動(dòng)物試驗(yàn)中也有類(lèi)似的表現(xiàn)。實(shí)施例1制備的一些其它喹啉類(lèi)物質(zhì)注射劑也有類(lèi)似的表現(xiàn)。因此，本發(fā)明的應(yīng)用選擇了靶區(qū)給藥為主要應(yīng)用方式。

3).給藥濃度范圍

試驗(yàn)動(dòng)物為荷乳腺癌細(xì)胞裸鼠，分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和藥物研究組。陰性對(duì)照組注射生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組注射常規(guī)抗瘤藥物阿霉素(4mg/kg)，藥物研究組注射不同濃度的二鹽酸奎寧水溶液。陽(yáng)性對(duì)照組用藥方式仍為尾靜脈注射，陰性對(duì)照組和藥物研究組為瘤體注射。各藥物研究組(B、C、D、E、F組)的注射劑的制備方法與表1中A2的制備方法相同，內(nèi)含2％苯甲醇、但含有所需的不同濃度二鹽酸奎寧，注射濃度分別為0.025M、0.05M、0.15M、0.25M、0.4M、0.5M。藥物研究組瘤區(qū)注射劑量小于300mg二鹽酸奎寧/kg，注射體積由注射劑量和濃度確定，給藥次數(shù)為5次，給藥頻率為每?jī)商煲淮?。圖1顯示了二鹽酸奎寧注射劑的注射濃度-抑瘤率關(guān)系曲線。

在圖1中，橫坐標(biāo)X為瘤區(qū)注射濃度(4×10^XμM)的指數(shù)(X)，縱坐標(biāo)Y為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中測(cè)出的抑瘤率(Y％)。在很大的濃度范圍內(nèi)(X之差大于3)，即在常識(shí)可預(yù)見(jiàn)的大于IC₅₀幾十倍、甚至上千倍的用藥濃度范圍內(nèi)，觀察不到與此濃度變化相應(yīng)的藥效變化，抑瘤率一直小于25％。與陰性對(duì)照組相比，抑瘤率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在50mM(X＝4)處，抑瘤率突變上升到45％，然后在一個(gè)相對(duì)較窄的用藥濃度范圍內(nèi)(X之差等于1)迅速達(dá)到85％以上，出現(xiàn)了突破。 在0.4M處，抑瘤率又出現(xiàn)下降。

在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，陰性對(duì)照組腫瘤體積呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。在0.05M-0.4M二鹽酸奎寧的注射濃度范圍內(nèi)的藥物研究組與陰性對(duì)照組相比，抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照物的抑瘤率為53％，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

如圖2所示，用伯氨喹注射劑進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，得到類(lèi)似的結(jié)果。

總而言之，唯有其瘤體注射濃度超過(guò)某一臨界值時(shí)，二鹽酸奎寧或伯氨喹注射劑才顯示出藥效對(duì)濃度的高度敏感，然后又重新變得不那么敏感，甚至于抑瘤率可能出現(xiàn)下降。

我們還觀測(cè)了受試動(dòng)物瘤區(qū)注射后的一般狀況、體重變化、死亡率及局部變性。在實(shí)驗(yàn)期間，二鹽酸奎寧注射劑的各研究組未見(jiàn)裸鼠死亡，平均體重與陰性對(duì)照組體重變化接近(下降小于10％)，表示藥物在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)明顯的毒性反應(yīng)。研究組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，一般狀況類(lèi)似。但陽(yáng)性對(duì)照組平均體重下降更大(大于20％)，提示一個(gè)較強(qiáng)的毒性反應(yīng)。

在瘤區(qū)用藥期間，與陰性對(duì)照組相比較，研究組中、尤其是高濃度(>0.4M)組中大部分注射部位均有明顯的色澤變化、甚至伴有肌肉變性，范圍多在10mm以內(nèi)。這提示該應(yīng)用條件確實(shí)引起了肌細(xì)胞的部分損傷，注射部位有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但不影響正常功能。在給藥停止后，研究組裸鼠注射部位的肌肉組織外觀逐步實(shí)現(xiàn)正?；?。對(duì)給藥停止后30天剖殺的裸鼠的注射部位進(jìn)行了病理切片檢查，結(jié)果顯示研究組與陰性對(duì)照組的差別明顯縮小，趨于正常。

此外，我們還利用相同的方法研究了二鹽酸奎寧注射劑對(duì)于接種時(shí)間不同、因而癌細(xì)胞的發(fā)育有所區(qū)別的瘤體的作用。藥物研究組為B組和C組。B組比C組晚12天接種人乳腺癌細(xì)胞的動(dòng)物。在最后一組接種后10天，各組分別選擇瘤體平均體積分別約為25mm³(B組)和103mm³(C組)的8只荷瘤裸鼠注射。瘤體注射0.25M二鹽酸奎寧，注射劑量均為300mg/kg，注射體積由注射劑量和濃度確定。隔天給藥、連續(xù)6次。

從試驗(yàn)第5天起，各藥物研究組荷瘤小鼠腫瘤相對(duì)腫瘤體積明顯降低；17天時(shí)腫瘤相對(duì)體積達(dá)到最低值；32天起，C組相對(duì)腫瘤體積出現(xiàn)上升，有復(fù)發(fā)的趨勢(shì)；B組則效果一直非常明顯，暫無(wú)復(fù)發(fā)的趨勢(shì)。38天時(shí)，C組比B組的瘤重明顯較大，B組的平均瘤重接近于0。

這一實(shí)驗(yàn)所提供的模型說(shuō)明,在本發(fā)明提供的抗瘤應(yīng)用中的優(yōu)選條件下，二鹽酸奎寧注射劑可應(yīng)用于惡性腫瘤治療，甚至于可用于完全去除有一定致癌風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤，以防止其發(fā)展為惡性腫瘤。

在一些文獻(xiàn)中，二鹽酸奎寧也被視作硬化劑。我們選擇了通常認(rèn)為更有效 的一種硬化劑(聚多卡醇)進(jìn)行了對(duì)照研究。在相同的條件下，聚多卡醇的濃度為自1.5w/v％直到6w/v％(該濃度引起瘤區(qū)明顯水泡及出現(xiàn)中毒癥狀)，其抑瘤率一直在30％左右，未發(fā)現(xiàn)有類(lèi)似的濃度-抑瘤率關(guān)系趨勢(shì)。這個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明的組合物明顯地區(qū)別于基于硬化劑機(jī)理的應(yīng)用。

用實(shí)施例1中制備的一些其它喹啉類(lèi)物質(zhì)注射劑(例如表1中的注射劑)也獲得類(lèi)似結(jié)果。此外，在以下實(shí)施例中，當(dāng)喹啉類(lèi)物質(zhì)應(yīng)用于其它甲狀腺、乳腺疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)也獲得類(lèi)似結(jié)果。

根據(jù)這些藥效學(xué)結(jié)果及局部副反應(yīng)結(jié)果，本發(fā)明提供的喹啉類(lèi)物質(zhì)在甲狀腺、乳腺疾病治療應(yīng)用中的優(yōu)選條件如下：靶區(qū)給藥，喹啉類(lèi)物質(zhì)注射濃度為0.05-0.50M、優(yōu)選0.1-0.4M、更優(yōu)選0.1-0.3M。

此外，另一組試驗(yàn)顯示，本發(fā)明的喹啉類(lèi)物質(zhì)注射劑在同樣濃度下，一個(gè)較大的注射量顯示出更好的藥物學(xué)效果。如果靶區(qū)體積太大，為控制給藥劑量,可以對(duì)靶區(qū)進(jìn)行分部處理。注射劑的每次給藥體積必須為欲處理部份體積的70％以上、優(yōu)選110％以上。當(dāng)靶區(qū)的靶塊為腫塊(例如腫瘤、非瘤腫塊)且其個(gè)體足夠小時(shí)，欲處理部份體積即為單個(gè)腫塊體積。

實(shí)施例3：在乳腺疾病治療中的應(yīng)用

在臨床上，最常見(jiàn)的乳腺疾病是乳腺腫大，包括腫瘤和非瘤腫大。本實(shí)施例中，對(duì)喹啉類(lèi)物質(zhì)的應(yīng)用研究首先使用二鹽酸奎寧進(jìn)行。各藥物研究組(B、C、D、E、F組)的注射劑的制備方法與表1中A2的制備方法相同，內(nèi)含2％苯甲醇、但含有所需的不同濃度二鹽酸奎寧，其注射濃度分別為0.025M、0.05M、0.15M、0.25M、0.4M。注射劑量小于300mg二鹽酸奎寧/kg動(dòng)物，注射體積由注射劑量和濃度確定。

1.乳腺腫瘤治療

試驗(yàn)動(dòng)物為荷乳腺癌細(xì)胞裸鼠，分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和藥物研究組。陽(yáng)性對(duì)照組尾靜脈注射常規(guī)抗瘤藥物阿霉素(7mg/kg)，陰性對(duì)照組瘤體注射生理鹽水。藥物研究組瘤區(qū)注射劑量小于300mg二鹽酸奎寧/kg，注射體積由注射劑量和濃度確定，給藥次數(shù)為5次,給藥頻率為每?jī)商煲淮巍?/p>

在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，陰性對(duì)照組腫瘤體積呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；從試驗(yàn)第5天起，陽(yáng)性對(duì)照組和各藥物研究組荷瘤小鼠腫瘤體積與陰性對(duì)照組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

從試驗(yàn)第7天起直到第17天，各藥物研究組荷瘤小鼠的相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)均小于40％；試驗(yàn)第17天起，B組相對(duì)腫瘤增殖率上升，有復(fù)發(fā)的趨勢(shì)； C、D、E、F組的相對(duì)腫瘤增殖率(T/C)仍在減小，說(shuō)明這四組在停藥后仍有有明顯的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果。試驗(yàn)第22天起，C、F組相對(duì)腫瘤增殖率上升，有復(fù)發(fā)趨勢(shì)；而D、E組相對(duì)腫瘤增殖率仍接近于0％，效果一直非常明顯，暫無(wú)復(fù)發(fā)趨勢(shì)。在試驗(yàn)期間，陽(yáng)性對(duì)照組相對(duì)腫瘤增殖率的下降比D、E組在時(shí)間上晚，在數(shù)據(jù)上明顯更大(40％左右)。

給藥后第28天，各藥物研究組荷瘤小鼠的瘤重與陰性對(duì)照組相比顯著降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中以D、E組抑瘤率最高(均在95％以上)；F組抑瘤率為90.11±2.76％，其它組抑瘤率低于85％。陽(yáng)性對(duì)照組抑瘤率為53％。

此外，在本發(fā)明提供的抗瘤應(yīng)用中的優(yōu)選條件下，二鹽酸奎寧注射劑對(duì)于接種時(shí)間不同、因而癌細(xì)胞的發(fā)育有所區(qū)別的瘤體的作用，也是接種時(shí)間越短的腫瘤抑瘤效果越好，其除了可應(yīng)用于乳腺癌治療，甚至于可用于有較大致癌風(fēng)險(xiǎn)的非惡性瘤的完全去除，以預(yù)防其發(fā)展為惡性瘤。

在實(shí)驗(yàn)期間，各研究組未見(jiàn)裸鼠死亡，平均體重與陰性對(duì)照組體重變化接近(下降小于10％)，表示藥物在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)明顯的毒性反應(yīng)。研究組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，一般狀況類(lèi)似。但陽(yáng)性對(duì)照組平均體重下降更大(大于20％)，提示一個(gè)較強(qiáng)的毒性反應(yīng)。

在靶區(qū)用藥期間，與陰性對(duì)照組相比較，研究組中、尤其是F組中大部分注射部位均有明顯的色澤變化、甚至伴有肌肉變性，范圍多在10mm以內(nèi)。進(jìn)一步的研究說(shuō)明，這些變性是二鹽酸奎寧作用造成的。在給藥停止后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠注射部位的肌肉組織外觀逐步實(shí)現(xiàn)正?；?。對(duì)給藥停止后30天剖殺的裸鼠的注射部位進(jìn)行了病理切片檢查，結(jié)果顯示試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的差別明顯縮小，趨于正常。

2.乳腺非瘤增生(非瘤腫大)治療

乳腺增生是一種非腫瘤良性增生性腫大，臨床表現(xiàn)以不同程度的乳房疼痛和乳房腫塊為特征。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)述如下：

所用動(dòng)物：SPF級(jí)未孕大鼠，性別全部為雌性，分組時(shí)動(dòng)物體重為150-180g。

動(dòng)物建模和分組：將上述大鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg，1次/天，連續(xù)20天。繼而肌注黃體酮5mg/kg，1次/天，連續(xù)5天。造模結(jié)束后，隨機(jī)取6只大鼠處死，取第二對(duì)乳房活檢，見(jiàn)乳腺小葉及腺泡明顯增多、導(dǎo)管上皮增多、細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，乳腺呈分泌狀態(tài)，表示造模成功。采用PEMS 3.2軟件對(duì)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組，分為空白對(duì)照組(末建模動(dòng)物)和造模成功的以下組：陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組(A組)、藥物研究組。

給藥：分組當(dāng)日開(kāi)始給藥。陰性對(duì)照組的注射物為9％乙醇。陽(yáng)性對(duì)照物為 乳增寧片，灌服，給藥次數(shù)為27次，給藥頻率為每天一次，劑量為每次1g/kg。各藥物研究組(B、C、D、E、F組)于腫塊注射，給藥次數(shù)為5次，給藥頻率為每?jī)商煲淮巍?/p>

觀察、測(cè)量和分析：

1).一般狀態(tài)觀察：每天觀察1次，自給藥開(kāi)始至試驗(yàn)第28天，觀察指標(biāo)或內(nèi)容包括但不限于動(dòng)物給藥局部、外觀體征、一般行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、死亡等情況及其它異常表現(xiàn)。

2).體重測(cè)定：給藥前測(cè)定1次和給藥期每周測(cè)定2次。

3).攝食量測(cè)定：給藥期每周測(cè)定1次。

4).乳房局部形態(tài)：分別于給藥后第1、3、5、7、11、16、21、27天用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量大鼠第二對(duì)左右兩個(gè)乳頭直徑(記為D)。

相對(duì)乳頭直徑計(jì)算公式為：RTD＝D_t/D₀，式中D₀為分組第一次給藥測(cè)量所得乳頭直徑，D_t為每一次測(cè)量時(shí)的乳頭直徑。

相對(duì)乳頭增大率計(jì)算公式為：T/C(％)＝T_RTD/C_RTD×100，式中T_RTD為陽(yáng)性對(duì)照組或藥物研究組RTD，C_RTD為陰性對(duì)照組RTD。

藥物研究組的藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：T/C(％)>50為無(wú)活性，T/C(％)≤50(但是>25％)并經(jīng)方差分析與陰性對(duì)照組相比P<0.05為有活性，T/C(％)≤25并經(jīng)方差分析與陰性對(duì)照組相比P<0.05為有優(yōu)選活性。

5).乳腺組織病理改變：末次給藥后第二天處死動(dòng)物，摘取大鼠第二對(duì)乳腺，石蠟切片，HE染色后在光鏡下觀察乳腺組織病理形態(tài)的改變。通過(guò)觀察小葉及腺泡的形態(tài)，對(duì)各組大鼠乳腺組織病理進(jìn)行積分，按病理增生程度分為4級(jí)：乳腺小葉不增生，腺體數(shù)量極少，腺泡不擴(kuò)張，記0分；乳腺小葉無(wú)明顯增生，個(gè)別腺泡有輕度增生，但無(wú)擴(kuò)張，記1分；乳腺小葉大部分增生，部分腺泡明顯擴(kuò)張，記2分；乳腺小葉明顯增生，腺泡處于極度擴(kuò)張狀態(tài)，腺上皮細(xì)胞呈扁平狀，腺泡內(nèi)及導(dǎo)管內(nèi)有大量的分泌物，記3分；乳腺腺泡、導(dǎo)管、小葉的病理性增生明顯，記4分。

藥物研究組的藥效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：病理積分≥3為無(wú)活性，1<病理積分<3并經(jīng)方差分析與陰性對(duì)照組相比P<0.05為有活性，病理積分≤1并經(jīng)方差分析與陰性對(duì)照組相比P<0.05為有優(yōu)選活性。

動(dòng)物在造模后均不同程度的出現(xiàn)皮毛欠光澤、脫毛、厭食、易激怒等癥狀。藥物研究組所有荷瘤小鼠體重和攝食量與陰性對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯異常改變，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

分組當(dāng)日，動(dòng)物乳頭腫大直立，充血明顯，個(gè)別可見(jiàn)乳頭表面有黃白色分泌物殘留。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，陰性對(duì)照組乳頭直徑呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；從試驗(yàn)第7天起， 除B組以外各藥物研究組乳頭直徑與陰性對(duì)照組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從試驗(yàn)第10天起直到第19天，B組以外各藥物研究組相對(duì)乳頭增大率(T/C)均小于50％；試驗(yàn)第19天起，C、D組相對(duì)乳頭增大率均小于20％，E組相對(duì)乳頭增大率的下降要慢一些。在試驗(yàn)期間，陽(yáng)性對(duì)照組相對(duì)乳頭增大率的下降比C、D、E組在時(shí)間上晚，在數(shù)據(jù)上明顯更大(大于30％)。給藥后第20天，C、D、E組的病理積分≤1，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)而陽(yáng)性對(duì)照組病理積分大于2。

在以上各實(shí)驗(yàn)期間，各研究組未見(jiàn)動(dòng)物死亡，平均體重與陰性對(duì)照組體重變化接近(下降小于10％)，表示藥物在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)明顯的毒性反應(yīng)。研究組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，一般狀況類(lèi)似。但移植瘤試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照組平均體重下降更大(大于20％),提示一個(gè)較強(qiáng)的毒性反應(yīng)。

在靶區(qū)用藥期間，與陰性對(duì)照組相比較，研究組中、尤其是最高濃度組中大部分注射部位均有明顯的色澤變化、甚至伴有肌肉變性，范圍多在10mm以內(nèi)。進(jìn)一步的研究說(shuō)明，這些變性是二鹽酸奎寧作用造成的。在給藥停止后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠注射部位的肌肉組織外觀逐步實(shí)現(xiàn)正常化。對(duì)給藥停止后30天剖殺的裸鼠的注射部位進(jìn)行了病理切片檢查,結(jié)果顯示試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的差別明顯縮小,趨于正常。

用實(shí)施例1中制備的一些其它喹啉類(lèi)物質(zhì)注射劑(例如表1中的注射劑)也獲得類(lèi)似結(jié)果。根據(jù)以上這些藥效學(xué)結(jié)果及局部副反應(yīng)結(jié)果，本發(fā)明提供的藥物組合物在治療乳腺疾病應(yīng)用中的優(yōu)選條件如下：靶區(qū)給藥；喹啉類(lèi)物質(zhì)注射濃度為0.05-0.5M、優(yōu)選0.1-0.4M、更優(yōu)選0.1-0.3M。不同的喹啉類(lèi)物質(zhì)注射劑可以有稍許不同的優(yōu)選注射濃度范圍。例如，含奎寧的注射劑為0.25-0.35M、含一鹽酸奎寧的注射劑為0.2-0.35M、含二鹽酸奎寧的注射劑為0.2-0.3M、含伯氨喹的注射劑為0.1-0.2M、喹啉類(lèi)化合物組合物注射劑的總濃度范圍等于或略大于所含化合物的濃度范圍、等等。

此外，另一組試驗(yàn)顯示，本發(fā)明的藥物組合物在同樣濃度下，一個(gè)較大的注射量顯示出更好的藥物學(xué)效果。如果靶區(qū)體積太大,為控制給藥劑量，可以對(duì)靶區(qū)進(jìn)行分部處理。注射劑的每次給藥體積必須為欲處理部份體積的70％以上、優(yōu)選110％以上。當(dāng)靶區(qū)的靶塊為腫塊(例如腫瘤、非瘤腫塊)且其個(gè)體足夠小時(shí)，欲處理部份體積即為單個(gè)腫塊體積。

實(shí)施例4：在甲狀腺疾病治療中的應(yīng)用

在臨床上,最常見(jiàn)的甲狀腺疾病是甲狀腺腫大和甲亢。本實(shí)施例中，對(duì)喹啉類(lèi)物質(zhì)的研究首先使用一鹽酸奎寧進(jìn)行。各藥物研究組(B、C、D、E、F組)的 注射劑的制備方法與表1中B2的制備方法相同，內(nèi)含2％苯甲醇、但含有所需的不同濃度一鹽酸奎寧，注射濃度分別為0.025M、0.05M、0.15M、0.25M、0.4M，注射劑中的乙醇含量為5-9％。注射劑量小于300mg一鹽酸奎寧/kg動(dòng)物,注射體積由注射劑量和濃度確定。

1.甲狀腺腫瘤治療

試驗(yàn)動(dòng)物為荷甲狀腺癌細(xì)胞裸鼠,陽(yáng)性對(duì)照組尾靜脈注射常規(guī)抗瘤藥物阿霉素(4mg/kg)，陰性對(duì)照組瘤體注射生理鹽水。其它的實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)施例3中乳腺腫瘤治療實(shí)驗(yàn)相同，試驗(yàn)結(jié)果亦類(lèi)似，概言之：

在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，陰性對(duì)照組腫瘤體積呈增長(zhǎng)趨勢(shì)；從試驗(yàn)第5天起，陽(yáng)性對(duì)照組和各藥物研究組荷瘤小鼠腫瘤體積與陰性對(duì)照組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

給藥期內(nèi)，各藥物研究組荷瘤小鼠的相對(duì)腫瘤增殖率下降；試驗(yàn)第17天起，B組以外的各藥物研究組相對(duì)腫瘤增殖率均在很低的水平(<25％)。試驗(yàn)第22天起，C、D組相對(duì)腫瘤增殖率接近于15％，效果一直非常明顯，暫無(wú)復(fù)發(fā)趨勢(shì)。在試驗(yàn)期間，陽(yáng)性對(duì)照組相對(duì)腫瘤增殖率的下降比B組以外的各藥物研究組在時(shí)間上晚，在數(shù)據(jù)上明顯更大(40％左右)。

給藥后第28天，B組以外的各藥物研究組荷瘤小鼠的瘤重與陰性對(duì)照組相比顯著降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中以D組抑瘤率最高(90％以上)。陽(yáng)性對(duì)照組抑瘤率為61％。

此外,在本發(fā)明提供的抗瘤應(yīng)用中的優(yōu)選條件下，本發(fā)明藥物組合物對(duì)于接種時(shí)間不同、因而癌細(xì)胞的發(fā)育有所區(qū)別的瘤體的作用，也是接種時(shí)間越短的腫瘤抑瘤效果越好,其除了可應(yīng)用于癌癥治療，甚至于可用于有較大致癌風(fēng)險(xiǎn)的非惡性腫瘤的完全去除,以預(yù)防其發(fā)展為惡性瘤。

2.甲狀腺腫治療

單純甲狀腺腫(simple goiter)又稱(chēng)非炎性甲狀腺腫，是由非炎性或腫瘤性原因引起甲狀腺素合成障礙而導(dǎo)致的甲狀腺代償性腫大。通過(guò)建立缺碘性甲狀腺腫動(dòng)物模型，進(jìn)行了此項(xiàng)研究。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用成年大鼠，雌雄不限,體重100-200g。

建模和分組：開(kāi)始時(shí)，動(dòng)物飼以以低碘飼料(含碘量50ng/kg濕重飼料，主要含玉米55％、大豆15％、酵母10％、奶粉10％、低碘羊肉9％、無(wú)機(jī)鹽維生素1％)。逐步去掉低碘羊肉和奶粉，使大鼠適應(yīng)低碘飲食而不會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良的發(fā)生。大鼠在低碘飼料喂養(yǎng)的環(huán)境下飼養(yǎng)3個(gè)月以上。以尿碘明顯下降、甲狀腺明 顯腫大為建模成功。采用PEMS 3.2軟件對(duì)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組,分為空白對(duì)照組(末建模動(dòng)物)和造模成功的以下組:陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組(A組)、藥物研究組，每組6只。

給藥：分組當(dāng)日開(kāi)始給藥。陽(yáng)性對(duì)照物為碘酸鉀KIO₃，灌服，給藥次數(shù)為27次，給藥頻率為每天一次，劑量為每次0.4μg/kg。陰性對(duì)照組的注射物為相應(yīng)的溶媒。藥物研究組和陰性對(duì)照組均為甲狀腺腫塊及周邊注射,給藥次數(shù)為10次,給藥頻率為每?jī)商煲淮巍?/p>

觀察、測(cè)量和分析：

1).一般狀態(tài)觀察：每天觀察1次，自給藥開(kāi)始至試驗(yàn)第22天，觀察指標(biāo)或內(nèi)容包括但不限于動(dòng)物給藥局部、外觀體征、一般行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、死亡等情況及其它異常表現(xiàn)。

2).體重測(cè)定：給藥前測(cè)定1次和給藥期每周測(cè)定2次。

3).攝食量測(cè)定：給藥期每周測(cè)定1次。

4).局部形態(tài)：分別于給藥后第1、6、11、16、21天觀察大鼠甲狀腺腫大。

5).24h碘排出量：收集24h尿液及糞便，測(cè)定及計(jì)算24h尿碘及糞碘排出量。尿碘的測(cè)定采用溫和酸硝化砷-鈰反應(yīng)分光光度法。糞碘的測(cè)定采用堿灰法。

6).病理學(xué)檢查：末次給藥后第10天處死動(dòng)物，觀察甲狀腺形態(tài)、濾泡形態(tài)、上皮細(xì)胞形態(tài)、小葉間纖維組織形態(tài)。

整個(gè)試驗(yàn)周期中，動(dòng)物無(wú)死亡，無(wú)體溫異常。

分組前的24h碘排出量檢測(cè)顯示，建模動(dòng)物與未建模動(dòng)物比較其碘排出量明顯降低，甲狀腺明顯腫大。從試驗(yàn)第11天起，各藥物研究組甲狀腺腫大與陰性對(duì)照組相比明顯改善，碘排出量降低相對(duì)趨緩。其中，C、D、E組碘排出量與空白對(duì)照組趨于一致(差別<25％)，效果明顯比陽(yáng)性對(duì)照組(與空白對(duì)照組差別>35％)好。

病理學(xué)檢查中，陰性對(duì)照組可觀察到甲狀腺明顯腫大，濾泡密集，上皮細(xì)胞增生肥大呈高柱狀，可見(jiàn)增生的細(xì)胞團(tuán)索,濾泡間的血管明顯增多，管腔擴(kuò)張充血，小葉間纖維組織增多。各藥物研究組中均可觀察到明顯改善。其中，D、E組在甲狀腺大小、濾泡形態(tài)大小、上皮細(xì)胞、小葉間纖維組織等方面均趨于正常，明顯比陽(yáng)性對(duì)照組更接近未建模大鼠的狀態(tài)。

3.甲亢治療

甲狀腺功能亢進(jìn)癥(hyperthyroidism，HT)(本發(fā)明中簡(jiǎn)稱(chēng)甲亢)，是指由多種因素引起體內(nèi)甲狀腺素分泌過(guò)多，導(dǎo)致以神經(jīng)、循環(huán)、消化等系統(tǒng)興奮性增高和代謝亢進(jìn)為主要表現(xiàn)的一組疾病的總稱(chēng)。因此，甲亢是一種臨床綜合征。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年雄性SD大鼠，體重300-400g，36-40日齡。

建模和分組：將左旋甲狀腺素溶于生理鹽水中，每天腹腔內(nèi)注射，注射劑量為50μg/100g體重，連續(xù)注射10天。然后進(jìn)行血清學(xué)檢查和病理學(xué)檢查，以判斷是否建模成功。采用PEMS 3.2軟件對(duì)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組,分為空白對(duì)照組(末建模動(dòng)物)和造模成功的以下組：陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組(A組)、藥物研究組,每組6只。

給藥：分組當(dāng)日開(kāi)始給藥。陽(yáng)性對(duì)照物為他巴唑，灌服，給藥次數(shù)為27次，給藥頻率為每天一次，劑量為每次2mg/kg。陰性對(duì)照組的注射物為生理鹽水。藥物研究組和陰性對(duì)照組均為甲狀腺體注射，給藥次數(shù)為10次，給藥頻率為每?jī)商煲淮巍?/p>

觀察、測(cè)量和分析：

1).一般狀態(tài)觀察：每2天觀察1次，自給藥開(kāi)始至給藥后第30天，觀察指標(biāo)或內(nèi)容包括但不限于動(dòng)物給藥局部、外觀體征、一般行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、死亡等情況及其它異常表現(xiàn)。

2).體重測(cè)定：給藥前測(cè)定1次和給藥期每周測(cè)定2次。

3).攝食量測(cè)定：給藥期每周測(cè)定1次。

4).血清學(xué)檢查：分別于給藥前和給藥后第30天從待檢動(dòng)物抽取血液5ml，采用放免法(RIA)測(cè)定其血清T₃、T₄及促甲狀腺激素(TSH)濃度值。

5).病理學(xué)檢查：分別于給藥前和給藥后第30天將抽血后的待檢動(dòng)物處死，觀察甲狀腺形態(tài)、濾泡形態(tài)、上皮細(xì)胞形態(tài)、小葉間纖維組織形態(tài)。甲狀腺肉眼觀察均不同程度呈彌漫性增大；鏡下觀察到濾泡上皮增生呈高柱狀，并有小濾泡形成；濾泡周邊出現(xiàn)許多大小不一的上皮細(xì)胞吸收空泡，間質(zhì)血管豐富、充血，淋巴組織增生。

分組前的血清學(xué)檢查顯示，建模動(dòng)物與未建模動(dòng)物比較其血清T₃、T₄明顯升高(升高100％以上)，TSH則明顯下降，說(shuō)明建模成功。在給藥后第30天的血清學(xué)檢查中，各藥物研究組血清T₃、T₄與陰性對(duì)照組相比T₃、T₄升高趨緩，TSH下降趨于改善。其中，C、D組的血清學(xué)檢查結(jié)果與未建模動(dòng)物的血清值差別小于25％，而陽(yáng)性對(duì)照組的差別大于35％。

病理學(xué)檢查中，陰性對(duì)照組可觀察到甲狀腺呈彌漫性增大，濾泡上皮增生呈高柱狀并有小濾泡形成，濾泡周邊出現(xiàn)許多大小不一的上皮細(xì)胞吸收空泡，間 質(zhì)血管豐富、充血，淋巴組織增生。與陰性對(duì)照組相比，各藥物研究組的甲狀腺?gòu)浡杂兴鶞p退，濾泡上皮增生及小濾泡形成的情況明顯減少；濾泡周邊出現(xiàn)的上皮細(xì)胞吸收空泡、間質(zhì)血管的數(shù)目和充血及淋巴組織增生均有所減弱。各組甲狀腺?gòu)浡猿氏и厔?shì)，其它與甲亢有關(guān)的病理學(xué)現(xiàn)象有消退趨勢(shì)，接近未建模動(dòng)物的狀態(tài)，明顯比陽(yáng)性對(duì)照組好。

在以上實(shí)驗(yàn)期間,各研究組未見(jiàn)動(dòng)物死亡，平均體重與陰性對(duì)照組體重變化接近(下降小于10％)，表示藥物在實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)明顯的毒性反應(yīng)。研究組與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，一般狀況類(lèi)似。但移植瘤試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照組平均體重下降更大(大于20％),提示一個(gè)較強(qiáng)的毒性反應(yīng)。

在靶區(qū)用藥期間，與陰性對(duì)照組相比較，研究組中、尤其是最高濃度組中大部分注射部位均有明顯的色澤變化、甚至伴有肌肉變性，范圍多在10mm以內(nèi)。進(jìn)一步的研究說(shuō)明，這些變性是一鹽酸奎寧和乙醇的共同作用造成的。在給藥停止后,實(shí)驗(yàn)組裸鼠注射部位的肌肉組織外觀逐步實(shí)現(xiàn)正常化。對(duì)給藥停止后30天剖殺的裸鼠的注射部位進(jìn)行了病理切片檢查,結(jié)果顯示試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的差別明顯縮小，趨于正常。

用實(shí)施例1中制備的一些其它喹啉類(lèi)物質(zhì)注射劑(例如表1中的注射劑)也獲得類(lèi)似結(jié)果。根據(jù)以上這些藥效學(xué)結(jié)果及局部副反應(yīng)結(jié)果,本發(fā)明提供的藥物組合物在治療甲狀腺疾病應(yīng)用中的優(yōu)選條件如下：靶區(qū)給藥；喹啉類(lèi)物質(zhì)注射濃度為0.05-0.5M、優(yōu)選0.1-0.4M、更優(yōu)選0.1-0.3M。不同的喹啉類(lèi)物質(zhì)注射劑可以有稍許不同的優(yōu)選注射濃度范圍。例如，含奎寧的注射劑為0.25-0.35M、含一鹽酸奎寧的注射劑為0.2-0.35M、含二鹽酸奎寧的注射劑為0.2-0.3M、含伯氨喹的注射劑為0.1-0.2M、喹啉類(lèi)化合物組合物注射劑的總濃度范圍等于或略大于所含化合物的濃度范圍、等等。

此外，另一組試驗(yàn)顯示，本發(fā)明的藥物組合物在同樣濃度下，一個(gè)較大的注射量顯示出更好的藥物學(xué)效果。如果靶區(qū)體積太大，為控制給藥劑量，可以對(duì)靶區(qū)進(jìn)行分部處理。注射劑的每次給藥體積必須為欲處理部份體積的70％以上、優(yōu)選110％以上。當(dāng)靶區(qū)的靶塊為腫塊(例如腫瘤、非瘤腫塊)且其個(gè)體足夠小時(shí)，欲處理部份體積即為單個(gè)腫塊體積。