本申請(qǐng)請(qǐng)求Lali K.MEDINA-KAUWE等人于2014年1月17日提交的且名稱為“c-MET TARGETING CONSTRUCT AND USES THEREOF”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/928,903，該專利的全部公開內(nèi)容(包括附圖)以引用的方式并入本文。

政府權(quán)利

本文公開的主題是在國(guó)家健康研究所/國(guó)家癌癥研究所授予的基金CA140995和CA129822下由政府支助所進(jìn)行。政府對(duì)所公開主題具有某些權(quán)利。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)的領(lǐng)域。特定而言，本發(fā)明涉及將治療劑遞送至靶細(xì)胞(諸如癌細(xì)胞)的組合物。

發(fā)明背景

抵抗臨床中所用的當(dāng)前靶向治療或獲得對(duì)該其靶向治療的耐受性的許多腫瘤顯示出蛋白質(zhì)(諸如c-Met)的表面水平升高。例如，肺癌獲得對(duì)EGF-R抑制劑(諸如Tarceva)的耐受性。諸如Tarceva之類抑制劑旨在阻斷受體酪氨酸激酶的活性(稱為酪氨酸激酶抑制劑，或TKI's)，但大多數(shù)情況對(duì)TK抑制不響應(yīng)。這些腫瘤的特征在于細(xì)胞表面蛋白質(zhì)(諸如c-Met)水平升高，并且因此變成用于本文所述治療方法的極好候選者，該方法可靶向過(guò)表達(dá)蛋白質(zhì)并且滲透腫瘤細(xì)胞。

本領(lǐng)域中，目前正試圖研發(fā)出旨在阻斷通過(guò)c-Met的信號(hào)的c-Met抗體或抑制劑。然而，過(guò)往歷史表明大多數(shù)情況將對(duì)信號(hào)阻斷抗體或小分子無(wú)響應(yīng)，因?yàn)樵撃[瘤采用替代性方式來(lái)連續(xù)增生，而不論信號(hào)抑制如何。

本文所述組合物規(guī)避了使用細(xì)胞表面受體(例如c-Met)作為入口來(lái)將毒性分子遞送至腫瘤細(xì)胞中并且從內(nèi)部殺死腫瘤以便阻斷信號(hào)的需要。配體導(dǎo)向遞送允許靶向結(jié)合至對(duì)特定細(xì)胞表面受體(例如c-Met)呈陽(yáng)性的腫瘤，并且遞送分子中的膜滲透結(jié)構(gòu)域允許在細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的胞吞作用之后跨體內(nèi)膜進(jìn)行滲透和溶解。遞送蛋白經(jīng)改性以通過(guò)(例如)離子相互作用來(lái)與某些治療性分子組裝并且運(yùn)送所述某些治療性分子。

發(fā)明概述

本文公開的是藥物遞送分子，其包括：配體，其靶向細(xì)胞表面分子；膜滲透結(jié)構(gòu)域；和有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及包含所述藥物遞送分子的藥物組合物。還公開了在有需要的受試者中治療癌癥、抑制癌癥的進(jìn)展、預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移、和向腦部遞送治療性化合物，所述方法包括：鑒別需要該方法的受試者；提供包含本文公開的藥物遞送分子的組合物；以及向受試者施用有效量的所述組合物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1示出使用作為對(duì)照物的Lipofectamine(圖1A)以及HerPBK10(圖1B)來(lái)攝取單鏈低聚核苷酸的結(jié)果。

圖2示出PBK10可遞送編碼GFP的合成mRNA。圖2A提供本實(shí)驗(yàn)中所用的mRNA的概要。圖2B示出來(lái)自由Lipofectin遞送的mRNA(右)和與其比較的由Lipofectin遞送的GFP表達(dá)質(zhì)粒(左)的GFP表達(dá)。圖2C是PBK10-mRNA復(fù)合物的示意圖。圖2D示出用于PBK10-mRNA復(fù)合物的細(xì)胞結(jié)合數(shù)據(jù)。圖2E示出細(xì)胞結(jié)合復(fù)合物的攝取的結(jié)果。圖2F示出GFP表達(dá)的結(jié)果的圖像，而圖2G以圖表形式描繪相同數(shù)據(jù)。

圖3是以下的示意圖：(A)Inlb321，其涵蓋用于c-MET受體結(jié)合的最小結(jié)構(gòu)域；(B)InlB321，其結(jié)合至c-MET的胞外結(jié)構(gòu)域。

圖4是示出重組基因構(gòu)造物被組裝以編碼新融合蛋白(InlB-PBK10)的示意圖。A.pRSET-InlB-PBK10的構(gòu)造。B.pRSET-GFP-InlB的構(gòu)造。C.通過(guò)限制性消化證實(shí)克隆插入物。

圖5是Western印跡的結(jié)果，其表明在細(xì)菌中產(chǎn)生了重組蛋白InlB、InlB-PBK10和GFP-InlB。

圖6是示出在不同腫瘤和非腫瘤細(xì)胞系之間c-MET的表面水平變化的圖表。示出了通過(guò)以96孔格式執(zhí)行的細(xì)胞表面ELISA來(lái)測(cè)得的在非透化細(xì)胞表面上的相對(duì)受體水平。ELISA結(jié)果表明H1993(肺癌細(xì)胞系)和MDA-MB-231(乳腺癌細(xì)胞系)是具有c-MET的最高細(xì)胞表面水平的細(xì)胞。RANKL(前列腺癌細(xì)胞系)和MDA-MB-435(乳腺癌細(xì)胞系)顯示中等水平，而LN-GFP(前列腺癌細(xì)胞系)和Cos-7(非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞)顯示細(xì)胞表面c-MET的較低水平。

圖7示出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，該結(jié)果表明InlB衍生肽識(shí)別出c-MET。A.InlB321肽展示出對(duì)c-MET陽(yáng)性(而不是低c-MET)細(xì)胞的優(yōu)先結(jié)合。使用熒光激化細(xì)胞分選(FACS)來(lái)測(cè)量結(jié)合至c-MET陽(yáng)性細(xì)胞的InlB(由免疫熒光識(shí)別)的相對(duì)水平。FACS數(shù)據(jù)示出與低c-MET細(xì)胞(LN GFP)相比，結(jié)合至高c-MET細(xì)胞(H1993)的InlB的水平相對(duì)更高。B.通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制證實(shí)c-MET結(jié)合。當(dāng)在結(jié)合至細(xì)胞之前，采用來(lái)源于c-MET(MET)的胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶解肽來(lái)預(yù)培育游離InlB時(shí)，可抑制InlB向H1993結(jié)合。InlB和MET在1:1摩爾比率(MET:InlB)下培育，如果InlB對(duì)MET具有特異性，則預(yù)測(cè)受體結(jié)合降低50％。C.通過(guò)InlB-PBK10的細(xì)胞結(jié)合與c-MET水平成比例。InlB-PBK10表明：如通過(guò)細(xì)胞表面ELISA所測(cè)量，與表達(dá)相對(duì)低c-MET水平的細(xì)胞(Cos-7)相比，具有更高c-MET細(xì)胞表面表達(dá)的細(xì)胞(MDA-MB-231)的結(jié)合水平更高。D.通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性配體抑制對(duì)c-MET+細(xì)胞的結(jié)合。當(dāng)濃度增加的InlB被預(yù)結(jié)合至細(xì)胞時(shí)，在添加InlB-PBK10之前，經(jīng)1h在冰上使?jié)舛戎鸩缴叩挠坞xInlB配體預(yù)結(jié)合至MDA-MB-231細(xì)胞。E.InlB-PBK10在混懸液中經(jīng)歷向c-MET+細(xì)胞的受體特異性結(jié)合。混懸液中的MDA-MB-435細(xì)胞用濃度增加的游離InlB配體來(lái)培育，并且在移除未結(jié)合InlB之后，用InlB-PBK10培育細(xì)胞。選擇游離InlB配體的濃度，以使得InlB-PBK10與InlB的摩爾比率為1:1、1:5和1:10。執(zhí)行Western印跡以測(cè)量與細(xì)胞團(tuán)塊共沉淀的相對(duì)InlB-PBK10水平。免疫印跡條帶的密度計(jì)測(cè)量表明，InlB-PBK10結(jié)合的水平隨InlB的濃度增加而降低，這與向c-MET結(jié)合的InlB-PBK10相一致。

圖8示出InlB-PBK10內(nèi)化入c-MET+細(xì)胞中。

圖9示出InlB-PBK10可向c-MET+細(xì)胞遞送毒性分子。A.制備InlB-PBK10-Ga顆粒。示意圖示出在將InlB-PBK10與Ga-咔咯(Ga-corrole)混合以促進(jìn)非共價(jià)組裝之后通過(guò)超濾作用分離顆粒的程序。B.InlB-PBK10-Ga顆粒的DLS。C.InlB-PBK10介導(dǎo)咔咯(corrole)有效負(fù)載的細(xì)胞溶質(zhì)入口。D.I-Dox降低c-MET陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的存活率。E.游離InlB抑制I-Dox毒性。

圖10示出在攜帶皮下雙側(cè)脅腹MDA-MB-435腫瘤的nu/nu小鼠中全身性(尾靜脈)遞送之后，InlB-PBK10的生物分布的Xenogen Spectum圖像。A.在尾靜脈注射之后所示時(shí)間點(diǎn)處的整個(gè)小鼠的圖像。藍(lán)色箭頭指向腎。白色箭頭指向腫瘤。B.從4h時(shí)間點(diǎn)之后處死的相同小鼠中收獲的腫瘤和組織的圖像。

圖11描繪HerMn的組裝。A.HerPBK10蛋白的示意圖，突出顯示了功能域。B.Mn-咔咯的化學(xué)結(jié)構(gòu)(S2Mn)。C非共價(jià)組裝的示意圖。D.溶液中HerMn顆粒的TEM(插入物)和動(dòng)態(tài)光散射(DSL)測(cè)量。

圖12是一組圖表，其示出HerPBK10結(jié)合至HER3并且未受患者血清抑制。A.對(duì)HerPBK10結(jié)合至固定化HER3(人類ErbB3胞外結(jié)構(gòu)域；Prospec)的ELISA-/+用可溶解HER3肽作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(HER3阻斷)來(lái)預(yù)培育。Un∶無(wú)HerPBK10。B.對(duì)HerPBK10結(jié)合至HER2+細(xì)胞的ELISA-/+用1x和10x摩爾比率的可溶解HER3肽、可溶解HER4肽(ERBB4肽，Abnova)、β細(xì)胞素(10μg/mL)、或帕妥珠單抗(Pz)作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑進(jìn)行預(yù)培育。C.在來(lái)自5位HER2+患者和年齡匹配對(duì)照物(HER2-)的血清中，對(duì)HerPBK10結(jié)合到HER2+(MDA-MB-435)細(xì)胞的ELISA。對(duì)照樣品在牛血清中結(jié)合，并且通過(guò)與重組體heregulin配體(+Her)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制進(jìn)行受體結(jié)合檢驗(yàn)。N＝3.*,p<0.05，與對(duì)照物相比(-Her:無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)。

圖13示出HerPBK10結(jié)合至小鼠HER3的結(jié)果。A.人類和小鼠HER3的結(jié)構(gòu)域I-II(aa 20-239，heregulin結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列比對(duì)。藍(lán)色殘基指示氨基酸差異。B.使用與人類和小鼠HER3交叉反應(yīng)的抗HER3抗體(1B2E；細(xì)胞信號(hào)技術(shù))通過(guò)ELISA(無(wú)透化作用)檢測(cè)的相對(duì)HER3水平。C.HerPBK10向4T1小鼠乳房腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。N＝3.*,p<0.05，與單獨(dú)HerPBK10相比

圖14是示出HerMn毒性對(duì)人類HER2+和HER2-腫瘤細(xì)胞的數(shù)據(jù)的圖表。

圖15是示出HerMn細(xì)胞毒性的機(jī)制的圖片。A.共焦熒光圖像，示出通過(guò)MDA-MB-435細(xì)胞中的HerMn使線粒體膜電勢(shì)降低。B.共焦熒光圖像，通過(guò)HerMn示出肌動(dòng)蛋白(紅色)和微管蛋白(綠色)的超氧化物介導(dǎo)瓦解。

圖16示出S2Ga與TSPO相互作用的數(shù)據(jù)。A-B.通過(guò)測(cè)量吸光率和熒光光譜，針對(duì)TSPO結(jié)合咔咯的存在，評(píng)估滲余物。C-D.HerGa與TSPO原位相互作用的證據(jù)。當(dāng)積累到線粒體中時(shí)，C中所用的綠色熒光JC-1染料發(fā)紅色熒光。D是對(duì)C中紅色熒光的定量。^*,p<0.05。

圖17示出荷瘤小鼠中的生物分布。在尾靜脈注射之后對(duì)Alexa680標(biāo)記HerMn、曲妥單抗(Tz)和BSA(12nmol ea)進(jìn)行Xenogen成像和定量。圖表平均熒光-/+SEM。

圖18示出HerMn的治療效力的數(shù)據(jù)。A.雌性裸小鼠中的HER2+MDA-MB-435腫瘤生長(zhǎng)，該雌性裸小鼠接受HerMn或S2Mn的每日IV(經(jīng)由尾靜脈)注射(5nmole咔咯/注射)，每日一次，持續(xù)6個(gè)連續(xù)日。對(duì)照組接受與HerMn等同濃度的鹽水或HerPBK10。治療在約200mm3平均腫瘤體積時(shí)開始。在試劑注射之前(第1天)，在試劑注射期間(第3天)，以及在試劑注射之后(第8天、第15天和第22天)，測(cè)量腫瘤體積。N＝8-10腫瘤/組。*p<0.05(單向ANOVA)。B.在持續(xù)2天(實(shí)線)或5天(虛線)暴露于HerMn、S2Mn、HerPBK10、或阿霉素(Dox)期間，人類CDC生活力。N＝3per conc，來(lái)自3次單獨(dú)實(shí)驗(yàn)

圖19示出在無(wú)腫瘤的小鼠中HerPBK10的組織分布。

實(shí)施方案的詳述

定義∶

為了方便起見，在此收集了在說(shuō)明書、實(shí)施例和附加權(quán)利要求書中采用的某些術(shù)語(yǔ)。除非另行指出或從上下文暗示，下列術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)包括下面提供的含義。除非另外明確說(shuō)明或從上下文明顯可見，以下術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)不排除術(shù)語(yǔ)或短語(yǔ)在其所述的領(lǐng)域獲取的含義。提供定義是為了有助于描述特定實(shí)施方案，并且不旨在限制要求保護(hù)的發(fā)明，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受權(quán)利要求書限制。除非另外定義，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員通常所理解含義相同的含義。

“有益的結(jié)果”可以包括，但決不限于，減輕或緩和該疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度、預(yù)防該疾病狀態(tài)惡化、治愈該述疾病狀態(tài)、預(yù)防該疾病狀態(tài)發(fā)展、降低患者發(fā)展該疾病狀態(tài)的幾率以及延長(zhǎng)患者壽命或預(yù)期壽命。在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病狀態(tài)是癌癥。在一些實(shí)施方案中，疾病狀態(tài)為自身免疫疾病。

“癌癥”和“癌性”是指或描述哺乳動(dòng)物的特征通常在于細(xì)胞生長(zhǎng)不受調(diào)控的生理病狀。癌癥的實(shí)例包括但不限于：白血病、骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)、腦癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、腎癌、胃癌、胰癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲狀腺癌、腎臟癌、癌腫、黑素瘤、頭頸癌、腦癌、前列腺癌、雄激素依賴性前列腺癌、和雄激素非依賴性前列腺癌。

如本文所用的“化學(xué)治療藥物”或“化學(xué)治療劑”是指用于治療癌癥的藥物，所述藥物包括但不限于：白蛋白結(jié)合紫杉醇(nab-紫杉醇)、放線菌素、阿利類視色素(Alitretinoin)、全反式視黃酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、貝伐珠單抗、貝沙羅汀(Bexatotene)、博萊霉素、硼替佐米、卡鉑、卡培他濱、西妥昔單抗、順鉑、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、柔紅霉素、多西他賽、去氧氟尿苷、阿霉素、表柔比星、埃博霉素、埃羅替尼、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉非替尼、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、伊馬替尼、易普利單抗(Ipilimumab)、伊立替康、氮芥、美法侖、巰基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、阿侖單抗(Ocrelizumab)、奧法木單抗、奧沙利鉑、紫杉醇、帕尼妥單抗(Panitumab)、培美曲塞、利妥昔單抗、他氟泊苷(Tafluposide)、替尼泊苷、硫鳥嘌呤、托泊替康、類視色素、戊柔比星、威羅菲尼、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春瑞濱、伏立諾他、羅米地辛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巰基嘌呤(6-MP)、克拉屈濱、氯法拉濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、噴司他丁、絲裂霉素、伊沙匹隆、雌莫司汀或其組合。

“受試者”或“個(gè)體”或“動(dòng)物”或“患者”或“哺乳動(dòng)物”意指任何受試者，具體是哺乳動(dòng)物受試者，希望對(duì)它們進(jìn)行診斷、預(yù)后或治療。在一些實(shí)施方案中，受試者患有癌癥。在一些實(shí)施方案中，受試者受試者在該受試者壽命中某一時(shí)間點(diǎn)患有癌癥。在各種實(shí)施方案中，受試者的癌癥處于緩解期，是復(fù)發(fā)的或是非復(fù)發(fā)的。

如本文所用"哺乳動(dòng)物"是指哺乳綱的任何成員，其包括但不限于：人類，家畜，農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，動(dòng)物園動(dòng)物，運(yùn)動(dòng)會(huì)動(dòng)物，寵物動(dòng)物，諸如狗、貓、豚鼠、兔子，大鼠，小鼠，馬，牛，奶牛；靈長(zhǎng)類動(dòng)物，諸如類人猿、猴子、猩猩和黑猩猩；犬科動(dòng)物，諸如狗和狼；貓科動(dòng)物，諸如貓、獅子、和老虎；馬科動(dòng)物，諸如馬、驢和斑馬；食品動(dòng)物，諸如奶牛、豬和羊；有蹄類動(dòng)物，諸如鹿和長(zhǎng)頸鹿；嚙齒動(dòng)物，諸如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠和豚鼠；等等。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為人類受試者。所述術(shù)語(yǔ)不指示特定年齡或性別。因此，成年和新生受試者以及胎兒無(wú)論雄性或雌性都意欲包括在這個(gè)術(shù)語(yǔ)的范圍內(nèi)。

如本文所用的“治療(Treatment/treating/therapy)”或“治療性(therapeutic)是指治療性治療和預(yù)防性或防止性措施，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)針對(duì)的病理性病狀、預(yù)防該病理性病狀、追求或獲得有益的結(jié)果或降低個(gè)體發(fā)展所述病狀的幾率，即使治療最終不成功。需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)患有病狀的對(duì)象，以及易患所述病狀的對(duì)象或要預(yù)防所述病狀的對(duì)象。具體的程序或施用被認(rèn)為是治療性的，即便在施用之后受試者未感覺更佳。因此，認(rèn)為受試者疾病狀態(tài)的任何改善、或疾病進(jìn)展的任何減緩是治療性的。癌癥治療的實(shí)例包括但不限于：主動(dòng)監(jiān)測(cè)，觀察，手術(shù)介入，化學(xué)療法，免疫療法，輻射療法(諸如外線束輻射，立體定位輻射手術(shù)(伽馬刀)，和分次立體定向輻射治療(FSR))，局部療法，全身性療法，疫苗療法，病毒療法，分子靶向療法，或其組合。

如本文所用的“腫瘤”是指所有贅生性細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖(無(wú)論惡性或良性)以及所有癌前和癌性細(xì)胞和組織。

如本文所用的“治療劑”是指用于(例如)治療、抑制、預(yù)防、減輕疾病的影響，降低疾病的嚴(yán)重程度，降低疾病發(fā)展的可能性，減緩疾病進(jìn)展和/或治愈疾病的藥劑。治療劑靶向的疾病包括但不限于：癌腫、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細(xì)胞腫瘤、胚細(xì)胞瘤各種免疫者細(xì)胞上表達(dá)的抗原以及在與各種血液疾病、自身免疫疾病和/或炎性疾病相關(guān)的細(xì)胞上表達(dá)的抗原。

在本公開的背景下，“約”某一值意指本公開涵蓋所列值±25％，或者所列值±15％，或者所列值±10％，或者所列值±5％。因此，例如，“約50個(gè)氨基酸”意指50±25％氨基酸(即，37至63個(gè)氨基酸的范圍)，或者50±15％氨基酸(即，42至58個(gè)氨基酸的范圍)，或者50±10％氨基酸(即，45至55個(gè)氨基酸的范圍)，或者50±5％氨基酸(即，47至53個(gè)氨基酸的范圍)。

藥物遞送分子

本文所述的是藥物遞送分子。藥物遞送分子包括靶向細(xì)胞表面分子、膜滲透結(jié)構(gòu)域和有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體。藥物遞送分子中的配體將分子遞送至靶細(xì)胞，諸如癌細(xì)胞。膜滲透結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)滲透。有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成具有治療劑的復(fù)合物。在具有治療性分子的復(fù)合物中的藥物遞送分子將治療劑遞送至靶細(xì)胞，諸如癌細(xì)胞。在各種實(shí)施方案中，所述癌細(xì)胞以下中的任何一種或多種：白血病、骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)、腦癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、腎癌、胃癌、胰癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲狀腺癌、腎臟癌、癌腫、黑素瘤、頭頸癌、腦癌、前列腺癌、雄激素依賴性前列腺癌、和雄激素非依賴性前列腺癌。

在一些實(shí)施方案中，由此公開的藥物遞送分子形成直徑為約5nm至約50nm的納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，納米顆?；加屑s10至約30nm的大小。有效負(fù)載(即，治療劑)隨后結(jié)合至該納米顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，納米顆粒包含金屬化咔咯，例如錳(Mn)、鐵(Fe)、或鎵(Ga)咔咯。在其他實(shí)施方案中，納米顆粒包含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。在一些實(shí)施方案中，治療劑向納米顆粒的結(jié)合是通過(guò)選自由以下組成的組的方法進(jìn)行：靜電相互作用、疏水性相互作用、親水性相互作用、氫鍵以及共價(jià)鍵。一旦納米顆粒治療劑組合進(jìn)入細(xì)胞，則納米顆粒與治療劑之間的結(jié)合斷裂，這要么是因?yàn)樵摷?xì)胞破壞納米顆粒與治療劑的締合，要么是因?yàn)檫@兩者間的共價(jià)鍵被酶水解。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是涉及到導(dǎo)致細(xì)胞程序死亡減少或消除的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的受體。在本文所述藥物遞送分子中可能被配體靶向的細(xì)胞表面分子的實(shí)例包括但不限于以下中的任何一種或多種：4-1BB、5T4、腺癌抗原、α-胎兒球蛋白、BAFF、B淋巴瘤細(xì)胞、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、c-MET、CCR4、CD152、CD19、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受體)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNTO888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纖連蛋白額外結(jié)構(gòu)域-B、葉酸鹽受體1、GD2、GD3神經(jīng)節(jié)苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、人類分散因子受體激酶、IGF-1受體、IGF-I、IgGl、L1-CAM、IL-13、IL-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體、整聯(lián)蛋白α5β1、整聯(lián)蛋白αvβ3、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸、NPC-1C、PDGF-Rα、PDL192、磷脂酰絲氨酸、前列腺癌腫細(xì)胞、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白或其組合。對(duì)癌癥特異性的其他靶向分子或顆粒將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，并且可結(jié)合本發(fā)明的替代性實(shí)施方案來(lái)使用。在實(shí)施方案中，配體靶向癌細(xì)胞上的c-MET。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體是HGF。在實(shí)施方案中，配體是內(nèi)化蛋白B或其片段或其變型。在另一實(shí)施方案中，配體是細(xì)菌侵襲素(Inv)蛋白質(zhì)。

因此，在一些實(shí)施方案中，配體是天然結(jié)合配偶體，或可結(jié)合至細(xì)胞表面分子的分子。在一些實(shí)施方案中，配體是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、多肽、或低聚肽。在其他實(shí)施方案中，配體是抗體或抗體片段。在某些其他實(shí)施方案中，配體是結(jié)合至細(xì)胞表面分子的有機(jī)小分子。在一些實(shí)施方案中，有機(jī)小分子模仿用于靶細(xì)胞表面分子的天然結(jié)合配偶體的結(jié)構(gòu)，并且競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合至該靶細(xì)胞表面分子，而在其他實(shí)施方案中，該有機(jī)小分子非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合至靶細(xì)胞表面分子。

在一些實(shí)施方案中，膜滲透結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、多肽、或低聚肽。在某些實(shí)施方案中，膜滲透結(jié)構(gòu)域是具有約3至約35個(gè)氨基酸的多肽。

在實(shí)施方案中，所述膜滲透結(jié)構(gòu)域是五鄰體基底蛋白或其得自腺病毒的片段。五鄰體基底蛋白通常在感染早期期間介導(dǎo)腺病毒(例如腺病毒血清型5)的細(xì)胞結(jié)合、進(jìn)入和細(xì)胞溶質(zhì)滲透。五鄰體基底可包括RGD基元(Arg-Gly-Asp)。如本文所用，“PB”是指五鄰體基底片段。

在一些實(shí)施方案中，有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、多肽、或低聚肽。在某些實(shí)施方案中，膜滲透結(jié)構(gòu)域是具有約3至約35個(gè)氨基酸的多肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域是十賴氨酸基元，也稱為“K10”。十賴氨酸基元包含十個(gè)賴氨酸殘基。

在一些實(shí)施方案中，結(jié)合至有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域的有效負(fù)載結(jié)合的是核酸。在一些實(shí)施方案中，核酸選自由以下組成的組：雙鏈脫氧核糖核酸(dsDNA)，單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)，核糖核酸(RNA)，信使核糖核酸(mRNA)，轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)，核糖體核糖核酸(rRNA)，小干擾核糖核酸(siRNA)，單鏈核糖核酸(ssRNA)，和低聚核苷酸(無(wú)論單鏈或雙鏈)。

在某些實(shí)施方案中，有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域向有效負(fù)載的結(jié)合是通過(guò)選自由以下組成的組的方法進(jìn)行：靜電相互作用、親電子相互作用、親水性相互作用(范德瓦耳斯力)、氫鍵或共價(jià)鍵。

在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子中的配體靶向癌細(xì)胞上的細(xì)胞表面分子。在實(shí)施方案中，細(xì)胞表面分子是癌細(xì)胞上的受體。

在實(shí)施方案中，本文所述的是藥物遞送分子，其包括靶向細(xì)胞表面分子的配體、膜滲透結(jié)構(gòu)域和有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述配體是內(nèi)化蛋白B(InlB)或其片段或其變型，所述膜滲透結(jié)構(gòu)域是五鄰體基底蛋白或其片段并且所述有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域是十賴氨酸基元。內(nèi)化蛋白B靶向細(xì)胞表面蛋白質(zhì)c-Met。c-Met的天然配體是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)。HGF形成四聚物并且需要二硫鍵形成。得自核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的內(nèi)化蛋白B也識(shí)別并且結(jié)合c-MET，但不四聚化或不需要二硫鍵形成。內(nèi)化蛋白B可表達(dá)為融合蛋白質(zhì)，并且該融合蛋白質(zhì)也結(jié)合至c-Met。InlB未與HGF競(jìng)爭(zhēng)。在一些實(shí)施方案中，包含InlB、五鄰體基底蛋白和十賴氨酸基元的藥物遞送分子可能還包含細(xì)胞毒素劑，諸如咔咯化合物。咔咯化合物是卟啉樣分子。這些化合物可螯合大量不同金屬(諸如鐵、鎵、錳等等)，非共價(jià)結(jié)合載體蛋白質(zhì)，是細(xì)胞毒素，并且在無(wú)載體蛋白質(zhì)情況下不能滲透細(xì)胞。

在其他實(shí)施方案中，配體靶向細(xì)胞表面分子CD4，或者CD19或CD20。在其他實(shí)施方案中，配體靶向人類表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)中的一個(gè)，例如HER2或HER3。在另一實(shí)施方案中，配體靶向整聯(lián)蛋白。

在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子還包含治療劑。治療劑形成具有有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物。在各種實(shí)施方案中，治療劑包括但不限于烷基化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗菌素、有絲分裂抑制劑、皮質(zhì)類固醇、細(xì)胞毒素劑或其組合。治療劑與有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的復(fù)合物可能是共價(jià)的或非共價(jià)的。在一些實(shí)施方案中，非共價(jià)復(fù)合物可能是經(jīng)由范德瓦耳斯力、氫鍵、靜電相互作用、疏水性/親水性相互作用來(lái)形成。在一些實(shí)施方案中，治療劑與有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的相互作用可通過(guò)聯(lián)結(jié)子介導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，治療劑是阿霉素或咔咯化合物。

本文還描述了用于在有需要的受試者中治療癌癥的方法。所述方法包括鑒別需要治療的受試者和提供包括藥物遞送分子的組合物以及向受試者施用有效量的組合物以便治療癌癥。在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子包括靶向細(xì)胞表面上的受體的配體，膜滲透結(jié)構(gòu)域以及有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且還包括本文所述的治療劑。

本文還描述了用于在有需要的受試者中抑制癌癥進(jìn)展的方法。所述方法包括鑒別需要治療的受試者和提供包括藥物遞送分子的組合物以及向受試者施用有效量的組合物以便抑制癌癥進(jìn)展。在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子包括靶向細(xì)胞表面上的受體的配體，膜滲透結(jié)構(gòu)域以及有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且還包括本文所述的治療劑。

本文還描述了用于在有需要的受試者中預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的方法。所述方法包括鑒別需要預(yù)防的受試者和提供包括藥物遞送分子的組合物以及向受試者施用有效量的組合物以便預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移。在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子包括靶向細(xì)胞表面上的受體的配體，膜滲透結(jié)構(gòu)域以及有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且還包括本文所述的治療劑。

本文還提供了用于治療、抑制或預(yù)防藥物抗性癌癥的轉(zhuǎn)移(例如，抗EGFR酪氨酸激酶抑制劑的癌癥)。所述方法包括鑒別需要治療的受試者和提供包括藥物遞送分子的組合物以及向受試者施用有效量的組合物以便治療、抑制或預(yù)防藥物抗性癌癥的轉(zhuǎn)移。在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子包括靶向細(xì)胞表面上的受體的配體，膜滲透結(jié)構(gòu)域以及有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且還包括本文所述的治療劑。在實(shí)施方案中，藥物抗性癌癥過(guò)表達(dá)選自由c-Met、HER2、CD4和CD20組成的組的受體。

本文還提供了向腦部遞送治療性化合物的方法。所述方法包括鑒別需要此類遞送的受試者和提供包括藥物遞送分子的組合物以及向受試者施用有效量的組合物。在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子包括靶向細(xì)胞表面上的受體的配體，膜滲透結(jié)構(gòu)域以及有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且還包括本文所述的治療劑。本文所述組合物令人意外地越過(guò)血腦屏障并且向腦部中細(xì)胞遞送有效負(fù)載。因此，這些組合物獨(dú)一無(wú)二適合于治療腦部中的癌癥(例如轉(zhuǎn)移性癌癥)。

在本文所述治療性方法的各種方面中，組合物中的藥物遞送分子包括靶向細(xì)胞表面上受體的配體、膜滲透結(jié)構(gòu)域和有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中該配體是內(nèi)化蛋白B(InlB)或其片段或其變型，該膜滲透結(jié)構(gòu)域是五鄰體基底蛋白或其片段并且該有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域是十賴氨酸基元。藥物遞送分子還包含治療劑，諸如阿霉素或咔咯化合物。

療法

本發(fā)明的另一方面涉及通過(guò)施用有效量的組合物來(lái)治療癌癥(例如白血病、骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)、腦癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、腎癌、胃癌、胰癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲狀腺癌、腎臟癌、癌腫、黑素瘤、頭頸癌、腦癌、前列腺癌、雄激素依賴性前列腺癌和雄激素非依賴性前列腺癌)，所述組合物包括與本文所述治療劑復(fù)合的藥物遞送分子。在一些實(shí)施方案中，治療劑可以是適用于治療特定類型癌癥的任何化學(xué)治療藥物。治療劑可以是有機(jī)分子、生物分子(例如肽或核酸)、或其組合。在各種實(shí)施方案中，治療劑包括但不限于烷基化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗菌素、有絲分裂抑制劑、皮質(zhì)類固醇、細(xì)胞毒素劑或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑是咔咯化合物。在實(shí)施方案中，治療劑是siRNA分子。

在一些實(shí)施方案中，將包含有效量的與治療劑復(fù)合的藥物遞送分子的組合物與諸如本文所述那些的一種或多種化學(xué)治療劑一起施用。有效量的組合物和化學(xué)治療劑可以順序地或同時(shí)地施用。

在一些實(shí)施方案中，施用是全身性的。在一些實(shí)施方案中，施用是局部的。向受試者施用組合物的各種方式是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本發(fā)明的所有實(shí)施方案的一些方面中，組合物是通過(guò)包括眼部、經(jīng)口、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮膚、氣道(氣溶膠)、肺部、皮膚、局部、或注射施用的途徑來(lái)施用。

可以與包含有效量的與治療劑復(fù)合的藥物遞送分子的組合物一起使用來(lái)治療癌癥的另外的療法包括但不限于外科手術(shù)、輻射、免疫療法、疫苗或其組合。可以與包括施用有效量的包含有效量的與治療劑復(fù)合的藥物遞送分子的組合物的療法順序地或同時(shí)地，施用所述另外的療法來(lái)治療癌癥(例如，黑素瘤或卵巢癌腫)。

在一些實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑可以選自以下中任何一種或多種：細(xì)胞毒素抗菌素、抗代謝物、抗有絲分裂劑、烷基化劑、砷化合物、DNA局部異構(gòu)酶抑制劑、紫杉烷、核苷類似物、植物生物堿和毒素；以及其合成衍生物。示例性化合物包括但不限于：烷基化劑∶蘇消安，和曲洛磷胺；植物生物堿∶長(zhǎng)春花堿，紫杉醇，多西紫杉醇；DNA局部異構(gòu)酶抑制劑∶阿霉素，表柔比星，依托泊苷，喜樹堿，托泊替康，依立替康，替尼泊苷，克立那托，和絲裂霉素；抗葉酸劑∶氨甲喋呤，霉酚酸，和羥基脲；嘧啶模擬物∶5-氟尿嘧啶，去氧氟尿苷，和阿糖胞苷；嘌呤模擬物∶巰基嘌呤和硫鳥嘌呤；DNA抗代謝物∶2'-脫氧-5-氟尿苷，阿非迪霉素甘氨酸鹽，和吡唑并咪唑；和抗有絲分裂劑∶軟海綿素，秋水仙堿，和根霉素。還可以使用包含一種或多種化學(xué)治療劑(例如FLAG、CHOP)的組合物。FLAG包含氟達(dá)拉濱、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包含環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿、阿霉素和強(qiáng)的松。在另一實(shí)施方案中，使用PARP(例如PARP-1和/或PARP-2)抑制劑，并且此類抑制劑是本領(lǐng)域眾所周知的(例如，Olaparib,ABT-888,BSI-201,BGP 15(N-Gene Research Laboratories,Inc.)；INO-1001(Inotek Pharmaceuticals Inc.)；PJ34(Soriano等人，2001；Pacher等人，2002b；3-氨基苯甲酰胺(Trevigen)；4-氨基-1,8-萘酰亞胺；(Trevigen)；6(5H)-菲啶酮(Trevigen)；苯甲酰胺(美國(guó)專利Re.36,397)；和NU1025(Bowman等))。

如本文所述，在各種實(shí)施方案中，療法包括例如輻射療法。輻射療法中所用輻射可能是電離輻射。輻射療法還可以是伽馬射線、X射線、或質(zhì)子束。輻射療法的實(shí)例包括但不限于：外線束輻射療法、放射性同位素(I-125、鈀、銥)的間質(zhì)植入、諸如鍶-89的放射性同位素、胸部輻射療法、腹膜內(nèi)P-32輻射療法，和/或全腹部和骨盆輻射療法。對(duì)于輻射療法的總體概述，參見Heilman,Chapter 16:Principles of Cancer Management:Radiation Therapy，第6版，2001，DeVita等人編，J.B.Lippencott Company,Philadelphia。輻射療法可作為外線束輻射或遠(yuǎn)距療法來(lái)施用，其中所述輻射是從遠(yuǎn)端源引導(dǎo)出。輻射治療還可以作為內(nèi)部療法或短距療法來(lái)施用，其中輻射源被放置在身體內(nèi)部接近于癌細(xì)胞或腫瘤塊。還涵蓋了使用光動(dòng)力療法，所述光動(dòng)力療法包括施用光敏劑，諸如血卟啉和其衍生物，維替泊芬(Vertoporfin)(BPD-MA)，酞菁，光敏劑Pc4，去甲氧基-竹紅菌甲素；和2BA-2-DMHA。

如本文所述，在各種實(shí)施方案中，療法包括例如免疫療法。免疫療法可以包括例如使用癌癥疫苗和/或敏化的抗原遞呈細(xì)胞。免疫療法可涉及用于對(duì)宿主進(jìn)行短期保護(hù)的被動(dòng)免疫，其通過(guò)施用針對(duì)癌癥抗原或疾病抗原的預(yù)形成抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)(例如，向腫瘤抗原施用任選地連接至化學(xué)治療劑或毒素的單克隆抗體)。免疫療法還可以集中于使用癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒素淋巴細(xì)胞識(shí)別表位。

如本文所述，在各種實(shí)施方案中，，療法包括例如激素療法。激素治療性治療可包括例如：激素激動(dòng)劑，激素拮抗劑(例如氟他米特、比卡魯胺、三苯氧胺、雷洛昔芬、乙酸亮脯利特(LUPRON)、LH-RH拮抗劑)，激素生物合成和加工的抑制劑，和類固醇(例如地塞米松、類視色素、類三角醇(deltoid)、倍他米松、考的索、考的松、強(qiáng)的松、去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、雌激素、睪酮、孕酮)，維生素A衍生物(例如全反式視黃酸、(ATRA))；維生素D3模擬物；抗促孕激素(例如米非司酮、奧那司酮)，或抗雄激素(例如，乙酸環(huán)丙孕酮)。

用抗癌療法進(jìn)行治療的持續(xù)時(shí)間和/或劑量可能根據(jù)具體抗癌劑或其組合來(lái)變化。具體癌癥治療劑的恰當(dāng)治療時(shí)間將是熟練技術(shù)人員所了解的。本發(fā)明涵蓋對(duì)各癌癥治療劑的最佳治療日程表的連續(xù)評(píng)價(jià)，其中由本發(fā)明方法確定的受試者的癌癥的基因簽字是確定最佳治療劑量和日程表的因子。

在各種實(shí)施方案中，用于確定抗癌療法的預(yù)測(cè)效力的受試者是哺乳動(dòng)物(例如小鼠，大鼠，靈長(zhǎng)類，非人類哺乳動(dòng)物，家畜，諸如狗、貓、母牛、馬)，并且優(yōu)選是人類。在本發(fā)明方法的另一實(shí)施方案中，受試者未經(jīng)歷化學(xué)療法或輻射療法。在替代性實(shí)施方案中，受試者經(jīng)歷化學(xué)療法或輻射療法(例如，諸如采用順鉑、卡鉑、和/或紫杉烷)。在相關(guān)實(shí)施方案中，受試者未暴露于超過(guò)受試者物種一般或平均遭遇的輻射或化學(xué)毒性劑的水平。在某些實(shí)施方案中，受試者必須采用外科手術(shù)來(lái)移除癌性或癌前組織。在其他實(shí)施方案中，癌性組織沒有被移除，例如，癌性組織可能位于身體的不宜手術(shù)區(qū)域，諸如在生命所必需的組織中，或處于手術(shù)操作將對(duì)患者造成相當(dāng)?shù)膫︼L(fēng)險(xiǎn)的區(qū)域中，或例如，所述受試者在移除癌性組織之前被給予抗癌療法。

藥物組合物

在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，所述藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的賦形劑以及治療有效量的本文所述藥物遞送分子，以便治療癌癥(例如白血病、骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)、腦癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、肝細(xì)胞癌、腎癌、胃癌、胰癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲狀腺癌、腎臟癌、癌腫、黑素瘤、頭頸癌、腦癌、前列腺癌、雄激素依賴性前列腺癌以及雄激素非依賴性前列腺癌)。在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子包括靶向細(xì)胞表面上的受體的配體，膜滲透結(jié)構(gòu)域和有效負(fù)載結(jié)合結(jié)構(gòu)域。藥物遞送分子還包括與本文所述藥物遞送分子復(fù)合的治療劑。在各種實(shí)施方案中，藥物遞送分子遞送治療劑以靶向癌細(xì)胞。

“藥學(xué)上可接受的的賦形劑”是指適用于制備藥物組合物的通常安全、無(wú)毒且合乎需要的賦形劑，并且包括可為獸醫(yī)學(xué)用途以及人醫(yī)藥用途所接受的賦形劑。此類賦形劑可為固體、液體、半固體，或在氣溶膠組合物的情況下可為氣體。

在各種實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可被配制來(lái)通過(guò)任給藥途徑進(jìn)行遞送。“施用途徑”可指本領(lǐng)域中已知的任何施用途徑，包括但不限于氣溶膠、經(jīng)鼻、經(jīng)口、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮膚、胃腸外或腸內(nèi)?！拔改c外”是指通常與注射相關(guān)的施用途徑，包括眶內(nèi)、眼內(nèi)、輸注、動(dòng)脈內(nèi)、囊內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)、脊椎內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、子宮內(nèi)、靜脈內(nèi)、蛛網(wǎng)膜下、囊下、皮下、經(jīng)粘膜或經(jīng)氣管。通過(guò)胃腸外途徑，組合物可呈用于輸注或用于注射的溶液或混懸液形式，或呈凍干粉末形式。通過(guò)胃腸外途徑，組合物可呈用于輸注或用于注射的溶液或混懸液形式。通過(guò)經(jīng)腸途徑，藥物組合物可呈片劑、凝膠膠囊、糖包衣片劑、糖漿、混懸液、溶液、粉末、顆粒劑、乳劑、允許控釋的微球或納米球或脂質(zhì)囊泡或聚合物囊泡形式。通常，組合物通過(guò)靜脈內(nèi)地或腹膜內(nèi)地注射來(lái)施用。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，這些施用的方法使已知的。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物還可含有任何藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”是指涉及自身體的一種組織、器官或部分?jǐn)y帶或運(yùn)送目標(biāo)化合物至身體的另一組織、器官或部分的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或媒介物。舉例而言，載體可為液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封物質(zhì)或其組合。載體的各組分必須是“藥學(xué)上可接受的”，因?yàn)樗仨毰c配方的其他成分相容。它還必須適用于與它可能與之接觸的任何組織或器官接觸，這意味著它必須不攜有毒性、刺激、過(guò)敏反應(yīng)、免疫原性或過(guò)度超過(guò)其治療益處的任何其他并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物也可被包載、制片或以乳劑或糖漿形式制備以供口服施用?？商砑铀帉W(xué)上可接受的固體或液體載體以增強(qiáng)或穩(wěn)定組合物，或有助于制備組合物。液體載體包括糖漿、花生油、橄欖油、甘油、鹽水、醇和水。固體載體包括淀粉、乳糖、硫酸鈣、二水合物、白土、硬脂酸鎂或硬脂酸、滑石粉、果膠、阿拉伯膠、瓊脂或明膠。載體還可以包括持續(xù)釋放物質(zhì)，如單獨(dú)或與蠟組合的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

藥物制劑是遵循常規(guī)制藥技術(shù)制備的，所述技術(shù)涉及研磨、混合、?；捅匾獣r(shí)壓制(針對(duì)片劑形式)；或研磨、混合和填充(針對(duì)硬質(zhì)明膠膠囊形式)。當(dāng)使用液體載體時(shí)，制劑將呈糖漿、酏劑、乳劑或水性或非水性混懸液形式。此類液體制劑可直接經(jīng)口施用或填充至軟質(zhì)明膠膠囊中。

根據(jù)本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以以治療有效量遞送。精確的治療有效量是就在給定受試者中的治療療效而言，組合物將產(chǎn)生最有效的結(jié)果的那個(gè)量。這個(gè)量將取決于多種因子而變化，所述因子包括但不限于治療化合物的特征(包括活性、藥物動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和生物利用度)、受試者的生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體狀況、對(duì)給定劑量的反應(yīng)性和藥物類型)、制劑中一種或多種藥學(xué)上可接受的載體的性質(zhì)以及施用途徑。臨床和藥理學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)，例如通過(guò)監(jiān)測(cè)受試者對(duì)施用化合物的反應(yīng)以及相應(yīng)調(diào)整劑量來(lái)確定治療有效量。對(duì)于其他指導(dǎo)，參見Remington:The Science and Practice of Pharmacy(Gennaro編，第20版,Williams&Wilkins PA,USA)(2000)。

在施用到受試者之前，可將制劑組分添加到藥劑。液體制劑可能是優(yōu)選的。例如，這些制劑組分可包括油、聚合物、維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖劑、白蛋白、表面活性劑、增量劑或其組合。

碳水化合物制劑組分包括糖或糖醇，諸如單糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、右旋糖酐、支鏈淀粉、糊精、α-環(huán)糊精和β-環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素，或其混合物?！疤谴肌倍x為具有--OH基團(tuán)的C4-C8烴，并且包括半乳糖醇、肌醇、甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、甘油、和阿拉伯糖醇。上述這些糖或糖醇可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。用量沒有固定的限制，只要糖或糖醇在液體制備物中可溶。在一個(gè)實(shí)施方案中，糖或糖醇濃度在1.0重量/體積％和7.0重量/體積％之間，更優(yōu)選在2.0和6.0重量/體積％之間。

氨基酸制劑組分包括肉毒堿、精氨酸和甜菜堿的左旋(L)形式；然而，可添加其他氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，作為制劑組分的聚合物包括平均分子量在2,000和3,000之間的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量在3,000和5,000之間的聚乙二醇(PEG)。

還優(yōu)選在組合物中使用緩沖液以將凍干前或復(fù)水后溶液的pH變化最小化?？墒褂么蠖鄶?shù)任何生理緩沖液，包括但不限于檸檬酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽和谷氨酸鹽緩沖液或其混合物。在一些實(shí)施方案中，濃度為0.01至0.3摩爾?？商砑拥街苿┑谋砻婊钚詣┦居跉W洲專利號(hào)270,799和268,110中。

另外，例如，組合物可通過(guò)共價(jià)軛合至聚合物來(lái)化學(xué)改性以增加其循環(huán)半衰期。優(yōu)選聚合物以及將它們連接至肽的方法示于美國(guó)專利號(hào)4,766,106；4,179,337；4,495,285；以及4,609,546中，所述專利全文藉此以引用方式并入本文。優(yōu)選聚合物是聚氧乙烯化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫下可溶于水，并且在一些實(shí)施方案中，具有1000至40,000之間、2000至20,000之間、或3,000至12,000之間的平均分子量。在一些實(shí)施方案中，PEG具有至少一個(gè)羥基基團(tuán)，諸如羥端基基團(tuán)。羥基基團(tuán)可能被激活以與抑制劑上的游離氨基基團(tuán)反應(yīng)。然而，應(yīng)理解，反應(yīng)性基團(tuán)的類型和量可能變化，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的共價(jià)軛合的PEG/抗體。

水溶性聚氧乙烯化多元醇也可用于本發(fā)明。它們包括聚氧乙烯化山梨糖醇、聚氧乙烯化葡萄糖、聚氧乙烯化甘油(POG)等等。POG是優(yōu)選的。一個(gè)原因是因?yàn)榫垩跻蚁┗视偷母视椭麈準(zhǔn)且詥嗡岣视王?、二酸甘油酯、三酸甘油酯天然存在于例如?dòng)物和人類中的相同主鏈。因此，這種支化在身體內(nèi)不會(huì)必然地被視作外來(lái)作用劑。POG具有與PEG相同范圍的分子量。用于POG的結(jié)構(gòu)示于Knauf等人，1988,J.Bio.Chem.263:15064-15070，并且POG/IL C 2軛合物的討論見于美國(guó)專利號(hào)4,766,106中，這兩份文獻(xiàn)皆以其全文藉此以引用方式并入本文。

液體藥物組合物被制備后，可凍干以防止降解并保持無(wú)菌。用于凍干液體組合物的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。在使用之前，組合物可用無(wú)菌稀釋劑(例如林格氏溶液，蒸餾水，或無(wú)菌鹽水)復(fù)水，其可包括額外成分。復(fù)水后，使用對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的那些方法將組合物施用給受試者。

施用的劑量和模式將取決于個(gè)體。一般而言，施用組合物，以使得以1μg/kg至20mg/kg之間、20μg/kg至10mg/kg之間、1mg/kg至7mg/kg之間的劑量給予抗體。在一些實(shí)施方案中，其作為單次劑量給予，以將循環(huán)水平增加10至20倍并且在單次劑量之后持續(xù)4至6小時(shí)。也可在單次劑量之后使用連續(xù)輸注。倘若如此，抗體可以以5μg/kg/分鐘至20μg/kg/分鐘、或7μg/kg/分鐘至15μg/kg/分鐘之間的劑量輸注。

試劑盒

本發(fā)明還提供試劑盒來(lái)在有需要的受試者中治療、抑制和/或預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移。該試劑盒包括：組合物，該組合物包含與本文所述治療劑復(fù)合的藥物遞送分子；和用于在有需要的受試者中治療、抑制和/或預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移的組合物的使用說(shuō)明書。

試劑盒是包括至少一種本發(fā)明組合物的材料或組分的集合物。因此，在一些實(shí)施方案中，試劑盒含有包括與如上所述治療劑復(fù)合的藥物遞送分子的組合物。

本發(fā)明試劑盒中配置的組分的準(zhǔn)確性質(zhì)取決于所述試劑盒的預(yù)定目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒是特別針對(duì)人類受試者配置的。在其他實(shí)施方案中，試劑盒被配置來(lái)用于治療諸如但不限于農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、家畜和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的受試者的獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

使用說(shuō)明書可包括在試劑盒中。“使用說(shuō)明書”通常包括描述在使用試劑盒的組分來(lái)實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果時(shí)采用的技術(shù)的明確表述，以便治療受試者中的中性粒細(xì)胞減少癥、減輕其嚴(yán)重程度、抑制或預(yù)防。任選地，試劑盒還含有其它適用組分，如測(cè)量工具、稀釋劑、緩沖劑、藥學(xué)上可接受的載體、注射器或?qū)⒁子谟杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到的其它適用附件。

可向從業(yè)者提供試劑盒中組裝的以保持材料或組分的可操作性和效用的任何便利和適合方式儲(chǔ)存的材料或組分。舉例而言，組分可呈溶解、脫水或凍干形式；它們可提供在室溫、冷藏溫度或冷凍溫度下。組分通常包含于合適的包裝材料中。如本文所用的短語(yǔ)“包裝材料”是指一種或多種用于容納試劑盒的內(nèi)容物(如本發(fā)明組合物等)的物理結(jié)構(gòu)。包裝材料是通過(guò)熟知方法構(gòu)造的，優(yōu)選提供無(wú)菌、無(wú)污染物的環(huán)境。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“包裝”是指諸如玻璃、塑料、紙、箔等能夠容納個(gè)別試劑盒組分的合適的固體基質(zhì)或材料。因此，例如，包裝可以是用于容納合適數(shù)量的發(fā)明組合物，所述發(fā)明組合物含有由本文所述方法產(chǎn)生的具有唾液酸酶活性的催化活性抗體。包裝材料通常具有指示試劑盒和/或其組分的內(nèi)容物和/或目的的外部標(biāo)簽。

實(shí)施例

提供以下實(shí)施例以更好說(shuō)明要求保護(hù)的本發(fā)明且不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。就提及的特定材料而言，僅出于說(shuō)明目的且不意圖限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可在不行使本發(fā)明的能力和不脫離本發(fā)明的范圍下開發(fā)等效手段或反應(yīng)物。

實(shí)施例1∶單鏈低聚核苷酸和合成mRNA的遞送

合成mRNA的遞送是對(duì)基因遞送的改進(jìn)替代方式。基因遞送載體必須破壞細(xì)胞核以允許基因表達(dá)，而mRNA僅需要遞送到用于翻譯蛋白質(zhì)產(chǎn)物的細(xì)胞質(zhì)中。諸如將方法用于表達(dá)(例如)用于誘發(fā)體細(xì)胞中的多潛能的所謂山中因子(Yamanaka factor)。雖然傳統(tǒng)“脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法”可用于活體外遞送mRNA，但這種系統(tǒng)和類似系統(tǒng)在活體內(nèi)無(wú)效。

所公開的靶細(xì)胞滲透蛋白(HerPBK10)已證明了用于活體內(nèi)核酸和藥物遞送的效力。還為基因和藥物遞送發(fā)展了相關(guān)蛋白質(zhì)(PBK10)。HerPBK10經(jīng)由與人類表皮生長(zhǎng)因子受體(HER3)的相互作用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的靶向結(jié)合和滲透，并且PBK10經(jīng)由整聯(lián)蛋白相互作用來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的靶向結(jié)合和滲透。

下文中，證明了HerPBK10和PBK10用于遞送單鏈低聚核苷酸和合成mRNA的效用。

HerPBK10在MDA-MB-435細(xì)胞中運(yùn)送標(biāo)記的低聚核苷酸。為確定HerPBK10是否可以介導(dǎo)單鏈低聚核苷酸遞送，采用HerPBK10(5μg)或Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、商用轉(zhuǎn)染試劑作為比較性對(duì)照物，在0.1M HEPES/Optimem I(Invitrogen；Carlsbad,CA,USA)中，室溫下培育Cy3標(biāo)記低聚核苷酸(50pmol)20分鐘。將合成混合物加入MDA-MB-435細(xì)胞，其表達(dá)HER，并且在37℃下培育1h。細(xì)胞在室溫下固定于4％PFA中15分鐘，并且針對(duì)HerPBK10為免疫熒光法進(jìn)行處理。用DAPI復(fù)染色細(xì)胞以鑒別細(xì)胞核。使用Leica SP2激光掃描共焦顯微鏡獲得圖像。正如所料，脂質(zhì)體介導(dǎo)攝取導(dǎo)致低聚核苷酸定位在細(xì)胞內(nèi)部(圖1A)。重要地，HerPBK10在HerPBK10低聚復(fù)合物的結(jié)合和攝取期間與低聚核苷酸共存(圖1B)，從而HerPBK10介導(dǎo)低聚核苷酸向細(xì)胞中的運(yùn)送。

PBK10介導(dǎo)mRNA遞送。將編碼GFP的1kb合成mRNA(圖2A)用于測(cè)試PBK10介導(dǎo)向用于蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞中遞送的能力。將來(lái)自由Lipofectin遞送的mRNA的GFP表達(dá)與由Lipofectin遞送的GFP表達(dá)質(zhì)粒相比較。當(dāng)由Lipofectin遞送時(shí)，mRNA在HeLa細(xì)胞中以可由熒光顯微術(shù)檢測(cè)到的水平表達(dá)GFP(圖2B)。PBK10和編碼GFP的合成mRNA以PBK10:mRNA為20:1的體重比在室溫下于HEPES-緩沖鹽水(HBS)中混合約20分鐘，并隨后以約50至70％匯合度被添加至附著HeLa細(xì)胞。因此，PBK10形成具有mRNA的復(fù)合物，該復(fù)合物類似于先前發(fā)展PBK10來(lái)遞送的基因遞送復(fù)合物(圖2C)。

通過(guò)首先評(píng)價(jià)在PBK10與mRNA之間制得的復(fù)合物的細(xì)胞結(jié)合，檢驗(yàn)PBK10介導(dǎo)遞送的能力。在HeLa細(xì)胞上在冰上培育PBK10-mRNA復(fù)合物，以促進(jìn)受體結(jié)合而不是內(nèi)化，隨后所述細(xì)胞被洗滌以移除游離(未結(jié)合)復(fù)合物并且通過(guò)ELISA處理以使用針對(duì)PBK10的一級(jí)抗體鑒別細(xì)胞表面結(jié)合復(fù)合物。細(xì)胞表面結(jié)合的基于ELISA的檢測(cè)表明復(fù)合物(PBK10+mRNA)結(jié)合至細(xì)胞(圖2D)。在細(xì)胞上培育PBK10(無(wú)mRNA)之后，還為免疫熒光法單獨(dú)針對(duì)PBK10處理細(xì)胞。為驗(yàn)證細(xì)胞結(jié)合復(fù)合物(E)的攝取，細(xì)胞如早前描述在冰上用復(fù)合物培育，洗滌，隨后在37℃下溫?zé)嵋源龠M(jìn)內(nèi)化。細(xì)胞在溫?zé)嶂笾甘緯r(shí)間點(diǎn)處固定，并且為免疫熒光法針對(duì)PBK10(綠色)進(jìn)行處理。細(xì)胞用羅丹明鬼筆環(huán)肽與DAPI分別地復(fù)染色以鑒別肌動(dòng)蛋白(紅色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)。使用Leica SPE激光掃描共焦顯微鏡獲得圖像。該發(fā)現(xiàn)表明復(fù)合物經(jīng)歷向HeLa細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的時(shí)間依賴性內(nèi)化(圖2E)。在用PBK10-mRNA復(fù)合物培育細(xì)胞之后約24h時(shí)，固定一組單獨(dú)的HeLa細(xì)胞并且為免疫熒光法針對(duì)GFP進(jìn)行處理。該發(fā)現(xiàn)表明GFP表達(dá)可在PBK10介導(dǎo)的mRNA遞送之后檢測(cè)到，雖然頻率很低(極少細(xì)胞)(圖2D)。允許充分GFP表達(dá)(可被免疫熒光法檢測(cè))的PBK10:mRNA的最佳體重比是20(圖2E)。這些發(fā)現(xiàn)總而言之表明有可能通過(guò)PBK10或HerPBK10來(lái)遞送mRNA，因?yàn)閮煞N蛋白質(zhì)皆以類似方式與核酸相互作用。

實(shí)施例2∶靶向c-Met的蛋白質(zhì)納米構(gòu)造物

受體酪氨酸激酶(RTK)、c-MET以及其內(nèi)源性配體、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)有助于細(xì)胞遷移、形態(tài)發(fā)生分化、和三維管狀結(jié)構(gòu)的機(jī)化以及在正常組織發(fā)育期間的細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成。然而，c-MET和HGF的調(diào)節(jié)異?？捎兄谀[瘤進(jìn)展，并且在此類環(huán)境中，與大量人類癌癥中的不良預(yù)后有關(guān)。

c-MET的細(xì)胞表面上升與耐藥性相關(guān)，包括獲得的對(duì)電信號(hào)阻斷療法的耐受性，并因此變?yōu)镽TK靶向療法的重要生物標(biāo)記。然而，大多數(shù)靶向RTK的療法被設(shè)計(jì)成抑制支持腫瘤存活的下游信號(hào)路徑，初始響應(yīng)此類治療的腫瘤幾乎普遍獲得對(duì)信號(hào)抑制的耐受性，同時(shí)大量組體已內(nèi)在地抵抗此類信號(hào)阻斷療法。

不需要信號(hào)抑制的腫瘤靶向策略可證明對(duì)c-MET陽(yáng)性癌細(xì)胞更有效?？赏ㄟ^(guò)配體識(shí)別c-MET以觸發(fā)附屬治療的的細(xì)胞攝取，從而省略對(duì)阻斷信號(hào)的需要，解決這一問題。雖然HGF有潛力完成此舉，但其對(duì)四聚體化和二硫鍵的需要對(duì)治療學(xué)發(fā)展構(gòu)成技術(shù)難題。一種用于c-MET靶向的替代性和潛在更優(yōu)配體可能來(lái)源于導(dǎo)致食物中毒的細(xì)菌。

人類病原體(核細(xì)胞增生利斯特氏菌)結(jié)合c-MET，從而通過(guò)其稱為內(nèi)化蛋白的表面蛋白質(zhì)來(lái)侵襲寄主細(xì)胞。特定而言，在c-Met結(jié)合之后，內(nèi)化蛋白B(InlB)觸發(fā)受體介導(dǎo)胞吞作用。InlB和HGF識(shí)別c-Met的不同區(qū)域，并且InlB不需要用于結(jié)合的四聚體化或二硫鍵。因此，InlB可能適宜于我們先前建立來(lái)用于靶向諸如人類表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)之類其他受體的用于腫瘤靶向的納米生物策略。

PBK10是來(lái)源于腺病毒衣殼五鄰體基底的重組蛋白，所述腺病毒衣殼五鄰體基底可通過(guò)五鄰體基底的膜滲透活性來(lái)介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞中的基因和藥物遞送。已表明，當(dāng)融合至腫瘤特異性配體時(shí)，PBK10可靶向腫瘤細(xì)胞。在該研究中，InlB的受體-結(jié)合位點(diǎn)是作為與PBK10的重組融合體來(lái)產(chǎn)生，以產(chǎn)生新蛋白質(zhì)(InlB-PBK10)，其介導(dǎo)細(xì)胞毒素劑向c-MET陽(yáng)性癌細(xì)胞的靶向遞送。

該發(fā)現(xiàn)表明，InlB-PBK10可作為可溶解融合蛋白質(zhì)產(chǎn)生，可溶解融合蛋白質(zhì)識(shí)別各種腫瘤細(xì)胞系上的c-MET，并且在細(xì)胞結(jié)合之后經(jīng)歷迅速內(nèi)化。InlB-PBK10形成具有毒性化合物(諸如咔咯)的直徑約10至20nm的納米簇，并且在細(xì)胞進(jìn)入之后介導(dǎo)咔咯滲透入向細(xì)胞質(zhì)中，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。因此，Inl-PBK10是用于毒性分子向MET表達(dá)腫瘤的靶向遞送的新穎構(gòu)造物。

背景

作為腫瘤生物標(biāo)記的c-MET。間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)變因子或MET是首先作為激活癌基因發(fā)現(xiàn)的受體酪氨酸激酶(RTK)。用于MET、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的內(nèi)源性配體(又名成纖維細(xì)胞衍生細(xì)胞運(yùn)動(dòng)因子或分散因子(SF))通常激活MET以誘發(fā)細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)性、存活和分化路徑。MET和HGF主要分別在上皮和間充質(zhì)來(lái)源的細(xì)胞中表達(dá)。HGF和MET之間的旁分泌信號(hào)介導(dǎo)上皮-間充質(zhì)相互作用，該相互作用調(diào)控組織生長(zhǎng)和形態(tài)發(fā)生分化。正常組織中的HGF-MET信號(hào)有助于胚胎發(fā)生、器官發(fā)生、血管生成、傷口愈合和組織再生，而這種路徑的異常信號(hào)是與腫瘤發(fā)展和進(jìn)展、腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

c-MET由胺基(N)-端胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜片段和羧基(C)-端胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成。胞外區(qū)域由接近PSI結(jié)構(gòu)域(存在于plexin、semaphorin和整聯(lián)蛋白中)的胺基(N)-端Semaphorin(Sema)結(jié)構(gòu)域以及4種免疫球蛋白(Ig)-樣結(jié)構(gòu)域組成，這4種免疫球蛋白(Ig)-樣一起組成HGF的結(jié)合部位。通過(guò)HGF的受體結(jié)合，導(dǎo)致MET的二聚作用，激活了通過(guò)ERK1/2、AKT和STAT3、磷脂酰肌醇3-激酶(PI-3K)、Ras-Raf-MAPK和磷脂酶C的信號(hào)。配體觸發(fā)的MET胞吞作用通過(guò)發(fā)動(dòng)蛋白和網(wǎng)格蛋白依賴性路徑發(fā)生，所述路徑介導(dǎo)通過(guò)降解和再循環(huán)胞吞途徑的運(yùn)輸(trafficking)。

c-MET信號(hào)的調(diào)節(jié)異常通過(guò)若干機(jī)制發(fā)生，包括有或者沒有基因擴(kuò)增的過(guò)表達(dá)和組成性激酶活化，激酶結(jié)構(gòu)域突變，以及通過(guò)過(guò)表達(dá)HGF對(duì)c-MET的旁分泌/自分泌激活。c-MET的配體獨(dú)立性激活還破壞正常HGF-MET信號(hào)，并且可由導(dǎo)致組成性二聚作用的突變以及缺氧條件引起。后者可激活MET的HIF-1α-誘發(fā)轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致蛋白水平升高，擴(kuò)增HGF信號(hào)并且促進(jìn)侵襲。

一般而言接受的是，跨腫瘤的各種RTK的異源表達(dá)是許多種癌癥中耐受性的主要機(jī)制。旨在抑制一種特異性RTK的療法常常因?yàn)槠渌鸕TK的上調(diào)或配體刺激而不成功，所述上調(diào)或配體刺激又維持對(duì)于細(xì)胞存活關(guān)鍵性的因子的信號(hào)，所述因子包括PI3K和促分裂原激活蛋白質(zhì)激酶(MAPK)。研究中對(duì)這種耐受性機(jī)制的鑒別表明，對(duì)EGFR抑制劑的耐受性與非小細(xì)胞肺癌以及其他腫瘤(包括乳腺癌)中MET信號(hào)的補(bǔ)償上調(diào)相關(guān)。總而言之，c-MET是治療性干預(yù)的有效候選者，因?yàn)槠渑c各種類型的癌癥、不良預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且可能是用于抗鑒別和靶向腫瘤的有用生物標(biāo)記。

臨床中目前靶向HGF/MET路徑的療法是由針對(duì)HGF(Ficlatuzumab)或MET(Onartuzumab)的抗體、或?qū)騇ET激酶結(jié)構(gòu)域的小分子抑制劑(Tivantinib或ARQ197)組成。所有這些方法的問題在于它們對(duì)治療效力的信號(hào)抑制的依賴，這可能造成先前提及的補(bǔ)償性RTK串饋，促進(jìn)耐受性的發(fā)展。存在著對(duì)使用組合療法來(lái)阻斷或破壞多個(gè)RTK、尤其EGF-R和MET的功能的日益增加的興趣，條件是這兩個(gè)受體之間有顯著串饋。雖然測(cè)試這種方法的活體外研究已顯示出對(duì)腫瘤細(xì)胞系諸如肺癌、乳腺癌、胃癌和結(jié)腸直腸癌的前景，但測(cè)試這個(gè)方法的臨床試驗(yàn)尚在進(jìn)行中并且還有不確定性。

細(xì)菌病原體蛋白質(zhì)用作潛在c-MET靶向劑。內(nèi)化蛋白B(InlB)是在人類細(xì)菌病原體(單核細(xì)胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes；Lm))的表面上顯示的蛋白質(zhì)，并且通過(guò)結(jié)合至c-MET來(lái)促進(jìn)Lm進(jìn)入到非吞噬性細(xì)胞中。InlB是Lm內(nèi)化蛋白的大家族的成員，所述Lm內(nèi)化蛋白包含N端螺旋帽結(jié)構(gòu)域，以及不同數(shù)目的富白氨酸重復(fù)(LRR)，所述重復(fù)接近于免疫球蛋白樣內(nèi)重復(fù)(IR)區(qū)域。與其他內(nèi)化蛋白不同，InlB結(jié)構(gòu)還在C端含有B重復(fù)和3個(gè)GW模塊。InlB321(InlB的能夠以高親合力結(jié)合至c-MET的片段)由稱為Cap、LRR(蛋白-蛋白相互作用域)和IR區(qū)域的蛋白結(jié)構(gòu)域組成。InlB321向MET的結(jié)合通過(guò)其兩個(gè)結(jié)構(gòu)域發(fā)生∶LRR和IR，其分別結(jié)合至MET的Ig1和Sema結(jié)構(gòu)域。

InlB作為潛在腫瘤靶向配體比HGF具有若干優(yōu)點(diǎn)。HGF是含有20個(gè)硫化物鍵的異源二聚蛋白，并且需要將前蛋白分裂成組裝亞基，這可能使重組體生產(chǎn)變得復(fù)雜，尤其是作為向外源蛋白結(jié)構(gòu)域的融合體時(shí)。相比之下，InlB321已經(jīng)在大腸桿菌(Escherichia coli)中作為重組可溶解配體產(chǎn)生，并且可容忍向其他蛋白質(zhì)的融合(圖3A)?；铙w外研究已證明，InlB321肽可在MET結(jié)合之后觸發(fā)受體介導(dǎo)內(nèi)化，這有助于其作為納米遞送劑來(lái)使用。同樣重要的是注意到，MET的HGF結(jié)合部位與InlB321的HGF結(jié)合部位之間不存在重疊(圖3B)；因此，用于結(jié)合至MET的這兩個(gè)配體之間不存在競(jìng)爭(zhēng)。

在目前研究中，通過(guò)將這種肽作為向Ad5五鄰體基底(PB)的重組融合體來(lái)產(chǎn)生它，使其重塑，所述Ad5五鄰體基底在羧基(C)端由十賴氨酸序列(K10)修飾。所得多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)(InlB-PBK10)包含用于以下的功能：運(yùn)送陰離子裝載物，如核酸或咔咯(由K10結(jié)構(gòu)域介導(dǎo))；靶向結(jié)合和內(nèi)化(由InlB321結(jié)構(gòu)域介導(dǎo))；以及膜滲透和胞內(nèi)運(yùn)輸(由PB結(jié)構(gòu)域介導(dǎo))。提供了針對(duì)以下的結(jié)果：InB-PBK10融合基因的構(gòu)造，由這種重組基因編碼的融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，針對(duì)該蛋白質(zhì)結(jié)合至MET和進(jìn)入細(xì)胞的能力進(jìn)行表征，和估價(jià)其在活體外遞送細(xì)胞毒素有效負(fù)載的能力。

結(jié)果

可構(gòu)造重組基因以編碼InlB-PBK10。產(chǎn)生InlB-PBK10基因構(gòu)造物的策略涉及兩步克隆法，所述兩步克隆法必須包括InlB 321的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增以克隆進(jìn)入pRSET-A細(xì)菌表達(dá)質(zhì)粒中，隨后在InlB321序列的3’端處插入PBK10。為完成此舉，設(shè)計(jì)低聚核苷酸引物以通過(guò)PCR將限制性內(nèi)切位點(diǎn)引入InlB321中來(lái)將這種序列與PBK10接合以用于“框內(nèi)”插入表達(dá)質(zhì)粒pRSET-A中。

我們的正向和反向低聚核苷酸引物分別包含以下序列∶

5’-AGTGAGCTCGAGACTATCACTGTG-3’(SEQ ID NO:1)和5’-GTTGGTGACTTTCTCCCACCTTCACCACCTTCTCTAGATATCCATGGTAT-3’(SEQ ID NO:2)。

將限制性內(nèi)切位點(diǎn)SacI引入正向引物，以將InlB321閱讀框放置成與由pRSET-A編碼的N端聚組氨酸序列毗連。BglII和KpnI限制性內(nèi)切位點(diǎn)被引入反向引物中。SacI和KpnI被用于將InlB321插入pRSETA中，并且BglII被用于隨后將PBK10插入InlB321編碼序列的3’端。編碼Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:3)氨基酸基元的序列被包括在反向引物中以在InlB321和PBK10之間摻入短的柔性聯(lián)結(jié)子。使用高保真度聚合酶來(lái)確保不將突變引入InlB321PCR產(chǎn)物。

800bp InlB321PCR產(chǎn)物在SacI和KpnI限制性內(nèi)切位點(diǎn)連接到pRSETA中，產(chǎn)生質(zhì)粒構(gòu)造物，pRSETA-InlB。PBK10隨后被在限制性內(nèi)切位點(diǎn)BglII和HindIII處插入pRSETA-InlB中。為此，在限制性內(nèi)切位點(diǎn)BamHI和HindIII處從質(zhì)粒構(gòu)造物pRSETA-PBK10中切除PBK10，并且連接到兩倍消化pRSETA-InlB中，產(chǎn)生pRSETA-InlB-PBK10構(gòu)造物(圖4A)。我們還生產(chǎn)了構(gòu)造物pRSETA-GFP-InlB，其將InlB321編碼為綠色熒光蛋白(GFP)的羧基[C]端融合以用于將來(lái)可能的活體外和活體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)。該構(gòu)造物通過(guò)消化先前用SacI和BglII描述的800bp InlB PCR產(chǎn)物來(lái)制得，并且將它連接到pRSETA-GFP質(zhì)粒中，這將InlB插入物放置成與GFP的編碼序列在框內(nèi)(圖4B)。所有構(gòu)造物被兩倍消化并且使用1％瓊脂糖凝膠通過(guò)電泳來(lái)評(píng)估以確認(rèn)預(yù)期條帶的存在(圖4C)。另外，所有3種構(gòu)造物被測(cè)序以確認(rèn)其同一性以及驗(yàn)證突變未被引入閱讀框中。

重組蛋白InlB、InlB-PBK10和GFP-InlB可在細(xì)菌中產(chǎn)生。先前描述的所有3種質(zhì)粒構(gòu)造物(pRSET-InlB、pRSET-InlB-PBK10和pRSET-GFP-InlB)被轉(zhuǎn)變成大腸桿菌菌株，BLR(DE3)pLysS，以用于隨后的蛋白表達(dá)和純化，如所述方法中描述。與更傳統(tǒng)的(即BL21)表達(dá)菌株相反，該菌株更加容忍重復(fù)序列，因此實(shí)現(xiàn)獲得包含C端聚賴氨酸的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的能力。同時(shí)，pRSET-A質(zhì)粒將蛋白質(zhì)編碼為多組氨酸序列的N端融合。這種組氨酸(His)標(biāo)記實(shí)現(xiàn)使用鎳螯合樹脂的親合力純化，并且通過(guò)抗His標(biāo)記抗體提供用于識(shí)別的表位。

所有3種構(gòu)造物在細(xì)菌中產(chǎn)生可溶解蛋白質(zhì)(InlB、InlB-PBK10和GFP-InlB)，所述可溶解蛋白質(zhì)可使用鎳-軛合樹脂通過(guò)金屬螯合物親和色譜法分離，如所述方法中描述?？笻is標(biāo)記抗體識(shí)別所有3種蛋白質(zhì)，其通過(guò)在約37kDa(InlB)、約100kDa(InlB-PBK10)和約63kDa(GFP-InlB)的預(yù)測(cè)分子量處使凝膠電泳變性來(lái)遷移(圖5)。

c-MET的表面水平在不同腫瘤細(xì)胞系之間不同。表征InlB-PBK10的第一目標(biāo)是確定該蛋白質(zhì)是否識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的c-MET。大部分針對(duì)與不同腫瘤細(xì)胞系相關(guān)的c-MET水平的文獻(xiàn)是基于總c-MET蛋白質(zhì)表達(dá)或者RNA表達(dá)，且因此不提供關(guān)于在細(xì)胞表面上顯示的c-MET的水平的信息。因此，重要的是首先在可為我們所用的細(xì)胞系的圖上確定c-MET的相對(duì)細(xì)胞表面水平。這經(jīng)證明是最初的挑戰(zhàn)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)可用于此類評(píng)價(jià)的抗體已針對(duì)c-MET的細(xì)胞溶質(zhì)結(jié)構(gòu)域被產(chǎn)生，并且用于評(píng)估c-MET表達(dá)和激活的機(jī)制。為了該研究，使用特別針對(duì)細(xì)胞表面c-MET研發(fā)的MET3抗體。我們使用細(xì)胞表面ELISA來(lái)測(cè)量c-MET在各種細(xì)胞系上的相對(duì)細(xì)胞表面水平。簡(jiǎn)單地說(shuō)，這種方法實(shí)現(xiàn)我們?cè)诜峭富?xì)胞上測(cè)量表面上相對(duì)受體水平，并且可以以96孔格式執(zhí)行，允許多重復(fù)制以及保存貴重試劑。我們的ELISA結(jié)果表明H1993(肺癌細(xì)胞系系)和MDA-MB-231(乳腺癌細(xì)胞系系)是具有最高的c-MET細(xì)胞表面水平的細(xì)胞系。RANKL(前列腺癌細(xì)胞系)和MDA-MB-435(乳腺癌細(xì)胞系)顯示中等水平，而LN-GFP(前列腺癌細(xì)胞系)和Cos-7(非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞)顯示細(xì)胞表面c-MET的較低水平(圖6)。

InlB衍生肽識(shí)別c-MET。為了評(píng)價(jià)靶向配體的受體特異性，我們使用熒光激化細(xì)胞分選(FACS)來(lái)測(cè)量InlB結(jié)合至c-MET陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)水平。測(cè)試兩種腫瘤細(xì)胞系對(duì)InlB的結(jié)合∶一種腫瘤細(xì)胞系具有高表達(dá)的c-MET(H1993)，并且另一種腫瘤細(xì)胞系具有低表達(dá)的c-MET(LN GFP)。與LN GFP相比，InlB顯示出相應(yīng)更高水平的對(duì)H1993細(xì)胞的結(jié)合(圖7A)。為驗(yàn)證InlB是否特異性結(jié)合至c-MET，我們使用來(lái)源于MET的胞外、配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可溶解肽(MET肽)作為InlB結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。抑制劑與配體的等摩爾比率預(yù)測(cè)受體結(jié)合降低50％。一致同意，MET:InlB的等摩爾(1:1)濃度使InlB對(duì)H1993細(xì)胞的結(jié)合減少50％，指示c-MET選擇性結(jié)合。(圖7B)。

InlB-PBK10的細(xì)胞結(jié)合與c-MET水平相關(guān)，并且被游離配體競(jìng)爭(zhēng)性抑制。在上述部分中，我們展示了InlB具有通過(guò)c-MET結(jié)合至c-MET陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞系的能力。下一個(gè)目標(biāo)是測(cè)試當(dāng)具體化為融合蛋白質(zhì)的一部分時(shí)，通過(guò)InlB的受體結(jié)合是否將被影響。為評(píng)估此狀況，我們使用細(xì)胞表面ELISA評(píng)價(jià)InlB-PBK10對(duì)表達(dá)高c-MET(MDA-MB-231)和低c-Met(Cos-7)的細(xì)胞系的結(jié)合。與表達(dá)相對(duì)低c-MET水平的細(xì)胞(Cos-7)相比，InlB-PBK10展示出對(duì)具有更高c-MET細(xì)胞表面表達(dá)(MDA-MB-231)的細(xì)胞的更高結(jié)合水平(圖7C)。為進(jìn)一步確認(rèn)InlB-PBK10識(shí)別c-MET，將游離InlB配體用作競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。在增加濃度的InlB存在下，InlB-PBK10展示出對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的結(jié)合減少，表明InlB-PBK10通過(guò)c-MET結(jié)合這種細(xì)胞(圖7D)。

InlB-PBK10在懸浮液中顯示對(duì)細(xì)胞上c-MET的結(jié)合。作為對(duì)c-MET識(shí)別的進(jìn)一步確認(rèn)，我們測(cè)試InlB-PBK10是否可在懸浮液中結(jié)合至細(xì)胞(與評(píng)價(jià)結(jié)合至附著細(xì)胞的上述試驗(yàn)相反)。我們執(zhí)行拉下實(shí)驗(yàn)，其中我們?cè)谧鳛楦?jìng)爭(zhēng)性抑制劑的增加濃度的游離InlB配體存在下，在具有InlB-PBK10的懸浮液中培育c-MET陽(yáng)性細(xì)胞系(MDA-MB-435)。選擇游離InlB配體的濃度，以使得InlB-PBK10:InlB的摩爾比率為1:1、1:5和1:10。與細(xì)胞團(tuán)塊共沉淀的InlB-PBK10水平隨后通過(guò)Western印跡使用對(duì)InlB-PBK10特異性的抗體(Ad5抗體，其識(shí)別五鄰體基底)來(lái)評(píng)價(jià)。Inl-PBK10結(jié)合的水平隨InlB的濃度增加而降低，其中結(jié)合幾乎被完全抑制，從而驗(yàn)證InlB-PBK10在懸浮液中可識(shí)別和結(jié)合c-MET(圖7E)。

InlB-PBK10內(nèi)化到c-MET+細(xì)胞中。為檢驗(yàn)細(xì)胞攝取之后InlB-PBK10的存活率和檢測(cè)性，我們首先在4℃下培育具有3種不同細(xì)胞類型(MDA-MB-231、MDA-MB-435和H1993)的InlB-PBK10以促進(jìn)受體結(jié)合而不是內(nèi)化。為誘發(fā)胞吞作用，我們隨后在37℃下經(jīng)歷指示時(shí)間培育細(xì)胞并且在特定時(shí)間點(diǎn)固定所述細(xì)胞至多30分鐘。免疫熒光著色和共焦顯微術(shù)表明在所有3種細(xì)胞系中，InlB-PBK10(以綠色示出)聚集在細(xì)胞膜上，并且在結(jié)合的首個(gè)5分鐘內(nèi)集合到細(xì)胞膜上的焦點(diǎn)中。InlB-PBK10隨后經(jīng)30分鐘積累在核周區(qū)域中。這些數(shù)據(jù)表明InlB-PBK10可在細(xì)胞結(jié)合之后30分鐘內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)部?jī)?nèi)在化和積累(圖8)。細(xì)胞在特定時(shí)間點(diǎn)固定至多30分鐘，并且通過(guò)激光掃描共焦顯微術(shù)成像。紅色，肌動(dòng)蛋白；藍(lán)色，細(xì)胞核。比例尺，約10微米。

InlB-PBK10向c-MET+細(xì)胞遞送毒性分子。為評(píng)估InlB-PBK10的內(nèi)涵體溶解能力，我們?cè)u(píng)價(jià)其是否可介導(dǎo)自身先天不能夠滲透細(xì)胞膜的細(xì)胞毒素劑進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入。包含鎵(III)(S2Ga或Ga-咔咯)的磺化咔咯是強(qiáng)熒光化合物，其可自發(fā)地與蛋白質(zhì)組裝。在沒有膜滲透載體來(lái)將這些化合物遞送到細(xì)胞中以觸及毒性的細(xì)胞質(zhì)靶標(biāo)的情況下，所述化合物不可能跨越細(xì)胞膜。20-22Medina-Kauwe實(shí)驗(yàn)室先前已顯示單獨(dú)的Ga-咔咯是無(wú)毒的，但當(dāng)通過(guò)HerPBK10遞送到HER2+腫瘤細(xì)胞中時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞死亡。

為了該研究，將InlB-PBK10與Ga-咔咯混合以促進(jìn)非共價(jià)組裝，并且所得InlB-PBK10-Ga復(fù)合物通過(guò)透射電子顯微術(shù)(TEM)和動(dòng)態(tài)光散射來(lái)表征(圖9A和9B)。TEM(圖9A的右圖)顯示，與單獨(dú)的InlB-PBK10(-S2Ga)相比，當(dāng)Ga-咔咯(+S2Ga)添加至InlB-PBK10時(shí)，形成球形組裝物。該圖像顯示所述蛋白和咔咯形成10至20nm直徑的簇。用于測(cè)量粒度的動(dòng)態(tài)光散射顯示，單獨(dú)的InlB-PBK10形成平均直徑8.4nm的顆粒，而InlBPBK10-Ga直徑為約16.4nm。

為檢驗(yàn)InlB-PBK10-Ga是否可滲透細(xì)胞以及誘發(fā)c-MET陽(yáng)性癌細(xì)胞系中的咔咯介導(dǎo)毒性，我們將MDA-MB-435細(xì)胞暴露于1μM、5μM和10μM的以下各者：InlB-PBK10、S2Ga和InlB-PBK10-Ga。在1μm濃度下，InlB-PBK10-Ga使細(xì)胞存活率減少60％，而1μm和更高濃度的單獨(dú)S2Ga和單獨(dú)InlB-PBK10不影響細(xì)胞存活率。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)InlB-PBK10具有內(nèi)涵體溶解能力，并且表明該構(gòu)造物能夠遞送諸如Ga-咔咯的細(xì)胞毒素劑到表達(dá)細(xì)胞表面c-MET的細(xì)胞中(圖9C)。

為進(jìn)一步評(píng)估InlB-PBK10的治療性能力，評(píng)價(jià)該蛋白是否可用于遞送更多主流化學(xué)治療分子。阿霉素(Dox)是FDA批準(zhǔn)的用于大量癌癥類型的細(xì)胞毒素劑。如果此類藥物可主要地靶向腫瘤細(xì)胞，則其就減少副作用而言將是有益的。在該方法中，Dox首先被插入到雙鏈低聚中以形成DNA-Dox，其隨后可結(jié)合至InlB-PBK10的聚賴氨酸(經(jīng)由與DNA磷酸鹽主鏈的電荷相互作用)并且形成我們稱為I-Dox的復(fù)合物。I-Dox復(fù)合物(相對(duì)于Dox濃度5μM)是在所述方法中描述的條件下在指示細(xì)胞系上培育。InlB-PBK10是在與I-Dox復(fù)合物等同的濃度下培育。細(xì)胞存活率是通過(guò)在治療之后24h的代謝(MTT)分析來(lái)評(píng)價(jià)。當(dāng)與具有低c-MET表達(dá)的細(xì)胞(LAPC4)相比時(shí)，I-Dox復(fù)合物誘發(fā)具有高c-MET表達(dá)的細(xì)胞(H1993)顯著的毒性(圖9D)。H1993細(xì)胞首先用游離InlB配體處理以阻斷c-MET，隨后在如上相同條件下暴露于I-Dox。單獨(dú)的InlB-PBK10似乎稍微而不是顯著地減少細(xì)胞數(shù)量，表明細(xì)胞死亡的主要機(jī)制是通過(guò)Dox的遞送發(fā)生作用。另外，游離InlB配體通過(guò)I-Dox抑制細(xì)胞毒性，表明I-Dox-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通過(guò)用于遞送Dox的c-MET結(jié)合和進(jìn)入來(lái)發(fā)生(圖9E)。

實(shí)驗(yàn)程序

細(xì)胞。人類乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-435*和MDA-MB-231)是得自國(guó)家癌癥研究所(National Cancer Institute)。人類肺癌(H1993)和非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞(Cos-7)細(xì)胞系是得自ATCC。人類卵巢癌細(xì)胞(A2780)是得自Sigma-Aldrich。前列腺癌細(xì)胞系(LNCaP^Neo/RANKL,LNCaP^Neo)由Leland Chung博士友情提供(Cedars-Sinai醫(yī)療中心)。MDA-MB-435和MDA-MB-231被維持在DMEM中(5％CO₂下，10％v/v胎牛血清(FBS,Sigma-Aldrich)，和1％v/v青霉素/鏈霉素(Sigma-Aldrich))。H1993和A2780細(xì)胞被維持在RPMI中(5％CO₂下，10％v/v FBS和1％v/v青霉素/鏈霉素)。Cos-7細(xì)胞維持在DMEM/F12培養(yǎng)基中(5％CO₂下，20％v/v非加熱鈍化胎牛血清(ATCC 30-2020)和1％v/v青霉素/鏈霉素(Sigma-Aldrich))。LNCaP^Neo/RANKL、LNCaP^Neo被維持在RPMI培養(yǎng)基中(10％v/v FBS，和1％v/v青霉素/鏈霉素和200μg G418重硫酸鹽溶液(Sigma Aldrich G8168))。將200μg/mL潮霉素(GEMINI生物產(chǎn)物400-123)添加至LNCaP^Neo/RANKL細(xì)胞的培養(yǎng)基以維持RANKL表達(dá)質(zhì)粒。為了維持細(xì)胞系之間的等同匯合度，在某些分析中，根據(jù)其生長(zhǎng)率來(lái)涂覆它們。

DNA構(gòu)建體。靶向構(gòu)造物(InlB-PBK10)是通過(guò)兩步克隆法產(chǎn)生(圖8A中概括)，其中編碼InlB和PBK10的序列順序地一起被連接到蛋白表達(dá)質(zhì)粒pRSET-A(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。編碼內(nèi)化蛋白B的aa 36-321的質(zhì)粒構(gòu)造物(pMET-30-InlB321)(CeBiTec)，Bielefeld University,Germany)被用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的模板，使用分別包含序列5’-AGTGAGCTCGAGACTATCACTGTG-3’(SEQ ID NO:1)和5’-GTTGGTGACTTTCTCCCACCTTCACCACCTTCATCTAGATATCCATGGTAT-3’(SEQ ID NO:2)的正向和反向低聚核苷酸引物。SacI限制性內(nèi)切位點(diǎn)被引入正向引物中以用于框內(nèi)插入p RSET-A中。BglII和KpnI限制性內(nèi)切位點(diǎn)被引入反向引物以用于P BK10隨后框內(nèi)插入InlB編碼序列的3’。反向引物還包含位于InlB和PBK10序列中間的編碼柔性聯(lián)結(jié)子(GlyGlySerGlyGlySer)(SEQ ID N O:3)。800bp InlB PCR產(chǎn)物用SacI和KpnI消化以連接到pRSET-A中。所得構(gòu)造物pRSETA-InlB隨后用BglII和HindIII消化以容納與I nlB在框內(nèi)的PBK10的插入。使用BamHI和HindIII限制酶從質(zhì)粒p RSET-PBK10中切除PBK10，并且插入pRSETA-InlB的BglII-HindII I位點(diǎn)中，產(chǎn)生pRSET-InlB-PBK10構(gòu)造物。

通過(guò)用SacI和BglII消化先前描述的800bp InlB PCR產(chǎn)物并且將其連接到pRSETA-GFP質(zhì)粒中以用于InlB321的框內(nèi)克隆，制得pRSETA-GFP-InlB構(gòu)造物，其將InlB321編碼為綠色熒光蛋白(GFP)的羧基[C]端融合。

細(xì)菌的蛋白表達(dá)和純化。將BLR(DE3)pLysS(Novagen,Madison WI,USA)細(xì)菌轉(zhuǎn)化體的過(guò)夜培養(yǎng)物1:50接種于包含0.5mg/ml氨芐西林和0.034mg/mL氯霉素和0.0125mg/ml四環(huán)素的LB中。當(dāng)培養(yǎng)物在600nm光密度波長(zhǎng)(OD 600)下達(dá)到0.6的吸光率讀數(shù)時(shí)，培養(yǎng)物用0.4mM IPTG誘發(fā)并且在37℃下伴隨振動(dòng)進(jìn)一步生長(zhǎng)3小時(shí)。收獲培養(yǎng)物并且壓成丸。細(xì)胞團(tuán)塊再懸浮于溶解緩沖液(50mM Tris,pH 8.0,50mM NaCl,2mM EDTA,pH 8.0)中，并且通過(guò)添加0.1％Triton X-100和一個(gè)循環(huán)的凝固-解凍將其溶解，其中1mM苯基甲基磺酰氟化物(PMSF)在解凍期間添加。解凍之后，溶解產(chǎn)物接受10mM MgCl₂，和0.01mg/mL DNase，并且溶解產(chǎn)物在室溫下?lián)u晃10分鐘以允許在溶解產(chǎn)物恢復(fù)至冰之前消化基因組DNA，此后它們接受300mM NaCl和10mM咪唑。溶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷卻離心管，配平，并且在4℃下于預(yù)冷卻轉(zhuǎn)子中以39,000x g離心1小時(shí)?；厥丈锨逡海砑又劣肕CAC-10(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,10mM imidazole，和1％Triton X-100,pH 8.0)預(yù)平衡的Ni-NTA樹脂(Qiagen,Valencia,CA,USA)，并且在冰上培育1小時(shí)。將包含結(jié)合蛋白的樹脂洗滌，一次用20mL MCAC-10緩沖液在冰上10分鐘搖晃，三次用MCAC-20(50mM NaH2PO4，500mM NaCl,20mM咪唑，和10％甘油，pH 8.0)，隨后用50mM Na-磷酸鹽(pH 8.0)、300mM NaCl、250mM咪唑和10％甘油的2mL溶液洗提。蛋白質(zhì)同時(shí)地緩沖交換到低鹽緩沖液中并且通過(guò)超濾作用濃縮(Amicon Ultra Centrifugal Filters-Ultracel-50K(Millipore,Bedford,MA,USA)，并且使用BioRad蛋白定量分析(BioRad Laboratories,Hercules,CA,USA)測(cè)量其濃度。

蛋白質(zhì)檢測(cè)。在本領(lǐng)域已知的不連續(xù)凝膠緩沖系統(tǒng)中執(zhí)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用設(shè)定在恒壓(20V)下的BioRad半干轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的192mM甘氨酸、25mM Tris和20％甲醇，歷時(shí)40分鐘，將蛋白質(zhì)電學(xué)轉(zhuǎn)移到硝化纖維上。印跡用Tris-緩沖鹽水中的3％牛血清白蛋白(10mM Tris,pH 7.5,150mM NaCl)阻斷。印跡以阻斷緩沖液中以1:1500稀釋用抗RGS-His Tag抗血清(Qiagen)過(guò)夜培育。抗體-抗原復(fù)合物通過(guò)以下方式檢測(cè)：用辣根過(guò)氧化酶(HRP)軛合二級(jí)抗體(Sigma,St Louis,MO USA)培育，隨后與HRP底物和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(Thermo Fisher)反應(yīng)，以及暴露于膜(Hyperfilm ECL；Amersham Pharmacia Biotech)。

用于c-MET細(xì)胞表面表達(dá)的基于ELISA的分析。為確定細(xì)胞系上的c-MET水平，使用以下細(xì)胞數(shù)量將細(xì)胞涂覆于96孔板中：每孔8x10³MDA-MB-231、MDA-MB-435、A2780、LNCaP^Neo/RANKL、LNCaP^Neo以及9x10³H1993和LAPC4。48小時(shí)后培養(yǎng)基被吸出，并且細(xì)胞簡(jiǎn)單用包含1mM MgCl₂和1mM CaCl₂(PBS+)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，隨后在室溫下(RT)用12分鐘固定于PBS中的4％PFA內(nèi)，隨后用PBS+(200μL每孔)洗滌3次，然后在阻斷溶液中(3％BSA/PBS，100μL每孔)在室溫下培育1小時(shí)。抗c-MET抗體(小鼠單克隆抗c-MET，按0.87μg/mL使用；Knudson博士)一式三孔地添加(100μL每孔)并且在室溫下培育1小時(shí)。細(xì)胞用PBS+洗滌3次，并且在室溫下用HRP-軛合二級(jí)抗體以1:2000稀釋培育1小時(shí)。細(xì)胞用PBS+洗滌3和用蒸餾水洗滌一次，并且根據(jù)制造商指示，將100μL TMB(eBioscience)溶液添加至各孔。所述板用底物在黑暗中培育30分鐘(或直至看就藍(lán)色顯色)，并且通過(guò)添加100μL的1N HC1來(lái)終止。在450nm處于Spectra MaxM2板式讀數(shù)器(Molecular Devices Corp.)中測(cè)量吸光率。隨后執(zhí)行結(jié)晶紫分析以確定相對(duì)細(xì)胞數(shù)量。簡(jiǎn)單地說(shuō)，細(xì)胞用PBS+(200μL/孔)洗滌一次并且用0.1％結(jié)晶紫(100μL/孔)在室溫下培育15分鐘。細(xì)胞用PBS+(200μL/孔)徹底洗滌4次，并且在室溫下用95％乙醇(100μL/孔)培育10分鐘。在490nm處測(cè)量吸光率。

細(xì)胞結(jié)合分析。為確定不同濃度InlB-PBK10對(duì)細(xì)胞的結(jié)合，按以下濃度將細(xì)胞涂覆于96孔板中∶每孔8x10³LNCaP^Neo/RANKL、LNCaP^Neo和9x10³H1993和LAPC4。在48小時(shí)后，培養(yǎng)基被吸出并且細(xì)胞簡(jiǎn)單用100μL緩沖液A(無(wú)血清DMEM,20mM HEPES，pH 7.4,2mM MgCl₂,3％BSA)洗滌。細(xì)胞用包含指示濃度的InlB-PBK10的50μL緩沖液A在4℃下在冰上伴隨攪動(dòng)培育1小時(shí)。細(xì)胞用PBS+(200μL/孔)洗滌一次，并且經(jīng)受先前描述的細(xì)胞表面ELISA(用于c-MET的細(xì)胞表面表達(dá)ELISA)，并作以下更改∶為檢測(cè)InlB-PBK10，板用一級(jí)抗體(RGS-His；Qiagen)以1:1500稀釋過(guò)夜培育，并且用二級(jí)抗體(山羊抗小鼠，1:2000稀釋)在室溫下培育1小時(shí)。

為了競(jìng)爭(zhēng)性抑制分析，在添加InlB-PBK10之前，使指示濃度的InlB在細(xì)胞上培育。特定而言，按先前描述涂覆的細(xì)胞系簡(jiǎn)單地用100μL緩沖液A洗滌，隨后在包含1μM、5μM或10μM InlB的50μL緩沖液A中在4℃下伴隨攪動(dòng)培育1小時(shí)。細(xì)胞用緩沖液A(100μL/孔)洗滌一次，并隨后用包含1μM InlB-PBK10的50μL緩沖液A以4℃下伴隨攪動(dòng)在冰上培育1小時(shí)。細(xì)胞用PBS+(200μL/孔)洗滌一次，并且處理以用于先前描述的表面結(jié)合的免疫檢測(cè)，不同的是板用識(shí)別InlB-PBK10的五鄰體基底域的抗體(Ad5抗體；Abcam)以1:5000稀釋培育。板用二級(jí)抗體(山羊抗兔，1:2000稀釋)在室溫下培育1小時(shí)。如解釋針對(duì)c-MET細(xì)胞表面表達(dá)ELISA解釋的那樣檢測(cè)結(jié)合。

細(xì)胞存活率分析。MDA-MB-435細(xì)胞以8x10³細(xì)胞每孔涂覆于96孔板中。48小時(shí)后的培養(yǎng)基被吸出，并且用包含不同濃度的InlB-PBK10-Ga和S2Ga(1、5和10μM)的30至50μL培養(yǎng)基在5％CO₂培育箱中37℃下在搖擺器上培育4小時(shí)。4小時(shí)培育周期之后，添加額外的培養(yǎng)基來(lái)使每孔總?cè)萘窟_(dá)到100μL，并且細(xì)胞在不搖晃的情況下培育大約24小時(shí)。使用Promega CellTiter 96水性非放射性細(xì)胞增殖分析來(lái)測(cè)量細(xì)胞生活力。移除培養(yǎng)基，并且將100μL新鮮培養(yǎng)基添加至孔。根據(jù)制造商指示，將2.0mL MTS溶液與100μL PMS溶液混合并且添加20μL至各孔。板在37℃下經(jīng)5％CO₂培育，并且在添加MTT試劑之后1小時(shí)和2小時(shí)，在490nm處讀取吸光率。隨后執(zhí)行結(jié)晶紫著色以確定相對(duì)細(xì)胞數(shù)量。簡(jiǎn)單地說(shuō)，細(xì)胞用包含1mM Ca²⁺和1mM Mg²⁺的PBS+洗滌，隨后用0.1％結(jié)晶紫(100μl/孔)在室溫下培育15分鐘并隨后用PBS+(200μL/孔)洗滌4次。板用95％乙醇(100μL/孔)在室溫下培育10分鐘，并且在590nm處測(cè)量吸光率。

InlB-PBK10攝取/胞內(nèi)運(yùn)輸分析。為了InlB-PBK10攝取分析，細(xì)胞以1x10⁵細(xì)胞/孔涂覆在12孔盤中的蓋片上并且生長(zhǎng)2天。在治療當(dāng)天，將盤轉(zhuǎn)移在冰上并且細(xì)胞針對(duì)所示實(shí)驗(yàn)根據(jù)以下方法進(jìn)行處理。為研究攝取的時(shí)間過(guò)程，細(xì)胞用冷PBS洗滌兩次，并隨后將含8μg的InlB-PBK10的0.4mL緩沖液A添加至各孔。在冰上培育盤1小時(shí)并在4℃下?lián)u晃以促進(jìn)受體結(jié)合而不是內(nèi)化，并隨后用冷PBS洗滌細(xì)胞以移除未結(jié)合蛋白質(zhì)?？纂S后接受預(yù)溫?zé)嵬耆囵B(yǎng)基，并且以37℃下以5％CO₂培育盤至指示時(shí)間點(diǎn)。個(gè)別蓋片隨后被移除，用PBS/1％MgCl₂洗滌3次，隨后在室溫下用4％多聚甲醛固定于PBS中15分鐘。蓋片用PBS洗滌3次，隨后在室溫下，用PBS中50mM氯化銨培育5分鐘，用PBS中0.1％Triton X-100培育5分鐘，并隨后用PBS中1％BSA阻斷30分鐘。蓋片上細(xì)胞用一級(jí)抗體在4℃下過(guò)夜培育，用PBS洗滌3次并且在室溫下在黑暗中用二級(jí)抗體培育1小時(shí)。在有指示的情況下，針對(duì)肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞核而復(fù)染色的細(xì)胞在二級(jí)抗體培育期間用Texas Red x-鬼筆環(huán)肽(Invitrogen T7471)以1:100稀釋培育，隨后在DAPI中以300nM最終濃度培育5分鐘。鬼筆環(huán)肽、DAPI和一級(jí)和二級(jí)抗體全部烯釋于PBS中1％BSA內(nèi)。在二級(jí)抗體和DAPI治療之后，蓋片上細(xì)胞用PBS洗滌3次并且在Prolong Antifade封固劑(Molecular Probes,Eugene,OR,USA)中封固。為檢測(cè)InlB-PBK10，以1:150稀釋使用RGS-His抗體(Qiagen)，并且將熒光團(tuán)軛合山羊抗小鼠(FITC-軛合)以1:500稀釋用于在488nm處熒光檢測(cè)InlB-PBK10，在405nm處(DAPI)熒光檢測(cè)細(xì)胞核以及在532nm處(Texas red)熒光檢測(cè)F-Actin。

InlB-PBK10-Dox(I-Dox)組裝。病毒衣殼衍生融合蛋白質(zhì)InlB-PBK10遵循嚴(yán)格建立的程序與阿霉素組裝。簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)將等于摩爾濃度的30堿基低聚核苷酸、LLAA-5(5'-CGCCTGAGCAACGCGGCGGGCATCCGCAAG-3')(SEQ ID NO:4)和其對(duì)應(yīng)反向補(bǔ)充物L(fēng)LAA-3混合到一起來(lái)制備互補(bǔ)低聚核苷酸雙鏈。混合物沸騰5分鐘并且歷時(shí)30分鐘冷卻至室溫以促進(jìn)低聚核苷酸的退火。雙鏈低聚糖以1:10摩爾比率(DNA:Dox)與Dox混合，并且在室溫下(RT)培育30分鐘，隨后用InlB-PBK10以6:1摩爾比率的InlB-PBK10:DNA-Dox于HBS中培育，并且使用50k MW截止(mwco)過(guò)濾膜進(jìn)行超濾(其通過(guò)用10％甘油預(yù)培育2小時(shí)至過(guò)夜來(lái)制備)以從不完全組裝的組分中分離I-Dox。復(fù)合物以4000x g離心15分鐘或直至體積減少≥80％。I-Dox中的Dox濃度通過(guò)依照Dox吸光率或熒光校準(zhǔn)曲線(SpectraMax,Molecular Devices,USA)推斷480nm處的測(cè)得吸光率或590nm處的熒光來(lái)確定(Ex:480nm)。Dox的濃度通過(guò)應(yīng)用Beer-Lambert公式來(lái)計(jì)算∶(在λ最大/Dox消光系數(shù)下的吸光率)×稀釋因子＝濃度(M)，使用的Dox系數(shù)為11，500M-¹cm-¹。實(shí)驗(yàn)中所用I-Dox劑量是基于I-Dox中Dox濃度計(jì)。

InlB-PBK10-Ga組裝。通過(guò)用InlB-PBK10在黑暗中4℃下伴隨輕輕攪動(dòng)培育10x摩爾過(guò)量咔咯達(dá)1h，使InlB-PBK10與磺化鎵咔咯(S2Ga)非共價(jià)地組裝。通過(guò)50K MW截止旋轉(zhuǎn)柱過(guò)濾器(Millipore Corporation,Billerica,MA,USA)根據(jù)制造商的過(guò)濾程序進(jìn)行超濾來(lái)移除未結(jié)合的咔咯，并且復(fù)合物用PBS洗滌，直至濾液澄清。滲余物在過(guò)濾法中保持其亮綠色(指示咔咯顏料)。滲余物再懸浮于PBS中并且在咔咯的λ_最大處測(cè)量吸光率以獲得先前描述的咔咯濃度。然而，當(dāng)結(jié)合至蛋白質(zhì)時(shí)，S2Ga的λ最大(例如)從424nm移動(dòng)至429nm，這未顯著地改變對(duì)復(fù)合物中咔咯濃度的估計(jì)。

FACS分析。為評(píng)估InlB321的結(jié)合，將H1993和Ln GFP細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)。在用PBS洗滌兩次之后，通過(guò)在2mM EDTA中37C下培育5至10分鐘分離細(xì)胞。將包含0.01％MgCl₂和CaCl₂(0.01％PBS+)的PBS添加至所述細(xì)胞，并且以2000rpm旋轉(zhuǎn)4分鐘。細(xì)胞再用0.01％PBS+洗滌3次，再懸浮，計(jì)數(shù)，并且分入Eppendorf管中。所述管以300x g旋轉(zhuǎn)2分鐘，并且用包含指示濃度InlB的PBS中3％牛奶再懸浮，并且在低溫室中在冰上培育1小時(shí)。細(xì)胞隨后用PBS洗滌4次并且在室溫下用PBS中3％BSA內(nèi)烯釋150倍的RGS-His抗體培育30分鐘。細(xì)胞洗滌4次，然后用二級(jí)抗體抗體(Alexa Fluor647、山羊抗小鼠IgG(H+L))在3％BSA中再懸浮，并且在室溫下培育30分鐘。細(xì)胞洗滌4次，用0.1％PFA培育15分鐘，并隨后再洗滌4次，并且用Beckman Cyan ADP FACS機(jī)器分析。

為驗(yàn)證由InlB321進(jìn)行的細(xì)胞結(jié)合是通過(guò)c-MET進(jìn)行，InlB321和MET肽(YCP2247SPEED BioSystems.Rockville,MD)在冰上在1xPBS中3％牛奶內(nèi)培育30至40分鐘，然后結(jié)合至細(xì)胞。結(jié)合分析如以下所述進(jìn)行。

細(xì)胞拉下實(shí)驗(yàn)。使用1x PBS中2mM EDTA在37℃下伴隨攪動(dòng)5至10分鐘，提升生長(zhǎng)48小時(shí)的MDA-MB-435細(xì)胞。在以300x g將細(xì)胞旋轉(zhuǎn)5分鐘之后，將細(xì)胞洗滌一次并且再懸浮于緩沖液A+3％BSA并且分入4個(gè)Eppendorf管(2x 10⁶細(xì)胞/管)。細(xì)胞再旋轉(zhuǎn)并且再懸浮到500μL的緩沖液A+3％BSA中。在3個(gè)管中，添加0.4μM、2μM和4μM，并且未添加蛋白質(zhì)至第四管；所有管皆在冰上培育1小時(shí)。在洗滌和旋轉(zhuǎn)所有細(xì)胞以移除未結(jié)合InlB之后，將500ul緩沖液A中0.4μM的InlB-PBK10添加至所有4個(gè)管，隨后在冰上搖晃2小時(shí)以促進(jìn)受體結(jié)合而不是內(nèi)化。如先前描述，細(xì)胞洗滌并且旋轉(zhuǎn)3次。團(tuán)塊隨后懸浮在50μL SDS-PAGE樣本緩沖液中，并且通過(guò)SDS-PAGE/Wesrten印跡使用對(duì)InlB-PBK10特異性的抗體(Ad5抗體，其識(shí)別五鄰體基底)以1:5000稀釋來(lái)評(píng)估。

實(shí)施例3∶攜帶雙側(cè)脅腹MDA-MB-435腫瘤的nu/nu小鼠中的Inl-PBK10生物分布

背景

如圖6中名稱為“靶向c-Met的蛋白質(zhì)納米構(gòu)造物”的先前實(shí)例所示，MDA-MB-435細(xì)胞顯示出細(xì)胞表面上c-MET的標(biāo)記水平。此外，如圖7E所示，c-MET靶向蛋白質(zhì)構(gòu)造物InlB-PBK10通過(guò)被c-MET配體InlB競(jìng)爭(zhēng)性抑制的相互作用來(lái)結(jié)合這些細(xì)胞，表明該構(gòu)造物可通過(guò)c-MET結(jié)合這些細(xì)胞。圖8示出InlB-BK10在受體結(jié)合之后進(jìn)入這些細(xì)胞，并且圖9C示出該蛋白質(zhì)可介導(dǎo)膜不可滲透毒性分子(鎵金屬化咔咯)遞送到這些細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞死亡(從而還驗(yàn)證Inl-PBK10能夠體內(nèi)膜分裂)。

結(jié)果

在此，我們?cè)u(píng)估了用MDA-MB-435腫瘤評(píng)估Inl-PBK10在小鼠中的生物分布，以評(píng)價(jià)其是否能夠在活體內(nèi)在這些腫瘤上積累。為此，攜帶MDA-MB-435腫瘤的雙側(cè)脅腹異種移植的雌性nu/nu小鼠接受單次尾靜脈注射Alexa680標(biāo)記InlB-PBK10(2nmol蛋白質(zhì))，并且使用640nm激發(fā)和700nm發(fā)射過(guò)濾器，通過(guò)在注射之后所示時(shí)間點(diǎn)的Xenogen成像來(lái)成像。整體動(dòng)物成像顯示出在注射之后4小時(shí)，動(dòng)物中的熒光完全清除(圖10A)。4小時(shí)時(shí)間點(diǎn)之后，將小鼠處死并且移除腫瘤和組織用于進(jìn)一步成像。雖然腫瘤顯示一些熒光累積，但顯著比例的注入材料經(jīng)4小時(shí)被排除至腎臟，同時(shí)可在肝臟檢測(cè)到一些熒光(圖10B)。剩余組織，包括心臟、脾、肺、腦和骨骼肌，未顯示可檢測(cè)熒光(圖10B)。進(jìn)一步研究將必需在較早和較晚時(shí)間點(diǎn)的組織收獲來(lái)確定向腎的遞送是否是迅速清除的結(jié)果，以及確定在競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑情況下確定生物分布以驗(yàn)證腫瘤遞送經(jīng)由c-MET發(fā)生。

實(shí)施例4∶腦轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的納米生物靶向

人類表皮生長(zhǎng)因子受體亞基3(HER3)的細(xì)胞表面水平升高與轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤相關(guān)，包括擴(kuò)散至腦部的那些乳腺腫瘤。然而，大量靶向療法當(dāng)前是使用來(lái)與周圍性乳腺腫瘤斗爭(zhēng)，這些分子向腦轉(zhuǎn)移的遞送受血腦屏障(BBB)限制。這通過(guò)轉(zhuǎn)移至腦部的HER2+乳腺腫瘤來(lái)例證∶這些腫瘤雖然在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)外可由HER2抗體(諸如曲妥單抗)靶向，但不能由這些相同抗體觸及，因?yàn)镠ER2亞基雖然存在于腦部?jī)?nèi)皮上，但不介導(dǎo)跨血管壁的抗體轉(zhuǎn)胞吞。

在另一方面，HER3在配體結(jié)合時(shí)經(jīng)歷跨腦部?jī)?nèi)皮的迅速轉(zhuǎn)胞吞，所述迅速轉(zhuǎn)胞吞通常發(fā)生來(lái)介導(dǎo)對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白生長(zhǎng)因子的遞送以用于神經(jīng)生長(zhǎng)和維持。我們已研發(fā)出自組裝納米生物學(xué)顆粒HerMn，其使用HER3作為入口以用于毒性分子向腫瘤細(xì)胞中的靶向進(jìn)入。HerMn是10至20nm直徑的血清穩(wěn)定顆粒，其由受體靶向細(xì)胞滲透蛋白HerPBK10組成。所述HerPBK10與磺化錳(III)咔咯(S2Mn或Mn-咔咯)非共價(jià)組裝(圖11)。HerPBK10的靶向結(jié)構(gòu)域來(lái)源于配體(調(diào)蛋白α)，其特異性地與人類表皮生長(zhǎng)因子受體亞基3(HER3)相互作用并且誘發(fā)迅速受體介導(dǎo)胞吞作用。因?yàn)镠ER3是HER2的優(yōu)選二聚作用配偶體，并且HER2-3異源二聚體在HER2+上很普遍，我們先前已展示HerPBK10可將治療性和成像分子靶向至小鼠中的HER2+腫瘤，與化學(xué)療法藥劑(阿霉素)相比，在>10x的更低劑量下介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)消融，同時(shí)節(jié)約心臟和肝臟組織，并且沒有可檢測(cè)的免疫原性。HerMn的腫瘤靶向毒性通過(guò)線粒體膜分裂和對(duì)細(xì)胞骨架的超氧化物介導(dǎo)損害來(lái)發(fā)生。由于咔咯的順磁性質(zhì)，HerMn還可以通過(guò)磁共振成像(MRI)引出腫瘤選擇性檢測(cè)。

HerMn似乎在全身性注射于小鼠之后分布至腦部，另外顯示出優(yōu)先歸巢和對(duì)皮下HER2+腫瘤的毒性。有趣地，由于其在正常組織上的抗氧化劑活性，錳咔咯已知顯示出神經(jīng)保護(hù)作用。在支持中，HerMn支持人類心臟病細(xì)胞活體外存活率?？偠灾腥さ氖遣聹y(cè)HerMn可能具有對(duì)腦轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤的靶向毒性，同時(shí)節(jié)約脫靶組織，因?yàn)槠渚哂邪邢蚰芰拖蛘＝M織諸如腦部和心臟提供有益保護(hù)效應(yīng)的能力。

背景

腦轉(zhuǎn)移是嚴(yán)重臨床問題。乳腺癌轉(zhuǎn)移至腦部的患者平均幸存小于1年。雖然已出現(xiàn)不斷增長(zhǎng)的靶向療法用于治療周圍性腫瘤，但大多數(shù)都不適合于治療腦轉(zhuǎn)移，因?yàn)樗鼈儾荒芸缭窖X屏障(BBB)。對(duì)此的實(shí)例為使用單克隆抗體(曲妥單抗(Tz))，其是針對(duì)人類表皮生長(zhǎng)因子受體亞基2(HER2)用于治療HER2+乳腺癌。HER2+癌癥與侵襲性腫瘤、對(duì)標(biāo)準(zhǔn)療法的不順應(yīng)性、轉(zhuǎn)移、和死亡率增加相關(guān)。轉(zhuǎn)移至腦部的HER2+腫瘤不可能用Tz治療，因?yàn)镠ER2雖然存在于腦內(nèi)皮上，但不跨血管壁胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)(transcytose)。三陰性乳腺癌(TNBC)是HER2-轉(zhuǎn)移性以及腦轉(zhuǎn)移性的，并且因?yàn)槿狈μ禺愋约?xì)胞表面生物標(biāo)記而具有甚至更少的選擇。雖然拉帕替尼(Lapatinib；Lp)(HER2和EGFR的小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI))可以容易地透過(guò)細(xì)胞膜以靶向這兩種腫瘤類型，但這些腫瘤可能部分地由于HER3升高而抗此類抑制劑。

結(jié)果

HerPBK10對(duì)HER3具有特異性。HerPBK10包含HER3配體的受體結(jié)合區(qū)域，調(diào)蛋白-α(氨基酸35-239，包含Ig樣和EGF樣結(jié)構(gòu)域)，融合至來(lái)源于腺病毒五鄰體基底衣殼蛋白質(zhì)的膜滲透部分(圖11A)。HerPBK10初始設(shè)計(jì)為非病毒基因轉(zhuǎn)移載體，在單個(gè)多疇蛋白質(zhì)分子內(nèi)包含有效負(fù)載組裝、靶向、內(nèi)化和體內(nèi)滲透功能。因?yàn)镠ER3是HER2的優(yōu)選二聚作用配偶體，并且HER2-3異源二聚體在HER2+上很普遍，已表明HerPBK10可將治療性和成像分子靶向至小鼠中的HER2+腫瘤，與化學(xué)療法藥劑(阿霉素)相比，在>10x的更低劑量下介導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)消融，同時(shí)節(jié)約心臟和肝臟組織，并且沒有可檢測(cè)的免疫原性。

HerPBK10對(duì)HER3的特異性由其結(jié)合至包含人類HER3的胞外結(jié)構(gòu)域的固定化肽的能力支持(圖12A)。這受到在活體外游離HER3肽情況下HerPBK10的預(yù)吸附的抑制(圖12A)。相同肽還抑制對(duì)人類(圖12B)和小鼠(圖13B-C)HER3+細(xì)胞兩者的結(jié)合。特別地，小鼠和人類HER3的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域享有很高(94％)序列同一性(圖13A)。雖然HER2-3異源二聚體在HER2+腫瘤細(xì)胞上很普遍，但異源二聚化抑制抗體(帕妥珠單抗(Pz))不阻止HerPBK10對(duì)細(xì)胞HER3的結(jié)合(圖12B)，從而表明HER2-3二聚作用并非HerPBK10結(jié)合所必要的。結(jié)合也不受HER4肽或β細(xì)胞素(其阻斷HER4)抑制(圖12B)，從而表明HerPBK10是HER3特異性的。

在培養(yǎng)物中，來(lái)自HER2+患者和年齡匹配對(duì)照物的血清未阻止HerPBK10對(duì)HER2+細(xì)胞的結(jié)合(并且表明彼此之間無(wú)顯著差異)，與添加過(guò)量重組配體(+Her)用作競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑形成對(duì)比(圖12C)。先前研究已表明HerPBK10在免疫能力小鼠中的重復(fù)劑量未產(chǎn)生針對(duì)該蛋白質(zhì)的可檢測(cè)中和抗體形成。此外，在培養(yǎng)物中，可識(shí)別HerPBK10的針對(duì)整體腺病毒產(chǎn)生的多克隆抗體未阻止受體結(jié)合至細(xì)胞。

HerPBK10與Mn-咔咯自組裝以形成HerMn納米顆粒。HerPBK10的羧基[C]-端包含十賴氨酸尾部(圖11A)，其可以介導(dǎo)對(duì)陰離子分子(包括咔咯)的親電子結(jié)合。咔咯是與卟啉具有結(jié)構(gòu)相似性的大環(huán)分子，并且同樣地可以包含金屬配體(圖11B)。磺化咔咯是兩親的，可溶于生理溶液，并且可以通過(guò)非共價(jià)相互作用(包括親電子和疏水性相互作用)自發(fā)地結(jié)合蛋白質(zhì)。因?yàn)槭軒ж?fù)電細(xì)胞膜的排斥，陰離子磺酸基團(tuán)阻止非特異性細(xì)胞進(jìn)入，從而實(shí)現(xiàn)經(jīng)由載體蛋白質(zhì)將咔咯引導(dǎo)到靶細(xì)胞中的可能性。我們已將HerPBK10與磺化錳(III)咔咯(S2Mn或Mn-咔咯)組合以形成稱為HerMn的迅速自組裝10-20nm直徑顆粒(圖11C-D)。這些顆粒包含結(jié)合至單個(gè)蛋白質(zhì)(25-35咔咯/蛋白質(zhì))的多個(gè)咔咯分子，并且可以經(jīng)得起高速超濾作用。這些發(fā)現(xiàn)與我們先前的研究和我們合作者的研究相一致，表明咔咯可以以可忽略解離結(jié)合于蛋白質(zhì)袋(pockets)中，并且一旦結(jié)合至HerPBK10，則抵抗轉(zhuǎn)移至血清蛋白質(zhì)。

HerMn靶向HER3+腫瘤。在培養(yǎng)物中，HerMn顯示出對(duì)HER2+/HER3+而不是HER2-/HER3-腫瘤細(xì)胞的靶向毒性，同時(shí)Mn-咔咯對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)影響。數(shù)據(jù)示于圖14中，其中各細(xì)胞系接受指示濃度的HerMn或S2Mn，并且在24小時(shí)后經(jīng)由結(jié)晶紫(CV)著色評(píng)價(jià)存活率。每個(gè)濃縮物的N＝3，來(lái)自3個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)。已表明，HerPBK10的靶向配體誘發(fā)受體結(jié)合之后的迅速胞吞作用。因?yàn)榛腔强┎豢赡茏灾髌茐捏w內(nèi)膜，HerPBK10的五鄰體基底部分實(shí)現(xiàn)胞吞攝取之后的有效膜分裂，以及向細(xì)胞質(zhì)中的進(jìn)入。

在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞接受10μM S2Mn或HerMn，隨后在24小時(shí)后接受HBSS中TMRM(30nM)。結(jié)果示于圖15A中，其中對(duì)照物是PBS治療。共焦熒光圖像(圖15B)示出在MDA-MB-435細(xì)胞上培育24小時(shí)之后，肌動(dòng)蛋白(紅色)和微管蛋白(綠色)通過(guò)HerMn(5μM)而超氧化物介導(dǎo)瓦解。S2Mn(5μM)、HerPBK10(與HerMn等同的蛋白質(zhì)濃度)和PBS充當(dāng)對(duì)照物。另外的細(xì)胞接受Tiron(5mM)1小時(shí)，然后HerMn治療。藍(lán)色，細(xì)胞核。比例尺＝10μm

一旦處于細(xì)胞質(zhì)中，HerMn瓦解(collapse)線粒體膜電勢(shì)(圖15A)以及通過(guò)超氧化物升高和對(duì)細(xì)胞骨架(圖15B)的氧化損害使這些細(xì)胞骨架瓦解，與鎵(III)咔咯(S2Ga或Ga-咔咯)一致。

人們發(fā)現(xiàn)，Ga-咔咯直接結(jié)合線粒體外部膜蛋白TSPO。圖16中展示結(jié)果?？扇芙庵亟MTSPO蛋白用S2Ga在室溫下以等同摩爾濃度(1μM)培育約20分鐘，隨后超濾以移除游離、未結(jié)合S2Ga。通過(guò)測(cè)量吸光率和熒光光譜，針對(duì)TSPO蛋白結(jié)合咔咯的存在，評(píng)估滲余物。在有指示的情況下，將PK11195用作用于TSPO上卟啉結(jié)合部位的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑(圖16A-B)。存在HerGa與TSPO原位相互作用的證據(jù)。在細(xì)胞用HerGa處理并且檢驗(yàn)HerGa-介導(dǎo)線粒體分裂之前24小時(shí)，MDA-MB-435細(xì)胞用表達(dá)外源TSPO的質(zhì)粒(作為內(nèi)源性TSPO結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑)轉(zhuǎn)染，證據(jù)為線粒體中的紅色熒光染料累積減少并且細(xì)胞質(zhì)中綠色熒光積累(圖16C-D)。

TSPO移位卟啉和其他代謝物到線粒體中以用于處理，與線粒體磁導(dǎo)率轉(zhuǎn)變核孔復(fù)合物的組分相互作用，并且有助于細(xì)胞體內(nèi)平衡。Ga-咔咯特異性識(shí)別TSPO上的卟啉結(jié)合部位(圖16A-B)，因?yàn)檫强┙Y(jié)合可以受PK11195競(jìng)爭(zhēng)性抑制，這抑制卟啉結(jié)合至TSPO。重組可溶解TSPO于MDA-MB-435細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)阻止線粒體膜電勢(shì)的咔咯-介導(dǎo)分裂(圖16C-D)，表明咔咯與TSPO原位相互作用。因?yàn)镸n-咔咯顯示與Ga-咔咯類似的線粒體膜分裂，很可能TSPO是Mn-咔咯的分子靶標(biāo)。在異種移植小鼠腫瘤模型中，HerMn在全身性遞送之后活體內(nèi)歸巢至腫瘤，繞過(guò)包括心臟在內(nèi)的大多數(shù)正常組織(圖17)，并且以極低藥理學(xué)劑量(0.008mg/kg)消融腫瘤生長(zhǎng)(圖18A)。Mn-咔咯還是順磁的，從而可用于MRI。

已發(fā)現(xiàn)，除在小鼠中全身性遞送之后積累于腫瘤中以外，與曲妥單抗(Tz)相反，HerMn可以分布至腦部(圖17)注入無(wú)腫瘤小鼠的尾靜脈中的HerPBK10還示出腦定位，而PBK10的全身性遞送(其缺乏HER3靶向配體)未示出可檢測(cè)的腦部遞送(圖19)。已發(fā)現(xiàn)，HerMn不但對(duì)人類心球衍生細(xì)胞(CDC)無(wú)毒，而且在逐步升高劑量與延長(zhǎng)暴露的情況下，增加培養(yǎng)物中CDC存活率，這與阿霉素(其具有已知的心肌毒性)以及單獨(dú)的HerPBK10相反，所述HerPBK10對(duì)腫瘤細(xì)胞或CDC不具有毒性或生長(zhǎng)促進(jìn)作用(圖18B)。這支持在活體外和活體內(nèi)的視神經(jīng)病變模型中的先前發(fā)現(xiàn)，表明Mn-咔咯可以是神經(jīng)保護(hù)性的。這似乎對(duì)Mn-咔咯是獨(dú)特的，因?yàn)镚a-咔咯未展示此類神經(jīng)保護(hù)作用。

一同地，這些發(fā)現(xiàn)表明HerMn給予正常組織有益作用，同時(shí)使毒性靶向腫瘤組織，尤其靶向具有升高HER3的腦轉(zhuǎn)移。HerMn的靶向特異性使得這一點(diǎn)不那么相關(guān)，因?yàn)槿硇灶w粒的少數(shù)似乎分布至非腫瘤組織(圖17)。但是，因?yàn)橄鄬?duì)低的咔咯水平提供神經(jīng)保護(hù)，以及腫瘤毒性(圖18A)，這種潛在雙活性值得探索。

應(yīng)用

HerMn具有遞送毒性至腦轉(zhuǎn)移性乳腺腫瘤同時(shí)節(jié)約脫靶組織的能力，因?yàn)槠渚哂邪邢蚰芰σ约跋蛘＝M織諸如腦部和心臟提供保護(hù)的能力。

實(shí)施例5∶使用小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)侵襲素衍生肽靶向β-1整聯(lián)蛋白

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是細(xì)菌病原體，其侵襲腸內(nèi)上皮，尤其是腸內(nèi)壁的集合淋巴結(jié)(Peyer’s patch)，以及導(dǎo)致食物中毒。對(duì)腸內(nèi)上皮的結(jié)合和進(jìn)入是通過(guò)細(xì)菌侵襲素(Inv)蛋白與β-1整聯(lián)蛋白的相互作用來(lái)發(fā)生，所述β-1整聯(lián)蛋白主要表達(dá)在覆蓋集合淋巴結(jié)的上皮細(xì)胞上。

包含編碼侵襲素的核苷酸序列的質(zhì)粒(pHIT123-Inv)被用作PCR模板，并且將低聚核苷酸引物設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)增編碼β-1整聯(lián)蛋白結(jié)合部位的最小序列(約600bp)，同時(shí)將用于框內(nèi)克隆的限制性內(nèi)切位點(diǎn)引入到用于靶向遞送的外源肽中。所用引物包括以下序列∶5’-ACAGAGCTCATAACCGGCATTAACGTGAAT-3’(SEQ ID NO:6)；5’-CTGTGTGCGGAGCCGCAATAGGAATTCATC-3’(SEQ ID NO:7)；和5’-GATGAATTCCTATTGCGGCTCCGCACACAG-3’(SEQ ID NO:8)。這些引物被用于向Inv插入物中擴(kuò)增和添加SacI和EcoRI限制性內(nèi)切位點(diǎn)。另外的引物包括以下序列∶5’-GTCCAAAACCAAGAAAAGGCGGAGCAGCTGTAC-3’(SEQ ID NO:9)；5’-ACAATGACGCGTGTACAGCTGCTCCGCCTTTTCTTGGTTTTGGAC-3’(SEQ ID NO:10)；5’-CCGCTGTGTGCGGAGCCGCAAGGAGGAACGCGTACACAC-3’(SEQ ID NO:11)；5’-GTGTGTACGCGTTCCTCCTTGCGGCTCCGCACACAGCGG-3’(SEQ ID NO:12)；和5’-ACACACGGATCCTTGCGGCTCCGC ACACAGCGG-3’(SEQ ID NO:13)。這些引物引入MluI或BamHI限制性內(nèi)切位點(diǎn)以用于克隆到鼓起(Knob)或全長(zhǎng)纖維構(gòu)造物中。

外源肽編碼腺病毒(Ad)衣殼纖維和鼓起蛋白質(zhì)。該纖維勾劃出從Ad衣殼伸出的各個(gè)觸角樣突出物，所述突出物介導(dǎo)一級(jí)細(xì)胞結(jié)合以開始感染，并且包含N端長(zhǎng)纖維軸結(jié)構(gòu)域以及隨后的C端球狀鼓起域。鼓起域與細(xì)胞表面受體特異性相互作用，并且作為在不存所述軸的情況下作為可溶解蛋白質(zhì)產(chǎn)生。當(dāng)融合至PBK10時(shí)，Inv是有效配體。

使用由Inv替換鼓起亞域的兩種策略來(lái)將Inv序列插入該鼓起中，產(chǎn)生重組鼓起構(gòu)造物：ABCJ-Inv和AGJ-Inv。重組蛋白是在細(xì)菌中從表達(dá)這些構(gòu)造物的pRSET載體中產(chǎn)生，如N端GFP標(biāo)記蛋白(GFP-ABCJ-Inv和GFP-AGJ-Inv)和未標(biāo)記蛋白。在第三策略中，Inv被插入該鼓起的DG環(huán)中并且用于體外翻譯中以產(chǎn)生S35標(biāo)記蛋白。非變性凝膠電泳示出該重組蛋白維持形成類似于野生型可溶解鼓起的低聚物(二聚物和三聚物)(從而表明該Inv插入物未混淆融合蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu))。在所有情形下，產(chǎn)生全長(zhǎng)可溶解蛋白質(zhì)。

還產(chǎn)生其中Inv將全長(zhǎng)纖維蛋白質(zhì)的鼓起替換的構(gòu)造物。使用桿狀病毒載體來(lái)在細(xì)菌中表達(dá)該蛋白質(zhì)。產(chǎn)生第二纖維構(gòu)造物以在全長(zhǎng)纖維蛋白質(zhì)的軸和鼓起域中間表達(dá)Inv，并且FactorX分裂位點(diǎn)被引入Inv和鼓起之間。

實(shí)施例6∶CD4的配體

來(lái)源于人類免疫缺陷病毒(HIV)gp120包膜蛋白的CD4結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列TITLPCRIKQFINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSS NITGLLLTR(SEQ ID No:5)足以結(jié)合至CD4。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)獲得該序列。編碼SEQ ID NO:5的核酸序列(約132nt)被克隆到pBluescript(PSK)質(zhì)粒中。溴化乙錠著色電泳凝膠示出通過(guò)BamH I-EcoRI消化從載體(約3kb)上切除了插入物(約132nt)。所得產(chǎn)物隨后隨后與諸如PBK10的外源肽框內(nèi)插入以用于將此類遞送蛋白靶向至表達(dá)CD4的細(xì)胞(即，“助手”T-細(xì)胞)。