本發(fā)明屬藥物制藥領(lǐng)域，涉及人胰腺癌干細(xì)胞shh信號(hào)通路抑制劑，具體涉及黃芩素作為shh信號(hào)通路抑制劑在制備治療癌胰腺癌藥物的用途。

背景技術(shù)：

胰腺癌預(yù)后極差，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康已成為共識(shí)，研究顯示，胰腺癌腫瘤中有胰腺癌干細(xì)胞(cscs)的存在，胰腺癌干細(xì)胞(cscs)是一群具有類(lèi)似干細(xì)胞功能的腫瘤細(xì)胞，其高惡性潛能體現(xiàn)在可無(wú)限制的自我更新、可分化成不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞，從而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及放、化療耐藥，最終影響患者預(yù)后生存。已有研究表明胰腺癌干細(xì)胞對(duì)臨床預(yù)后起著決定性作用，瘤體中富含胰腺癌干細(xì)胞的患者往往預(yù)示著較短的生存期與較高的腫瘤復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率。有研究顯示sonichedgehog信號(hào)通路在胰腺癌干細(xì)胞呈現(xiàn)高表達(dá)，廣泛地參與了胰腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)功能。靶向調(diào)控sonichedgehog信號(hào)通路能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)生存期，具有良好的臨床前景。

有研究以″濕熱蘊(yùn)結(jié)″為核心的胰腺癌病機(jī)理論假說(shuō)，確立″清熱化濕″法用中藥復(fù)方清胰化積(qyhj)方治療胰腺癌，結(jié)果顯示：臨床療效明顯，約8％晚期胰腺癌患者獲得5年以上帶瘤生存，但其長(zhǎng)期帶瘤生存作用機(jī)制尚未明確。

基于此，本申請(qǐng)的發(fā)明人擬針對(duì)所述中藥復(fù)方中的有效成分尤其是其中的單體黃芩素探索對(duì)腫瘤干細(xì)胞及sonichedgehog信號(hào)通路的可能調(diào)控作用，進(jìn)一步提供黃芩素作為shh信號(hào)通路抑制劑在制備治療癌胰腺癌藥物的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的為提供黃芩素在制備shh信號(hào)通路抑制劑制中的新用途，尤其涉及黃芩素作為shh信號(hào)通路抑制劑在制備治療癌胰腺癌藥物的用途。

本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行中藥復(fù)方清胰化積(qyhj)方中不同單體的抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)，利用cck-8法評(píng)估qyhj方中常見(jiàn)的八種單體：野黃芩苷、黃芩素、槲皮素、木犀草素、芹菜素、熊果酸、齊墩果酸和山奈酚對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，抑制胰腺癌干細(xì)胞增殖，其機(jī)理與下調(diào)胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)，核轉(zhuǎn)錄因子sox-2、nanog表達(dá)，抑制sonichedgehog信號(hào)通路相性等，結(jié)果顯示，在相同濃度的條件下，黃芩素對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用最為明顯。

本發(fā)明所述的黃芩素具有式(i)的結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明進(jìn)一步采用黃芩素對(duì)人胰腺癌panc-1干細(xì)胞的調(diào)控作用及對(duì)sonichedgehog信號(hào)通路的影響進(jìn)行試驗(yàn)：

采用cck-8檢測(cè)細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞比例變化，含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)成球?qū)嶒?yàn)測(cè)定胰腺癌干細(xì)胞自我更新能力；westernblot檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物及sonichedgehog信號(hào)通路成員蛋白表達(dá)變化；復(fù)制荷人胰腺癌panc-1干細(xì)胞移植瘤裸鼠，采用免疫組織化學(xué)分析對(duì)抑瘤效果及胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物及sonichedgehog信號(hào)通路成員蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)；

結(jié)果顯示，黃芩素可顯著下調(diào)panc-1胰腺癌細(xì)胞，48h的ic50為37.27um呈劑量依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)性，細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱；黃芩素可顯著下調(diào)cd44⁺/cd24⁺panc-1胰腺癌細(xì)胞活力，黃芩素干預(yù)后panc-1胰腺癌干細(xì)胞在含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基中的腫瘤干細(xì)胞球數(shù)目明顯減少(p＜0.01)；胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物cd24、cd44蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，核轉(zhuǎn)錄因子oct-4、sox-2蛋白水平表達(dá)亦減少，shh、ptch-1、smo、gli2均受到抑制，gli2rnai后，oct-4、sox-2蛋白水平表達(dá)亦減少；實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，黃芩素通過(guò)調(diào)控sonichedgehog信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制胰腺癌干細(xì)胞自我更新，可用于制備shh信號(hào)通路抑制劑制，進(jìn)一步，黃芩素可作為shh信號(hào)通路抑制劑制備治療癌胰腺癌的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1，黃芩素抑制panc-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，a：不同濃度黃芩素干預(yù)24h，48h和72h對(duì)panc-1細(xì)胞活力的影響；b：劃痕實(shí)驗(yàn)觀察黃芩素對(duì)人胰腺癌panc-1細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力的影響。

圖2顯示了黃芩素下調(diào)人胰腺癌panc-1細(xì)胞干細(xì)胞比例，抑制胰腺癌干細(xì)胞自我更新能力，其中，a不同濃度黃芩素干預(yù)24h，48h和72h對(duì)panc-1干細(xì)胞活力的影響；b為黃芩素干預(yù)3d后對(duì)panc-1細(xì)胞細(xì)胞中胰腺癌干細(xì)胞成球能力的影響。

圖3顯示了流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各個(gè)胰腺癌細(xì)胞系檢測(cè)結(jié)果，其中，a：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)cd44+/cd24+panc1細(xì)胞最多；b為干細(xì)胞hedgehog信號(hào)通路各成員的蛋白表達(dá)結(jié)果；c為panc1干細(xì)胞在細(xì)胞成球呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性。

圖4顯示了黃芩素下調(diào)人胰腺癌panc-1細(xì)胞干細(xì)胞比例并對(duì)人胰腺癌panc1干細(xì)胞表面標(biāo)志物的調(diào)控作用，其中，a：不同濃度姜黃素干預(yù)48h后panc-1細(xì)胞中胰腺癌干細(xì)胞(cd24+cd44+細(xì)胞)比例的變化**與dmso對(duì)照組比較，p＜0.01；b：對(duì)照組和不同黃芩素干預(yù)組干預(yù)后瘤體克隆形成能力變化；c：黃芩素顯著性下調(diào)胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物cd24、cd44、cd133，黃芩素顯著性下調(diào)sonichedgehog信號(hào)通路成員shh，ptch1，smo和核轉(zhuǎn)錄因子gli-2蛋白表達(dá)。

圖5顯示了黃芩素對(duì)人胰腺癌panc1干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路sonichedgehog信號(hào)通路表達(dá)的影響。

圖6，黃芩素對(duì)人胰腺癌panc1干細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤增殖的影響，其中顯示了不同治療組腫瘤生長(zhǎng)情況，a為不同治療組瘤塊大小示意圖；b，不同治療組腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

圖7，8，9顯示了黃芩素對(duì)裸鼠原位移植瘤胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物及sonichedgehog信號(hào)通路成員蛋白表達(dá)表達(dá)的影響及分別的對(duì)照組、低劑量組和高劑量的評(píng)分。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞

人胰腺癌panc-1細(xì)胞系購(gòu)自atcc(americantypeculturecollection)。

1.2動(dòng)物

balb/c裸鼠，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)碼：scxk(滬)2007～0005，4周齡，體重：18～22g；雌性；飼養(yǎng)于spf級(jí)環(huán)境中。

1.2.主要試劑

1.2.1單體：中藥單體黃芩素均購(gòu)自上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心。1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及體外檢測(cè)相關(guān)試劑：rpmi1640、胎牛血清試劑購(gòu)自gibco或hyclon公司，谷氨酰胺購(gòu)自hyclon公司，青鏈霉素雙抗、丙酮酸鈉購(gòu)自sigma公司。bfgf，egf，b27購(gòu)自invitrogen公司。

1.2.3體外增殖檢測(cè)試劑盒wst-8basedcolorimetricassaycellcountingkit8(cck-8)購(gòu)自日本本同仁化學(xué)研究所。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)試劑：細(xì)胞凋亡檢測(cè)annexinv/pi試劑盒購(gòu)自invitrogen公司，cd24-pe抗體，cd44-apc抗體購(gòu)自bd公司。

1.2.5westenbblot相關(guān)試劑：哺乳動(dòng)物蛋白提取試劑盒、pmfs、蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(bca法)、sds-page凝膠配制試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。兔抗人shh，ptch1，gli購(gòu)自cellsignallingtechnology公司。鼠抗人smo多克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔igg二抗購(gòu)自santacruz公司。封閉液為脫脂奶粉溶于1×tpbs，終濃度5％。pvdf膜(0.22μm)購(gòu)自millipore公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

二、實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

panc-1細(xì)胞用含有10％胎牛血清、2mml-谷氨酰胺、1％的青鏈霉素雙抗、1mm丙酮酸鈉的rpmi1640進(jìn)行培養(yǎng)，所有細(xì)胞均在37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換培液一次。傳代時(shí)用0.25％的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2cck-8法檢測(cè)黃芩素素對(duì)細(xì)胞活力的影響

黃芩素干預(yù)濃度為0um，2um，4um，8um，16um，32um，64um，128um，256um干預(yù)24h，48h和72h。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞比例

將單細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為2×10⁵/ml，鋪6孔板，1ml/孔。黃芩素干預(yù)48h后，胰酶消化，用含2％胎牛血清的rpmi-1640沖洗2次，每次5分鐘1000rpm，重新懸浮于100μl含2％胎牛血清的rpmi-1640中，調(diào)整濃度為10⁶/100μl。加入20ulcd24-pe，20ulcd44-apc流式抗體冰上孵育30min，用含2％胎牛血清的rpmi-1640沖洗2次，每次5分鐘1000rpm，重新懸浮于100μl含2％胎牛血清的rpmi-1640中。以不加抗體加4’，6二脒基-2-苯吲哚鹽酸(dapi)(1μl/ml終濃度)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。流式細(xì)胞儀分析胰腺癌干細(xì)胞比例變化情況。

2.4無(wú)血清培養(yǎng)成球?qū)嶒?yàn)

以干細(xì)胞培養(yǎng)液(無(wú)血清，含bfgf20ug/ml，egf10ug/ml，b2750×)調(diào)整細(xì)胞濃度為500/ml，接種于超低粘附6孔板中，每孔2ml，每隔3-4天換液一次。1周后計(jì)數(shù)克隆球形成數(shù)。評(píng)價(jià)克隆形成率變化情況。

2.5westernblot檢測(cè)

蛋白印跡法檢測(cè)黃芩素干預(yù)panc-1胰腺癌干細(xì)胞48h后細(xì)胞表面標(biāo)志物、核轉(zhuǎn)錄因子、sonichedgehog信號(hào)通路成員蛋白水平表達(dá)情況.

2.6人panc-1胰腺癌干細(xì)胞裸鼠原位移植模型的建立

裸鼠panc-1胰腺癌干細(xì)胞皮下移植瘤模型的建立在超凈鏡臺(tái)內(nèi)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以tb空針將細(xì)胞懸液注入實(shí)驗(yàn)裸鼠左側(cè)下肢近腋窩處，每只鼠皮下接種0.2ml，含細(xì)胞數(shù)2x10⁶個(gè)/只，4周后出現(xiàn)粟粒大的皮下移植瘤后開(kāi)始治療實(shí)驗(yàn)。

2.6.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

待瘤體積約50至60mm時(shí)進(jìn)行分組：(1)對(duì)照組：生理鹽水灌胃0.2ml；(2)黃芩素低劑量組：每只裸鼠按20mg/kg，腹腔注射，0.2ml/次；(3)黃芩素高劑量組：每只裸鼠按60mg/kg，腹腔注射，0.2ml/次2.6.2腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)

自各治療組分組之日起，觀察成瘤生長(zhǎng)情況，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小(測(cè)量其長(zhǎng)徑(a)和垂直橫徑(b)，隔天測(cè)量一次。按公式v＝0.52×a×b2計(jì)算腫瘤體積，描繪腫瘤體積增長(zhǎng)曲線(xiàn))。

2.6.3抑瘤率

脫頸處死，剝離瘤塊，稱(chēng)取瘤重，計(jì)算抑瘤率：抑瘤率(％)＝對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重×100％。

2.6.4免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)。首先將染色強(qiáng)度打分：0分為無(wú)色，：1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色(染色深淺需與背景著色相對(duì)比)。再將陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比打分：0分為陰性，1分為陽(yáng)性細(xì)胞≤10％，2分為11％-50％，3分為51％-75％，4分為＞75％。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積分才算免疫反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)軟件spss17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示，進(jìn)行多樣本均數(shù)間比較的單因素方差分析，方差齊時(shí)，采用lsd法，方差不齊時(shí)，采用games-howell法，p＜0.05提示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：

黃芩素干預(yù)可明顯抑制panc-1細(xì)胞增殖，細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱，panc-1細(xì)胞經(jīng)濃度為0um，2um，4um，8um，16um，32um，64um，128um，256um的黃芩素干預(yù)后，細(xì)胞活力呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性下降，黃芩素干預(yù)panc-1細(xì)胞48h的ic50為37.27um(如圖1所示)；

黃芩素干預(yù)可明顯抑制cd44+/cd24+panc-1細(xì)胞增殖，panc-1細(xì)胞經(jīng)濃度為0um，2um，4um，8um，16um，32um，64um，128um，256um的黃芩素干預(yù)后，細(xì)胞活力呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性下降。黃芩素干預(yù)cd44+/cd24+panc-1細(xì)胞48h的ic50為42.16um(如圖2所示)；

利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各個(gè)胰腺癌細(xì)胞系進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在胰腺癌細(xì)bxpc3、panc1、sw1990胞系中，均高表達(dá)cd44+和cd133，表達(dá)量都在70％以上，三染后的細(xì)胞主要由cd24+細(xì)胞組成；流式結(jié)果顯示，3種3×107細(xì)胞系中cd44+/cd24+panc1細(xì)胞分選最多，結(jié)合westernblot檢測(cè)人胰腺癌bxpc3、panc1、sw1990干細(xì)胞hedgehog信號(hào)通路各成員的蛋白表達(dá)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)采用人panc1胰腺癌干細(xì)胞作為模型進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，panc1胰腺癌干細(xì)胞在細(xì)胞成球呈現(xiàn)時(shí)間依賴(lài)性(如圖3所示)；

黃芩素下調(diào)人胰腺癌panc-1細(xì)胞干細(xì)胞比例并對(duì)人胰腺癌panc1干細(xì)胞表面標(biāo)志物的調(diào)控作用，在cd44+/cd24+panc1細(xì)胞中，dmso對(duì)照組胰腺癌干細(xì)胞比例為12.8±0.53％，而不同濃度(10um，30um和60um)黃芩素干預(yù)后，胰腺癌干細(xì)胞比例均呈不同程度的下降，cd24+/cd44+分別為11.2±0.03％，8.7±0.31％和6.5±0.25％，均明顯低于對(duì)照組(p＜0.01)，此外，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)42.16um濃度的黃芩素干預(yù)28天后克隆形成數(shù)目得出了一致的結(jié)果；westernblot檢測(cè)不同治療組人胰腺癌panc1干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況，結(jié)果顯示黃芩素下調(diào)胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物cd24、cd44、cd133和核轉(zhuǎn)錄因子oct-4、sox-2蛋白的表達(dá)(如圖4所示)；

gli2rnai后對(duì)人胰腺癌panc1干細(xì)胞表面標(biāo)志物的調(diào)控作用結(jié)果顯示，gli2rnai后，oct-4、sox-2蛋白水平表達(dá)及免疫熒光共聚焦表達(dá)亦減少；黃芩素通過(guò)調(diào)控sonichedgehog信號(hào)通路來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖(如圖5所示)；黃芩素對(duì)人胰腺癌panc1干細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤增殖的影響，結(jié)果顯示，成功建立胰腺癌干細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型后，隨機(jī)分成3個(gè)組進(jìn)行干預(yù)，分別為對(duì)照組、低劑量組、高劑量組。藥物干預(yù)過(guò)程中，裸鼠狀態(tài)良好。干預(yù)三周后，對(duì)照組瘤塊重量達(dá)1.97±0.07g、低劑量組瘤塊重量達(dá)1.68±0.06g，腫瘤生長(zhǎng)抑制率為14.72％；高劑量組瘤塊重0.76±0.03g，腫瘤生長(zhǎng)抑制率為61.42％(如表1，圖6所示)；

表1

表1中，各治療組與對(duì)照組比較結(jié)果；**高劑量組與低劑量組比較結(jié)果；

對(duì)裸鼠原位移植瘤胰腺癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物及sonichedgehog信號(hào)通路成員蛋白表達(dá)表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)照組、低劑量組和高劑量的評(píng)分分別為(如表2、圖7所示)；cd24：對(duì)照組、低劑量組與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01)cd44：與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)cd133：與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)

表2

其中：cd24：※與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01)＊與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01)cd44：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)cd133：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)；

對(duì)照組、低劑量組和高劑量的評(píng)分分別為(如表3、圖8所示)；oct-4：對(duì)照組、低劑量組與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01).低劑量組與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01)；sox-2：對(duì)照組、低劑量組與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01).低劑量組與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01)。nanog：與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)；

表3

其中：oct-4：※與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01)＊與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01)sox-2：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)nanog：※與對(duì)照組比較有顯著差異，p＜0.01；

對(duì)照組、低劑量組和高劑量的評(píng)分分別為(如表4所示)；shh：低劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01).低劑量組與高劑量組比較有差異(p＜0.05).ptch1：低劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01).低劑量組與高劑量組比較有差異(p＜0.05)smo：低劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01).低劑量組與高劑量組比較有差異(p＜0.05)

表4

其中：oct-4：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)＊與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.05)sox-2：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)＊與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.05)nanog：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)＊與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.05)；

對(duì)照組、低劑量組和高劑量的評(píng)分分別為(如表5、圖9所示)；gli1：低劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01).低劑量組與高劑量組比較有差異(p＜0.05)gli2：低劑量組、高劑量組與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01).低劑量組與高劑量組比較有差異(p＜0.01).cd133：與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)

表5

其中：gli1：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)＊與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.05)gli2：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)＊與高劑量組比較有顯著差異(p＜0.01).gli3：※與對(duì)照組比較有顯著差異(p＜0.01)。