本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于材料科學(xué)、組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的無化學(xué)交聯(lián)、有生物活性、有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)和有結(jié)構(gòu)記憶特征的多孔細(xì)胞生長支架細(xì)胞生長支架的制備方法，具體的說是一種具有結(jié)構(gòu)記憶特性的細(xì)胞生長支架的制備方法。

背景技術(shù)：

因病變、創(chuàng)傷或外科手術(shù)常致使人體軟組織的缺損，使人體自身機(jī)體重新生長所需要的軟組織是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)需要解決的一個難題。國內(nèi)外已經(jīng)研發(fā)出多種用于軟組織缺損修復(fù)的填充材料和敷料，包括基于人工合成高分子材料和天然生物材料制備而成的水凝膠及多孔海綿類填充材料。以動物組織為原料，經(jīng)過酸處理或酶處理后提純的膠原蛋白，可以制備成膠原蛋白水凝膠，適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)交聯(lián)處理可提高水凝膠制劑中膠原蛋白的穩(wěn)定性，在體內(nèi)較不易于被降解。膠原蛋白懸浮液或水凝膠可以經(jīng)過凍干制備成多孔的膠原海綿材料，經(jīng)過進(jìn)一步的化學(xué)交聯(lián)固定處理，不僅可以增進(jìn)海綿材料中膠原蛋白的穩(wěn)定性，同時也以保留膠原海綿材料的多孔結(jié)構(gòu)特性。多孔膠原海綿材料在臨床醫(yī)學(xué)上已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于創(chuàng)口的止血、組織缺損部位的填充，以及藥物載體等。

中國專利文獻(xiàn)cn1235947c、cn101549171b分別提供了制備此類膠原海綿材料的具體方法。其中，cn1235947c專利文獻(xiàn)提供的技術(shù)方案是在常溫下用鹽酸或醋酸溶液浸泡含有豐富膠原蛋白的動物組織(皮膚、軟骨、板筋、肌腱等)，酶解后獲得動物組織細(xì)胞外膠原框架，研磨和勻漿處理獲得膠原懸浮液，將膠原懸浮液置入模具，加壓成型和凍干制備膠原海綿填充劑，在凍干前或凍干后用化學(xué)交聯(lián)劑處理。專利文獻(xiàn)cn101549171b提出了在提取出的高純度ii型膠原溶液后，用聚乙二醇對ii型膠原溶液進(jìn)行濃縮，然后用含碳化二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺作交聯(lián)劑對濃縮后的ii型膠原進(jìn)行交聯(lián)，冷凍干燥制備得到的膠原海綿。

以上技術(shù)方案均采用化學(xué)交聯(lián)的方式獲得膠原海綿，但缺陷也是顯而易見的：經(jīng)酸化和酶解制備的膠原海綿穩(wěn)定性差，缺少生物活性及有降解過快等缺點。

除此之外，在技術(shù)領(lǐng)域中也有在膠原海綿制備過程中添加透明質(zhì)酸鈉、殼聚糖、甲殼素、硫酸軟骨素等其他生物大分子材料來制備成復(fù)合海綿材料并改善了膠原海綿的生物性能。例如，中國專利文獻(xiàn)cn101862475b披露的技術(shù)方案是在膠原溶液中添加了透明質(zhì)酸鈉，經(jīng)過化學(xué)交聯(lián)制備得到復(fù)合的膠原材料。中國專利文獻(xiàn)cn103007336a是在魚皮膠原中添加了殼聚糖，冷凍干燥后經(jīng)交聯(lián)再進(jìn)行二次冷凍干燥制備魚皮膠原基復(fù)合海綿。盡管化學(xué)交聯(lián)處理提高了膠原海綿的穩(wěn)定性，含有透明質(zhì)酸和殼聚糖等其他生物大分子的膠原海綿復(fù)合材料有較好的生物活性，輻射滅菌后這些海綿材料的穩(wěn)定性還是明顯下降，在大面積軟組織填充或傷口修復(fù)時容易出現(xiàn)較為嚴(yán)重的炎癥。

以上技術(shù)方案盡管仍以化學(xué)交聯(lián)處理的方式提高了膠原海綿的穩(wěn)定性，且含有透明質(zhì)酸和殼聚糖等其他生物大分子的膠原海綿復(fù)合材料有較好的生物活性。但實踐中還是存在輻射滅菌后這些海綿材料的穩(wěn)定性明顯下降的問題，尤其是在大面積軟組織填充或傷口修復(fù)時容易出現(xiàn)較為嚴(yán)重的炎癥。

美國專利文獻(xiàn)us2012/0263763a1描述了一種基于纖維化后的脫細(xì)胞的組織基質(zhì)海綿材料。制備該材料的方法是以豬皮為原料，經(jīng)過去脂肪、冷凍超薄切片、脫細(xì)胞和去抗原、清洗、纖維化勻漿、病毒滅活、滅菌、以及將脫細(xì)胞基質(zhì)懸浮液凍干制備成組織基質(zhì)海綿材料，凍干的海綿材料可以用環(huán)氧乙烷或輻射滅菌。該方法產(chǎn)生的積極效果是不采用化學(xué)交聯(lián)的方式，使該細(xì)胞外組織基質(zhì)材料較好的保留了原來組織基質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)特征；除膠原蛋白成分外，還包含其他重要的細(xì)胞外組織基質(zhì)成分，如彈性蛋白、纖維蛋白，蛋白聚糖等；制備工藝中沒有酸處理、酶解處理的過程，該海綿材料具有良好的生物相容性，支持宿主細(xì)胞快速生長，膠原蛋白穩(wěn)定性較好，降低了炎癥反應(yīng)。但存在的問題是由此方法獲得的該海綿材料結(jié)構(gòu)強(qiáng)度差、彈性差，受壓后容易碎和變形，且不能保持原有材料結(jié)構(gòu)和不能恢復(fù)原有的形狀。

總結(jié)以上文獻(xiàn)披露的技術(shù)方法，突顯的問題是：無論是使用酸解或酶解后純化的膠原蛋白水凝膠，還是脫細(xì)胞后勻漿的組織基質(zhì)材料懸浮液，在制備多孔的膠原海綿材料時，現(xiàn)有的技術(shù)是先將水凝膠或懸浮液凍干，再經(jīng)過進(jìn)一步的化學(xué)交聯(lián)處理來提高材料的力學(xué)強(qiáng)度和增進(jìn)海綿材料中膠原蛋白的穩(wěn)定性，化學(xué)交聯(lián)處理使組織基質(zhì)材料損失了作為孔細(xì)胞生長支架原本擁有的許多優(yōu)良的天然特性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有結(jié)構(gòu)記憶特性的細(xì)胞生長支架的制備方法，由此方法獲得的支架不僅具有優(yōu)良的生物兼容性和完全的生物可降解性，同時具有支持細(xì)胞生長、支持體內(nèi)和體外的組織和器官生長。

為此，本發(fā)明解決所述問題的技術(shù)方案是：一種具有結(jié)構(gòu)記憶特性的細(xì)胞生長支架的制備方法，其特征是，所述方法包括：步驟一，原料收集：用于制備脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的生物組織原材料的收集，所述原材料包括但不局限于人體或動物的皮膚，軟骨，血管、半月板，胃，小腸，大腸，隔膜，肌腱，韌帶，神經(jīng)組織，膀胱和尿道，將富含膠原蛋白的組織切割分離出來，切成1-20毫米的小塊或小片；步驟二，原料消毒:將步驟一獲取的小塊或小片用2%碳酸鈉浸泡4～48小時或用其他ph在10.5～12.5的堿性溶液浸泡；步驟三，脫細(xì)胞處理:將步驟二浸泡后的小塊或小片再用0.1～2.0%的脫氧膽酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、或用每升10～200單位的中性酶脫細(xì)胞處理4～36小時；步驟四，脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的清洗：將步驟三脫細(xì)胞處理后的小塊或小片再用生理鹽水或其他中性的滲溶液按每公斤材料1-6升沖洗2-5遍，每次1～12小時；步驟五：脫細(xì)胞組織基質(zhì)絞碎：將步驟四脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料清洗后小塊或小片再用絞碎機(jī)將脫細(xì)胞的組織基質(zhì)材料碎磨成微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料；步驟六，酸化處理：將步驟五獲取的微纖維狀或絮狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料浸泡在的5～200ml的、ph調(diào)至2.8～3.5的鹽酸或醋酸溶液中做酸化處理1～24小時，再次將基質(zhì)材料打碎研磨成水凝膠狀顆粒，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至4.0～6.5；步驟七，混合與注模：在20～30℃室溫中按60～90%的比例混合微纖維狀或絮狀脫細(xì)胞織基質(zhì)材料與按40～10的酸化處理的水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)顆?；靹蚝笞⑷氚b模具中；步驟八，冰凍處理：將有含有脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料懸浮液的模具放入-20℃以下的凍箱中深凍，或在第一次解凍后再次深凍提高其懸浮液空隙結(jié)構(gòu)；步驟九，輻射處理：將深凍的材料用x-射線、伽馬射線或電子束處理；步驟十，將步驟九處理后的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料制備成固態(tài)的、無化學(xué)交聯(lián)、有生物活性、有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)和有結(jié)構(gòu)記憶特征的多孔細(xì)胞生長支架型材。并且，本發(fā)明內(nèi)容步驟十中的多孔細(xì)胞生長支架，其脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料是纖維直徑為2–250微米、長度為100–3000微米的微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料和顆粒直徑為2–150微米酸化處理水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料。其基質(zhì)材料中總的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料含量為每立方厘米10～100毫克、總空隙度90～99%，并且，基質(zhì)材料的顆粒大于25微米的空隙度為80～98%。所述支架中的微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料按干重質(zhì)量比為60%～90%，所述的酸化處理水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料按干重質(zhì)量比為40%～10%。

相比現(xiàn)有技術(shù)，由本發(fā)明提供的制備方法制作的生長支架是一種無化學(xué)交聯(lián)、有生物活性、有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)和有結(jié)構(gòu)記憶特征的多孔細(xì)胞生長支架，它是通過將纖維或絮狀的組織材料和酸化的水凝膠材料按一定比例混合在一起并通過凍/融擠壓和輻射工序制成的有特殊性能的多孔材料。該支架不僅具有優(yōu)良的生物兼容性和完全的生物可降解性，也支持細(xì)胞生長，同時支持體內(nèi)和體外的組織和器官的生長，是適合于體軟組織創(chuàng)傷和缺損的修復(fù)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的一個實施例結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是關(guān)于圖1的支架產(chǎn)品掃描量熱儀（dsc）曲線示意圖；

圖3是關(guān)于構(gòu)成支架產(chǎn)品的兩種材料的穩(wěn)定性與顆粒直徑的關(guān)系曲線示意圖；

圖4是關(guān)于圖1的支架產(chǎn)品生成形態(tài)關(guān)系的曲線示意圖；

圖5是本發(fā)明制備具有結(jié)構(gòu)記憶特性的細(xì)胞生長支架的流程示意圖。

具體實施方式

參見附圖5，本發(fā)明涉及一種具有結(jié)構(gòu)記憶特性的細(xì)胞生長支架的制備方法，所述方法包括：步驟一，原料收集：用于制備脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的生物組織原材料的收集，所述原材料包括但不局限于人體或動物的皮膚，軟骨，血管、半月板，胃，小腸，大腸，隔膜，肌腱，韌帶，神經(jīng)組織，膀胱和尿道，將富含膠原蛋白的組織切割分離出來，切成1-20毫米的小塊或小片；步驟二，原料消毒:將步驟一獲取的小塊或小片用2%碳酸鈉浸泡4～48小時或用其他ph在10.5～12.5的堿性溶液浸泡；步驟三，脫細(xì)胞處理:將步驟二浸泡后的小塊或小片再用0.1～2.0%的脫氧膽酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚、或用每升10～200單位的中性酶脫細(xì)胞處理4～36小時；步驟四，脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的清洗：將步驟三脫細(xì)胞處理后的小塊或小片再用生理鹽水或其他中性的滲溶液按每公斤材料1-6升沖洗2-5遍，每次1～12小時；步驟五：脫細(xì)胞組織基質(zhì)絞碎：將步驟四脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料清洗后小塊或小片再用絞碎機(jī)將脫細(xì)胞的組織基質(zhì)材料碎磨成微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料；步驟六，酸化處理：將步驟五獲取的微纖維狀或絮狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料浸泡在的5～200ml的、ph調(diào)至2.8～3.5的鹽酸或醋酸溶液中做酸化處理1～24小時，再次將基質(zhì)材料打碎研磨成水凝膠狀顆粒，并用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至4.0～6.5；步驟七，混合與注模：在20～30℃室溫中按60～90%的比例混合微纖維狀或絮狀脫細(xì)胞織基質(zhì)材料與按40～10的酸化處理的水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)顆?；靹蚝笞⑷氚b模具中；步驟八，冰凍處理：將有含有脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料懸浮液的模具放入-20℃以下的凍箱中深凍，或在第一次解凍后再次深凍提高其懸浮液空隙結(jié)構(gòu)；步驟九，輻射處理：將深凍的材料用x-射線、伽馬射線或電子束處理；步驟十，將步驟九處理后的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料制備成固態(tài)的、無化學(xué)交聯(lián)、有生物活性、有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)和有結(jié)構(gòu)記憶特征的多孔細(xì)胞生長支架型材。并且，本發(fā)明內(nèi)容步驟十中的多孔細(xì)胞生長支架，其脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料是纖維直徑為2–250微米、長度為100–3000微米的微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料和顆粒直徑為2–150微米酸化處理水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料。其基質(zhì)材料中總的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料含量為每立方厘米10～100毫克、總空隙度90～99%，并且，基質(zhì)材料的顆粒大于25微米的空隙度為80～98%。所述支架中的微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料按干重質(zhì)量比為60%～90%，所述的酸化處理水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料按干重質(zhì)量比為40%～10%。

例如圖1所示，是指本發(fā)明涉及的部分產(chǎn)品的形態(tài)結(jié)構(gòu)示意圖。其中，圖中的（a）是圓片形和圓柱形細(xì)胞生長支架；圖中的（b）是直徑1.8厘米、高3.0厘米的柱形細(xì)胞生長支架在（手指捏的）壓力作用下收縮形態(tài)；圖中的（c）是（指捏）壓力釋放后支架完全恢復(fù)了原有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)和形狀。具體地說，本制備的細(xì)胞生長支架每立方厘米含有43毫克脫細(xì)胞基質(zhì)材料，即組織基質(zhì)的干重含量4.3%。細(xì)胞生長支架有很好的彈性，直徑1.8厘米和高3厘米的園柱形支架在壓力作用下可收縮至高5毫米，壓力釋放后支架完全恢復(fù)原有的穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)和形狀，多次反復(fù)受壓不變形。

例如圖2所示，是經(jīng)0.5%脫氧膽酸鈉溶液脫細(xì)胞后組織基質(zhì)材料的差示掃描量熱儀（dsc）曲線示意；其中，圖中的（a）是微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料；圖中的（b是）經(jīng)50mm醋酸溶液處理后的脫細(xì)胞組織基質(zhì)水凝膠狀顆粒；圖中的（c）是按70%微纖維狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料和30%酸化處理的水凝膠狀顆粒制備而成的細(xì)胞生長支架。具體地說，差示掃描量熱儀（dsc）比較測定了一下材料的熱穩(wěn)定性能：（a）微纖維狀或絮狀的組織基質(zhì)材料，（b）酸化處理后的水凝膠狀組織基質(zhì)材料，（c）按干重比70%微纖維狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料和30%酸化處理的水凝膠狀顆粒制備而成的細(xì)胞生長支架。微纖維狀或絮狀的組織基質(zhì)材料的起始變性溫度是56.7℃，熱焓值為-56.4j/gdw（克干重）；酸化處理后的水凝膠狀組織基質(zhì)材料的起始變性溫度是39.0℃，熱焓值為-39.4j/gdw，表明酸化處理后的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)已經(jīng)膨脹松動、不穩(wěn)定；最后制備成的細(xì)胞生長支架的起始變性溫度是55.3℃，熱焓值為-54.3j/gdw，基本上保留了天然豬真皮細(xì)胞外基質(zhì)材料的穩(wěn)定性。

例如圖3所示，是經(jīng)0.5%脫氧膽酸鈉溶液脫細(xì)胞處理和50mm醋酸處理后的脫細(xì)胞組織基質(zhì)水凝膠狀顆粒的穩(wěn)定性與顆粒直徑的關(guān)系曲線示意圖。具體地說，50mm醋酸處理后的脫細(xì)胞組織基質(zhì)水凝膠狀顆粒的穩(wěn)定性與顆粒直徑有關(guān)（圖3）。當(dāng)平均顆粒直徑從140微米減少到約15微米時，起始變性溫度從55℃降至35℃，低于人體的正常體溫。水凝膠狀顆粒越小，熱穩(wěn)定性越差。

結(jié)合以上附圖可以清楚地看出關(guān)于廣泛應(yīng)用于普外科、骨科、整形外科、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的具有結(jié)構(gòu)記憶特性的細(xì)胞生長支架是如何由本發(fā)明的制備方法實現(xiàn)的。

再詳細(xì)地說，所謂細(xì)胞生長的基質(zhì)材料是由兩種性質(zhì)不同的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料按一定比例組成的材料，即，原材料的來源是脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料是從但不局限于人體或動物的皮膚，軟骨，血管、半月板，胃，小腸，大腸，隔膜，肌腱，韌帶，神經(jīng)組織，膀胱，和尿道等。將富含膠原蛋白的組織切割分離出來，切成1-20毫米的小塊或小片中獲取。在獲取兩種性質(zhì)不同的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料后就可以制作具有結(jié)構(gòu)記憶特性的細(xì)胞生長支架了。例如，首先解決的生物細(xì)胞生長支架的組織構(gòu)架問題，本例中所說的支架是由纖維直徑為2–250微米、長度為100–3000微米的微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料和顆粒直徑為2–150微米酸化處理水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料按各自干重質(zhì)量比例混合后再經(jīng)注模、冰凍，擠壓、輻射、重新交織工序所構(gòu)成；在這當(dāng)中，細(xì)胞生長的基質(zhì)材料是細(xì)胞生長支架的基質(zhì)材料，其基質(zhì)材料中總的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料含量應(yīng)限定在每立方厘米10～100毫克、總空隙度90～99%的方位內(nèi)；并且，將基質(zhì)材料的顆粒限定在大于25微米的空隙度為80～98%的范圍內(nèi)。在制作細(xì)胞生長支架的過程中優(yōu)選的方案是支架中的微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料應(yīng)按干重質(zhì)量比為60%～90%、酸化處理水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料應(yīng)按干重質(zhì)量比為40%～10%調(diào)比；在注模工序中應(yīng)將微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料和酸化處理水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料均勻混合成懸浮液后再注入模具；在冰凍工序中應(yīng)在-20℃條件下并經(jīng)伽馬射線輻射處理才可將模具內(nèi)的混合懸浮液制成冰晶或者將模具內(nèi)的混合懸浮液通過至少兩次以上的凍融過程完成冰凍程序；在擠壓、重新交織工序中應(yīng)將冰晶擠壓使懸浮液中微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料和酸化處理的水凝膠狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)顆粒材料重新交織在一起后再制成具有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)和有結(jié)構(gòu)記憶特征的多孔細(xì)胞生長支架材料。經(jīng)過上述工序后才能將具有穩(wěn)定三維結(jié)構(gòu)和有結(jié)構(gòu)記憶特征的多孔細(xì)胞生長支架材料制成形態(tài)各異的支架產(chǎn)品。

實施例：

例一，從剛屠宰和脫毛的豬體身上收集新鮮豬皮，機(jī)械去除皮下脂肪和表皮，取約1.5毫米厚的真皮。洗清完皮膚中血液和其它污垢，人工拔除皮膚上剩余的毛發(fā)。將豬真皮切成約1厘米見方的小塊，用純化水沖洗干凈。稱取200克真皮原料放于1升的高密度聚丙烯瓶中，加入800毫升含有2%的碳酸鈉和10mm氫氧化鈉的堿液，在搖床上處理20小時(ph=12.5)。堿液處理后用0.5m的醋酸溶液進(jìn)行酸堿中和。倒去中和后的溶液，加入800毫升含有0.5%脫氧膽酸鈉和5mm乙二胺四乙酸二鈉的5mm羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液(ph=7.5)，在室溫下?lián)u床上處理過夜（約20小時）脫細(xì)胞。用無菌生理鹽水快速沖洗經(jīng)過脫細(xì)胞處理的小塊真皮材料2次，每次30-60分鐘。將小塊真皮材料用高速研磨機(jī)研磨，制備成細(xì)小的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料，使組織顆粒平均寬度在500–2000微米之間、長度在2000–5000微米之間。用離心法收集基質(zhì)材料，倒去上面的上清液。加入無菌生理鹽水，將離心沉降基質(zhì)材料懸浮起來，再次離心清洗基質(zhì)材料。加入800毫升0.1%過氧乙酸溶液，處理60分鐘。離心、收集基質(zhì)材料。用無菌生理鹽水，通過懸浮、搖換、離心和收集基質(zhì)材料洗2次，每次30～60分鐘。按每50克基質(zhì)材料加入500毫升10mm乙二胺四乙酸二鈉磷酸鹽緩沖溶液（ph=7.5），并用高速研磨機(jī)研磨打碎，制備成微纖維狀或絮狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料，使微纖維的直徑為2–250微米之間、長度為100–3000微米之間。離心，倒去上清液，收集離心沉降的基質(zhì)微纖維材料。將微纖維狀或絮狀的基質(zhì)材料懸浮于0.9%鹽水中，得到細(xì)胞外組織基質(zhì)材料懸浮液，懸浮液中微纖維基質(zhì)材料含量為4.9%。然后取部分微纖維狀或絮狀的基質(zhì)材料，加入醋酸，使最終的醋酸濃度為50mm。酸化處理導(dǎo)致基質(zhì)材料膨脹后，用高速研磨機(jī)繼續(xù)研磨，制備成大小10–250微米的水凝膠顆粒，用氫氧化鈉溶液將酸化的水凝膠調(diào)ph至6.5，水凝膠材料含量為1.5%。將微纖維狀或絮狀的組織基質(zhì)材料和酸化處理的水凝膠狀的組織基質(zhì)材料按干重比70%對30%混合。將混合后的基質(zhì)材料懸浮液加入到圓片形和圓柱形模具中，放入-20℃冰箱中冷凍。利用結(jié)冰形成多孔結(jié)構(gòu)。冷凍后采用25kgy伽馬輻射處理，制備得到穩(wěn)定的、有結(jié)構(gòu)記憶特征的細(xì)胞生長支架，且可放于室溫中保存。

實施例二，從剛屠宰和脫毛的豬體身上收集新鮮豬皮，去除皮下脂肪和表皮，洗清皮膚中血液和其它污垢，人工機(jī)械拔除皮膚上剩余的微小毛發(fā)后，將豬真皮切成約厚2毫米、寬1厘米見方的小塊，用純化水沖洗一次，稱取原料200克，放于高密度聚丙烯瓶中。加入堿液（含2%碳酸鈉,10mm氫氧化鈉和0.2%聚乙二醇辛基苯基醚），放置于搖床，在堿液中處理20小時。加入醋酸溶液進(jìn)行酸堿中和。加入0.5%十二烷基硫酸鈉（溶于5mm乙二胺四乙酸二鈉和5mm羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖液中）進(jìn)行脫細(xì)胞,室溫下?lián)u床振蕩處理20小時。無菌生理鹽水快速沖洗2次，每次30-60分鐘。將材料用高速研磨機(jī)研磨打碎，將材料打碎成長約2.0～4.0mm，寬約0.5～2.0mm大小。離心，收集基質(zhì)材料，倒去上清液。將收集到的基質(zhì)材料浸泡于0.1%過氧乙酸溶液中處理2小時。用無菌生理鹽水沖洗1～2次，每次30～60分鐘。將生理鹽水沖洗過的材料用10mm乙二胺四乙酸二鈉磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行清洗，并用高速研磨機(jī)研磨打碎，將材料打碎成長約500～2500毫米，寬約50～500毫米大小，離心，收集基質(zhì)微纖維，倒去上清液。將基質(zhì)微纖維懸浮于0.9%鹽水中，制備得到細(xì)胞外組織基質(zhì)微纖維材料懸浮液，材料含量為4.6%。取三分之一的微纖維材料懸浮液，用50mm醋酸溶液將材料進(jìn)行稀釋和酸化。將酸化處理過的材料用高速研磨機(jī)研磨打碎，制備成水凝膠材料。用氫氧化鈉溶液將酸化的水凝膠材料進(jìn)行中和，ph調(diào)至6.5，制備得到的水凝膠材料含量為1.7%。將微纖維狀或絮狀組織基質(zhì)材料和酸化的水凝膠材料按干重比80%對20%混合，混合后的基質(zhì)材料倒入到模具中。在-20℃冰箱中冷凍后，采用25kgy伽馬輻射處理，制備得到生物組織細(xì)胞生長支架。如圖4所示，用差示掃描量熱儀（dsc）比較測定了一下材料的熱穩(wěn)定性能：（a）0.5%十二烷基硫酸鈉脫細(xì)胞的微纖維狀或絮狀的組織基質(zhì)材料，（b）酸化處理后的水凝膠狀組織基質(zhì)材料，（c）按干重比80%微纖維狀的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料和20%酸化處理的水凝膠狀顆粒制備而成的細(xì)胞生長支架。0.5%十二烷基硫酸鈉脫細(xì)胞的微纖維狀或絮狀的組織基質(zhì)材料的起始變性溫度是53.1℃，熱焓值為-49.2j/gdw；酸化處理后的水凝膠狀組織基質(zhì)材料的起始變性溫度是34.9℃，熱焓值為-30.2j/gdw；最后制備成的細(xì)胞生長支架的起始變性溫度是53.3℃，熱焓值為-50.3j/gdw，基本上保留了天然豬真皮細(xì)胞外基質(zhì)材料的穩(wěn)定性。