本申請要求2014年2月11日提交的美國專利申請?zhí)?1/938,378的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用全文納入本文。

發(fā)明背景

選定的氨基酸被突變成半胱氨酸Cys的單克隆抗體(例如工程化的半胱氨酸mAbs，即ecmAbs)特別適合用于偶聯(lián)物(例如抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs))，因?yàn)檫@些由其衍生的偶聯(lián)物具有有利的特性，其中包括同質(zhì)性、有利的藥物動力學(xué)、穩(wěn)定性和溶解性。這些半胱氨酸突變被置于在抗體氨基酸序列中的某些位置，這些位置通常不會形成鏈間或者鏈內(nèi)的二硫鍵，并且在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生突變mAb的表達(dá)機(jī)制會將半胱氨酸殘基作為未配對的半胱氨酸進(jìn)行處理。因此，工程化半胱氨酸，通常會用非編碼的半胱氨酸分子以混合的二硫鍵產(chǎn)物形式表達(dá)(例如，工程化半胱氨酸通常用封端劑(例如半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸、谷胱甘肽)進(jìn)行“封端(capped)”)。

因此，為了從ecmAbs出發(fā)制備偶聯(lián)物(例如ADC)，通常需要將ecmAb置于還原條件下，從而將工程化半胱氨酸從混合的二硫鍵產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為自由巰基，通常這一“脫封端”或者“活化”伴隨著ecmAb鏈間二硫鍵的還原。盡管鏈間二硫鍵可以通過溫和氧化重新形成，但是這種再氧化步驟增加了ADC制備過程中復(fù)雜性和費(fèi)用。選擇性還原方法是難以實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)橐炎C明難以還原工程化半胱氨酸殘基的同時而不還原鏈間二硫鍵。因此，需要開發(fā)用于對工程化半胱氨酸殘基的進(jìn)行脫封端的選擇性還原方法。本發(fā)明解決了這個和其它需求。

發(fā)明概述

在本發(fā)明中，提供了一種選擇性還原工程化的半胱氨酸抗體的方法。這種方法包括：將一還原劑與工程化的半胱氨酸抗體分子接觸，每個抗體分子含有至少一個封端的工程化的半胱氨酸殘基和至少一個鏈間二硫鍵，以及將還原劑與抗體分子在足以使工程化的半胱氨酸殘基“脫封端”并且形成封端副產(chǎn)物的條件下進(jìn)行反應(yīng)。封端副產(chǎn)物在還原反應(yīng)的過程中被移去。這種方法導(dǎo)致形成脫封端的工程化半胱氨酸抗體制劑。這種脫封端的工程化半胱氨酸抗體制劑可以包含封端的和脫封端的工程化半胱氨酸抗體。還原反應(yīng)前存在于抗體分子中基本上所有的鏈間二硫鍵，在脫封端的工程化半胱氨酸抗體制劑中仍然保留。所述方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：在移除封端副產(chǎn)物時，向還原反應(yīng)補(bǔ)充額外的還原劑。在還原反應(yīng)過程中從反應(yīng)混合物中移除封端副產(chǎn)物，可以通過例如透析或滲濾進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在還原反應(yīng)混合物中，封端副產(chǎn)物濃度被維持低于如下濃度：在該濃度下，再封端阻止了工程化半胱氨酸殘基被進(jìn)一步活化。

在某些方面，所述方法提供一種非封端的工程化半胱氨酸抗體制劑。典型地，在抗體制劑中至少60％的工程化的半胱氨酸是非封端工程化的半胱氨酸殘基。在某些方面，在抗體制劑中至少70％，至少75％或者至少80％的工程化的半胱氨酸殘基是非封端工程化的半胱氨酸殘基。在某些方面，采用本發(fā)明方法，在抗體分子中至少85％的還原反應(yīng)前就存在的鏈間二硫鍵在脫封端工程化的半胱氨酸抗體制劑中仍然保留。在某些方面，選擇還原劑和還原條件，使得不超過20％，不超過15％，不超過10％或者不超過5％的抗體分子中存在的鏈間二硫鍵，在還原反應(yīng)過程中被轉(zhuǎn)化成一對自由巰基。

在相關(guān)方面，這個發(fā)明提供抗體偶聯(lián)物，包括抗體藥物偶聯(lián)物，和采用脫封端抗體制備抗體偶聯(lián)物的方法。在制備抗體藥物偶聯(lián)物之前，抗體制劑中殘留的還原劑被移除。

本發(fā)明還提供一種選擇性還原含有非配對半胱氨酸殘基的非抗體蛋白質(zhì)的方法。這種方法包括：將一還原劑與蛋白質(zhì)分子接觸，每個蛋白質(zhì)分子含有至少一個封端的工程化的半胱氨酸殘基和至少一個鏈間二硫鍵，以及將還原劑與蛋白質(zhì)分子在足以使半胱氨酸殘基“脫封端”并形成封端副產(chǎn)物的條件下進(jìn)行反應(yīng)。封端副產(chǎn)物在還原反應(yīng)的過程中被移去。所述方法導(dǎo)致形成脫封端的半胱氨酸蛋白質(zhì)制劑。這種脫封端的半胱氨酸蛋白質(zhì)制劑可以包含封端和脫封端的半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)分子中在還原反應(yīng)前就存在的基本上所有的鏈間二硫鍵，在脫封端的半胱氨酸蛋白質(zhì)制劑中仍然保留。這種方法可以進(jìn)一步包括以下步驟：在移除封端副產(chǎn)物時，向還原反應(yīng)補(bǔ)充額外的還原劑。在還原反應(yīng)過程中從反應(yīng)混合物中移除封端副產(chǎn)物可以通過例如透析或滲濾進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在還原反應(yīng)混合物中，封端副產(chǎn)物濃度被維持低于如下濃度：在該濃度下，再封端阻止了工程化半胱氨酸殘基被進(jìn)一步活化。所述方法提供一種非封端的半胱氨酸蛋白質(zhì)制劑。典型地，采用所述方法，至少60％的半胱氨酸是脫封端(或者，換言之，是活化的)。在某些方面，采用所述方法，至少70％，至少75％或者至少80％的封端的半胱氨酸殘基是被脫封端的。在某些方面，采用本發(fā)明方法，蛋白質(zhì)分子中至少85％的還原反應(yīng)前就存在的鏈間二硫鍵，在脫封端工程化的半胱氨酸抗體制劑中仍然保留。在某些方面，選擇還原劑和還原條件，使得不超過20％，不超過15％，不超過10％或者不超過5％的蛋白質(zhì)分子中存在的鏈間二硫鍵，在還原反應(yīng)過程中被轉(zhuǎn)化成一對自由巰基。

附圖說明

圖1顯示了用三種不同的單巰基還原劑(半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和半胱胺)，在相同的條件下(低濃度2mM)處理一種ecmAb(溶液濃度99μM)，對所得的樣品進(jìn)行rPLRP柱分析的結(jié)果。Y軸代表可用的總工程化的半胱氨酸的活化百分比。沒有一種還原劑能夠達(dá)到對可用的工程化的半胱氨酸殘基的100％激活。沒有證據(jù)表明，在這些實(shí)驗(yàn)中，鏈間二硫鍵被還原。

圖2顯示了一種S239C ecmAb mcMMAF ADC的重鏈的rPLRP柱分析結(jié)果。S239C ecmAb用本發(fā)明中的方法選擇性地還原，并且偶聯(lián)到mcMMAF藥物接頭。還原劑是0.8mM半胱氨酸。工程化的半胱氨酸殘基的活化基本上進(jìn)行到完成。標(biāo)注為％H0的柱表示沒有與藥物接頭偶聯(lián)的重鏈。標(biāo)注為％H1的柱表示偶聯(lián)有1個藥物接頭的重鏈；而標(biāo)注為％H2的柱表示偶聯(lián)有2個藥物-接頭的重鏈。

圖3顯示了S239C ecmAb mcMMAF ADC重鏈的rPLRP柱分析結(jié)果。S239C ecmAb用本發(fā)明中的方法選擇性地還原，并且偶聯(lián)到mcMMAF藥物-接頭上。還原劑是0.55mM半胱氨酸。只有小百分比的工程化的半胱氨酸殘基保持封端(％H0)，而未封端工程化的半胱氨酸殘基的百分比接近100％(％H1)，而且非特異性還原(％H2)的量保持在低位。

圖4顯示了通過S239C ecmAbs選擇性實(shí)現(xiàn)了工程化的半胱氨酸的活化，該活化與重鏈和輕鏈可變區(qū)的種類無關(guān)。mAb 1是人源化2H12ecMAb，mAb2是人源化的h1F6ecMab(活化:％H0；選擇性:％H2)。對于兩種mAbs而言，脫封端速率是類似的。工程化半胱氨酸殘基的選擇性活化，在mAb1的三個變異位點(diǎn)S239,K326和A327上得到證明。這些結(jié)果表明，工程化半胱氨酸的活化可以在不同位點(diǎn)選擇性地實(shí)現(xiàn)。這些實(shí)驗(yàn)中采用約0.9mM的半胱氨酸。

圖5顯示了mAb1的S239C突變體的工程化的半胱氨酸的活化。反應(yīng)混合物中mAb的濃度與圖4反應(yīng)中類似，但是半胱氨酸的濃度更低一些，在整個時間進(jìn)程中大約為0.5mM。這個實(shí)驗(yàn)顯示，采取低濃度的半胱氨酸可獲得最大選擇性，并且在給予足夠時間的情況下，可以以非常高的選擇性實(shí)現(xiàn)完全活化。這次實(shí)驗(yàn)最終時間點(diǎn)所制備得到的偶聯(lián)物的平均載藥量是1.93，這與標(biāo)稱值2.0很接近，并且落在通過傳統(tǒng)非選擇性還原然后再氧化所得的數(shù)值范圍內(nèi)。

發(fā)明詳細(xì)描述

Ⅰ.綜述

在本發(fā)明中，提供了一種選擇性移除抗體(包括單克隆抗體)中工程化的半胱氨酸上硫化物封端的方法。盡管在將抗體長時間暴露于低濃度小分子硫醇中后觀察到某些選擇性移除，但是在靜態(tài)反應(yīng)混合物中不會發(fā)生完全的脫封端。有利地，用本發(fā)明的方法，其中當(dāng)還原副產(chǎn)物被移除時維持還原劑濃度，能夠?qū)崿F(xiàn)工程化的半胱氨酸的近乎完全活化。在不需要活化基本上所有工程化半胱氨酸的實(shí)施例中，本方法可以用于控制活化水平。令人意外的是，獲得的脫封端的抗體具有完整的鏈間二硫鍵，從而維持了抗體結(jié)構(gòu)，并消除了在將抗體與藥物或者其它功能劑進(jìn)行偶聯(lián)前的再氧化步驟。通過本發(fā)明方法，對制備抗體偶聯(lián)物(包括抗體藥物偶聯(lián)物)的目前生產(chǎn)操作進(jìn)行了大幅簡化。

Ⅱ.定義

如本文所用，術(shù)語“抗體”泛指完整的單克隆抗體、多克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，和那些表現(xiàn)出所需生物活性(例如特異性結(jié)合到目標(biāo)抗原)和那些至少具有一個天然鏈間二硫鍵的抗體片段。典型的片段包括，例如，F(xiàn)abs，迷你抗體(minibodies)及其類似物。一個完整的抗體通常由4個多肽鏈組成(兩個重鏈和兩個輕鏈)，每個多肽主要有2個區(qū)域：可變區(qū)和恒定區(qū)。可變區(qū)特異性地結(jié)合于目標(biāo)抗原并與目標(biāo)抗原反應(yīng)?？勺儏^(qū)包括互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，所述互補(bǔ)決定區(qū)識別和結(jié)合到某一特定抗原的特異性結(jié)合位點(diǎn)。恒定區(qū)可以被免疫系統(tǒng)識別和發(fā)生相互作用(見例如，Janeway et al.,2001,Immuno.Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。這4個多肽通過鏈間二硫鍵相互共價連接?？贵w可以是任何型(例如IgG，IgE，IgM,IgD和IgA)，類別(例如IgG1，IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)或亞類?？贵w可以來自任何合適的物種。在某些實(shí)施方式中，抗體是人或者鼠來源的。單克隆抗體可以是例如，人的，人源化的，或者嵌合的。根據(jù)上下文，術(shù)語“抗體”可以指一個單一的抗體分子，或者抗體分子的集合，例如在抗體溶液中。

如本文所用，術(shù)語“鏈間二硫鍵”指一個抗體相鄰多肽鏈上的兩個半胱氨酸殘基之間的共價鍵。二硫鍵具有結(jié)構(gòu)式R¹-S-S-R²，其中S原子位于半胱氨酸的側(cè)鏈，R¹和R²代表半胱氨酸殘基的其余部分以及所在的多肽鏈。鏈間二硫鍵通常位于一個抗體分子的重鏈和輕鏈之間，或者兩條重鏈之間。

如本文所用，術(shù)語“工程化的半胱氨酸殘基”指被引入到蛋白質(zhì)(例如抗體)多肽序列中的半胱氨酸殘基。含有半胱氨酸殘基的單克隆抗體，可以稱為“ecmAb”。工程化的半胱氨酸殘基通常在蛋白質(zhì)的天然(自然存在的)肽序列中是不存在的。工程化的半胱氨酸殘基可以取代多肽序列某一給定位點(diǎn)的自然存在的氨基酸，并通過重組技術(shù)例如定點(diǎn)誘變被引入到多肽序列上。工程化的半胱氨酸殘基可以是封端或者非封端的。

如本文所用，術(shù)語“非封端(或脫封端)半胱氨酸殘基”指一半胱氨酸殘基，其α側(cè)鏈含有一個自由的巰基，其具有結(jié)構(gòu)R¹-SH。R¹代表半胱氨酸殘基的非巰基部分。非封端半胱氨酸殘基可以是非封端的工程化的半胱氨酸殘基。

如本文所用，術(shù)語“封端的半胱氨酸殘基”指一個半胱氨酸殘基，其α側(cè)鏈含有一個二硫鍵化部分，其具有結(jié)構(gòu)式R¹-S-S-R³。R¹代表半胱氨酸殘基的非巰基部分，并且R³代表分子量小于或等于500Da的封端劑的非巰基部分。封端劑可以是，例如，半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸、或者谷胱甘肽(R³分別代表自由半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸的非巰基部分，或者谷胱甘肽的非巰基部分)或者其它可用的單硫醇。封端半胱氨酸殘基可以是封端的工程化的半胱氨酸殘基。

如本文所用，術(shù)語“還原反應(yīng)”指這樣的反應(yīng)，其中具有結(jié)構(gòu)式R¹-S-S-R³的封端半胱氨酸殘基(例如封端的工程化的半胱氨酸殘基)被還原，并且形成具有結(jié)構(gòu)R¹-SH的硫醇部分。R¹和R³如上定義。

如本文所用，術(shù)語“還原劑”指能夠還原二硫鍵的化合物。還原劑包括但不限于：硫醇例如半胱氨酸、半胱胺、和β-硫基乙醇。

如本文所用，術(shù)語“氧化劑”指能夠?qū)⒁粚ψ杂蓭€基轉(zhuǎn)化為二硫鍵的化合物。氧化劑的例子包括但不限于：5,5′-二硫代(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、脫氫抗壞血酸(DHAA)和硫酸銅(CuSO₄)?！霸傺趸襟E”是使得一對自由巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵的確定性步驟。該確定性步驟包括：引入外源氧化劑和/或有意的保持一段時間,以便發(fā)生自氧化。

如本文所用，從包含抗體和某一物質(zhì)的混合物中術(shù)語“移除”該物質(zhì)(例如封端副產(chǎn)物)，是指從混合物中移除該物質(zhì)的任一部分，包括該物質(zhì)的全部。移除這種物質(zhì)還可以包括：將所述抗體從包含該物質(zhì)的第一混合物中轉(zhuǎn)移到不包含該物質(zhì)的第二混合物中。從混合物中移除某一物質(zhì)，可包括步驟例如透析、滲濾、色譜法等。

如本文所用，術(shù)語“抗體藥物偶聯(lián)物”和“ADC”指可任選地通過接頭而偶聯(lián)有治療劑(例如藥物)的抗體。

如本文所用，術(shù)語“藥物-接頭化合物”，或“藥物-接頭”指具有藥物部分和連接在其上的接頭的分子，其中所述接頭含有適合于連接到抗體中的氨基酸殘基(例如半胱氨酸殘基)的反應(yīng)性基團(tuán)。

Ⅲ.具體實(shí)施方式描述

在本發(fā)明中，提供了一種選擇性還原工程化的半胱氨酸抗體從而形成非封端抗體制劑的方法。這種方法包括：將還原試劑與工程化的半胱氨酸抗體分子接觸，其中每個抗體分子具有至少一個封端的工程化的半胱氨酸殘基和至少一個鏈間二硫鍵，以及將還原劑與抗體分子在足以使工程化的半胱氨酸殘基脫封端并形成封端副產(chǎn)物的條件下進(jìn)行反應(yīng)。在還原反應(yīng)過程中，封端副產(chǎn)物被移除，從而阻止新形成的硫醇被再次發(fā)生封端。隨著封端副產(chǎn)物一起被移除的還原劑，被替換以驅(qū)動還原反應(yīng)向前進(jìn)行。選擇還原劑和還原條件，使得工程化的半胱氨酸殘基被選擇性地還原(即，選擇性地活化)。因此，不需要為了重新形成鏈間二硫鍵而在還原步驟之后采取單獨(dú)的再氧化步驟。具有工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子中的基本上所有鏈間二硫鍵，在脫封端的抗體中都被保留。使用術(shù)語“保留”，并不表示鏈間二硫鍵在還原反應(yīng)中保持不變。鍵在還原反應(yīng)過程中可以被破壞，但是在轉(zhuǎn)化為一對自由巰基之前重新形成鍵。鍵的重新形成不依賴于單獨(dú)的再氧化步驟，而是在還原反應(yīng)過程中發(fā)生，如圖2所示。

流程1顯示了采用本發(fā)明的方法，對半胱氨酸殘基進(jìn)行脫封端的示意圖，其中用單克隆抗體作為示范的蛋白質(zhì)。如反應(yīng)(i)所示，還原劑(1)與具有封端工程化的半胱氨酸殘基(2)的抗體反應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生具有脫封端的半胱氨酸殘基的抗體(3)和封端副產(chǎn)物(4)。反應(yīng)(i)能夠向兩個方向進(jìn)行，并且脫封端的工程化氨基酸殘基與封端副產(chǎn)物之間反應(yīng)，能夠?qū)е鹿こ袒陌腚装彼釟埢辉俅畏舛?。逆反?yīng)的結(jié)果是形成一組合物，在該組合物中只有一部分抗體具有脫封端的工程化的半胱氨酸殘基。根據(jù)本發(fā)明方法，向反應(yīng)混合物中補(bǔ)充額外的還原劑，如在反應(yīng)(ii)所示，并且將反應(yīng)副產(chǎn)物從反應(yīng)混合物中移除。補(bǔ)充還原劑和移除反應(yīng)副產(chǎn)物能夠驅(qū)動正反應(yīng)和防止逆反應(yīng)，從而促使形成所需的具有脫封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體(3)。

流程1

在正常(即“靜態(tài)溶液”)條件下，在再封端反應(yīng)限制了工程化的半胱氨酸被活化的程度。圖1中的圖顯示了在相同條件下用三種不同的單硫醇處理ecmAb的結(jié)果。Y軸代表總的可用的工程化的半胱氨酸活化的百分比。這張圖顯示：每種還原劑都不能活化近乎100％的可用的工程化的半胱氨酸，而這種限制是因?yàn)槎蜴I副產(chǎn)物(流程1中的4)會將生成的硫醇再封端，如上所述。

還原劑

任何合適的還原劑都可以用于本發(fā)明的方法。還原劑的例子包括但不限于：單硫醇還原劑例如半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、半胱胺、β-巰基乙醇、2-巰基乙磺酸鈉鹽等。溫和的還原劑例如半胱氨酸等特別適合于移除封端半胱氨酸殘基(例如封端的工程化的半胱氨酸殘基)的封端，并不破壞鏈間二硫鍵。強(qiáng)還原劑，例如二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)和雙(2-巰基乙基)砜，在大多數(shù)情況下，能夠過快還原鏈間二硫鍵。具體地，對于還原劑例如TCEP和DTT是不可能選擇性地使封端半胱氨酸的發(fā)生脫封端，對于所述還原劑而言流程2中混合二硫鍵化物的中間產(chǎn)物6或者不形成，或者僅僅暫時形成。在一些實(shí)施方式中，還原劑選自半胱氨酸、半胱胺、β-巰基乙醇、2-巰基乙磺酸鈉鹽及其混合物。

反應(yīng)條件

盡管多種單硫醇可以用于選擇性活化，圖1中的圖表顯示，不同的硫醇以不同的速率活化工程化的半胱氨酸，并達(dá)到不同的最大化程度。因此，確定工程化的半胱氨酸殘基活化的合適條件，包括確定合適的還原劑和確定合適的還原劑濃度。

反應(yīng)條件的確定，部分地是根據(jù)工程化的半胱氨酸的位置，封端劑的種類，或者特定抗體上的殘基。例如，溶劑暴露的工程化的半胱氨酸殘基，較之被掩埋或者部分掩埋的工程化的半胱氨酸殘基，更容易被脫封端。

有利于選擇性還原蛋白中非配對半胱氨酸殘基的條件，可以基于流程2中的反應(yīng)來理解。如果還原劑與工程化的半胱氨酸殘基反應(yīng)(如在反應(yīng)(a)所示)比其與鏈間二硫鍵(如在反應(yīng)(b)所示)的反應(yīng)快得多，那么選擇性活化是相對簡單的。這種情形僅僅只發(fā)生在，如果有的話，半胱氨酸高度暴露于抗體表面的溶劑。然而，經(jīng)常地，在抗體偶聯(lián)物例如ADCs中使用的ecmAbs中的工程化的半胱氨酸而言，低暴露的位點(diǎn)是優(yōu)選的。還原劑可以與這些低暴露的工程化的半胱氨酸殘基以及與二硫鍵以可比較的速率進(jìn)行反應(yīng)。因此，當(dāng)反應(yīng)(a)和反應(yīng)(b)以可比較的速率發(fā)生時，常常需要找到選擇性的活化條件。

在反應(yīng)(a)和反應(yīng)(b)以可比的速率發(fā)生—或者反應(yīng)(b)比反應(yīng)(a)更快的情形下，選擇性活化工程化的半胱氨酸殘基就要求確保當(dāng)鏈間二硫鍵被還原劑攻擊的時候，重新形成二硫鍵的反應(yīng)(c)要快于第二還原步驟(d)，該步驟(d)會導(dǎo)致不希望的鏈間二硫鍵的斷裂。通常，不可能影響反應(yīng)(c)的速率，因?yàn)樗菃畏肿臃磻?yīng)。硫醇和混合二硫鍵產(chǎn)物(如6所示)是同一抗體的部分。但是反應(yīng)(d)的速率取決于還原劑的濃度，因此可以通過使用一個足夠低濃度的還原劑使得反應(yīng)(d)比反應(yīng)(c)慢。當(dāng)然，反應(yīng)(a)和反應(yīng)(b)也取決于還原劑的濃度，所以在這種條件下，所述活化也很慢。因此，通過在一段長的時間內(nèi)維持非常溫和的還原條件(低還原劑濃度和相對溫和的還原劑)，通常有利于選擇性活化工程化的半胱氨酸。

流程2

還原反應(yīng)混合物可以包括任何合適量的蛋白質(zhì)。典型地，在還原反應(yīng)混合物中蛋白質(zhì)濃度(不管是抗體還是非抗體蛋白質(zhì))的濃度范圍為：大約0.01mg/mL到大約150mg/mL，更典型地，從大約1mg/ml到大約50mg/ml。所述還原反應(yīng)混合物可以包含，例如：大約0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、12.5、15、17.5、20、22.5、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140或大約150mg蛋白質(zhì)(不管是抗體還是非抗體蛋白質(zhì))/每mL還原反應(yīng)混合物。蛋白質(zhì)濃度(不管是抗體還是非抗體蛋白質(zhì))可以更高或更低，這取決于采用的特定反應(yīng)條件。一個本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)①|(zhì)量濃度(例如mg/mL)換算為摩爾濃度(例如摩爾/L)。

任何合適量的還原劑可以應(yīng)用于本發(fā)明的方法。通常，還原反應(yīng)混合物中還原劑濃度足夠高以至于還原反應(yīng)能夠發(fā)生，但是足夠低以至于鏈間二硫鍵的還原緩慢到幾乎可以忽略。典型地，采用一起始量的還原劑在起始濃度下，從而形成還原反應(yīng)混合物。通過在還原反應(yīng)持續(xù)過程中連續(xù)或分批向還原反應(yīng)混合物補(bǔ)充額外的還原劑，基本上維持這種起始濃度。在某一實(shí)施方式中，在整個還原反應(yīng)過程中，以連續(xù)方式向還原反應(yīng)混合物中補(bǔ)充額外的還原劑。優(yōu)化還原劑濃度可以采用這里描述的教導(dǎo)通過實(shí)驗(yàn)加以確定，并且對不同的硫醇可以是不同的，因?yàn)樗鼈兊倪€原能力不同。已確定，在實(shí)施例所描述的條件下，半胱氨酸的最優(yōu)濃度為大約0.5mM到大約1.5mM。依據(jù)還原劑的還原能力和ecmAb的濃度，這一濃度可以提高或降低。在某些實(shí)施例中，還原劑的濃度被維持在高于總抗體的濃度。最優(yōu)的還原劑相對于總抗體的濃度比，也取決于還原劑的還原能力。在某些方面，還原反應(yīng)混合物中還原劑的濃度，比還原反應(yīng)混合物中總抗體濃度高大約5倍到大約25倍，5倍到大約20倍，5倍到大約15倍，5倍到大約10倍。例如，在某些實(shí)施方式中，還原反應(yīng)混合物中還原劑與總抗體的濃度比為大約5∶1、6∶1、7∶1、8:1、9∶1、10∶1、11∶1、12∶1、13∶1、14∶1、15∶1、16∶1、17∶1、18∶1、19∶1，或20∶1。在某些實(shí)施方式中，包括某些實(shí)施方式中，當(dāng)還原劑是半胱氨酸的時候，還原反應(yīng)混合物中還原劑與總抗體濃度比為從5∶1到大約12∶1，從7∶1到大約12∶1,優(yōu)選地大約8∶1。在一些方面，工程化的半胱氨酸殘基位于重鏈的239位(命名根據(jù)歐洲索引)。其它濃度比也可應(yīng)用于本發(fā)明的方法，這取決于多種因素，例如采用的特定的還原劑，或者工程化的半胱氨酸在抗體上的位置。

進(jìn)行半胱氨酸殘基(工程化的或者天然的半胱氨酸殘基)脫封端的還原反應(yīng)，從而減少鏈間二硫鍵的還原和后續(xù)自由巰基的產(chǎn)生。采用本發(fā)明方法形成的脫封端蛋白質(zhì)制劑中，在具有封端半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)上存在的基本上所有鏈間二硫鍵都被保留。通常，至少約80％鏈間二硫鍵被保留在脫封端蛋白質(zhì)制劑中。在某些實(shí)施方式中，至少大約85％鏈間二硫鍵被保留在脫封端蛋白質(zhì)制劑中。在某些實(shí)施方式中，至少大約90或者大約95％鏈間二硫鍵被保留在脫封端蛋白質(zhì)制劑中。在某些實(shí)施方式中，所有鏈間二硫鍵被保留在脫封端蛋白質(zhì)制劑中?；蛘撸瑩Q言之，在代表性的實(shí)施方式中，不超過大約20％，不超過大約15％，不超過大約10％，或者不超過大約5％的鏈間二硫鍵在還原反應(yīng)中被轉(zhuǎn)化為一對自由巰基。當(dāng)它應(yīng)用于抗體時，存在于具有封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子(例如還原反應(yīng)前的抗體分子)上的基本上所有鏈間二硫鍵，都被保留在用本發(fā)明方法形成的脫封端抗體制劑中。通常，脫封端抗體制劑中，至少約80％的鏈間二硫鍵被保留。在某些實(shí)施方式中，脫封端抗體制劑中，至少約85％的鏈間二硫鍵被保留。在某些實(shí)施方式中，脫封端抗體制劑中，至少約90％或者大約95％的鏈間二硫鍵被保留。在某些實(shí)施方式中，脫封端抗體制劑中，全部的鏈間二硫鍵被保留。或者，換言之，在代表性實(shí)施方式中，不超過大約20％，不超過大約15％，不超過大約10％，或者不超過大約5％的鏈間二硫鍵，在還原反應(yīng)中被轉(zhuǎn)化為一對自由巰基。

在還原反應(yīng)混合物中還原劑濃度被維持時，還原副產(chǎn)物從還原反應(yīng)混合物中被移除。還原劑的添加和副產(chǎn)物的移除可以連續(xù)或分步的方式進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，還原劑的添加和副產(chǎn)物的移除以連續(xù)的方式進(jìn)行。還原劑的添加和副產(chǎn)物的移除可以采用技術(shù)包括但不限于：切向流過濾(例如滲濾)、尺寸排阻色譜法、固相固定法和透析。在滲濾過程中，還原劑水溶液通常是以給定的速率添加到還原反應(yīng)混合物中，而一部分混合物以同樣的速率被移除。半透膜可以用于將蛋白質(zhì)(例如抗體)保留在還原反應(yīng)混合物中?；蛘?，所述蛋白質(zhì)(例如抗體)可以被固定在固相載體上(例如蛋白質(zhì)A的瓊脂糖珠)，而水相還原劑溶液可以流經(jīng)固定化的蛋白質(zhì)(例如抗體)。也可以使用能夠和封端副產(chǎn)物反應(yīng)的活性樹脂。例如，封端副產(chǎn)物可以用具有反應(yīng)性基團(tuán)(例如孔內(nèi)具有二硫鍵產(chǎn)物)的樹脂進(jìn)行捕獲，其中這些孔足夠小從而將蛋白質(zhì)(例如抗體)排除在外。

相應(yīng)地，本發(fā)明一些實(shí)施方式中提供了如上所述的方法，其中，從還原反應(yīng)混合物中移除封端副產(chǎn)物包括：在還原反應(yīng)過程中，透析或者滲濾所述的還原反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方式中，從還原反應(yīng)混合物中移除封端副產(chǎn)物包括：在還原反應(yīng)過程中，滲濾所述的還原反應(yīng)混合物。

通常，實(shí)施本發(fā)明方法為了最大化進(jìn)行半胱氨酸殘基的脫封端。然而，任一種蛋白質(zhì)分子可具有封端的半胱氨酸殘基以及非封端的殘基。通常，脫封端抗體制劑將包含兩種或兩種以下物質(zhì)：一種具有至少二個脫封端工程化的半胱氨酸殘基且沒有封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子；一種具有至少二個封端工程化的半胱氨酸殘基且沒有脫封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子；和一種具有至少一個封端工程化的半胱氨酸殘基和至少一個脫封端工程化的半胱氨酸殘基的抗體分子。有利的是，本發(fā)明方法提供高水平的選擇性脫封端工程化的半胱氨酸殘基。例如，執(zhí)行所述方法以至于至少40％的工程化的半胱氨酸殘基被脫封端。在某些方面，執(zhí)行所述方法以至于至少40％，至少大約45％，至少大約50％，至少大約55％，至少大約60％，至少大約65％，至少大約70％，至少大約75％，至少大約80％，至少大約85％，至少大約90％的工程化的半胱氨酸殘基被脫封端。在某些實(shí)施方式中，至少60％的工程化的半胱氨酸殘基被脫封端。高或者低水平的脫封端都可能發(fā)生，這部分取決于特定抗體以及工程化的半胱氨酸殘基在抗體上的位置。盡管，本發(fā)明的方法通常被執(zhí)行，從而使得半胱氨酸殘基的脫封端最大化，但是在有些情況下，使半胱氨酸殘基脫封端最大化并不需要，例如，當(dāng)一個抗體具有二個半胱氨酸殘基，并只需要將一個半胱氨酸殘基與功能性試劑偶聯(lián)的時候。在某些這樣的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法可以用于嚴(yán)格控制工程化的半胱氨酸的活化程度。本發(fā)明方法的有利的方面是，中等程度的脫封端很容易實(shí)現(xiàn)，只要將活化停止在所需要的水平并進(jìn)行偶聯(lián)即可。當(dāng)采用全還原后再氧化的方法時，難以獲得這種中等水平的偶聯(lián)物。

反應(yīng)混合物可以包含額外的反應(yīng)試劑或化合物。作為非限制性例子，反應(yīng)混合物可以包含緩沖劑(例如2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)，2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)，3-嗎啉丙磺酸(MOPS)，三羥甲基氨基甲烷(TRIS)，磷酸鉀，磷酸鈉，磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鈉，乙酸鈉，和硼酸鈉)，共溶劑(例如二甲亞砜、二甲基甲酰胺、乙醇、甲醇、異丙醇、丙三醇、四氫呋喃、丙酮、乙腈和乙酸)，鹽(例如NaCl，KCl，CaCl₂，Mn²⁺和Mg²⁺的鹽)，變性劑(例如尿素和鹽酸胍)，清潔劑(例如十二烷基磺酸鈉，和Triton-X100)，和螯合劑(例如乙二醇雙(2-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、2-({2-[雙(羧甲基)氨基]乙基}(羧甲基)氨基)乙酸(EDTA)，以及1,2-雙(鄰氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA))。緩沖溶液、共溶劑、鹽、變性劑、清潔劑和螯合劑可以采用任何合適的濃度，這些對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是很容易確定的。通常，如果存在緩沖劑、共溶劑、鹽、變性劑、清潔劑和螯合劑，其被包含在在反應(yīng)混合物中的濃度范圍為大約1μM到大約1M。例如，緩沖劑、共溶劑、鹽、變性劑、清潔劑和螯合劑可以被包含在反應(yīng)混合物中，其濃度為大約1μM，或大約10μM，或大約100μM，或大約1mM，或大約10mM，或大約25mM，或大約50mM，或大約100mM，或大約250mM，或大約500mM，或大約1M。具體地，共溶劑可以被包含在反應(yīng)混合物中，其含量范圍為，例如大約1％v/v到大約75％v/v，或更高。共溶劑可以被包含在反應(yīng)混合物中，例如含量為大約5，10，20，30，40或50％v/v。

在足以形成脫封端半胱氨酸殘基的條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)可以在任何合適溫度下進(jìn)行。通常，反應(yīng)在大約4℃到大約40℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)可以在例如，大約25℃到大約37℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)可以在任何pH條件下進(jìn)行。通常，反應(yīng)在大約6.5到大約10的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。在某些情況下，pH范圍為大約7.0到大約8.5。反應(yīng)可以在任何合適的時長下進(jìn)行。時長的選擇取決于還原劑的能力。因?yàn)闇睾偷倪€原條件(低濃度還原劑和相對溫和的還原劑)被應(yīng)用于本發(fā)明方法，因此還原反應(yīng)將會延長到大于典型的還原鏈間二硫鍵(所需)預(yù)期時間。在一些優(yōu)選的方面，還原反應(yīng)將會繼續(xù)直到至少大約60％，至少大約70％或至少大約80％或至少大約85％封端的工程化的半胱氨酸殘基被脫封端。在某些方面，還原反應(yīng)在合適的條件下溫育至少1h，至少2h，至少3h，至少4h，至少5h，或者至少6h。反應(yīng)可以在惰性氣體氛圍下進(jìn)行，例如氮?dú)夥諊蛘邭鍤夥諊?。其它的反?yīng)條件可應(yīng)用于本發(fā)明，這取決于某一特定抗體的種類，或者還原劑。

在某些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物的pH范圍從大約6.5到大約8.5。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括：維持反應(yīng)混合物的溫度在大約4℃到大約37℃的范圍。在某些實(shí)施方式中，反應(yīng)混合物在期望的溫度下維持一段時間，從大約1h到大約8h。

一些已知的純化技術(shù)可以應(yīng)用于本發(fā)明方法中的不同節(jié)點(diǎn)。這些技術(shù)可以根據(jù)需要，被用于移除過量的還原劑，將緩沖溶液或者其它組分更換入或者更換出所述的反應(yīng)混合物，以及濃縮或者稀釋抗體組分。用于本發(fā)明方法的純化技術(shù)包括但不限于：切向流過濾(TFF)，凝膠過濾，免疫沉淀，親和色譜法等。優(yōu)選地，減少純化時間，從而防止不必要的氧化或者脫封端工程化的半胱氨酸殘基被再封端。

抗體偶聯(lián)物

抗體上脫封端工程化的半胱氨酸殘基可充當(dāng)有用的基座，以用于安裝多種功能基團(tuán)，其中包括成像試劑(例如發(fā)色基團(tuán)和熒光基團(tuán))，診斷試劑(例如MRI對比劑和放射性同位素)，穩(wěn)定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑。具有脫封端半胱氨酸殘基的抗體可以被偶聯(lián)到功能劑以形成抗體-功能劑的偶聯(lián)物。功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩(wěn)定劑)被偶聯(lián)(共價連接)至抗體上的工程化的半胱氨酸殘基位點(diǎn)。功能劑可以通過功能劑上的活性巰基直接地、或者是通過接頭間接地進(jìn)行連接。

具有脫封端的半胱氨酸殘基的抗體，可以偶聯(lián)藥物從而形成抗體藥物偶聯(lián)物(ADCs)。典型地，ADC包含位于藥物和抗體之間的接頭。接頭可以是可降解的或者是不可降解的接頭?？山到獾慕宇^典型地在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境下容易降解，例如在目標(biāo)位點(diǎn)處接頭發(fā)生降解，從而使藥物從抗體上釋放出來。合適的可降解的接頭包括，例如酶降解的接頭，其中包括可以被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶(例如溶酶體蛋白酶或者內(nèi)體蛋白酶)降解的含有肽基的接頭，或者糖接頭例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接頭。肽基接頭可以包括，例如二肽，例如纈氨酸-瓜氨酸，苯丙氨酸-賴氨酸或者纈氨酸-丙氨酸。其它合適的可降解的接頭包括，例如，pH敏感接頭(例如pH小于5.5時水解的接頭，例如腙接頭)和在還原條件下會降解的接頭(例如二硫鍵接頭)。不可降解的接頭典型地在抗體被蛋白酶水解的條件下釋放藥物。

連接到抗體之前，接頭具有能夠和脫封端的工程化的半胱氨酸殘基反應(yīng)的活性反應(yīng)基團(tuán)，連接通過活性反應(yīng)基團(tuán)實(shí)現(xiàn)。巰基特異性的活性反應(yīng)基團(tuán)是優(yōu)選的，并包括：例如馬來酰亞胺類化合物，鹵代酰胺(例如碘、溴或氯代的)；鹵代酯(例如碘、溴或氯代的)；鹵代甲基酮(例如碘、溴或氯代)，芐基鹵代物(例如碘、溴或氯代的)；乙烯基砜，吡啶基二硫化物；二硫化二氧化衍生物(disulfide dioxide derivatives)；汞衍生物例如3,6-二-(汞甲基)二氧六環(huán)，而對離子是醋酸根、氯離子或者硝酸根；和聚亞甲基二甲基硫醚硫代磺酸鹽。接頭可以包括，例如，通過硫代丁二酰亞胺連接到抗體上的馬來酰亞胺。

藥物可以是任何細(xì)胞毒性，抑制細(xì)胞生長或者免疫抑制的藥物。在實(shí)施方式中，接頭連接抗體和藥物，而藥物具有可以和接頭成鍵的功能性基團(tuán)。例如，藥物可以具有可以和連接物成鍵的氨基，羧基，巰基，羥基，或者酮基。在藥物直接連接到接頭的情況下，藥物在連接到抗體之前，具有能夠與脫封端的半胱氨酸殘基反應(yīng)的活性基團(tuán)。

有用的藥物類別包括，例如，抗微管蛋白藥物、DNA小溝結(jié)合試劑、DNA復(fù)制抑制劑、烷化試劑、抗生素、葉酸拮抗物、抗代謝藥物、化療增敏劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、長春花生物堿等。特別有用的細(xì)胞毒性藥物類的例子包括，例如，DNA小溝結(jié)合試劑、DNA烷基化試劑、和微管蛋白抑制劑、典型的細(xì)胞毒性藥物包括、例如奧瑞他汀(auristatins)、喜樹堿(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素類化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓類(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的藥物(benzodiazepine containing drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓類(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓類(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓類(oxazolidinobenzodiazepines))和長春花生物堿(vinca alkaloids)。選擇的含有苯并二氮卓類的藥物在WO 2010/091150,WO 2012/112708,WO 2007/085930,和WO 2011/023883中有描述。

在某些典型的實(shí)施方式中，合適的細(xì)胞毒性試劑包括：DNA小溝結(jié)合試劑(例如，烯二炔類(enediynes)和萊希菌素(lexitropsins)、CBI化合物；見美國6,130,237號專利)，多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)(見美國專利公開號為20060024317)、紫杉烷(例如紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel))、嘌呤霉素(puromycins)、長春花生物堿、CC-1065,SN-38、拓?fù)涮婵?topotecan)、嗎啉代-阿霉素/多柔比星(morpholino-doxorubicin)、根霉素(rhizoxin)、氰基嗎啉基代-阿霉素/多柔比星(cyanomorpholino-doxorubicin)、棘霉素(echinomycin)、考布他汀(combretastatin)、紡錘菌素(netropsin)、埃博霉素(epothilone)A和B、雌莫司汀(estramustine)、念珠藻素(cryptophysins)、西馬多丁(cemadotin)、美登素類化合物(maytansinoids)、迪斯德莫來/圓皮海綿內(nèi)酯(discodermolide)、艾榴塞洛素(eleutherobin)和米托蒽醌(mitoxantrone)。

所述藥物可以是抗微管蛋白藥物(anti-tubulin agent)?？刮⒐艿鞍姿幬锏睦影ǎ幌抻?，紫杉烷(例如(紫杉醇)，泰索帝/多西(多烯紫杉醇))，T67(杜拉瑞克(Tularik))和長春花生物堿(例如長春新堿(vincristine)，長春花堿(vinblastine)，長春地辛(vindesine)和長春瑞濱(vinorelbine))。其它抗微管蛋白藥物包括，例如漿果赤霉素衍生物(baccatinderivatives)、紫杉烷類似物(例如埃博霉素A和B)、諾考達(dá)唑(nocodazole)、秋水仙堿(colchicine)和秋水仙胺(colcimid)、雌莫司汀(estramustine)、念珠藻素(cryptophysins)、西馬多丁(cemadotin)、美登素類化合物(maytansinoids)、考布他汀(combretastatins)、迪斯德莫來/圓皮海綿內(nèi)酯(discodermolide)、奧瑞他汀(auristatins)、和艾榴塞洛素(eleutherobin)。

藥物可以是美登木素或美登醇，另外類別的抗微管蛋白藥物(ImmunoGen,Inc.；還可參見Chari等人，1992,Cancer Res.52∶127-131以及U.S.專利No.8,163,888)。

藥物可以是奧瑞他汀(auristatin)。奧瑞他汀(Auristatins)包括，但不限于，AE,AFP,AEB,AEVB,MMAF,和MMAE。奧瑞他汀(Auristatins)的合成和結(jié)構(gòu)描述見美國專利申請公開號2003-0083263和2009-0111756；國際專利申請公開號WO 04/010957；國際專利申請公開號WO 02/088172；美國專利號6,884,869；美國專利號7,659,241；美國專利號7,498,298；美國專利號8,343,928；和美國專利號8,609,105；出于各種目的，每一篇通過引用方式整體引入。

在某些實(shí)施方式中，藥物部分選自下組：抗微管蛋白試劑，DNA結(jié)合試劑，和DNA烷化試劑。在某些實(shí)施方式中，藥物選自下組：奧瑞他汀(auristatin)，吡咯并苯并二氮卓類(pyrrolobenzodiazepine)，多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycin)，美登醇，紫杉烷，卡奇霉素(calicheamicin)和蒽環(huán)霉素(anthracycline)。

藥物-接頭可以用于在一個簡單步驟中形成ADC。在其它實(shí)施方式中，雙功能連接物化合物可以用于在兩步或多步方法中形成ADC。例如，脫封端的工程化的半胱氨酸殘基在第一步驟中與接頭的反應(yīng)活性部分反應(yīng)，并且在隨后的步驟中，接頭上的功能性基團(tuán)與藥物反應(yīng)，從而形成ADC。

通常，選擇接頭上功能性基團(tuán)，以利于特異性地與藥物部分上的合適的反應(yīng)活性基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。作為非限制性的例子，基于疊氮化合物的部分可以用于特異性地與藥物部分上的反應(yīng)性炔基基團(tuán)反應(yīng)。藥物通過疊氮和炔基之間的1,3-偶極環(huán)加成，從而共價結(jié)合于接頭。其它的有用的功能性基團(tuán)包括，例如酮類和醛類(適合與酰肼類和烷氧基胺反應(yīng))，膦(適合與疊氮反應(yīng))；異氰酸酯和異硫氰酸酯(適合與胺類和醇類反應(yīng))；和活化的酯類，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯(適合與胺類和醇類反應(yīng))。這些和其它的連接策略，例如在《生物偶聯(lián)技術(shù)》，第二版(Elsevier)中所描述的，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，對于藥物部分和接頭的選擇性反應(yīng)，當(dāng)選擇了一個互補(bǔ)對的反應(yīng)活性功能基團(tuán)時，該互補(bǔ)對的每一個成員既可以用于接頭，也可以用于藥物。

相應(yīng)地，本發(fā)明的某些實(shí)施例提供了制備如上所述的脫封端抗體制劑的方法，其可進(jìn)一步地包括：將脫封端抗體(例如將脫封端抗體制劑)與藥物-接頭化合物，在足以形成抗體偶聯(lián)物(ADC)的條件下進(jìn)行結(jié)合。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法包括：在足以形成抗體-接頭偶聯(lián)物的條件下，將脫封端抗體與雙功能接頭化合物進(jìn)行結(jié)合。在這些實(shí)施方式中，本發(fā)明方法還進(jìn)一步地包括：在足以將藥物部分通過接頭共價連接到抗體的條件下，將抗體接頭偶聯(lián)物與藥物部分進(jìn)行結(jié)合。

在某些實(shí)施方式中，抗體藥物偶聯(lián)物ADC如下分子式所示：

其中：

Ab是抗體，

LU是接頭；

D是藥物；

而且下標(biāo)p是選自1到8的值。

在上式中，接頭LU，通過脫封端的工程化的半胱氨酸殘基連接到抗體上。下標(biāo)p的數(shù)值取決于可用于偶聯(lián)的脫封端半胱氨酸殘基的數(shù)量。例如，對于一個具有2個脫封端的工程化半胱氨酸殘基的抗體(例如每個重鏈上有1個或者每個輕鏈上有1個位點(diǎn))，p值可以是2。類似地，對于一個具有4個脫封端的工程化半胱氨酸殘基的抗體(例如每個重鏈上有2個位點(diǎn)，或者每個輕鏈上有2個位點(diǎn))，p值可以是4。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，p值為1到4的值。

載藥量

抗體上藥物-接頭分子的平均數(shù)量(或者平均載藥量)是ADC組分的一個重要特性，因?yàn)樗緵Q定了能夠輸送到目標(biāo)細(xì)胞的藥物量。平均載藥量包括偶聯(lián)到工程化的半胱氨酸殘基的藥物，還有偶聯(lián)到目標(biāo)工程化的半胱氨酸殘基之外的其它位點(diǎn)的藥物，以及在組合物中未偶聯(lián)的抗體的量。如果目標(biāo)是平均載藥量為每個抗體有2個藥物，那么可以用具有2個半胱氨酸殘基的抗體(例如每個重鏈上1個位點(diǎn)或者每個輕鏈上1個位點(diǎn))來制備ADC組分。如果目標(biāo)是平均載藥量為每個抗體有4個藥物，那么可以用具有4個半胱氨酸殘基的抗體(例如每個重鏈上2個位點(diǎn)或者每個輕鏈上2個位點(diǎn)，或者每個重鏈上1個位點(diǎn)并且每個輕鏈上1個位點(diǎn))來制備ADC組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，治療用的其它載藥量水平取決于特定抗體或特定藥物(包括，例如，載藥量小于2或者載藥量大于4)。用于藥物偶聯(lián)的結(jié)合位點(diǎn)可以被引入抗體，這可以通過在重鏈上1個以上或者2個以上位點(diǎn)設(shè)置工程化的半胱氨酸殘基，或者在輕鏈上設(shè)置工程化的半胱氨酸殘基，或者兼而有之。重要的是，上述工程化的半胱氨酸殘基脫封端水平，導(dǎo)致可以制備具有有用載藥量的ADC組合物。

典型地，采用具有2個工程化的半胱氨酸殘基的抗體所制備的ADC組合物，其平均載藥量為每個抗體有大約1.5到2.5個藥物。每個抗體上的平均藥物量可以是，例如，大約1.5,1.6,1.7,1.8,1.9,2.0,2.1,2.2,2.3,2.4,或2.5。在某些實(shí)施方式中，采用具有2個工程化的半胱氨酸殘基的抗體所制備的ADC組合物，其平均載藥量為每個抗體有大約1.5到大約2.2個藥物。典型地，采用具有4個工程化的半胱氨酸殘基的抗體所制備的ADC組合物，其平均載藥量為每個抗體有大約3.4到大約4.5個藥物。每個抗體上的平均藥物數(shù)量可以是，例如，大約3.3,3.4,3.5,3.6,3.7,3.8,3.9或4.0。在某些實(shí)施方式中，采用具有4個工程化的半胱氨酸殘基的抗體所制備的ADC組合物，其平均載藥量為每個抗體有大約3.6到大約4.2個藥物，或者每個抗體有從大約3.8到大約4個藥物。

典型地，實(shí)施本發(fā)明方法，以便選擇性修飾未封端的工程化的半胱氨酸殘基，但是常常觀察到不同程度的非工程化的(例如天然)半胱氨酸殘基的修飾。根據(jù)需要，可以控制反應(yīng)條件以限制非工程化的半胱氨酸殘基的修飾。在某些特定情形下，可以實(shí)行所述方法以消除或者減低非工程化的半胱氨酸殘基的修飾。例如，實(shí)行所述方法以至于ADC組合物中不超過大約20％，不超過大約15％，不超過大約10％，不超過大約5％的抗體分子中，藥物部分被共價連接到非工程化的半胱氨酸殘基上。也可以采用上述方法制備ADC組合物，其中具有修飾的非工程化的半胱氨酸殘基的抗體數(shù)量不超過抗體分子總量的大約5％,10％,15％,20％,25％，或30％。

可以采用多種分析方法確定偶聯(lián)物的產(chǎn)量和同分異構(gòu)體混合物。在將藥物偶聯(lián)到抗體之后，偶聯(lián)的藥物-抗體種類可以被分離出來。在某些實(shí)施方式中，偶聯(lián)的抗體種類可以基于抗體、藥物和/或偶聯(lián)物的特性加以分離。其它用于分析ADC組合物的技術(shù)包括但不限于：反相色譜，毛細(xì)管電泳和質(zhì)譜。ADC組合物可以例如通過酶解聯(lián)合LC/MS進(jìn)行分析，以確定藥物部分在ADC上的位置。

抗體

大量的合適的抗體可以用于本發(fā)明方法。用于本發(fā)明方法的抗體在許多應(yīng)用領(lǐng)域都有用處，包括體外或者體內(nèi)診斷，體內(nèi)成像，以及治療與獨(dú)特抗原相關(guān)的疾病和癥狀。5種人的抗體類型(IgG,IgA,IgM,IgD和IgE)，和這些類型的多種亞型(例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)，可基于結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行識別，例如單個抗體分子中免疫球蛋白單元的數(shù)量，單個單元上的二硫橋的結(jié)構(gòu)，以及鏈長度和序列的差異?？贵w的類和亞類被稱為抗體的同種異型。

抗體可以是完整的抗體或者是抗原結(jié)合抗體片段，只要抗體片段含有至少一個鏈間二硫鍵。

典型地，抗體是人，嚙齒動物(例如小鼠和大鼠)，驢，綿羊，兔，山羊，豚鼠，駱駝，馬和雞?？贵w可以是，例如，用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知技術(shù)所制備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。重組抗體，例如嵌合的和人源化的單克隆抗體，包括人的和非人的部分，可以通過標(biāo)準(zhǔn)的DNA重組技術(shù)獲得，它們都是有用的抗體。嵌合抗體是一個分子，其中不同的部分來自不同的動物種，例如具有來自鼠的單克隆抗體的可變區(qū)，和來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)的嵌合抗體(見例如美國專利4,816,567和美國專利4,816,397,在此通過引用方式整體引入本文)。人源化的抗體是指來源于非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源于非人物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)和來源于人免疫球蛋白分子的框架區(qū)域(見美國專利5,585,089，在此通過引用方式整體引入本文)。這些嵌合和人源化的單克隆抗體可以采用本領(lǐng)域熟知的DNA重組技術(shù)制備。如本文所用，“人”抗體包括具有人免疫球蛋白序列，以及包括分離自人免疫球蛋白庫，分離自人B細(xì)胞，或者分離自具有一個或多個人免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物(例如美國專利5,939,598和6,111,166中所述)的抗體。

抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性、或者更多的多重特異性。

在某些情況下，恒定區(qū)具有效應(yīng)子功能。如本文所用，術(shù)語“抗體效應(yīng)子功能”指一種由Ig的Fc區(qū)域貢獻(xiàn)的功能。這一功能可以，例如通過Fc效應(yīng)子區(qū)域結(jié)合到具有吞噬或裂解活性的免疫細(xì)胞上的Fc受體，或者通過Fc效應(yīng)子區(qū)域結(jié)合到補(bǔ)體系統(tǒng)中的成分來實(shí)現(xiàn)。效應(yīng)子功能可以是，例如，“抗體依賴的細(xì)胞毒性”即ADCC，“抗體依賴的吞噬作用”即ADCP，或者“補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性”即CDC。在某些情況下，恒定區(qū)缺乏一個或多個效應(yīng)功能。通過將藥物-接頭化合物偶聯(lián)到效應(yīng)子功能結(jié)合區(qū)域內(nèi)的工程化的半胱氨酸殘基，能夠調(diào)控效應(yīng)子功能。

抗體可以直接針對任何感興趣的抗原，例如醫(yī)學(xué)和/或治療興趣。例如，抗原可以是與以下有關(guān)的抗原：病原體(例如但不限于病毒，細(xì)菌，真菌和原生動物)，寄生蟲，腫瘤細(xì)胞，或者特定醫(yī)療癥狀。在腫瘤相關(guān)抗原(TAA)情況下，癌癥可能是免疫系統(tǒng)的、肺、結(jié)腸、直腸、乳腺、卵巢、前列腺、頭部、頸部、骨頭、或任何其他解剖位置。感興趣的抗原包括，但不限于，CD30、CD40、LewisY、CD70、CD2、CD20、CD22、CD33、CD38、CD40、CD52、HER2、EGFR、VEGF、CEA、HLA-DR、HLA-Dr10、CA125、CA15-3、CA19-9、L6、Lewis X、甲胎蛋白、CA242、胎盤堿性磷酸酶、前列腺特異抗原、前列腺酸性磷酸酶、表皮生長因子、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體、p97、MUC1-KLH、gp100、MART1、IL-2受體、人體絨毛膜促性腺激素、粘蛋白、P21、MPG、和Neu致癌基因產(chǎn)物。

一些具體有用的抗體包括但不限于：針對CD33抗原的抗體(例如，國際專利申請WO 2013/173496所描述的人源化2H12抗體)，針對CD70抗原的抗體(例如，國際專利申請WO2006/113909所描述的人源化1F6抗體)，針對CD30抗原的抗體(例如，國際專利申請WO2008/025020所描述的人源化AC10抗體)，針對CD19抗原的抗體(例如，國際專利申請WO 2009/052431所描述的人源化BU12抗體)，針對LIV-1,NTBA,或αVβ6的抗體。許多其它可以和腫瘤特異性抗原結(jié)合的內(nèi)化抗體都可以采用，見綜述(參見,例如,Franke等人(2000),Cancer Biother Radiopharm.15∶459-76；Murray(2000),Semin Oncol.27∶64-70；Breitling等人,重組抗體(Recombinant Antibodies),John Wiley,and Sons,New York,1998)。這些參考文獻(xiàn)和國際申請中的披露內(nèi)容在此通過引用引入并用于所有目的。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于制備具有如上所述具有脫封端的半胱氨酸殘基的抗體的方法，其中在抗體中包含至少3個鏈間二硫鍵。在某些實(shí)施方式中，所述抗體包含至少4個鏈間二硫鍵。在某些實(shí)施方式中，所述抗體包含1、2、3、4或者5個鏈間二硫鍵。在某些實(shí)施方式中，工程化的半胱氨酸殘基位于抗體的重鏈恒定區(qū)或者輕鏈恒定區(qū)。

工程化的半胱氨酸位置

工程化的半胱氨酸位置可對ADC的性質(zhì)有影響。例如，全部包埋入蛋白結(jié)構(gòu)的工程化的半胱氨酸殘基難以被偶聯(lián)，因?yàn)殡y以接觸溶劑，而位于抗體外表面的工程化的半胱氨酸殘基則因?yàn)檠娱L暴露于血漿中的物質(zhì)，導(dǎo)致ADCs具有受損的穩(wěn)定性。此外，從具有高的表面暴露的工程化的半胱氨酸殘基的ecmAbs制備的ADCs，可能對藥物的疏水性敏感；而位于更加受保護(hù)的位置的工程化的半胱氨酸殘基對藥物特性更不敏感，因?yàn)榕c溶液中其它物質(zhì)接觸是受限制的。工程化的半胱氨酸殘基的位置也可以用于調(diào)節(jié)效應(yīng)子功能，這對于一些特定ADC是必要的。例如，將藥物-接頭偶聯(lián)到位于效應(yīng)子功能結(jié)合區(qū)域的工程化半胱氨酸殘基，可以用于封閉與效應(yīng)子功能調(diào)節(jié)受體的結(jié)合。

在某些實(shí)施方式中，工程化的半胱氨酸殘基位于重鏈恒定區(qū)、重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)、或其組合。優(yōu)選的半胱氨酸殘基是位于這樣的位點(diǎn)，所述位點(diǎn)是可偶聯(lián)的并且導(dǎo)致穩(wěn)定的連接。“可偶聯(lián)”的意思是工程化的半胱氨酸殘基能夠偶聯(lián)到功能試劑(例如成像試劑，診斷試劑，穩(wěn)定劑或治療劑)而不會先使抗體變性。選擇引入半胱氨酸殘基位點(diǎn)的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知,而所述殘基隨后被偶聯(lián)于功能性試劑(例如，見，舉例來說,Junutula等人，2008,Nature Biotechnology,26(8),925-932)。

在某些方面，工程化的半胱氨酸殘基的分?jǐn)?shù)溶劑可及性(fractional solvent accessibility)為10％或者更高，20％或者更高，30％或者更高，40％或者更高，50％或者更高。在某些方面，半胱氨酸殘基具有分?jǐn)?shù)溶劑可及性范圍從大約10％到95％，從大約10％到85％，從大約10％到75％，從大約10％到60％，從大約20％到95％，從大約20％到85％，從大約20％到75％，從大約20％到60％，從大約40％到95％，從大約40％到85％，從大約40％到75％，從大約40％到60％。確定某一特定位點(diǎn)殘基的分?jǐn)?shù)溶劑可及性的方法為本領(lǐng)域熟知并且能夠例如采用在線服務(wù)器getarea加以確定，該服務(wù)器采用Fraczkiewicz和Braun,1998,J.Comp.Chem.,19,319-333(參見http://curie.utmb.edu/getarea.html)中所描述的方法。示例的殘基包括位于輕鏈上的位點(diǎn)15,114,121,127,168,205(根據(jù)Kabat編號)，或者位于重鏈的位點(diǎn)112,114，或116(根據(jù)Kabat編號法進(jìn)行編號)。示例的殘基包括那些位于IgG1抗體的Fc區(qū)域的位點(diǎn)，例如那些位于Fc區(qū)域的位點(diǎn)239，326，327或者269(根據(jù)EU索引進(jìn)行編號)。位于位點(diǎn)239，326，327的殘基的分?jǐn)?shù)溶劑可及性分別為大約50％，大約94％，和大約23％。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠識別，選擇性活化工程化的半胱氨酸殘基所需要的條件將取決于工程化的半胱氨酸殘基在抗體上的位置。流程2的化學(xué)式為選擇能夠選擇性活化工程化的半胱氨酸殘基的還原條件提供了一個框架，不管它們發(fā)生在蛋白序列的什么位置。在某些實(shí)施方式中，一個抗體具有從1至8個，或者從2至8個，或者從2至4個工程化的半胱氨酸殘基。

非抗體蛋白質(zhì)

本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，盡管這里描述的過程以抗體作為示例，它也可以成功應(yīng)用于任何具有非配對、在表達(dá)或者生產(chǎn)的過程中被硫醇封端的、工程化的或者天然的半胱氨酸殘基(在蛋白質(zhì)上通常不形成鏈間或者鏈內(nèi)鍵的半胱氨酸)的蛋白質(zhì)。所述方法特別有幫助的蛋白質(zhì)是這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)除了包含非配對的半胱氨酸殘基，還包含天然的半胱氨酸殘基并形成鏈間二硫鍵，特別是那些可以被切斷并不立刻導(dǎo)致蛋白去折疊的鍵。當(dāng)涉及到非抗體蛋白質(zhì)時，術(shù)語“鏈間二硫鍵”是指相鄰肽鏈上的2個半胱氨酸殘基之間的共價鍵。候選的非抗體蛋白質(zhì)包括：那些具有暴露于溶劑的二硫鍵，且所述二硫鍵在天然折疊構(gòu)象中的穩(wěn)定性與那些被封端的硫醇的穩(wěn)定性具有可比性。如本文所用，工程化的半胱氨酸蛋白質(zhì)，是指選定的氨基酸被突變?yōu)榘腚装彼岬牡鞍踪|(zhì)。代表性的蛋白質(zhì)還包括Fc-融合蛋白，例如包含一個抗體的Fc區(qū)域的蛋白質(zhì)，其共價連接于提供針對目標(biāo)靶點(diǎn)的特異性的蛋白質(zhì)。

Ⅳ.實(shí)施例

實(shí)施例1：實(shí)施選擇性還原的代表性方法

一個反應(yīng)容器與一切向流過濾(TFF)設(shè)備相連接，并且安裝超濾膜(例如，88cm²,Millipore Pelicon 3,再生纖維素)。(許多不同類型的具有合適大小的膜可以應(yīng)用于上述過程。對于還原劑添加速率計(jì)算所需要的流出速率和篩分因素，應(yīng)該根據(jù)方法中采用的膜的滲透通量和膜的類型以及表面積來確定。)根據(jù)制造商的說明，對膜進(jìn)行沖洗和平衡。設(shè)置滲濾緩沖液池，它含有緩沖劑(例如，50mM Tris/5mM EDTA,pH 8.0)。它是通過管道與反應(yīng)容器相連，并且液體流經(jīng)管道是通過蠕動泵加以控制(例如滲濾緩沖泵)。包含封端的工程化半胱氨酸殘基的mAb被放置在反應(yīng)容器中。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)混合物被連續(xù)泵送通過超濾膜，控制滯留線以保證跨膜壓力為約20psi。

包含還原劑的溶液池通過管道連接于滲濾緩沖液管線，或者連接于流路或者反應(yīng)容器的其它位置。計(jì)算流速，在該流速下包含還原劑的原液被添加到反應(yīng)混合物中以維持反應(yīng)混合物中起始的(或所需要的)還原劑濃度(反應(yīng)混合物中最優(yōu)的還原劑濃度采用本文描述的方法并通過實(shí)驗(yàn)確定，并且對不同的硫醇是不同的，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌倪€原能力，如圖1所示)。還原劑濃度在整個反應(yīng)時間基本上保持不變。滲濾緩沖液也以可控的速率被泵送到反應(yīng)容器中，以便整個反應(yīng)體積保持不變(即在恒體積滲濾中)，即，還原劑和滲濾緩沖液被引入反應(yīng)器的速率與通過滲透所導(dǎo)致的體積損失速率相匹配。

實(shí)施例2采用半胱氨酸、N-乙?；腚装彼岷桶腚装纷鳛檫€原劑，并在不移除封端副產(chǎn)物的情況下，對工程化的半胱氨酸殘基進(jìn)行脫封端

將S239C工程化的半胱氨酸抗體(IgG1抗體，其在239位為工程化的半胱氨酸殘基，根據(jù)EU索引進(jìn)行編號)，20mg(135nmol，15mg/mL)，用33μL 100mM(3.3μmol)半胱氨酸、N-乙?；腚装彼峄蛘甙腚装?，在pH 8.0和室溫下處理8h。按每1h間隔取出樣品，純化，與過量SGD-1269偶聯(lián)，并冷凍儲存。純化和偶聯(lián)終止了還原反應(yīng)，保存了在還原過程中產(chǎn)生的二硫鍵。偶聯(lián)的樣品在變性條件下通過反相HPLC(“rPLRP”)進(jìn)行分析，由此可以推導(dǎo)出工程化的半胱氨酸殘基的脫封端程度(從H0轉(zhuǎn)換為H1)。鏈間二硫鍵的斷裂程度也可以通過具有偶聯(lián)有>1mcMMAF(mcMMAF是連接于藥物單甲基奧瑞他汀F的馬來酰亞胺己酸接頭)的重鏈量加以確定。沒有觀察到偶聯(lián)有>2mcMMAF分子的重鏈。靜態(tài)溶液還原實(shí)驗(yàn)中得出的結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，三種硫醇中每一種都能夠與ecmAb反應(yīng)，將工程化的半胱氨酸殘基脫封端，但是三者表現(xiàn)很不同。NAC的表現(xiàn)形式可用流程1中的第一個反應(yīng)最直接地加以描述：反應(yīng)進(jìn)行直至富集足夠濃度的二硫鍵產(chǎn)物4，然后因?yàn)檎磻?yīng)和逆反應(yīng)以相同的速率發(fā)生而發(fā)生停止。半胱氨酸是比NAC更強(qiáng)大的還原劑，但是，與停止在部分活化ecmAb不同，反應(yīng)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，再產(chǎn)生ecmAb。這一逆轉(zhuǎn)表明，采用半胱氨酸，會涉及額外的反應(yīng)，即還原劑的自氧化。

2R-SH+O2→R-S-S-R (iii)

因此，半胱氨酸的自氧化所產(chǎn)生的胱氨酸，也會將活化的工程化的半胱氨酸殘基再封端，從而逆轉(zhuǎn)最初的還原。對圖1進(jìn)行仔細(xì)查閱，可顯示出，采用半胱胺時，也發(fā)生了同樣的現(xiàn)象(即起始還原后伴隨著再封端)，但是半胱胺是一種更弱的還原劑，因此起始還原程度沒有采用半胱氨酸或者N-乙酰半胱氨酸時高。

實(shí)施例3選擇性活化ecmAbs上的工程化的半胱氨酸殘基

反應(yīng)容器與一切向流過濾(TFF)設(shè)備相連接，并且安裝超濾膜(例如，88cm²,Millipore Pelicon 3,再生纖維素)。根據(jù)制造商的說明書，對膜進(jìn)行沖洗和平衡。設(shè)置滲濾緩沖液池，它含有緩沖劑(例如，50mM Tris/5mM EDTA,pH 8.0)。它是通過管道與反應(yīng)容器相連，并且液體流經(jīng)管道通過蠕動泵加以控制(例如滲濾緩沖泵)。包含封端工程化的半胱氨酸殘基的mAb(h2H12S239C ecMab,h1F6 239ecMab,h2H12K326C ecMab或h2H12A327C ecMab,根據(jù)EU索引進(jìn)行編號)被放置在反應(yīng)容器中，濃度大約為15mg/mL并且pH被調(diào)至8.0.。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，反應(yīng)混合物被連續(xù)泵送通過超濾膜，控制滯留線以保證跨膜壓力為約20psi。

包含半胱氨酸的溶液池通過管道與滲濾緩沖液管線連接。計(jì)算流速，在該流速下，將包含半胱氨酸的原液添加到反應(yīng)混合物中以維持反應(yīng)混合物中起始的(或所需要的)半胱氨酸濃度。如下計(jì)算注入到反應(yīng)混合物中的半胱氨酸原液濃度和添加速率，以便于半胱氨酸濃度在整個反應(yīng)時間基本上保持不變。在圖2-5所示的例子中，半胱氨酸的反應(yīng)濃度范圍為0.5-0.9mM(如圖中所描述的說明)；半胱氨酸原液濃度為100mM,10mM,或者5mM，并且半胱氨酸被泵送到反應(yīng)器中的流速也被調(diào)節(jié)以根據(jù)下述化學(xué)式維持實(shí)驗(yàn)中的半胱氨酸濃度。半胱氨酸的篩分因素經(jīng)測定是0.8-0.9。在整個實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)混合物中半胱氨酸的濃度采用DTNB分析法周期性地測定，以保證半胱氨酸水平維持在需要的濃度(未顯示)。

滲濾緩沖液也以可控的速率被泵送到反應(yīng)容器中，以便整個反應(yīng)體積保持不變(即在恒體積滲濾中)，即，將半胱氨酸和滲濾緩沖液引入反應(yīng)器的速率與通過滲透所導(dǎo)致的體積損失速率是相匹配的。

樣品在圖中所示的時間間隔被移出，在PD-10柱中洗脫純化，并且與SGD-1269偶聯(lián)。偶聯(lián)的樣品然后通過rPLRP進(jìn)行分析。rPLRP圖譜分析提供了維持封端(％H0)的重鏈比例，工程化的半胱氨酸殘基被選擇性地還原(％H1)的比例，或者工程化的半胱氨酸位點(diǎn)并且額外地在鏈間二硫鍵位置被還原(％H2；非選擇性還原)的比例。

半胱氨酸添加速率計(jì)算

半胱氨酸被添加到反應(yīng)混合物中的速率與半胱氨酸通過滲透所損失的速率相同。分析物通過滲透所導(dǎo)致初始損失速率可用方程式2計(jì)算，這可以來自恒定體積速率的清除率理論方程(即方程式1)推導(dǎo)出。半胱氨酸原液被泵送到反應(yīng)混合物中以維持起始半胱氨酸濃度的速率見方程式3。

方程式1：C/C₀＝e(-NS)。C是在任一時間t的濃度；C₀是初始濃度；N是時間t時的置換體積數(shù)，并且S是分析物的篩分因子(經(jīng)驗(yàn)值)。置換體積數(shù)N，是r*t/V_d，其中r是滲透流速，V_d是批量體積。進(jìn)行替換，求導(dǎo)，并且評估在t＝0時的導(dǎo)數(shù)，得到方程式2。

方程式2:dC/dt＝-C₀*(r/Vd)*S,：其中，dC/dt是半胱氨酸在t₀時的損失速率。

在反應(yīng)混合物中添加半胱氨酸溶液以實(shí)現(xiàn)給定濃度的速率見方程式3。

方程式3:R＝-dC/dt*V_d/[Cys]，其中[Cys]是半胱氨酸的原液濃度。

因此，替換方程式2中的表達(dá)式dC/dt，給出了用于添加速率的方程式4，

方程式4:R＝C₀*r*S/[Cys]＝(0.8mM)*(720mL/hr)*(0.8)/(100mM)＝4.61mL/hr。

結(jié)果

通過在反應(yīng)過程中連續(xù)滲濾ecmAb，并在全過程中將半胱氨酸加入到滲濾緩沖液中，可以實(shí)現(xiàn)選擇性活化ecmAb上的工程化的半胱氨酸殘基。連續(xù)滲濾清除了反應(yīng)副產(chǎn)物。半胱氨酸的添加速率，基于半胱氨酸通過滲濾的理論中半胱氨酸的理論清除率來計(jì)算，以便為反應(yīng)混合物中提供恒定的半胱氨酸濃度。圖2顯示4.5hr后，約80％可用的工程化的半胱氨酸殘基被活化(“％H1”)，而鏈間二硫鍵的斷裂幾乎可以忽略(由％H2表示)。這一實(shí)驗(yàn)采用0.6mM半胱氨酸在更長的時間下進(jìn)行重復(fù)，得到了類似的結(jié)果(圖3)。在更高的濃度下，反應(yīng)更快但是特異性較低。應(yīng)理解，在整個過程中，反應(yīng)混合物處于流動狀態(tài)，伴隨半胱氨酸溶液通過半胱氨酸添加泵進(jìn)入反應(yīng)混合物，以及通過TFF膜(滲透)離開反應(yīng)混合物，因此，在整個反應(yīng)過程中，濃度可以稍微波動，但是活化條件通?？梢越咏鼧?biāo)稱濃度。1.5-2mM或者更高濃度的半胱氨酸，會導(dǎo)致鏈間二硫鍵斷裂增加。圖4顯示了工程化的半胱氨酸殘基活化可以在許多位點(diǎn)選擇性地獲得，而與抗體的種類無關(guān)。K326突變體的活化時間曲線表明，這一位點(diǎn)的活化比S239或A327位點(diǎn)快。這很可能是由于以下事實(shí)：K326是更加溶液可及的，但盡管如此，該方法仍獲得了理想的選擇性活化。圖5顯示通過采用低濃度的還原劑并在較長時間下反應(yīng)，可以使得反應(yīng)被驅(qū)動到工程化的半胱氨酸殘基被近乎100％活化，并且具有很好的選擇性。

盡管為了清楚和理解的目的，通過闡述和例子，對上述內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，可以進(jìn)行某些改變和變動。此外，在本文中所提供的每個文獻(xiàn)，都同樣程度地通過引用被整體引入本文，就好比每個文獻(xiàn)被單獨(dú)地引用而引入本文。