本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，更具體地涉及CD11b抑制劑在促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞的生成，和/或減輕胰島素抵抗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

改革開放以來，隨著經(jīng)濟(jì)的繁榮和生活水平的提高，中國人享受到豐富的食物供應(yīng)和便捷的交通和工作條件。隨之而來，肥胖——這一不斷困擾發(fā)達(dá)國家的社會(huì)問題，越來越沉重的擺在中國面前。2004年衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國成人超重率為22.8％，肥胖率分別為7.1％，估計(jì)超重人數(shù)為2億，肥胖人數(shù)為6000萬。其中，大城市成人超重率已達(dá)30％，肥胖率達(dá)12.3％，兒童肥胖率為8.1％(http://www.nhfpc.gov.cn/zhuzhan/zcjd/201304/189a0bf9a9cf49a9af6693fb95970da1.shtml)。據(jù)2015年衛(wèi)生部公布的最新數(shù)據(jù)顯示，目前全國18歲及以上成人超重率為30.1％，肥胖率為11.9％(中國居民營養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告(2015年))。

肥胖會(huì)引發(fā)包括高血壓，心血管疾病，甚至癌癥在內(nèi)的諸多疾病，其中肥胖對(duì)II型糖尿病以及糖尿病前期胰島素抵抗有直接的促進(jìn)作用。伴隨著肥胖率的增加，糖尿病和胰島素抵抗日益威脅著中國人的健康。一項(xiàng)由寧光教授領(lǐng)導(dǎo)的多中心的糖尿病監(jiān)測調(diào)查表明，中國成人糖尿病的預(yù)計(jì)患病率為11.6％，確診患病率為3.6％。而糖尿病前期流行率高達(dá)50.1％。這表明中國有1.139億的糖尿病患者，和4.934億的糖尿病前期人群。對(duì)肥胖及其導(dǎo)致的糖尿病和胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制的深入研究將會(huì)給這些代謝疾病的發(fā)生發(fā)展帶來新的認(rèn)知，并為其治療和預(yù)防帶來新的思路和手段，符合中國社會(huì)衛(wèi)生事業(yè)的迫切需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供CD11b抑制劑在促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞的生成，和/或減輕胰島素抵抗中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種整合素αM(CD11b)抑制劑的用途，用于制備一制劑或組合物，所述制劑或組合物用于(a)促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞的生成，和/或(b)減輕胰島素抵抗。

在另一優(yōu)選例中，所述的CD11b抑制劑包括：化合物、抗體、反義核酸、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。

在另一優(yōu)選例中，所述的單克隆抗體包括M1/70、和5C6。

在另一優(yōu)選例中，所述的反義核酸包括MicroRNA、siRNA、shRNA、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑抑制CD11b與SHP-1的相互作用。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑抑制CD11b與SFK的相互作用。

在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑抑制CD11b與整合素β2(CD18)的結(jié)合。

在另一優(yōu)選例中，所述的制劑或組合物還用于抑制SHP-1的活性和/或表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的制劑或組合物還用于抑制SFK的活性和/或表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，所述的制劑或組合物獨(dú)立地或額外地用于增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)IL-4的敏感性。

在另一優(yōu)選例中，所述的制劑或組合物獨(dú)立地或額外地用于增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的STAT6的磷酸化水平。

在另一優(yōu)選例中，所述的巨噬細(xì)胞來源于脂肪組織。

在另一優(yōu)選例中，所述的胰島素抵抗包括由肥胖引起的胰島素抵抗。

在另一優(yōu)選例中，所述的CD11b來源于人或非人哺乳動(dòng)物。

在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為藥物組合物、食品組合物、或膳食補(bǔ)充劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包含(I)CD11b抑制劑；和(II)藥學(xué)上可接受的載體、或食品學(xué)上可接受的載體。

在另一優(yōu)選例中，所述組合物中含有0.001-99wt％，較佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的CD11b抑制劑，按組合物的總重量計(jì)。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物的劑型為口服劑型、或注射劑型。

在另一優(yōu)選例中，所述口服劑型包括片劑、膠囊劑、膜劑、顆粒劑等，還包括緩釋型或非緩釋型劑型。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還可含有其他藥物活性成分。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種篩選減輕胰島素抵抗的候選藥物的方法，所述方法包括步驟：

(a)提供一待測化合物，并在檢測所述待測化合物對(duì)CD11b的抑制情況，從而選出對(duì)CD11b有抑制作用的待測化合物，作為經(jīng)初篩的化合物；以及

(b)測試所述經(jīng)初篩的化合物對(duì)胰島素抵抗的效果，從而選出能夠減輕胰島素抵抗的化合物，作為候選藥物。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，在實(shí)驗(yàn)組中，在加入所述待測化合物并在巨噬細(xì)胞存在的條件下，測定(i)JAK1、JAK3或STAT6的磷酸化水平，或(ii)Arg1、Retnla或Ym1的表達(dá)水平，記為Mt；并且在不存在所述待測化合物且其他條件相同的對(duì)照組中，測定相應(yīng)參數(shù)的磷酸化水平或表達(dá)水平，記為Mc；并對(duì)Mt 和Mc進(jìn)行比較；

其中，如果Mt顯著高于Mc，則表明所述的待測化合物為抑制CD11b的待測化合物，即作為經(jīng)初篩的化合物；

如果Mt顯著低于Mc，則表明所述的待測化合物為促進(jìn)CD11b的待測化合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的“顯著高于”指Mt/Mc≥1.5，較佳地≥2.0，更佳地≥3.0。

在另一優(yōu)選例中，所述的“顯著低于”指Mt/Mc≤1/1.5，較佳地≤1/2，更佳地≤1/3。

在另一優(yōu)選例中，所述的巨噬細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞為脂肪巨噬細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪巨噬細(xì)胞為骨髓來源的巨噬細(xì)胞。

在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，還包括設(shè)置陽性對(duì)照組、和/或陰性對(duì)照組。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種CD11b促進(jìn)劑的用途，用于制備一制劑或組合物，所述制劑或組合物用于(a)抑制替代性活化的巨噬細(xì)胞的生成，和/或(b)增強(qiáng)胰島素抵抗。

在本發(fā)明的第四方面，提供了一種體外的促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞生成的方法，所述方法包括步驟：

(a)在CD11b抑制劑存在的條件下，培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，從而促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞生成。

在另一優(yōu)選例中，所述的CD11b抑制劑包括：化合物、抗體、反義核酸、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括單克隆抗體M1/70。

在另一優(yōu)選例中，所述的M1/70的施用濃度為0.3mg/kg體重。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法是非診斷非治療性方法。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了CD11b缺失使得胰島素抵抗降低同時(shí)增加脂肪組織巨噬細(xì)胞。

圖1A顯示了高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的葡萄糖耐受試驗(yàn)(n＝9-10)。

圖1B顯示了高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的胰島素耐受試驗(yàn)(n＝9-10)。

圖1C顯示了高脂飲食的用野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓重構(gòu)的CD45.1野生型 小鼠的葡萄糖耐受試驗(yàn)(n＝6-8)。

圖1D顯示了高脂飲食的用野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓重構(gòu)的CD45.1野生型小鼠的胰島素耐受試驗(yàn)(n＝6-8)。

圖1E顯示了附睪脂肪組織蘇木素伊紅染色顯示白細(xì)胞的聚集。

圖1F顯示了附睪脂肪組織免疫熒光染色顯示巨噬細(xì)胞的聚集。

圖1G顯示了流式分析每克高脂飲食的野生型小鼠和CD11b-/-小鼠的附睪脂肪組織中的各種免疫細(xì)胞的數(shù)量。

圖2顯示了CD11b缺失影響單核細(xì)胞向脂肪組織的遷移。

圖2A顯示了競爭性單核細(xì)胞重建的實(shí)驗(yàn)方案示意圖。

圖2B顯示了通過特異性的F4/80和CD45.2標(biāo)記分子流式檢測供體單核細(xì)胞來源的脂肪組織巨噬細(xì)胞。

圖2C顯示了來源于野生型和CD11b^-/-單核細(xì)胞的脂肪組織巨噬細(xì)胞在附睪脂肪組織中的比例。

圖2D顯示了四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的過繼移植單核細(xì)胞在附睪脂肪組織中浸潤的細(xì)胞量統(tǒng)計(jì)。

圖2E顯示了來源于野生型和CD11b^-/-單核細(xì)胞的脂肪組織巨噬細(xì)胞在腹股溝脂肪組織中的比例。

圖2F顯示了四次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的過繼移植單核細(xì)胞在腹股溝脂肪組織中浸潤的細(xì)胞量統(tǒng)計(jì)。

圖3顯示了CD11b缺失促進(jìn)肥胖條件下脂肪組織巨噬細(xì)胞的原位增殖。

圖3A顯示了流式分析高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞的Ki67表達(dá)。

圖3B顯示了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(F3A)的所有小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞的Ki67表達(dá)量統(tǒng)計(jì)值。

圖3C顯示了免疫熒光檢測高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞的Ki67表達(dá)。

圖3D顯示了流式分析高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞的EdU摻入量。

圖3E顯示了兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(F3D)的所有小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞的EdU摻入量統(tǒng)計(jì)值。

圖3F顯示了免疫熒光檢測高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織EdU摻入的巨噬細(xì)胞。

圖4顯示了脂肪組織巨噬細(xì)胞的增殖依賴IL4/STAT6信號(hào)軸。

圖4A&B顯示了小鼠附睪脂肪組織和腹股溝脂肪組織用IL4和IL4抗體復(fù)合 物或者緩沖液對(duì)照處理48小時(shí)后，分析脂肪組織巨噬細(xì)胞Ki67表達(dá)(4B)和EdU摻入量(4A)(n＝4-5)。

圖4C&D顯示了野生型和STAT6^-/-小鼠的附睪脂肪組織用IL4和IL4抗體復(fù)合物或者緩沖液對(duì)照處理48小時(shí)后，分析脂肪組織巨噬細(xì)胞Ki67表達(dá)(4D)和EdU摻入量(4C)(n＝6)。

圖4E顯示了免疫熒光染色檢測高脂飲食的野生型和STAT6-/-小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞中的Ki67表達(dá)。

圖4F顯示了流式檢測高脂飲食的野生型和STAT6-/-小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞中的Ki67表達(dá)(n＝6)。

圖5顯示了CD11b抑制IL4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖和選擇性激活。

圖5A顯示了流式分析每克高脂飲食的野生型小鼠的附睪脂肪組織中的嗜酸性粒細(xì)胞的數(shù)量(n＝4)。

圖5B顯示了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測高脂飲食的野生型小鼠的附睪脂肪組織中的IL4水平(n＝5)。

圖5C顯示了野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織用IL4和IL4抗體復(fù)合物或者緩沖液對(duì)照處理48小時(shí)后，分析脂肪組織巨噬細(xì)胞EdU摻入量(n＝5)。

圖5D顯示了用20ng/ml IL4刺激野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測不同時(shí)間點(diǎn)的磷酸化的STAT6水平。

圖5E-G顯示了用10ng/ml IL4刺激野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞12小時(shí)后，巨噬細(xì)胞Arg1(5E)、Retnla(5F)、和Ym1(5G)的相對(duì)表達(dá)量。

圖6顯示了CD11b通過SHP-1抑制IL4/STAT6信號(hào)軸。

圖6A顯示了用20ng/ml IL4刺激野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞30分鐘，免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測磷酸化的JAK1,JAK3和STAT6水平。

圖6B顯示了免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測野生型骨髓來源巨噬細(xì)胞用CD11b抗體或IgG2b處理的磷酸化的JAK1、JAK3和STAT6水平。

圖6C顯示了實(shí)時(shí)定量PCR檢測野生型骨髓來源巨噬細(xì)胞用CD11b抗體或IgG2b處理的精氨酸酶I(Arg1)表達(dá)量。

圖6D顯示了免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞經(jīng)PP2處理與否的磷酸化的JAK3和STAT6水平。

圖6E顯示了實(shí)時(shí)定量PCR檢測野生型和CD11b^-/-小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞經(jīng)PP2處理與否的精氨酸酶I(Arg1)表達(dá)量。

圖6F顯示了免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測野生型和me^v/me^v小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞磷酸化的JAK3和STAT6水平。

圖7顯示了CD11b通過抑制脂肪組織巨噬細(xì)胞選擇性激活而促進(jìn)胰島素抵 抗。

圖7A顯示了流式分析高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞的RELM-α的表達(dá)(n＝5)。

圖7B&C分別顯示了分選出的高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞的Arg1(7B)和Ym1(7C)的相對(duì)表達(dá)量(n＝4)。

圖7D顯示了流式分析高脂飲食用1mg包裹氯膦酸鹽的甘露糖酰化脂質(zhì)體處理的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞的RELM-α的表達(dá)。

圖7E&F分別顯示了高脂飲食的用1mg包裹氯膦酸鹽的甘露糖?；|(zhì)體處理前(7E)和處理后(7F)的野生型和CD11b^-/-小鼠的葡萄糖耐受試驗(yàn)(n＝9-10)。

圖7G&H分別顯示了高脂飲食的用1mg包裹氯膦酸鹽的甘露糖?；|(zhì)體處理前(7G)和處理后(7H)的野生型和CD11b^-/-小鼠的胰島素耐受試驗(yàn)(n＝9-10)。

圖8顯示了高脂誘導(dǎo)肥胖脂肪組織中巨噬細(xì)胞增殖的情況。

圖8A顯示了流式分析正常小鼠和肥胖小鼠的附睪脂肪和腹股溝脂肪組織中的EdU+巨噬細(xì)胞。

圖8B顯示了正常小鼠和肥胖小鼠的附睪脂肪和腹股溝脂肪組織中的EdU+巨噬細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖8C顯示了流式分析正常小鼠和肥胖小鼠Ki67+的脂肪巨噬細(xì)胞。

圖8D顯示了正常小鼠和肥胖小鼠Ki67+的脂肪巨噬細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

圖8E顯示了研究巨噬細(xì)胞原位增殖對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞累積的貢獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)流程。

圖8F顯示了外周血中，供體來源的單核細(xì)胞在各實(shí)驗(yàn)組中比例。

圖8G顯示了各實(shí)驗(yàn)組中供體來源的巨噬細(xì)胞比例。

圖8H顯示了各實(shí)驗(yàn)組中供體來源的嗜酸性粒細(xì)胞比例。

圖8I顯示了HFD處理12周的嵌合體小鼠中，摻入EdU的CD45.2+和CD45.1+的脂肪巨噬細(xì)胞比例。

圖9顯示了遺傳性肥胖脂肪組織中巨噬細(xì)胞增殖的情況。

圖9A&B顯示了瘦素受體突變小鼠(Leprdb/db)中，純合子突變小鼠的Ki67+的脂肪巨噬細(xì)胞比例高于雜合子小鼠。

圖9C&D顯示了瘦素受體突變小鼠(Leprdb/db)中，純合子突變小鼠的EdU+的脂肪巨噬細(xì)胞比例高于雜合子小鼠。

圖10顯示了高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的特點(diǎn)。

圖10A顯示了高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的食物攝取累積量(n＝10)。

圖10B顯示了高脂飼料和正常飼料喂養(yǎng)下的野生型和CD11b^-/-小鼠體重 (n＝9-10)。

圖10C1顯示了高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織。

圖10C2顯示了高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織的重量(n＝5)。

圖10D&E分別顯示了高脂飲食8周和12周的野生型和CD11b^-/-小鼠的葡萄糖耐受測試(n＝5)。

圖10F顯示了高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的血清胰島素水平(n＝7)。

圖10G顯示了骨髓移植小鼠的單核細(xì)胞和脂肪組織巨噬細(xì)胞的嵌合比例(n＝3)。

圖11顯示了流式細(xì)胞術(shù)分析的圈門策略。

圖11A顯示了流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果，圖中CD45⁺F4/80^hiSiglec-F^-定義為脂肪組織巨噬細(xì)胞，CD45⁺F4/80⁺Siglec-F⁺為嗜酸性粒細(xì)胞，CD45⁺NK1.1⁺為自然殺傷細(xì)胞，CD45⁺Ly6G⁺為中性粒細(xì)胞。

圖11B顯示了脂肪組織的淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果，圖中包括CD19⁺B細(xì)胞、CD3⁺CD8⁺T細(xì)胞、和CD3⁺CD4⁺T細(xì)胞。

圖11C顯示了流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果，圖中單核細(xì)胞定義為CD11b⁺CD115⁺，包括亞群Ly6C^-、Ly6C^mid、和Ly6C^hi。

圖12顯示了單核細(xì)胞的競爭性重構(gòu)。

圖12A顯示了用磁鐵激活的細(xì)胞陰性選擇富集骨髓單核細(xì)胞(表面標(biāo)記Ly6C⁺CD115⁺)。

圖12B顯示了移植前確認(rèn)野生型和CD11b^-/-的單核細(xì)胞的混合細(xì)胞。

圖12C顯示了移植24小時(shí)后，小鼠外周血單核細(xì)胞中野生型和CD11b^-/-的單核細(xì)胞的比例。

圖12D顯示了過繼移植的小鼠外周血單核細(xì)胞中野生型和CD11b^-/-的單核細(xì)胞比例的統(tǒng)計(jì)值(n＝4)。

圖13顯示了TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測脂肪組織巨噬細(xì)胞的凋亡。TUNEL實(shí)驗(yàn)是在高脂飲食的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織的石蠟包埋切片上進(jìn)行的；陽性對(duì)照為DNaseⅠ預(yù)處理的ob/ob小鼠脂肪組織石蠟切片；陰性對(duì)照是用無終端轉(zhuǎn)移酶活性的標(biāo)記溶液代替TUNEL反應(yīng)混合液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的。

圖14顯示了肥胖條件下，脂肪組織巨噬細(xì)胞的增殖。

圖14A顯示了高脂飼料和正常飼料喂養(yǎng)下的小鼠的附睪脂肪組織的巨噬細(xì)胞的EdU摻入量。

圖14B顯示了用EdU或者PBS緩沖液處理3小時(shí)后，小鼠血液單核細(xì)胞的EdU 摻入量。

圖14C顯示了高脂飼料和正常飼料喂養(yǎng)下的小鼠的附睪脂肪組織的巨噬細(xì)胞的Ki67表達(dá)量。

圖14D顯示了高脂飲食的CD11b^-/-小鼠及其同窩雜合子對(duì)照的附睪脂肪組織的巨噬細(xì)胞的Ki67表達(dá)量。

圖15顯示了MCP-1和M-CSF對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞增殖的影響。

圖15A顯示了流式分析高脂飼料和正常飼料喂養(yǎng)下的小鼠的附睪脂肪組織的巨噬細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞的M-CSF受體(CD115)及IL4受體(IL4Rα)的表達(dá)水平。

圖15B顯示了流式分析脂肪組織單核細(xì)胞的M-CSF受體(CD115)的表達(dá)水平。

圖15C顯示了流式分析用MCP-1,M-CSF或者緩沖液對(duì)照處理48小時(shí)的小鼠的外周血中的髓細(xì)胞。

圖15D顯示了流式分析用MCP-1,M-CSF或者緩沖液對(duì)照處理48小時(shí)的小鼠的附睪脂肪組織的巨噬細(xì)胞的EdU摻入量。

圖16顯示了巨噬細(xì)胞對(duì)IL-4刺激的反應(yīng)性分析。

圖16A顯示了高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織的巨噬細(xì)胞的IL-13表達(dá)水平。

圖16B顯示了野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織的巨噬細(xì)胞的IL4受體(IL4Rα)表達(dá)水平。

圖16C顯示了野生型和CD11b^-/-小鼠的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的IL4受體(IL4Rα)表達(dá)水平。

圖16D顯示了用野生型和CD11b^-/-小鼠的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的JAK1，STAT6，磷酸化的JAK1和磷酸化的STAT6免疫印記分析。

圖16E顯示了CD11b^-/-小鼠的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的精氨酸酶I(Arg1)表達(dá)水平。

圖17顯示了比較野生型和CD11b^-/-小鼠的脂肪組織巨噬細(xì)胞、肝組織巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和微生物群。

圖17A顯示了分選的高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織的巨噬細(xì)胞的Ppard、Gas6、Lyve1、和Pdgfc基因相當(dāng)β-actin的表達(dá)量(n＝4)。

圖17B顯示了流式分析高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的肝臟組織巨噬細(xì)胞(CD45⁺、Siglec-F^-、Ly6C^-、Ly6G^-、F4/80⁺)的精氨酸酶I(Arg1)表達(dá)量(n＝5)。

圖17C顯示了高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的肝臟組織的F4/80, CD68相當(dāng)表達(dá)量，以及選擇性激活巨噬細(xì)胞的標(biāo)志基因如Arg1、Clec10A、Clec7A、Il1rn、Jag1、Mrc1、Pdcd1lG、PparD、RetnlA、和Ym1的相對(duì)表達(dá)量(n＝6)。

圖17D顯示了流式分析高脂飲食的野生型小鼠的脂肪組織巨噬細(xì)胞和肝臟組織巨噬細(xì)胞的CD11b表達(dá)量(n＝7)。

圖17E&F分別顯示了流式分析高脂飲食的野生型小鼠的每克附睪脂肪組織的總嗜中性粒細(xì)胞(17E)和總自然殺傷細(xì)胞(17F)數(shù)量。

圖17G-I顯示了高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的附睪脂肪組織的IL4(17G)，中性彈力蛋白酶(17H)和IFNγ(17I)的表達(dá)量。

圖17J顯示了高脂飲食下的野生型和CD11b^-/-小鼠的特定的腸道細(xì)菌的豐度。

圖18顯示了包裹氯膦酸鹽的甘露糖?；|(zhì)體處理對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞和肝組織巨噬細(xì)胞的影響。

圖18A&B分別顯示了用高脂飲食的骨髓重構(gòu)小鼠的脂肪組織連續(xù)切片免疫組織化學(xué)分析Ki67⁺巨噬細(xì)胞(18A)和RELM-α⁺巨噬細(xì)胞(18B)。

圖18C顯示了圖18A切片視野中圍繞脂肪細(xì)胞形成冠狀結(jié)構(gòu)的巨噬細(xì)胞在Ki67⁺脂肪組織巨噬細(xì)胞中的比例。

圖18D顯示了圖18B切片視野中圍繞脂肪細(xì)胞形成冠狀結(jié)構(gòu)的巨噬細(xì)胞在RELM-α⁺脂肪組織巨噬細(xì)胞中的比例。

圖18E顯示了肝臟組織巨噬細(xì)胞的流式分析(Lin指Siglec-F，Ly6C和Ly6G的組合)。

圖18F顯示了流式分析脂肪組織巨噬細(xì)胞包裹氯膦酸鹽的甘露糖酰化脂質(zhì)體處理與否的RELM-α表達(dá)。

圖19顯示了應(yīng)用CD11阻斷抗體(M1/70)可以有效改善肥胖引起的胰島素抵抗。

圖19A顯示了應(yīng)用CD11阻斷抗體(M1/70)后的血液葡萄糖水平。

圖19B顯示了應(yīng)用抗體IgG2b后的脂肪組織切片。

圖19C顯示了應(yīng)用CD11阻斷抗體(M1/70)后的脂肪組織切片。

注：附圖中的WT表示野生型小鼠，CD11b^-/-表示CD11b^-/-小鼠，ND表示正常飼料喂養(yǎng)，HFD表示高脂飼料喂養(yǎng)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)了CD11b抑制劑可以顯著地促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞的生成，和/或減輕胰島素抵抗。實(shí)驗(yàn)表明，CD11b 抑制劑可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)IL-4的敏感性，提高巨噬細(xì)胞的STAT6的磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞的生成并減輕胰島素抵抗。

巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞是一種位于組織內(nèi)的白血球，源自單核細(xì)胞，而單核細(xì)胞又來源于骨髓中的前體細(xì)胞。巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞皆為吞噬細(xì)胞，在脊椎動(dòng)物體內(nèi)參與非特異性防衛(wèi)(先天性免疫)和特異性防衛(wèi)(細(xì)胞免疫)。它們的主要功能是以固定細(xì)胞或游離細(xì)胞的形式對(duì)細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫細(xì)胞，令其對(duì)病原體作出反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)，肥胖是一個(gè)慢性的炎癥過程，其中，脂肪組織中以巨噬細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞浸潤是這種慢性炎癥的一個(gè)重要體現(xiàn)。這些炎癥細(xì)胞及其分泌的炎癥因子是包括胰島素抵抗，糖尿病在內(nèi)的眾多代謝疾病的直接因素。

作為炎癥反應(yīng)的重要參與者，巨噬細(xì)胞在肥胖相關(guān)的炎癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮中樞作用。巨噬細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)性的細(xì)胞群且具有可塑性，因所處微環(huán)境的不同表現(xiàn)出不同的性狀，最新研究表明，微環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞的的塑造作用是在表觀遺傳學(xué)水平進(jìn)行的(Tissue-Resident Macrophage Enhancer Landscapes Are Shaped by the Local Microenvironment)。不同性狀的巨噬細(xì)胞不僅在控制炎癥反應(yīng)中扮演不同角色，也對(duì)代謝發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)作用。經(jīng)典性活化的巨噬細(xì)胞(Classically activated macrophages,CAMs)分泌促炎因子，例如TNF-alpha，IL-6和IL-1。經(jīng)典性活化的巨噬細(xì)胞在肥胖脂肪組織中的聚集會(huì)加劇肥胖相關(guān)的組織炎癥，促進(jìn)胰島素抵抗。而IL-4和IL-13等細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)的替代性活化的巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages,AAMs)。在健康的脂肪組織中的留駐巨噬細(xì)胞(resident macrophages)以這些替代性活化的巨噬細(xì)胞為主，它們表達(dá)IL-10，Ym1，Arg1等分子，這種巨噬細(xì)胞能降低胰島素抵抗。因此，不同類型的巨噬細(xì)胞在脂肪組織中的累積能夠?qū)е虏煌拇x狀態(tài)，對(duì)胰島素抵抗起不同的作用。

胰島素抵抗

胰島素抵抗是指各種原因使胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，機(jī)體代償性的分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定。胰島素抵抗易導(dǎo)致代謝綜合征和2型糖尿病。50年代Yallow等應(yīng)用放射免疫分析技術(shù)測定血漿胰島素濃度，發(fā)現(xiàn)血漿胰島素水平較低的病人胰島素敏感性較高，而血漿胰島素較高的人對(duì)胰島素不敏感，由此提出了胰島素抵抗的概念。

CD11b

CD11b是控制單核細(xì)胞遷移的一種重要細(xì)胞表面粘附分子，又稱為整合素αM(integrinαM)，其與整合素β2(Integrinβ2,CD18)組成異源二聚體跨膜蛋白MAC-1(Macrophage-1 antigen，或integrin αMβ2)，CD11b的缺失即導(dǎo)致 MAC-1的缺失。MAC-1同血管壁上的ICAM-1相互作用，在調(diào)控白細(xì)胞穿越血管壁遷移至組織中發(fā)揮重要作用。

作為整合素，CD11b的功能依賴于由內(nèi)到外(inside-out)和由外到內(nèi)(outside-in)的雙向傳遞跨膜信號(hào)。其中，酪氨酸激酶，特別是src家族的酪氨酸激酶的活化，是整合素由外到內(nèi)信號(hào)傳遞所必須的(The ins and outs of leukocyte integrin signaling)。除了介導(dǎo)白細(xì)胞的粘附和遷移，CD11b還對(duì)免疫反應(yīng)有多方面的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)抗原呈遞細(xì)胞上的CD11b能通過抑制Th17細(xì)胞的分化來促進(jìn)口服抗原耐受。CD11b還能抑制Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)在巨噬細(xì)胞上的觸發(fā)的信號(hào)，從而幫助機(jī)體抵抗內(nèi)毒素休克(endotoxic shock)。CD11b對(duì)免疫反應(yīng)的調(diào)控也體現(xiàn)在B細(xì)胞上，CD11b能夠在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中抑制自體反應(yīng)性B細(xì)胞。值得注意的是，CD11b和ICAM-1這對(duì)能互相結(jié)合的分子都能夠調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪，CD11b分子缺失的小鼠和ICAM-1缺失的小鼠更容易發(fā)生肥胖。

RNA干擾(RNAi)

在本發(fā)明中，一類有效的CD11b抑制劑是干擾RNA。

如本文所用，術(shù)語“RNA干擾(RNA interference，RNAi)”是指：一些小的雙鏈RNA可以高效、特異地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá)，促使mRNA降解，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，其也稱為RNA干預(yù)或者RNA干涉。RNA干擾是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機(jī)制。

如本文所用，術(shù)語“小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過程就是RNA干擾途徑(RNA interference pathway)。

在本發(fā)明中，干擾RNA包括siRNA、shRNA以及相應(yīng)的構(gòu)建物。

一種典型的構(gòu)建物為雙鏈，并且其正鏈或負(fù)鏈含有式I所示的結(jié)構(gòu)：

Seq_正向-X-Seq_反向 式I

式中，

Seq_正向為CD11b相關(guān)基因或片段的核苷酸序列；

Seq_反向為與Seq_正向基本上互補(bǔ)的核苷酸序列；

X為位于Seq_正向和Seq_反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq_正向和Seq_反向不互補(bǔ)。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，Seq_正向、Seq_反向的長度為19-30bp，較佳地為20-25bp。

在本發(fā)明中，一種典型的shRNA如式II所示，

式中，

Seq’_正向為Seq_正向序列對(duì)應(yīng)的RNA序列或序列片段；

Seq’_反向為與Seq’_正向基本上互補(bǔ)的序列；

X’為無；或?yàn)槲挥赟eq’_正向和Seq’_反向之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq’_正向和Seq’_反向不互補(bǔ)，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之間形成的氫鍵。

在另一優(yōu)選例中，所述的間隔序列X的長度為3-30bp，較佳地為4-20bp。

組合物和施用方法

本發(fā)明還提供了一種含有CD11b抑制劑作為活性成分的用于促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞的生成，和/或減輕胰島素抵抗的制劑或組合物。所述的組合物包括(但并不限于)：藥物組合物、食品組合物、膳食補(bǔ)充劑、飲料組合物等。

在本發(fā)明中，CD11b抑制劑可直接用于疾病治療，例如，用于胰島素抵抗方面的治療。在使用本發(fā)明CD11b抑制劑時(shí)，還可同時(shí)使用其他治療劑，如減輕胰島素抵抗的藥物等。

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的CD11b抑制劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉劑、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。本發(fā)明的藥物組合也可以被制成粉劑用于霧化吸入?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。

對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物，可通過常規(guī)的方式施用于所需的對(duì)象(如人和非人哺乳動(dòng)物)。代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、注射、霧化吸入等。

使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的CD11b抑制劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

(a)CD11b抑制劑減輕胰島素抵抗效果顯著。

(b)CD11b抑制劑減輕胰島素抵抗機(jī)制明確，安全可靠。

(c)CD11b可以作為防治胰島素抵抗的全新靶點(diǎn)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則 百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

通用材料與方法

1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

實(shí)施例中的C57BL/6小鼠和BALB/c小鼠均購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；CD11b^-/-小鼠與C57BL/6小鼠回交；STAT6^-/-(C.129S2-Stat6tm1Gru/J)和me^v/me^v(C57BL/6J-Ptpn6me-v/J)小鼠來源于Jackson實(shí)驗(yàn)室；CD45.1C57BL/6小鼠由中國科學(xué)院健康科學(xué)研究所的張雁云饋贈(zèng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院健康科學(xué)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型是用含60％卡路里脂肪的飼料(D12492)飼養(yǎng)5周齡雄性小鼠建立，而對(duì)照組小鼠用正常食物飼養(yǎng)。在小鼠進(jìn)行高脂飲食8-10周后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)是按每千克小鼠體重1克葡萄糖的比例進(jìn)行腹腔注射葡萄糖；胰島素耐受實(shí)驗(yàn)是按每千克小鼠體重0.75單位的胰島素的比例進(jìn)行腹腔注射胰島素；血清中的胰島素水平利用Bio-Rad公司的Bio-Plex技術(shù)進(jìn)行多重免疫分析；在比較單核細(xì)胞的遷移能力實(shí)驗(yàn)中，利用Stemcell Technologies公司的陰性選擇試劑盒將CD11b^-/-小鼠和野生型小鼠的單核細(xì)胞從骨髓中分離出來，將兩種單核細(xì)胞按1：1的比例混合或者只有CD11b^-/-小鼠單核細(xì)胞尾靜脈注射到高脂飲食飼養(yǎng)的CD45.1小鼠體內(nèi)。使用Click-iT EdU試劑盒((Life Technologies)進(jìn)行EdU摻入實(shí)驗(yàn)，具體是腹腔注射10微克每克小鼠體重的EdU，并在三小時(shí)后進(jìn)行分析。收集脂肪組織，然后根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行Click-iT反應(yīng)，并用流式細(xì)胞術(shù)或者免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行分析。為了確定MCP-1、M-CSF和IL4在脂肪巨噬細(xì)胞的增殖中的作用，采用腹腔注射0.1或1微克MCP-1，1或10微克M-CSF，5微克IL4和25微克IL4中和抗體混合物到小鼠體內(nèi)，48小時(shí)后分析脂肪巨噬細(xì)胞。在去除選擇性激活的巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射1毫克包裹氯膦酸鹽的甘露糖?；|(zhì)體(mannosylated clodronate liposome)，然后在第四天和第八天分析脂肪巨噬細(xì)胞和葡萄糖耐受情況。

2.流式分析細(xì)胞蛋白

脂肪組織剪碎后，懸浮在PBS緩沖液中，用2毫克每毫升的膠原酶I消化1小時(shí)，然后用70微米孔徑的篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸浮液，并離心分離脂肪細(xì)胞，然后細(xì)胞團(tuán)用紅細(xì)胞裂解液重懸。在進(jìn)行細(xì)胞表面分子染色前，用CD16/CD32抗體孵育細(xì)胞懸液封閉細(xì)胞表面的Fc受體。用于檢測細(xì)胞表面蛋白的抗體包括：購自ebioscience的CD3e、CD4、CD8a、CD19、NK1.1、F4/80、CD45、CD11b、CD45.1、CD45.2、Ki67、Ly6C和購自biolegend的CD115、Ly6G、和Siglec-F。IL4Rα抗體購自R&D。

通過在消化前以和膠原酶為1：1000比例加入GolgiPlug，進(jìn)行脂肪巨噬細(xì) 胞胞內(nèi)RELM-α染色。在表面分子染色完成后再根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行細(xì)胞固定破膜，然后再進(jìn)行胞內(nèi)染色。其使用抗體為兔源抗鼠的RELM-α抗體和Alexa Fluor 647標(biāo)記的驢源抗兔IgG抗體。

3.免疫組織化學(xué)

脂肪組織切成小塊后，在4％多聚甲醛中4℃固定24小時(shí)，然后樣品用1％的Triton X-100破膜，并用含1％BSA和3％FBS的PBS封閉液封閉后，用Alexa Fluor488標(biāo)記的大鼠來源抗小鼠的F4/80單克隆抗體和Alexa Fluor 647標(biāo)記的大鼠來源抗小鼠的Ki67單克隆抗體進(jìn)行染色，最后細(xì)胞核再用Hoechst 33342復(fù)染。脂肪細(xì)胞用BODIPY 558/568C12復(fù)染。用Roche Applied Science的原位細(xì)胞死亡檢測試劑盒在石蠟包埋的組織切片上進(jìn)行TUNEL細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)。

4.骨髓來源的巨噬細(xì)胞

取CD11b^-/-小鼠和野生型小鼠的股骨和脛骨的骨髓細(xì)胞，在含10％FBS和20％L929細(xì)胞培養(yǎng)上清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)七天獲得骨髓來源的巨噬細(xì)胞。在CD11b封閉實(shí)驗(yàn)中，骨髓來源巨噬細(xì)胞在鋪板前先用20微克每毫升的CD11b抗體M1/70或同濃度的大鼠IgG2b室溫處理1小時(shí)。在SFKs抑制實(shí)驗(yàn)中，骨髓來源巨噬細(xì)胞用DMSO或者0.5微摩爾或10微摩爾的PP2處理1小時(shí)，然后用IL4處理1小時(shí)。

5.免疫印跡實(shí)驗(yàn)

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細(xì)胞樣品，然后用SDS/PAGE膠分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至尼龍膜或PVDF膜上。孵育檢測的抗體為購自Abcam公司的STAT6的Tyr641位點(diǎn)磷酸化特異性抗體；購自Cell Signaling Technology的JAK1的Tyr1022和Tyr1023位點(diǎn)磷酸化特異性抗體，JAK3的Tyr980和Tyr981位點(diǎn)磷酸化特異性抗體，及JAK1抗體和GAPDH抗體；以及購自Santa Cruz Biotechnology的總STAT6抗體和購Sigma-Aldrich的β-Actin單克隆抗體。

6.基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)定量PCR是用Roche Applied Science的FastStart Universal SYBR Green Master在Life Technologies的7900 HT Fast Real-Time PCR system上進(jìn)行的。使用的寡核苷酸引物序列如下：

Arg1,

P1：5′-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3′(SEQ ID NO.:1)，

P2：5′-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3′(SEQ ID NO.:2)；

Retnla,

P3：5′-GGATGCCAACTTTGAATAGGA-3′(SEQ ID NO.:3)，

P4：5′-GGATAGTTAGCTGGATTGGCA-3′(SEQ ID NO.:4)；

Ym1,

P5：5′-CAGGTCTGGCAATTCTTCTGAA-3′(SEQ ID NO.:5)，

P6：5′-GTCTTGCTCATGTGTGTAAGTGA3′(SEQ ID NO.:6)；

Actb,

P7：5′-CCACGAGCGGTTCCGATG-3′(SEQ ID NO.:7)，

P8：5′-GCCACAGGATTCCATACCCA-3′(SEQ ID NO.:8)。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)表示為平均值±平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差。顯著性分析除了特殊說明的都采用非配對(duì)的雙尾t檢驗(yàn)。且定義當(dāng)P<0.05為存在顯著性。

實(shí)施例1

CD11b缺失減輕胰島素抵抗但加重脂肪巨噬細(xì)胞累積

整合素CD11b在調(diào)控巨噬細(xì)胞的遷移和功能方面具有重要作用。為了研究該分子在肥胖相關(guān)的胰島素抵抗方面的作用，用高脂飼料(high-fat diet,HFD)誘導(dǎo)CD11b缺失小鼠和野生型對(duì)照小鼠肥胖。盡管攝入同量的飼料(圖10A)，CD11b^-/-小鼠的體重增加要顯著快于野生型小鼠(圖10B)，且脂肪組織更大(圖10C)。然而有趣的是，與野生型對(duì)照相比，這些肥胖的CD11b^-/-小鼠對(duì)葡萄糖耐受更為耐受(圖1A,圖10D,10E)，胰島素敏感性顯著提高(圖1B)，同時(shí)血清胰島素水平也更低(圖10F)。應(yīng)用CD11阻斷抗體(M1/70)可以有效改善肥胖引起的胰島素抵抗(圖19)。為進(jìn)一步研究，將CD11b缺失骨髓和野生型骨髓分別移植到野生型小鼠后，進(jìn)行HFD誘導(dǎo)肥胖，結(jié)果顯示前者的胰島素抵抗顯著降于后者(圖1C,1D,圖10G)。

肥胖伴隨著長期的、低度的炎癥，該炎癥據(jù)認(rèn)為在胰島素抵抗發(fā)生中具有重要作用。因此，采用組織學(xué)手段和流式細(xì)胞術(shù)檢測了脂肪組織中炎癥細(xì)胞的數(shù)量。出乎意料的是，白細(xì)胞浸潤在CD11b^-/-小鼠的脂肪組織中顯著高于野生型小鼠(圖1E)。進(jìn)一步的免疫熒光分析(圖1F)和流式細(xì)胞術(shù)分析(圖1G,圖11A,11B)顯示，這些增加的白細(xì)胞主要是巨噬細(xì)胞，而不是T細(xì)胞和B細(xì)胞。

實(shí)施例2

CD11b^-/-小鼠增加的脂肪巨噬細(xì)胞不是源于單核細(xì)胞遷移

創(chuàng)傷，感染以及自身免疫疾病中炎癥的發(fā)生需要單核細(xì)胞的招募和遷移。研究表明，CD11b在單核細(xì)胞中高表達(dá)，并在這些細(xì)胞向炎癥部位的遷移中發(fā)揮重要作用。為了研究CD11b是否參與介導(dǎo)單核細(xì)胞向肥胖的脂肪組織中的遷移，進(jìn)行了競爭性遷移實(shí)驗(yàn)：用陰選磁珠從CD45.2背景的CD11b^-/-以及野生型小鼠中分別分離得到單核細(xì)胞(Ly6C+CD115+，圖12A)，將其1：1混合，通過尾 靜脈輸注給HFD誘導(dǎo)肥胖的CD45.1小鼠(圖2A,圖12B)。24小時(shí)可以在脂肪組織中發(fā)現(xiàn)供體來源的巨噬細(xì)胞(圖2B)。由野生型和CD11b^-/-的供體單核細(xì)胞發(fā)育而成的巨噬細(xì)胞可以通過CD11b染色來進(jìn)行區(qū)分(圖2C)。在所有供體單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞中，在附睪脂肪組織(代表內(nèi)臟脂肪)中可以發(fā)現(xiàn)80％來自野生型單核細(xì)胞，20％來自CD11b^-/-單核細(xì)胞(圖2C,2D)。在腹股溝脂肪組織(代表皮下脂肪)中也有同樣的分布(圖2E,2F)。與此同時(shí)，供體來源的兩種單核細(xì)胞在受體小鼠的外周血中的比例仍為1：1(圖12C,12D)，說明上述觀察到的兩種單核細(xì)胞招募的不同不是由于其在外周血中存活或被清除方面的差異造成的。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)CD11b缺失會(huì)削弱單核細(xì)胞向肥胖小鼠脂肪組織的遷移。

然而這一結(jié)論與實(shí)施例1觀察到的CD11b^-/-小鼠具有更多的脂肪巨噬細(xì)胞相悖，與單核細(xì)胞遷移決定巨噬細(xì)胞浸潤這一觀念相矛盾。這一矛盾由兩種可能的因素所造成：一種是CD11b的缺失能延長巨噬細(xì)胞的生存期，據(jù)報(bào)道CD11b能夠增強(qiáng)促凋亡信號(hào)，CD11b/CD18促進(jìn)中性粒細(xì)胞的吞噬誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，采用TUNEL檢測來檢驗(yàn)CD11b^-/-的脂肪巨噬細(xì)胞是否凋亡降低。結(jié)果顯示，野生型和CD11b^-/-的小鼠的巨噬細(xì)胞的凋亡作用都不明顯，沒有檢測到兩組之間存在差異(圖13)。另外一種導(dǎo)致CD11b^-/-脂肪巨噬細(xì)胞增加的因素就是其原位增殖加強(qiáng)。

實(shí)施例3

肥胖引發(fā)脂肪巨噬細(xì)胞原位增殖

為了檢驗(yàn)巨噬細(xì)胞在脂肪組織中是否進(jìn)行增殖，對(duì)正常小鼠和肥胖小鼠腹腔注射EdU(5-ethynyl-2′-deoxyuridine)，EdU是一種胸腺嘧啶的類似物，會(huì)隨著細(xì)胞增殖摻入新合成DNA中，3小時(shí)后用流式細(xì)胞術(shù)分析摻入EdU的脂肪巨噬細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，同正常小鼠相比，肥胖小鼠的附睪脂肪和腹股溝脂肪組織中EdU+巨噬細(xì)胞都顯著增加(圖8A,B)。與此同時(shí)，外周血單核細(xì)胞并未有EdU的摻入，表明EdU+的脂肪巨噬細(xì)胞并非由于摻入了EdU的單核細(xì)胞遷移至脂肪組織中衍生而成。EdU摻入實(shí)驗(yàn)標(biāo)記的只是出于有絲分裂S期的細(xì)胞，進(jìn)一步分析Ki67的表達(dá)，這個(gè)蛋白表達(dá)在所有處在活化細(xì)胞周期中的細(xì)胞。結(jié)果顯示，肥胖小鼠中Ki67+的脂肪巨噬細(xì)胞要比正常小鼠中高出很多(圖8C,D)。進(jìn)一步分析遺傳性肥胖中是否也有同樣的情況發(fā)生，在瘦素受體突變小鼠(Lepr^db/db)中，與雜合子相比，純合子突變小鼠有更高比例的Ki67+(圖9A,B)以及EdU+(圖9C,D)的脂肪巨噬細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)說明肥胖的發(fā)生會(huì)引起脂肪巨噬細(xì)胞的原位增殖，這是造成巨噬細(xì)胞在肥胖的脂肪組織中累積的一個(gè)潛在因素。

為了進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞原位增殖對(duì)脂肪組織巨噬細(xì)胞累積的貢獻(xiàn)，用6厘米厚的鉛塊遮蔽CD45.2小鼠的附睪脂肪的部位，對(duì)其他部位進(jìn)行9.5Gy的γ射線輻照，然后給小鼠移植CD45.1的骨髓細(xì)胞，經(jīng)過7周的骨髓重構(gòu)后對(duì)嵌合體小鼠進(jìn)行HFD誘導(dǎo)肥胖，通過分析受體來源、供體來源的巨噬細(xì)胞的比例來 確定巨噬細(xì)胞原位增殖、單核細(xì)胞招募兩種方式分別對(duì)脂肪巨噬細(xì)胞累積的貢獻(xiàn)(圖8E)。結(jié)果顯示，外周血中，供體來源的單核細(xì)胞在各組中均為30％左右(圖8F)，說明供體骨髓已經(jīng)成功植活。進(jìn)一步檢測脂肪巨噬細(xì)胞的嵌合水平。經(jīng)過8周的HFD處理，小鼠的脂肪巨噬細(xì)胞增加，然而供體來源的巨噬細(xì)胞僅為2％，同普通飼料飼喂的小鼠相當(dāng)(3.6％)(圖8G)。這說明在肥胖初始階段，脂肪巨噬細(xì)胞的增加主要通過原位增殖而不是依賴于單核細(xì)胞的遷移。有趣的是，在12周HFD處理的小鼠中，供體來源的巨噬細(xì)胞大量增加(圖8G)，表明在肥胖的后期，單核細(xì)胞的遷移在巨噬細(xì)胞增加中發(fā)揮了重要作用。作為對(duì)照，分析了脂肪組織嗜酸性粒細(xì)胞的嵌合水平。嗜酸性粒細(xì)胞是從血液遷移到脂肪組織，是在肥胖和胰島素抵抗調(diào)控中發(fā)揮重要作用的另一類髓系細(xì)胞，它們不具有增殖能力。結(jié)果顯示，脂肪組織中供體來源的嗜酸性粒細(xì)胞不論是在8周HFD處理還是在12周HFD處理的小鼠中都有較高的比例(圖8H)。這從另一個(gè)角度證實(shí)了脂肪巨噬細(xì)胞的增加在肥胖早期通過留駐巨噬細(xì)胞原位增殖，在后期通過單核細(xì)胞遷移。

為進(jìn)一步研究增殖能力是否僅限于留駐巨噬細(xì)胞，還是遷移來的巨噬細(xì)胞也有增殖能力，對(duì)HFD處理12周的嵌合體小鼠進(jìn)行EdU摻入實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CD45.2+和CD45.1+的脂肪巨噬細(xì)胞都會(huì)摻入EdU，且比例相當(dāng)(圖8I)。說明留駐巨噬細(xì)胞和遷移來的巨噬細(xì)胞都能通過局部增殖來促進(jìn)脂肪巨噬細(xì)胞的累積。

實(shí)施例4

IL-4/STAT6信號(hào)通路介導(dǎo)肥胖中的巨噬細(xì)胞增殖

據(jù)報(bào)道，許多細(xì)胞因子，如IL-4，M-CSF，和MCP-1都能調(diào)控單核/巨噬細(xì)胞的增殖。Th2細(xì)胞因子IL-4能夠在蠕蟲誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的原位增殖。IL-4受體(IL-4Rα)也在脂肪巨噬細(xì)胞上表達(dá)(圖15A)。為了檢驗(yàn)IL-4是否能誘導(dǎo)脂肪巨噬細(xì)胞增殖，給正常小鼠腹腔注射重組IL-4，并在48小時(shí)后進(jìn)行EdU摻入實(shí)驗(yàn)以及Ki67檢測。結(jié)果顯示，IL-4能極大的增加EdU摻入的脂肪巨噬細(xì)胞(圖4A)以及Ki67+的巨噬細(xì)胞(圖4B)。M-CSF的受體在腹腔巨噬細(xì)胞以及脂肪單核細(xì)胞中高表達(dá)，但是在脂肪巨噬細(xì)胞上不表達(dá)(圖15A,15B)，因此不可能是脂肪巨噬細(xì)胞增殖的誘因。最近報(bào)道指出MCP-1是脂肪巨噬細(xì)胞增殖的一個(gè)可能因素。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)M-CSF和MCP-1對(duì)脂肪巨噬細(xì)胞增殖的作用，給正常小鼠腹腔注射不同濃度的M-CSF和MCP-1，48小時(shí)后，盡管兩種細(xì)胞因子都能增加血液里的髓系細(xì)胞(圖15C)(與髓系細(xì)胞成熟和招募有關(guān))，但是脂肪巨噬細(xì)胞的增殖并未增加(圖15D)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明IL-4而不是MCP-1或M-CSF是誘導(dǎo)脂肪巨噬細(xì)胞增殖的潛在因素。

結(jié)合IL-4之后，IL-4受體招募STAT6和IRS2來激活淋巴細(xì)胞的有絲分裂，其中STAT6起主要作用。用IL-4處理STAT6-/-小鼠和野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)同野生型小鼠相比，STAT6-/-小鼠的脂肪巨噬細(xì)胞的EdU摻入(圖4C)以及Ki67的表達(dá)。 (圖4D)都顯著降低。這說明IL-4誘導(dǎo)的脂肪巨噬細(xì)胞增殖是依賴于STAT6的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IL-4/STAT6信號(hào)是否在肥胖相關(guān)的脂肪巨噬細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，對(duì)STAT6-/-小鼠和野生型小鼠誘導(dǎo)肥胖，檢驗(yàn)脂肪巨噬細(xì)胞Ki67的表達(dá)。通過免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)STAT6-/-小鼠的Ki67+的脂肪巨噬細(xì)胞要顯著少于野生型小鼠(圖4E,4F)。因此，IL-4/STAT6信號(hào)是肥胖相關(guān)的脂肪巨噬細(xì)胞增殖所依賴的。

實(shí)施例5

CD11b缺失小鼠中脂肪巨噬細(xì)胞增殖更強(qiáng)

在確定肥胖發(fā)生時(shí)脂肪巨噬細(xì)胞會(huì)增殖且IL-4/STAT6發(fā)揮重要作用后，猜想CD11b的缺失會(huì)誘發(fā)更強(qiáng)的脂肪巨噬細(xì)胞增殖，從而使得CD11b^-/-小鼠的脂肪巨噬細(xì)胞含量高于野生型小鼠。通過比較HFD處理的CD11b^-/-和野生型小鼠脂肪巨噬細(xì)胞的Ki67表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD11b^-/-小鼠脂肪中Ki67+脂肪巨噬細(xì)胞要顯著高于野生型小鼠(圖3A,3B)。進(jìn)一步分析了HFD處理的CD11b^-/-和雜合子同窩小鼠的Ki67表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD11b^-/-小鼠有更多的Ki67+小鼠(圖14D)。通過免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)這些Ki67+的巨噬細(xì)胞位于脂肪細(xì)胞被巨噬細(xì)胞圍繞形成的冠狀結(jié)構(gòu)中，且CD11b^-/-小鼠的脂肪中有更多的Ki67+巨噬細(xì)胞(圖3C)。進(jìn)一步對(duì)HFD處理的野生型和CD11b^-/-小鼠進(jìn)行了EdU摻入實(shí)驗(yàn)，并且通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)CD11b^-/-的脂肪巨噬細(xì)胞有更多的EdU摻入(圖3D-F)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，CD11b的缺失會(huì)增強(qiáng)脂肪巨噬細(xì)胞的原位增殖。

實(shí)施例6

CD11b阻礙IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞增殖和替代性活化

接下來探討CD11b^-/-脂肪巨噬細(xì)胞在肥胖時(shí)過度增殖的分子機(jī)制。由于IL-4是肥胖相關(guān)的巨噬細(xì)胞增殖的驅(qū)動(dòng)因子，檢測CD11b^-/-小鼠的脂肪組織是否具有更高的IL-4水平。有研究表明，嗜酸性粒細(xì)胞是脂肪組織里主要的產(chǎn)生IL-4的細(xì)胞，然而結(jié)果顯示，嗜酸性粒細(xì)胞在CD11b^-/-和野生型脂肪組織中并沒有顯著差異(圖5A,圖11A)，同時(shí)也沒有發(fā)現(xiàn)IL-4水平在兩者間存在顯著差異(圖5B)，另外一個(gè)Th2細(xì)胞因子—IL-13在兩者之間也無差異(圖16A)。因此，猜想CD11b^-/-脂肪巨噬細(xì)胞對(duì)IL-4誘導(dǎo)的增殖更敏感。為此，給普通飼料飼喂的CD11b^-/-和野生型小鼠腹腔注射等量的IL-4，盡管兩者有相同的IL-4受體水平(圖16B)，CD11b^-/-小鼠摻入EdU的巨噬細(xì)胞要顯著多于野生型小鼠(圖5C)。

上述結(jié)果提示CD11b對(duì)巨噬細(xì)胞上的IL-4/STAT6信號(hào)通路有影響。為了深入探討這一點(diǎn)，制備了CD11b^-/-和野生型的骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)。兩者具有相同的IL-4受體水平(圖16C)，然而用IL-4刺激后，CD11b^-/-的巨噬細(xì)胞的STAT6磷酸化水平要比野生型高很多(圖5D,圖16D)。

除了調(diào)控增殖，Th2細(xì)胞因子對(duì)巨噬細(xì)胞最著名的作用是通過STAT6誘導(dǎo)替代性活化。因此，檢測了替代性活化的巨噬細(xì)胞的標(biāo)志分子，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-4刺激，Arg1、Retnla和Ym1在CD11b^-/-BMDM中的表達(dá)要顯著高于野生型BMDM(圖5E-G)。結(jié)果表明，CD11b的缺失可以促進(jìn)替代性活化的巨噬細(xì)胞的生成。

實(shí)施例7

CD11b通過SHP-1抑制IL-4/STAT6信號(hào)

激酶JAK1和JAK3將IL-4的信號(hào)傳遞到STAT6。我們發(fā)現(xiàn)在IL-4處理下，CD11b^-/-BMDM比野生型BMDM有更高的JAK1和JAK3的磷酸化水平(圖6A,16D)。因此，CD11b可能通過JAK激酶來調(diào)控IL-4信號(hào)。值得注意的是，在巨噬細(xì)胞中JAK1的磷酸化水平會(huì)比JAK3低很多。CD11b^-/-巨噬細(xì)胞中IL-4信號(hào)更強(qiáng)，與此相一致的是，用單克隆抗體M1/70阻抗巨噬細(xì)胞的CD11b也同樣能增強(qiáng)IL-4誘導(dǎo)的JAK1，JAK3和STAT6的磷酸化(圖6B)。同時(shí)，阻抗CD11b也能進(jìn)一步增加IL-4誘導(dǎo)的Arg1的表達(dá)(圖6C)。

整合素CD11b信號(hào)傳導(dǎo)起始的關(guān)鍵步驟是激活src家族的激酶(src family kinases,SFKs)。為了檢測CD11b激活的SFK是否參與對(duì)IL-4/STAT6信號(hào)通路的抑制，用SFK的抑制劑PP2來預(yù)處理BMDM，發(fā)現(xiàn)PP2能夠在野生型巨噬細(xì)胞中增強(qiáng)IL-4誘導(dǎo)的JAK3和STAT6的磷酸化，而在CD11b^-/-的巨噬細(xì)胞中沒有增強(qiáng)作用(圖6D)。同時(shí)，抑制SFK能夠在野生型巨噬細(xì)胞中增強(qiáng)IL-4誘導(dǎo)的Arg1的表達(dá)(圖6E)，在CD11b^-/-巨噬細(xì)胞中沒有增強(qiáng)作用(圖16E)。這些結(jié)果表明SFK和/或其下游組分參與了CD11b對(duì)IL-4/STAT6的負(fù)調(diào)控。

所有的JAK-STAT通路們都受到SHP-1的控制，它也可以直接抑制IL-4/STAT6信號(hào)通路。為了檢驗(yàn)SHP-1是否參與了CD11b對(duì)STAT6磷酸化的負(fù)調(diào)控，從me^v/me^v小鼠(SHP-1有突變，失去了大部分蛋白酪氨酸磷酸酶活性)中制備了BMDM。在野生型小鼠中，IL-4誘導(dǎo)的JAK3和JAK6的磷酸化在M1/70阻抗CD11b后進(jìn)一步增強(qiáng)；然而，在me^v/me^v BMDM中這種增強(qiáng)作用消失了(圖6F)。這些結(jié)果表明CD11b對(duì)IL-4/STAT6通路的負(fù)調(diào)控依賴于SHP-1。

實(shí)施例8

CD11b^-/-小鼠的替代性活化的脂肪巨噬細(xì)胞緩解胰島素抵抗

以上的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明CD11b能夠調(diào)控脂肪巨噬細(xì)胞的累積和替代性活化，接下來研究這些變化同胰島素抵抗的關(guān)系。在HFD誘導(dǎo)的肥胖中，我們發(fā)現(xiàn)CD11b^-/-小鼠比野生型小鼠擁有更多的RELM-α+脂肪巨噬細(xì)胞(圖7A)。對(duì)這些肥胖小鼠中分選到脂肪巨噬細(xì)胞的替代性活化的特征基因進(jìn)行檢測，包括Arg1、Ym1、Ppard、Gas6、Lyve1和Pdgfc的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)這些特征基因在CD11b^-/-小鼠的脂肪巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平要顯著高于野生型(圖7B,7C,圖17A)。這表明CD11b^-/-小鼠的替代性活化巨噬細(xì)胞要多于野生型。

肝臟Kupffer細(xì)胞是以一種可以調(diào)節(jié)胰島素抵抗的組織特異的巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步檢驗(yàn)了CD11b對(duì)IL-4/STAT6信號(hào)的抑制是否也會(huì)影響Kupffer細(xì)胞的替代性活化。用流式細(xì)胞術(shù)分析了ARG-1在Kupffer細(xì)胞中的表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)CD11b^-/-與野生型小鼠間存在顯著差異(圖17B)。還檢測了幾個(gè)其他巨噬細(xì)胞替代性活化的特征基因(Clec10a、Clec7a、Il1rn、Jag1、Mrc1、Pdcd1lg、Ppard、Retnla和Ym1)在野生型和CD11b^-/-的肝臟Kupffer細(xì)胞上的表達(dá)，也未發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖17C)。結(jié)果顯示，Kupffer細(xì)胞上的CD11b水平比脂肪巨噬細(xì)胞低7倍還要多(圖17D)。這一低水平的表達(dá)使得CD11b的對(duì)Kupffer細(xì)胞的作用要小于脂肪巨噬細(xì)胞。

CD11b也表達(dá)于嗜酸性粒細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞上。有研究顯示這些細(xì)胞在脂肪組織中的浸潤也與肥胖相關(guān)的胰島素抵抗相關(guān)：嗜酸性粒細(xì)胞能通過分泌IL-4促進(jìn)脂肪巨噬細(xì)胞的替代性活化來改善胰島素抵抗；嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生彈性蛋白酶(elastase)降解胰島素受體促進(jìn)胰島素抵抗；NK細(xì)胞釋放促炎癥因子IFN-γ促進(jìn)胰島素抵抗。然而，本實(shí)施例的結(jié)果顯示，CD11b^-/-和野生型小鼠的脂肪組織中各種細(xì)胞的數(shù)目沒有顯著差異(圖5A,圖11A,圖17E和圖17F)。進(jìn)一步分析上述細(xì)胞的效應(yīng)分子，包括IL-4，彈性蛋白酶和IFN-γ的表達(dá)水平，也未見差異(圖17G-I)。

腸道菌群也在肥胖和代謝紊亂中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，在肥胖人群以及肥胖小鼠中，厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌的豐度增加，而擬桿菌門(Bacteroidetes)細(xì)菌的豐度降低。通過分析細(xì)菌16S rRNA基因，檢測CD11b^-/-和野生型小鼠上述兩個(gè)門的腸道細(xì)菌分布，從而探討腸道菌群是否在CD11b^-/-小鼠的胰島素降低中發(fā)揮作用，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)顯著區(qū)別。進(jìn)一步分析與肥胖和血糖相關(guān)的多種細(xì)菌類群，仍然未發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖17J)。因此，CD11b^-/-小鼠的胰島素抵抗降低不是由于腸道菌群的改變?cè)斐傻摹?/p>

在骨髓移植模型里檢驗(yàn)CD11b^-/-小鼠胰島素抵抗降低是否與脂肪巨噬細(xì)胞的增殖和替代性活化有關(guān)。通過免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)移植了CD11b^-/-骨髓的CD45.1小鼠的脂肪組織里的Ki67+以及RELM-α+的巨噬細(xì)胞要顯著高于移植野生型骨髓的CD45.1小鼠(圖18A-D)，表明在該模型里CD11b^-/-脂肪巨噬細(xì)胞的增殖和替代性活化也都增強(qiáng)。

為了證明替代性活化的脂肪巨噬細(xì)胞對(duì)CD11b^-/-小鼠胰島素抵抗的改善作用，采用包裹氯膦酸鹽的甘露糖?；|(zhì)體(mannosylated clodronate liposome)。這種脂質(zhì)體能夠特異的通過甘露糖受體介導(dǎo)，被替代性活化的巨噬細(xì)胞所吞噬，從而誘導(dǎo)這些細(xì)胞的凋亡。經(jīng)過試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該脂質(zhì)體處理HFD飼喂的小鼠4天后，Kupffer細(xì)胞的數(shù)量沒有降低，然而腹股溝脂肪和附睪脂肪里的RELM-α+巨噬細(xì)胞都大幅減少(圖18E,18F)。接下來用該脂質(zhì)體處理HFD飼喂的CD11b^-/-和野生型小鼠，發(fā)現(xiàn)RELM-α+脂肪巨噬細(xì)胞在兩種小鼠中都降低到同樣的水平(圖7D)。與此同時(shí)，CD11b^-/-小鼠與野生型小鼠在胰島素抵抗上的差異消失了 (圖7E-H)。因此，證實(shí)CD11b通過影響巨噬細(xì)胞的替代性活化來調(diào)節(jié)胰島素抵抗。

討論

脂肪巨噬細(xì)胞累積是肥胖相關(guān)的慢性炎癥的重要特點(diǎn)。這些巨噬細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)胰島素抵抗等代謝紊亂。然而，巨噬細(xì)胞累積的具體機(jī)制以及不同表型的巨噬細(xì)胞在這一過程中的作用并不清楚。CD11b廣為人知的作用是調(diào)控白細(xì)胞遷移和粘附。本發(fā)明揭示了CD11b在調(diào)節(jié)脂肪巨噬細(xì)胞累積和功能方面的新作用。CD11b能夠介導(dǎo)單核細(xì)胞向脂肪組織的遷移。更重要的是，缺失CD11b后，脂肪巨噬細(xì)胞的原位增殖和替代性活化都會(huì)增強(qiáng)，同時(shí)胰島素抵抗降低。在這一過程中，增強(qiáng)的替代性活化巨噬細(xì)胞在CD11b缺失小鼠的代謝改善中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。而原位增殖的加劇進(jìn)一步增加了這些替代性活化的巨噬細(xì)胞的數(shù)量，加強(qiáng)了其作用效果。因此，申請(qǐng)人認(rèn)為CD11b^-/-小鼠的胰島素抵抗改善是脂肪巨噬細(xì)胞原位增殖和替代性活化的一個(gè)協(xié)同作用。

一般認(rèn)為，脂肪巨噬細(xì)胞源于循環(huán)系統(tǒng)里的單核細(xì)胞。近期研究表明多種組織里的巨噬細(xì)胞可以自身群體的維持，其前體細(xì)胞可能不是來源于骨髓。在一些組織里，巨噬細(xì)胞能在正常情況里自我更新，局部增殖，例如小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)，Kupffer細(xì)胞，以及朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cells)。在急性炎癥情況里，如寄生蟲感染的誘導(dǎo)下，Th2細(xì)胞因子能夠極大的促進(jìn)巨噬細(xì)胞的局部增殖，且這些巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)替代性活化的表型。在低度長期的炎癥情況里，如動(dòng)脈粥樣硬化，巨噬細(xì)胞累積也同樣可能是局部增殖導(dǎo)致的。然而，關(guān)于脂肪巨噬細(xì)胞起源和增殖的信息還很少。本發(fā)明意外地發(fā)現(xiàn)，留駐脂肪巨噬細(xì)胞的原位增殖是引發(fā)脂肪巨噬細(xì)胞累積的主要因素，單核細(xì)胞遷移主要在肥胖后期對(duì)巨噬細(xì)胞累積發(fā)揮作用。同時(shí)，不論是留駐的巨噬細(xì)胞還是遷移來的巨噬細(xì)胞都具有增殖能力。我們?cè)贑D11b^-/-小鼠上對(duì)巨噬細(xì)胞數(shù)量的觀察也佐證了上述結(jié)論，盡管CD11b^-/-的單核細(xì)胞向脂肪組織的遷移能力比野生型單核細(xì)胞低4倍，CD11b^-/-小鼠的脂肪巨噬細(xì)胞要顯著多于野生型，這是由于CD11b缺失引發(fā)的脂肪巨噬細(xì)胞過度增殖造成的。

在探討脂肪巨噬細(xì)胞增殖的介導(dǎo)因素時(shí)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)用CCL2或M-CSF處理都不能促進(jìn)普通小鼠的脂肪巨噬細(xì)胞增殖，然而，用IL-4處理能夠很大程度促進(jìn)其增殖。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)IL-4的這一促進(jìn)增殖作用是通過STAT6實(shí)現(xiàn)的。更重要的是，在HFD誘導(dǎo)肥胖的STAT6缺失小鼠中，脂肪巨噬細(xì)胞的原位增殖顯著降低，證實(shí)了IL-4確實(shí)在肥胖相關(guān)的脂肪巨噬細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要作用。脂肪組織中有多種細(xì)胞都能產(chǎn)生IL-4，例如Th2細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，甚至脂肪細(xì)胞本身。肥胖的發(fā)生伴隨著脂肪組織中引發(fā)Th2免疫反應(yīng)，有IL-4表達(dá)的上升和巨噬細(xì)胞替代性活化的增加。在肥胖的病人身上也能觀察到IL-4水平的升高。

IL-4的促進(jìn)有絲分裂特性依賴于IL-4受體及相關(guān)的JAK1，JAK3和下游的 STAT6。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)CD11b缺失促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的脂肪巨噬細(xì)胞增殖，即CD11b抑制了IL-4引發(fā)的脂肪巨噬細(xì)胞增殖。盡管CD11b如何調(diào)控IL-4信號(hào)的具體機(jī)制仍待探索，本發(fā)明的研究指出src家族激酶和SHP-1是這一過程所必需的。src家族激酶的活化是整合素信號(hào)通路里的上游事件，其活化對(duì)免疫受體(immunoreceptors)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有雙重作用：既可以磷酸化免疫受體酪氨酸激活基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAMs)又可以磷酸化免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs)。實(shí)際上，IL-4R的C端也具有一個(gè)ITIM結(jié)構(gòu)域，能夠招募SHP-1來下調(diào)IL-4的信號(hào)?；谶@些信息，申請(qǐng)人提出一個(gè)模型：整合素CD11b活化src家族的激酶，這些激酶磷酸化IL-4Rα的ITIM結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而招募SHP-1來抑制IL-4/STAT6。

總之，本發(fā)明證實(shí)整合素CD11b負(fù)調(diào)控IL-4/STAT6介導(dǎo)的脂肪巨噬細(xì)胞增殖和替代性活化。CD11b的這一作用依賴于包括src家族激酶和SHP-1在內(nèi)的復(fù)雜信號(hào)通路。CD11b這一新發(fā)現(xiàn)的功能不僅拓展了對(duì)整合素的生理作用的認(rèn)識(shí)，還提出了肥胖相關(guān)胰島素抵抗的一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。