本發(fā)明屬中藥領(lǐng)域，涉及中藥復(fù)方，具體涉及防治流感及病毒性肺炎的中藥復(fù)方制劑，尤其是用于治療病毒誘導(dǎo)急性肺損傷的復(fù)方藥物。

背景技術(shù)：

研究報(bào)道，病毒性肺炎(viralpneumonia)是由多種病毒感染而引起的肺部炎癥，通常是由上呼吸道病毒感染向下蔓延所致。研究顯示，引起肺炎的病毒以流感病毒為常見(jiàn)，還包括副流感病毒，巨細(xì)胞病毒、腺病毒、鼻病毒、冠狀病毒和某些腸道病毒等也可導(dǎo)致病毒性肺炎。甲型流感病毒是引起人和禽類(lèi)呼吸道疾病的重要病原體。流感病毒侵入細(xì)支氣管上皮引起細(xì)支氣管炎，感染波及肺間質(zhì)與肺泡而致肺炎；流感病毒一方面在呼吸道上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，損傷肺組織，破壞氣體交換屏障；另一方面，通過(guò)巨噬細(xì)胞、分葉核中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等釋放大量細(xì)胞因子，宿主免疫機(jī)制被過(guò)度激活并失控，導(dǎo)致急性肺損傷(孫婉容，吳琦，邵世峰.國(guó)際呼吸雜志，2011，14:1094-1096)。研究報(bào)道，在機(jī)體抗病毒感染免疫的過(guò)程中，早期起作用的是以巨噬細(xì)胞、干擾素和nk細(xì)胞為主的非特異性免疫，后期則是特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫起作用；在流感病毒感染的過(guò)程中，單核/巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，以網(wǎng)絡(luò)的形式在調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中起著重要作用(侯佩莉，張茂林，李影，關(guān)振宏.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010,10：108-112)。

甲型h1n1流感是由a型流感病毒(influenzaavirus，iav)引起的一種急性呼吸道傳染病，該a型流感病毒是病毒性肺炎的常見(jiàn)病原微生物，調(diào)查顯示，人群對(duì)甲型h1n1流感病毒普遍易感，通常表現(xiàn)為流感樣癥狀，少數(shù)病例病情進(jìn)展迅速，出現(xiàn)呼吸衰竭，病情嚴(yán)重者可以導(dǎo)致死亡。在流感重癥臨證中，中醫(yī)顏乾麟認(rèn)為疫癘之邪，從口鼻侵犯人體，病勢(shì)強(qiáng)悍，傳變迅猛的特點(diǎn)，尤為強(qiáng)調(diào)攻邪不傷正；在臨證中寒溫藥物同用，扶正達(dá)邪，一則提高機(jī)體衛(wèi)外抗邪能力，再則注意顧護(hù)人體脾胃之氣；運(yùn)用此法，在長(zhǎng)期臨床過(guò)程中反復(fù)實(shí)踐，每獲殊效， 故創(chuàng)制寒溫藥物并用的中藥復(fù)方羌英方。

流感病毒誘導(dǎo)的病毒性肺炎主要病理改變是肺泡水平的氣體交換障礙，病毒感染后所致的急性肺損傷(acutelunginjury,ali)可引發(fā)患者出現(xiàn)呼吸窘迫和嚴(yán)重的低氧血癥。研究表明單核細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡水腫是形成肺毛細(xì)血管通透性增高及肺水腫的病理基礎(chǔ)，病毒感染誘發(fā)的肺損傷，臨床表現(xiàn)為呼吸困難，嚴(yán)重的可以導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征，甚至死亡。本發(fā)明證實(shí)了羌英湯對(duì)甲型流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠具有保護(hù)作用。

綜觀國(guó)內(nèi)外的研究，均未見(jiàn)報(bào)道羌英湯治療病毒誘導(dǎo)急性肺損傷的藥效及其藥物研究。本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供中藥羌英湯在用于制備防治甲型流感及病毒性肺炎的藥物中的新的藥用用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種防治流感及病毒性肺炎的中藥復(fù)方制劑，具體涉及防治甲型流感及病毒性肺炎的中藥復(fù)方制劑，尤其是用于治療病毒誘導(dǎo)急性肺損傷的復(fù)方藥物。

本發(fā)明所述的復(fù)方制劑由羌活，蒼術(shù)，蒲公英，黃芩，生黃芪，防風(fēng)，魚(yú)腥草，天花粉八味中藥材制成；其中，羌活為君，發(fā)汗達(dá)邪，祛風(fēng)燥濕；蒲公英，黃芩，魚(yú)腥草，天花粉為臣，清熱解毒燥濕；黃芪，防風(fēng)，蒼術(shù)為佐使藥，益氣固表。全方發(fā)汗達(dá)邪，清熱解毒，補(bǔ)脾實(shí)衛(wèi)，發(fā)汗而不峻猛，達(dá)邪不傷正，清熱解毒但顧護(hù)脾胃之本，以李東垣《內(nèi)外傷辨惑論》中指出“脾胃一虛，肺氣先絕”為指導(dǎo)，活用黃芪、蒼術(shù)，一來(lái)托表達(dá)邪，再則“先安未受邪之地”。所述的復(fù)方制劑集中體現(xiàn)了內(nèi)外因兼顧，標(biāo)本同治，散中寓補(bǔ)，補(bǔ)內(nèi)兼疏的治療思路。

本發(fā)明的實(shí)施例中，所述的復(fù)方制劑的中藥材按下述重量比例配伍組成：羌活5g；蒼術(shù)10g；蒲公英20g；黃芩10g；黃芪20g；防風(fēng)5g；魚(yú)腥草10g；天花粉15g，進(jìn)一步制備本發(fā)明復(fù)方制劑凍干粉。

基于中醫(yī)在流感重癥臨證中，認(rèn)為重癥h1n1流感屬邪盛正虛，虛實(shí)夾雜之證，濕熱毒邪為其病理因素，自擬益氣固表，清熱燥濕解毒進(jìn)行治療。

本發(fā)明采用復(fù)方制劑中藥材水提物，經(jīng)整體動(dòng)物模型試驗(yàn)證實(shí)，其針對(duì)h1n1甲型流感病毒毒株誘導(dǎo)的小鼠肺急性損傷模型，具有顯著增加病毒感染 鼠的存活率，改善體重，減輕肺部的炎性損傷，降低病毒效價(jià)，抑制炎性細(xì)胞因子、趨化因子及nfκb炎性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)的藥效，能顯著治療流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所述的復(fù)方制劑不僅能抑制流感病毒在鼠肺內(nèi)的復(fù)制，還能減輕病毒感染造成的炎性免疫損傷；其保護(hù)病毒誘導(dǎo)肺損傷的作用機(jī)制與抗病毒、抗炎有關(guān)，通過(guò)降低肺毛細(xì)血管通透性、減少淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性蛋白的招募發(fā)揮的抑制肺部炎癥。

本發(fā)明所述的復(fù)方制劑可用于治療甲型流感及其誘導(dǎo)的病毒性肺炎。

本發(fā)明中，所述的甲型流感包括但不限于h1n1，h3n2等病毒株。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述的復(fù)方制劑可用于制備預(yù)防流感及病毒性肺炎的藥物。

本發(fā)明中，所述的病毒性肺炎，包括但不限于甲型流感病毒誘導(dǎo)的肺炎，也可用于其它病毒誘導(dǎo)的病毒性肺炎。

附圖說(shuō)明

圖1，本發(fā)明的復(fù)方制劑對(duì)h1n1病毒感染生存保護(hù)及體重的的影響。

圖2，本發(fā)明的復(fù)方制劑對(duì)h1n1病毒感染鼠肺病理形態(tài)學(xué)的影響；

其中，a：正常組；b：利巴韋林組；c：本復(fù)方制劑組；d：拆方組；e：模型組。

圖3，本發(fā)明的復(fù)方制劑湯對(duì)h1n1病毒感染鼠指數(shù)的影響。

圖4，本發(fā)明的復(fù)方制劑對(duì)h1n1病毒感染鼠肺血凝滴度的影響。

圖5，本發(fā)明的復(fù)方制劑對(duì)h1n1病毒感染鼠勻漿tnf-α的作用。

圖6，本發(fā)明的復(fù)方制劑對(duì)h1n1病毒感染鼠勻漿il-6的作用。

圖7，本發(fā)明的復(fù)方制劑對(duì)h1n1病毒感染鼠肺勻漿ccl5的作用。

圖8，本發(fā)明的復(fù)方制劑湯對(duì)h1n1病毒感染鼠肺nfκb表達(dá)的抑制作用，

其中，a：正常組；b：利巴韋林組；c：本復(fù)方制劑組；d：拆方組；e：模型組。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1制備本發(fā)明復(fù)方制劑凍干粉：

取中藥材羌活5g；蒼術(shù)10g；蒲公英20g；黃芩10g；黃芪20g；防風(fēng)5g；魚(yú)腥草10g；天花粉15g，按常規(guī)方法制成中藥飲片；

取中藥飲片置于電動(dòng)煎藥壺內(nèi)，加相當(dāng)于藥材量5倍的礦泉水浸泡1小時(shí)，大火煮沸30min，紗布過(guò)濾。藥渣再加6倍重量礦泉水繼續(xù)煎煮，煮沸20min，過(guò)濾；合并兩次濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(0.095mpa，50℃)真空減壓濃縮，濃縮蒸干至浸膏；再將浸膏放入冷凍干燥機(jī)(133pa，-25℃)，制備凍干粉，提取率為24％，分裝，-80℃凍存。

實(shí)施例2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

balb/c小鼠60只(16-18g),按體重隨機(jī)分為5組(a、b、c、d，e)：a組為正常對(duì)照組，b組為h1n1病毒模型組，c組為本復(fù)方制劑組(40mg/kg)，d組為拆方對(duì)照組(mg/kg)，e組為利巴韋林100mg/kg，每組12只；除a組外的所有組動(dòng)物經(jīng)乙醚麻醉，滴鼻感染10ld50h1n1病毒液30μl，a組滴鼻感染1640培養(yǎng)液30μl作為對(duì)照；c、d、e組感染h1n1后2小時(shí)灌胃給藥，劑量分別為羌英方和利巴韋林100mg/kg；同時(shí)a組與b組給予0.5％cmc灌胃給藥，作為正常和病毒對(duì)照，一天給藥一次，連續(xù)給藥七天，停藥觀察到14天，每天記錄動(dòng)物的體重、存活數(shù)量及死亡數(shù)，計(jì)算藥物對(duì)重癥流感感染鼠的生命保護(hù)率及體重變化。

實(shí)施例3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

balb/c小鼠40只(16-18g)，實(shí)驗(yàn)分組、感染劑量及給藥方案同實(shí)施例2；除a組外的所有組動(dòng)物經(jīng)乙醚麻醉，滴鼻感染10ld50h1n1病毒液30μl，c、d、e組感染h1n1后2小時(shí)灌胃給藥，劑量分別為羌英方、拆方和利巴韋林100mg/kg；同時(shí)a組與b組給予0.5％cmc灌胃給藥，一天給藥一次，連續(xù)給藥四天，h1n1病毒攻擊96h后，稱(chēng)量體重，摘眼球取血，取全肺標(biāo)本常規(guī)處理后稱(chēng)重記錄；其中右肺上葉置于10％福爾馬林中；右肺中葉、下葉及左肺右肺下葉，用生理鹽水漂洗干凈，置于-80℃保存；凍存的肺組織之后 使用預(yù)冷的pbs，用勻漿器在冰浴中勻漿，收獲勻漿液，離心，收集上清，分裝，-80℃保存，用于檢測(cè)炎性細(xì)胞因子及趨化因子等指標(biāo)。

實(shí)施例4本復(fù)方制劑對(duì)重癥h1n1甲型流感病毒感染鼠的生存保護(hù)試驗(yàn)：

選用balb/c小鼠，以h1n1甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒誘導(dǎo)重癥肺損傷模型，給藥7天，停藥觀察7天，觀察本復(fù)方制劑對(duì)重癥流感感染鼠的14天觀察期的生命保護(hù)作用，結(jié)果證實(shí)，口服本復(fù)方制劑后，能提高重癥流感病毒感染鼠的生命率，增加小鼠體重，具有生命保護(hù)作用。

實(shí)施例5治療h1n1甲型流感病毒誘導(dǎo)急性肺損傷試驗(yàn)

選用balb/c小鼠，以h1n1甲型流感病毒滴鼻感染，建立流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷模型，本復(fù)方制劑灌胃給藥，96h后觀察動(dòng)物肺炎性損傷程度及炎性細(xì)胞因子、趨化因子，nfκb蛋白表達(dá)等指標(biāo)，結(jié)果證實(shí)口服本復(fù)方制劑后，對(duì)h1n1流感病毒誘導(dǎo)急性小鼠肺損傷有顯著的保護(hù)作用。

實(shí)施例6對(duì)病毒誘導(dǎo)鼠肺急性損傷的抗炎相關(guān)研究指標(biāo)檢測(cè)方法

1)肺指數(shù)

病毒感染第四天，動(dòng)物稱(chēng)重，常規(guī)處理取肺臟稱(chēng)重，以此為肺濕重；計(jì)算肺指數(shù)，肺指數(shù)＝肺濕重(mg)/體重(g)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，本復(fù)方制劑可顯著抑制小鼠肺指數(shù)的增高(p<0.01)；

2)肺勻漿血凝效價(jià)測(cè)定

根據(jù)流感病毒上的血凝素ha能與雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)的原理，評(píng)價(jià)病毒毒力的強(qiáng)弱；取肺勻漿液，高速離心獲得上清液，將等倍系列稀釋的勻漿液與u型96孔板內(nèi)1％雞紅血球混合，靜置觀察，記錄發(fā)生雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集的稀釋度即該肺組織勻漿的血凝效價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，20mg/kg和40mg/kg本復(fù)方制劑可顯著抑制病毒感染鼠肺中血凝素的效價(jià)升高(p<0.05，p<0.01)，說(shuō)明能有效抑制病毒在鼠肺中的復(fù)制；

3)肺勻漿tnf-α、il-6、ccl5測(cè)定

小鼠肺勻漿液，高速離心收獲上清，分裝，凍存。應(yīng)用elisa法，將勻漿上 清按tnf-α、il-6、ccl5試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，結(jié)果顯示，與模型組相比，本復(fù)方制劑可顯著降低鼠肺中干促炎因子/趨化因子tnf-α、il-6、ccl5水平的升高(p<0.05)；

4)肺組織nfkb蛋白表達(dá)的檢測(cè)

將切好的4um厚的肺組織白片放在玻片架上置于烘箱烘烤30分鐘，脫蠟入水，將玻片架用0.01m的pbs浸泡5分鐘，然后放在97℃水浴加熱的edta抗原修復(fù)液ph8.0里進(jìn)行抗原修復(fù)12分鐘，將放置室溫的玻片用pbs浸泡5分鐘，然后放入pbs浸泡5分鐘，之后3％h2o2的甲醇溶液中10分鐘；將玻片架放置在pbs浸泡5分鐘，反復(fù)3次，然后將玻片上過(guò)多的水分用吸水紙擦去，加100ul的血清37℃孵育30分鐘，擦去過(guò)多的血清，加入磷酸化nfkb一抗4℃孵育過(guò)夜，室溫復(fù)溫45分鐘，然后用pbs浸泡5分鐘，反復(fù)3次，再滴加hrp標(biāo)記的二抗，37℃孵育30分鐘。用pbs清洗5分鐘，反復(fù)3次，滴加dab顯色，再用蘇木素復(fù)染30-45秒，沖洗后，用0.5％-1％的鹽酸酒精分化1-2秒，迅速放置流水里沖洗，將玻片架分別放在70％酒精，80％酒精，90％酒精，100％酒精；二甲苯，二甲苯，二甲苯；用中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察結(jié)果，甲型流感病毒感染可以導(dǎo)致p-nfkb大量的表達(dá)，表明口服本復(fù)方制劑能顯著抑制炎性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本復(fù)方制劑對(duì)流感病毒h1n1誘導(dǎo)的急性肺損傷均有顯著治療作用；可顯著提高重癥流感病毒感染小鼠的生存率，降低肺指數(shù)(肺組織濕重/體重比值)和血凝素效價(jià)、抑制肺內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子(包括tnf-α、il-6、ccl5)的釋放，并且抑制炎癥核轉(zhuǎn)錄因子nfκb的表達(dá)。