本申請要求在2014年1月28日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/932,706的優(yōu)先權，其公開的內容在此并入作為參考。

背景技術：

在世界各地還未滿足對同時防御人類免疫缺陷病毒（HIV）和其它性傳播感染（STI）的技術的需求。目前防御HIV和其它STI的殺微生物劑將以能夠接受及能夠負擔的方式處理這些健康風險，并且對全球公共衛(wèi)生作出主要貢獻。而且，具有對除HIV外的STI適應癥的殺微生物劑，可更適用于不擔心HIV的那些人使用這樣的殺微生物劑，從而提高可接受性和粘附性。

令人遺憾的是，以往帶有廣譜抗病毒活性和能力以在體外或在體內阻擋不同的STI的單一活性藥物成分（API）的研究，在臨床試驗中均沒有表現出療效。臨床試驗中缺乏如此療效的原因是未知的，但可能是由于各種原因，例如包括低效力，保護窗不足（short window of protection），生物體液存在下活性降低，或者粘膜的誘導以及微生物群落的變化。Romano, J.W., et al., Non-specific microbicide product development: then and now. Current HIV research, 2012. 10(1): p. 9-18。因此，存在對鑒定更有效和安全的API的持續(xù)性需求，此API可被單獨使用或組合起來用于殺微生物的用途。

已知在體內具有殺微生物活性的化合物包括卡拉膠。卡拉膠是從通常被稱為海藻的赤藻中獲得的多糖。它們是海藻的結構部件，并經提取成三種主要類型，即ι、κ、λ，盡管還有其它類型，包括κ-II、μ和ν卡拉膠?？ɡz作為增稠劑、膠凝劑、穩(wěn)定劑和分散劑，被廣泛應用于食品、藥物和化妝品行業(yè)。已進行了大量的藥理學及毒理學研究。已發(fā)現卡拉膠即使在極高劑量下通過口服、經皮和吸入的給藥途徑都是無毒的。因此卡拉膠在1972年被美國食品及藥物管理局（FDA）分類為“一般認為安全”（GRAS）。Food and Drug Administration. GRAS (Generally recognized as safe) food ingredients: Carrageenan. FDA Publications PB-221 206, (1972)。

在豬、大鼠、小鼠、沙鼠、豚鼠、白鼬、倉鼠、狗和猴身上進行了進一步大量的口服藥代動力學研究，表明卡拉膠在胃腸道的分解是很少的，并且其吸收是幾乎不存在的。Benitz, K.F., et al., Toxicol. Appi. Pharmacol. 22, 282 (1972); Fox, M.R.S. & Jacobs, R.M. Metal Ions in Biological Systems., pp. 214-248 (Marcel Decker, Inc.,1986); Luscombe, D.K. & Nicholls, P.J. Fd. Cosmet. Toxicol. 11, 229-237 (1973); Naess, B. Acta Vet. Scand. 12, 592-600. 1971; Samman, S. & Roberts, D.C.K. ,Med. J. Australia 146, 246-249 (1987); U.S.EPA. Health Effects Assessment of for Zinc (and Compounds). EPA/540-1-96-048. 1984. Washington, D.C., US Environmental Protection Agency, Office of Research and Development; Walden, J.T. & Derreth, D. FDA New Release 72/55. FDA Publications 72/55, (1972); Walker, A.P. et al. Fd. Chem. Toxic. 35, 1099-1106 (1997); Weiner, M.L. Intestinal transport of some macromolecules in food.Fd. Chem. Toxic.26, 10, 867-880 (1988)。

國際專利公布號WO 94/15624教導使用硫酸化多糖，如ι卡拉膠、硫酸葡聚糖、κ卡拉膠、λ卡拉膠、肝素模擬物、硫酸肝素、戊聚糖多硫酸酯、硫酸軟骨素、香菇多糖硫酸酯、凝膠多糖硫酸酯、脫-N-硫酸化肝素和巖藻多糖，以抑制HIV的細胞至細胞傳播，因此也抑制獲得性免疫缺乏綜合征（AIDS）的性傳播以及衣原體有機體。這項公布教導ι卡拉膠是商業(yè)上能夠得到的在預防HIV感染中以及在體內和體外阻隔衣原體感染中最有效的硫酸化卡拉膠。

鋅是針對如HIV和單純性皰疹病毒-2（HSV-2）這樣的性傳播病原體的另一種已知的抑制劑。醋酸鋅（ZA）和硫酸鋅已表現出在細胞培養(yǎng)中抑制HIV感染，以及在細胞培養(yǎng)和試驗動物中抑制HSV-2感染。鋅鹽已表現出在體外有效阻隔HIV引起的感染（Haraguchi, Y., et al. Antiviral Res 43, 123-133 (1999)），并且還阻隔由口蹄疫病毒、人類鼻病毒、A型流行性感冒和B型流行性感冒、塞姆利基森林病毒和辛德畢斯病毒引起的感染。Sergio, W. Medical Hypotheses 26,253 (1988)。Haraguchi等通過p24 ELISA和RT測定，發(fā)現氯化鋅、醋酸鎘和氯化汞抑制HIV-1產生。當存在濃度多達550μg/mL時，氯化鋅并沒有顯示出明顯的細胞毒性。

凝集素是碳水化合物結合蛋白，通過結合到在入侵病原體上存在的碳水化合物，其可在免疫系統(tǒng)中起作用。凝集素被稱為格瑞弗森（Griffithsin，GFRT或G），已報道凝集素具有有效的抗HIV活性，能夠以次納米摩爾濃度（IC₅₀值為0.02~0.8 nM）在體外阻隔HIV復制。參見Alexandre, K.B., et al., Virology, 2012. 423(2): p. 175-86; Huskens, D. and D. Schols, Marine Drugs, 2012, 10(7): p. 1476-97; Mori, T., et al., The Journal of biological chemistry, 2005. 280(10): p. 9345-53；以及美國專利8,088,729，所有這些內容在此全部并入作為參考。

在煙草中能夠生產多克量的格瑞弗森。O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009. 106(15): p. 6099-104. 值得注意的是，GRFT抵抗被幾種蛋白酶降解，即使在高溫下仍高度穩(wěn)定，無刺激性，不導致細胞激活，以及通過血液或上皮細胞在炎癥性細胞因子和趨化因子的分泌中只導致最小的變化。O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009. 106(15): p. 6099-104;Kouokam, J.C., et al., PloS one, 2011. 6(8): p. e22635; Moncla, B.J., et al., Advances in bioscience and biotechnology, 2011. 2(6): p. 404-408。

格瑞弗森已表現出在外植體模型中抵抗HIV極好的安全性和有效性，并且修飾形式的GRFT已報道為具有改善的效力、穩(wěn)定性和溶解性。O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009. 106(15): p. 6099-104. GRFT也表現出體內抗HSV-2活性。Nixon, B., et al., Journal of virology, 2013. 87(11): p. 6257-69。

申請人以前曾報道過在水溶性金屬鹽和卡拉膠之間的復合物（complex）能夠提供抗微生物作用。該水溶性金屬鹽可以是鋅金屬，以及在一個具體的實施方案中，在卡拉膠凝膠中配制的醋酸鋅（ZA）組合已表現出有效抵抗HIV、HSV-2、人類乳頭瘤病毒（HPV）以及陰道毛滴蟲。Fernandez-Romero, J.A., et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2012. 56(1): p. 358-68; Kenney, J., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013. 57(8): p. 4001-9。并參見美國專利8,567,098，其全部內容在此并入為參考。盡管這樣，對于能夠防御HIV和/或其它STI的額外廣譜、更有效的殺微生物劑的需求仍然存在。

技術實現要素：

申請人已發(fā)現帶有廣和極有效活性的殺微生物組合物可通過將凝集素與水溶性金屬鹽和/或卡拉膠結合而生產。因此，在第一方面，本發(fā)明涉及抗微生物組合物，該抗微生物組合物包含有效含量的抗微生物劑以及一種或多種額外的抗微生物劑，所述有效含量的抗微生物劑包含一種或多種凝集素，所述一種或多種額外的抗微生物劑選自生理學能夠接受的水溶性金屬鹽、卡拉膠或其它聚合物，如樹枝狀大分子、纖維素、纖維素類似物、纖維素衍生物及其組合。

在具體的實施方案中，組合物包含與鋅金屬鹽（Z）和/或卡拉膠（C）結合（combination）的一種或多種凝集素。在具體的實施方案中，本發(fā)明的抗微生物組合物能夠包含與鋅金屬鹽結合的凝集素格瑞弗森（GZ）；或可包含與鋅金屬鹽和卡拉膠結合的格瑞弗森（GZC）。在各種具體的實施方案中，鋅金屬鹽是醋酸鹽（ZA）和/或卡拉膠。

在另外的實施方案中，本發(fā)明的組合物可以是適用于抗微生物劑傳送的任何物質形態(tài)，包括凝膠、溶液、固體或者干燥或粉末形態(tài)。

在相關方面中，本發(fā)明涉及性傳播感染（STI）抑制組合物，該組合物包含本發(fā)明的抗微生物組合物。如本文所預期，該組合物可防止STI的陰道或直腸感染，并相應地配制該組合物。

本發(fā)明的組合物還可包含一種或多種額外的抗微生物劑和/或藥物，包括但不限于能夠在陰道或直腸給藥的藥物，以提供可給藥于對象的組合物，以作為多用途防治技術治療或預防一種或多種病癥。

在此應該理解本文涵蓋了除微生物感染外其它病癥的預防。例如，在具體的實施方案中，組合物可包含了一種或多種抗微生物劑，還可包含激素或非激素的抗避孕藥以防止非計劃的懷孕，或者可包含用于激素取代療法的試劑。

如本文所預期，在另一方面中，本發(fā)明的組合物可以是藥物組合物，并因此還包含了除一種或多種藥學上可接受的試劑或賦形劑之外，在本文公開的一種或多種抗微生物劑或藥物。在具體的實施方案中，此組合物配制為非處方藥物組合物。在具體的實施方案中，藥學上可接受的試劑或賦形劑是生理學上可接受的pH控制劑和/或生理學上可接受的防腐劑。在另一個實施方案中，藥學上可接受的試劑或賦形劑促進將藥物組合物傳送給有需要的對象。在具體的實施方案中，此藥物組合物以適合陰道和/或直腸給藥的劑型配制。

在另一方面中，本發(fā)明涉及在有需要的對象中抑制微生物感染的方法，該方法包括將本發(fā)明的有效含量的抗微生物組合物給藥于所述對象。因此，在一個實施方案中，此方法包括將含有有效含量的GRFT和卡拉膠的抗微生物組合物給藥于有需要的對象，以便抑制由HPV引起的感染。

在另一實施方案中，此方法包括將含有有效含量的GRFT和鋅金屬鹽的抗微生物組合物給藥于有需要的對象，以便抑制由HIV引起的感染。在具體的實施方案中，此鋅金屬鹽是ZA。

在另一實施方案中，此方法包括將含有有效含量的GRFT、卡拉膠和鋅金屬鹽的抗微生物組合物給藥于有需要的對象，以便抑制由HSV-2引起的感染。

在另一實施方案中，此方法包括將含有有效含量的GRFT、卡拉膠和鋅金屬鹽的抗微生物組合物給藥于有需要的對象，以便抑制HIV、HSV-2、HPV及其它性傳播感染（STI）中的一種或多種。

在另一實施方案中，此方法包括將含有有效含量的GRFT的抗微生物組合物給藥于有需要的對象，以便抑制由HPV引起的感染。在具體實施方案中，此組合物還包含卡拉膠。

附圖說明

圖1包括對數坐標圖，其顯示了在GRFT（nM）存在下病毒復制百分比。圖1A和圖1B的數據確定了GRFT對抗HIV具有有效活性。圖1C的數據表明GRFT對抗HPV16、HPV18以及HPV45假病毒（PsV）具有溫和的體外活性。在圖1A中，利用MAGI試驗（R Begay O, et al. AIDS Research and Human Retroviruses, 2011 Sep 1;27(9):1019–24）以及實驗室菌株HIV-1_MN（X4病毒）和HIV-1_ADA-M（R5病毒）在TZM-bl細胞中測試抗HIV活性。在圖1B中，利用實驗室菌株HIV-1_NL4-3在PBMC（Trkola A, et al., J Virol. 1999 Nov; 73(11):8966–74）中測試抗HIV活性。在圖1C中，利用螢火素酶報告基因試驗（Buck CB, et al. PLoS Pathog. 2006 Jul 1;2(7):e69）以及測試對抗三種不同HPV PsV類型（16、18和45）的抗病毒活性，在HeLa細胞中評估抗HPV活性。在圖1A、1B、1C中，IC₅₀值描述為有95%置信區(qū)間的垂直虛線，并利用在GraphPad Prism v5.0軟件中的劑量反應抑制（dose-response-inhibition）分析計算出。所有的非毒性GRFT濃度以一式三份測試并用平均值±SD示出。

圖2描述的柱狀圖說明了GRFT防止HSV-2入侵靶細胞但沒有防止病毒吸附。圖2A描述了對病毒吸附的抑制。如前所述地進行了噬斑抑制試驗。Ashley, R., Herpes simplex viruses, p375-395. In Schmidt NJ, Emmons RW (ed), Diagnostic procedures for viral, rickettsial, and chlamydial infections, 7th ed. American Public Health Association, Washington, DC. 1995。在37 oC下預培養(yǎng)HSV-2 G菌株以及不同濃度的GRFT或培養(yǎng)基（病毒對照）0、0.5、1和2小時，然后添加至預冷凍的Vero細胞并在4oC下保存。用冷凍培養(yǎng)基將單細胞層清洗三次，然后添加甲基纖維素覆蓋物，并在37oC、5% CO₂、98%濕度下培養(yǎng)48小時，接著固定、染色和計量噬斑形成單位（pfu）。病毒復制百分比是相對病毒對照計算的。圖2B描述的是對病毒入侵的抑制。進行與圖2A相同的試驗，但在4oC下培養(yǎng)2小時后，將細胞轉移至37oC、5% CO₂、98%濕度額外培養(yǎng)2小時。用檸檬酸緩沖液（pH=3.0）處理單細胞層2分鐘，以使任何殘留在細胞表面上的病毒失活。用冷培養(yǎng)基將單細胞層清洗三次，然后添加甲基纖維素覆蓋物，并在37oC、5% CO₂、98%濕度下培養(yǎng)48小時，接著固定、染色和計量噬斑形成單位（pfu）。此圖顯示相對于病毒對照的病毒復制百分比（平均值±SD）（每種條件一式三份）。

圖3是描述含有GZC的抗微生物組合物在嚴格的小鼠模型中顯著減少了HSV-2感染的圖。在應用的所示的配方（GZC=GRFT+ZA+CG；ZC=ZA+CG；GC=GRFT+CG和C=CG，即卡拉膠凝膠）后，用106 pfu的HSV-2攻擊經Depo處理的Balb/C小鼠 1小時(A)或2小時(B)（n=15-30/配方）。基于癥狀，顯示了每一個處理組隨時間變化的未被感染的動物百分比。組合配方和單獨C之間的顯著差異由星號表示（p<0.037）。1小時下GZC對ZC（p=x）與GC對ZC（p=x）之間，以及2小時下GZC對GC（p=x）與ZC對GC（p=x）之間也存在顯著差異。利用費舍爾精確檢驗進行統(tǒng)計分析。

具體實施方式

雖然本說明書通過特別指出并清楚地要求保護本發(fā)明的權利要求作出結論，但據信通過以下說明將更好地理解本發(fā)明。

在本文使用的百分比和比率均按總組合物的重量計算，除非本文另有說明。所有測量均在25 oC以及常壓下進行，除非另有指定。所有溫度均為攝氏度，除非另有規(guī)定。本發(fā)明能夠包括（開放的）或基本上由本發(fā)明的組分以及本文所述的其它成分或要素組成。如本文使用的，“包含”的意思是敘述到的要素或其結構或功能上的等價物，加上任何其他的要素或沒有敘述到的要素。術語“具有”和“包括”同樣解釋為開放的，除非上下文另有提示。

所有在本文敘述到的范圍包括端點、包括敘述在兩個數值“之間”的范圍。術語如“約”、“通?！?、“大體上”和諸如此類解釋為修飾術語或數值，使得其不是絕對的，但不會在現有技術上閱讀到。將根據情況定義這樣的術語，且它們修飾的術語是本領域的技術人員所理解的。這至少包括用于測量數值的給定技術的預計的實驗誤差、技術誤差以及儀器誤差的程度。

除非另有指出，如本文使用的，“一種”和“一”包括復數，例如“一種卡拉膠”能夠意味著至少一種卡拉膠，以及復數形式的卡拉膠，即多于一種卡拉膠，包括但不僅限于不同種類的卡拉膠。

在本文使用的，當用于一列兩個或者更多個項目時，術語“和/或”意思是任何一個列出的特征能夠存在，或者兩個或更多個列出的特征的任何組合能夠存在。例如，如果一種組合物被描述為包含試劑A、B和/或C，該組合物能夠包含只有A特征；只有B；只有C；A和B的組合；A和C的組合；B和C的組合；或A、B和C的組合。

在本文引用的所有參考文獻在全文中并入作為參考。

已經研究了卡拉膠和鋅金屬鹽以單獨以及組合形式，例如以鋅金屬鹽/卡拉膠凝膠的形式的抗微生物作用。參見例如Fernandez-Romero, J.A., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2012. 56(1): p. 358-68; Kenney, J., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013. 57(8): p. 4001-9；以及美國專利8,367,098，在此全部并入作為參考。

另外，已經報道過碳水化合物結合劑如特定的海藻凝集素具有抗HIV活性。據說最有效的海藻凝集素為格瑞弗森 （GRFT），其已被報道為對HIV、C型肝炎以及SARS相關的冠狀病毒具有抗病毒活性。Huskens, D. and D. Schols, Marine drugs, 2012. 10(7): p. 1476-97。最近也已顯示GRFT對HSV-2具有抑制作用。Nixon, B., et al., Journal of virology, 2013. 87(11): p. 6257-69。

申請人意外地和意想不到地發(fā)現特定的抗微生物劑能夠結合以生產具有更有效及協同抑制作用的抗微生物組合物。具體地，如在本文公開的，申請人已觀察到與醋酸鋅（ZA）結合，GRFT的抗HIV活性得到提高，表現出對HIV的協同抗病毒作用。而且，與ZA和CG（GZC）結合的GRFT具有提高的體內和體外抗HSV-2活性。另外，申請人也發(fā)現與卡拉膠結合的GRFT對HPV產生協同抑制作用。

如本文所理解的，如在本文實施例1中提供的，本發(fā)明的組合物可以凝膠形式配制。如本文使用的，凝膠，例如“卡拉膠凝膠”指的是組合物的相對黏性形式，其能夠被用于以促進組合物傳送而傳送時最少泄漏量的方式給藥抗微生物劑，例如用于陰道內或直腸給藥。本發(fā)明的組合物可以本領域技術人員熟悉的其它物質形態(tài)存在，包括但不僅限于固體、溶液或干燥或粉末的形式，其可能是根據預期的劑型特別地合適。因此，在此特別考慮不同于凝膠的制劑，并可根據常規(guī)方法制作。例如，包含GRFT、卡拉膠、如醋酸鋅的水溶性金屬鹽的組合物的組分可在溶液中結合以制作組合物，或者可利用常規(guī)實驗室技術由本領域技術人員結合成干燥或粉末形式。

申請人還在此報道單獨的GRFT能夠對HPV產生對抑制作用。根據申請人所知，這是GRFT，對包膜病毒具有已被報道的抗病毒活性的凝集素，首次表現出對無包被病毒HPV具有抗病毒活性。

如本文所預期的，本發(fā)明包括抗微生物組合物，所述抗微生物組合物能夠包含兩種或更多種在組合中提供增強的抑制作用的不同抗微生物劑。還考慮到這樣的殺微生物組合物可包含至少兩種不同的抗微生物成分，所述至少兩種不同的抗微生物成分能夠提供對包括HIV、HSV-2、HPV和其他STI在內的一種或更多種目標病毒的抗病毒功效的協同作用。如本文使用的，抗微生物劑包括抗病毒劑。

在本文中提及的“抗病毒劑”是本領域技術人員熟悉的。如本文所預期的，這樣的試劑包括但不僅限于包括鋅金屬鹽在內的水溶性金屬鹽、卡拉膠和凝集素。另外，“抗病毒劑”包括本領域技術人員熟悉的其它化合物，包括例如各種聚合物，如萘磺酸鹽以及其它硫酸化或磺化聚合物（McCormack S et al., Lancet, 2010 Oct 16;376(9749):1329-37）；樹枝狀大分子（Rupp R, et al., Int J Nanomedicine,2007;2(4):561–6）；以及纖維素，包括其類似物及衍生物（Chaobo Huanga, et al., Biomaterials Volume 33, Issue 3, January 2012, Pages 962–969）。

如本文所預期的，在本發(fā)明的組合物中所用合適的殺微生物劑（包括但不僅限于其它抗病毒劑）是本領域技術人員所熟悉的。在此應理解，這些殺微生物劑包含化合物，所述化合物能夠用于對抗STI，包括但不僅限于HIV，即在此考慮到的抗微生物劑并不是所有抗HIV殺微生物劑必需的。McCormack S et al., Lancet, 2010 Oct 16;376(9749):1329-37。

在具體的實施方案中，此組合物包含與卡拉膠配制的ZA，與GRFT或其它凝集素組合，以便生產具有對抗HIV、HSV-2、HPV和潛在的其它STI的廣和極有效的活性的組合物。在其它具體實施方案中，該組合物可包含與ZA和/或卡拉膠任意組合的GRFT。在此也考慮到該組合物可包含格瑞弗森，用于預防HPV感染。

如本文使用的，術語“格瑞弗森”通常用于指代天然的格瑞弗森或任何相關、功能上等價的（即抗病毒的）多肽或其衍生物，包括但不僅限于在美國專利US 8,088,729中公開的形式。

如本文使用的，“其它STI”為本領域技術人員熟悉的，并包括例如淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原體、細菌性陰道病、陰道毛滴蟲、乙型肝炎和其它。

不希望受任何具體操作理論束縛，據信以不同的作用機制使用殺微生物劑傳送不同的抗微生物劑將很可能為更多有效策略提供組合物，用于防止和/或治療更廣譜的微生物感染，包括多于一種病原體的合并感染，以及當使用一種或多種抗微生物劑時，能夠提供增強的且協同的抑制作用對抗如HIV和其它STI的病毒。因此，在本文中公開的不同的殺微生物劑可組合以獲得不同水平的抗微生物保護，以及能夠在以各種劑型給藥時將其設計成維持不同的時間。在此還考慮到，對預防包括但不僅限于HIV的STI有用的本發(fā)明的組合物，將提供一種抗HIV預防策略，所述抗HIV預防策略可被那些不愿意鑒定或確定自己潛在地處于HIV感染高風險的個體更加能夠接受而使用，并因此為全世界公共衛(wèi)生帶來益處。

如本文所預期的，在具體實施例中，本發(fā)明的抗微生物組合物不包括任何抗逆轉錄病毒的藥物（ARV）。因此，如果本發(fā)明的組合物的給藥導致抗藥性，將不會抵抗ARV。同樣地，本發(fā)明的組合物不太可能產生抗藥性，使得能夠危害使用ARV的替代性有效治療。因此，如本文所預期的，在本文中公開的組合物的使用避免了選擇HIV抵抗菌株（其有時會在ARV給藥時產生），并因此本發(fā)明的組合物為預防HIV提供有利的替代選擇。

如本文所預期的，由于本發(fā)明的組合物能夠用于治療由多于一種微生物引起的合并感染，理論上，可使用所述組合物，而不需要對個體進行HIV首次篩檢。另外，如本文所預期的，本發(fā)明的組合物可配制成非處方（OTC）分布。因此，展望此組合物將提升包括抗HIV組合物在內的這些抗微生物組合物的可達性和可負擔性，并因此為公共衛(wèi)生帶來重大益處。

當存在于本發(fā)明的組合物中時，卡拉膠包含λ卡拉膠。就此而言，存在非λ卡拉膠（這種情況下組合物的卡拉膠組分可被稱為“卡拉膠”或“卡拉膠混合物”），卡拉膠混合物含有至少約50%（并優(yōu)選至少50%）的λ卡拉膠，基于組合物中卡拉膠的總干重。在更優(yōu)選的實施方案中，λ卡拉膠的用量至少約為卡拉膠總干重的75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99 %（即λ卡拉膠及非λ卡拉膠）。其他優(yōu)選的用量為至少75%、至少約85%、至少約95%、約85至約99%以及從約94至約97%的λ卡拉膠。適用于本發(fā)明中的卡拉膠可從商業(yè)供應商（如Sigma Aldrich, St. Louis, MO）中獲得。

在本發(fā)明的組合物中卡拉膠的剩余部分可包含至少一種非λ卡拉膠?！胺铅丝ɡz”意思是除了λ卡拉膠外的任何卡拉膠，如κ卡拉膠、ι卡拉膠、κ-II卡拉膠（其包括κ和ι卡拉膠）、μ卡拉膠和ν卡拉膠。非λ卡拉膠也可從商業(yè)上（如Sigma Aldrich, St. Louis, MO）獲得，或可依照標準技術從海藻中提取。在優(yōu)選的實施方案中，非λ卡拉膠包括κ卡拉膠、ι卡拉膠和κ-II卡拉膠，及其任何兩種或更多種的混合物。在優(yōu)選的實施方案中，卡拉膠構成中的非λ卡拉膠組分少于卡拉膠總干重的約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或約25%。在更優(yōu)選的實施方案中，非λ卡拉膠組分為大約卡拉膠總干重的少于約25%、少于約15%、少于約5%、約1至約15%或約3至約6%。在其它優(yōu)選的實施方案中，卡拉膠混合物大體上或完全不含右旋糖，此成分常發(fā)現在用于食品工業(yè)的卡拉膠中。

可使用含有含量少于1%或多于5%的λ卡拉膠或卡拉膠的組合物，只要所述組合物提供抑微生物作用并保持藥物可接受性，例如陰道可接受性?！瓣幍揽山邮苄浴钡囊馑际牵髯兲匦?，如組合物的粘度允許其用于預期目的（例如組合物保持粘度，以便使用者能夠應用并保留在陰道穹窿中，以及提供諸如大體上無氣味、平滑、清晰、無色和無味的審美特性）。選擇粘度以便使組合物能夠均勻地覆蓋陰道穹窿的上皮層。通常，組合物的粘度為約10000至約50000cP，優(yōu)選約20000至約50000cP，以及更優(yōu)選約30000至約50000cP。

卡拉膠是由以線性方式排列的重復的D-半乳糖以及3,6-脫水D-半乳糖單元組成的線型多糖。此聚合物高度硫酸化，每個二糖單元含有三個SO₃基團?？ɡz具有連續(xù)的分子量。通常，在本發(fā)明組合物中所用到的卡拉膠混合物可具有多達約2×10⁶道爾頓的分子量，少于約1%的卡拉膠分子具有1×10⁵道爾頓的平均分子量（用氣相滲透色譜以及光散射法測定）。更具體地，本發(fā)明中的λ卡拉膠具有約600000至約1200000道爾頓的平均分子量。這種物理性質把不被吸收性賦予最終制劑，其反過來提供延長的抗微生物活性。

本發(fā)明的卡拉膠能夠提供數個其它益處。若曝露在冰凍溫度、環(huán)境溫度或沸騰溫度，卡拉膠保持穩(wěn)定。該混合物能與人類陰道環(huán)境相適應。不希望受任何具體操作理論束縛，據信此卡拉膠與人類陰道環(huán)境相適應，且不會作為基質，或相反引起或刺激天然陰道菌群的生長，它們也不是有毒的以致瓦解在陰道內的天然菌群的平衡。除歸屬于本發(fā)明的卡拉膠的性質之外，其抗微生物活性延續(xù)一段時間，由于其并非全身吸收或降解成對人體有害的任何能夠吸收的副產物。

如上面所討論到的，申請人此前已報道過水溶性金屬鹽與卡拉膠之間的復合物的抗病毒作用。金屬鹽與卡拉膠的這種復合物可與一種或多種凝集素結合應用于本發(fā)明的組合物中。在優(yōu)選的實施方案中，此金屬鹽為鋅鹽（且此抗微生物組合物可被稱為“卡拉膠鋅”）。

鋅是諸如HIV和HSV-2之類的性傳播病原體的抑制劑。已表明醋酸鋅與硫酸鋅抑制在細胞培養(yǎng)中的HIV感染，以及抑制在細胞培養(yǎng)和實驗室動物中的HSV-2感染。已表明鋅鹽有效阻隔在體外由HIV引起的感染（Haraguchi, Y., et al. Antiviral Res 43, 123-133 (1999）以及阻隔由口蹄疫病毒、人類鼻病毒、A型流行性感冒和B型流行性感冒、塞姆利基森林病毒以及辛德畢斯病毒引起的感染（Sergio, W. Medical Hypotheses 26,253 (1988)）。Haraguchi等通過p24 ELISA和RT試驗，發(fā)現氯化鋅、醋酸鎘和氯化汞抑制HIV-1的生產。當以多達550μg/mL的濃度存在時，氯化鋅沒有表現出明顯的細胞毒性。另外，Fenstermacher和DeStefano提出鋅形成帶有顯著削弱的催化活性的高度穩(wěn)定的HIV逆轉錄酶-（引物-模板）復合物。Fenstermacher KJ, Destefano JJ. Journal of Biological Chemistry. 2011 Nov 18;286(47):40433–42。

因此，除與卡拉膠和凝集素結合使用之外，在本文中也考慮到此水溶性鋅鹽可與在本發(fā)明的組合物中的一種或多種凝集素結合使用。特別地，包含GFRT和醋酸鋅的組合物可結合使用，以提高GFRT的抗HIV效力。

在本發(fā)明中有用的鋅鹽既包括無機鹽也包括有機鹽，當依照本發(fā)明使用時，其顯示出抗微生物性能，而不引起不能接受的刺激。本發(fā)明所使用的可能的水溶性鋅鹽包括醋酸鋅、丙酸鋅、丁酸鋅、甲酸鋅、葡萄糖酸鋅、甘油酸鋅、羥乙酸鋅、乳酸鋅、硫酸酸、氯化鋅以及溴化鋅。在此也考慮到ZnSO₄、ZnCl₂、ZnBr₂、Zn(Ac)₂等的使用。銅和銀對應的鹽在本發(fā)明中也是有用的，倘若它們在體內是無刺激性的并且不會引起降解至對人體有害的任何能夠吸收的副產物。如本文所預期的，本發(fā)明的組合物可包括在約0.03%和1.5%之間的水溶性金屬鹽，且具體為組合物總重量的約0.3%到1.0%的重量。

卡拉膠和鋅金屬的復合物，以及具體到在本發(fā)明中所使用的醋酸鋅，可根據在現有技術中公開的方法制備，如在美國專利8,367,098中所描述的。同時參見Fernández-Romero JA, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2012 Jan;56(1):358–68; Kenney, J., et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2013. 57(8): p. 4001-9，在此全部并入作為參考。簡單地說，這樣的復合物可以通過標準程序制備，其中金屬離子替換在多糖主鏈上天然存在的陽離子。例如，卡拉膠鋅（指的是本發(fā)明的鋅陽離子和卡拉膠之間的復合物）是通過鋅非共價地附著于卡拉膠的硫酸基團的過程所合成的化合物。Kenney, J., et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2013. 57(8): p. 4001-9。

以上過程產生了水溶的并有效對抗諸如HIV和HSV-2的包膜病毒或如HPV的無包被病毒的化合物。和無機鋅鹽或簡單的有機鋅鹽不同，卡拉膠鋅維持了優(yōu)選的流變特性并具有高分子量（多達2000000道爾頓），使其負責被配制成無刺激性且不被吸收的陰道內或直腸產品。此組合物可被稱為“復合物”，因為在金屬與卡拉膠之間存在的分子間相互作用排斥或阻止其解離成游離的金屬陽離子。金屬鹽和帶負電的硫酸化多糖的本復合物，在其物理、化學和/或抗微生物性能方面不同于水溶性金屬鹽和卡拉膠的混合物。

如本文公開的，一種或多種凝集素添加至水溶性鋅金屬鹽和卡拉膠的組合；或者凝集素與鋅金屬鹽或與卡拉膠的組合能夠給組合物提供提高的抗病毒效力。適用于本發(fā)明的組合物的凝集素，包括但不僅限于格瑞弗森、西亞諾韋林（Cyanovirin）、西托韋林（Scytovirin）、 阿克汀諾文（Actinohivin）及其它抗病毒凝集素蛋白。參見如Brichacek B, et al., In Vivo Evaluation of Safety and Toxicity of a Lactobacillus jensenii Producing Modified Cyanovirin-N in a Rhesus Macaque Vaginal Challenge Model. Bereswill S, editor. PLoS ONE. 2013 Nov 12;8(11):e78817; Takebe Y, et al. Antiviral Lectins from Red and Blue-Green Algae Show Potent In Vitro and In Vivo Activity against Hepatitis C Virus. Choi J, editor. PLoS ONE. 2013 May 21;8(5):e64449; Tanaka H, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009 Sep 15;106(37):15633–8；以及O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009. 106(15): p. 6099-104。

更具體地說，申請人已發(fā)現添加GFRT至卡拉膠組合物和醋酸鋅組合物（單獨或組合）能夠提供意想不到且協同的抗病毒活性。特別地，如在以下實施例中所提供的，GFRT的抗HIV活性在醋酸鋅的存在下顯著地提高。另外，卡拉膠在HPV上的抑制活性，以及卡拉膠和醋酸鋅的組合在HSV-2上的抑制作用，均在GFRT的存在下協同地提高。

因此，如本文所預期的，本發(fā)明的抗微生物組合物可具體包含與鋅金屬和卡拉膠中的一種或多種組合的一種或多種凝集素。這些抗微生物劑可用于在本文中敘述的各種組合中，以提供具有提高的且協同的抗微生物活性的殺微生物組合物。這樣的組合物可根據常規(guī)方法制得。例如，添加劑，如GFRT和/或ZA可例如以復合物的形式，與卡拉膠混合或聯合。例如，如在US 8,367,098中所公開的，卡拉膠可與鋅金屬以復合物的形式存在。

在本文中考慮的卡拉膠、水溶性金屬鹽以及凝集素的組合優(yōu)選地包括以上討論的卡拉膠，包括卡拉膠的干重至少50%含量的λ卡拉膠，卡拉膠的剩余部分為至少一種非λ卡拉膠的，并且最優(yōu)選的是95%λ卡拉膠和5%κ卡拉膠的組合，總組成以凝膠的形式包括1%至5%之間的卡拉膠，優(yōu)選約3%的卡拉膠；組合物包括水溶性金屬鹽，優(yōu)選包含鋅鹽，最優(yōu)選為醋酸鋅或乳酸鋅的形式，在總組成中包括約0.1 wt.%至1.5 wt.%的金屬，例如鋅，最優(yōu)選為約總組成的0.3 wt.%；并且可進一步包括一種或多種凝集素。在一個具體的實施方案中，凝集素的含量可為約0.01至1%之間，并具體為組合物的總重量約0.05%至0.2%之間。如本文所預期的，凝集素，如GRFT，可存在于組合物中，使得其占組合物總重量的0.1%。

如本文所預期的，“抗微生物劑”的“有效含量”是在有需要的對象中抑制一種或多種微生物感染的傳染性的足夠含量。然而，如本領域技術人員所理解的，抗微生物劑的有效含量，或用于組合物中這樣的試劑的實際重量百分比，能夠根據各種因素而有所變化，例如包括在組合物中的凝集素和其它抗微生物劑對于待處理的目標微生物的實際抗微生物活性。這樣的活性能夠根據常規(guī)方法以及相應配制的活性試劑的含量確定。例如，物質的抗病毒活性可根據在本文的圖1和表2中所描述的方法測量。在確定活性抗微生物劑的劑量中所考慮的其它因素是本領域技術人員所熟悉的，且所述其它因素包括藥物組合物的實際劑型和傳送方式，例如此劑型是否打算用于緩釋。

在此應理解，在組合物中的個別活性抗微生物劑，如每一個構成本發(fā)明的組合物的抗微生物劑的抗病毒組分，可以足以產生殺微生物劑的含量存在于組合物中，如以足以在將對所需個體施行組合物給藥于有需要的對象時產生抗病毒作用的含量存在于組合物中。如本文所描述，以及在以下實施例中詳述的，提高的且協同的抗微生物作用能夠根據某些抗病毒劑的組合而獲得。

因此，如上文描述的，為了提供抗微生物作用，λ卡拉膠或卡拉膠通常以基于組合物總重量約1至約5%的含量存在。當包含在本發(fā)明的組合物中時，在優(yōu)選的實施方案中，卡拉膠以占組合物總重量約3%的含量存在。然而，這樣的含量，還有凝集素、金屬鹽和其它試劑的含量，可變化并由本領域技術人員利用常規(guī)方法確定。

“抗微生物的”或“抗微生物作用”意思是此組合物抑制或降低由細菌、原生動物、病毒或另一微生物引起的性傳播感染的傳播可能性。本發(fā)明的組合物對于預防性傳播感染，例如抑制由HIV、HPV和HSV-2引起的感染是有用的。另一方面，術語“抗微生物的”和“抗微生物作用”并不意為表達、暗示或被限制為由此實現抑制感染傳播的任何具體的方法。

申請人也意外地發(fā)現GFRT對HPV具有抗病毒效用。因此，本發(fā)明包含了含有單獨的GFRT或與其它抗微生物劑和藥劑組合的GFRT的組合物，以及通過給藥這樣的組合物在有需要的對象中治療HPV感染的方法。如本文討論到的，GFRT在這樣的組合物中的有效含量和劑型可由本領域技術人員根據常規(guī)方法確定。

本領域技術人員將意識到在本文公開的任何一種或多種抗微生物組合物還可具有對其它STI的抑制作用，并因此作為多用途預防技術的一部分，向有需要的對象給藥這樣的組合物可同時用于治療或預防由其它STI引起的感染，并因此獲得公共衛(wèi)生益處。

因此，在此可以預期本發(fā)明的抗微生物組合物可給藥于對象（如人類），以便治療或預防微生物感染，包括但不僅限于病毒感染，例如通過抑制微生物的生長或復制。特別需要關注治療或預防的病毒包括但不僅限于HIV、HPV、HSV各種菌株，包括HSV-2。

如本文所使用的，有需要的對象包括處于微生物如病毒感染風險的人或已受感染的人。如本文具體考慮的，微生物感染的風險包括病毒感染的風險，并且包括但不僅限于性傳播引起的感染的風險。如在本文中使用的，術語對象的“治療”是本領域技術人員所熟悉的，并包含在已感染的個體中減少癥狀和/或病原體的擴散。這樣的減少可與處于病原體傳播至另一個體的可能性中的疾病相關，并與已治療的對象獲得另一種微生物感染，如HIV的可能性的減少相關。例如，已觀察到受皰疹感染的個體具有獲得HIV感染的增加的傾向。因此，據信根據本發(fā)明的方法， STI的治療將具有使病人不易受其它感染，如HIV影響的相關益處。

如本文所使用的，術語“預防”被理解為是指設計成降低微生物感染可能性的預防性治療，包括但不僅限于未受感染、通過性傳播易受影響的個體的感染。

如本文所使用的，“其它STI”是本領域技術人員所熟悉的，并及包括如淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原體、細菌性陰道病、陰道毛滴蟲、乙型肝炎和其它。

除在此討論的卡拉膠、凝集素及金屬鹽之外，其它抗微生物化合物也能夠用于本發(fā)明的組合物，包括聚合物，如萘磺酸鹽及其他硫酸化或磺化的聚合物（McCormack S et al., Lancet. 2010 Oct 16;376(9749):1329-37；樹枝狀大分子（Rupp R, et al., Int J Nanomedicine,2007;2(4):561–6；以及纖維素，包括纖維素類似物及其衍生物（Chaobo Huanga, et al., Biomaterials Volume 33, Issue 3, January 2012, Pages 962–969。這些及其它合適的抗微生物劑，包括但不僅限于適用于本發(fā)明組合物的抗病毒化合物，均為本領域技術人員所熟悉。

本發(fā)明的組合物可配制成進一步含有其它活性試劑和/或惰性成分，取決于預期的用途（如以下描述的）。例如，包含一種或多種治療劑的制藥配方，包括例如一種或多種活性抗微生物劑或其它治療劑或在藥學上可接受的載體中的藥物，均在此考慮到。適用于藥物組合物的載體，以及特別是用于在此考慮到的組合物的陰道內和直腸內能接受的劑型的載體，均為本領域技術人員所熟悉，并且包括例如各種商業(yè)上能夠獲得的生理學能接受的運載體（vehicles）、助劑、賦形劑和稀釋劑。

這樣的組合物可經配制用于處方及非處方用途。如本文所理解的，“非處方”藥物組合物（也稱為“OTC”或非處方藥物）為本領域技術人員所熟悉并且指的是沒有處方也能買到的藥物。

在具體實施方案中，本發(fā)明的組合物還可含有能夠在陰道給藥的藥物。優(yōu)選的藥物包括，例如避孕藥，如類固醇激素，例如Saleh等、美國專利5,972,372（“Saleh”）公開的那些，其所公開的內容在此并入作為參考。在本發(fā)明中有用的的避孕藥的例子包括孕酮、ACTH、雄激素、雌激素、促性腺激素、人類生長激素、尿促性素、黃體酮、孕酮（如左炔諾孕酮、炔諾酮、3-酮-去氧孕烯和孕二烯酮）、孕激素、尿促卵泡素、抗利尿激素及其組合。優(yōu)選的試劑包括促孕化合物（如醋酸炔諾酮和NESTORONE? (“NES”)。（也就是16-亞甲基-17α-乙酰氧基-19-去甲孕甾烯-3,20-二酮（16-methylene-17.alpha.-acetoxy-19-norpregnene-3,20-dione））），以及孕酮（如左炔諾孕酮（LNG））。

優(yōu)選的避孕藥為Nestorone 16-亞甲基-17α-乙酰氧基-19-去甲孕甾-4-烯-3,20-二酮（16-methylene- l7α-acetoxy- 19-norpregn-4-ene-3, 20-dione）（在下文為“NES”），其在文獻中已被鑒定為“ST-1435”。在利用經典生物鑒定測量促孕的效力的比較研究中，發(fā)現NES具有高于黃體酮100倍并高于左炔諾孕酮10倍的促孕活性（Kumar, N., et al.Steroid 65, 629-636 (2000)）。因此需要較少含量的NES以獲得排卵抑制。與缺乏雄激素、雌激素和類糖皮質激素（肝糖原沉積）活性以及缺乏對脂質或臨床化學參數的作用結合的效力，賦予NES在避孕藥中使用的特殊優(yōu)點。Kumar, N., et al.Steroid 65, 629-636 (2000); Odlind, V., et al. Contraception 31, 130 (1985); Robins, A. & Bardin, C. Ann N Y Acad Sci828, 38-46 (1997)。然而，NES在口服時已表現出經歷快速的新陳代謝和失活，使其當經由移植物或陰道環(huán)來給予時適用于哺乳期婦女。Massai, R., et al. Steroid 65, 703-707 (2000); Lahteenmaki PLA, et al. Contraception 42, 555-562 (1990)。當與κ/λ卡拉膠混合物以凝膠形式結合時，NES的優(yōu)選傳送劑量為約75至約100μg每天之間，這將達到約200 pmol/L的NES的血漿水平并獲得在月經期間良好的出血模式。其它優(yōu)選的能夠在陰道給藥的藥物包括用于激素取代療法的試劑，如雌激素物質（例如乙炔雌二醇）以及其它甾族化合物。

不希望受任何具體操作理論束縛，據信卡拉膠具有賦予殺微生物性能，同時為避孕藥劑或用于激素取代療法的試劑提供釋放傳送系統(tǒng)的雙重功能。另外，據信卡拉膠能夠賦予殺微生物性能，同時穩(wěn)定蛋白質乳液。當它們可以凝膠形式在組合物中使用時，在此描述的組合物不僅限于只包含卡拉膠凝膠的使用。能夠制備出用于其它傳送系統(tǒng)的制劑，也因此該組合物可以是適用于抗微生物劑傳送的任何物理形態(tài)，包括凝膠、溶液、固體或者干燥或粉末的形態(tài)。

此組合物還可含有與在本文公開的組合物適用的、生理學能接受的pH控制劑。合適的緩沖劑可由本領域技術人員利用常規(guī)方法確定。在具體實施方案中，此緩沖液為醋酸緩沖液。在另一實施方案中，此醋酸緩沖液包含醋酸和醋酸鈉的混合物。

在具體的實施方案中，此組合物還可包含防腐劑。在具體的實施方案中，此防腐劑為苯甲酸甲酯。其它合適的防腐劑包括例如對羥基苯甲酸的烷基酯（如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯）、乙內酰脲衍生物、對羥基苯甲酸酯類（如對羥基苯甲酸甲酯）、丙酸鹽、三氯生三碳酸替苯胺（triclosan tricarbanilide）、茶樹油、乙醇、法尼醇、醋酸法尼酯、六氯酚以及季銨鹽，如苯變形物（benzolconjure）、鋅鹽和鋁鹽、苯甲酸鈉、苯甲醇、苯扎氯銨和氯丁醇。通常，此防腐劑以基于組合物總重量多達約0.3%的用量存在。

除了抑制在生產過程中因疏忽引入的微生物的生長之外，此防腐劑能夠防止可能發(fā)生在組合物中的活性試劑的有害影響，歸因于一旦組合物引入體內，存在正常的身體菌群。這會延長活性試劑在組合物中保持活性的時間長度。此組合物包括約5mM至約25mM的pH控制劑以及0.1%至0.3%的防腐劑。

如根據本發(fā)明的方法所考慮到的，本發(fā)明的組合物可以本技術領域人員所熟悉的各種各劑型給藥。因此，在此可以理解，本發(fā)明的抗微生物組合物的藥物制劑包含常見的制劑，該常見的制劑適于使用在本文公開的抗微生物劑的治療所用的劑型和給藥路徑。這樣的制劑能夠包括例如液體溶液、液體懸浮液、片劑、膠囊、軟膠囊（gelcap）、氣溶膠以及皮膚貼片，所述液體溶液、液體懸浮液、片劑、膠囊、軟膠囊、氣溶膠以及皮膚貼片包含有效含量的一種或多種用于口腔、鼻腔、和/或外用的抗微生物劑。因此，在此考慮到的是組合物可被給藥以治療或預防全身性感染。然而，如本文所考慮的，在具體的實施方案中，本發(fā)明的藥物制劑和組合物期望用于陰道和/或直腸給藥以預防或治療感染。

這樣的組合物可由本領域技術人員根據制藥工業(yè)的標準技術適當地配制成例如凝膠、乳霜、泡沫、薄膜、片劑和栓劑、陰道內環(huán)、子宮內避孕器或系統(tǒng)以及納米纖維。

如本文所考慮的，本發(fā)明的方法包括根據由本領域技術人員設計的給藥模式和頻率給藥在本文公開的組合物，以實現在有需要的對象中以最適合預防或治療微生物感染的含量和一段時間內的治療劑量給藥。這樣的給藥可例如用于立即釋放或緩釋。

以下實施例用于進一步闡明本發(fā)明的某些實施方案，但并不用于以任何方式限制本發(fā)明。在下文描述到的實驗中利用了常規(guī)方法和商業(yè)上能能夠獲取的試劑，除了由B. O'Keefe (Molecular Targets Development Program, National Cancer Institute at Frederick, Frederick, MD)友好提供的GFRT外。

實施例1. GZC凝膠制劑的生產。

此前已描述過適用于本發(fā)明的卡拉膠+醋酸鋅組合的制備方法，并在下文概述。參見例如Kenney J, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2013 Jul 15;57(8):4001–9。

卡拉膠的制備：對于步驟1，將2829g無菌已過濾的水以及3.923g三水乙酸鈉（Sigma）倒進4升雙行星式攪拌器（Charles Ross & Son, Hauppauge, NY）中。在69°C、40rpm下加熱此溶液5分鐘。加入卡拉膠（102g，最終濃度為3.4%），并在69°C下攪拌此混合物3小時。對于步驟2，待此制劑冷卻至25°C后，加入含有6g苯甲酸甲酯（Spectrum, Gardena, CA）)-60ml丙二醇（Sigma）的溶液，并在40rpm下攪拌此溶液額外1小時。調節(jié)制劑pH至6.8，并在真空條件下攪拌反應體積15分鐘以除去氣泡。

醋酸鋅/卡拉膠的制備：對于步驟1，利用與制作卡拉膠的方案類似的方案制作醋酸鋅/卡拉膠的組合，但有以下改變：使用894ml的10mM醋酸鈉緩沖液（pH 6.4）。加入卡拉膠（31g）以達到3%的最終濃度。加入含有3g二水醋酸鋅-50ml醋酸鈉緩沖液的溶液，并在40rpm下攪拌此溶液額外20分鐘。使用含有2g苯甲酸甲酯-20ml丙二醇的混合物。

對羥基苯甲酸甲酯含量、鋅的含量以及生理化學性質（滲透壓濃度、pH、簡單粘度（simple viscosity））利用如在Fernandez-Romero JA et al., 2012, Antimicrob Agents Chemother. 56:358-368中描述的已建立的方法確定。

穩(wěn)定性研究。等份（25g）的凝膠在以下條件下儲存在30ml聚丙烯瓶（Qorpak, Bridgeville, PA）中：30°C/65%相對濕度（RH），40°C/75% RH以及50°C/環(huán)境濕度。定期移出瓶子，并分析凝膠的對羥基苯甲酸甲酯含量、滲透壓濃度、pH、粘度以及鋅的含量，如Fernandez-Romero JA et al., 2012, Antimicrob Agents Chemother. 56:358-368所描述的。

格瑞弗森/醋酸鋅/卡拉膠制劑的制備：重復如上提供的制備醋酸鋅/卡拉膠制劑的步驟，但有額外的第三步，其中往醋酸鋅/卡拉膠制劑加入GRFT的水溶液（O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009. 106(15): p. 6099-104；美國專利8,088,729），并且如在步驟2中的在25°C、40rpm下混合額外的20分鐘。

實施例2. GRFT對抗HIV和HPV的活性的體外試驗。

在標準體外試驗中驗證GRFT對抗HIV的活性。簡單來說，GRFT由Dr. Barry O’Keefe (NCI)提供并利用如Begay O, et al. AIDS Research and Human Retroviruses. 2011 Sep 1;27(9):1019–24所描述的MAGI試驗以及實驗室菌株HIV-1_MN（X4病毒）和HIV-1_ADA-M（R5病毒）在TZM-bl細胞（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program）中測試其抗HIV活性；參見圖1A。

實驗室菌株HIV-1_MN（X4病毒）和HIV-1_ADA-M（R5病毒）由在the AIDS and Cancer Virus Program, SAIC-Frederick, Inc., National Cancer Institute, Frederick, MD的Dr. J.D. Lifson提供。用不同的非毒性GRFT濃度處理TZM-bl細胞，然后立即加入HIV-1病毒（100-200個感染單位），接著培養(yǎng)72小時，然后固定并染色細胞單層。在GraphPad Prism v5.0軟件中利用劑量反應抑制分析計算IC₅₀值（在圖中表示為有95%的置信區(qū)間的垂直虛線）。所有非毒性GRFT濃度均以一式三份測試。圖表顯示了平均值±SD。

還根據常規(guī)方法利用實驗室菌株HIV-1_NL4-3在外周血單個核細胞（PBMC）中測試抗HIV活性。參見Trkola A, et al., J Virol. 1999 Nov;73(11):8966–74。簡單來說，用不同的非毒性濃度的GRFT處理激活的PBMC（2×10⁶/ml），然后添加100 TCID₅₀的病毒，接著過夜培養(yǎng)。在感染后的第1天和第4天將上層清液替換為新鮮的刺激培養(yǎng)基。在感染后第7天利用p24 ELISA測試上層清液中的p24水平。在GraphPad Prism v5.0軟件中利用劑量反應抑制分析計算IC₅₀值（在圖中表示為有95%的置信區(qū)間的垂直虛線）。所有的非毒性GRFT濃度均以一式三份測試。參見圖1B。此圖表顯示平均值±SD。來自兩種試驗的數據證實了GRFT在體外具有有效的抗HIV活性。

還研究了GRFT對抗HPV假病毒的活性。具體地，在HeLa細胞中利用熒光素酶檢測估計GRFT對HPV16、HPV18以及HPV45假病毒（PsV）的抗病毒活性（Buck CB, et al. PLoS Pathog. 2006 Jul 1;2(7):e69）。在此實驗中，用不同的非毒性GRFT濃度處理HeLa細胞，然后立即添加HPV16、HPV18或HPV45 PsV（生產~300-700相對發(fā)光單元的病毒數量），接著培養(yǎng)72小時。進行熒光素酶檢測以獲得圖1C所示的劑量反應曲線。在GraphPad Prism v5.0軟件中利用劑量反應抑制分析計算IC₅₀值（在圖中表示為有95%的置信區(qū)間的垂直虛線）。所有的非毒性GRFT濃度均以一式三份測試。此圖表顯示平均值±SD。數據表明GRFT具有溫和的體外活性對抗HPV16、18和45 PsV。

實施例3. 與ZA和C組合的GRFT導致抗HIV和抗HPV協同作用。

根據以上描述的方法測試與醋酸鋅（ZA）和卡拉膠（C）組合的GRFT的抗HIV和抗HPV活性。簡單來說，為了測試抗HIV活性，用各種均等劑量的GRFT、ZA或GRFT+ZA（基于每一個API的IC₅₀）在37 ^oC下處理激活的PBMC 1小時，然后在相同劑量的每個化合物或組合存在下，曝露于100 TCID₅₀ 的HIV-1_92BR014（一式三份）。包括了培養(yǎng)基處理（只有病毒）的細胞作為對照。十八個小時之后，清洗細胞并在有IL-2的培養(yǎng)基的存在下鋪板（plate）（僅有的例外是用ZA處理的那些樣品，其中ZA已經被替換）。在第4天重復此步驟并在第7天收集上層清液，以通過ELISA測量HIV-1的p24水平。為了試驗抗HPV活性，在 37 ^oC下用各種均等劑量的GRFT、C或GRFT+C（基于每一個API的IC₅₀）處理HeLa細胞，并立即曝露于HPV16 PsV（一式三份）。包括了培養(yǎng)基處理（只有病毒）的細胞作為對照。熒光素酶測試在感染后72小時進行。利用Chou-Talalay方法（Chou, T.C. Pharmacological Reviews, 2006, 58(3): p. 621-81）與Windows軟件的Cacusyn（Biosoft, Cambridge, United Kingdom）估計組合指數（Combination indexes，CI）。結果在表1中提供。如本文所提供的，“CI”指的是藥物相互作用程度的數量測度，如下：累加作用（CI=1）；協同作用（CI<1），或拮抗作用（CI>1）?！癉m”指的是半數有效劑量（IC₅₀）；“m”指的是劑量效應曲線的S形態(tài)的測量，還代表了半數有效曲線的斜率；“r”指的是半數有效曲線的線性相關系數。如其中所使用的，%IC₅₀下降= 1-[IC₅₀組合/IC₅₀ GRFT]*100。^?%IC₅₀下降值是基于粗體的API。N/A=不適用。

在表1中提供的數據表明在ZA和GRFT之間對抗HIV以及在C和GRFT之間對抗HPV16 PsV有意外的協同作用（表1；CI值小于1）。另外，重要的是，看不到在GRFT和C或ZA之間的拮抗作用的證據。

表1. 與ZA和CG組合的GRFT導致抗HIV和抗HPV協同作用。

實施例4. GRFT防止HSV-2入侵靶細胞但沒有阻止病毒吸附。

Nixon等最近的研究（Nixon, B., et al., Journal of virology, 2013. 87(11): p. 6257-69）表明 GRFT在體內外阻隔HSV-2感染，而且提到抑制病毒作為作用方式的細胞至細胞的傳播。我們已在Vero細胞中進行了實驗，提出了抑制HSV-2的入侵但沒有吸附至靶細胞。對于抑制病毒吸附，如此前描述的進行了噬斑抑制試驗。Ashley, R., Herpes simplex viruses, p375-395. In Schmidt NJ, Emmons RW (ed), Diagnostic procedures for viral, rickettsial, and chlamydial infections, 7th ed. American Public Health Association, Washington, DC. 1995。簡單來說，在37 oC下預培養(yǎng)HSV-2 G菌株和不同濃度的GRFT或培養(yǎng)基（病毒對照）0、0.5、1和2小時，然后添加至預冷凍的Vero細胞并于4 oC下保存。用冷培養(yǎng)基清洗單細胞層三次，然后添加甲基纖維素覆蓋物，并在37oC、5% CO₂和98%的濕度下培養(yǎng)48小時，然后固定、染色和計量噬斑形成單位（pfu）。病毒復制百分比是相對病毒對照計算的。參見圖2A。還試驗了病毒入侵的抑制。簡單來說，進行了與上述吸附研究和圖2A相同的試驗，然而，在4oC下培養(yǎng)2小時后，細胞被轉移至37oC、5% CO₂和98%的濕度培養(yǎng)額外的2h。用檸檬酸緩沖液（pH=3.0）處理單細胞層2分鐘，以使殘留在細胞表面上的任何病毒失活。用冷培養(yǎng)基清洗單細胞層三次，然后添加甲基纖維素覆蓋物，并在37oC、5% CO₂和98%的濕度下培養(yǎng)48小時，然后固定、染色和計量噬斑形成單位（pfu）。在圖2B中描述的圖表示相對于病毒對照的病毒復制百分比（平均值±SD）（每種條件一式三份）。

實施例5. GRFT/ZA/C組合提高了對抗HSV-2的抗病毒活性。

之前我們報道過ZA和CG的組合導致了對抗HSV-2的有效的抗病毒協同作用。Fernandez-Romero, J.A., et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2012. 56(1): p. 358-68。最近我們發(fā)現在體外抗HSV-2活性的水平GRFT、ZA和C的兼容性，并發(fā)現當兩種或三種這些化合物組合時IC₅₀值的顯著下降。簡單來說，在37 oC下預培養(yǎng)HSV-2 G菌株和不同濃度的每種化合物或其組合（基于均等的IC₅₀比率），并添加至Vero細胞，然后在37oC、5% CO₂和98%的濕度下培養(yǎng)6天。進行了上染PrestoBlue試驗以測試抗病毒活性。相對熒光單元（RFU）在570nm下激發(fā)、600nm下發(fā)射而測量。利用以下公式計算病毒復制百分比：病毒復制百分比=[(O.D_細胞對照- O.D_化合物)/(O.D_細胞對照- O.D_病毒對照)]*100。在GraphPad Prism v5.0軟件中利用劑量反應抑制分析計算IC₅₀值。數據在下文的表2中提供。如表所提供的，^?IC₅₀或IC₅₀降低百分比數值是基于粗體字的API；N/A=不適用。

表2. GRFT/ZA/C組合提高對抗HSV-2的抗病毒活性。

實施例6. GZC在嚴格小鼠模型中顯著降低HSV-2感染

為了確定GZC組合是否在體內有效對抗HSV-2，我們使用了高度嚴格的模型，其中用醋酸鋅/卡拉膠凝膠處理經DepoProvera處理的小鼠1或2小時，然后用10⁶ pfu的HSV-2進行陰道攻擊。Fernández-Romero JA, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2012 Jan;56(1):358–68。

簡單來說，在指定的配方（GZC=GRFT+ZA+C；ZC=ZA+C；GC=GRFT+C且在此實施例中C表示卡拉膠）之后，用10⁶pfu的HSV-2攻擊經Depo處理的Balb/C小鼠1小時（圖3A）或2小時（圖3B）。在此實施例中的所有制劑均應用為凝膠制劑（n=15-30/配方）?；诎Y狀，在圖3中對每一個治療組記錄并顯示隨時間變化的未被感染的動物百分比。在組合配方與單獨C之間的顯著區(qū)別由星號（p<0.037）指出。利用費舍爾精確檢驗進行統(tǒng)計分析。利用此方法，我們發(fā)現包含0.1%GRFT、0.3%ZA以及3%CG凝膠（GZC）的組合物顯著降低了HSV-2感染（相對于CG對照；圖3）。值得注意的是，可見在GZC處理的小鼠中的感染頻率低于在GC或ZC組中觀察到的感染頻率。

盡管本發(fā)明在此已參照特定實施方案進行描述，但是應該理解這些實施方案僅僅作為例證說明本發(fā)明的原理和應用。因此應理解，可對示例性實施方案進行各種修改，并且可設計其它方案，而不背離由所附權利要求書限定的本發(fā)明的精神和范圍。