本發(fā)明屬于生物技術(shù)藥物領(lǐng)域，具體涉及一種粉螨變應(yīng)原制備方法。

背景技術(shù)：

變態(tài)反應(yīng)性疾病被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重點(diǎn)防治的疾病。過敏性疾病是當(dāng)代社會(huì)中最常見的一種疾病，它是由廣泛存在的過敏原引起的。據(jù)世界變態(tài)反應(yīng)組織報(bào)告，全世界有30％～40％普通人被過敏問題困擾。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球約有3億人患有哮喘，其中50％以上的成人和至少80％的兒童患者均由過敏因素誘發(fā)，每年約25萬人死于哮喘。

螨是全球范圍內(nèi)最主要的過敏原，現(xiàn)在市售的螨變應(yīng)原產(chǎn)品主要是戶塵螨和粉塵螨相關(guān)的診斷、治療等變應(yīng)原產(chǎn)品。引起過敏的種類很多，螨的變應(yīng)原產(chǎn)品僅限于戶塵螨和粉塵螨對于病人的診斷和治療是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。家食甜螨是粉螨的一種，呈世界性廣泛分布，大量發(fā)生于房屋及牲畜棚草屑中，也見于大米、面粉、小麥麩皮、花生、亞麻籽、芝麻、煙草、紅糖、紅棗、干牛肚等儲藏物中；也可大量發(fā)生于麻類纖維上，以生長在纖維上的真菌為食。家食甜螨可引起人類皮炎，在某些情況下與人類哮喘性疾病有關(guān)。因此當(dāng)家食甜螨過敏的病人接觸到家食甜螨的排泄物、皮屑、被家食甜螨染污的食物等，會(huì)引起過敏。由于缺少家食甜螨變應(yīng)原無法進(jìn)行對家食甜螨過敏病人的診斷和治療。未見有家食甜螨變應(yīng)原的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種粉螨變應(yīng)原的制備方法。

本發(fā)明粉螨變應(yīng)原中的螨是指家食甜螨(Glycyphagus domesticus)。雄螨：軀體長320～400微米，圓形，表皮模糊，有微小乳突。前足體背板或頭脊狹長，中央變闊并包圍頂內(nèi)毛，其前半部的骨化較后半部不明顯。軀體剛毛均為細(xì)櫛齒狀并硬直，呈輻射狀排列在體表?；?jié)上毛叉狀且有分枝；2對胛毛在一條線上，胛內(nèi)毛較胛外毛長。軀體后緣肛后毛3對及骶毛2對。腹面，足I表內(nèi)突相連成短胸板，足II表皮內(nèi)突也較發(fā)達(dá)，足III和IV表皮內(nèi)突細(xì)長，且在足III表皮內(nèi)突有一向前的突起。生殖孔在基節(jié)II、III間。足均長并漸細(xì)，各足末端為前跗節(jié)和小爪。各足的亞跗鱗片為位于跗節(jié)中央的櫛狀剛毛所代替，正中毛、背中毛和側(cè)中毛在腹中毛基部和跗節(jié)頂端間，跗節(jié)I的第1感棒細(xì)桿狀，為跗節(jié)II的長度的2倍；芥毛較短。脛節(jié)III和IV的脛節(jié)毛遠(yuǎn)離該節(jié)端部。雌螨：軀體長400～750微米。與雄螨相似，不同點(diǎn)：生殖孔伸展到III基節(jié)臼的后緣，長度較肛門孔前端至生殖孔后端的距離短，一小新月形生殖板覆蓋在生殖褶的前端。后1對生殖毛位于生殖孔的后緣。肛門孔的前端有肛毛2對。1條管狀的交配囊由軀體的后緣突出。

本發(fā)明第一方面是提供了家食甜螨變應(yīng)原原材料的制備方法。

家食甜螨變應(yīng)原原材料通過種子建立、接種培養(yǎng)、收集、純化等步驟制備。

1)種子建立

螨種收集：廣泛收集起房屋、儲藏物等中的粉塵以及灰塵。24℃～27℃、相對濕度為60～75％的環(huán)境中培養(yǎng)2～4個(gè)月。

分離鑒定：每周觀察2～3次粉塵、灰塵中螨生長情況，發(fā)現(xiàn)有家食甜螨活動(dòng)時(shí)，接種針挑出，對家食甜螨進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，確認(rèn)家食甜螨后，將家食甜螨分離出來，進(jìn)行培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)：培養(yǎng)基為：酵母粉30％、小麥胚芽40％、大豆蛋白粉30％，培養(yǎng)基各成分分別通過200目以上的分樣篩，鈷60照射滅菌處理。取600ml無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶以無菌操作接入20～30克培養(yǎng)基，然后接入1.0～1.5克上述已分離鑒定好的家食甜螨，24℃～27℃、相對濕度為60～75％的環(huán)境中避光培養(yǎng)2～3個(gè)月。至家食甜螨達(dá)到50％左右作為種子。家食甜螨種子于24℃～27℃、相對濕度為60～75％條件下避光保存，每3～4個(gè)月傳代一次。

2)接種培養(yǎng)：培養(yǎng)基為：酵母粉30％、小麥胚芽40％、大豆蛋白粉30％，培養(yǎng)基各成分分別通過200目以上的分樣篩，鈷60照射滅菌處理。取600ml無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶以無菌操作接入20～30克培養(yǎng)基，然后接入1.0～1.5克家食甜螨工作種子。將接種好的培養(yǎng)瓶置于24℃～27℃、相對濕度為60～75％條件下避光培養(yǎng)2～3個(gè)月。

3)收集：將培養(yǎng)瓶內(nèi)的家食甜螨與培養(yǎng)基的混合物倒入準(zhǔn)備好的不銹鋼盤中，放入-80℃冰箱過夜，真空冷凍干燥48小時(shí)以上。

4)純化：將家食甜螨原材料通過200目分篩，超聲篩分純化，取其篩上部分，鏡檢家食甜螨含量90％以上為合格。

5)脫脂：加入2倍體積的-20℃以下丙酮脫脂，振蕩30min后靜置5min，重復(fù)操作，直至上清液無色為止。

6)真空干燥：棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開，真空干燥48h以上。

7)保存：-20℃以下密封避光保存。

本發(fā)明另一方面提供了家食甜螨變應(yīng)原的制備方法。

1)提取：家食甜螨純螨變應(yīng)原原材料與0.9％生理鹽水按1～2∶20(W/V)的比例混合，2～8℃，攪拌提取24小時(shí)。

2)離心：于4℃，8000rmp離心15～30分鐘。

3)過濾：過濾上清液濾紙過濾，0.22μm膜除菌過濾。

4)濃縮：用截留分子量5kD的膜，以0.9％生理鹽水衡濾，至濾出液無色為止，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0.22μm膜過濾除菌得家食甜螨變應(yīng)原原液。

5)真空冷凍干燥：用甘露醇水溶液稀釋到規(guī)定濃度，甘露醇終濃度為2％。稀配后的家食甜螨變應(yīng)原原液經(jīng)0.22μm膜過濾除菌后分裝到西林瓶中，每瓶1ml。真空冷凍干燥48h以上，即得家食甜螨變應(yīng)原。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：家食甜螨變應(yīng)原原材料的制備方法。

1)種子建立

螨種收集：廣泛收集起房屋、儲藏物等中的粉塵以及灰塵。24℃～27℃、相對濕度為60～75％的環(huán)境中培養(yǎng)2～4個(gè)月。

分離鑒定：每周觀察2～3次粉塵、灰塵中螨生長情況，發(fā)現(xiàn)有家食甜螨活動(dòng)時(shí)，接種針挑出，對家食甜螨進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，確認(rèn)為家食甜螨，將家食甜螨分離出來，進(jìn)行培養(yǎng)。

種子培養(yǎng)：培養(yǎng)基為：酵母粉30％、小麥胚芽40％、大豆蛋白粉30％，培養(yǎng)基各成分分別通過200目以上的分樣篩，鈷60照射滅菌處理。取600ml無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶 以無菌操作接入20～30克培養(yǎng)基，然后接入1.0～1.5克上述已分離鑒定好的家食甜螨，24℃～27℃、相對濕度為60～75％的環(huán)境中避光培養(yǎng)2～3個(gè)月。至家食甜螨達(dá)到50％左右作為種子。家食甜螨種子于24℃～27℃、相對濕度為60～75％條件下避光保存，每3～4個(gè)月傳代一次。

2)接種培養(yǎng)：培養(yǎng)基為：酵母粉30％、小麥胚芽40％、大豆蛋白粉30％，培養(yǎng)基各成分分別通過200目以上的分樣篩，鈷60照射滅菌處理。取600ml無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶以無菌操作接入20～30克培養(yǎng)基，然后接入1.0～1.5克家食甜螨工作種子。將接種好的培養(yǎng)瓶置于24℃～27℃、相對濕度為60～75％條件下避光培養(yǎng)2～3個(gè)月。

3)收集：將培養(yǎng)瓶內(nèi)的家食甜螨與培養(yǎng)基的混合物倒入準(zhǔn)備好的不銹鋼盤中，放入-80℃冰箱過夜，真空冷凍干燥48小時(shí)以上。

4)純化：將家食甜螨原材料通過200目分篩，超聲篩分純化，取其篩上部分，螨含量90％以上為合格，鏡檢家食甜螨含量96％。

5)脫脂：加入2倍體積的-20℃以下丙酮脫脂，振蕩30min后靜置5min，重復(fù)操作，直至上清液無色為止。

6)真空干燥：棄去廢液后將固體物在濾紙上攤開，真空干燥48h以上。

7)保存：-20℃以下密封避光保存。

實(shí)施例2：家食甜螨變應(yīng)原的制備方法。

1)提?。杭沂程痱凃儜?yīng)原原材料與0.9％生理鹽水按1∶20(w/v)的比例混合，2～8℃，攪拌提取24小時(shí)。

2)離心：于4℃，8000rmp離心15～30分鐘。

3)過濾：過濾上清液濾紙過濾，0.22μm膜除菌過濾。

4)濃縮：用截留分子量5kD的膜，以0.9％生理鹽水衡濾，至濾出液無色為止，超濾濃縮至體積為原體積的三分之一，收集回流液，經(jīng)0.22μm膜過濾除菌得家食甜螨變應(yīng)原原液。

5)真空冷凍干燥：

甘露醇溶液(4％)的配制：按比例稱取適量甘露醇，用60℃注射水定容至終體積的1/3，當(dāng)溫度降至30℃時(shí)，加入0.2％針用活性炭，30℃攪拌30min。然后使用鈦棒將藥液過濾除去碳顆粒。脫碳后的甘露醇溶液用60℃注射水定容至終體積，加入0.05％針用活性炭，60℃攪拌吸附30分鐘，用0.8μm膜過濾，除去活性炭，經(jīng)0.22μm膜過濾除菌。

用甘露醇水溶液稀釋到規(guī)定濃度，甘露醇終濃度為2％。稀配后的家食甜螨變應(yīng)原原液經(jīng)0.22μm膜過濾除菌后分裝到西林瓶中，每瓶1ml。

半壓塞放入凍干機(jī)腔體內(nèi)，以每分鐘2.5～3.0℃/min的速度將溫度降至-45℃，保持8h；然后以每分鐘0.4℃/min的速度將溫度升至-30℃，保持30h，維持腔內(nèi)真空度15Pa；再以2℃/min速度將溫度升至25℃，保持50min，同時(shí)維持真空度為0Pa；再以0.5℃/min的速度將溫度升至30℃，保持60min，同時(shí)維持真空度0Pa，即得家食甜螨變應(yīng)原。