本發(fā)明提供了包含粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和抗生素磷霉素(fosfomycin)作為其主要成分的組合物，其用于治療身體皮膚或膜的傷口、潰瘍、瘡(sore)、燒傷和其他損傷。因此，其與內科學及外科學、創(chuàng)傷學和燒傷學領域中的皮膚病學和護理領域相關。
背景技術：
傷口愈合
傷口愈合是活體動物的正常特性，并且是涉及多種類型細胞和細胞外基質的動態(tài)、互動過程，其速度和效率取決于多種內部及外部因素?？蓪⒄５挠线^程依照包含1)止血、2)炎癥、3)增殖和4)重塑的程序化的四個階段來進行描述。
1)止血是在損害后立刻發(fā)生并且通常持續(xù)長達數(shù)小時的血管應答期。開始時傷口會出血，但血液凝固和血管收縮重建止血，同時凝固的血液為細胞遷移提供臨時的細胞外基質。
2)炎癥通常開始于受傷時，并且在正常愈合過程中的3-4天內結束。在臨床上通過炎癥的經典體征和癥狀(例如熱、紅、腫和痛)來識別炎癥階段。傷口開始滲出流體(其有助于移除組織碎片)，并且將蛋白酶釋放到傷口區(qū)域中。白細胞和巨噬細胞開始在病變中聚集以清除碎片：巨噬細胞釋放的生長因子刺激成纖維細胞。在該階段中構建細胞外基質。炎癥總是存在，而細菌的進入可從定殖過渡至臨床感染以加劇炎性階段消退的任何延遲。
3)增殖通常在炎性階段之后繼續(xù)，并且其特征是成纖維細胞的增殖和遷移以及結締組織的產生。其在創(chuàng)傷發(fā)生之后約4天開始，并且在通常愈合閉合的傷口中持續(xù)2-3周。在具有嚴重組織損傷的開放性傷口中，該階段可顯著延長，在此情況下完全閉合將需要大量結締組織的產生。在該階段中，發(fā)生新血管形成、上皮形成、傷口收縮和膠原產生。
4)重塑(也稱為成熟、慢化(moderation)或結痂階段)開始于傷口閉合后的2-3周，而其不會在傷口已愈合之前在開放性傷口中開始。在此之后，其通常持續(xù)數(shù)周、數(shù)月或者甚至數(shù)年。成熟涉及傷口收縮、覆蓋肉芽組織的新上皮組織生長，以及可能的疤痕形成。在該階段中，肌成纖維細胞從成纖維細胞中形成，并且膠原纖維逐漸成熟并變得相對更加組織化(organized)。
對于傷口的最佳愈合，全部的四個階段必須以合適的順序和時間框架發(fā)生。傷口的不同部分可以不同速率愈合，所以正常傷口的一些部分(相對于其他部分)可處于愈合的更晚期階段。
延遲的傷口愈合和慢性或非愈合性傷口和潰瘍
許多因素可引起包括延長性愈合失敗(非愈合性傷口)在內的異常或缺陷性傷口愈合。此類傷口一般已經無法通過正常的愈合階段進行，并且經常由于延遲的、不完整的或不協(xié)調的愈合過程而進入病理性炎癥狀態(tài)。這些傷口通常受到一種或更多種細菌物種的定殖或感染，這加劇并延長炎癥，并促使愈合延遲。
多數(shù)慢性傷口是與缺血、糖尿病、靜脈淤滯或壓迫相關的潰瘍。非愈合性傷口影響了工業(yè)化世界中超過1％的人口。在美國，其可影響多達六百萬人口，其中約85％將是65歲或/和更年長的人。非愈合性傷口導致巨大的衛(wèi)生保健支出，其在美國的總年度費用估計超過三十億美元。
隨著人口老化以及患糖尿病的個體數(shù)量提高，預計患病率將提高。慢性潰瘍降低了患者的生活質量與工作能力，并且意味著對衛(wèi)生保健系統(tǒng)的巨大財政負擔。
下肢潰瘍(尤其是那些由糖尿病或者靜脈性或動脈性缺陷引起的那些)占慢性潰瘍相當大的比例。約15％至25％的患有糖尿病的個體在其一生中的某時間點會發(fā)生足潰瘍(foot ulcer)，并且估計那些患者中12％需要下肢截肢。愈合因糖尿病性神經病而變得復雜，并且對感染的敏感性也大幅提高。靜脈性疾病占慢性下肢潰瘍的大多數(shù)。繼發(fā)于多種原因的靜脈高壓(venous hypertension)可損傷血管壁并最終導致皮膚破裂(skin breakdown)。動脈性潰瘍不太常見，并且是由循環(huán)受損(impaired circulation)引起，所述循環(huán)受損可對愈合產生不利影響并導致潰瘍。
細菌定殖和感染在慢性潰瘍中的作用
在傷口愈合受損的炎癥階段中，細菌總是會通過從定殖和嚴重定殖到感染的過程污染該潰瘍。嚴重定殖不常與感染的明顯體征共存，但可導致愈合失敗、肉芽組織低質、傷口脆弱性升高以及滲出提高(Frank C等，2005)。慢性傷口(例如潰瘍)的菌群最通常以生物膜表型(biofilm phenotype)存在并且已知其嚴重損害正常的愈合進程(Smith DM等，2010)。標準治療包括使用表面抗微生物劑(碘及銀制劑)或表面抗生素(單獨或多種組合的莫匹羅星、夫西地酸、氨基糖苷類、桿菌肽、多黏菌素B、短桿菌肽類以及甲硝唑)兩周左右。其可隨后給予相關經口抗生素。涉及慢性皮膚潰瘍的細菌種類
慢性皮膚潰瘍的定殖與感染中涉及的細菌種類通常包括存在于對側或周圍完整皮膚中的那些，但會表現(xiàn)出某些細菌屬的存在有量大幅上升，包括例如在關于糖尿病性潰瘍的研究中的棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、埃希氏菌屬(Escherichia)、志賀氏菌屬(Shigella)和沙雷氏菌屬(Serratia)(Gontcharova V等，2010)。厭氧的屬也很常見，例如芬格爾德氏菌屬(Finegoldia)及嗜胨菌屬(Peptoniphilus)。雖然葡萄球菌屬(Staphylococcus)以屬出現(xiàn)頻率并不過高，金黃色葡萄球菌(S.aureus)對慢性傷口的感染必須被嚴肅對待。在對褥瘡性潰瘍(decubitus ulcer)的分析中，所鑒定到最常見的細菌屬是鏈球菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬、芬格爾德氏菌屬、厭氧球菌屬(Anaerococcus)、假單胞菌和嗜胨菌屬。發(fā)現(xiàn)許多功能上等同的致病組(pathogroup)(原本非致病性種的共生菌落，其協(xié)同作用以宿主為代價來促進其自身存活)作為慢性傷口致病性生物膜定殖和生存，其被承認為慢性傷口的主要感染性病原體(Smith DM等，2010)。
非愈合性傷口和潰瘍的標準治療
所有非愈合性傷口及潰瘍的標準治療包括壞死組織的清創(chuàng)、感染控制和局部傷口護理。對于非愈合性傷口的每種類別，必須實施專門的治療模式。例如，對于糖尿病性足潰瘍，必須關注機械減負、嚴格的血糖控制和對患者足部護理的教育。對于靜脈性潰瘍，其專門措施通常包括機械擠壓以及肢體抬高以逆轉組織水腫并改善靜脈血流。對于由動脈供血不足引起的潰瘍著重在重建血流以及使組織灌注的進一步損失最小化。對于壓力性潰瘍，減負方法或設備是治療的金標準。
如果潰瘍不能以標準療法得到充分治愈，可需要另外的治療模式，其經常稱為“高級傷口護理治療”。已經開發(fā)出大量且仍在增多的具有不同組成和適應癥的高級傷口護理治療系列。對于這些數(shù)量可觀的治療，其療效、相對效果和不良作用并未良好地確立。因此，盡管傷口愈合治療領域中已有廣泛研究，傷口和潰瘍的治療仍是復雜的任務，特別是在老年人或患病群體中。
粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)
粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)是集落刺激因子(CSF)家族的成員，其為刺激造血祖細胞之增殖和成熟以及增強成熟效應細胞之功能活性的糖蛋白。簡而言之，在非成熟細胞層面，CSF確保精力庫(staminal pool)的自我更新，并激活造血細胞分化的第一階段。在后續(xù)階段中，當細胞增殖與成熟細胞特性的進行性獲得相關，其極大提高了分化細胞的數(shù)量。在最終階段，其刺激成熟細胞的循環(huán)和激活。
GM-CSF已展現(xiàn)出在傷口愈合上的積極作用，該作用通過輔助傷口收縮、引發(fā)炎性細胞的局部募集、以及誘發(fā)角質細胞增殖來實現(xiàn)。GM-CSF還在愈合過程中激活單核吞噬細胞、改善上皮細胞遷移、以及進一步調節(jié)細胞因子產生。
成熟GM-CSF是單體蛋白質，具有127個氨基酸殘基，其中有數(shù)個潛在糖基化位點。糖基化的可變度導致其分子量范圍為14k Da至35kDa。非糖基化和糖基化GM-CSF表現(xiàn)出相似的體外活性(Cebon J等，1990)。GM-CSF的晶體學分析揭示其由四個短α螺旋構成的桶形結構(Diederichs K等，1991)。有兩種已知的GM-CSF序列變體。在體內，GM-CSF蛋白的活性形式在細胞外表現(xiàn)為同源二聚體。
GM-CSF通過與其受體結合來實現(xiàn)其生物學活性。GM-CSF受體(GM-CSF-R)表達的最重要位置是在骨髓細胞的細胞表面上，例如I型和II型巨噬細胞、上皮細胞以及內皮細胞，其中淋巴細胞為GM-CSF-R陰性。天然受體由α亞基和β亞基構成。其α亞基賦予配體特異性并以納摩爾親和力結合GM-CSF。β亞基也是白介素-3和白介素-5受體復合物的組成部分并且與GM-CSF-R之α亞基及GM-CSF締合，導致形成具有皮摩爾結合親和力的復合物(Hayashida K等，1990)。GM-CSF上對受體的結合域已經定位：GM-CSF通過其第一α螺旋內非常受限的區(qū)域與其受體的β亞基相互作用(Shanafelt AB等，1991a；b；Lopez AF等，1991)。與α亞基的結合可定位于第三α螺旋(螺旋C，環(huán)的起始殘基將螺旋C與螺旋D結合)以及GM-CSF的羧基末端尾部(BrownCB等，1994)。
該GM-CSF三聚受體復合物的形成導致復合物信號轉導級聯(lián)的激活，其涉及JAK/STAT家族、She、Ras、Raf、MAP激酶、磷脂酰肌醇-3激酶和NFκB的分子，最終導致c-myc、c-fos以及c-iun的轉錄。激活主要由受體的β亞基引起(Hayashida K等，1990；Kitamura T等，1991；Sato N等，1993)。共享的β亞基也負責IL-3、IL-5和GM-CSF所發(fā)揮的重疊功能(Groot RP等綜述，1998)。
除了其在造血細胞生長和分化中的刺激活性，GM-CSF也作為促炎細胞因子發(fā)揮作用。GM-CSF激活巨噬細胞(例如I型和II型巨噬細胞類和單核細胞，以及中性粒細胞和嗜酸性粒細胞)，導致其他細胞因子和趨化因子和基質降解蛋白酶的釋放，以及HLA和細胞黏附分子或CC-趨化因子受體表達升高。這繼而導致炎性細胞進入發(fā)炎組織的趨化升高。
已知傷口中的巨噬細胞會釋放多種生物活性物質，其可作為吸引單核細胞和成纖維細胞二者的化學引誘劑，例如轉化生長因子-β(TGF-β)和血小板源性生長因子(PDGF)。激活的巨噬細胞消化失活的膠原和纖維蛋白凝塊。凝塊的溶解允許傷口愈合第二個階段中傷口部位肉芽組織的形成。
利用GM-CSF刺激傷口愈合
以上所概述的GM-CSF活性不僅刺激細胞增殖、成熟以及涉及傷口愈合炎癥和增生階段的活性，并且在同一過程中還提升了針對細菌感染的天然防衛(wèi)機制。表面施用重組人GM-CSF以加速多種類型慢性傷口和潰瘍的愈合的用途已被系統(tǒng)性地綜述，并且得出其對于深部分厚度燒傷(deep partial-thickness burn)、慢性下肢潰瘍和麻風性潰瘍的治療有益的結論，也有一些證據支持其對壓迫性潰瘍和癌癥相關潰瘍具有積極效果(Hu X等，2011)。發(fā)現(xiàn)在大鼠中對由大腸桿菌(Escherichia coli)感染的實驗性傷口表面施用GM-CSF刺激針對感染的天然防御，如與加速的傷口閉合相關的細菌計數(shù)降低中所見的那樣(Robson M等，1994)。
利用表面抗生素控制慢性傷口和潰瘍中的細菌感染
上文已經概述了在慢性傷口和潰瘍的標準護理中表面抗微生物劑及抗生素的當前應用。表面抗微生物劑(例如基于碘或銀的制劑)可大體上比作防腐劑(antiseptic)：盡管其可能具有強大的殺菌作用，其對于活體細胞也有顯著的毒性作用，而這些細胞對于傷口愈合過程至關重要。對于局部殺菌作用與對宿主組織毒性之間的平衡需要重點關注。該平衡就所提到的抗生素來說，對于促進愈合可更加有利，但這些抗生素在所達到的局部濃度也可具有顯著的細胞毒性作用。選擇能夠強效殺菌而對涉及傷口愈合的細胞毒性小或沒有毒性的抗生素或抗生素組合是顯著有利的。另一種考慮是抗生素應該對已知存在于感染傷口和潰瘍的主要細菌種類有活性。另外，如果目前該抗生素對于近年來變得愈加流行的多種多藥耐藥性菌株有活性，則是巨大優(yōu)勢。最后，若對于該藥物具有抗性的細菌在較長時間內無明顯增多，也是優(yōu)勢，因此對于將出現(xiàn)的細菌耐藥性應有合理的預期。磷霉素
磷霉素是1969年從弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)菌株分離并表征的名稱為phosphomycin或phosphonomycin的廣譜抗生素的國際非專有名稱(Hendlin D等，1969)。其結構確定為(-)(1R，2S)-1，2-環(huán)氧丙基膦酸(Christensen BG等，1969)，其系統(tǒng)(IUPAC)命名為[(2R，3S）-3-甲基氧雜環(huán)丙烷-2-基]膦酸([(2R，3S)-3-methyloxiran-2-yl]phosphonic acid)，且其式量為138.1Da。磷霉素具有殺菌性，且通過使酶UDP-N-乙酰葡糖胺-3-烯醇式丙酮酸轉移酶(也稱為MurA)失活來抑制細菌細胞壁生物合成(Brown ED等，1995)。該酶催化肽聚糖生物合成中的關鍵步驟，即磷酸烯醇式丙酮酸與3’-羥基UDP-N-乙酰葡糖胺連接以形成N-乙酰胞壁酸。磷霉素是磷酸烯醇式丙酮酸類似物，通過烷基化活性位點半胱氨酸殘基抑制MurA。該抗生素通過甘油磷酸轉運體進入細菌細胞。
考慮到該作用機制，磷霉素殺菌譜廣，對需氧的屬具有活性，例如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、奈瑟菌屬(Neisseria)、埃希氏菌屬、變形桿菌屬(Proteus)(吲哚陰性)、沙雷氏菌屬、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬和弧菌屬，對于吲哚陽性的變形桿菌屬、克雷伯氏菌屬和埃希氏菌屬活性較差。已知其對厭氧的屬(消化鏈球菌屬(包括嗜胨菌屬、芬格爾達氏菌屬和厭氧球菌屬)和梭桿菌屬)有活性?？梢钥闯銎浠钚宰V包含大量在慢性皮膚潰瘍的嚴重定殖與感染中突出的屬。
社會上細菌對磷霉素的耐藥性流行性較低，并且自從引入磷霉素后，對細菌抗藥性流行性的研究顯示，其耐藥生物的流行性無提高，或僅有適量提高。然而，長期暴露與該抗生素可使得細菌能夠通過對缺乏甘油磷酸轉運體通路的突變體進行篩選而演化出耐藥性。作為替代的耐藥性機制涉及可誘導己糖磷酸轉運體的丟失(為MurAS中的Cys-Asp突變)，或者獲得編碼磷霉素滅活酶fosA和fosB(除了單核細胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)染色體fosX之外)的質粒。然而，突變體菌株也可表現(xiàn)為致病性減弱(Karageorgopoulos DE等，2012)。這可以解釋為何在體外長時間暴露會出現(xiàn)細菌耐藥性，而在體內頻率卻小得多。在經口或靜脈內注射施用磷霉素的對照臨床試驗中，耐藥性菌株的出現(xiàn)整體已達3.0％，在銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中達到最高15％。一般而言，磷霉素被看作針對多藥耐藥生物治療手段的有價值的補充。在細菌感染的慢性潰瘍治療中，并未出現(xiàn)針對磷霉素產生耐藥性的經驗。
盡管在人患者中使用磷霉素二鈉的靜脈內劑量高達0.5g/kg/天，但已證明磷霉素對哺乳動物細胞和器官顯著無毒性。此處的限制因素是反荷離子的過載，而非該抗生素的任何毒性效果。事實上，已發(fā)現(xiàn)磷霉素具有針對其他抗生素、免疫抑制或化學治療劑(例如氨基糖苷類、萬古霉素、兩性霉素B、多黏菌素、環(huán)孢素和順鉑)毒性作用的保護作用(GobernadoM，2003)。作為附加效果，其具有有助于吞噬的能力并且充當免疫調變劑。多形核白細胞會積累該藥物至其濃度達到細胞外液中的兩倍，但并不影響其細胞功能，反而表現(xiàn)出對金黃色葡萄球菌的殺菌作用。其主要不良作用為經口施用磷霉素二鈉對胃的刺激、變態(tài)反應的跡象(短暫的皮疹(病例中0.3％)和嗜酸性粒細胞增多癥(0.2％)的形式)、以及短暫升高的肝酶(病例中0.3％)(Gobernado M，2003)。
磷霉素與其他抗生素組合使用
當其與很多種抗生素(青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類和林可酰胺類)組合時，磷霉素對來自所提及的易感屬生物的大量菌株表現(xiàn)出可觀的協(xié)同作用。雖然早期研究顯示，當多種抗生素組合時，在受檢菌株中的約70％-100％均展現(xiàn)協(xié)同作用，但隨后更廣泛的研究顯示協(xié)同率為36％-74％。其余的菌株僅表現(xiàn)出相加作用，并且抑制作用僅見于對單一細菌菌株的一種或兩種獨立抗生素組合(Gobernado M，2003)。磷霉素與多種獨立抗生素表現(xiàn)出協(xié)同作用并且確實消除多種其他抗生素之毒性(包括氨基糖苷類的腎毒性和耳毒性)的事實支持磷霉素與其他抗生素組合使用以產生潛在殺菌作用并在更長期治療中抵消任何磷霉素耐藥性的出現(xiàn)。
發(fā)明概述
因此，本發(fā)明提供了藥物組合物，其用于表面治療表現(xiàn)出延遲愈合或不愈合且受到細菌嚴重定殖或感染的皮膚和黏膜或者傷口、慢性潰瘍和瘡，所述組合物主要包括：
1.藥物組合物，其含有：
a)粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或者其片段或變體；以及
b)磷霉素，其為其無機或有機鹽的形式。
2.根據上述1.所述的藥物組合物，其含有一種或更多種另外的抗生素或抗微生物劑。
將GM-CSF與磷霉素或磷霉素與其他抗生素的組合相組合的優(yōu)勢在于：利用GM-CSF的已知作用以促進傷口愈合和針對細菌感染的天然防衛(wèi)機制，同時還通過磷霉素的殺菌作用更迅速地消除感染細菌而加速傷口愈合，所述磷霉素對粒細胞、巨噬細胞以及GM-CSF通過其發(fā)揮治療作用的其他細胞無毒性作用。該作用是，對于表現(xiàn)出延遲愈合或不愈合的傷口和潰瘍，比通過已有治療或通過單獨表面GM-CSF或表面磷霉素(有或沒有另外的抗生素)獲得更快的愈合速度。
在如下發(fā)明詳述中，將會給出本發(fā)明范圍的詳述和所用術語的含義，以及實際實施本發(fā)明的細節(jié)。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了組合物，其包含粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或者其片段或變體、磷霉素(其為其無機或有機鹽的形式)，以及在另一實施方案中包含另外的抗生素或抗微生物劑，以及在又一實施方案中包含發(fā)現(xiàn)促進傷口愈合的另外的藥劑。所述組合物可用于治療皮膚或黏膜的傷口、潰瘍、瘡和其他類型損傷，并且旨在以進一步描述的多種方式表面施用。本發(fā)明的組合物和方法也存在于一些可用于治療方法的實施方案中。
GM-CSF制劑
出于實用的目的，本發(fā)明中待使用的GM-CSF制劑將不會是純化的天然人GM-CSF，而是通過重組DNA技術體外制備的人GM-CSF，當然，若前者可用量充足且可能存在的病毒污染問題得以克服，也可使用該制劑。在哺乳動物細胞中進行人重組GM-CSF(hrGM-CSF)的制備已有描述(Wong GG等，1985；Kaushansky K等，1986)。利用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞進行的類似工作已導致非專有名稱為瑞拉司亭(regramostim)的hrGM-CSF的產生(Moonen P等，1987首次報道)。Cantrell MA等報道了hrGM-CSF在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的表達(1985)，導致非專有名稱為沙格司亭(sargramostim)的制劑。沙格司亭與內源性人GM-CSF不同之處在于，在其前肽(pro-peptide)上第23位具有亮氨酸殘基而非脯氨酸殘基，并且與內源性人GM-CSF或瑞拉司亭中任一個相比，其糖基化程度較低(Armitage JO，1998)。Burgess AW等報道了hrGM-CSF在大腸桿菌中的表達(1987)，導致非專有名稱為莫拉司亭(molgramostim)的制劑，該制劑無法糖基化。上述三種hrGM-CSF制劑(瑞拉司亭、沙格司亭和莫拉司亭)均可用于本發(fā)明，但目前僅可獲得后兩種。
人GM-CSF的“功能同源物”在本文中定義為多肽，其與人GM-CSF已知且天然存在的序列和序列變體具有至少50％的序列同一性，并且具有該天然存在蛋白質的一種或更多種功能。這些功能包括以下：刺激來自多個譜系(lineage)的造血前體細胞的生長和分化，所述譜系包括粒細胞、巨噬細胞和單核細胞；增強成熟效應細胞的功能活性，所述細胞參與抗原呈遞和細胞介導免疫，包括中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞。所述功能還包括與傷口愈合特別相關的那些，例如在愈合過程中促進傷口收縮、導致炎性細胞局部募集、改善中性粒細胞的募集、引起角化細胞增殖、激活單個核吞噬細胞、促進上皮細胞遷移，以及進一步調節(jié)細胞因子產生。瑞拉司亭、沙格司亭和莫拉司亭可以說都是天然存在的人GM-CSF的功能同源物。
通過氨基酸序列比對評估的緊密相關的不同物種的GM-CSF同源物之間的演化保守性可用于確定在單個氨基酸殘基上的演化壓力程度。優(yōu)選地，在GM-CSF功能保守的物種之間比較GM-CSF序列，所述物種例如但不限于哺乳動物，包括嚙齒類、猴類和猿類。在高選擇壓力下的殘基更有可能表現(xiàn)為不可輕易取代的必需氨基酸殘基，而非在物種間變換的殘基。綜上可明顯說明，根據本發(fā)明，人GM-CSF序列可進行合理數(shù)量的修改或替換，而不干預該GM-CSF分子活性。這樣的GM-CSF分子在本文中稱為人GM-CSF的功能同源物，并且可以是下述天然人GM-CSF的此類變體和片段。
本文中使用的詞語“變體”是指與所指蛋白質(index protein)同源的多肽或蛋白質，其在本實例中為天然存在的人GM-CSF，但其與所指蛋白質的區(qū)別在于所指蛋白質序列中的一個或更多個氨基酸殘基替換為其他氨基酸殘基。當氨基酸殘基替換為具有大體相似性質的不同氨基酸殘基時，可認為這些替換為“保守的”，而當氨基酸殘基替換為一個不同類型時，則認為是“非保守的”。大體上說，可能會出現(xiàn)的不改變多肽生物學活性的非保守替換較少。
本領域技術人員將知曉如何完成和評估“保守的”氨基酸替換，從而將一個氨基酸殘基替換為與前者有一種或更多種共有化學和/或物理學性質的另一個氨基酸殘基。保守氨基酸替換影響該蛋白質功能的可能性較小。氨基酸可根據其共有屬性分類。保守的氨基酸替換為將某氨基酸預定組中的氨基酸替換為同組中另一個氨基酸，在該組中氨基酸表現(xiàn)相似或基本相似的性質。本文中使用的術語“保守的氨基酸替換”的含義中，可將氨基酸組中的一個氨基酸替換為另一氨基酸，所氨基酸組的特征在于具有：
i)極性側鏈(Asp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr和Cys)
ii)非極性側鏈(Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro和Met)
iii)脂肪族側鏈(Gly、Ala Val、Leu和Ile)
iv)環(huán)狀側鏈(Phe、Tyr、Trp、His和Pro)
v)芳族側鏈(Phe、Tyr和Trp)
vi)酸性側鏈(Asp和Glu)
vii)堿性側鏈(Lys、Arg和His)
viii)酰胺側鏈(Asn和Gln)
ix)羥基側鏈(Ser和Thr)
x)含硫側鏈(Cys和Met)
xi)屬于單氨基二羧酸或單氨基單羧-單酰胺基酸的氨基酸(Asp、Glu、Asn和Gln)。
本發(fā)明范圍中的功能同源物為多肽，其表現(xiàn)出與天然存在形式的人GM-CSF具有至少50％的序列同一性，例如至少60％的序列同一性，例如至少70％的序列同一性，例如至少75％的序列同一性，例如與天然存在形式的人GM-CSF至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
序列同一性可使用許多公知的算法并應用許多不同的空位罰分來計算。任何序列比對算法(例如但不限于FASTA、BLAST或GETSEQ)可用于搜索同源物以及計算序列同一性。此外，在適當情況下，任何公知的替代矩陣(例如但不限于PAM、BLOSSUM或PSSM矩陣)可與搜索算法一起應用。例如，PSSM(位置特異性得分矩陣(position specific scoring matrix))可通過PSI-BLAST程序進行應用。此外，進行序列比對時可使用一系列空位開放和延伸罰分。例如，可以在BLAST算法中使用范圍為5-12的空位開放罰分和范圍為1-2的空位延伸罰分。
因此，根據該發(fā)明，在其相同序列變體或片段內，或在其不同序列變體或片段之中，其變體或片段可包含至少一個替換，例如彼此獨立引入的多個替換。
上述簡述清楚地說明，其相同變體或片段可包含來自多于一個上文中所定義的保守氨基酸分組的多于一個保守氨基酸替換。
除了二十種標準氨基酸和兩種特殊氨基酸外(硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸)，還有大量的“非標準氨基酸”，其在體內不并入蛋白質。非標準氨基酸的實例包括含硫牛磺酸以及神經遞質GABA和多巴胺。其他實例為羊毛硫氨酸、2-氨基異丁酸和脫氫丙氨酸。其他非標準氨基酸有鳥氨酸和瓜氨酸。
非標準氨基酸通常通過對標準氨基酸進行修飾形成。例如，?；撬峥赏ㄟ^半胱氨酸脫羧形成，而多巴胺由酪氨酸合成，并且羥脯氨酸通過對脯氨酸進行翻譯后修飾得到(通常在膠原中)。非天然氨基酸的實例列于例如37C.F.R.section 1.822(b)(4)中，其均通過引用并入。
本文中所描述的標準和非標準氨基酸殘基二者均可以是“D”或“L”異構體形式。
可以預期根據本發(fā)明的功能等價物可包含任何氨基酸(包括非標準氨基酸)。在一些優(yōu)選的實施方案中，功能等價物僅包含標準氨基酸。
標準和/或非標準氨基酸可通過肽鍵或通過非肽鍵連接。如本領域中所已知的，術語肽還包括由化學或酶催化反應引入的翻譯后修飾。如果期望的話，這樣的翻譯后修飾可在分開前引入。本文中所特指的氨基酸將優(yōu)先為L-立體異構體形式。氨基酸類似物可用于替換20種天然氨基酸。已知數(shù)種此類類似物，包括氟苯丙氨酸、正亮氨酸、氮雜環(huán)丁烷-2-羧酸、S-氨乙基半胱氨酸、4-甲基色氨酸等。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述GM-CSF變體包含能夠延長活性成分半衰期的綴合物，例如白蛋白或脂肪酸。
適合的變體與人GM-CSF天然存在形式的預定序列具有至少60％的同一性，優(yōu)選至少70％，并且因此，變體優(yōu)選具有至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
功能同源物還可包含在人蛋白質中通常不存在的化學修飾，例如泛素化、標記(例如用放射性核素、多種酶等)、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或通過插入(或通過化學合成替換)氨基酸(例如鳥氨酸)。
除了本文中所描述的肽基化合物外，也可配制空間結構相似的化合物以模擬肽結構的關鍵部分，并且此類化合物還可以相同方式用于本發(fā)明的多肽。這可通過本領域技術人員已知的建模和化學設計技術來實現(xiàn)。例如，可以使用酯化和其他烷基化來修飾例如二精氨酸肽骨架的氨基末端(N-端)以模仿四肽結構?？梢岳斫?，所有此類空間相似結構都落入本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明還涵蓋N-端烷基化且C-端酯化的肽。功能等價物還包含以相同分子形成的糖基化的和共價或聚集的綴合物，包括二聚體或無關的化學部分。通過本領域中已知的方式，此類功能等價物通過將官能團與見于包含N-端和C-端中任一個或兩者的片段中的基團相連接制備。
所述“其片段”可指給定氨基酸序列的任何部分。片段連在一起可以包含全長蛋白質中的多于一個部分。適合的片段可以是缺失或添加突變體。添加至少一個氨基酸可以是添加優(yōu)選地2至250個氨基酸，例如10至20個氨基酸，例如20至30個氨基酸，例如40至50個氨基酸。片段可包含來自所述蛋白質的小區(qū)域或這些區(qū)域的組合。缺失和/或添加可以彼此獨立地是在序列中和/或在序列末端的缺失和/或添加。
缺失突變適當?shù)匕辽匍L度為20或40個連續(xù)氨基酸且更優(yōu)選至少80或100個連續(xù)氨基酸。因此，這樣的片段可以是取自人GM-CSF序列中的較短序列，其含有至少20個連續(xù)氨基酸，例如至少30個連續(xù)氨基酸，例如至少40個連續(xù)氨基酸，例如至少50個連續(xù)氨基酸，例如至少60個連續(xù)氨基酸，例如至少70個連續(xù)氨基酸，例如至少80個連續(xù)氨基酸，例如至少90個連續(xù)氨基酸，例如至少95個連續(xù)氨基酸，例如至少100個連續(xù)氨基酸，例如至少105個氨基酸，例如至少110個連續(xù)氨基酸，例如至少115個連續(xù)氨基酸，例如至少120個連續(xù)氨基酸，其中所述缺失突變體優(yōu)選地具有與人GM-CSF天然存在形式至少75％的序列同一性，例如至少80％的序列同一性，例如至少85％的序列同一性，例如至少90％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少91％的序列同一性，例如至少92％的序列同一性，例如至少93％的序列同一性，例如至少94％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性，例如至少96％的序列同一性，例如至少97％的序列同一性，例如至少98％的序列同一性，例如99％的序列同一性。
優(yōu)選地，GM-CSF的功能同源物包含至多500，更優(yōu)選至多400，甚至更優(yōu)選至多300，然而更優(yōu)選至多200，例如至多175，例如至多160，如至多150個氨基酸，例如至多144個氨基酸。
有兩種人GM-CSF的已知變體：變體1中的T115I替換以及變體2中的I117T替換。因此，本發(fā)明的一個實施方案中，GM-CSF的功能同源物包含與人GM-CSF NO：1或任何剪接變體具有高度序列同一性的序列。
例如，在美國專利No.5,229,496、5,393,870和5,391,485中描述了GM-CSF的類似物。該類似物也是本發(fā)明中所包含的功能等價物。
在一個實施方案中，根據本發(fā)明以同聚體或異聚體的形式使用GM-CSF。GM-CSF的同聚體或異聚體形式可包含一個或更多個GM-CSF單體或如上文中所定義的GM-CSF的功能同源物。同聚體和異聚體包括二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體、九聚體和十聚體。
在一個實施方案中，使用了GM-CSF的同源二聚體、三聚體或四聚體。
人(Homo sapiens)GM-CSF前體(包含信號肽)形式的氨基酸序列為：
MWLQSLLLLG TVACSISAPA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE.
對應的成熟蛋白質的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)為：
APARSPSPST QPWEHVNAIQ EARRLLNLSR DTAAEMNETV EVISEMFDLQ EPTCLQTRLE LYKQGLRGSL TKLKGPLTMM ASHYKQHCPP TPETSCATQI ITFESFKENL KDFLLVIPFD CWEPVQE
根據本發(fā)明的人GM-CSF天然存在形式的功能同源物市售可得，例如沙格司亭(Immunex，Seattle，WA，USA)。
GM-CSF的重組生產
GM-CSF或者其功能性變體或同源物可以以多種方式生產，例如從例如人或動物血清中分離或從細胞(例如原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞，哺乳動物細胞)中或無細胞系統(tǒng)中表達分離。
本發(fā)明的一個實施方案中，GM-CSF通過宿主細胞重組生產。因此，在本發(fā)明的一方面中，GM-CSF由宿主細胞生產，所述細胞包含編碼GM-CSF的第一核酸序列，其與能夠指導在所述宿主細胞中表達的第二核酸序列可操作地相關聯(lián)。因此，所述第二核酸序列可包含啟動子或甚至由其組成，所述啟動子將指導在所述細胞中表達目的蛋白質。技術人員將能夠容易地確定用于給定宿主細胞中的可用的第二核酸序列。
生產重組GM-CSF的方法大體上包括如下步驟：
-提供宿主細胞
-制備基因表達構建體，所述構建體包含編碼GM-CSF的第一核酸序列，其與能夠指導在所述宿主細胞中表達所述蛋白質的第二核酸序列可操作地相連接
-用所述構建體轉化所述宿主細胞
-培養(yǎng)所述宿主細胞，從而獲得GM-CSF的表達。
如此生產的重組GM-CSF可通過任何常規(guī)方法分離，例如下文中描述的任何蛋白質分離方法。技術人員將能夠確定用于純化GM-CSF的合適蛋白分離步驟。
在本發(fā)明的一個實施方案中，重組生產的GM-CSF由宿主細胞分泌。當分泌GM-CSF時，生產目標重組蛋白的方法可包括以下步驟：
-提供宿主細胞
-制備基因表達構建體，所述構建體包含編碼GM-CSF的第一核酸序列，其與能夠指導在所述宿主細胞中表達所述蛋白質的第二核酸序列可操作地相連接
-用所述構建體轉化所述宿主細胞
-培養(yǎng)宿主細胞，從而獲得GM-CSF的表達以及GM-CSF向培養(yǎng)基中的分泌
-從而獲得含有GM-CSF的培養(yǎng)基。
因此，在本發(fā)明的該實施方案中，包含GM-CSF和核酸的組合物可以是所述培養(yǎng)基或者由所述培養(yǎng)基制備的組合物。
在本發(fā)明的另一實施方案中，所述組合物為由動物、其部分或細胞制備的提取物或此類提取物的分離的級分。
在本發(fā)明的一個實施方案中，GM-CSF在體外于宿主細胞中重組生產，并從細胞裂解液、細胞提取物或從組織培養(yǎng)上清液中分離。在一個更優(yōu)選的實施方案中，GM-CSF由宿主細胞生產，所述細胞以使其表達相關GM-CSF的方式修飾。在本發(fā)明的一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，轉化所述宿主細胞以生產和分泌相關GM-CSF。
根據本發(fā)明的藥物組合物可包含GM-CSF或者其功能性變體或同源物，其濃度為1μg/mL至10mg/mL，更優(yōu)選5μg/mL至500μg/mL，并且甚至更優(yōu)選10μg/mL至200μg/mL。
磷霉素制劑
落入本發(fā)明范圍內的磷霉素制劑為化合物及化合物的鹽，其包含如下結構：(-)(1R，2S)-1，2-環(huán)氧丙基膦酸，系統(tǒng)名為[(2R，3S)-3-甲基氧雜環(huán)丙烷-2-基]膦酸，式量為138.1Da。盡管用此結構的游離酸形式作為用于計算磷霉素有效量和濃度的基礎，但游離酸不穩(wěn)定而用于臨床用途的抗生素作為無機或有機鹽存在。本發(fā)明范圍內磷霉素鹽的無機反離子的非限制性實例為鈉、鈣、鉀、鋰、銨、鎂。本發(fā)明范圍內磷霉素鹽有機反離子的非限制性實例為氨丁三醇(trometamol)(也稱為緩血酸胺(tromethamine)或tris，系統(tǒng)名為2-氨基-2-羥甲基-丙烷-1，3-二醇)、苯乙胺，以及大量其他生物相容性有機胺。本發(fā)明范圍內目前使用的磷霉素的主要形式為：
i)磷霉素二鈉，式量182.0Da，5％溶液pH為9.0-10.5。該鹽易溶于水，對胃有刺激性，且主要用于靜脈內注射。
ii)一水合磷霉素鈣，式量194.1Da，0.4％溶液pH為8.1-9.6。該鹽微溶于水，但對胃刺激性較小，且用于經口治療。其生物利用度可低至12％(Bergan T，1990)。
iii)磷霉素氨丁三醇，式量259.2Da，5％溶液pH為3.5-5.5。該鹽易溶于水，經口給予時耐受良好，且尤其用于下泌尿道感染的單劑量經口治療，表現(xiàn)出約40％的生物利用度。
通常對于這些制劑，其作為干粉在25℃下至少3年是穩(wěn)定的，但在水溶液中，表現(xiàn)出pH依賴性不穩(wěn)定性，在25℃下，在pH 3下在10小時內、在pH 6.5下在2月內以及在pH 9.75下在2年內，丟失10％的磷霉素活性。在配制具有合適保質期的用于表面施用的水性組合物時必須考慮低pH下降低的穩(wěn)定性。
與其他抗微生物劑組合
本發(fā)明的組合物還可含有一種或更多種另外的抗微生物劑以增強其對重要病原體(如金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌)的殺菌作用，阻止任何延長治療中產生耐藥性的菌株過度生長，或擴大抗微生物譜以包括非細菌病原體(包括但不限于真菌)。該組合物中可包含的抗微生物劑的非限制性實例為：夫西地酸或夫西地酸鈉、青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類、萬古霉素、林可霉素、克林霉素、氟喹諾酮類、莫匹羅星、桿菌肽、多黏菌素B、短桿菌肽類、甲硝唑、克霉唑、酮康唑和制霉菌素。特別適合包含于其中的藥劑表現(xiàn)與磷霉素的協(xié)同殺菌作用，其非限制性實例為：青霉素、氨芐西林、羧芐西林、甲氧西林、苯唑西林、美洛西林、哌拉西林、氨曲南、亞胺培南、頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢美唑、頭孢噻肟、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢磺啶、頭孢他啶、頭孢吡肟、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、阿米卡星、紅霉素、麥迪霉素、萬古霉素、林可霉素、克林霉素、替考拉寧、達托霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、司帕沙星。某些抗生素與磷霉素在水溶液中不相容，例如氨芐西林、美坦西林、頭孢噻啶、頭孢噻吩、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素，該特征可使其不適用于本發(fā)明范圍內的水性組合物。
在一個實施方案中，所述另外的抗生素或抗微生物劑選自：阿貝卡星、氨曲南、頭孢西丁、頭孢哌酮、頭孢氨芐、克林霉素、氟氯西林、美羅培南、甲硝唑、美洛西林或萬古霉素。選擇克林霉素或美羅培南或甲硝唑特別地旨在用于治療懷疑或通過合適的細菌培養(yǎng)已知受到厭氧菌(包括擬桿菌屬(Bacteroides)物種)感染的傷口。
在另一實施方案中，所述另外的抗生素至少為氨曲南和阿貝卡星的組合。其特別地旨在用于治療懷疑或通過合適的細菌培養(yǎng)已知受到銅綠假單胞菌感染的傷口。
所有以上化合物均為技術人員所知，基于待治療的感染性生物身份的試驗數(shù)據，技術人員無需過度負擔就可從化合物列表中選擇用哪種化合物與GM-CSF和磷霉素組合治療。
藥物組合物的其他成分
維生素A和抗氧化劑還可對愈合過程中的組織具有刺激作用。在本發(fā)明的一個實施方案中，本文中所限定的組合物還包含維生素A和/或抗氧化劑，其非限制性實例為：維生素E(以α-生育酚的形式)、泛醌、艾地苯醌、類胡蘿卜素(例如番茄紅素)、抗壞血酸或抗壞血酸鹽/酯、以及煙酰胺。
劑量
本發(fā)明的藥物組合物的“有效量”意為這樣的劑量，當將其施用于有此需要的對象時，獲得具有有利生物學作用的濃度，即通過治療、阻止或減輕刺激或病變(例如身體皮膚、黏膜或結締組織的傷口、潰瘍和其他病變)。這樣的有效量可由患者的主治醫(yī)師或獸醫(yī)確定，并且本領域普通技術人員可容易地確定。影響治療有效量的因素將包括以下：
i)所使用治療劑的特定活性
ii)病變類型(機械性或熱性，全厚度或部分厚度燒傷，等)
iii)病變尺寸
iv)病變深度(若為全厚度燒傷)
v)感染的存在和感染的類型
vi)受傷后所經過的時間
vii)其他疾病狀態(tài)的存在
viii)患者的年齡、身體狀況和營養(yǎng)狀態(tài)
患者可能正在接受的其他藥物治療將影響施用治療劑的治療有效量的確定。
雖然全身性治療中藥物組合物成分的有效量及劑量根據體重或體表面積確定，而假如活性成分的全身性吸收并不會導致患者接受不利的過高劑量，在以該組合物對傷口和潰瘍的表面施用時，可根據所治療的傷口或潰瘍面積更加恰當?shù)乇硎居行Я亢蛣┝?，例如以平方厘米表示?/p>
GM-CSF或者其功能性變體或同源物對傷口或潰瘍表面施用的有效量可以是1微克(μg)至100μg/平方厘米/天，例如2μg至80μg/平方厘米/天，且尤其是5μg至50μg/平方厘米/天。有效量根據人GM-CSF的全功能同源物(例如莫拉司亭)所給用量表示，且根據所用同源物的功能活性進行調整。
在實踐中，本發(fā)明的藥物組合物包含GM-CSF或者其片段或變體，其濃度為1μg/mL(或μg/g)至10mg/mL(或mg/g)，例如5μg/mL(或μg/g)至500μg/mL(或μg/g)，或例如10μg/mL(或μg/g)至200μg/mL(或μg/g)。
適合的磷霉素鹽對傷口或潰瘍表面施用的有效量可以是10mg至1000μg/平方厘米/天，例如20μg至800μg/平方厘米/天，且尤其是50μg至500μg/平方厘米/天。根據所用制劑中磷霉素游離酸含量表示有效量。
在實踐中，本發(fā)明的藥物組合物包含磷霉素鹽，其基于磷霉素游離酸的濃度為100μg/mL(或μg/g)至30mg/mL(或mg/g)，例如250μg/mL(或μg/g)至10mg/mL(或mg/g)。
表面施用的另外的抗微生物劑的有效量是本領域中已知的，且可添加至本發(fā)明的藥物組合物中，調整其用量以使得當達到GM-CSF和磷霉素的有效量時，也達到所述另外的抗微生物藥的有效量。在實踐中，這意味著例如夫西地酸將以與磷霉素相近的量添加至組合物，而例如妥布霉素將以磷霉素量的1％至10％的量添加。
優(yōu)選地，以每日有效劑量一日施用一次，但也可將其分為一日二次、一日三次、一日四次、一日五次或一日六次的劑量。
只要病變未愈合，給藥持續(xù)時間將通常為1天至約4個月，例如1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天，或1周至2周、2周至3周、3周至4周，或1個月至2個月、2個月至3個月、3個月至4個月。
將巨噬細胞用GM-CSF體外孵育后，從靜息巨噬細胞轉化為完全免疫活性的樹突細胞需約10天。在一個實施方案中，某劑量下給藥持續(xù)時間的長度足以完成所述轉化，因此該持續(xù)時間可以是7天至14天，例如8天至12天，例如8天，或9天，或10天，或11天，或12天。
給藥方案可以在施用以及不施用(暫停治療)本發(fā)明藥物組合物的階段之間交替。在該給藥方案中，暫停治療階段可持續(xù)5天至10天，例如5天，或6天，或7天，或8天，或9天，或例如10天或更久，例如1至4個月。
給藥方案的實例可包括用根據本發(fā)明的藥物組合物治療10天并暫停治療7天的循環(huán)。若將其替換為使用不含抗生素的制劑的替換療法，治療暫?？裳娱L至2周或3周或更久，最長為6周。這是為了阻止個體傷口中耐抗生素生物的產生。
可通過重復給藥方案來加速靜息巨噬細胞向樹突細胞的轉變。因此，為了獲得有效的治療，給藥方案可重復一次、兩次、三次、四次、五次或更多次。
在一個實施方案中，給藥方案重復了如一次、兩次、三次或更多次，例如在有需要之對象的剩余壽命中重復。
在另一實施方案中，患者接受如下給藥方案的治療：以根據本發(fā)明的藥物組合物治療10天，隨后所述治療暫停7-20天，且隨后重復此給藥方案2次至3次或更多次。
制劑
本發(fā)明的藥物組合物可以是散劑(powder)、噴灑粉末噴霧劑(dusting powder spray)、糊劑(paste)、軟膏劑(ointment)、洗劑(lotion)、凝膠劑(gel)、乳膏劑(cream)、油膏劑(salve)、乳劑(emulsion)、混懸劑(suspension)、溶液劑(solution)、噴霧劑(spray)、海綿(sponge)、條帶(strip)、硬膏劑(plaster)、墊(pad)、敷料(dressing)的形式，或配制在造口術板(ostomy plate)中。組合物活性成分可作為微粉化粉末的形式混懸于非水性介質中或溶解于水性介質中。
噴灑粉末為優(yōu)選制劑，因為所述組合物的活性成分彼此相容，并且以干粉形式在室溫下表現(xiàn)出長期穩(wěn)定性。所述制劑可含有粉末添加劑，如硬脂酸淀粉酯、纖維素、乳糖、氧化鋅、二氧化硅、碳酸鎂、滑石粉或黏土。
包含烴類凝膠而不含水性組分的軟膏劑也為優(yōu)選的劑型，因為微粉化形式的磷霉素不會受到在亞堿性pH水平下在水存在下的水解作用降解，且將具有適當長的保質期。軟膏劑可通過添加粉末(例如淀粉、氧化鋅、滑石粉或二氧化鈦)而制成糊劑。
實例2給出軟膏劑的組合物以提供在單次日施用中GM-CSF和磷霉素的有效劑量。
實例3給出軟膏劑的組合物以提供在單次日施用中GM-CSF和磷霉素與克林霉素的有效劑量，以對厭氧菌有強效并且也對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)有效。
實例4給出軟膏劑的組合物以提供在單次日施用中GM-CSF和磷霉素與阿貝卡星和氨曲南的有效劑量，以對銅綠假單胞菌有強效。
也可使用水性介質，例如凝膠劑、乳膏劑、洗劑、溶液劑和混懸劑，但將需要將pH調整為pH 7至pH 10的值，優(yōu)選為至少pH 8，以確保磷霉素組分的合理的穩(wěn)定性以及因此確保適合的制劑保質期。水性介質的pH可通過低濃度的合適生物相容性緩沖成分調節(jié)，非限制性實例為氨丁三醇、碳酸鈉和碳酸氫鈉，以及磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉。也可添加張力調節(jié)劑，例如氯化鈉、氯化鉀或氯化鈣。
根據本發(fā)明的組合物可配制成用于改善活性成分穿過黏膜屏障或表皮時的穿透和效力。改善黏膜屏障穿透可通過能夠黏附于黏膜、表皮或傷口表面的制劑獲得。這是所提出的軟膏劑型的固有特性，但也可添加改善穿透的特殊物質，其非限制性實例為丙二醇、聚乙二醇、二甲基亞砜、1-癸基二甲基亞砜、N-甲基吡咯烷酮、二乙基苯甲酰胺、豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)、棕櫚酸異丙酯和油酸的酯。
根據本發(fā)明的制劑可包含可藥用載體和賦形劑，包括微球、脂質體、膠束、微膠囊、納米顆粒等。例如，GM-CSF組分可配制成具有外側脂肪層和水相核心(GM-CSF組分溶于其中)的脂質體。此類制劑的脂質層克服表皮或黏膜的穿透屏障。
傳統(tǒng)脂質體通常由磷脂(中性或帶負電荷)和/或膽固醇構成。脂質體為基于圍繞水性隔室(compartment)的脂質雙層的囊泡狀結構。其物理化學性質(例如尺寸、脂質組成、表面電荷和數(shù)量以及磷脂雙層流動性)可以不同。用于形成脂質體的最常用的脂質為：1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DLPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸(單鈉鹽)(DMPA)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸(單鈉鹽)(DPPA)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(單鈉鹽)(DOPA)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](鈉鹽)(DMPG)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](鈉鹽)(DPPG)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](鈉鹽)(DOPG)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-[磷酸-l-絲氨酸](鈉鹽)(DMPS)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-[磷酸-l-絲氨酸](鈉鹽)(DPPS)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-[磷酸-l-絲氨酸](鈉鹽)(DOPS)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-(戊二酰)(鈉鹽)和1，1’，2，2’-四豆蔻酰心磷脂(銨鹽)。優(yōu)選由DPPC與其他脂類或脂質體調節(jié)劑組合構成的制劑，例如與膽固醇和/或磷脂酰膽堿組合。
生產脂質體的可用方法為將親水性聚合物聚乙二醇(PEG)與脂質體外表面共價連接。一些優(yōu)選的脂類為：1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](銨鹽)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-5000](銨鹽)、1，2-二油酰-3-三甲基銨-丙烷(氯鹽)(DOTAP)。
適用于脂質體的可能脂類由例如Avanti，Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL，USA提供。此外，脂質體懸液可包含脂質保護劑，其可保護脂質免受儲存中的自由基和脂質過氧化損害。優(yōu)選親脂性自由基淬滅劑，例如α-生育酚和水溶性鐵特異性螯合劑，例如鐵草胺(ferrioxamine)。
數(shù)種方法可用于制備脂質體，如例如以下中所述：Szoka F等(1980)、美國專利No.4,235,871、4,501,728和4,837,028，其均通過引用并入本文。另一種方法生產不均一尺寸的多層囊泡。在該法中，形成囊泡的脂質溶于適當有機溶劑或溶劑系統(tǒng)，并在真空或惰性氣體中干燥，以形成薄脂質膜。如果期望的話，該膜可重新溶解于適當溶劑(例如叔丁醇)中，并隨后凍干以形成更均勻的脂質混合物，所述混合物為更易于水合的粉末樣形式。以目標藥物和目標組分的水溶液覆蓋該膜，并允許水合，此過程通常在攪拌下經過15-60分鐘的時間。可通過在更劇烈攪拌條件下使脂質水合或通過添加增溶去垢劑(如脫氧膽酸鹽/酯(deoxycholate))使所得多層囊泡的尺寸分布向較小尺寸轉變。
為確保該皮膚病制劑組分的充足保質期(尤其是磷霉素，其在生理pH的水性介質中不穩(wěn)定)，并且同時為患者提供在施用部位的刺激性尚可接受的制劑，本發(fā)明的一個實施方案包括提供藥盒(kit)中的作為待在臨用前混合之獨立部分的活性成分。所述藥盒還可包含介質，在對傷口表面施用前，可將組分在該介質中混合。除了所述其他成分之外，所述介質可含有緩沖劑，例如上述那些，以確保當所有成分混合后，該制劑的pH適合于皮膚使用。
適應癥
本發(fā)明提供了藥物組合物，其用于治療身體皮膚、黏膜或結締組織的傷口、潰瘍、瘡、燒傷或其他病變，所述病變可以是急性或慢性。這樣的病變可由廣譜事件引起和/或可與其他疾病相關。待治療病變包括與以下有關的那些：割傷、撕裂、擦傷、水泡、血腫、刺傷、穿透、槍擊、電擊、輻照、化學、創(chuàng)傷、擠壓、咬傷、燒傷、凍傷、手術、原發(fā)癌或轉移、良性腫瘤、痤瘡、感染(例如細菌感染，其可與真菌或病毒或寄生蟲感染組合)、血液循環(huán)減弱相關病變(例如與靜脈或動脈供血不足相關的下肢潰瘍和足潰瘍)、褥瘡性潰瘍、壓瘡或褥瘡，以及與糖尿病相關的病變。
當傷口無法按照適當適時的愈合過程來實現(xiàn)所治療組織的正常持續(xù)且穩(wěn)定的解剖學和功能完整性時出現(xiàn)慢性傷口(目前通常稱為“非愈合性傷口”)、或病變、傷口或潰瘍。大體上說，若皮膚病變在三個月時間內無法取得愈合的實質性進展或已經穩(wěn)定處于部分愈合狀態(tài)長于三個月，則可歸類為慢性或“非愈合性”傷口。該一般定義并不全面適用，因為患者的年齡和健康狀況以及患者所遭受的其他因素(例如疾病或障礙，例如循環(huán)障礙)可顯著延長正常的愈合過程。在這樣的情況下，皮膚病變六個月后不愈合則可歸類為“非愈合性”傷口。
“非愈合性”傷口或慢性皮膚病變若涉及表皮和至少部分真皮的局灶性喪失則為潰瘍性。慢性潰瘍性皮膚病變常伴有除正常愈合過程失敗之外的其他癥狀。典型的伴隨跡象和癥狀包括以下一種或更多種：疼痛、滲出、難聞氣味、表皮脫落(excoriation)、傷口蔓延(wound spreading)、組織壞死、刺激性和角化過度(hyperkeratosis)。此類癥狀可致使患者極度虛弱和尷尬，并可能嚴重損害患者的生活質量。在嚴重的情況下，其可能導致截肢或甚至引起死亡。
惡性或惡化前慢性潰瘍性皮膚病變的出現(xiàn)可與原發(fā)性皮膚癌相關聯(lián)，或與局部腫瘤或遠處腫瘤向皮膚轉移有關。其可以是消耗性或非消耗性。例如，其形態(tài)可以是空腔、皮膚表面開放性區(qū)域、皮膚結節(jié)或從皮膚表面延伸的結節(jié)性生長。
本發(fā)明的藥物組合物可用于治療上述所有非愈合性傷口或慢性潰瘍性皮膚病變，并因此減輕或阻止伴隨此類病變的一種或更多種癥狀。
實施方案
1.藥物組合物，其包含：
a.粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)或者其片段或變體；以及
b.磷霉素，其為其無機或有機鹽的形式。
2.根據實施方案1所述的藥物組合物，其含有一種或更多種另外的抗生素或抗微生物劑。
3.根據實施方案2所述的組合物，其中所述一種或更多種另外的抗生素或抗微生物劑選自：夫西地酸、青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類、萬古霉素、林可霉素、克林霉素、氟喹諾酮類、莫匹羅星、桿菌肽、多黏菌素B、短桿菌肽類、甲硝唑、克霉唑、酮康唑和制霉菌素。
4.根據實施方案2或實施方案3所述的組合物，其中所述一種或更多種另外的抗生素或抗微生物劑選自：青霉素、氨芐西林、羧芐西林、甲氧西林、苯唑西林、氟氯西林、美洛西林、哌拉西林、氨曲南、亞胺培南、頭孢氨芐、頭孢噻吩、頭孢孟多、頭孢西丁、頭孢美唑、頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢磺啶、頭孢他定、頭孢吡肟、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、奈替米星、妥布霉素、阿米卡星、紅霉素、麥迪霉素、萬古霉素、林可霉素、克林霉素、替考拉寧、達托霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、培氟沙星、司帕沙星、頭孢曲松、阿貝卡星或萬古霉素。
5.根據前述實施方案中任一項所述的組合物，其中所述傷口或病變受到葡萄球菌(例如金黃色葡萄球菌)或假單胞菌(例如銅綠假單胞菌)感染。
6.根據前述實施方案中任一項所述的組合物，其中所述組合物不在水溶液中，并且其中所述另外的抗生素或抗微生物劑為以下任一種：氨芐西林、美坦西林、頭孢噻啶、頭孢噻吩、鏈霉素、慶大霉素或卡那霉素。
7.前述實施方案中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含以下一種或更多種：維生素A、抗氧化劑，例如以下一種或更多種：維生素E(以α-生育酚的形式)、泛醌、艾地苯醌、類胡蘿卜素(例如番茄紅素)、抗壞血酸或抗壞血酸鹽/酯或煙酰胺。
8.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其中所述組合物用于治療、減輕病變或加速其愈合：所述病變例如皮膚、黏膜或所述病變下方結締組織中任一者的傷口、潰瘍、瘡或燒傷。
9.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其中所述病變?yōu)槁浴?/p>
10.根據實施方案1至11中任一項所述的藥物組合物，其中所述病變?yōu)榧毙浴?/p>
11.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其中所述病變與細菌、真菌、病毒或寄生蟲的定殖或感染相關。
12.根據前述實施方案中任一項所述的組合物，其中所述病變受到來自以下任一屬細菌的感染：葡萄球菌屬、鏈球菌屬、奈瑟菌屬、埃希氏菌屬、變形桿菌屬、沙雷氏菌屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、假單胞菌屬、嗜血桿菌屬、以及弧菌屬、變形桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬、消化鏈球菌屬(包括嗜胨菌屬、芬格爾德氏菌屬和厭氧球菌屬)和梭桿菌屬。
13.根據前述實施方案中任一項所述的組合物，其中所述活性組分作為待在臨用前混合之獨立部分在藥盒中提供。
14.根據實施方案13所述的藥盒，其中所述藥盒還包含介質，可在對傷口表面施用前將所述組分在所述介質中混合。
15.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其中所述病變與糖尿病相關。
16.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其中所述病變與減弱的血液循環(huán)相關，所述減弱的血液循環(huán)例如靜脈性下肢潰瘍、靜脈性足潰瘍、動脈性下肢潰瘍、動脈性足潰瘍和褥瘡性潰瘍。
17.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其配制成用于作為散劑、糊劑、軟膏劑、洗劑、凝膠劑、乳膏劑、油膏劑、乳劑、混懸劑、溶液劑、噴霧劑、海綿、條帶、硬膏劑、墊、敷料表面施用，或配制在造口術板中。
18.根據前述實施方案中任一項所述的組合物，其中GM-CSF和磷霉素用于表面施用，并且所述另外的抗微生物藥物用于非表面施用。
19.根據實施方案1至14中任一項所述的藥物組合物，其中所述GM-CSF處于脂質體或膠束或微膠囊或納米顆粒制劑中。
20.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其中所述GM-CSF變體與SEQ ID NO：1或2具有至少70％的同一性。
21.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其中所述GM-CSF片段包含SEQ ID NO：1或2中任一個的至少50個連續(xù)氨基酸殘基。
22.根據實施方案21所述的藥物組合物，其中所述片段在重疊范圍內與SEQ ID NO：1或2具有至少70％的同一性。
23.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其包含濃度為1μg/mL至10mg/mL的GM-CSF或者其片段或變體。
24.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其包含濃度為5μg/mL至500μg/mL的GM-CSF或者其片段或變體。
25.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其包含濃度為10μg/mL至200μg/mL的GM-CSF或者其片段或變體。
26.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其包含以磷霉素游離酸計濃度為100μg/mL至10mg/mL的磷霉素鹽。
27.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其包含以磷霉素游離酸計濃度為250μg/mL至1mg/mL的磷霉素鹽。
28.根據實施方案17和18所述的藥物組合物，其中所述磷霉素鹽為磷霉素二鈉或磷霉素鈣或磷霉素氨丁三醇，所述磷霉素氨丁三醇還稱為磷霉素緩血酸胺。
29.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其還包含一種或更多種另外的抗生素或抗微生物劑。
30.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其還包含維生素A和/或抗氧化劑。
31.根據前述實施方案中任一項所述的藥物組合物，其中所述GM-CSF變體包含能夠延長所述GM-CSF之半衰期的綴合物。
32.根據前一實施方案所述的藥物組合物，其中能夠延長所述GM-CSF變體之半衰期的綴合物為白蛋白或脂肪酸。
33.根據前述權利要求中任一項所述的藥物組合物，其還可用于治療方法。
實施例
以下非限制性實施例進一步舉例說明本發(fā)明。
實施例1：序列
SEQ ID NO：1-人GM-CSF前體
＞sp|P04 141|CSF2_人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子
OS＝人
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
SEQ ID NO：2-成熟人GM-CSF
＞sp|P04141|18-144
A|PARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE
實施例2：用于治療皮膚傷口、潰瘍、瘡或燒傷的軟膏劑
該組合物可尤其適用于不表現(xiàn)出嚴重細菌感染臨床體征的由靜脈功能不全導致的下肢潰瘍。
實施例3：用于治療皮膚傷口、潰瘍、瘡或燒傷的軟膏劑，其含有除磷霉素之外的其他抗生素
該組合物可尤其適用于治療其中懷疑或通過厭氧菌培養(yǎng)證實受到厭氧菌感染的傷口和潰瘍。其也可適用于通過培養(yǎng)證實受到對克林霉素敏感的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染的傷口。
實施例4：用于治療皮膚傷口、潰瘍、瘡或燒傷的軟膏劑，其除磷霉素之外還含有另外兩種抗生素
該組合物可尤其適用于治療其中懷疑或通過細菌培養(yǎng)證實受到銅綠假單胞菌感染的傷口和潰瘍。
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