本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的三大疾病之一。血管抑素受體(angiostatinreceptorf1f0-atp合成酶)對(duì)腫瘤細(xì)胞中atp合成起重要作用。在正常人體組織中，血管抑素受體主要在線(xiàn)粒體內(nèi)膜上定位，但也有少量存在于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。相對(duì)而言，很多腫瘤細(xì)胞超量表達(dá)血管抑素受體，并大量定位于細(xì)胞膜上。因而腫瘤細(xì)胞膜上的血管抑素受體是一個(gè)潛在的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。

單克隆抗體市場(chǎng)作為制藥行業(yè)中增長(zhǎng)最快、獲利最大的市場(chǎng)之一，其在2003年和2004年間的增長(zhǎng)率已經(jīng)達(dá)到了48.1％。由于受從嵌合體、人源化到完全人源化抗體等一系列技術(shù)發(fā)展的推動(dòng)，這一市場(chǎng)份額在未來(lái)6年內(nèi)有可能上升三倍。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體經(jīng)歷了從鼠源單抗、人源化/嵌合單抗、人單抗和全人單抗四個(gè)主要發(fā)展階段。單克隆抗體的上述四個(gè)發(fā)展階段使鼠源性蛋白成分分別從100％下降至33％，乃至0％，成為真正的全人抗體。目前治療性單克隆抗體藥物的臨床指征覆蓋了惡性腫瘤、自身免疫性疾病、傳染性疾病，尤其是在癌癥和疑難雜癥的治療方面療效突出。

全人抗體藥物是利用人－人雜交瘤技術(shù)開(kāi)發(fā)的單克隆抗體藥物，與現(xiàn)有藥物比較具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、全人抗體，無(wú)副作用；2、技術(shù)更為簡(jiǎn)便，高通量篩選，開(kāi)發(fā)周期短。3、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，抗體產(chǎn)量高；4、與人體內(nèi)天然產(chǎn)生的抗體完全一致。截至2006年，美國(guó)fda已批準(zhǔn)35個(gè)抗體藥物，其中，人源化抗體占60％，全人抗體占20％，全人抗體已成為治療類(lèi)抗體在抗體類(lèi)型上必然趨勢(shì)。

納米生物技術(shù)是國(guó)際生物技術(shù)領(lǐng)域的前沿和熱點(diǎn)問(wèn)題，在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用和明確的產(chǎn)業(yè)化前景，特別是納米藥物載體。這種技術(shù)是以納米顆粒作為藥物載體，將藥物等治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，同時(shí)也在顆粒表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，如單克隆抗體等，通過(guò)靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性藥物和基因治療。目前美國(guó)生物科學(xué)公司已研制出了一種紫杉醇白蛋白納米懸浮液(abi-007)，已經(jīng)在歐美上市并應(yīng)用于臨床。雖然臨床研究結(jié)果顯示，abi-007所引起的毒副反應(yīng)明顯輕于同劑量的注射液，但abi一007還是會(huì)引起骨髓抑制，粒細(xì)胞減少等副反應(yīng)。因此，對(duì)紫杉醇納米制劑做更進(jìn)一步的改進(jìn)，開(kāi)發(fā)一種具有靶向治療效果的紫杉醇納米制劑將可提高靶細(xì)胞的藥物濃集、增加藥物療效，具有更重要意義和廣泛的臨床應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)的治療模式(手術(shù)、放療、化療)依然是腫瘤治療的主要手段。然而，臨床絕大多數(shù)抗癌制劑仍不能區(qū)分癌細(xì)胞與正常細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致了系統(tǒng)性的毒性與嚴(yán)重副作用。所以提高藥物的腫瘤選擇性，減少其在非靶向部位的聚集是提高抗腫瘤藥物療效的關(guān)鍵。靶向抗腫瘤納米藥物的研究正日益受到人們的普遍關(guān)注和重視。納米技術(shù)和納米生物學(xué)研究的進(jìn)一步深入已對(duì)醫(yī)藥業(yè)產(chǎn)生了巨大的影響，特別是納米藥物載體在藥物傳遞系統(tǒng)(dds)可發(fā)揮重要作用。目前研究的熱點(diǎn)和已有較好基礎(chǔ)及做出實(shí)質(zhì)性成果的是藥物納米載體和納米顆?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)。這種技術(shù)是以納米顆粒作為藥物和基因轉(zhuǎn)移載體，將藥物、dna和rna等基因治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，同時(shí)也在顆粒表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，如特異性配體、單克隆抗體等，通過(guò)靶向分子與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)安全有效的靶向性藥物和基因治療。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物是一類(lèi)新型的納米載體，它同時(shí)具有親水性基團(tuán)及疏水性基團(tuán)，在水中溶解后自發(fā)形成高分子膠束，并完成對(duì)藥物的增溶和包裹，它具有親水性外殼及疏水性?xún)?nèi)核，適合于攜帶不同性質(zhì)的藥物，且可使藥物能逃避單核巨噬細(xì)胞吞噬。因此，推進(jìn)靶向治療的有效靶點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)具有重要意義，結(jié)合納米技術(shù)研究新一代治療藥物與治療方法，具有重大的科學(xué)意義與社會(huì)意義。

通過(guò)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)相關(guān)的專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束及制備方法和應(yīng)用。

一種抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束，所述納米膠束是由抗血管抑素受體單克隆抗體與羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物連接而成。

而且，所述抗血管抑素受體單克隆抗體與羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩爾比為1：500-1：10000。

而且，所述抗血管抑素受體單克隆抗體為人源化單克隆抗體。

如上所述的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束的制備方法，步驟如下：

⑴采用高效與高通量全人抗體技術(shù)獲取高表達(dá)工程細(xì)胞株，制備抗hai-178特異性人源化抗體；

⑵聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的結(jié)構(gòu)修飾：

a)羧基化嵌段聚合物ct-p123的合成與表征；

聚合物表面修飾的具體步驟為：

取聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物，將其溶解于2m氫氧化鈉溶液中，105℃油浴回流反應(yīng)7h，反應(yīng)產(chǎn)物溶液以濃鹽酸調(diào)ph值至2，使用與反應(yīng)產(chǎn)物溶液等體積的二氯甲烷萃取加成反應(yīng)產(chǎn)物溶液，加入無(wú)水硫酸鈉放置過(guò)夜吸除萃取液中所含水分，過(guò)濾，濾液經(jīng)40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，真空干燥過(guò)夜除盡溶劑，得粗產(chǎn)物；將等體積乙醚和粗產(chǎn)物渦旋混合，粗產(chǎn)物沉淀析出，8000rpm離心10min除去溶劑，將等體積35.60℃的石油醚和離心后粗產(chǎn)渦旋混合，粗產(chǎn)物再次沉淀析出，8000rpm離心10min除去溶劑，沉淀經(jīng)30℃真空干燥過(guò)夜后即得到純化的ct-p123；

b)ct-p123與抗hai-178特異性人源化抗體的連接：

羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的羧基與單克隆抗體的氨基連接，將羧基活化劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽與ct-p123溶于純水溶液中，200-300r/min振蕩反應(yīng)15分鐘，加入抗hai-178特異性人源化抗體，其中，抗hai-178特異性人源化抗體與ct-p123的摩爾比為1：500-1：10000，繼續(xù)攪拌1-1.2h，制得未標(biāo)記的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束；

c)¹²⁵i標(biāo)記抗體，測(cè)活度，計(jì)算抗體結(jié)合率，得¹²⁵i標(biāo)記抗體：

采用常規(guī)方法¹²⁵i標(biāo)記her2單克隆抗體，即得抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束。

如上所述的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束在作為藥物載體方面中的應(yīng)用。

一種包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束，所述免疫膠束是由權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束作為載體和包裹在該載體中的紫杉醇組成。

而且，所述抗血管抑素受體單克隆抗體納米膠束與紫杉醇的質(zhì)量比為40-400：1。

如上所述的包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束的制備方法，步驟如下：

⑴采用如權(quán)利要求4所述的方法連接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗血管抑素受體單克隆抗體，得到抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束；

⑵采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法將紫杉醇包裹進(jìn)抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束中，所述星點(diǎn)設(shè)計(jì)法的具體步驟為：

步驟⑴的納米膠束的固定載體量為20mg，選擇對(duì)膠束形成有顯著影響的兩個(gè)因素：主藥的投藥量x1及水化時(shí)的水相量x2進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)采取兩因素、五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)為在二水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上極值點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成，其代碼分別為±1，±a和0，a＝(f)^1/4，f＝2k(k為因素?cái)?shù))；對(duì)于二因素的星點(diǎn)設(shè)計(jì)a＝1.414.確定各因素水平的極大(+a)和極小值(-a)后，±1，0水平的安排遵循任意兩個(gè)物理量之間的極差與對(duì)應(yīng)代碼之間差值成正比的原則安排實(shí)驗(yàn)，將各實(shí)驗(yàn)?zāi)z束用0.22um濾膜過(guò)濾后測(cè)定濾液中藥物的濃度，除以未過(guò)濾膠束中藥物的濃度，為該膠束的載藥量；以載藥量為因變量分別對(duì)各因素及其相互作用進(jìn)行回歸處理，分析各因素對(duì)各效應(yīng)值的影響，選取載藥量較多的工藝條件將紫杉醇包裹進(jìn)抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束中，即得包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束。

如上所述的包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：

1、本抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束納米膠束為具有親水端和疏水端的兩親性納米膠束，其所包含的人源化抗體免疫原性低，副作用小，同時(shí)該免疫膠束封包性能穩(wěn)定、封包率高、抗體活性良好，可以用作藥物載體，使得被包裹的藥物能夠更加準(zhǔn)確地識(shí)別靶位，在提高藥物治療效果的同時(shí)，也降低了藥物的毒副作用。

2、本發(fā)明中包裹了紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束既能使藥物送到一定的靶位，發(fā)揮紫杉醇與抗血管抑素受體單克隆抗體的抗腫瘤作用，特異性殺傷腫瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，并延長(zhǎng)藥物在腫瘤部位的作用時(shí)間；顯示出更優(yōu)越的抗腫瘤活性和更小的毒副作用。同時(shí)，本發(fā)明的免疫膠束采用納米粒子制備技術(shù)，表面改性等技術(shù)，在體內(nèi)減輕納米載藥顆粒與血清成分的相互作用，減小其被清除系統(tǒng)吞噬的概率，延長(zhǎng)在血液循環(huán)系統(tǒng)中的時(shí)間，同時(shí)又實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)緩釋的目的，避免了抗體半衰期短的缺點(diǎn)，在保持其抗體活性的同時(shí)，使之更適合體內(nèi)應(yīng)用。與現(xiàn)有的單抗藥物相比，可以大大降低用藥頻率。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束的制備方法的工藝流程圖；

圖2為本發(fā)明羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(ct-p123)的合成工藝流程圖；

圖3為本發(fā)明的相關(guān)粒徑檢測(cè)圖；其中，圖3-1為的pluronicp123膠束的粒徑檢測(cè)圖，圖3-2為載有紫杉醇的pluronicp123膠束的粒徑檢測(cè)圖，圖3-3為抗hai-178人源化抗體-ptx免疫膠束的粒徑檢測(cè)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明；下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明中所使用的原料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)的市售產(chǎn)品；本發(fā)明中所使用的方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

本發(fā)明用二維液相色譜分離技術(shù)獲得了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白hai-178，該蛋白為atp合成酶的同源物，然后利用高效與高通量(het-fat)全人抗體技術(shù)，獲得高表達(dá)工程細(xì)胞株，制備出抗血管抑素受體人源化單克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，將羰基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物與抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合制得抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束。然后采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化將廣譜抗癌藥紫杉醇包裹于上述納米膠束中，制得抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束。

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克?。涸囼?yàn)手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。

本發(fā)明中所使用的聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物可以購(gòu)自廠(chǎng)家basf。

一種抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束，所述納米膠束是由抗血管抑素受體單克隆抗體與羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物連接而成，較佳地，所述抗血管抑素受體單克隆抗體與羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的摩爾比為1：500-1：10000，其中，所述抗血管抑素受體單克隆抗體可以為人源化單克隆抗體，該抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束可以應(yīng)用于作為藥物載體中。

上述抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束的制備方法，步驟如下：

⑴采用高效與高通量全人抗體技術(shù)獲取高表達(dá)工程細(xì)胞株，制備抗hai-178特異性人源化抗體，具體方法參見(jiàn)專(zhuān)利200810202087.5的專(zhuān)利公開(kāi)文獻(xiàn)；

⑵聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的結(jié)構(gòu)修飾：

b)羧基化嵌段聚合物p123(ct-p123)的合成與表征；

聚合物表面修飾的具體步驟為：

取聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物，將其溶解于20ml2m氫氧化鈉溶液中，105℃油浴回流反應(yīng)7h，反應(yīng)產(chǎn)物溶液以濃鹽酸調(diào)ph值至2，使用與反應(yīng)產(chǎn)物溶液等體積的二氯甲烷萃取加成反應(yīng)產(chǎn)物溶液，加入無(wú)水硫酸鈉放置過(guò)夜吸除萃取液中所含水分，過(guò)濾，濾液經(jīng)40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，真空干燥過(guò)夜除盡溶劑，得粗產(chǎn)物；將等體積乙醚和粗產(chǎn)物渦旋混合，粗產(chǎn)物沉淀析出，8000rpm離心10min除去溶劑，將等體積石油醚(35.60℃)和離心后粗產(chǎn)物渦旋混合，粗產(chǎn)物再次沉淀析出，8000rpm離心10min除去溶劑，沉淀經(jīng)30℃真空干燥過(guò)夜后即得到純化的ct-p123(羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物即為ct-p123)。羧基化羧基化嵌段聚合物p123(ct-p123)過(guò)程見(jiàn)圖2。

b)ct-p123與抗hai-178特異性人源化抗體的連接：

羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物的羧基與單克隆抗體的氨基連接，將羧基活化劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(edc)與ct-p123溶于純水溶液中，200-300r/min振蕩反應(yīng)15分鐘，加入抗hai-178特異性人源化抗體，其中，抗hai-178特異性人源化抗體與ct-p123的摩爾比為1：500-1：10000，繼續(xù)攪拌1-1.2h，制得未標(biāo)記的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束；

c)¹²⁵i標(biāo)記抗體，測(cè)活度，計(jì)算抗體結(jié)合率(常規(guī)方法)，得¹²⁵i標(biāo)記抗體：

采用常規(guī)方法¹²⁵i標(biāo)記her2單克隆抗體，即得抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束。

一種包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束，所述免疫膠束是由上述抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束作為載體和包裹在該載體中的紫杉醇組成，其中，較佳地，所述抗血管抑素受體單克隆抗體納米膠束與紫杉醇的質(zhì)量比為40-400：1，該包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束可以應(yīng)用在制備抗腫瘤藥物中。

如上所述的包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束的制備方法，步驟如下：

⑴采用如上所述的方法連接羧基化聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物和抗血管抑素受體單克隆抗體，得到抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束；

⑵采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)法將紫杉醇包裹進(jìn)抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束中，所述星點(diǎn)設(shè)計(jì)法的具體步驟為：

步驟⑴的納米膠束的固定載體量為20mg，選擇對(duì)膠束形成有顯著影響的兩個(gè)因素：主藥的投藥量(x1)及水化時(shí)的水相量(x2)進(jìn)行考察，實(shí)驗(yàn)采取兩因素、五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)為在二水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上加上極值點(diǎn)和中心點(diǎn)構(gòu)成，其代碼分別為±1，±a和0，a＝(f)^1/4，f＝2k(k為因素?cái)?shù))；對(duì)于二因素的星點(diǎn)設(shè)計(jì)a＝1.414.確定各因素水平的極大(+a)和極小值(-a)后，±1，0水平的安排遵循任意兩個(gè)物理量之間的極差與對(duì)應(yīng)代碼之間差值成正比的原則安排實(shí)驗(yàn)，將各實(shí)驗(yàn)?zāi)z束用0.22um濾膜過(guò)濾后測(cè)定濾液中藥物的濃度，除以未過(guò)濾膠束中藥物的濃度，為該膠束的載藥量；以載藥量為因變量分別對(duì)各因素及其相互作用進(jìn)行回歸處理，分析各因素對(duì)各效應(yīng)值的影響，選取載藥量較多的工藝條件將紫杉醇包裹進(jìn)抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束中，即得包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束。

上述包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束的相關(guān)檢測(cè)：

⑴采用動(dòng)態(tài)光散射法(dls)等對(duì)制備的納米藥物進(jìn)行表征：

使用malvern公司mastersizer2000型納米粒徑分析儀，采用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定pbs(ph7.4)溶液中抗hif.1qptx免疫膠束的粒徑與粒徑分布。測(cè)定參數(shù)為：光源：he.ne激光；測(cè)定角度：900；溫度：25℃；粘度：0.8872cp；折光系數(shù)：1.33；波長(zhǎng)：633nm；每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定10次，每次10s。

為了達(dá)到在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)即緩釋的目的，膠束必須要有足夠小的粒徑以躲避res系統(tǒng)的識(shí)別與吞噬。利用dls技術(shù)檢測(cè)了pluronicp123膠束、載有紫杉醇的pluronicp123膠束、抗hai-178人源化抗體-ptx免疫膠束及粒徑分布，其粒徑大小分別為19.3±3.1nm，28.2±3.0nm，47.85±6.8nm，粒徑分布見(jiàn)圖3，由圖3可以看出所有膠束的粒徑分布范圍均較窄，粒徑均在50nm以下，雖然具備主動(dòng)靶向性的載藥膠束粒徑有所增大(mwofptx：853.9g/mol)，但仍小于大多數(shù)具主動(dòng)靶向性的藥物載體。

⑵hplc法測(cè)定免疫膠束對(duì)藥物的包封率及隨時(shí)間變化(常規(guī)方法)：使用常規(guī)方法進(jìn)行檢測(cè)；

⑶應(yīng)用之細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：觀察紫杉醇免疫膠束躲避體內(nèi)清除細(xì)胞的能力、進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞的效率與殺傷效應(yīng)，并設(shè)立對(duì)照；

a)采用血漿蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)、巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)探討紫杉醇免疫膠束躲避體內(nèi)清除的能力和機(jī)制；(常規(guī)方法)；

b)fitc標(biāo)記抗體，設(shè)立對(duì)照，觀察紫杉醇免疫膠束進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞的效率(常規(guī)方法)；

c)體外癌細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)，體外毒性(mtt)

人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)使用含10％新生牛血清、100μg/μl青霉素、100μg/μl鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)液，置5％c02、37。c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液隔天更換。收集細(xì)胞鋪種于96孔板，鋪種密度5000個(gè)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)一天，加藥，各孔所加樣液體積均為200μl，依次加入ptx濃度梯度從1到100ng/ml的抗血管抑素受體抗體-ptxpluronicp123免疫膠束(anti-hai178-ptx-pluronicp123)、ptxpluronicp123膠束(nms.ptx)，對(duì)照孔為不含ptx的抗hai178與羧基功能化pluronicp123膠束的僑聯(lián)物(mcabs.nms)、單純羧基功能化pluronicp123膠束(nms)。加樣完畢后置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加2μl濃度為5mg/ml的mttpbs(ph＝7.4)溶液，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入200μl二甲亞砜(dmso)37℃震搖10min以溶解紫色結(jié)晶，酶標(biāo)儀570nm讀取吸光度。

d)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡周期計(jì)算凋亡率(常規(guī)方法)。

⑷藥物動(dòng)力學(xué)研究

a)建立紫杉醇免疫膠束在wistar大鼠體內(nèi)的檢測(cè)方法

b)設(shè)立對(duì)照，對(duì)紫杉醇免疫膠束在wistar大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行研究、靶向效率評(píng)價(jià)。

⑸組織分布學(xué)研究

a)建立紫杉醇免疫膠束在乳腺癌動(dòng)物(balb小鼠乳腺注射mcf-7)各組織中的檢測(cè)方法，乳腺癌小鼠體內(nèi)靶向示蹤顯像采用免疫膠束包載疏水性量子點(diǎn)標(biāo)記，定量分析采用3h同位素標(biāo)記，或羅丹明標(biāo)記。

b)設(shè)立對(duì)照，對(duì)紫杉醇免疫膠束在乳腺癌動(dòng)物體內(nèi)的組織分布過(guò)程進(jìn)行研究。

c)組織靶向性評(píng)價(jià)。

⑹藥效實(shí)驗(yàn)

a)balb小鼠乳腺注射mcf-7建立乳腺癌動(dòng)物模型；

b)采用靜脈注射給藥，設(shè)計(jì)對(duì)照，觀察紫杉醇免疫膠束的抑癌效果。

⑺、安全性評(píng)價(jià)

a)對(duì)紫杉醇免疫膠束的溶血性、血漿蛋白結(jié)合率、ld50實(shí)驗(yàn)、刺激性實(shí)驗(yàn)；

b)紫杉醇免疫膠束對(duì)組織器官的影響實(shí)驗(yàn)，對(duì)關(guān)鍵臟器考慮切片分析。

經(jīng)檢測(cè)，本發(fā)明的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合納米膠束和包裹紫杉醇的抗血管抑素受體單克隆抗體結(jié)合免疫膠束的各檢測(cè)結(jié)果均較優(yōu)，因此其可以應(yīng)用在作為藥物載體方面中，特別是應(yīng)用在制備抗腫瘤藥物中。