本發(fā)明屬于藥學技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物及制備方法。
背景技術(shù)：
胡椒和蓽拔是回族藥學典籍中治療腦卒中方劑中出現(xiàn)頻率最高，用藥量較大的藥對。臨床醫(yī)學研究證明很多含有這個藥物組合的回藥方劑對腦卒中病人神經(jīng)功能損傷都有很好的治療作用?；厮幠X卒中治療方劑特點是藥材種類繁多，無明確的君臣佐使之分，這給回藥腦卒中方劑的現(xiàn)代化開發(fā)利用帶來很大的困擾。文獻整理研究表明，胡椒和蓽拔藥物組合物可能是腦卒中方劑中的核心藥物(類似于中藥中的君藥)。目前對這一理論的支撐研究鮮見。隨著現(xiàn)代藥學學科的快速發(fā)展，有了很多新的研究方法和手段，對腦卒中方劑中主要藥物的活性部位的確定非常有必要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物及制備方法，旨在明確胡椒和蓽拔藥物組合物中發(fā)揮腦卒中治療作用的有效部位，提供有效部位的制備方法，同時確定此有效部位在200mg/kg的劑量下對永久性腦缺血大鼠神經(jīng)功能損傷有明顯的恢復(fù)作用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物的制備方法，所述基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物的制備方法包括：
按照質(zhì)量比1∶1取胡椒和蓽拔藥材，粉碎后采用二氧化碳超臨界設(shè)備萃取，萃取至不出油為止；
將萃取后剩余的藥渣加入多功能提取罐，乙醇回流提取3次；
將提取液過濾后濃縮至無醇味，加3倍量的二氯甲烷萃取3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成流浸膏后放入鼓風干燥箱中烘干既得活性部位。
進一步，所述萃取壓力：300bar；萃取溫度：55℃；分離釜壓力：80bar；分離溫度50℃。
進一步，所述10倍量70％的乙醇回流提取3次，每次2h，提取加熱溫度為90℃。
本發(fā)明提供的基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物及制備方法，采用二氧化碳超臨界技術(shù)去除刺激性較大的極低極性的部位，同時通過二氯甲烷萃取使有效部位不包含糖及其他大極性雜質(zhì)。在小鼠急性毒性實驗中，制備的活性部位在1.5g/kg的劑量下未發(fā)生動物的死亡及其他毒性特征，降低了胡椒和蓽拔組合物自身的刺激性；除longa評分外，此活性部位對永久性腦缺血大鼠的其他神經(jīng)功能癥狀都有不同程度的改善。結(jié)果充分證實所制備的有效部位毒性較低且具有良好的神經(jīng)保護作用。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實施例提供的基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物的制備方法流程圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細的描述。
本發(fā)明實施例的基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物按照質(zhì)量比包括：胡椒和蓽拔＝1∶1。
如圖1所示，本發(fā)明實施例的基于胡椒和蓽拔的治療腦缺血活性部位藥物 的制備方法包括以下步驟：
s101：按照質(zhì)量比1∶1取胡椒和蓽拔藥材，粉碎后采用二氧化碳超臨界設(shè)備萃取，萃取壓力：300bar；萃取溫度：55℃；分離釜壓力：80bar；分離溫度50℃；萃取至不出油為止；
s102：將萃取后剩余的藥渣加入多功能提取罐，加10倍量70％的乙醇回流提取3次，每次2h，提取加熱溫度為90℃；
s103：將提取液過濾后濃縮至無醇味，加3倍量的二氯甲烷萃取3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成流浸膏后放入鼓風干燥箱中65℃烘干既得活性部位。
下面結(jié)合實驗對本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細的說明。
1通過以下的實驗對本發(fā)明的應(yīng)用效果作詳細的說明
1.1永久性大鼠腦缺血模型(pmcao)的建立
大鼠采用7％水合氯醛(0.5ml/100g體重)麻醉后，仰臥固定。剪開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露并分離右側(cè)頸總動脈(cca)、頸外動脈(eca)和頸內(nèi)動脈(ica)。結(jié)扎eca與cca近心端，用動脈夾夾閉ica遠心端，于eca與ica分叉處作一切口，緩慢插入頭部光滑的尼龍線(頭部直徑為0.26mm)，插入深度為17-18mm左右，實現(xiàn)右側(cè)大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。結(jié)扎切口處，剪掉血管外的尼龍線，逐層縫合肌肉皮膚。假手術(shù)組尼龍線插入深度為5mm，其余處理同模型組，動物蘇醒前用37℃的保溫毯維持體溫，蘇醒后立即轉(zhuǎn)入室溫下飼養(yǎng)。
1.2動物分組及剔除
待實驗動物清醒后，進行l(wèi)onga神經(jīng)功能評分，神經(jīng)功能評分標準為：
a.無神經(jīng)功能損傷癥狀，動物正?；顒釉u0分；
b.將動物尾巴提起后，左前肢屈曲1分；
c.將動物放置平板上，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈2分；
d.將動物放置平板上，用手輕推向左側(cè)傾倒3分；
e.動物左側(cè)偏癱，不能自發(fā)行走意識朦朧或喪失4分。
將評分為2的動物納入實驗，所有死亡以及術(shù)后存活時間未達到取材時間要求的大鼠，均不列入。將大鼠隨機分組為模型組，假手術(shù)組(每組10只大鼠)；腦缺血4h后給藥，1次/d，給藥14天。
1.3神經(jīng)功能評分
1.3.1神經(jīng)功能缺損評分
分別于pmcao后3d、6d、9d、12d、14d，按照longa5級評分法對動物進行評分。
1.3.2姿勢反射實驗
分別于pmcao后3d、6d、9d、12d、14d，按照longa5級評分法對動物進行評分。
o分：提鼠尾離開地面約1m，觀察前肢屈曲情況，正常大鼠雙前肢對稱伸向地面。
1分：如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕、肘的屈曲又有肩內(nèi)旋者，與任何數(shù)量的一致的前肢屈曲并沒有其他異常大鼠。
2分：將動物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，正?；蜉p度功能失調(diào)的老鼠在兩個方向上都不平等地滑動。嚴重功能障礙的大鼠持續(xù)減少，側(cè)推向健側(cè)阻力。
3分：大鼠有不停地向左側(cè)轉(zhuǎn)圈者。
1.3.3身體擺動測試
提升鼠尾距地面1m處，分別在第3d、6d、9d、12d和14d對其進行評分。
評分標準：
0分：軀干左右搖擺；
1分：不對稱搖擺＜30℃；
2分：不對稱搖擺＞30℃；
1.3.4橫木行走試驗
橫木長120cm，寬2.0或2.5cm，距地面80cm水平懸空放置。橫木一端連接一個暗盒，以適當噪音刺激大鼠通過橫木。術(shù)前訓(xùn)練7d，分別于pmcao后3d、6d、9d、12d、14d為觀察時間點進行檢測。
評分標準：
6分：順利通過；
5分：通過，但損傷的后肢滑落1次；
4分：滑落超過1次但不到總步數(shù)50％；
3分：滑落次數(shù)超過總步數(shù)50％；
2分：試圖通過橫木，但從橫木上摔下；
1分：能靜臥在橫木上但無法移動；
0分：不能靜臥在橫木上，直接從橫木上摔下；
1.3.5前肢抓握力測試
抓握力量測試評價大鼠腦缺血后前肢抓握力量的大小。測試者提住鼠尾，將大鼠置于拉力儀測試區(qū)域。當測試者拉住鼠尾向后拉拽大鼠時，大鼠試圖以前肢抓握橫桿不放以免從橫桿滑脫。繼續(xù)拖拽大鼠，直至大鼠滑脫，讀取使大鼠滑脫的最大拉力值。分別于pmcao后3d、6d、9d、12d、14d為觀察時間點進行檢測。
1.4統(tǒng)計方法
用spss17.0統(tǒng)計軟件one-wayanova法檢驗，如果方差齊，采用lsd檢驗，如果方差不齊，采用tamhane’st2檢驗，p＜0.05為有統(tǒng)計學意義。
2數(shù)據(jù)支持
2.1急性毒性實驗結(jié)果
在小鼠急性毒性實驗中，制備的有效部位在1.5g/kg的劑量下未發(fā)生動物的死亡及其他毒性特征，可以認為有效部位安全無毒。
2.2活性部位對pmcao大鼠的神經(jīng)保護作用
除longa評分外，活性部位對永久性腦缺血大鼠的其他神經(jīng)功能癥狀都有不同程度的改善。結(jié)果充分證實所制備的活性部位且具有良好的神經(jīng)保護作用。
2.2.1longa評分實驗
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)神經(jīng)功能評分在3-14天均未見明顯降低。
表1活性部位對pmcao大鼠longa評分的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05；(n模型＝12；n活性部位＝9)
2.2.2姿勢反射實驗
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)姿勢反射評分在6，9，12天均明顯降低(p＜0.05；p＜0.01)。
表2活性部位對pmcao大鼠姿勢反射的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05(n模型＝12；n活性部位＝9)
2.2.3身體擺動實驗
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)身體擺動評分在3，6，9，14天均明顯降低(p＜0.05；p＜0.01)。
表3活性部位對pmcao大鼠身體擺動的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05；**p＜0.01(n模型＝12；n活性部位＝9)
2.2.4橫木行走實驗
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)橫木行走評分在3， 6，9天均明顯升高(p＜0.05)。
表4活性部位對pmcao大鼠橫木行走的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05(n模型＝12；n活性部位＝9)
2.2.5抓力測試實驗
結(jié)果顯示，與模型組比較，活性部位組(200mg/kg)抓力值在6，9天明顯高于模型組(p＜0.05；p＜0.01)。
表5活性部位對pmcao大鼠抓力的影響
注：與模型組比較，*p＜0.05；**p＜0.01(n模型＝12；n活性部位＝9)
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。