本發(fā)明一般涉及用于治療自噬相關(guān)的人類疾病的組合物和方法的領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明提供使用小化學(xué)物質(zhì)控制自噬和治療自噬相關(guān)的人類疾病，如癌癥的方法

背景

自噬是一種在進化上保守的分解代謝降解細胞過程，其中錯誤折疊的蛋白質(zhì)或受損的細胞器首先被一雙層膜囊泡(稱為自噬體)隔離。自噬體然后與溶酶體融合以消化和再循環(huán)內(nèi)容物以維持細胞內(nèi)平衡。為細胞的生存，自噬也可被廣泛種類的壓力，如營養(yǎng)饑餓、感染和老化所顯著地誘導(dǎo)。功能障礙的自噬一直與廣泛范圍的人類疾病，例如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、心臟病、糖尿病和細菌性感染有關(guān)(Wirawan et al., 2012; Yang和Klionsky, 2010)。

自噬對許多細胞過程而言是一把雙刃劍，取決于遺傳背景和微環(huán)境。例如，自噬可以通過防止致癌蛋白基質(zhì)、毒性錯誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細胞器和活性氧物質(zhì)(ROS)積聚以引起基因組不穩(wěn)定和癌癥的開始而用作一種腫瘤抑制因子(Mathew et al., 2009; Yue et al., 2003)。另一方面，在建立的腫瘤細胞中檢測的較高基礎(chǔ)自噬活性通過在增加的代謝消耗和缺氧的微環(huán)境下，維持能量產(chǎn)生，發(fā)揮促進腫瘤生存和生長的功能，從而使得腫瘤能夠逃避化療和/或輻射(Amaravadi et al., 2007; Lock et al., 2011; Lum et al., 2005; Yang et al., 2011)。因此，剖析調(diào)節(jié)自噬的分子機制并識別適用于臨床應(yīng)用的特定自噬抑制劑或誘導(dǎo)劑對于特異性靶向自噬以對抗人類疾病是必要的。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的化學(xué)物質(zhì)促進或者抑制自噬。這些化合物中的一些已被廣泛用于剖析自噬的根本機制(Baek et al., 2012)。流行的自噬誘導(dǎo)劑包括mTOR激酶抑制劑，例如，雷帕霉素和torin 1 (Hanson et al., 2013)，和抑制肌醇單磷酸酶的化學(xué)物質(zhì)，如鋰和卡馬西平(Hidvegi et al., 2010)。值得注意的是，雷帕霉素是一種免疫抑制劑并且最近已被用作抗癌劑(Ravikumar et al., 2004)。鋰也已被用來治療亨廷頓氏病和其它相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病(Sarkar et al., 2005)。通常使用的自噬抑制劑包括氯喹(CQ)、3-甲基腺嘌呤、渥曼青霉素和巴弗洛霉素(BAF) (Baek et al., 2012; Rote和Rechsteiner, 1983; Seglen和Gordon, 1982; Wu et al., 2013)。由于建立的腫瘤細胞通常激活自噬以逃避化學(xué)療法和/或輻射(Yang et al., 2011)，大量的臨床前研究發(fā)現(xiàn)，自噬被CQ抑制恢復(fù)化學(xué)敏感性并通過不同的抗癌療法促進腫瘤細胞死亡(Kimura et al., 2013)。雖然CQ為癌癥治療提供了巨大的前景，但CQ誘導(dǎo)眼毒性和損害腎臟系統(tǒng)，以及HCQ或CQ的耐受劑量是否能達到人類腫瘤以有效地抑制自噬是不確定的(Kimura et al., 2013)。此外，大多數(shù)可獲得的自噬抑制劑，像HCQ或CQ，也缺乏或者特異性、效力或者抗腫瘤活性(Janku et al., 2011)。因此，需要自噬的有效的和特異性的抑制劑以為未來的癌癥治療提供一種新的和有力的方法。

最近，許多新的自噬化學(xué)調(diào)節(jié)劑已經(jīng)通過基于清除細胞中突變的α-突觸核蛋白(synuclein)的聚集體的篩選或者通過用GFP-LC3轉(zhuǎn)染的細胞的基于圖像的篩選被鑒定出來。雖然這些小化學(xué)物質(zhì)是研究自噬的有用的藥理學(xué)工具和是自噬相關(guān)疾病的潛在治療藥物，但這些化合物中的許多仍然缺乏特異性或者效力，或者二者(Rubinsztein et al., 2012)。因此，對特異性的和有效的自噬化學(xué)調(diào)節(jié)劑的研究必須繼續(xù)，以獲得對自噬的深入了解，并提供潛在的治療藥物。

通過篩選包含大約10,000個藥物-樣或前導(dǎo)-樣小化學(xué)物質(zhì)的Chembridge庫(ChemBridge Corporation, San Diego)，最初發(fā)現(xiàn)vacuolin-1誘導(dǎo)內(nèi)體或溶酶體的同型融合，從而形成大液泡。然而，它并沒有改變其它細胞結(jié)構(gòu)和膜運輸功能(Cerny et al., 2004; Huynh和Andrews, 2005; Shaik et al., 2009)。vacuolin-1是否阻斷Ca²⁺-依賴的溶酶體胞吐作用仍然是有爭議的。

簡述

本發(fā)明提供使用vacuolin-1及其類似物以控制自噬和治療自噬相關(guān)的人類疾病，如癌癥的方法。本發(fā)明還提供vacuolin-1及其類似物抑制自噬和內(nèi)體運輸?shù)膽?yīng)用。

一方面，提供了治療癌癥，例如，但不限于肺癌和鼻咽癌的方法。所述方法包括單獨或與一種或多種化療藥組合給予患有癌癥的受試者治療有效量的vacuolin-1，和/或一種或多種類似物。在至少一個實施方案中，所述方法被用來治療對用自噬抑制劑治療敏感的癌癥。

在一些實施方案中，所述方法導(dǎo)致自噬和/或內(nèi)體運輸?shù)囊种谱饔?。在一些實施方案中，所述方法?dǎo)致Rab5的激活，其導(dǎo)致內(nèi)體和溶酶體的成熟并有助于溶酶體的pH增加。在一些實施方案中，化療藥可包括紫杉醇、5-Fu、坦羅莫司(temirolimus)，及其組合。

在本發(fā)明的其它方面，vacuolin-1類似物通過虛擬的篩選鑒定。

附圖簡述

圖1顯示vacuolin-1和結(jié)構(gòu)類似物的結(jié)構(gòu)。

圖2顯示在用巴佛洛霉素、CQ和vacuolin-1處理后，表達RFP-GFP-LC3的HeLa細胞的免疫熒光染色分析。

圖3顯示vacuolin-1抑制HeLa細胞中的自噬體和溶酶體之間的融合。顯示了在用巴佛洛霉素、CQ和vacuolin-1處理后，表達RFP-GFP-LC3的HeLa細胞的免疫熒光染色分析。比例尺 = 20μM。(A) 在經(jīng)vacuolin-1誘導(dǎo)后，黃色LC3II色斑在表達RFP-GFP-LC3的HeLa細胞中的百分比。(B) 顯示經(jīng)vacuolin-1 (1μM)誘導(dǎo)的LC3-II和p62二者在HeLa細胞中的積聚的蛋白質(zhì)印跡分析。(C) 在HeLa細胞中GFP-LC3-II色斑的vacuolin-1 (1μM)誘導(dǎo)的免疫熒光染色分析，其不與RFP-Lamp1共定位。比例尺 = 20μM。(D) Vacuolin-1 (1μM)誘導(dǎo)自噬小泡的積聚，如電子顯微照片所顯示和在區(qū)域D1和D2所突顯的。

圖4顯示(A) 在用vacuolin-1或CQ以指定的劑量處理6小時后，HeLa細胞中的LC3和p62的蛋白質(zhì)印跡分析；(B) 在用vacuolin-1或CQ以指定的劑量處理48小時的HeLa細胞的細胞成活力的MTT測定；(C) vacuolin-1 (1μM)處理的HeLa細胞中的LC3和p62的蛋白質(zhì)印跡分析；(D) 在vacuolin-1 (1μM)誘導(dǎo)后，溶酶體示蹤劑(Lysosensor) DND-189染色的HeLa細胞的微孔板讀出儀(microplate reader)測量；(E) 在vacuolin-1 (1μM)誘導(dǎo)后，定量比率溶酶體示蹤劑(LysoSensor)黃色/藍色DND-160染色的HeLa細胞的微孔板讀出儀測量；和(F) 在vacuolin-1 (1μM)預(yù)處理5小時后，接著經(jīng)GPN (200μM)誘導(dǎo)的溶酶體Ca²⁺釋放后的Fura-2負載的HeLa細胞。

圖5顯示在用vacuolin-1或CQ以指定的劑量處理6小時的PC3前列腺癌細胞中針對LC3和p62的蛋白質(zhì)印跡分析。

圖6顯示通過對用vacuolin-1或CQ以指定的劑量處理48小時的PC3、HepG2、MCF7和A549細胞的MTT測定測量的細胞成活力的線圖。

圖7顯示(A) 在用或未用vacuolin-1 (1μM)或巴佛洛霉素(100 nM)處理的HeLa細胞中，針對LC3、p62和組織蛋白酶L的蛋白質(zhì)印跡分析；(B) 在EGFR降解測定(在vacuolin-1的存在或不存在下，用EGF處理HeLA細胞)后，針對在HeLa細胞中的EGFR的蛋白質(zhì)印跡分析；(C) 在用vacuolin-1 (1μM)處理的HeLa細胞中，對EGFR的免疫熒光染色分析(比例尺 = 20μM)；和(D)在vacuolin-1 (1μM)處理的和對照HeLa細胞中，對DQ-BSA-綠色熒光的流式細胞術(shù)分析。

圖8顯示(A) 在vacuolin-1和巴佛洛霉素處理的細胞中，顯示V-ATPase活性的體外V-ATPase測定；(B) 在HeLa細胞中GST-標記的Rabaptin5拉下(pull-down)測定的結(jié)果，顯示用vacuoin-1 (1μM)處理的或用Rab5A-CA或Rab5A-DN轉(zhuǎn)染的細胞中的活性Rab5；(C) 在HeLa細胞中針對LC3-II和p62的蛋白質(zhì)印跡分析，顯示Rab5A敲除阻斷vacuolin-1誘導(dǎo)LC3-II和p62積聚；(D) Rab5A-CA的表達促進vacuolin-1誘導(dǎo)的自噬停止，而Rab5A-DN的表達則在HeLa細胞中阻斷它；(E) 在Rab5A-CA表達后，針對LC3-II和p62的蛋白質(zhì)印跡分析；和(F) 在Rab5A-CA表達后，針對LC3-II和p62的免疫染色分析(比例尺 = 20μM)。

圖9顯示Rab5A-DN的表達不影響在HeLa細胞中的饑餓誘導(dǎo)的LC3色斑。

圖10顯示Rab5A敲除或Rab5A-DN的表達不影響在HeLa細胞中的饑餓誘導(dǎo)的LC3-II。

圖11顯示在vacuolin-1處理(B)后的HeLa細胞中放大的溶酶體的電子顯微圖像，與對照(A)對比。

圖12顯示vacuolin-1類似物抑制HeLa細胞中自噬體和溶酶體之間的融合。針對LC3-I、LC3-II和p62的蛋白質(zhì)印跡分析。

圖13顯示vacuolin-1有效地促進化療藥在人類癌細胞系中的抗-腫瘤效果。(A) Vacuolin-1增強化療藥的抗-腫瘤效果，(B) Vacuolin-1與化療藥組合大大地降低癌細胞的集落形成效率。

圖14顯示一種使用ChemDiv鑒別vacuolin-1類似物的虛擬篩選策略。

圖15顯示vacuolin-1類似物。

圖16顯示vacuolin-1顯著地抑制人類鼻咽癌的集落形成和遷移。(A) Vacuolin-1單獨處理在CNE-1或HONE-1細胞中顯示很少的細胞毒性。(B) Vacuolin-1極大地減少從單一CNE-1或HONE-1細胞生成的集落的大小和數(shù)目。(C) Vacuolin-1有效地抑制CNE-1和HONE-1細胞二者的遷移，如通過vacuolin-1處理誘導(dǎo)腫瘤細胞運動的顯著下降的觀察所顯示的。(D)和(E) Vacuolin-1顯著地抑制CNE-1和HONE-1細胞的遷移(D)和侵襲性(E)。

圖17顯示vacuolin-1在體外顯著地抑制人類肺癌干細胞(LCSC)的集落形成和遷移。(A) Vacuolin-1對人類肺癌干細胞(hLCSC)的自噬抑制作用的效力為其它腫瘤細胞系的十分之一，(B) Vacuolin-1不影響hLCSC的細胞增殖。(C-F)) Vacuolin-1 (> 10μM)幾乎完全抑制hLCSC的集落形成(C)、遷移(D)、侵襲(E)和腫瘤球形成(F)。

圖18顯示vacuolin-1顯著地抑制裸鼠中的腫瘤生長。(A). vacuolin-1 (5 mg/kg)一周兩次的腫瘤內(nèi)注射顯著地抑制裸鼠中的LCSC異種移植物的腫瘤生長，但對體重增加只有很少的影響。(B) vacuolin-1處理顯著地抑制腫瘤中的自噬。(C) 在年輕的成年小鼠中腹膜內(nèi)注射vacuolin-1 (250 mg/kg)表現(xiàn)出很少的急性毒性，因為藥物注射的小鼠在兩周后與對照相比，顯示出正?；钚院腕w重增加。

詳細描述

本發(fā)明描述作為自噬和內(nèi)體運輸?shù)挠行У暮涂赡娴囊种苿┑膙acuolin-1及其類似物，和單獨或與化療藥，如5-FU、坦羅莫司(temsirolimus)和紫杉醇組合或單獨使用vacuolin-1及其類似物，以控制自噬和治療癌癥，如分別為前列腺癌、乳腺癌和鼻咽癌或瘧疾的方法。

一方面，提供了治療癌癥，例如但不限于，結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤和/或鼻咽癌的方法。所述方法包括單獨或者與一種或多種化療藥組合給予患有癌癥的受試者治療有效量的vacuolin-1，和/或一種或多種類似物。

另一方面，提供了治療瘧疾的方法。所述方法包括給予感染瘧疾的受試者治療有效量的vacuolin-1，和/或一種或多種類似物。

在一些實施方案中，所述方法導(dǎo)致自噬和/或內(nèi)體運輸?shù)囊种谱饔谩Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，所述方法?dǎo)致Rab5的激活，其導(dǎo)致內(nèi)體和溶酶體的成熟并有助于溶酶體的pH增加。在一些實施方案中，化療藥可包括，但不限于，紫杉醇、5-Fu、坦羅莫司及其組合。

在本發(fā)明的其它方面，另外的vacuolin-1類似物通過虛擬篩選鑒定。

小化學(xué)物質(zhì)，vacuolin-1，及其類似物(圖1)通過阻斷哺乳動物細胞中自噬體和溶酶體之間的融合，有效地和可逆地抑制自噬，從而導(dǎo)致自噬體的積聚(圖2-5，和12)。Vacuolins比氯喹(CQ)的毒性低，但在抑制自噬方面與CQ比較有效至少10倍(圖3-5)。Vacuolin-1及其類似物表示一類可有效地和可逆地調(diào)節(jié)自噬的新的藥物。

本發(fā)明描述作為一般內(nèi)體運輸?shù)挠行У囊种苿?圖7)和一類新的Rab5 GTPase活化劑(圖8)的vacuolins。

此外，本文提供用vacuolins與其它化療藥如5-FU、坦羅莫司和紫杉醇組合治療人類癌癥，如結(jié)腸癌、骨肉瘤和鼻咽癌的方法(圖13和14)。其也設(shè)想vacuolins，和/或其類似物可單獨用于治療癌癥。此外，本發(fā)明還提供用vacuolins治療瘧疾的方法(圖15)。

在至少一個方面，vacuolins與化療藥如5-FU、坦羅莫司和紫杉醇組合使用，以協(xié)同殺滅體外的多種腫瘤細胞系并抑制異種移植物小鼠模型中的腫瘤生長(圖13和14)。期望vacuolin-1及其類似物提供一種與癌癥作斗爭的新的治療策略。還期望vacuolins使攜帶野生型p53，而不是突變體p53的腫瘤細胞對化療藥增敏。

Vacuolins是細胞-滲透性和水溶性的三嗪基化合物。與其它流行的自噬調(diào)節(jié)劑，例如已被用于十多個抗-癌臨床試驗的CQ比較，vacuolinsare至少10倍有效于抑制廣泛種類的癌細胞系中的自噬，同時顯示很少的毒性(圖4和6)。除了抑制自噬之外，vacuolins還有效地和可逆地抑制內(nèi)體運輸(圖7)。

Vacuolins顯著地激活Rab5和Rab5A-DN表達或Rab5A敲除消除vacuolin-1介導(dǎo)的自噬抑制作用(圖8)。Rab5是內(nèi)吞溶酶體系統(tǒng)的生物發(fā)生的一種主要的調(diào)節(jié)劑，且迄今為止未發(fā)現(xiàn)藥物(除了vacuolins外)可調(diào)節(jié)其活性。因此，vacuolins是第一類被鑒定的Rab5激動劑并可廣泛用于與自噬和細胞內(nèi)運輸二者相關(guān)的基礎(chǔ)研究中。

Vacuolins也適度抑制V-ATPase活性(在1μM為30%)，這可能是由于這樣的事實：V-ATPase對疏水性化合物一般是敏感的(圖8)。因此，vacuolins不是特異性的V-ATPase抑制劑，但盡管如此至少部分地導(dǎo)致溶酶體pH的增加，其也可歸因于自噬抑制作用。此外，內(nèi)體運輸對于溶酶體的功能和生物發(fā)生是必不可少的，因為溶酶體依賴新組分的流入。沒有引入的內(nèi)體運輸，溶酶體失去了它們的完整形態(tài)，質(zhì)子和其它離子的含量，和核周區(qū)的定位(Huotari和Helenius, 2011；Spang, 2009)。因此，vacuolins組成性激活Rab-5，且活性Rab5停止內(nèi)體成熟，這隨后削溶酶體的生物發(fā)生和功能。這也將部分地促使溶酶體pH的增加。

本發(fā)明還提供在無腫瘤和攜帶腫瘤的小鼠中，vacuolins與化療藥組合或無化療藥時的毒性研究。由于vacuolins的毒性比CQ小得多且其對細胞的效果是可逆的，vacuolins對小鼠的毒性比CQ小得多。

本發(fā)明還提供有關(guān)vacuolins在正常小鼠或大鼠中的藥代動力學(xué)研究。測定vacuolins在胃內(nèi)(口服)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給予后的血濃度。此外，在vacuolins與肝微粒體孵育后測定vacuolins的代謝產(chǎn)物。與CQ (其顯示單獨的高毒性且其對抗自噬的有效濃度很難在動物模型中達到)比較，本發(fā)明顯示vacuolin-1及其類似物是抗人類癌癥和瘧疾的未來臨床應(yīng)用的更好的先導(dǎo)化合物。

材料和方法

抗體和試劑 – 所用抗體列出如下：LC3 (Novus；1:1000用于蛋白質(zhì)印跡分析(WB))，p62 (Novus；1:500用于免疫熒光分析(IF)和1:1000 WB)，組織蛋白酶-L (BD Bioscience；1:250 WB)，EGFR (Santa Cruz；1:250 WB)，Rab5 (Cell Signaling；1:1000 WB)，GAPDH抗體(Sigma; 1:5000 WB)。Vacuolin-1購自Santa Cruz。巴佛洛霉素A1、氯喹(CQ)和甘氨酰-L-苯丙氨酸-β-萘胺(GPN)購自Sigma-Aldrich。Fura-2 AM、溶酶體示蹤劑綠色DND-189和溶酶體示蹤劑黃色/藍色DND-160購自Invitrogen。

細胞培養(yǎng)– 于5% CO₂和37℃，使HeLa、MCF-7、A549和HepG2細胞(ATCC)維持于DMEM (Invitrogen)加10%胎牛血清(Invitrogen)和100單位/ml的青霉素/鏈霉素(Invitrogen)中。于5% CO₂和37℃，使PC3細胞維持于RPMI (Invitrogen)加10%胎牛血清(Invitrogen)和100單位/ml的青霉素/鏈霉素(Invitrogen)中。

shRNA和慢病毒生產(chǎn)和感染 –在人類Rab5A基因中選擇兩個最優(yōu)21-聚體。在GFP基因中選擇一個21-聚體作為對照。然后將這些序列克隆到pLKO.1載體中用于表達shRNA。生產(chǎn)和感染如前所述進行(Lu et al., 2013)。

細胞內(nèi)Ca²⁺測量 – 使細胞在24-孔板中，以7x10⁴細胞/孔的密度在常規(guī)培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜并于室溫下用4μM Fura-2 AM (Invitrogen)在常規(guī)HBSS中標記30 min。然后細胞用含有2mM EGTA的無鈣HBSS洗滌3次并在vacuolin-1的存在或不存在下，于室溫培養(yǎng)另外10 min。細胞被放在奧林巴斯(Olympus)倒置落射熒光顯微鏡的鏡臺上并使用20x物鏡觀察。熒光圖像通過在340 nm和380 nm交替激發(fā)，以及設(shè)置在510 nm的發(fā)射來獲得。圖像由CCD照相機每3或6秒采集并經(jīng)細胞R (Cell R)成像軟件分析。

蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光染色分析 – 兩種測定如前所述進行(Lu et al., 2013)。

透射電子顯微鏡(TEM)的細胞準備 - 用于TEM的細胞準備如前所述進行(Mi et al., 2007)。

MTT細胞增殖測定 - 細胞按4個重復(fù)份處理并接種到96-孔板上。在藥物處理后，對于每100 μl培養(yǎng)基將20 μl的MTT溶液加入到各孔中并培養(yǎng)2小時，接著向各孔加入150 μL的DMSO溶液。最終的反應(yīng)產(chǎn)物，一種紫色甲臜(formazan)溶液，用微孔板讀出儀(Techan infinite M200)以570 nm的波長處的吸光度和630 nm的參考波長檢測。

溶酶體pH測量 - 通常使用溶酶體示蹤劑綠色DND-189測量酸性細胞器，例如溶酶體的pH，其在酸性環(huán)境中變得熒光更強。簡言之，在37℃在預(yù)熱常規(guī)培養(yǎng)基中，用1μM溶酶體示蹤劑綠色DND-189加載細胞20 min。然后細胞用PBS洗滌兩次并立即用流式細胞術(shù)(收集FL1熒光并對每個樣品收集10,000個細胞)或在微孔板讀出儀(激發(fā)/發(fā)射 = 485/530 nm)分析。

使用比率計量的溶酶體pH染料溶酶體示蹤劑黃色/藍色DND-160，進行溶酶體pH的定量。pH校準曲線如先前所描述地生成(Bankers-Fulbright et al., 2004)。簡言之，細胞經(jīng)胰蛋白酶消化并于37℃用2 μM溶酶體示蹤劑黃色/藍色DND-160在常規(guī)培養(yǎng)基中標記30 min，并用PBS洗掉過量的染料。標記的細胞用10 μM莫能菌素和10 μM尼日利亞菌素在25mM 2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)校準緩沖液(pH 3.5-6.0)中處理10 min，所述緩沖液含有5 mM NaCl、115 mM KCl和1.2 mM MgSO4。定量比較在96-孔板中進行，而熒光用微孔板讀出儀于37℃測量。分別測量響應(yīng)于340和380nm激發(fā)的在440和535nm發(fā)射的光。用340和380nm激發(fā)而發(fā)射的光的比率針對MES緩沖液的pH值作圖，而對于熒光探針的pH校準曲線從使用微軟軟件(Microsoft Excel)的作圖生成。

V-ATPase測定 -于27℃，天蛾(M. sexta) (鱗翅目(Lepidoptera)，天蛾科(Sphingidae))第五齡幼蟲，體重6-8 g，在長日照條件下(16 h的光照)，使用舞毒蛾(gypsy moth)食物(MP Biomedicals, Germany)飼養(yǎng)。V₁V_O全酶的純化如前所述進行(Huss et al., 2002)。以最終的體積160 μL并在pH 8.1下，按一式三份進行活性測定。測定包含3 μg純化的V₁V₀全酶、50 mM Tris-Mops、3 mM 2-巰基乙醇、1 mM MgCl₂、20 mM KCl、0.003% C₁₂E₁₀、20 mM NaCl和3 mM Tris-HCl。于30℃孵育10 min (有或無抑制劑)后，加入1 mM Tris-ATP，于30℃孵育2 min后，通過在液氮中冷凍樣品停止反應(yīng)。無機磷如先前所述測定(Wieczorek et al., 1990)。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)下拉測定 – 收集細胞并在前述的冰冷的EBC溶胞緩沖液中溶胞。溶胞產(chǎn)物通過于4℃以13,000g離心10 min澄清，于4℃使來自各上清液的等量蛋白質(zhì)(500μg)與30μl結(jié)合于30μl谷胱甘肽–瓊脂糖珠的GST-R5BD在轉(zhuǎn)動攪拌器上孵育1h。隨后洗滌珠并再懸浮于標準SDS-樣品緩沖液中，沸騰并經(jīng)受SDS-PAGE (15%凝膠)，接著用抗-Rab5 mAb免疫印跡分析。

統(tǒng)計學(xué)分析 – 數(shù)據(jù)表示為均值±S.E.M。差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性通過單向ANOVA或Student's t-檢驗估算。P<0.05被認為是顯著的。

實施例

實施例1.小化學(xué)物質(zhì)vacuolin-1作為自噬抑制劑通過在HeLa細胞中抑制自噬體-溶酶體融合發(fā)揮功能。

由許多可獲得的自噬化學(xué)調(diào)節(jié)劑缺乏有效性或者特異性的事實提示(Kimura et al., 2013)，建立基于熒光圖像的測定以篩選影響自噬的小分子。HeLa細胞，一種有自噬能力的細胞系，用攜帶編碼RFP-GFP-LC3 (tfLC3)的表達盒的慢病毒感染(Kimura et al., 2007)。因此，LC3-II陽性自噬體用顯示為黃色色斑的GFP和RFP兩種信號標記，并且在與溶酶體融合后，自吞溶酶體僅顯示為紅色色斑，因為GFP在酸性pH中失去其熒光。如在圖2中所示，饑餓大大地誘導(dǎo)僅僅黃色和紅色兩種色斑的增加，細胞還用巴佛洛霉素(BAF)，一種阻斷自噬體與溶酶體融合的液泡質(zhì)子泵抑制劑(Yamamoto et al., 1998)，或CQ (顯著地誘導(dǎo)僅僅黃色色斑的積聚)處理，表明自噬在自噬體(autophagasomes)被阻止。這些數(shù)據(jù)表明表達RFP-GFP-LC3的Hela細胞可用來監(jiān)測自噬的進展。

其次，可對市售獲得的和先前已表明影響囊泡運輸或細胞器形態(tài)學(xué)的一組小化學(xué)物質(zhì)進行選擇并對其在表達tfLC3的HeLa細胞中的自噬調(diào)節(jié)的效果進行篩選(數(shù)據(jù)未示出)。一個小化學(xué)物質(zhì)，vacuolin-1，有效地誘導(dǎo)LC3黃色色斑，而不是紅色色 (圖3A)。類似地，蛋白質(zhì)印跡分析證實了在用vacuolin-1處理的細胞中脂化的LC3-II顯著地增加。p62，一種自噬底物(Bjorkoy et al., 2006)，也在用vacuolin-1處理的細胞中積聚，提示vacuolin-1抑制自噬體和溶酶體之間的融合(圖3B)。事實上，GFP-LC3色斑在vacuolin-1處理的細胞中大大增加且不與Lamp1共定位(co-localize)，這與用BAF處理的細胞類似(圖3C)。此外，在電子顯微鏡下，大量的自噬空泡在vacuolin-1處理的維持在正常培養(yǎng)條件下的HeLa細胞中觀察到(圖3D)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，vacuolin-1，類似于BAF或CQ，阻斷自噬體和自吞溶酶體之間的融合，從而導(dǎo)致LC3-II陽性自噬體的聚集，以實現(xiàn)其自噬抑制的效果。

實施例2.Vacuolin-1有效地和可逆地抑制自噬，但顯示很少的細胞毒性。

Vacuolin-1是細胞-可滲透的和水溶性的三嗪基化合物。先前已報道，vacuolin-1誘導(dǎo)內(nèi)體和溶酶體的快速同型融合，以形成大而腫脹的結(jié)構(gòu)，但它沒有干擾細胞的細胞骨架網(wǎng)絡(luò)(Cerny et al., 2004；Huynh和Andrews, 2005；Shaik et al., 2009)。令人驚訝的是，vacuolin-1在抑制自噬方面比CQ有效至少10倍(圖4A和5)，但它比CQ在多種類型的細胞中顯示出更少的細胞毒性(圖4B和6)。有趣的是，自噬體和溶酶體之間的融合阻斷從培養(yǎng)基中除去vacuolin-1后3小時被完全解除(圖4C)。類似地，vacuolin-1誘導(dǎo)的內(nèi)體或溶酶體之間的同型融合在vacuolin-1除去后被恢復(fù)(數(shù)據(jù)未示出)。這些數(shù)據(jù)表明，vacuolin-1對自噬抑制或同型融合的作用是可逆的。

實施例3.Vacuolin-1堿化溶酶體pH并降低溶酶體Ca²⁺含量。

探索了作為vacuolin-1誘導(dǎo)的自噬停止的基礎(chǔ)的機制。由于溶酶體pH對于融合是重要的(Lu et al., 2013)和溶酶體經(jīng)vacuolin-1處理而擴大(Cerny et al., 2004；Huynh和Andrews, 2005；Shaik et al., 2009)，已檢查vacuolin-1是否影響在這些擴大的溶酶體中的溶酶體pH。溶酶體示蹤劑綠色DND-189 (pK_a = ~ 5.2)被首次應(yīng)用于定量測量溶酶體pH (Davis-Kaplan et al., 2004)。溶酶體示蹤劑綠色DND-189透過細胞膜并在酸性胞內(nèi)細胞器中積聚，且其熒光在酸性或堿性環(huán)境中分別增加或降低。如在圖4D中所示，vacuolin-1處理升高HeLa細胞中的溶酶體pH。溶酶體pH經(jīng)定量的比例計量的溶酶體示蹤劑黃色/藍色DND-160 (DePedro和Urayama, 2009)染色的細胞進一步量化并發(fā)現(xiàn)在vacuolin-1處理的HeLa細胞中的溶酶體pH從對照細胞的pH 4.7增加至pH 5.2 (圖4E)。因此，明顯的是，vacuolin-1堿化溶酶體pH。

因為溶酶體也是一種主要的細胞內(nèi)Ca²⁺庫，且Ca²⁺和質(zhì)子在溶酶體中是緊密偶聯(lián)的(Morgan et al., 2011)，也評價了vacuolin-1處理是否影響溶酶體Ca²⁺含量。細胞用甘氨酰-l-苯丙氨酸2-萘胺(GPN)處理選擇性破壞溶酶體膜(Jadot et al., 2001)，從而釋放溶酶體Ca²⁺(Srinivas et al., 2002)。如在圖4F中所示，用vacuolin-1預(yù)處理細胞顯著地降低GPN誘導(dǎo)的溶酶體Ca²⁺釋放的能力，提示vacuolin-1也降低溶酶體Ca²⁺水平。

實施例4.Vacuolin-1抑制HeLa細胞中的一般內(nèi)體-溶酶體降解。

由于溶酶體pH的增加通常減弱溶酶體活性，評價了vacuolin-1是否影響一般的溶酶體抑制自噬成熟的功能。組織蛋白酶L從前體形式到其成熟形式的處理通常被用作溶酶體活性的標記物，且已發(fā)現(xiàn)將組織蛋白酶L加工成其成熟形式在vacuolin-1處理的HeLa細胞中不受影響，但vacuolin-1的確明顯地增加組織蛋白酶L的不成熟形式的水平(圖7A)。其次，進行上皮生長因子受體(EGFR)降解測定以檢查vacuolin-1是否影響一般的內(nèi)體-溶酶體途徑。在這個測定中，在vacuolin-1的存在或不存在下用EGF處理HeLa細胞。在EGF結(jié)合于其受體(EGFR)后，受體復(fù)合物經(jīng)歷內(nèi)吞作用并被靶向溶酶體以供降解。如在圖7B中所示，vacuolin-1抑制EGF-觸發(fā)的EGFR降解。有趣的是，EGFR通常被內(nèi)化，但含有EGFR的內(nèi)體不能與溶酶體融合；這解釋了EGFR在vacaulin-1處理的細胞中的積聚(圖7C)。類似地，DQ-BSA-綠降解測定被應(yīng)用以測量一般內(nèi)體-溶酶體降解。DQ-BSA-綠是用自-猝滅熒光染料標記的BSA。在DQ-BSA-綠經(jīng)由內(nèi)吞作用傳遞至溶酶體后，其被溶酶體蛋白酶水解為單一染料-標記的肽，從而減輕自-猝滅，而熒光可隨后被流式細胞術(shù)監(jiān)測。如在圖7D中所示，vacuolin-1顯著地抑制BSA被溶酶體的降解，然而DQ-BSA-綠存在于內(nèi)體中，但不能傳遞至溶酶體(數(shù)據(jù)未示出)?？偟膩碚f，這些結(jié)果支持vacuolin-1抑制一般的內(nèi)體-溶酶體降解，這可能是由于堿化的溶酶體pH阻止了內(nèi)體與溶酶體的融合。

實施例5. 需要Rab5用于vacuolin-1誘導(dǎo)的自噬停止和內(nèi)體融合。

雖然vacuolin-1增加溶酶體pH，vacuolin-1在體外對V-ATPase活性僅有很少的影響(圖8A)。vacuolin-1也誘導(dǎo)內(nèi)體或溶酶體的同型融合，而Rab5 (一種小的GTPase)，對內(nèi)體融合是必要的(Zeigerer et al., 2012)。因此，已檢查vacuolin-1是否激活Rab5以間接地改變?nèi)苊阁wpH。事實上，vacuolin-1顯著地激活Rab5，如由GST-標記的Rabaptin5下拉測定所示的，其特異性地與Rab5-GTP，而不是Rab5-GDP相互作用(圖8B) (Liu et al., 2007)。Rab5A敲除始終顯著地降低vacuolin-1誘導(dǎo)的LC3-II和p62二者的積聚(圖8C)。類似地，Rab5A的顯性負形式(Rab5A-DN)的過度表達阻斷vacuolin-1誘導(dǎo)的自噬停止和同型融合，而Rab5A的組成型形式(Rab5A-CA)的過度表達(Bohdanowicz et al., 2012)增強vacuolin-1誘導(dǎo)的自噬停止和同型融合的能力(圖8D)。有趣的是，Rab5A-CA單獨的過度表達也阻斷自噬體-溶酶體融合，從而誘導(dǎo)LC3-II和p62的積聚(圖8E和8F)。值得注意的是，Rab5A-DN表達或Rab5A敲除不影響?zhàn)囸I-誘導(dǎo)的自噬(圖9和10)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Rab5A對于vacuolin-1誘導(dǎo)的自噬停止是需要的。

實施例6. Vacuolin-1顯著地抑制人類鼻咽癌的集落形成和遷移。

雖然CQ已被應(yīng)用于治療廣譜的人類癌癥，CQ誘導(dǎo)眼部或腎毒性并容易引發(fā)耐藥性(Kimura et al., 2013)。因此，發(fā)明人評價vacuolin-1是否顯示出任何抗-腫瘤能力和是否其可像CQ一樣增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。發(fā)明人首先調(diào)查vacuolin-1在兩種鼻咽癌細胞系，CNE-1和HONE-1中的抗-腫瘤效果。如在圖16A中所示，vacuolin-1單獨治療在CNE-1或HONE-1細胞中顯示很少的細胞毒性。令人驚訝地，vacuolin-1與幾種臨床抗-腫瘤藥物，例如紫杉醇、5-FU和坦羅莫司組合也幾乎不顯示出對抑制腫瘤細胞增殖的協(xié)同效果(圖16A和數(shù)據(jù)未示出)?；蛘?，進行集落形成測定以評價vacuolin-1是否影響單一腫瘤細胞生長成集落的能力。如在圖16B中所示，vacuolin-1極大地減少從單一CNE-1或HONE-1細胞生成的集落的大小和數(shù)目。發(fā)明人隨后進行傷口愈合測定以評價vacuolin-1是否影響腫瘤細胞的遷移。引人注目的是，vacuolin-1有效地抑制CNE-1和HONE-1細胞二者的遷移，如通過vacuolin-1處理誘導(dǎo)腫瘤細胞運動的顯著下降的觀察所揭示的(圖16C和數(shù)據(jù)未示出)。同樣，vacuolin-1顯著地抑制CNE-1和HONE-1細胞的遷移和侵襲性(圖16D, 圖16E，且數(shù)據(jù)未示出)。明顯地，vacuoin-1是體外有效的抗-腫瘤劑。

實施例7. Vacuolin-1在體外顯著地抑制人肺癌干細胞(LCSC)的集落形成和遷移。

癌癥干細胞(CSC)，一種在腫瘤內(nèi)的細胞亞群，實際上推動腫瘤的生長和復(fù)發(fā)。CSC對許多目前的癌癥治療，包括化學(xué)-和輻射療法有抵抗，因此它們可以在這些療法中生存，以再生新的腫瘤。已顯示CSC具有干細胞特征，例如自我更新、抗壓和抗藥性，以及增強的遷移，所有這些已涉及疾病的復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移(Gupta et al., 2009)。因此，評價vacuolin-1對于CSC的抗-腫瘤作用具有很大的意義。事實上，vacuolin-1在人類肺癌干細胞(hLCSC)中對自噬的抑制作用的有效性為其它腫瘤細胞系的1/10 (圖17A)，且vacuolin-1不影響hLCSC的細胞增殖(圖17B)。同樣，vacuolin-1 (> 10μM)幾乎完全抑制hLCSC的集落形成、遷移、侵襲和腫瘤球形成(圖17C-17F)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明，vacuolin-1可有效地抑制肺癌干細胞體外的致瘤潛力。

實施例8. Vacuolin-1顯著地抑制裸鼠的腫瘤生長。

由vacuolin-1在體外有效地抑制人類鼻咽癌細胞和人類肺癌干細胞的遷移和集落形成能力的事實所支持，發(fā)明人檢查了vacuolin-1在異種移植物小鼠模型中抑制腫瘤進展的能力。發(fā)明人首先評價vacuolin-1在BALB/c裸小鼠中抑制LCSC腫瘤異種移植物的能力。簡言之，使1×10⁴肺癌干細胞(LCSC，第3代)以1:1的比例懸浮于Matrigel (BD Biosciences)中，并將200 ìL細胞皮下注射到裸小鼠的背上。腫瘤體積在注射后每5天測量并從下式計算：長度 × 寬度 × 深度 × π /6。當小鼠的腫瘤體積超過2000 mm³時，將它們從研究中排除(圖18A)。如在圖18A中所示，腫瘤內(nèi)注射vacuolin-1 (5 mg/kg)一周兩次顯著地抑制LCSC異種移植物在裸鼠中的腫瘤生長，但對體重增加具有很少的影響。如所期望，vacuolin-1治療顯著地抑制在腫瘤中的自噬(圖18B)。發(fā)明人也測試了vacuolin-1在小鼠中的急性毒性。在年輕的成年小鼠中腹膜內(nèi)注射vacuolin-1 (250 mg/kg)顯示出很少的急性毒性，因為藥物注射的小鼠與對照比較，在兩周后顯示出正?；钚院腕w重增加(圖18C)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，vacuolin-1是在體內(nèi)具有可耐受毒性的有前景的抗-腫瘤劑。

參考文獻