以ASCII文本文件(名稱：2159_441PC02_SequenceListing_ST25.txt；大?。?23,500字節(jié)；以及創(chuàng)建日期：2015年1月9日)形式電子提交的序列表的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。

發(fā)明背景

甲型血友病(Haemophilia A)是一種由編碼凝血因子VIII(FVIII)的基因的缺陷引起的流血病癥，并且影響萬分之一至萬分之二的男性出生者。Graw等,Nat.Rev.Genet.6(6):488-501(2005)。受甲型血友病影響的患者可以輸注純化或重組產(chǎn)生的FVIII加以治療。然而，已知所有可商購獲得的FVIII產(chǎn)品的半衰期都是約8-12小時，從而要求頻繁向患者進(jìn)行靜脈內(nèi)施用。參見Weiner M.A.和Cairo,M.S.,Pediatric Hematology Secrets,Lee,M.T.,12.Disorders of Coagulation,Elsevier Health Sciences,2001；Lillicrap,D.Thromb.Res.122增刊4:S2-8(2008)。此外，已嘗試許多方法來延長FVIII半衰期。舉例來說，用以延長凝結(jié)因子的半衰期的處于開發(fā)中的方法包括聚乙二醇化、糖聚乙二醇化和與白蛋白綴合。參見Dumont等,Blood.119(13):3024-3030(2012年1月13日在線發(fā)表)。然而，無論所用蛋白質(zhì)工程改造如何，當(dāng)前在開發(fā)中的長效FVIII產(chǎn)品據(jù)報(bào)道具有有限半衰期-在臨床前動物模型中僅約1.5至2小時。參見同上。已在人中證明一致結(jié)果，例如據(jù)報(bào)道相較于rFVIIIFc在甲型血友病患者中的半衰期改進(jìn)多達(dá)約1.7倍。參見同上。因此，盡管存在微小改進(jìn)，但半衰期增加可指示存在其它T1/2限制因素。參見Liu,T.等,2007ISTH會議,摘要#P-M-035；Henrik,A.等,2011ISTH會議,摘要#P＝MO-181；Liu,T.等,2011ISTH會議摘要#P-WE-131。

血漿范威爾邦德因子(von Willebrand Factor，VWF)的半衰期是約16小時(在13至18小時的范圍內(nèi))。Goudemand J等J Thromb Haemost 2005；3:2219–27。VWF半衰期可受以下許多因素影響：糖基化樣式、ADAMTS-13(具有血栓反應(yīng)素(thrombospondin)基序-13的解整合素(disintegrin)和金屬蛋白酶)和VWF中的各種突變。

在血漿中，95-98％的FVIII以與全長VWF的緊密非共價復(fù)合物形式循環(huán)。這個復(fù)合物的形成對于維持體內(nèi)FVIII的適當(dāng)血漿水平是重要的。Lenting等,Blood.92(11):3983-96(1998)；Lenting等,J.Thromb.Haemost.5(7):1353-60(2007)。全長野生型FVIII主要以具有重鏈(MW 200kD)和輕鏈(MW 73kD)的異二聚體形式存在。當(dāng)FVIII由于在重鏈中的位置372和740處以及在輕鏈中的位置1689處的蛋白水解而活化時，結(jié)合于FVIII的VWF被從活化FVIII移除。活化FVIII連同活化因子IX、鈣和磷脂一起(“因子X活化酶復(fù)合物(tenase complex)”)誘導(dǎo)因子X活化，從而產(chǎn)生大量凝血酶。凝血酶轉(zhuǎn)而接著裂解纖維蛋白原以形成可溶性纖維蛋白單體，所述單體接著自發(fā)聚合以形成可溶性纖維蛋白聚合物。凝血酶也活化因子XIII，因子XIII連同鈣一起用于交聯(lián)和穩(wěn)定化可溶性纖維蛋白聚合物，從而形成交聯(lián)(不溶性)纖維蛋白?；罨疐VIII通過蛋白水解從循環(huán)快速清除。

歸因于頻繁給藥和由給藥時程引起的不便，所以仍然需要開發(fā)要求較小施用頻率的FVIII產(chǎn)品，即半衰期長于半衰期限制1.5至2倍的FVIII產(chǎn)品。

發(fā)明簡述

本發(fā)明提供一種嵌合蛋白，其包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含融合于第一免疫球蛋白(“Ig”)恒定區(qū)或其一部分的因子VIII(“FVIII”)蛋白，和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含含有VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的范威爾邦德因子(“VWF”)蛋白，所述VWF蛋白通過在之間的XTEN序列融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分，其中所述XTEN序列含有小于288個氨基酸殘基，并且其中所述第一多肽與所述第二多肽連接或締合。某些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中第二多肽中的XTEN序列由長度在12個氨基酸與287個氨基酸之間的氨基酸序列組成。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中相較于包含第一多肽和第二多肽的相應(yīng)融合蛋白，其中所述融合蛋白的第二多肽包含含有至少288個氨基酸的XTEN序列，所述嵌合蛋白展現(xiàn)較長半衰期。一些實(shí)施方案包括含有至少288個氨基酸的XTEN序列AE288。在一些實(shí)施方案中，AE288是SEQ ID NO:8。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中第二多肽的XTEN序列含有約36、約42、約72或約144個氨基酸。在一些實(shí)施方案中，第二多肽的XTEN序列選自AE42、AE72、AE144、AG42、AG72或AG144。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中第二多肽的XTEN序列選自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；或SEQ ID NO:63。

在某些實(shí)施方案中，第一多肽進(jìn)一步包含使FVIII蛋白與第一Ig恒定區(qū)或其一部分連接的第二XTEN序列。也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中第一多肽包含插入在FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處的第三XTEN序列。在一些實(shí)施方案中，第一多肽進(jìn)一步包含插入在FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處的第二XTEN序列。在某些實(shí)施方案中，第一多肽包含使FVIII蛋白與第一Ig恒定區(qū)或其一部分連接的第三XTEN序列。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中第二XTEN序列、第三XTEN序列、或第二XTEN序列和第三XTEN序列各自獨(dú)立地選自AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288和AG144。在一些實(shí)施方案中，第二XTEN序列、第三XTEN序列、或第二XTEN序列和第三XTEN序列各自獨(dú)立地選自SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；或SEQ ID NO:63。在某些實(shí)施方案中，第二XTEN序列、第三XTEN序列、或第二XTEN序列與第三XTEN序列兩者各自獨(dú)立地是AE288或AG288。在一些實(shí)施方案中，通過接頭使第二多肽中的XTEN序列融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分。在某些實(shí)施方案中，接頭是可裂解接頭。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中接頭可由選自以下的蛋白酶裂解：因子XIa、因子XIIa、胰舒血管素(kallikrein)、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2(Elastase-2)、粒酶-B(Granzyme-B)、TEV、腸激酶(Enterokinase)、蛋白酶3C、分選酶A(Sortase A)、MMP-12、MMP-13、MMP-17和MMP-20。在一些實(shí)施方案中，接頭可由因子IIa(凝血酶)裂解。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中接頭包含一個或多個包含選自以下的氨基酸序列的裂解位點(diǎn)：RRRR(SEQ ID NO:102)、RKR RKR(SEQ ID NO:103)、RRRRS(SEQ ID NO:104)、TQSFNDF TR(SEQ ID NO:1)、SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:3)、DFLAEGG GVR(SEQ ID NO:4)、TTKIKPR(SEQ ID NO:5)、LVPRG(SEQ ID NO:6)、ALRPR(SEQ ID NO:7)、KLTRAET(SEQ ID NO:121)、DFTRVVG(SEQ ID NO:122)、TMTRIVGG(SEQ ID NO:123)、SPFRSTGG(SEQ ID NO:124)、LQVRIVGG(SEQ ID NO:125)、PLGRIVGG(SEQ ID NO:126)、IEGRTVGG(SEQ ID NO:127)、LTPRSLLV(SEQ ID NO:128)、LGPVSGVP(SEQ ID NO:129)、VAGDSLEE(SEQ ID NO:130)、GPAGLGGA(SEQ ID NO:131)、GPAGLRGA(SEQ ID NO:132)、APLGLRLR(SEQ ID NO:133)、PALPLVAQ(SEQ ID NO:134)、ENLYFQG(SEQ ID NO:135)、DDDKIVGG(SEQ ID NO:136)、LEVLFQGP(SEQ ID NO:137)、LPKTGSES(SEQ ID NO:138)、DKNTGDYYEDSYEDISAY LLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:88)和IEPRSFS(SEQ ID NO:194)。在一些實(shí)施方案中，接頭包含TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWED EEK(SEQ ID NO:146)。在某些實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含氨基酸序列LVPRG(SEQ ID NO:6)。在其它實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含氨基酸序列IEPRSFS(SEQ ID NO:194)。在其它實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含氨基酸序列IEPRSFS(SEQ ID NO:194)，其中所述裂解位點(diǎn)不是FVIII的全長a2區(qū)。在一些實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包括FVIII的a2區(qū)的包含至少序列IEPR(SEQ ID NO:200)的片段。在其它實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包括FVIII的a2區(qū)的包含至少序列IEPR(SEQ ID NO:200)的片段，其中所述裂解位點(diǎn)不是全長a2區(qū)。在某些實(shí)施方案中，在如本文提供或如本領(lǐng)域中已知的凝血酶裂解測定中，裂解位點(diǎn)是可裂解的。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中所述第一Ig恒定區(qū)或其一部分包含第一Fc區(qū)和/或第二Ig恒定區(qū)或其一部分包含第二Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，第一Ig恒定區(qū)或其一部分和第二Ig恒定區(qū)或其一部分使嵌合蛋白的半衰期延長。在一些實(shí)施方案中，第一多肽和第二多肽通過接頭融合。在某些實(shí)施方案中，第一多肽和第二多肽通過可加工接頭融合。在一些實(shí)施方案中，第一Ig恒定區(qū)或其一部分與第二Ig恒定區(qū)或其一部分締合。在某些實(shí)施方案中，第一Ig恒定區(qū)或其一部分通過共價鍵與第二Ig恒定區(qū)或其一部分締合。在一些實(shí)施方案中，共價鍵是二硫鍵。

也公開包含下式(a)-(hh)中的每一個的嵌合蛋白：

(a)FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V；

(b)FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2；

(c)F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V；

(d)F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2；

(e)FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V；

(f)FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2；

(g)FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V；

(h)FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2；

(i)F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V；

(j)F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2；

(k)V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1；

(l)V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII；

(m)F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V；

(n)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V；

(o)FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2；

(p)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V；

(q)F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII；

(r)F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1；

(s)V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1；

(t)V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2)；

(u)F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V；

(v)F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2；

(w)FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2；

(x)FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V；

(y)F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2)；

(z)F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1；

(aa)V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1；

(bb)V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII；

(cc)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V；

(dd)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2；

(ee)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1；

(ff)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V；

(gg)F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII；或

(hh)F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2；

其中V是VWF蛋白，其包含D’結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，X或X1是含有小于288個氨基酸的第一XTEN序列，X2是第二XTEN序列，F(xiàn)VIII包括FVIII蛋白，F(xiàn)VIII(X2)包括具有插入在FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)中的第二XTEN序列的FVIII蛋白，F(xiàn)1是第一Ig恒定區(qū)或其一部分，F(xiàn)2是第二Ig恒定區(qū)或其一部分，L1、L2、L3、L4或L5是任選接頭，(-)是肽鍵；并且(:)是共價鍵或非共價鍵。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中X或X1由長度在12個氨基酸與287個氨基酸之間的氨基酸序列組成。

在某些實(shí)施方案中，相較于包含所述式，例外之處是X或X1是AE288的相應(yīng)嵌合蛋白，如本文所述的嵌合蛋白展現(xiàn)較長半衰期。在一些實(shí)施方案中，AE288是SEQ ID NO:8。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中式中X或X1含有約36、約42、約72或約144個氨基酸。在某些實(shí)施方案中，式中X或X1選自AE42、AE72、AE144、AG42、AG72或AG144。在一些實(shí)施方案中，式中X或X1選自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；或SEQ ID NO:63。在某些實(shí)施方案中，X2包含長度是至少約36個氨基酸、至少約42個氨基酸、至少約144個氨基酸、至少約288個氨基酸、至少約576個氨基酸、至少約864個氨基酸的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，X2選自AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288和AG144。在一些實(shí)施方案中，X2選自SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；或SEQ ID NO:63。在某些實(shí)施方案中，X2是AE288或AG288。

也公開如本文所述的包含X或X1和/或X2的嵌合蛋白，其相較于不包含X或X1和/或X2的嵌合蛋白展現(xiàn)較長半衰期。在一些實(shí)施方案中，L1和/或L2是可裂解接頭。在某些實(shí)施方案中，L4和/或L5是可裂解接頭。在某些實(shí)施方案中，接頭可由選自以下的蛋白酶裂解：因子XIa、因子XIIa、胰舒血管素、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、粒酶-B、TEV、腸激酶、蛋白酶3C、分選酶A、MMP-12、MMP-13、MMP-17和MMP-20。在一些實(shí)施方案中，接頭可由因子IIa(凝血酶)裂解。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中接頭包含一個或多個包含選自以下的氨基酸序列的裂解位點(diǎn)：RRRR(SEQ ID NO:102)、RKRRKR(SEQ ID NO:103)、RRRRS(SEQ ID NO:104)、TQSFNDFTR(SEQ ID NO:2)、SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:3)、DFLAEGGGVR(SEQ ID NO:4)、TTKIKPR(SEQ ID NO:5)、LV PRG(SEQ ID NO:6)、ALRPR(SEQ ID NO:7)、KLTRAET(SEQ ID NO:121)、DFTRVVG(SEQ ID NO:122)、TMTRIVGG(SEQ ID NO:123)、SPFRSTGG(SEQ ID NO:124)、LQVRIVGG(SEQ ID NO:125)、PLGRIVGG(SEQ ID NO:126)、IEGRTVGG(SEQ ID NO:127)、LTPRSLLV(SEQ ID NO:128)、LGPVSGVP(SEQ ID NO:129)、VAGDSLEE(SEQ ID NO:130)、GPAGLGGA(SEQ ID NO:131)、GPAGLRGA(SEQ ID NO:132)、APLGLRLR(SEQ ID NO:133)、PALPLVAQ(SEQ ID NO:134)、ENLYFQG(SEQ ID NO:135)、DDDKIVGG(SEQ ID NO:136)、LEVLFQGP(SEQ ID NO:137)和LPKTGSES(SEQ ID NO:138)。在一些實(shí)施方案中，接頭包含TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO:146)。在某些實(shí)施方案中，接頭包含氨基酸序列LVPRG(SEQ ID NO:6)。在一些實(shí)施方案中，接頭包括FVIII的a1區(qū)、FVIII的a2區(qū)、FVIII的a3區(qū)或其任何組合。在某些實(shí)施方案中，接頭包括FVI II的a2區(qū)的片段。在一些情況下，a2區(qū)的片段可包含序列DKNTG DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:88)。在其它實(shí)施方案中，可使用FVIII的a2區(qū)的較小片段，包括具有序列IEPR SFS(SEQ ID NO:194)的片段。在一個特定實(shí)施方案中，接頭包含氨基酸序列IEPRSFS(SEQ ID NO:194)。在另一實(shí)施方案中，接頭包含氨基酸序列IEPRSFS(SEQ ID NO:194)，其中接頭不是FVIII的全長a2區(qū)。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中FVIII的a2區(qū)包含與ISDK NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:106)或DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:88)至少約80％、約85％、約90％、約95％或100％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，a1區(qū)包含與ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(SEQ ID NO:107)至少約80％、約85％、約90％、約95％或100％同一的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，a3區(qū)包含與ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ(SEQ ID NO:108)至少約80％、約85％、約90％、約95％或100％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)1包含第一Fc區(qū)和/或F2包含第二Fc區(qū)。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中相較于不包含F(xiàn)1和F2的嵌合蛋白，包含F(xiàn)1和F2的嵌合蛋白展現(xiàn)較長半衰期。在某些實(shí)施方案中，L3是可加工接頭。在一些實(shí)施方案中，VWF蛋白通過非共價鍵與FVIII蛋白締合。在一些實(shí)施方案中，相較于無VWF蛋白和/或XTEN序列的FVIII蛋白或相較于野生型FVIII，嵌合蛋白的半衰期被延長。在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白的半衰期比無VWF蛋白或XTEN序列的FVIII蛋白或比野生型FVIII延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中嵌合蛋白的半衰期是至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。在一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白在HemA小鼠中的半衰期是約40小時。在某些實(shí)施方案中，VWF蛋白不實(shí)質(zhì)上結(jié)合VWF清除受體。在一些實(shí)施方案中，VWF蛋白能夠保護(hù)FVIII蛋白免遭一種或多種蛋白酶裂解，保護(hù)FVIII蛋白免遭活化，使FVIII蛋白的重鏈和/或輕鏈穩(wěn)定，或防止FVIII蛋白被一種或多種清道夫受體清除。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中VWF蛋白通過遮蔽或阻斷FVIII蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)來抑制或防止內(nèi)源性VWF結(jié)合FVIII蛋白。在某些實(shí)施方案中，VWF結(jié)合位點(diǎn)位于FVIII蛋白的A3結(jié)構(gòu)域或C2結(jié)構(gòu)域、或A3結(jié)構(gòu)域與C2結(jié)構(gòu)域兩者中。在一些實(shí)施方案中，VWF結(jié)合位點(diǎn)包含對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1669至1689以及2303至2332的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，第一Ig恒定區(qū)或其一部分和第二Ig恒定區(qū)或其一部分是相同的或不同的。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白連接于和/或插入有至少兩個XTEN序列、至少三個XTEN序列、至少四個XTEN序列、至少五個XTEN序列或至少六個XTEN序列。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中FVIII蛋白包含F(xiàn)VIII的一個或多個選自以下的結(jié)構(gòu)域：A1結(jié)構(gòu)域、a1酸性區(qū)、A2結(jié)構(gòu)域、a2酸性區(qū)、B結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域、a3酸性區(qū)、C1結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、其一個或多個片段及其任何組合。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中FVIII蛋白中的一個或多個插入位點(diǎn)位于FVIII蛋白的一個或多個選自以下的結(jié)構(gòu)域內(nèi)：A1結(jié)構(gòu)域、a1酸性區(qū)、A2結(jié)構(gòu)域、a2酸性區(qū)、A3結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域及其任何組合，或位于FVIII蛋白的一個或多個選自由以下組成的組的結(jié)構(gòu)域之間：A1結(jié)構(gòu)域和a1酸性區(qū)、a1酸性區(qū)和A2結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和a2酸性區(qū)、a2酸性區(qū)和B結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域和A3結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域和C1結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域及其任何組合，或位于FVIII蛋白的選自以下的兩個結(jié)構(gòu)域之間：A1結(jié)構(gòu)域和a1酸性區(qū)、a1酸性區(qū)和A2結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和a2酸性區(qū)、a2酸性區(qū)和B結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域和A3結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域和C1結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域及其任何組合。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白中的一個或多個插入位點(diǎn)是一個或多個選自由表7、表8、表9和表10中的氨基酸殘基組成的組的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白中的插入位點(diǎn)位于緊靠對應(yīng)于成熟FVIII蛋白(SEQ ID NO:65)的氨基酸745的下游。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白中的插入位點(diǎn)位于緊靠對應(yīng)于成熟FVIII蛋白(SEQ ID NO:65)的殘基1656和殘基1900的下游。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白中的插入位點(diǎn)緊靠對應(yīng)于成熟FVIII蛋白(SEQ ID NO:65)的殘基26、1656和1900的下游。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白中的插入位點(diǎn)緊靠對應(yīng)于成熟FVIII蛋白(SEQ ID NO:65)的殘基403和745的下游。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白中的插入位點(diǎn)緊靠對應(yīng)于成熟FVIII蛋白(SEQ ID NO:65)的殘基745和1900的下游。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白中的插入位點(diǎn)緊靠對應(yīng)于成熟FVIII蛋白(SEQ ID NO:65)的殘基18和745的下游。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白是雙鏈FVIII亞型。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白是單鏈FVIII亞型。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白包含B結(jié)構(gòu)域或其一部分。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白是SQ B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中單鏈FVIII亞型在對應(yīng)于以下的殘基處含有至少一個氨基酸取代：對應(yīng)于全長成熟因子VIII多肽(SEQ ID NO:65)的殘基1648、殘基1645或兩個殘基或SQ BDD因子VIII(SEQ ID NO:67)的殘基754、殘基751或兩個殘基。在某些實(shí)施方案中，氨基酸取代是除精氨酸以外的氨基酸。在一些實(shí)施方案中，雙鏈FVIII亞型包含含有FVIII的重鏈的第一鏈和含有FVIII的輕鏈的第二鏈，其中所述重鏈和所述輕鏈通過金屬鍵彼此締合。在某些實(shí)施方案中，D'結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO:21的氨基酸764至866至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，D3結(jié)構(gòu)域包含與SEQ ID NO:21的氨基酸867至1240至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，VWF蛋白是單體。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其包含至少兩個VWF蛋白、至少三個VWF蛋白、至少四個VWF蛋白、至少五個VWF蛋白或至少六個VWF蛋白。在某些實(shí)施方案中，VWF蛋白包含與SEQ ID NO:21的氨基酸764至1240至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，VWF蛋白基本上由以下組成或由以下組成：SEQ ID NO:21的氨基酸764至1240。在某些實(shí)施方案中，VWF蛋白在對應(yīng)于SEQ ID NO:21的殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142兩者的殘基處含有至少一個氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，VWF蛋白含有取代對應(yīng)于SEQ ID NO:21的殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142兩者的殘基的除半胱氨酸以外的氨基酸。在某些實(shí)施方案中，VWF蛋白進(jìn)一步包含VWF的D1結(jié)構(gòu)域、D2結(jié)構(gòu)域、或D1和D2結(jié)構(gòu)域。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中VWF蛋白進(jìn)一步包含選自以下的VWF結(jié)構(gòu)域：A1結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域、D4結(jié)構(gòu)域、B1結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、CK結(jié)構(gòu)域、其一個或多個片段及其任何組合。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中VWF蛋白基本上由以下組成或由以下組成：(1)VWF的D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；(2)VWF的D1、D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；(3)VWF的D2、D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；(4)VWF的D1、D2、D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；或(5)VWF的D1、D2、D'、D3和A1結(jié)構(gòu)域或其片段。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的嵌合蛋白，其中VWF蛋白進(jìn)一步包含VWF或FVIII的可操作地連接于VWF蛋白的信號肽。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中一個或多個接頭的長度是至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，一個或多個接頭的長度是約1至約2000個氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，一個或多個接頭包括gly/ser肽。在一些實(shí)施方案中，gly/ser肽具有式(Gly₄Ser)_n(SEQ ID NO:94)或S(Gly₄Ser)_n(SEQ ID NO:164)，其中n是選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10組成的組的正整數(shù)。在某些實(shí)施方案中，(Gly₄Ser)_n接頭是(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:100)或(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO:165)。在一些實(shí)施方案中，接頭包含20個氨基酸、35個氨基酸、48個氨基酸、73個氨基酸或95個氨基酸。在某些實(shí)施方案中，可裂解接頭是SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGG(SEQ ID NO:166)。

在一些實(shí)施方案中，如本文所述的嵌合蛋白是聚唾液酸化、聚乙二醇化或羥乙基淀粉化的。

也公開如本文所述的嵌合蛋白，其中第一多肽包括與FVIII161(SEQ ID NO:69)、FVIII169(SEQ ID NO:70)、FVIII173(SEQ ID NO:72)、FVIII195(SEQ ID NO:73)、FVIII196(SEQ ID NO:74)、FVIII199(SEQ ID NO:75)、FVIII201(SEQ ID NO:76)、FVIII203(SEQ ID NO:77)、FVIII204(SEQ ID NO:78)、FVIII205(SEQ ID NO:79)、FVIII266(SEQ ID NO:80)、FVIII267(SEQ ID NO:81)、FVIII268(SEQ ID NO:82)、FVIII269(SEQ ID NO:83)、FVIII271(SEQ ID NO:84)、FVIII272(SEQ ID NO:85)或FVIII282(SEQ ID NO:159)至少約80％、90％、95％、99％或100％同一，并且第二多肽包括與VWF057(SEQ ID NO:152)或VWF059(SEQ ID NO:197)至少約80％、90％、95％、99％或100％同一。在一些實(shí)施方案中，第一多肽包含F(xiàn)VIII169(SEQ ID NO:70)，并且第二多肽包含VWF057(SEQ ID NO:152)。在其它實(shí)施方案中，第一多肽包含F(xiàn)VIII169(SEQ ID NO:70)，并且第二多肽包含VWF059(SEQ ID NO:197)。在另一實(shí)施方案中，第一多肽包含F(xiàn)VIII169(SEQ ID NO:70)，并且第二多肽包含VWF062(SEQ ID NO:199)。在一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白有效預(yù)防和/或阻止從有需要的受試者流血。

也公開編碼如本文所述的嵌合蛋白的一種多核苷酸或一組多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，如本文所述的多核苷酸進(jìn)一步包含編碼PC5或PC7的多核苷酸鏈。

一些實(shí)施方案包括一種載體，其包含如本文所述的多核苷酸和一種或多種可操作地連接于所述多核苷酸或所述一組多核苷酸的啟動子。

在一些實(shí)施方案中，如本文所述的載體進(jìn)一步包括包含編碼PC5或PC7的多核苷酸鏈的另外的載體。

也公開一種包含如本文所述的多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞選自HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞和BHK細(xì)胞。

也公開一種藥物組合物，其包含如本文所述的嵌合蛋白、多核苷酸、載體或宿主細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體。在一些實(shí)施方案中，相較于野生型FVIII蛋白，嵌合蛋白具有延長的半衰期。在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白的半衰期比野生型FVIII延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。

一些實(shí)施方案包括如本文所述的組合物，其中嵌合蛋白的半衰期是至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白在HemA小鼠中的半衰期是約40小時。在一些實(shí)施方案中，通過選自由以下組成的組的途徑施用如本文所述的組合物：局部施用、眼內(nèi)施用、胃腸外施用、鞘內(nèi)施用、硬膜下施用和口服施用。在某些實(shí)施方案中，胃腸外施用是靜脈內(nèi)或皮下施用。

在一些實(shí)施方案中，如本文所述的組合物用于治療有需要的受試者的流血疾病或病狀。在某些實(shí)施方案中，流血疾病或病狀選自由以下組成的組：流血凝血病癥、關(guān)節(jié)積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸流血、顱內(nèi)出血、腹內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)流血、咽后隙中流血、腹膜后隙中流血、髂腰肌鞘中流血及其任何組合。在一些實(shí)施方案中，受試者預(yù)定經(jīng)受手術(shù)。在某些實(shí)施方案中，治療是防治性的或按需進(jìn)行。

也公開一種延長或增加嵌合蛋白的半衰期的方法，其中所述方法包括向有需要的受試者添加有效量的如本文所述的嵌合蛋白、多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞或組合物，其中VWF蛋白、XTEN序列、第一Ig恒定區(qū)或其一部分和第二Ig恒定區(qū)或其一部分使嵌合蛋白的半衰期增加。

一些實(shí)施方案包括一種治療有需要的受試者的流血疾病或病癥的方法，其包括施用有效量的如本文所述的嵌合蛋白、多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞或組合物，其中所述流血疾病或病癥選自由以下組成的組：流血凝血病癥、關(guān)節(jié)積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸流血、顱內(nèi)出血、腹內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)流血、咽后隙中流血、腹膜后隙中流血和髂腰肌鞘中流血。在一些實(shí)施方案中，受試者是動物。在某些實(shí)施方案中，動物是人。在一些實(shí)施方案中，受試者正罹患甲型血友病。在某些實(shí)施方案中，治療是防治性的或按需進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，有效量是0.1μg/kg至500mg/kg。

也公開一種如本文所述的方法，其中通過選自由以下組成的組的途徑施用如本文所述的嵌合蛋白、多核苷酸、載體、宿主細(xì)胞或組合物：局部施用、眼內(nèi)施用、胃腸外施用、鞘內(nèi)施用、硬膜下施用和口服施用。在某些實(shí)施方案中，胃腸外施用選自由以下組成的組：靜脈內(nèi)施用、皮下施用、肌肉內(nèi)施用和皮內(nèi)施用。

一些實(shí)施方案包括一種制備嵌合蛋白的方法，其包括用如本文所述的多核苷酸或載體轉(zhuǎn)染一種或多種宿主細(xì)胞，以及在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述嵌合蛋白。在一些實(shí)施方案中，如本文所述的方法進(jìn)一步包括分離嵌合蛋白。在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白有效阻止和/或預(yù)防受試者的流血。

附圖簡述

圖1顯示嵌合蛋白的示意圖，所述嵌合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含融合于Fc區(qū)的FVIII蛋白(A1-A2-部分或完全B-A3-C1-C2)，其中XTEN插入在所述FVIII蛋白內(nèi)的插入位點(diǎn)處；和第二多肽，所述第二多肽包含含有D’D3結(jié)構(gòu)域的VWF蛋白、具有小于288個氨基酸的XTEN、凝血酶可裂解接頭和第二Fc區(qū)。XTEN插入在FVIII蛋白中和/或融合于VWF蛋白通過增加流體動力學(xué)半徑以及通過阻斷受體介導(dǎo)的清除來延長嵌合蛋白的半衰期。VWF的D’D3結(jié)構(gòu)域阻斷FVIII與內(nèi)源性VWF相互作用，使FVIII蛋白穩(wěn)定，并且延長嵌合蛋白的半衰期。Fc結(jié)構(gòu)域可使D’D3結(jié)構(gòu)域與FVIII蛋白共價連接，并且通過FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)路徑來延長嵌合蛋白的半衰期。凝血酶可裂解接頭使得能夠在FVIII活化后釋放D’D3結(jié)構(gòu)域，并且確保FVIII與VWF的D’D3結(jié)構(gòu)域之間的正確對齊。

圖2顯示FVIII-XTEN-Fc:D’D3-XTEN-Fc異二聚體的三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)：第一質(zhì)粒包含編碼單鏈FVIII-XTEN-Fc的核苷酸序列，其中XTEN插入B結(jié)構(gòu)域中；第二質(zhì)粒包含編碼D1D2D’D3-XTEN-Fc的核苷酸序列，其中XTEN序列包含小于288個氨基酸；并且第三質(zhì)粒包含編碼PACE(一種原肽加工酶)的核苷酸序列。當(dāng)三種多肽從三種質(zhì)粒表達(dá)時，VWF的D1D2原肽結(jié)構(gòu)域可通過細(xì)胞內(nèi)加工來從D’D3結(jié)構(gòu)域加以加工。所得復(fù)合物含有三種產(chǎn)物，第一分子是FVIII-XTEN/D’D3異二聚體，第二分子是副產(chǎn)物，即D’D3-XTEN-Fc的同二聚體，并且第三分子是另一副產(chǎn)物，即FVIII(XTEN)-Fc。

圖3顯示XTEN插入物對異二聚體的半衰期延長的累加作用。FVIII169包含融合于Fc區(qū)的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII蛋白，其中XTEN序列(例如AE288)插入在對應(yīng)于成熟全長FVIII的氨基酸745處。FVIII205包含融合于Fc區(qū)的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII蛋白，其中XTEN序列(例如AE144)插入在對應(yīng)于成熟全長FVIII的氨基酸18處，并且另一XTEN序列(例如AE288)插入在對應(yīng)于成熟全長FVIII的氨基酸745處。VWF031包含通過凝血酶可裂解接頭融合于Fc區(qū)的VWF的D’結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域(無XTEN)。VWF034包含融合于AE288和Fc區(qū)的VWF的D’結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域。FVIII169/VWF031(倒三角)在HemA小鼠中的半衰期是16.7小時；FVIII205/VWF031(圓圈)在HemA小鼠中的半衰期是29.4小時；并且FVIII169/VWF034(方塊)在HemA小鼠中的半衰期是31.1小時。

圖4顯示當(dāng)插入在VWF的D’D3結(jié)構(gòu)域與Fc結(jié)構(gòu)域之間時，AE144XTEN比AE288XTEN賦予更佳半衰期延長。舉例來說，盡管VWF169/VWF034(方塊)在HemA小鼠中的半衰期是31.1.小時，但FVIII169/VWF057(圓圈)在HemA小鼠中的半衰期是42小時。VWF057包含融合于AE144和Fc區(qū)的VWF的D’D3結(jié)構(gòu)域。

圖5顯示Fc結(jié)構(gòu)域?yàn)榍逗系鞍桩惗垠w的半衰期延長所需。當(dāng)將FVIII205/VWF031(圓圈)在HemA小鼠中的半衰期與在FcRn結(jié)合位點(diǎn)處含有突變(IHH三重突變Fc)并且因此不能通過FcRn路徑再循環(huán)的FVIII263/VWF050(方塊)的半衰期進(jìn)行比較時，F(xiàn)VIII263/VWF050的半衰期(23小時)短于VWF205/VWF031的半衰期(29.4小時)。這指示Fc區(qū)為半衰期延長所必需。

圖6A顯示在HemA小鼠尾部鉗夾模型中，F(xiàn)VIII-XTEN-Fc/D’D 3-XTEN-Fc異二聚體相較于B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII(SQ BDD FVIII)的類似急性功效。在75IU/kg下對小鼠給藥，并且通過aPTT測定來測量活性。SQ BDD FVIII顯示為圓圈，而FVIII169/VWF034顯示為方塊，F(xiàn)VIII169/VWF057顯示為菱形，并且媒介物顯示為倒三角。FVIII169、VWF034和VWF057的構(gòu)建體細(xì)節(jié)顯示在本文其它地方。圖6B顯示在37.5IU/kg劑量下，F(xiàn)VIII169/VWF034與B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII(SQ BDD FVIII)在HemA小鼠中的急性功效的比較，并且通過aPTT測定來測量活性。各治療組中小鼠的中值失血(uL)由水平線指示，C57/BL6小鼠中的失血(uL)顯示為中空三角；在37.5IU/kg的rBDD-FVIII給藥之后的失血(uL)顯示為中空圓圈；在37.5IU/kg的FVIII169/VWF034給藥之后的失血(uL)顯示為中空方塊，并且在媒介物給藥之后的失血(uL)顯示為倒三角。

圖7A-B顯示rFVIII169/VWF057異二聚體在尾部靜脈橫切流血模型中對HemA小鼠提供較長久保護(hù)。圖7A顯示在尾部損傷之前72小時接受rFVIII169/VWF057(方塊)、在尾部損傷之前48小時接受SQ BDD-FVIII(菱形)、在尾部損傷之前24小時接受SQ BDD FVIII(倒三角)以及接受媒介物(圓圈)的小鼠中的再流血數(shù)據(jù)。通過aPTT測定來測量活性。X軸顯示以小時計(jì)的時間，并且Y軸顯示非流血者的百分比。圖7B顯示圖7A中所示的四個種類的小鼠中的相應(yīng)存活數(shù)據(jù)。相較于在尾部損傷之前24小時接受SQ BDD FVIII治療的小鼠，在尾部損傷之前72小時接受12IU/kg的FVIII169/VWF057的小鼠顯示關(guān)于再流血和存活的類似保護(hù)。

圖8A顯示在損傷之前96小時接受rFVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體的小鼠中相對于在損傷之前24小時接受rBDD-FVIII的小鼠中的類似再流血數(shù)據(jù)。實(shí)心方塊顯示在損傷之前24小時接受FVIII169/VWF034的小鼠中的再流血數(shù)據(jù)；中空方塊顯示在損傷之前96小時接受FVIII169/VWF034的小鼠中的再流血數(shù)據(jù)；實(shí)心菱形顯示在損傷之前24小時接受FVIII169/VWF057的小鼠中的再流血數(shù)據(jù)；中空菱形顯示在損傷之前96小時接受FVIII169/VWF057的小鼠中的再流血數(shù)據(jù)；實(shí)心圓圈顯示在損傷之前24小時接受rBDD-FVIII的小鼠中的再流血數(shù)據(jù)；中空圓圈顯示在損傷之前48小時接受rBDD-FVIII的小鼠中的再流血數(shù)據(jù)；并且實(shí)心三角顯示接受媒介物的小鼠中的再流血數(shù)據(jù)。X軸顯示以小時計(jì)的時間，并且y軸顯示非流血者的百分比。

圖8B顯示在損傷之前96小時接受rFVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體的小鼠中相對于在損傷之前24小時接受rBDD-FVIII的小鼠中的存活曲線。X軸顯示以小時計(jì)的時間，并且y軸顯示存活百分比。符號與圖8A相同。

圖9顯示代表性FVIII-VWF異二聚體以及FVIII169、FVIII286、VWF057、VWF059和VWF062構(gòu)建體的圖解。舉例來說，F(xiàn)VIII169構(gòu)建體包含融合于Fc區(qū)的具有R1648A取代的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII蛋白，其中XTEN序列(例如AE288)插入在對應(yīng)于成熟全長FVIII的氨基酸745處(A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-Fc)。FVIII286構(gòu)建體包含融合于Fc區(qū)的具有R1648取代的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII蛋白，其中XTEN序列(例如AE288)插入在對應(yīng)于成熟全長FVIII的氨基酸745處，在FVIII與Fc之間具有另外的a2區(qū)(A1-a1-A2-a2-288XTEN-a3-A3-C1-C2-a2-Fc)。VWF057是一種VWF-Fc融合構(gòu)建體，其包含通過包含LVPRG凝血酶位點(diǎn)(“LVPRG”；SEQ ID NO:6)和GS接頭(“GS”)的VWF接頭連接于Fc區(qū)的VWF蛋白的D'D3結(jié)構(gòu)域(在D'D3結(jié)構(gòu)域中具有兩個氨基酸取代，即C336A和C379A)，其中XTEN序列(即AE144)插入在D'D3結(jié)構(gòu)域與VWF接頭之間(D'D3-144XTEN-GS+LVPRG-Fc)。VWF059是一種VWF-Fc融合構(gòu)建體，其包含通過FVIII的酸性區(qū)2(a2)作為VWF接頭連接于Fc區(qū)的VWF蛋白的D'D3結(jié)構(gòu)域(在D'D3結(jié)構(gòu)域中具有兩個氨基酸取代，即C336A和C379A)，其中XTEN序列(即AE144)插入在D'D3結(jié)構(gòu)域與VWF接頭之間。VWF062是一種VWF-Fc融合構(gòu)建體，其包含連接于Fc區(qū)的VWF蛋白的D'D3結(jié)構(gòu)域(在D'D3結(jié)構(gòu)域中具有兩個氨基酸取代，即C336A和C379A)，其中XTEN序列(即AE144)插入在D'D3結(jié)構(gòu)域與Fc區(qū)之間(D'D3-144XTEN-Fc)。

圖10顯示表示FVIII/VWF異二聚體構(gòu)建體，例如FVIII169/VWF057、FVIII169/VWF059、FVIII169/VWF059A和FVIII169/VWF073的示意圖。箭頭顯示添加任選接頭以引入凝血酶裂解位點(diǎn)所處的位點(diǎn)。FVIII169/VWF057具有包含LVPRG(SEQ ID NO:6)的接頭。FVIII169/VWF059具有包含F(xiàn)VIII a2區(qū)(即ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNADKTH(SEQ ID NO:106))的接頭。FVIII169/VWF059A具有包含截短FVIII a2區(qū)(即DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNADKTH(SEQ ID NO:88))的接頭。FVIII169/VWF073在VWF073構(gòu)建體(SEQ ID NO:175)內(nèi)具有包含F(xiàn)VIII a2區(qū)的由IEPRSFS(SEQ ID NO:194)組成的片段的接頭。

圖11A-C顯示在凝血酶消化FVIII169/VWF057和FVIII-Fc對照之后的SDS-PAGE圖像。圖11A顯示用抗D3抗體(AB 96340)對SDS-PAGE凝膠的染色。箭頭突出“LCFc:D'D3-XTEN-Fc”，其是未裂解的全長FVIII169/VWF057；和“D'D3-144 XTEN”，其是在由凝血酶裂解之后的所得片段。圖11B顯示用抗HC抗體(GMA012)對SDS-PAGE凝膠的染色。箭頭突出FVIII重鏈(“HC”)和FVIII A2結(jié)構(gòu)域。圖11C顯示圖A和B的重疊圖。在各圖的頂部指示的時間點(diǎn)收集樣品。箭頭指向相關(guān)蛋白質(zhì)。

圖12A-C顯示在凝血酶消化FVIII169/VWF059之后的SDS-PAGE圖像。圖12A顯示用抗D3抗體(AB 96340)對SDS-PAGE凝膠的染色。箭頭突出“LCFc:D'D3-XTEN-Fc，”其是未裂解的全長FVIII169/VWF059；和“D'D3-144 XTEN，”其是在由凝血酶裂解之后的所得片段。圖12B顯示用抗HC抗體(GMA012)對SDS-PAGE凝膠的染色。箭頭突出未裂解的全長FVIII169/VWF059；D'D3-144 XTEN-a3，其是在由凝血酶裂解之后的所得片段；和“A2，”其是FVIII的A2結(jié)構(gòu)域。圖12C顯示圖A和B的重疊圖。在各圖的頂部指示的時間點(diǎn)收集樣品。

圖13顯示相較于用BDD-FVIII對照(方塊)治療的HemA小鼠，用FVIII169/VWF059(圓圈)治療的HemA小鼠的急性功效數(shù)據(jù)。在尾部鉗夾之后測量失血值。p＝0.9883。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及一種包含兩個多肽的嵌合蛋白，第一多肽包含融合于第一Ig恒定區(qū)的FVIII蛋白，并且第二多肽包含通過XTEN序列融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分的VWF蛋白，其中所述XTEN序列含有小于288個氨基酸。

I.定義

應(yīng)注意術(shù)語“一”實(shí)體是指一個或多個那個實(shí)體；例如“一核苷酸序列”應(yīng)理解為表示一個或多個核苷酸序列。因此，術(shù)語“一”、“一個(種)或多個(種)”和“至少一個(種)”在本文中可互換使用。

此外，當(dāng)在本文中使用時，“和/或”應(yīng)視為特定公開兩個指定特征或組分中的每一個，伴有或不伴有另一個。因此，如本文在諸如“A和/或B”的短語中所用的術(shù)語“和/或”意圖包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨(dú))和“B”(單獨(dú))。同樣，如諸如“A、B和/或C”的短語中所用的術(shù)語“和/或”意圖涵蓋以下方面中的每一個：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨(dú))；B(單獨(dú))；和C(單獨(dú))。

應(yīng)了解每當(dāng)在本文中以措辭“包含”描述各個方面的情況下，也提供以“由…組成”和/或“基本上由…組成”描述的另外類似方面。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與由本公開所相關(guān)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。舉例來說，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修訂版,2000,Oxford University Press提供技術(shù)人員以本公開中使用的許多術(shù)語的綜合詞典。

單位、前綴和符號以它們的Système International de Unites(SI)接受形式表示。數(shù)值范圍包括界定范圍的數(shù)值。除非另外指示，否則氨基酸序列以氨基至羧基定向從左至右書寫。本文提供的標(biāo)題并非是對本公開的各個方面的限制，所述各個方面可通過參考說明書整體而得到。因此，通過參考說明書整體，以下緊接著定義的術(shù)語被更充分闡釋。

術(shù)語“約”在本文中用于意指近似、大致、大約或在...左右。當(dāng)術(shù)語“約”與數(shù)值范圍聯(lián)合使用時，它通過使邊界延伸高于和低于闡述的數(shù)值來修飾那個范圍。一般來說，術(shù)語“約”可通過向上或向下(增高或降低)變化例如10％來修飾數(shù)值高于和低于陳述的值。

術(shù)語“多核苷酸”或“核苷酸”意圖涵蓋單個核酸以及多個核酸，并且是指分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸包含常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(例如酰胺鍵，諸如見于肽核酸(PNA)中)。術(shù)語“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一個或多個核酸區(qū)段，例如DNA或RNA片段。就“分離的”核酸或多核苷酸來說，其意指已從它的天然環(huán)境移除的核酸分子DNA或RNA。舉例來說，出于本發(fā)明的目的，載體中含有的編碼因子VIII多肽的重組多核苷酸被視為是分離的。分離的多核苷酸的其它實(shí)例包括維持在異源性宿主細(xì)胞中的重組多核苷酸，或呈溶液形式的從其它多核苷酸純化(部分或?qū)嵸|(zhì)上純化)的重組多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明的多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。本發(fā)明的分離的多核苷酸或核酸進(jìn)一步包括合成產(chǎn)生的所述分子。此外，多核苷酸或核酸可包括調(diào)控元件，諸如啟動子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止信號。

如本文所用，“編碼區(qū)”或“編碼序列”是多核苷酸的由可翻譯成氨基酸的密碼子組成的一部分。盡管“終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)通常不翻譯成氨基酸，但它可被視為編碼區(qū)的一部分，然而任何側(cè)接序列(例如啟動子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等)都不是編碼區(qū)的一部分。編碼區(qū)的邊界通常由在5'末端的起始密碼子(編碼所得多肽的氨基末端)和在3'末端的翻譯終止密碼子(編碼所得多肽的羧基末端)來確定。本發(fā)明的兩個或更多個編碼區(qū)可存在于單一多核苷酸構(gòu)建體中，例如在單一載體上，或存在于單獨(dú)多核苷酸構(gòu)建體中，例如在單獨(dú)(不同)載體上。那么由此可見單一載體可僅含有單一編碼區(qū)，或包含兩個或更多個編碼區(qū)，例如單一載體可單獨(dú)編碼如下所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域A和結(jié)合結(jié)構(gòu)域B。此外，本發(fā)明的載體、多核苷酸或核酸可編碼融合或未融合于編碼本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸的異源性編碼區(qū)。異源性編碼區(qū)包括不限于專門化元件或基序，諸如分泌信號肽或異源性功能性結(jié)構(gòu)域。

由哺乳動物細(xì)胞分泌的某些蛋白質(zhì)與分泌信號肽締合，一旦逐漸增長的蛋白質(zhì)鏈跨越粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的排出已被引發(fā)，所述信號肽即從成熟蛋白質(zhì)裂解。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解信號肽通常融合于多肽的N末端，并且從完全或“全長”多肽裂解以產(chǎn)生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些實(shí)施方案中，使用天然信號肽，或那個序列的保留引導(dǎo)可操作地與它關(guān)聯(lián)的多肽分泌的能力的功能性衍生物?；蛘撸墒褂卯愒葱圆溉閯游镄盘栯?，例如人組織纖維蛋白溶酶原活化因子(tissue plasminogen activator，TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)信號肽或其功能性衍生物。

術(shù)語“下游”在涉及核苷酸序列時意指核酸或核苷酸序列位于參照核苷酸序列的3'。在某些實(shí)施方案中，下游核苷酸序列涉及在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)之后的序列。舉例來說，基因的翻譯起始密碼子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游。術(shù)語“下游”在涉及多肽序列時意指氨基酸或氨基酸插入位點(diǎn)位于參照氨基酸的C末端。舉例來說，緊靠對應(yīng)于成熟野生型FVIII蛋白的氨基酸745的下游的插入位點(diǎn)意指插入位點(diǎn)在對應(yīng)于成熟野生型FVIII蛋白的氨基酸745與氨基酸746之間。

術(shù)語“上游”是指核苷酸序列位于參照核苷酸序列的5'。在某些實(shí)施方案中，上游核苷酸序列涉及位于編碼區(qū)或轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5'側(cè)的序列。舉例來說，大多數(shù)啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游。

如本文所用，術(shù)語“調(diào)控區(qū)”是指位于編碼區(qū)的上游(5'非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3'非編碼序列)，并且影響關(guān)聯(lián)的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄、RNA加工、穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。調(diào)控區(qū)可包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化識別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)物結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。如果編碼區(qū)意圖在真核細(xì)胞中表達(dá)，那么聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列將通常位于編碼序列的3'。

編碼基因產(chǎn)物(例如多肽)的多核苷酸可包括可操作地與一個或多個編碼區(qū)關(guān)聯(lián)的啟動子和/或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件。在一可操作關(guān)聯(lián)中，基因產(chǎn)物(例如多肽)的編碼區(qū)以將所述基因產(chǎn)物的表達(dá)置于調(diào)控區(qū)的影響或控制下的方式與一個或多個調(diào)控區(qū)關(guān)聯(lián)。舉例來說，如果誘導(dǎo)啟動子功能導(dǎo)致編碼由編碼區(qū)編碼的基因產(chǎn)物的mRNA轉(zhuǎn)錄，并且如果啟動子與編碼區(qū)之間的連接的性質(zhì)不干擾啟動子引導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)的能力或不干擾DNA模板被轉(zhuǎn)錄的能力，那么編碼區(qū)和啟動子被“可操作地關(guān)聯(lián)”。除啟動子之外，其它轉(zhuǎn)錄控制元件(例如增強(qiáng)子、操縱子、阻遏子和轉(zhuǎn)錄終止信號)也可可操作地與編碼區(qū)關(guān)聯(lián)以引導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)。

多種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。這些轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括不限于在脊椎動物細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，諸如但不限于來自巨細(xì)胞病毒(立即早期啟動子，與內(nèi)含子-A聯(lián)合)、猿猴病毒40(早期啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)段。其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括源于脊椎動物基因(諸如肌動蛋白(actin)、熱休克蛋白、牛生長激素和兔β-球蛋白)的那些轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，以及能夠控制真核細(xì)胞中的基因表達(dá)的其它序列。另外適合轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動子和增強(qiáng)子以及淋巴因子(lymphokine)誘導(dǎo)性啟動子(例如可由干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動子)。

類似地，多種翻譯控制元件為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。這些翻譯控制元件包括但不限于核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始和終止密碼子、以及源于微小RNA病毒的元件(特別是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)或IRES，也被稱為CITE序列)。

如本文所用的術(shù)語“表達(dá)”是指多核苷酸產(chǎn)生基因產(chǎn)物(例如RNA或多肽)所采用的過程。它包括不限于多核苷酸轉(zhuǎn)錄成信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)或任何其它RNA產(chǎn)物，以及mRNA翻譯成多肽。表達(dá)產(chǎn)生“基因產(chǎn)物”。如本文所用，基因產(chǎn)物可為核酸(例如通過基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使RNA)或從轉(zhuǎn)錄物翻譯的多肽。本文所述的基因產(chǎn)物進(jìn)一步包括具有轉(zhuǎn)錄后修飾(例如聚腺苷酸化或剪接)的核酸、或具有翻譯后修飾(例如甲基化、糖基化、添加脂質(zhì)、與其它蛋白質(zhì)亞單位締合、或蛋白水解裂解)的多肽。

“載體”是指用于將核酸克隆和/或轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中的任何媒介物。載體可為另一核酸區(qū)段可與其連接以便致使所連接區(qū)段復(fù)制的復(fù)制子?！皬?fù)制子”是指在體內(nèi)充當(dāng)自主復(fù)制單元，即能夠在它自身控制下復(fù)制的任何遺傳元件(例如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)。術(shù)語“載體”包括用于在體外、離體或在體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞中的病毒媒介物與非病毒媒介物兩者。本領(lǐng)域中已知并使用許多載體，包括例如質(zhì)粒、修飾的真核病毒或修飾的細(xì)菌病毒。將多核苷酸插入適合載體中可通過將適當(dāng)多核苷酸片段連接至具有互補(bǔ)粘性末端的所選載體中來實(shí)現(xiàn)。

載體可被工程改造以編碼提供對已并有載體的細(xì)胞的選擇或鑒定的可選擇標(biāo)記或報(bào)道體?？蛇x擇標(biāo)記或報(bào)道體的表達(dá)允許鑒定和/或選擇并有且表達(dá)載體上含有的其它編碼區(qū)的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域中已知并使用的可選擇標(biāo)記基因的實(shí)例包括：提供對氨芐青霉素(ampicillin)、鏈霉素(streptomycin)、慶大霉素(gentamycin)、卡那霉素(kanamycin)、潮霉素(hygromycin)、雙丙胺膦(bialaphos)除草劑、磺酰胺等的抗性的基因；以及用作表型標(biāo)記的基因，即花青素(anthocyanin)調(diào)控基因、異戊基轉(zhuǎn)移酶基因等。本領(lǐng)域中已知并使用的報(bào)道體的實(shí)例包括：熒光素酶(Luc)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、-半乳糖苷酶(LacZ)、-葡萄糖醛酸酶(Gus)等?？蛇x擇標(biāo)記也可被視為報(bào)道體。

術(shù)語“質(zhì)?！笔侵溉旧w外元件，其常攜帶不是細(xì)胞的中心代謝的一部分的基因，并且通常呈環(huán)狀雙鏈DNA分子形式。所述元件可為源于任何來源的具有單鏈或雙鏈DNA或RNA的線性、環(huán)狀或超螺旋自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，其中許多核苷酸序列已被接合或重組成能夠?qū)幼悠魏退x基因產(chǎn)物的DNA序列連同適當(dāng)3'非翻譯序列一起引入細(xì)胞中的獨(dú)特構(gòu)造。

可使用的真核病毒載體包括但不限于腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和痘病毒(例如痘苗病毒)載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電荷脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和生物聚合物。

“克隆載體”是指是依序復(fù)制的具有一定單元長度的核酸，并且包含復(fù)制起點(diǎn)的“復(fù)制子”(諸如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒)，另一核酸區(qū)段可與其連接以便致使所連接區(qū)段復(fù)制。某些克隆載體能夠在一種細(xì)胞類型(例如細(xì)菌)中復(fù)制，并且在另一細(xì)胞類型(例如真核細(xì)胞)中表達(dá)。克隆載體通常包含一種或多種可用于選擇包含載體的細(xì)胞的序列和/或一個或多個用于插入目標(biāo)核酸序列的多克隆位點(diǎn)。

術(shù)語“表達(dá)載體”是指被設(shè)計(jì)以使得能夠在插入宿主細(xì)胞中之后表達(dá)插入的核酸序列的媒介物。插入的核酸序列以與如上所述的調(diào)控區(qū)可操作關(guān)聯(lián)的方式放置。

通過本領(lǐng)域中熟知的方法將載體引入宿主細(xì)胞中，所述方法例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE右旋糖苷、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、使用基因槍、或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)體。

如本文所用的“培養(yǎng)”意指在允許細(xì)胞生長或分裂的體外條件下孵育細(xì)胞或以存活狀態(tài)維持細(xì)胞。如本文所用的“培養(yǎng)的細(xì)胞”意指在體外繁殖的細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語“多肽”意圖涵蓋單個“多肽”以及多個“多肽”，并且是指由通過酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)組成的分子。術(shù)語“多肽”是指具有兩個或更多個氨基酸的任何一個或多個鏈，并且不指特定長度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或用于指代具有兩個或更多個氨基酸的一個或多個鏈的任何其它術(shù)語包括在“多肽”的定義內(nèi)，并且術(shù)語“多肽”可替代任何這些術(shù)語加以使用或可與任何這些術(shù)語互換使用。術(shù)語“多肽”也意指具有多肽的表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，所述修飾包括不限于糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、由已知保護(hù)/封閉基團(tuán)達(dá)成的衍生化、蛋白水解裂解、或由非天然存在的氨基酸達(dá)成的修飾。多肽可源于天然生物來源或通過重組技術(shù)產(chǎn)生，但未必從指定核酸序列翻譯。它可以任何方式，包括通過化學(xué)合成產(chǎn)生。

“分離的”多肽或其片段、變體或衍生物是指不在它的天然環(huán)境中的多肽。不要求特定純化水平。舉例來說，分離的多肽可僅從它的天然或自然環(huán)境移除。出于本發(fā)明的目的，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被視為是分離的，已通過任何適合技術(shù)分離、分級分離、或部分或?qū)嵸|(zhì)上純化的天然或重組多肽也被視為是分離的。

本發(fā)明中也包括多肽的片段或變體及其任何組合。術(shù)語“片段”或“變體”在涉及本發(fā)明的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合分子時包括保留參照多肽的至少一些性質(zhì)(例如FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fc變體的FcRn結(jié)合親和力、FVIII變體的凝血活性或VWF片段的FVIII結(jié)合活性)的任何多肽。除在本文其它地方討論的特定抗體片段之外，多肽的片段也包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在的全長多肽(或成熟多肽)。本發(fā)明的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合分子的變體包括如上所述的片段以及氨基酸序列由于氨基酸取代、缺失或插入而改變的多肽。變體可為天然存在的或非天然存在的。非天然存在的變體可使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變異多肽可包含保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。

本文所用的術(shù)語“VWF蛋白”或“VWF蛋白”意指與FVIII相互作用，并且保留至少一種或多種通常由全長VWF對FVIII提供的性質(zhì)的任何VWF片段，所述性質(zhì)例如防止過早活化成FVIIIa，防止過早蛋白水解，防止與磷脂膜進(jìn)行可導(dǎo)致過早清除的締合，防止結(jié)合可結(jié)合裸露FVIII而非VWF結(jié)合的FVIII的FVIII清除受體，和/或使FVIII重鏈和輕鏈相互作用穩(wěn)定。

“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基置換的氨基酸取代。具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族已在本領(lǐng)域中加以定義，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被來自同一側(cè)鏈家族的另一氨基酸置換，那么取代被視為是保守性的。在另一實(shí)施方案中，一串氨基酸可被在側(cè)鏈家族成員的順序和/或組成方面不同的在結(jié)構(gòu)上類似的一串保守置換。

如本領(lǐng)域中所知，通過比較一個多肽的氨基酸序列與第二多肽的序列來確定兩個多肽之間的“序列同一性”。當(dāng)在本文中討論時，任何特定多肽是否與另一多肽至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一可使用本領(lǐng)域中已知的方法和計(jì)算機(jī)程序/軟體來確定，諸如但不限于BESTFIT程序(用于Unix的Wisconsin序列分析包,第8版,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)的局部同源性算法以得到兩個序列之間具有同源性的最佳區(qū)段。當(dāng)使用BESTFIT或任何其它序列比對程序來確定特定序列是否與本發(fā)明的參照序列例如95％同一時，當(dāng)然應(yīng)設(shè)置參數(shù)以使歷經(jīng)參照多肽序列的全長計(jì)算同一性百分比，并且允許同源性空位占參照序列中氨基酸總數(shù)的多達(dá)5％。

如本文所用，通過比對以使第一VWF或FVIII序列與第二VWF或FVIII序列之間的同一性或類似性最大來鑒定VWF序列或FVIII蛋白質(zhì)序列中“對應(yīng)于…的氨基酸”或“等效氨基酸”。用于鑒定第二VWF或FVIII序列中等效氨基酸的編號基于用于鑒定第一VWF或FVIII序列中相應(yīng)氨基酸的編號。

如本文所用，術(shù)語“插入位點(diǎn)”是指FVIII多肽或其片段、變體或衍生物中緊靠可插入異源性部分所處的位置的上游的位置。以某一編號指定“插入位點(diǎn)”，所述編號是成熟天然FVIII(SEQ ID NO:65)中由插入位點(diǎn)所對應(yīng)的氨基酸的編號，所述氨基酸緊靠插入位置的N末端。舉例來說，短語“a3在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656的插入位點(diǎn)處包含XTEN”指示異源性部分位于對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656和氨基酸1657的兩個氨基酸之間。

如本文所用的短語“緊靠氨基酸的下游”是指緊接于所述氨基酸的末端羧基的位置。類似地，短語“緊靠氨基酸的上游”是指緊接于所述氨基酸的末端胺基團(tuán)的位置。因此，如本文所用的短語“在插入位點(diǎn)的兩個氨基酸之間”是指XTEN或任何其它多肽插入在兩個鄰近氨基酸之間所處的位置。因此，短語“緊靠氨基酸的下游插入”和“插入在插入位點(diǎn)的兩個氨基酸之間”與“在插入位點(diǎn)處插入”同義使用。

如本文所用的術(shù)語“插入”、“被插入”、“插入…中”或語法相關(guān)術(shù)語是指相對于天然成熟人FVIII中的類似位置，XTEN在嵌合多肽中的位置。如本文所用，所述術(shù)語是指重組FVIII多肽相對于天然成熟人FVIII的特征，并且不指示、暗示或意指制備嵌合多肽所采用的任何方法或過程。舉例來說，關(guān)于本文提供的嵌合多肽，短語“將XTEN緊靠FVIII多肽的殘基745的下游插入”意指所述嵌合多肽在緊靠對應(yīng)于天然成熟人FVIII中的氨基酸745的氨基酸的下游包含XTEN，其例如由對應(yīng)于天然成熟人FVIII的氨基酸745和746的氨基酸界定。

“融合”或“嵌合”蛋白包含連接于在自然界中它不天然連接的第二氨基酸序列的第一氨基酸序列。通常存在于單獨(dú)蛋白質(zhì)中的氨基酸序列可以融合多肽形式集合在一起，或通常存在于同一蛋白質(zhì)中的氨基酸序列可以新排列放置在融合多肽中，例如本發(fā)明的因子VIII結(jié)構(gòu)域與Ig Fc結(jié)構(gòu)域的融合。例如通過化學(xué)合成，或通過產(chǎn)生并翻譯其中肽區(qū)域以所需關(guān)系被編碼的多核苷酸來產(chǎn)生融合蛋白。嵌合蛋白可進(jìn)一步包含通過共價非肽鍵或非共價鍵與第一氨基酸序列締合的第二氨基酸序列。

如本文所用，術(shù)語“半衰期”是指特定多肽在體內(nèi)的生物半衰期。半衰期可由向受試者施用的一半數(shù)量從動物中的循環(huán)和/或其它組織清除所需的時間表示。當(dāng)構(gòu)建給定多肽隨時間變化的清除曲線時，曲線通常是雙相的，即快速α相和較長β相。α相通常表示施用的Fc多肽在血管內(nèi)間隙與血管外間隙之間達(dá)到平衡，并且部分地由多肽的大小決定。β相通常表示多肽在血管內(nèi)間隙中的分解代謝。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII和包含F(xiàn)VIII的嵌合蛋白是單相的，并且因此不具有α相，而僅具有單一β相。因此，在某些實(shí)施方案中，如本文所用的術(shù)語半衰期是指處于β相的多肽的半衰期。人抗體在人中的典型β相半衰期是21天。

如本文所用的術(shù)語“連接”是指第一氨基酸序列或核苷酸序列分別共價或非共價接合于第二氨基酸序列或核苷酸序列。第一氨基酸或核苷酸序列可直接接合或毗連于第二氨基酸或核苷酸序列，或者間插序列可使第一序列共價接合于第二序列。術(shù)語“連接”不僅意指第一氨基酸序列在C末端或N末端融合于第二氨基酸序列，而且也包括將整個第一氨基酸序列(或第二氨基酸序列)插入第二氨基酸序列(或相應(yīng)地，第一氨基酸序列)中的任何兩個氨基酸中。在一個實(shí)施方案中，第一氨基酸序列可通過肽鍵或接頭連接于第二氨基酸序列。第一核苷酸序列可通過磷酸二酯鍵或接頭連接于第二核苷酸序列。接頭可為肽或多肽(用于多肽鏈)或核苷酸或核苷酸鏈(用于核苷酸鏈)或任何化學(xué)部分(用于多肽鏈與多核苷酸鏈兩者)。術(shù)語“連接”也用連字符(-)指示。

如本文所用，術(shù)語“與…締合”是指在第一氨基酸鏈與第二氨基酸鏈之間形成共價或非共價鍵。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“與…締合”意指共價非肽鍵或非共價鍵。這個締合可用冒號，即(:)指示。在另一實(shí)施方案中，它意指除肽鍵之外的共價鍵。舉例來說，氨基酸半胱氨酸包含可與第二半胱氨酸殘基上的硫醇基團(tuán)形成二硫鍵或二硫橋的硫醇基團(tuán)。在大多數(shù)天然存在的IgG分子中，CH1區(qū)和CL區(qū)通過二硫鍵締合，并且兩個重鏈通過兩個二硫鍵在對應(yīng)于239和242的位置處締合，所述位置使用Kabat編號系統(tǒng)(位置226或229，EU編號系統(tǒng))。共價鍵的實(shí)例包括但不限于肽鍵、金屬鍵、氫鍵、二硫鍵、σ鍵、π鍵、δ鍵、糖苷鍵、抓氫鍵(agnostic bond)、彎曲鍵、偶極鍵、π反向鍵、雙鍵、三鍵、四鍵、五鍵、六鍵、共軛、超共軛、芳香性、哈普托數(shù)(hapticity)或反鍵合。非共價鍵的非限制性實(shí)例包括離子鍵(例如陽離子-π鍵或鹽鍵)、金屬鍵、氫鍵(例如二氫鍵、二氫復(fù)合物、低能障氫鍵或?qū)ΨQ氫鍵)、范德華力(van der Walls force)、倫敦分散力(London dispersion force)、機(jī)械鍵、鹵素鍵、親金性、插入、堆積、熵力或化學(xué)極性。

本文所用的術(shù)語“單體-二聚體雜交物”是指包含通過二硫鍵彼此締合的第一多肽鏈和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中所述第一鏈包含凝結(jié)因子(例如因子VIII)和第一Fc區(qū)，并且所述第二鏈包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：無凝結(jié)因子的第二Fc區(qū)。因此，單體-二聚體雜交物構(gòu)建體是一種雜交物，其包含僅具有一個凝結(jié)因子的單體方面和具有兩個Fc區(qū)的二聚體方面。

如本文所用，術(shù)語“裂解位點(diǎn)”或“酶促裂解位點(diǎn)”是指由酶識別的位點(diǎn)。某些酶促裂解位點(diǎn)包括細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，多肽具有由在凝結(jié)級聯(lián)期間活化的酶裂解的酶促裂解位點(diǎn)，以致所述位點(diǎn)的裂解發(fā)生在凝塊形成的部位處。示例性所述位點(diǎn)包括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa識別的那些。示例性FXIa裂解位點(diǎn)包括例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO:1)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:3)。示例性凝血酶裂解位點(diǎn)包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO:4)、TTKIKPR(SEQ ID NO:5)、LVPRG(SEQ ID NO:6)、ALRPR(SEQ ID NO:7)、ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:106)、DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:88)和IEPRSFS(SEQ ID NO:194)。其它酶促裂解位點(diǎn)在本領(lǐng)域中是已知的，并且描述于本文其它地方。

如本文所用，術(shù)語“加工位點(diǎn)”或“細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn)”是指多肽中的一種類型的酶促裂解位點(diǎn)，其是在所述多肽翻譯之后起作用的酶的靶標(biāo)。在一個實(shí)施方案中，所述酶在從高爾基體腔(Golgi lumen)轉(zhuǎn)運(yùn)至反面高爾基體(trans-Golgi)區(qū)室期間起作用。細(xì)胞內(nèi)加工酶在蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌之前裂解多肽。所述加工位點(diǎn)的實(shí)例包括例如由內(nèi)肽酶的PACE/弗林蛋白酶(furin)(其中PACE是成對堿性氨基酸裂解酶(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)的首字母縮略詞)家族靶向的那些。這些酶定位于高爾基體膜，并且在序列基序Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基末端側(cè)上裂解蛋白質(zhì)。如本文所用，“弗林蛋白酶”家族的酶包括例如PCSK1(也稱為PC1/Pc3)、PCSK2(也稱為PC2)、PCSK3(也稱為弗林蛋白酶或PACE)、PCSK4(也稱為PC4)、PCSK5(也稱為PC5或PC6)、PCSK6(也稱為PACE4)或PCSK7(也稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。其它加工位點(diǎn)在本領(lǐng)域中是已知的。

在包括超過一個加工或裂解位點(diǎn)的構(gòu)建體中，應(yīng)了解所述位點(diǎn)可相同或不同。

術(shù)語“弗林蛋白酶”是指對應(yīng)于EC編號3.4.21.75的酶。弗林蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶樣原蛋白轉(zhuǎn)化酶，其也稱為PACE(成對堿性氨基酸裂解酶)。弗林蛋白酶使非活性前體蛋白質(zhì)的各段缺失以使它們轉(zhuǎn)化成生物活性蛋白質(zhì)。在它的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)期間，VWF的原肽可由弗林蛋白酶從成熟VWF分子裂解。在一些實(shí)施方案中，弗林蛋白酶從VWF的D'D3裂解D1D2。在其它實(shí)施方案中，編碼弗林蛋白酶的核苷酸序列可連同編碼VWF片段的核苷酸序列一起表達(dá)以使D1D2結(jié)構(gòu)域可由弗林蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)裂解去除。

在包括超過一個加工或裂解位點(diǎn)的構(gòu)建體中，應(yīng)了解所述位點(diǎn)可相同或不同。

如本文所用的“可加工接頭”是指包含至少一個在本文其它地方描述的細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn)的接頭。

如本文所用的止血病癥意指特征在于由于形成纖維蛋白凝塊的能力受損或不能形成纖維蛋白凝塊而有自發(fā)出血或由于創(chuàng)傷而出血的傾向的基因遺傳性或獲得性病狀。所述病癥的實(shí)例包括血友病。三種主要形式是甲型血友病(因子VIII缺乏癥)、乙型血友病(因子IX缺乏癥或“克雷司馬斯病(Christmas disease)”)和丙型血友病(因子XI缺乏癥，輕微流血傾向)。其它止血病癥包括例如范威爾邦德??；因子XI缺乏癥(PTA缺乏癥)；因子XII缺乏癥；纖維蛋白原、凝血酶原、因子V、因子VII、因子X或因子XIII缺乏癥或結(jié)構(gòu)異常；伯納德-蘇里爾綜合征(Bernard-Soulier syndrome)，其是一種GPIb缺陷癥或缺乏癥。VWF的受體GPIb可為缺陷性的，并且導(dǎo)致缺乏初級凝塊形成(初級止血)和流血傾向增加、以及格蘭茨曼和內(nèi)格利血小板無力癥(thrombasthenia of Glanzman and Naegeli)(格蘭茨曼血小板無力癥)。在肝衰竭(急性和慢性形式)中，由肝產(chǎn)生的凝血因子存在不足；此可增加流血風(fēng)險。

本發(fā)明的嵌合分子可防治性加以使用。如本文所用，術(shù)語“防治性治療”是指在流血發(fā)作之前施用分子。在一個實(shí)施方案中，需要一般性止血劑的受試者正經(jīng)受或即將經(jīng)受手術(shù)。本發(fā)明的嵌合蛋白可在手術(shù)之前或之后作為防治劑加以施用。本發(fā)明的嵌合蛋白可在手術(shù)期間或之后施用以控制急性流血發(fā)作。手術(shù)可包括但不限于肝移植、肝切除、牙科程序或干細(xì)胞移植。

本發(fā)明的嵌合蛋白也用于按需治療。術(shù)語“按需治療”是指回應(yīng)于流血發(fā)作的癥狀或在可能導(dǎo)致流血的活動之前施用嵌合分子。在一個方面，按需治療可在流血開始時(諸如在損傷之后)或在預(yù)期會流血時(諸如在手術(shù)之前)給予受試者。在另一方面，按需治療可在會增加流血風(fēng)險的活動(諸如接觸性運(yùn)動)之前給予。

如本文所用，術(shù)語“急性流血”是指無論潛伏原因如何的流血發(fā)作。舉例來說，受試者可具有創(chuàng)傷、尿毒癥、遺傳性流血病癥(例如因子VII缺乏癥)、血小板病癥，或由于產(chǎn)生針對凝結(jié)因子的抗體而具有抗性。

如本文所用的治療是指例如減輕疾病或病狀的嚴(yán)重性；降低疾病病程的持續(xù)時間；改善一種或多種與疾病或病狀相關(guān)的癥狀；向患有疾病或病狀的受試者提供有益作用，而未必治愈所述疾病或病狀；或防治一種或多種與疾病或病狀相關(guān)的癥狀。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“治療”意指通過施用本發(fā)明的嵌合蛋白或VWF片段來使受試者中的FVIII谷底水平維持在至少約1IU/dL、2IU/dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、11IU/dL、12IU/dL、13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或20IU/dL。在另一實(shí)施方案中，治療意指維持FVIII谷底水平在以下之間：約1與約20IU/dL、約2與約20IU/dL、約3與約20IU/dL、約4與約20IU/dL、約5與約20IU/dL、約6與約20IU/dL、約7與約20IU/dL、約8與約20IU/dL、約9與約20IU/dL或約10與約20IU/dL。治療疾病或病狀也可包括維持受試者中的FVIII活性在類似于非血友病受試者中的FVIII活性的至少約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的水平下。為治療所需的最小谷底水平可通過一種或多種已知方法測量，并且可針對每個人加以調(diào)整(增加或減少)。

II.嵌合蛋白

本發(fā)明涉及使用融合于XTEN序列的VWF蛋白，通過防止或抑制FVIII半衰期限制因素(即內(nèi)源性VWF)與FVIII蛋白締合來延長嵌合蛋白的半衰期。內(nèi)源性VWF與約95％至約98％的FVIII以非共價復(fù)合物形式締合。盡管內(nèi)源性VWF是FVIII半衰期限制因素，但也已知內(nèi)源性VWF結(jié)合于FVIII蛋白質(zhì)會以各種方式保護(hù)FVIII。舉例來說，全長VWF(呈具有約250kDa的多聚體形式)可保護(hù)FVIII免遭蛋白酶裂解和FVIII活化，使FVIII重鏈和/或輕鏈穩(wěn)定，并且防止FVIII被清道夫受體清除。但同時，內(nèi)源性VWF通過防止胞飲作用以及通過VWF清除路徑從系統(tǒng)清除FVIII-VWF復(fù)合物而限制FVIII半衰期。在不受理論束縛下，據(jù)信內(nèi)源性VWF是阻止融合于半衰期延長物的嵌合蛋白的半衰期比野生型FVIII的半衰期長約兩倍的半衰期限制因素。因此，本發(fā)明涉及使用包含D’結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF蛋白(例如VWF片段)來防止或抑制內(nèi)源性VWF與FVIII蛋白之間的相互作用，以及同時通過使用XTEN序列與Ig恒定區(qū)或其一部分組合來增加所得FVIII蛋白的半衰期。特定來說，本發(fā)明顯示較短XTEN序列(即在長度方面含有小于288個氨基酸的XTEN，即短于288個氨基酸的XTEN)在延長嵌合蛋白的半衰期方面更佳。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種嵌合蛋白，其包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含融合于第一Ig恒定區(qū)或其一部分的FVIII蛋白，和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含含有VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF蛋白，所述VWF蛋白通過在之間的XTEN序列融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分，其中所述XTEN序列含有小于288個氨基酸殘基，并且其中所述第一多肽與所述第二多肽連接或締合。在另一實(shí)施方案中，第二多肽中的XTEN序列由長度在12個氨基酸與287個氨基酸之間的氨基酸序列組成。在其它實(shí)施方案中，相較于包含第一多肽和第二多肽的相應(yīng)融合蛋白，其中第二多肽包含含有至少288個氨基酸的XTEN序列(例如AE288，例如SEQ ID NO:8)，嵌合蛋白展現(xiàn)較長半衰期。在其它實(shí)施方案中，第二多肽中的XTEN序列含有至少約36、至少約42、至少約72或至少約144個氨基酸，但小于288個氨基酸，例如AE42、AE72、AE144(AE144、AE144_2A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_5A、AE144_6B)、AG42、AG72或AG144(AG144、AG144_A、AG144_B、AG144_C、AG144_F)，例如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；或SEQ ID NO:63。

本發(fā)明的嵌合蛋白可進(jìn)一步包含使FVIII蛋白與第一Ig恒定區(qū)或其一部分連接的第二XTEN序列。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種嵌合蛋白，其包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含融合于第一Ig恒定區(qū)或其一部分的FVIII蛋白，和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含含有VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF蛋白，所述VWF蛋白通過在之間的第一XTEN序列融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分，其中所述XTEN序列含有小于288個氨基酸殘基，并且其中所述第一多肽與所述第二多肽連接或締合，并且其中所述第一多肽進(jìn)一步包含插入在所述FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處或融合于所述FVIII蛋白和/或所述第一Ig恒定區(qū)或其一部分的第二XTEN序列。因此，在一個實(shí)施方案中，第二XTEN序列插入在FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處。在另一實(shí)施方案中，第二XTEN序列融合于FVIII蛋白和/或第一Ig恒定區(qū)或其一部分。在其它實(shí)施方案中，第二XTEN序列插入在FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處，并且第三XTEN序列融合于FVIII蛋白和/或第一Ig恒定區(qū)或其一部分。

第二XTEN序列和/或第三XTEN序列可為任何長度的XTEN氨基酸。舉例來說，在本文其它地方公開第二XTEN序列和/或第三XTEN序列，例如AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288和AG144，例如SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；或SEQ ID NO:63。在特定實(shí)施方案中，第二XTEN序列和/或第三XTEN序列是AE288或AG288，例如SEQ ID NO:8或19。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種嵌合蛋白，其包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含通過任選接頭融合于第一Ig恒定區(qū)或其一部分的FVIII蛋白，其中任選XTEN序列(X2)插入在所述FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處或融合于所述FVIII蛋白或所述第一Ig恒定區(qū)或其一部分，和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含含有VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF蛋白，所述VWF蛋白通過在所述VWF蛋白與第二Ig恒定區(qū)或其一部分之間的XTEN序列(X1)融合于所述第二Ig恒定區(qū)或其一部分，其中所述XTEN序列(X1)含有小于288個氨基酸殘基，并且通過接頭融合于所述VWF蛋白，并且其中所述第一多肽和所述第二多肽相締合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種嵌合蛋白，其包含(i)第一多肽，所述第一多肽包含通過任選接頭融合于第一Ig恒定區(qū)或其一部分的FVIII蛋白，其中任選XTEN序列(X2)插入在所述FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處或融合于所述FVIII蛋白或所述第一Ig恒定區(qū)或其一部分，和(ii)第二多肽，所述第二多肽包含含有VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF蛋白，所述VWF蛋白通過在所述VWF蛋白與第二Ig恒定區(qū)或其一部分之間的XTEN序列(X1)融合于所述第二Ig恒定區(qū)或其一部分，其中所述XTEN序列(X1)含有小于288個氨基酸殘基，并且通過接頭融合于所述第二Ig恒定區(qū)或其一部分，并且其中所述第一多肽和所述第二多肽相締合。在其它實(shí)施方案中，使XTEN序列(X1)與VWF蛋白或第二Ig恒定區(qū)或其一部分融合的接頭是可裂解接頭。在本文其它地方顯示可裂解接頭的非限制性實(shí)例。在特定實(shí)施方案中，接頭是凝血酶可裂解接頭。

在一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白是兩個多肽鏈，第一鏈包含上述第一多肽，并且第二鏈包含上述第二多肽。舉例來說，兩個多肽鏈包含(i)第一鏈，其包含單鏈FVIII蛋白、第一Ig恒定區(qū)或其一部分以及插入在所述FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處或融合于所述FVIII蛋白或所述第一Ig恒定區(qū)或其一部分的任選XTEN序列，和(ii)第二鏈，其包含通過在之間的XTEN序列(X1)融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分的VWF蛋白，其中所述XTEN序列(X1)含有小于288個氨基酸。

在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白是兩個多肽鏈，第一鏈包含F(xiàn)VIII蛋白的重鏈，并且第二鏈從N末端至C末端包含F(xiàn)VIII蛋白的輕鏈、插入在所述FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處或融合于所述FVIII蛋白或第一Ig恒定區(qū)或其一部分的任選XTEN序列以及第一Ig恒定區(qū)或其一部分、任選接頭(例如可加工接頭)、VWF蛋白、XTEN序列(X1)、第二任選接頭(例如可裂解接頭)和第二Ig恒定區(qū)或其一部分。

在其它實(shí)施方案中，嵌合蛋白是三個多肽鏈，(i)第一鏈包含F(xiàn)VIII蛋白的重鏈，(ii)第二鏈包含F(xiàn)VIII蛋白的輕鏈、第一Ig恒定區(qū)或其一部分以及插入在所述FVIII蛋白的所述重鏈或所述輕鏈內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處或融合于所述FVIII蛋白或所述第一Ig恒定區(qū)或其一部分的任選XTEN序列，以及(iii)第三鏈包含通過在之間的XTEN序列(X1)融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分的VWF蛋白，其中所述第一鏈和所述第二鏈通過例如金屬鍵的非共價鍵締合，并且所述第二鏈和所述第三鏈通過例如二硫鍵的共價鍵締合。

在其它實(shí)施方案中，嵌合蛋白是單鏈，其從N末端至C末端包含單鏈FVIII蛋白、插入在所述FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處或融合于所述FVIII蛋白或第一Ig恒定區(qū)或其一部分的任選XTEN序列以及第一Ig恒定區(qū)或其一部分、任選接頭(例如可加工接頭)、VWF蛋白、XTEN序列(X1)、第二任選接頭(例如可裂解接頭)和第二Ig恒定區(qū)或其一部分。

在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含下式(a)-(hh)中的一個：

(a)FVIII-F1:F2-L2-X-L1-V；

(b)FVIII-F1:V-L1-X-L2-F2；

(c)F1-FVIII:F2-L2-X-L1-V；

(d)F1-FVIII:V-L1-X-L2-F2；

(e)FVIII-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V；

(f)FVIII-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2；

(g)FVIII(X2)-F1:F2-L2-X1-L1-V；

(h)FVIII(X2)-F1:V-L1-X1-L2-F2；

(i)F1-X2-F1:F2-L2-X1-L1-V；

(j)F1-X2-F1:V-L1-X1-L2-F2；

(k)V-L1-X-L2-F2-L3-FVIII-L4-F1；

(l)V-L1-X-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII；

(m)F1-L4-FVIII-L3-F2-L2-X-L1-V；

(n)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V；

(o)FVIII-L4-F1-L3-V-L1-X-L2-F2；

(p)FVIII-L4-F1-L3-F2-L2-X-L1-V；

(q)F2-L2-X-L1-V-L3-F1-L4-FVIII；

(r)F2-L2-X-L1-V-L3-FVIII-L4-F1；

(s)V-L1-X1-L2-F2-L3-FVIII(X2)-L4-F1；

(t)V-L1-X1-L2-F2-L3-F1-L4-FVIII(X2)；

(u)F1-L4-FVIII(X2)-L3-F2-L2-X1-L1-V；

(v)F-L4-FVIII(X2)-L3-V-L1-X1-L2-F2；

(w)FVIII(X2)-L4-F1-L3-V-L1-X1-L2-F2；

(x)FVIII(X2)-L4-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V；

(y)F2-L2-X1-L1-V-L3-F1-L4-FVIII(X2)；

(z)F2-L2-X1-L1-V-L3-FVIII(X2)-L4-F1；

(aa)V-L1-X2-L2-F2-L3-FVIII-L4-X2-L5-F1；

(bb)V-L1-X2-L2-F2-L3-F1-L5-X2-L4-FVIII；

(cc)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-F2-L2-X2-L1-V；

(dd)F1-L5-X2-L4-FVIII-L3-V-L1-X2-L2-F2；

(ee)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-V-L1-X1-L2-F1；

(ff)FVIII-L5-X2-L4-F2-L3-F1-L2-X1-L1-V；

(gg)F1-L2-X1-L1-V-L3-F2-L4-X2-L5-FVIII；或

(hh)F1-L2-X1-L1-V-L3-FVIII-L5-X2-L4-F2；

其中V是VWF蛋白，其包含D’結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，

X或X1是含有小于288個氨基酸的第一XTEN序列，

X2是第二XTEN序列，

FVIII包括FVIII蛋白，

FVIII(X2)包括具有插入在FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)中的第二XTEN序列的FVIII蛋白，

F1是第一Ig恒定區(qū)或其一部分，

F2是第二Ig恒定區(qū)或其一部分，

L1、L2、L3、L4或L5是任選接頭，

(-)是肽鍵；并且

(:)是共價鍵或非共價鍵。

在一個實(shí)施方案中，X或X1由長度在12個氨基酸與287個氨基酸之間的氨基酸序列組成。在另一實(shí)施方案中，相較于包含其中X或X1是AE288(例如SEQ ID NO:8)的式的相應(yīng)融合蛋白，嵌合蛋白展現(xiàn)較長半衰期。

在其它實(shí)施方案中，式中X或X1含有至少約36、至少約42、至少約72或至少約144個氨基酸，但小于288個氨基酸，例如AE42、AE72、AE144(AE144、AE144_2A、AE144_3B、AE144_4A、AE144_5A、AE144_6B)、AG42、AG72或AG144(AG144、AG144_A、AG144_B、AG144_C、AG144_F)，例如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:55；SEQ ID NO:56；SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:58；SEQ ID NO:59；SEQ ID NO:14；SEQ ID NO:60；SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:62；或SEQ ID NO:63。

在其它實(shí)施方案中，X2包含長度是至少約36個氨基酸、至少42個氨基酸、至少144個氨基酸、至少288個氨基酸、至少576個氨基酸或至少864個氨基酸的氨基酸序列，例如AE42、AE72、AE864、AE576、AE288、AE144、AG864、AG576、AG288或AG144，例如SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:10；SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:11；SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:14。在特定實(shí)施方案中，X2是AE288或AG288，例如SEQ ID NO:8或19。

在某些實(shí)施方案中，相較于無X或X1和/或X2的嵌合蛋白，包含X或X1和/或X2的嵌合蛋白具有延長的半衰期。在其它實(shí)施方案中，L1和/或L2是可裂解接頭。在其它實(shí)施方案中，L4和/或L5是可裂解接頭。

II.A.范威爾邦德因子(VWF)蛋白

VWF(也稱為F8VWF)是一種存在于血漿中，并且在內(nèi)皮(在懷布爾-帕拉德體(Weibel-Palade body)中)、巨核細(xì)胞(血小板的α-顆粒)和內(nèi)皮下結(jié)締組織中組成性產(chǎn)生的大型多聚糖蛋白?；綱WF單體是具有2813個氨基酸的蛋白質(zhì)。每個單體都含有許多具有特定功能的特定結(jié)構(gòu)域，即D'/D3結(jié)構(gòu)域(其結(jié)合因子VIII)、A1結(jié)構(gòu)域(其結(jié)合血小板GPIb受體、肝素和/或可能膠原蛋白)、A3結(jié)構(gòu)域(其結(jié)合膠原蛋白)、C1結(jié)構(gòu)域(其中RGD結(jié)構(gòu)域在這個結(jié)構(gòu)域被活化時結(jié)合血小板整合素(integrin)αIIbβ3)和在蛋白質(zhì)的C末端的“半胱氨酸結(jié)(cysteine knot)”結(jié)構(gòu)域(VWF與血小板源性生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGFβ)和β-人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，βHCG)共有所述結(jié)構(gòu)域)。

在一個實(shí)施方案中，VWF蛋白是VWF片段。如本文所用的術(shù)語“VWF片段”包括但不限于能夠抑制內(nèi)源性VWF結(jié)合FVIII的包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的功能性VWF片段。在一個實(shí)施方案中，VWF片段結(jié)合FVIII蛋白。在另一實(shí)施方案中，VWF片段阻斷FVIII蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)，由此抑制FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF的相互作用。VWF片段包括保留VWF的這些活性的衍生物、變體、突變體或類似物。

人VWF的2813單體氨基酸序列在Genbank中以登記號NP_000543.2加以報(bào)道。編碼人VWF的核苷酸序列在Genbank中以登記號NM_000552.3加以報(bào)道。人VWF的核苷酸序列指定為SEQ ID NO:20。SEQ ID NO:21是全長VWF的氨基酸序列。VWF的各結(jié)構(gòu)域列于表1中。

表1.VWF序列

如本文所用的VWF蛋白可為包含VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF片段，其中所述VWF片段結(jié)合因子VIII(FVIII)，并且抑制內(nèi)源性VWF(全長VWF)結(jié)合FVIII。包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF片段可進(jìn)一步包含選自由以下組成的組的VWF結(jié)構(gòu)域：A1結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域、D1結(jié)構(gòu)域、D2結(jié)構(gòu)域、D4結(jié)構(gòu)域、B1結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、CK結(jié)構(gòu)域、其一個或多個片段及其任何組合。在一個實(shí)施方案中，VWF片段包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：(1)VWF的D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；(2)VWF的D1、D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；(3)VWF的D2、D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；(4)VWF的D1、D2、D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；或(5)VWF的D1、D2、D'、D3和A1結(jié)構(gòu)域或其片段。本文所述的VWF片段不含有結(jié)合VWF清除受體的位點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，本文所述的VWF片段不是SEQ ID NO:21的氨基酸764至1274。本發(fā)明的VWF片段可包含連接于或融合于VWF片段的任何其它序列。舉例來說，本文所述的VWF片段可進(jìn)一步包含信號肽。

在一個實(shí)施方案中，包含D’結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF片段與FVIII蛋白結(jié)合或締合。通過與FVIII蛋白結(jié)合或締合，本發(fā)明的VWF片段保護(hù)FVIII免遭蛋白酶裂解和FVIII活化，使FVIII的重鏈和輕鏈穩(wěn)定，并且防止FVIII被清道夫受體清除。在另一實(shí)施方案中，VWF片段與FVIII蛋白結(jié)合或締合，并且阻斷或防止FVIII蛋白結(jié)合磷脂和活化的蛋白質(zhì)C。通過防止或抑制FVIII蛋白與內(nèi)源性全長VWF結(jié)合，本發(fā)明的VWF片段降低FVIII被VWF清除受體清除，并且因此延長嵌合蛋白的半衰期。因此，嵌合蛋白的半衰期延長是由于缺乏VWF清除受體結(jié)合位點(diǎn)的VWF片段與FVIII蛋白結(jié)合或締合以及由VWF片段遮蔽或保護(hù)FVIII蛋白免遭含有VWF清除受體結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)源性VWF。結(jié)合于VWF片段或由VWF片段保護(hù)的FVIII蛋白也可允許FVIII蛋白再循環(huán)。通過消除全長VWF分子中含有的VWF清除路徑受體結(jié)合位點(diǎn)，本發(fā)明的FVIII/VWF異二聚體被遮蔽免遭VWF清除路徑，從而進(jìn)一步延長FVIII半衰期。

在一個實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的VWF蛋白包含VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，其中所述D'結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:21的氨基酸764至866至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，其中所述VWF蛋白防止或抑制內(nèi)源性VWF結(jié)合FVIII。在另一實(shí)施方案中，VWF蛋白包含VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，其中所述D3結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:21的氨基酸867至1240至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，其中所述VWF蛋白防止或抑制內(nèi)源性VWF結(jié)合FVIII。在一些實(shí)施方案中，本文所述的VWF蛋白包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:21的氨基酸764至1240至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，其中所述VWF蛋白防止或抑制內(nèi)源性VWF結(jié)合FVIII。在其它實(shí)施方案中，VWF蛋白包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：D1、D2、D'和D3結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域與SEQ ID NO:21的氨基酸23至1240至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，其中所述VWF蛋白防止或抑制內(nèi)源性VWF結(jié)合FVIII。在其它實(shí)施方案中，VWF蛋白進(jìn)一步包含可操作地與其連接的信號肽。

在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的VWF蛋白基本上由以下組成或由以下組成：(1)D'D3結(jié)構(gòu)域、D1D'D3結(jié)構(gòu)域、D2D'D3結(jié)構(gòu)域或D1D2D'D3結(jié)構(gòu)域和(2)多達(dá)約10個氨基酸(例如SEQ ID NO:21的氨基酸764至1240至SEQ ID NO:21的氨基酸764至1250的任何序列)、多達(dá)約15個氨基酸(例如SEQ ID NO:21的氨基酸764至1240至SEQ ID NO:21的氨基酸764至1255的任何序列)、多達(dá)約20個氨基酸(例如SEQ ID NO:21的氨基酸764至1240至SEQ ID NO:21的氨基酸764至1260的任何序列)、多達(dá)約25個氨基酸(例如SEQ ID NO:21的氨基酸764至1240至SEQ ID NO:21的氨基酸764至1265的任何序列)或多達(dá)約30個氨基酸(例如SEQ ID NO:21的氨基酸764至1240至SEQ ID NO:21的氨基酸764至1260的任何序列)的另外的VWF序列。在特定實(shí)施方案中，包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域或基本上由D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域組成的VWF蛋白既不是SEQ ID NO:21的氨基酸764至1274也不是全長成熟VWF。在一些實(shí)施方案中，D1D2結(jié)構(gòu)域以反式與D'D3結(jié)構(gòu)域一起表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，D1D2結(jié)構(gòu)域以順式與D'D3結(jié)構(gòu)域一起表達(dá)。

在其它實(shí)施方案中，包含連接于D1D2結(jié)構(gòu)域的D'D3結(jié)構(gòu)域的VWF蛋白進(jìn)一步包含細(xì)胞內(nèi)裂解位點(diǎn)(例如PACE(弗林蛋白酶)或PC5的裂解位點(diǎn))，從而允許在表達(dá)后，從D'D3結(jié)構(gòu)域裂解D1D2結(jié)構(gòu)域。細(xì)胞內(nèi)裂解位點(diǎn)的非限制性實(shí)例在本文其它地方加以公開。

在其它實(shí)施方案中，VWF蛋白包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，但不包含選自由以下組成的組的氨基酸序列：(1)對應(yīng)于SEQ ID NO:21的氨基酸1241至2813，(2)對應(yīng)于SEQ ID NO:21的氨基酸1270至氨基酸2813，(3)對應(yīng)于SEQ ID NO:21的氨基酸1271至氨基酸2813，(4)對應(yīng)于SEQ ID NO:21的氨基酸1272至氨基酸2813，(5)對應(yīng)于SEQ ID NO:21的氨基酸1273至氨基酸2813，(6)對應(yīng)于SEQ ID NO:21的氨基酸1274至氨基酸2813，及其任何組合。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的VWF蛋白包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：對應(yīng)于D'結(jié)構(gòu)域、D3結(jié)構(gòu)域和A1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO:21的氨基酸764至1479至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，其中所述VWF蛋白防止內(nèi)源性VWF結(jié)合FVIII。在特定實(shí)施方案中，VWF蛋白不是SEQ ID NO:21的氨基酸764至1274。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的VWF蛋白包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，但不包含至少一個選自由以下組成的組的VWF結(jié)構(gòu)域：(1)A1結(jié)構(gòu)域，(2)A2結(jié)構(gòu)域，(3)A3結(jié)構(gòu)域，(4)D4結(jié)構(gòu)域，(5)B1結(jié)構(gòu)域，(6)B2結(jié)構(gòu)域，(7)B3結(jié)構(gòu)域，(8)C1結(jié)構(gòu)域，(9)C2結(jié)構(gòu)域，(10)CK結(jié)構(gòu)域，(11)CK結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域，(12)CK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域和C1結(jié)構(gòu)域，(13)CK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域，(14)CK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域，(15)CK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域和B1結(jié)構(gòu)域，(16)CK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域、B1結(jié)構(gòu)域和D4結(jié)構(gòu)域，(17)CK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域、B1結(jié)構(gòu)域、D4結(jié)構(gòu)域和A3結(jié)構(gòu)域，(18)CK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域、B1結(jié)構(gòu)域、D4結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域和A2結(jié)構(gòu)域，(19)CK結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域、B1結(jié)構(gòu)域、D4結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和A1結(jié)構(gòu)域，和(20)其任何組合。

在其它實(shí)施方案中，VWF蛋白包含D'D3結(jié)構(gòu)域和一個或多個結(jié)構(gòu)域或模塊。所述結(jié)構(gòu)域或模塊的實(shí)例包括但不限于Zhour等,Blood 2012年4月6日在線發(fā)表:DOI 10.1182/blood-2012-01-405134中公開的結(jié)構(gòu)域和模塊，所述文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文。舉例來說，VWF蛋白可包含D'D3結(jié)構(gòu)域和一個或多個選自由以下組成的組的結(jié)構(gòu)域或模塊：A1結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域、D4N模塊、VWD4模塊、C8-4模塊、TIL-4模塊、C1模塊、C2模塊、C3模塊、C4模塊、C5模塊、C5模塊、C6模塊及其任何組合。

在其它實(shí)施方案中，VWF蛋白連接于異源性部分，其中所述異源性部分連接于所述VWF蛋白的N末端或C末端或緊靠所述VWF蛋白中一個或多個氨基酸(例如一個或多個XTEN插入位點(diǎn))的下游插入。舉例來說，異源性部分在VWF蛋白中的插入位點(diǎn)可在D'結(jié)構(gòu)域、D3結(jié)構(gòu)域或兩者中。異源性部分可為半衰期延長物。

在某些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的VWF蛋白形成多聚體，例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體或更高級多聚體。在其它實(shí)施方案中，VWF蛋白是僅具有一個VWF蛋白的單體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的VWF蛋白可具有一個或多個氨基酸取代、缺失、添加或修飾。在一個實(shí)施方案中，VWF蛋白可包括氨基酸取代、缺失、添加或修飾以使VWF蛋白不能形成二硫鍵或不能形成二聚體或多聚體。在另一實(shí)施方案中，氨基酸取代在D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域內(nèi)。在特定實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的VWF蛋白在對應(yīng)于以下的殘基處含有至少一個氨基酸取代：對應(yīng)于SEQ ID NO:21的殘基1099、殘基1142、或殘基1099與1142兩者。至少一個氨基酸取代可為不天然存在于野生型VWF中的任何氨基酸。舉例來說，氨基酸取代可為除半胱氨酸以外的任何氨基酸，例如異亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、賴氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯氨酸、絲氨酸、酪氨酸、精氨酸或組氨酸。在另一實(shí)例中，氨基酸取代具有一個或多個防止或抑制VWF蛋白形成多聚體的氨基酸。

在某些實(shí)施方案中，適用于本文中的VWF蛋白可進(jìn)一步被修飾以改進(jìn)它與FVIII的相互作用，例如改進(jìn)對FVIII的結(jié)合親和力。作為非限制性實(shí)例，VWF蛋白包含在對應(yīng)于SEQ ID NO:21的氨基酸764的殘基處的絲氨酸殘基和在對應(yīng)于SEQ ID NO:21的氨基酸773的殘基處的賴氨酸殘基。殘基764和/或773可有助于VWF蛋白對FVIII的結(jié)合親和力。在其它實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的VWF蛋白可具有其它修飾，例如蛋白質(zhì)可被聚乙二醇化、糖基化、羥乙基淀粉化或聚唾液酸化。

II.B.XTEN序列

如本文所用，“XTEN序列”是指具有主要由小親水性氨基酸組成的非天然存在的大致上非重復(fù)序列的延長長度多肽，其中所述序列在生理?xiàng)l件下具有低度或不具有二級或三級結(jié)構(gòu)。作為嵌合蛋白配偶體，XTEN可充當(dāng)載體，從而例如當(dāng)連接于本發(fā)明的VWF蛋白或FVIII序列以產(chǎn)生嵌合蛋白時，賦予某些合乎需要的藥物動力學(xué)、物理化學(xué)和藥物性質(zhì)。所述合乎需要的性質(zhì)包括但不限于藥物動力學(xué)參數(shù)和溶解性特征增強(qiáng)。如本文所用，“XTEN”明確排除抗體或抗體片段，諸如單鏈抗體或輕鏈或重鏈的Fc片段。

本發(fā)明提供一種較短XTEN序列，當(dāng)所述XTEN序列融合于VWF蛋白和/或第二Ig恒定區(qū)或其一部分時，相較于較長XTEN序列，所述較短XTEN序列提供改進(jìn)的半衰期延長性質(zhì)。因此，融合于VWF蛋白和/或第二Ig恒定區(qū)或其一部分的XTEN序列在長度方面含有小于288個氨基酸，即短于288個氨基酸。在一個實(shí)施方案中，融合于VWF蛋白和/或第二Ig恒定區(qū)或其一部分的XTEN序列由長度在12個氨基酸與287個氨基酸之間的氨基酸序列組成。在另一實(shí)施方案中，融合于VWF蛋白和/或第二Ig恒定區(qū)或其一部分的XTEN序列包含至少約36個氨基酸、至少約42個氨基酸、至少約72個氨基酸或至少約144個氨基酸，但小于288個氨基酸。在其它實(shí)施方案中，融合于VWF蛋白和/或第二Ig恒定區(qū)或其一部分的XTEN序列選自AE36、AG36、AE42、AG42、AE72、AG72、AE144或AG144。在一個實(shí)施方案中，融合于VWF蛋白和/或第二Ig恒定區(qū)或其一部分的XTEN序列是與SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:14至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，其中相較于無XTEN序列的嵌合蛋白，嵌合蛋白展現(xiàn)改進(jìn)的半衰期。

本發(fā)明的嵌合蛋白可進(jìn)一步包含另外(第二、第三或更多)的XTEN序列。另外的XTEN序列可進(jìn)一步融合于FVIII蛋白或第一Ig恒定區(qū)或其一部分。另外的XTEN序列可為任何長度。舉例來說，融合于FVIII蛋白或第一Ig恒定區(qū)或其一部分的另外的XTEN序列是具有大于約20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000個氨基酸殘基的肽或多肽。在某些實(shí)施方案中，另外的XTEN序列是具有大于約20至約3000個氨基酸殘基、大于約30至約2500個殘基、大于約40至約2000個殘基、大于約50至約1500個殘基、大于約60至約1000個殘基、大于約70至約900個殘基、大于約80至約800個殘基、大于約90至約700個殘基、大于約100至約600個殘基、大于約110至約500個殘基、或大于約120至約400個殘基的肽或多肽。

XTEN序列(即融合于VWF蛋白和/或第二Ig恒定區(qū)或其一部分的XTEN序列或融合于FVIII蛋白和/或第一Ig恒定區(qū)或其一部分或插入在FVIII蛋白內(nèi)一個或多個插入位點(diǎn)處的XTEN序列)可包含一個或多個具有9至14個氨基酸殘基的序列基序或與所述序列基序至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，其中所述基序包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：4至6種類型的選自由以下組成的組的氨基酸：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)。參見US 2010-0239554 A1。

在一些實(shí)施方案中，XTEN序列包含非重疊序列基序，其中序列的至少約80％、或至少約85％、或至少約90％、或至少約91％、或至少約92％、或至少約93％、或至少約94％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或約100％由多個選自從表2A選擇的單一基序家族的非重疊序列單元組成，從而產(chǎn)生家族序列。如本文所用，“家族”意指XTEN具有僅選自來自表2A的單一基序種類的基序；即AD、AE、AF、AG、AM、AQ、BC或BD XTEN，并且選擇XTEN中不來自家族基序的任何其它氨基酸以實(shí)現(xiàn)所需性質(zhì)，諸如允許通過編碼核苷酸并入限制位點(diǎn)，并入裂解序列，或?qū)崿F(xiàn)與FVIII或VWF的更佳連接。在XTEN家族的一些實(shí)施方案中，XTEN序列包含AD基序家族或AE基序家族或AF基序家族或AG基序家族或AM基序家族或AQ基序家族或BC家族或BD家族的多個非重疊序列基序單元，從而所得XTEN展現(xiàn)上述同源性范圍。在其它實(shí)施方案中，XTEN包含來自表2A的兩個或更多個基序家族的多個基序序列單元?？蛇x擇這些序列以實(shí)現(xiàn)以下更充分描述的由基序的氨基酸組成賦予的所需物理/化學(xué)特征，包括諸如凈電荷、親水性、缺乏二級結(jié)構(gòu)或缺乏重復(fù)性的性質(zhì)。在上文于這個段落中所述的實(shí)施方案中，可使用本文所述的方法選擇并裝配并入XTEN中的基序以實(shí)現(xiàn)XTEN具有約36至約3000個氨基酸殘基。

表2A.具有12個氨基酸的XTEN序列基序和基序家族

●表示當(dāng)以各種排列一起使用時產(chǎn)生“家族序列”的個別基序序列

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的XTEN序列與選自由以下組成的組的序列至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一：AE42、AG42、AE48、AM48、AE72、AG72、AE108、AG108、AE144、AF144、AG144、AE180、AG180、AE216、AG216、AE252、AG252、AE288、AG288、AE324、AG324、AE360、AG360、AE396、AG396、AE432、AG432、AE468、AG468、AE504、AG504、AF504、AE540、AG540、AF540、AD576、AE576、AF576、AG576、AE612、AG612、AE624、AE648、AG648、AG684、AE720、AG720、AE756、AG756、AE792、AG792、AE828、AG828、AD836、AE864、AF864、AG864、AM875、AE912、AM923、AM1318、BC864、BD864、AE948、AE1044、AE1140、AE1236、AE1332、AE1428、AE1524、AE1620、AE1716、AE1812、AE1908、AE2004A、AG948、AG1044、AG1140、AG1236、AG1332、AG1428、AG1524、AG1620、AG1716、AG1812、AG1908和AG2004。參見US 2010-0239554 A1。

在一個實(shí)施方案中，XTEN序列與選自由以下組成的組的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一：AE42(SEQ ID NO:9)、AE72(SEQ ID NO:10)、AE144_2A(SEQ IDNO:55)、AE144_3B(SEQ ID NO:56)、AE144_4A(SEQ ID NO:57)、AE144_5A(SEQ ID NO:58)、AE144_6B(SEQ ID NO:59)、AG144_A(SEQ ID NO:60)、AG144_B(SEQ ID NO:61)、AG144_C(SEQ ID NO:62)、AG144_F(SEQ IDNO:63)、AE864(SEQ ID NO:15)、AE576(SEQ ID NO:16)、AE288(SEQ ID NO:8)、AE288_2(SEQ ID NO:54)、AE144(SEQ ID NO:11)、AG864(SEQ ID NO:17)、AG576(SEQ ID NO:18)、AG288(SEQ ID NO:19)、AG144(SEQ ID NO:14)及其任何組合。在另一實(shí)施方案中，XTEN序列選自由以下組成的組：AE42(SEQ ID NO:9)、AE72(SEQ ID NO:10)、AE144_2A(SEQ IDNO:55)、AE144_3B(SEQ ID NO:56)、AE144_4A(SEQ ID NO:57)、AE144_5A(SEQ IDNO:58)、AE144_6B(SEQ ID NO:59)、AG144_A(SEQ ID NO:60)、AG144_B(SEQ ID NO:61)、AG144_C(SEQ ID NO:62)、AG144_F(SEQ IDNO:63)、AE864(SEQ ID NO:15)、AE576(SEQ ID NO:16)、AE288(SEQ ID NO:8)、AE288_2(SEQ ID NO:54)、AE144(SEQ ID NO:11)、AG864(SEQ ID NO:17)、AG576(SEQ ID NO:18)、AG288(SEQ ID NO:19)、AG144(SEQ ID NO:14)及其任何組合。在特定實(shí)施方案中，XTEN序列是AE288。本發(fā)明的某些XTEN序列的氨基酸序列顯示于表2B中。

表2B.XTEN序列

在其中XTEN組分具有小于100％的它的氨基酸由4、5或6種類型的選自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸組成，或小于100％的序列由來自表3的序列基序或表4和13-17的XTEN序列組成的那些實(shí)施方案中，XTEN的其它氨基酸殘基選自其它14種天然L-氨基酸中的任一個，但優(yōu)先選自親水性氨基酸，以使XTEN序列含有至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少約99％親水性氨基酸。不是甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的XTEN氨基酸分散在整個XTEN序列中，位于序列基序內(nèi)部或之間，或集中在XTEN序列的一個或多個短鏈段中，例如以在XTEN組分與FVIII或VWF組分之間產(chǎn)生接頭。在XTEN組分包含除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)以外的氨基酸的所述情況下，優(yōu)選的是小于約2％或小于約1％氨基酸是疏水性殘基以使所得序列通常缺乏二級結(jié)構(gòu)，例如不具有超過2％α螺旋或2％β折疊，如通過本文公開的方法所確定。在構(gòu)建XTEN時有利性較小的疏水性殘基包括色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸。另外，可設(shè)計(jì)XTEN序列以含有小于5％或小于4％或小于3％或小于2％或小于1％或不含有以下氨基酸：半胱氨酸(以避免形成二硫化物和氧化)、甲硫氨酸(以避免氧化)、天冬酰胺和谷氨酰胺(以避免脫酰胺)。因此，在一些實(shí)施方案中，除甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)之外也包含其它氨基酸的XTEN組分具有促成α螺旋和β折疊的殘基小于5％(如通過Chou-Fasman算法所測量)的序列，并且具有至少90％或至少約95％或更多無規(guī)卷曲形成，如通過GOR算法所測量。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的XTEN序列影響本發(fā)明的嵌合蛋白的物理或化學(xué)性質(zhì)，例如藥物動力學(xué)。本發(fā)明中使用的XTEN序列可展現(xiàn)一種或多種以下有利性質(zhì)：構(gòu)象柔性、增強(qiáng)的水溶性、高度蛋白酶抗性、低免疫原性、與哺乳動物受體的低結(jié)合性或增加的流體動力學(xué)(或斯托克斯(Stokes))半徑。在特定實(shí)施方案中，連接于本發(fā)明中的FVIII蛋白的XTEN序列增加藥物動力學(xué)性質(zhì)，諸如較長的終末半衰期或增加的曲線下面積(AUC)，以使本文所述的嵌合蛋白相較于野生型FVIII在體內(nèi)停留時期增加。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的XTEN序列增加藥物動力學(xué)性質(zhì)，諸如較長的終末半衰期或增加的曲線下面積(AUC)，以使FVIII蛋白相較于野生型FVIII在體內(nèi)停留時期增加。

本發(fā)明的一個實(shí)施方案是一種FVIII/VWF融合蛋白，其包含融合于Fc區(qū)的FVIII部分和融合于Fc區(qū)的VWF部分，其中XTEN序列(例如AE288)插入在所述FVIII部分內(nèi)，并且其中具有小于288個氨基酸的XTEN序列(例如AE144)插入在所述VWF部分與Fc部分之間。如實(shí)施例中所述，在VWF部分與Fc部分之間插入具有小于288個氨基酸的XTEN對嵌合蛋白的藥物動力學(xué)的影響大于在VWF部分與Fc部分之間插入具有288個氨基酸的XTEN。舉例來說，相較于具有288個氨基酸的XTEN，在FVIII/VWF融合蛋白中的VWF部分與Fc部分之間插入具有小于288個氨基酸的XTEN序列可增加嵌合蛋白的終末半衰期。在一些實(shí)施方案中，相對于插入具有288個氨基酸的XTEN序列，終末半衰期增加至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％或至少約30％。在一個特定實(shí)施方案中，相對于插入具有288個氨基酸的XTEN，終末半衰期增加至少約35％。插入具有小于288個氨基酸的XTEN序列也可增加嵌合蛋白的AUC值。在一些實(shí)施方案中，相對于插入具有288個氨基酸的XTEN，AUC增加至少約50％、至少約100％或至少約200％。在一個特定實(shí)施方案中，AUC增加約兩倍。插入具有小于288個氨基酸的XTEN序列也可降低嵌合蛋白的清除率。舉例來說，相對于插入具有288個氨基酸的XTEN序列，清除率可降低至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％或至少約30％。相對于插入具有288個氨基酸的XTEN，插入具有小于288個氨基酸的XTEN序列可增加平均滯留時間(MRT)和/或降低穩(wěn)態(tài)表觀分布體積(Vss)。

多種方法和測定可用于測定包含XTEN序列的蛋白質(zhì)的物理/化學(xué)性質(zhì)。所述方法包括但不限于分析性離心、EPR、HPLC-離子交換、HPLC-尺寸排阻、反相HPLC、光散射、毛細(xì)管電泳、圓二色性、差示掃描量熱法、熒光、HPLC-離子交換、HPLC-尺寸排阻、IR、NMR、拉曼(Raman)光譜法、折射法和UV/可見光譜法。其它方法公開于Amau等,Prot Expr and Purif 48,1-13(2006)中。

可根據(jù)本發(fā)明使用的XTEN序列的其它實(shí)例公開于美國專利公布號2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1或國際專利公布號WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1、WO 2011028344 A2或WO 20130122617 A1中。

II.C.因子VIII(FVIII)蛋白

除非另外規(guī)定，否則如本文所用的“FVIII蛋白”意指在凝血中發(fā)揮它的正常作用的功能性FVIII多肽。術(shù)語FVIII蛋白包括其保留全長野生型因子VIII在凝血路徑中的功能的功能性片段、變體、類似物或衍生物。“FVIII蛋白”可與FVIII多肽(或蛋白質(zhì))或FVIII互換使用。FVIII功能的實(shí)例包括但不限于能夠活化凝血、能夠充當(dāng)因子IX的輔因子、或能夠在Ca²⁺和磷脂存在下與因子IX形成因子X活化酶復(fù)合物，其接著使因子X轉(zhuǎn)化成活化形式Xa。FVIII蛋白可為人、豬、犬、大鼠或鼠類FVIII蛋白。此外，來自人與其它物種的FVIII之間的比較已鑒定可能為功能所需的保守殘基(Cameron等,Thromb.Haemost.79:317-22(1998)；US 6,251,632)。

許多測試可用于評估凝血系統(tǒng)的功能：活化部分凝血激素時間(aPTT)測試、顯色測定、ROTEM測定、凝血酶原時間(PT)測試(也用于確定INR)、纖維蛋白原測試(常通過克勞斯(Clauss)方法)、血小板計(jì)數(shù)、血小板功能測試(常通過PFA-100)、TCT、流血時間、混合測試(如果患者的血漿與正常血漿混合，那么是否進(jìn)行異常矯正)、凝血因子測定、抗磷脂抗體、D-二聚體、遺傳測試(例如因子V Leiden、凝血酶原突變G20210A)、稀釋魯塞爾氏蝰蛇毒液時間(Russell's viper venom time，dRVVT)、雜項(xiàng)血小板功能測試、凝血彈性描記法(TEG或Sonoclot)、凝血彈性測量術(shù)(例如)或優(yōu)球蛋白(euglobulin)溶解時間(ELT)。

aPTT測試是衡量“內(nèi)在”凝血路徑(也稱為接觸活化路徑)與共同凝血路徑兩者的功效的性能指標(biāo)。這個測試通常用于測量可商購獲得的重組凝結(jié)因子(例如FVIII或FIX)的凝結(jié)活性。它與衡量外在路徑的凝血酶原時間(PT)聯(lián)合使用。

ROTEM分析提供關(guān)于以下完整止血動力學(xué)的信息：凝結(jié)時間、凝塊形成、凝塊穩(wěn)定性和溶解。凝血彈性測量術(shù)中的不同參數(shù)取決于血漿凝血系統(tǒng)的活性、血小板功能、纖維蛋白溶解或影響這些相互作用的許多因素。這個測定可提供對次級止血的完全綜覽。

已知FVIII多肽和多核苷酸序列，也已知許多功能性片段、突變體和修飾形式。以下顯示人FVIII序列(全長)的實(shí)例。

表3.全長因子VIII的氨基酸序列

(全長FVIII(FVIII信號肽加下劃線；FVIII重鏈加雙下劃線；B結(jié)構(gòu)域用斜體表示；并且FVIII輕鏈呈普通文本形式)

表4.編碼全長FVIII的核苷酸序列(SEQ ID NO:66)*

*加下劃線的核酸編碼信號肽。

FVIII多肽包括全長FVIII、全長FVIII減去N末端Met、成熟FVIII(減去信號序列)、在N末端具有另外的Met的成熟FVIII和/或B結(jié)構(gòu)域完全或部分缺失的FVIII。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII變體包括B結(jié)構(gòu)域缺失，無論部分或完全缺失。

天然成熟人FVIII的序列呈現(xiàn)為SEQ ID NO:65。天然FVIII蛋白具有下式：A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2，其中A1、A2和A3是結(jié)構(gòu)相關(guān)的“A結(jié)構(gòu)域”，B是“B結(jié)構(gòu)域”，C1和C2是結(jié)構(gòu)相關(guān)的“C結(jié)構(gòu)域”，并且a1、a2和a3是酸性間隔體區(qū)。關(guān)于SEQ ID NO:65中的一級氨基酸序列位置，人FVIII的A1結(jié)構(gòu)域從Ala1延伸至約Arg336，a1間隔體區(qū)從約Met337延伸至約Val374，A2結(jié)構(gòu)域從約Ala375延伸至約Tyr719，a2間隔體區(qū)從約Glu720延伸至約Arg740，B結(jié)構(gòu)域從約Ser741延伸至約Arg1648，a3間隔體區(qū)從約Glu1649延伸至約Arg1689，A3結(jié)構(gòu)域從約Ser1690延伸至約Leu2025，C1結(jié)構(gòu)域從約Gly2026延伸至約Asn2072，并且C2結(jié)構(gòu)域從約Ser2073延伸至Tyr2332。除特定蛋白水解裂解位點(diǎn)以外，對FVIII的結(jié)構(gòu)域和區(qū)域之間的邊界的位置的指定在不同參考文獻(xiàn)中可有所不同。因此，本文中指示的邊界通過使用術(shù)語“約”來指定為近似邊界。

分離人FVIII基因，并且在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)(Toole,J.J.等,Nature 312:342-347(1984)；Gitschier,J.等,Nature 312:326-330(1984)；Wood,W.I.等,Nature 312:330-337(1984)；Vehar,G.A.等,Nature 312:337-342(1984)；WO 87/04187；WO 88/08035；WO 88/03558；以及美國專利號4,757,006)。從如美國專利號4,965,199中所示的cDNA推斷FVIII氨基酸序列。此外，B結(jié)構(gòu)域部分或完全缺失的FVIII顯示于美國專利號4,994,371和4,868,112中。在一些實(shí)施方案中，人FVIII B結(jié)構(gòu)域被如美國專利號5,004,803中所示的人因子V B結(jié)構(gòu)域置換。編碼人因子VIII的cDNA序列和氨基酸序列分別以美國申請公布號2005/0100990的SEQ ID NO:1和2顯示。

豬FVIII序列發(fā)表在Toole,J.J.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5939-5942(1986)中。此外，由從豬脾cDNA文庫PCR擴(kuò)增FVIII序列獲得的完全豬cDNA序列已報(bào)道于Healey,J.F.等,Blood 88:4209-4214(1996)中。具有所有結(jié)構(gòu)域、所有亞單位和特定氨基酸序列的取代的雜交人/豬FVIII公開于Lollar和Runge的美國專利號5,364,771中和WO 93/20093中。更新近地，豬FVIII的A1和A2結(jié)構(gòu)域和用豬A1和/或A2結(jié)構(gòu)域取代相應(yīng)人結(jié)構(gòu)域的嵌合FVIII的核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列報(bào)道于WO 94/11503中。Lollar,J.S.的美國專利號5,859,204也公開豬cDNA和推斷的氨基酸序列。美國專利號6,458,563公開一種B結(jié)構(gòu)域缺失的豬FVIII。

Lollar,J.S.的美國專利號5,859,204報(bào)道具有降低的抗原性和降低的免疫反應(yīng)性的FVIII功能性突變體。Lollar,J.S.的美國專利號6,376,463也報(bào)道具有降低的免疫反應(yīng)性的FVIII突變體。Saenko等的美國申請公布號2005/0100990報(bào)道FVIII的A2結(jié)構(gòu)域中的功能性突變。

在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII(或嵌合蛋白的FVIII部分)可與具有SEQ ID NO:67的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:65的氨基酸1至2332的FVIII氨基酸序列(無信號序列)或具有SEQ ID NO:64的氨基酸1至19和SEQ ID NO:67的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:64的氨基酸1至19和SEQ ID NO:65的氨基酸1至2332的FVIII氨基酸序列(具有信號序列)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一，其中所述FVIII具有凝結(jié)活性，例如作為輔因子活化因子IX以使因子X轉(zhuǎn)化成活化因子X。FVIII(或嵌合蛋白的FVIII部分)可與具有SEQ ID NO:67的氨基酸1至1438或SEQ ID NO:65的氨基酸1至2332的FVIII氨基酸序列(無信號序列)同一。FVIII可進(jìn)一步包含信號序列。

如本文所用的FVIII的“B結(jié)構(gòu)域”與本領(lǐng)域中已知的通過內(nèi)部氨基酸序列同一性和蛋白水解裂解位點(diǎn)定義的B結(jié)構(gòu)域相同，例如是全長人FVIII的殘基Ser741-Arg1648。其它人FVIII結(jié)構(gòu)域由以下氨基酸殘基界定：A1，殘基Ala1-Arg372；A2，殘基Ser373-Arg740；A3，殘基Ser1690-Asn2019；C1，殘基Lys2020-Asn2172；C2，殘基Ser2173-Tyr2332。A3-C1-C2序列包括殘基Ser1690-Tyr2332。剩余序列殘基Glu1649-Arg1689通常被稱為a3酸性區(qū)。豬、小鼠和犬FVIII的包括B結(jié)構(gòu)域的所有結(jié)構(gòu)域的邊界位置在本領(lǐng)域中也是已知的。在一個實(shí)施方案中，缺失FVIII的B結(jié)構(gòu)域(“B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII”或“BDD FVIII”)。BDD FVIII的一實(shí)例是(重組BDD FVIII)，其與具有表5中的序列的因子VIII部分具有相同序列。(BDD FVIII重鏈加雙下劃線；B結(jié)構(gòu)域用斜體表示；并且BDD FVIII輕鏈呈普通文本形式)。編碼表6的核苷酸序列(SEQ ID NO:68)顯示于表6中。

表5.B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(BDD FVIII)的氨基酸序列

表6.編碼BDD FVIII的核苷酸序列(SEQ ID NO:68)*

*加下劃線的核酸編碼信號肽。

“B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII”可具有公開于美國專利號6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112和6,458,563中的完全或部分缺失。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII序列包含在美國專利號6,316,226(也在US 6,346,513中)的第4欄第4行至第5欄第28行和實(shí)施例1-5處公開的任一缺失。在另一實(shí)施方案中，B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII是S743/Q1638B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII(SQ BDD FVIII)(例如因子VIII具有從氨基酸744至氨基酸1637的缺失，例如因子VIII具有SEQ ID NO:65的氨基酸1-743和氨基酸1638-2332，即SEQ ID NO:67)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII具有在美國專利號5,789,203(以及US 6,060,447、US 5,595,886和US 6,228,620)的第2欄第26-51行和實(shí)施例5-8處公開的缺失。在一些實(shí)施方案中，B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII具有以下中描述的缺失：美國專利號5,972,885的第1欄第25行至第2欄第40行；美國專利號6,048,720的第6欄第1-22行和實(shí)施例1；美國專利號5,543,502的第2欄第17-46行；美國專利號5,171,844的第4欄第22行至第5欄第36行；美國專利號5,112,950的第2欄第55-68行，圖2和實(shí)施例1；美國專利號4,868,112的第2欄第2行至第19欄第21行和表2；美國專利號7,041,635的第2欄第1行至第3欄第19行、第3欄第40行至第4欄第67行、第7欄第43行至第8欄第26行、和第11欄第5行至第13欄第39行；或美國專利號6,458,563的第4欄第25-53行。在一些實(shí)施方案中，B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII缺失大部分B結(jié)構(gòu)域，但仍然含有為在體內(nèi)將初級翻譯產(chǎn)物蛋白水解加工成兩個多肽鏈所必需的B結(jié)構(gòu)域氨基末端序列，如WO 91/09122中所公開。在一些實(shí)施方案中，在缺失氨基酸747-1638，即實(shí)際上完全缺失B結(jié)構(gòu)域下構(gòu)建B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII。Hoeben R.C.等J.Biol.Chem.265(13):7318-7323(1990)。B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII也可含有FVIII的氨基酸771–1666或氨基酸868-1562的缺失。Meulien P.等Protein Eng.2(4):301-6(1988)。作為本發(fā)明的一部分的另外的B結(jié)構(gòu)域缺失包括以下：缺失氨基酸982至1562或760至1639(Toole等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1986)83,5939-5942))、797至1562(Eaton等Biochemistry(1986)25:8343-8347))、741至1646(Kaufman(PCT公布申請?zhí)朩O 87/04187))、747-1560(Sarver等,DNA(1987)6:553-564))、741至1648(Pasek(PCT申請?zhí)?8/00831))、或816至1598或741至1648(Lagner(Behring Inst.Mitt.(1988)第82期:16-25)；EP 295597)。在其它實(shí)施方案中，BDD FVIII包括含有B結(jié)構(gòu)域的保留一個或多個N連接的糖基化位點(diǎn)的片段的FVIII多肽，所述位點(diǎn)例如是對應(yīng)于全長FVIII序列的氨基酸序列的殘基757、784、828、900、963或任選943。B結(jié)構(gòu)域片段的實(shí)例包括如Miao,H.Z.等,Blood 103(a):3412-3419(2004)；Kasuda,A等,J.Thromb.Haemost.6:1352-1359(2008)；以及Pipe,S.W.等,J.Thromb.Haemost.9:2235-2242(2011)中公開的B結(jié)構(gòu)域的226個氨基酸或163個氨基酸(即保留B結(jié)構(gòu)域的前226個氨基酸或163個氨基酸)。在其它實(shí)施方案中，BDD FVIII進(jìn)一步包含在殘基309處的點(diǎn)突變(從Phe成為Ser)以改進(jìn)BDD FVIII蛋白的表達(dá)。參見Miao,H.Z.等,Blood 103(a):3412-3419(2004)。在其它實(shí)施方案中，BDD FVIII包括含有B結(jié)構(gòu)域的一部分，但不含有一個或多個弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)(例如Arg1313和Arg1648)的FVIII多肽。參見Pipe,S.W.等,J.Thromb.Haemost.9:2235-2242(2011)?？稍谌魏蜦VIII序列中進(jìn)行各前述缺失。

在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII具有部分B結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，具有部分B結(jié)構(gòu)域的FVIII蛋白是FVIII198。FVIII198是一種含有部分B結(jié)構(gòu)域的單鏈FVIIIFc分子-226N6。數(shù)字226表示FVIII B結(jié)構(gòu)域的N末端226個氨基酸，并且N6表示B結(jié)構(gòu)域中的六個N-糖基化位點(diǎn)。

在一個實(shí)施方案中，就在氨基酸1648(在全長因子VIII或SEQ ID NO:65中)、氨基酸754(在S743/Q1638B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII或SEQ ID NO:67中)處的精氨酸或相應(yīng)精氨酸殘基(在其它變體中)之后裂解FVIII，由此產(chǎn)生重鏈和輕鏈。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII包含通過金屬離子介導(dǎo)的非共價鍵連接或締合的重鏈和輕鏈。

在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII是單鏈FVIII，其尚未就在氨基酸1648(在全長FVIII或SEQ ID NO:65中)、氨基酸754(在S743/Q1638B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII或SEQ ID NO:67中)處的精氨酸或相應(yīng)精氨酸殘基(在其它變體中)之后被裂解。單鏈FVIII可包含一個或多個氨基酸取代。在一個實(shí)施方案中，氨基酸取代在對應(yīng)于全長成熟因子VIII多肽(SEQ ID NO:65)的殘基1648、殘基1645或兩者或SQ BDD因子VIII(SEQ ID NO:67)的殘基754、殘基751或兩者的殘基處。氨基酸取代可為除精氨酸以外的任何氨基酸，例如異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、硒代半胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸、吡咯賴氨酸或?；撬帷?/p>

FVIII可進(jìn)一步由凝血酶裂解，接著活化成FVIIIa，從而充當(dāng)活化因子IX(FIXa)的輔因子?；罨疐IX接著連同活化FVIII一起形成X酶復(fù)合物，并且使因子X轉(zhuǎn)化成活化因子X(FXa)。對于活化，F(xiàn)VIII由凝血酶在于氨基酸372、740和1689(對應(yīng)于B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII序列中的氨基酸372、740和795)處的三個精氨酸殘基之后裂解，所述裂解產(chǎn)生具有50kDa A1、43kDa A2和73kDa A3-C1-C2鏈的FVIIIa。在一個實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的FVIII蛋白是非活性FVIII。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白是活化FVIII。

具有與VWF蛋白連接或締合的FVIII多肽的蛋白質(zhì)可包含與SEQ ID NO:65或67至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列，其中所述序列具有FVIII凝結(jié)活性，例如活化因子IX作為輔因子以使因子X轉(zhuǎn)化成活化因子X(FXa)。

如本文所用的“雜交”或“嵌合”多肽和蛋白質(zhì)包括第一多肽鏈(例如融合于具有小于288個氨基酸的XTEN序列和第一Ig恒定區(qū)或其一部分的VWF蛋白)與第二多肽鏈(例如融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分的FVIII蛋白)的組合，由此形成異二聚體。在一個實(shí)施方案中，雜交物中的第一多肽與第二多肽通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(諸如電荷-電荷或疏水性相互作用)彼此締合。在另一實(shí)施方案中，第一多肽包含VWF蛋白-XTEN-Fc融合蛋白，并且第二多肽包含F(xiàn)VIII-Fc融合蛋白，從而使得雜交物是異二聚體，其中XTEN含有小于288個氨基酸。在其它實(shí)施方案中，第一多肽包含VWF蛋白-XTEN-Fc融合蛋白，并且第二多肽包含F(xiàn)VIII(X)-Fc融合蛋白，從而使得雜交物是異二聚體，其中XTEN含有小于288個氨基酸。第一多肽與第二多肽可通過第一Fc區(qū)與第二Fc區(qū)之間的共價鍵(例如二硫鍵)締合。第一多肽與第二多肽可進(jìn)一步通過VWF片段與FVIII蛋白之間的結(jié)合而彼此締合。

適用于本發(fā)明中的FVIII蛋白可包括具有一個或多個不影響FVIII凝血活性的另外的XTEN序列的FVIII。所述XTEN序列可融合于FVIII蛋白的C末端或N末端或插入在FVIII蛋白中一組或多組兩個氨基酸殘基之間，同時插入不影響FVIII凝血活性或FVIII功能。在一個實(shí)施方案中，插入改進(jìn)FVIII蛋白的藥物動力學(xué)性質(zhì)(例如半衰期)。在另一實(shí)施方案中，插入可為多個插入，例如大于兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個插入。插入位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于表7、8、9、10、11、12、13、14、15中所列的位點(diǎn)或其任何組合。

連接于一個或多個XTEN序列的FVIII蛋白可表示為FVIII(X2)或FVIII_(a→b)-X-FVIII_(c→d)，其中FVIII_(a→b)包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：FVIII蛋白的從氨基酸殘基“a”至氨基酸殘基“b”的第一部分；X2包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：一個或多個XTEN序列，F(xiàn)VIII_(c→d)包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：FVIII蛋白的從氨基酸殘基“c”至氨基酸殘基“d”的第二部分；

a是FVIII蛋白的第一部分的N末端氨基酸殘基，

b是FVIII蛋白的第一部分的C末端氨基酸殘基，但也是其中插入XTEN序列的插入位點(diǎn)的兩個氨基酸的N末端氨基酸殘基，

c是FVIII蛋白的第二部分的N末端氨基酸殘基，但也是其中插入XTEN序列的插入位點(diǎn)的兩個氨基酸的C末端氨基酸殘基，并且

d是FVIII蛋白的C末端氨基酸殘基，并且

其中FVIII蛋白的第一部分與FVIII蛋白的第二部分彼此不相同，并且共同具有足以使FVIII蛋白具有FVIII凝血活性的長度。

在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白的第一部分和FVIII蛋白的第二部分是SEQ ID NO:65[全長成熟FVIII序列]或SEQ ID NO:67[B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII]的片段，例如分別是N末端部分和C末端部分。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白的第一部分包含F(xiàn)VIII蛋白的A1結(jié)構(gòu)域和A2結(jié)構(gòu)域。FVIII蛋白的第二部分包含A3結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域和任選C2結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白的第一部分包含A1結(jié)構(gòu)域和A2結(jié)構(gòu)域，并且FVIII蛋白的第二部分包含B結(jié)構(gòu)域的一部分、A3結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域和任選C2結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白的第一部分包含F(xiàn)VIII蛋白的A1結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域的一部分，并且FVIII蛋白的第二部分包含A3結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域和任選C2結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白的第一部分包含F(xiàn)VIII蛋白的A1結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域的第一部分。FVIII蛋白的第二部分包含B結(jié)構(gòu)域的第二部分、A3結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域和任選C2結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，兩個氨基酸(“b”和“c”)可為表7、8、9、10、11、12、13、14和15中所示的氨基酸殘基插入位點(diǎn)中的任何一個或多個。舉例來說，“b”可為緊靠其中插入或連接一個或多個XTEN序列的位點(diǎn)的上游的氨基酸殘基，并且“c”可為緊靠其中插入或連接一個或多個XTEN序列的位點(diǎn)的下游的氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，“a”是FVIII蛋白的首個成熟氨基酸序列，并且“d”是FVIII蛋白的末個氨基酸序列。舉例來說，F(xiàn)VIII_(a→b)可為與SEQ ID NO:67[B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII氨基酸序列]或SEQ ID NO:65[全長FVIII]的氨基酸1至745至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列，并且FVIII_(c→d)可為分別SEQ ID NO:67的氨基酸746至1438或SEQ ID NO:65的氨基酸1641至2332。

在一些方面，F(xiàn)VIII蛋白中的插入位點(diǎn)位于FVIII蛋白的一個或多個結(jié)構(gòu)域(其是N末端、A1結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域、C末端或其兩個或更多個組合)中或位于FVIII蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域(其是A1結(jié)構(gòu)域和a1酸性區(qū)、以及a1酸性區(qū)和A2結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和a2酸性區(qū)、a2酸性區(qū)和B結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域和A3結(jié)構(gòu)域、以及A3結(jié)構(gòu)域和C1結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域或其任何組合)之間。舉例來說，其中可插入XTEN序列的插入位點(diǎn)選自由以下組成的組：N末端和A1結(jié)構(gòu)域、N末端和A2結(jié)構(gòu)域、N末端和A3結(jié)構(gòu)域、N末端和B結(jié)構(gòu)域、N末端和C1結(jié)構(gòu)域、N末端和C2結(jié)構(gòu)域、N末端和C末端、A1結(jié)構(gòu)域和A2結(jié)構(gòu)域、A1結(jié)構(gòu)域和A3結(jié)構(gòu)域、A1結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域、A1結(jié)構(gòu)域和C1結(jié)構(gòu)域、A1結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域、A1結(jié)構(gòu)域和C末端、A2結(jié)構(gòu)域和A3結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和C1結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域、A2結(jié)構(gòu)域和C末端、A3結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域和C1結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域和C末端、B結(jié)構(gòu)域和C1結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域和C末端、C1結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域、C1結(jié)構(gòu)域和C末端、C2結(jié)構(gòu)域和C末端及其兩個或更多個組合。插入位點(diǎn)的非限制性實(shí)例列于表7、8、9、10、11、12、13、14和15中。

其中緊靠FVIII蛋白中的一個或多個氨基酸(例如一個或多個XTEN插入位點(diǎn))的下游插入或在C末端或N末端連接XTEN序列的FVIII蛋白在連接于XTEN序列或由XTEN序列插入之后保留FVIII活性。XTEN序列可插入FVIII蛋白中一次或大于一次、兩次、三次、四次、五次或六次以使插入不影響FVIII活性(即FVIII蛋白仍然保留凝血性質(zhì))。

適用于本發(fā)明中的FVIII蛋白可通過任選接頭在FVIII蛋白的N末端或C末端連接于一個或多個XTEN多肽或通過一個或多個任選接頭緊靠FVIII蛋白中的一個或多個氨基酸(例如一個或多個XTEN插入位點(diǎn))的下游插入。在一個實(shí)施方案中，其中插入XTEN序列的兩個氨基酸殘基或XTEN序列所連接的氨基酸殘基對應(yīng)于SEQ ID NO:65[全長成熟FVIII]的兩個或一個選自由表7、表8、表9和表10中的殘基及其任何組合組成的組的氨基酸殘基。

在其它實(shí)施方案中，至少一個XTEN序列插入本文公開的任何一個或多個XTEN插入位點(diǎn)或其任何組合中。在一個方面，至少一個XTEN序列插入表7中公開的一個或多個氨基酸中公開的一個或多個XTEN插入位點(diǎn)中。

表7：示例性XTEN插入位點(diǎn)

*指示XTEN的基于成熟全長人FVIII的氨基酸編號的插入點(diǎn)，其中插入可在指示的氨基酸的N末端側(cè)或C末端側(cè)上。

在一些實(shí)施方案中，一個或多個XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905或1910或其任何組合的上游或下游約六個氨基酸內(nèi)。

表8.示例性XTEN插入范圍

*離插入殘基的距離是指離可進(jìn)行插入所處的指定插入殘基(殘基“0”)的N末端(負(fù)數(shù))或C末端(正數(shù))的相對氨基酸數(shù)目。標(biāo)號“-x”是指插入位點(diǎn)離指定插入殘基的N末端側(cè)x個氨基酸。類似地，標(biāo)號“+x”是指插入位點(diǎn)離指定插入殘基的C末端側(cè)x個氨基酸。

舉例來說，“-1,+2”指示在表示為-1、0、+1或+2的氨基酸殘基的N末端或C末端進(jìn)行插入。

在其它實(shí)施方案中，一個或多個XTEN序列緊靠對應(yīng)于全長成熟人FVIII的一個或多個選自由表9中的一個或多個插入位點(diǎn)組成的組的氨基酸的下游插入。

表9.示例性XTEN插入位點(diǎn)或范圍

*指示相對于成熟人FVIII的氨基酸編號加以編號的插入位點(diǎn)的范圍

在其它實(shí)施方案中，一個或多個XTEN插入FVIII的B結(jié)構(gòu)域中。在一個實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸740與1640之間，其中氨基酸740與1640之間的FVIII序列任選不存在。在另一實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸741與1690之間，其中氨基酸740與1690之間的FVIII序列任選不存在。在其它實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸741與1648之間，其中氨基酸741與1648之間的FVIII序列任選不存在。在其它實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸743與1638之間，其中氨基酸743與1638之間的FVIII序列任選不存在。在其它實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745與1656之間，其中氨基酸745與1656之間的FVIII序列任選不存在。在一些實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745與1657之間，其中氨基酸745與1657之間的FVIII序列任選不存在。在某些實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745與1667之間，其中氨基酸745與1667之間的FVIII序列任選不存在。在其它實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745與1686之間，其中氨基酸745與1686之間的FVIII序列任選不存在。在一些其它實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸747與1642之間，其中氨基酸747與1642之間的FVIII序列任選不存在。在其它實(shí)例中，XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸751與1667之間，其中氨基酸751與1667之間的FVIII序列任選不存在。

在一些實(shí)施方案中，一個或多個XTEN插入緊靠選自由表10中的氨基酸殘基組成的組的插入位點(diǎn)的氨基酸的下游的一個或多個氨基酸中。

表10：FVIII XTEN插入位點(diǎn)和構(gòu)建體標(biāo)號

*指示成熟FVIII蛋白的氨基酸編號

在一個實(shí)施方案中，一個或多個XTEN插入位點(diǎn)位于FVIII蛋白的一個或多個表面暴露的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)(例如容許環(huán))內(nèi)。舉例來說，至少一個XTEN序列可插入包含其中可插入至少一個XTEN多肽而不消除重組蛋白的促凝血活性或重組蛋白質(zhì)在體內(nèi)表達(dá)或在體外于宿主細(xì)胞中表達(dá)的能力的至少兩個“容許環(huán)”的各FVIII“A”結(jié)構(gòu)域中。容許環(huán)是允許插入至少一個XTEN序列的除了其它屬性之外也具有高表面或溶劑暴露和高構(gòu)象柔性的區(qū)域。A1結(jié)構(gòu)域包含容許環(huán)-1(A1-1)區(qū)域和容許環(huán)-2(A1-2)區(qū)域，A2結(jié)構(gòu)域包含容許環(huán)-1(A2-1)區(qū)域和容許環(huán)-2(A2-2)區(qū)域，A3結(jié)構(gòu)域包含容許環(huán)-1(A3-1)區(qū)域和容許環(huán)-2(A3-2)區(qū)域。

在一個方面，F(xiàn)VIII A1結(jié)構(gòu)域中的第一容許環(huán)(A1-1)位于β鏈1與β鏈2之間，并且FVIII A2結(jié)構(gòu)域中的第二容許環(huán)(A1-2)位于β鏈11與β鏈12之間。FVIII A2結(jié)構(gòu)域中的第一容許環(huán)(A2-1)位于β鏈22與β鏈23之間，并且FVIII A2結(jié)構(gòu)域中的第二容許環(huán)(A2-2)位于β鏈32與β鏈33之間。FVIII A3結(jié)構(gòu)域中的第一容許環(huán)(A3-1)位于β鏈38與β鏈39之間，并且FVIII A3中的第二容許環(huán)(A3-2)位于β鏈45與β鏈46之間。在某些方面，包含A1-1的表面暴露的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)對應(yīng)于天然成熟人FVIII中從SEQ ID NO:65的約氨基酸15至約氨基酸45，例如從SEQ ID NO:65的約氨基酸18至約氨基酸41的區(qū)域。在其它方面，包含A1-2的表面暴露的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)對應(yīng)于天然成熟人FVIII中從SEQ ID NO:65的約氨基酸201至約氨基酸232，例如從SEQ ID NO:65的約氨基酸218至約氨基酸229的區(qū)域。在其它方面，包含A2-1的表面暴露的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)對應(yīng)于天然成熟人FVIII中從SEQ ID NO:65的約氨基酸395至約氨基酸421，例如從SEQ ID NO:65的約氨基酸397至約氨基酸418的區(qū)域。在其它實(shí)施方案中，包含A2-2的表面暴露的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)對應(yīng)于天然成熟人FVIII中從SEQ ID NO:65的約氨基酸577至約氨基酸635，例如從SEQ ID NO:65的約氨基酸595至約氨基酸607的區(qū)域。在某些方面，包含A3-1的表面暴露的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)對應(yīng)于天然成熟人FVIII中從SEQ ID NO:65的約氨基酸1705至約氨基酸1732，例如從SEQ ID NO:65的約氨基酸1711至約氨基酸1725的區(qū)域。在其它方面，包含A3-2的表面暴露的柔性環(huán)結(jié)構(gòu)對應(yīng)于天然成熟人FVIII中從SEQ ID NO:65的約氨基酸1884至約氨基酸1917，例如從SEQ ID NO:65的約氨基酸1899至約氨基酸1911的區(qū)域。

在另一實(shí)施方案中，其中插入至少一個XTEN序列的一個或多個氨基酸位于a3結(jié)構(gòu)域，例如對應(yīng)于全長成熟FVIII多肽的氨基酸1649至1689內(nèi)。在特定實(shí)施方案中，XTEN序列插入在SEQ ID NO:65(全長成熟FVIII)的氨基酸1656與1657之間。在特定實(shí)施方案中，包含緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656的下游插入的XTEN序列的FVIII蛋白進(jìn)一步包含從對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745至氨基酸1656的缺失。

在一些實(shí)施方案中，用于一個或多個XTEN插入的一個或多個插入位點(diǎn)緊靠一個或多個選自由以下組成的組的對應(yīng)于成熟全長FVIII的氨基酸的下游：

(1)氨基酸3，(2)氨基酸18，(3)氨基酸22，

(4)氨基酸26，(5)氨基酸32，(6)氨基酸40，

(7)氨基酸60，(8)氨基酸65，(9)氨基酸81，

(10)氨基酸116，(11)氨基酸119，(12)氨基酸130，

(13)氨基酸188，(14)氨基酸211，(15)氨基酸216，

(16)氨基酸220，(17)氨基酸224，(18)氨基酸230，

(19)氨基酸333，(20)氨基酸336，(21)氨基酸339，

(22)氨基酸375，(23)氨基酸399，(24)氨基酸403，

(25)氨基酸409，(26)氨基酸416，(26)氨基酸442，

(28)氨基酸487，(29)氨基酸490，(30)氨基酸494，

(31)氨基酸500，(32)氨基酸518，(33)氨基酸599，

(34)氨基酸603，(35)氨基酸713，(36)氨基酸745，

(37)氨基酸1656，(38)氨基酸1711，(39)氨基酸1720，

(40)氨基酸1725，(41)氨基酸1749，(42)氨基酸1796，

(43)氨基酸1802，(44)氨基酸1827，(45)氨基酸1861，

(46)氨基酸1896，(47)氨基酸1900，(48)氨基酸1904，

(49)氨基酸1905，(50)氨基酸1910，(51)氨基酸1937，

(52)氨基酸2019，(53)氨基酸2068，(54)氨基酸2111，

(55)氨基酸2120，(56)氨基酸2171，(57)氨基酸2188，

(58)氨基酸2227，(59)氨基酸2277，和

(60)其兩個或更多個組合。

在一個實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的FVIII蛋白包含兩個XTEN序列，插入第一XTEN插入位點(diǎn)中的第一XTEN序列和插入第二XTEN插入位點(diǎn)中的第二XTEN。第一XTEN插入位點(diǎn)和第二XTEN插入位點(diǎn)的非限制性實(shí)例列于表11中。

表11.兩個XTEN的示例性插入位點(diǎn)

插入或連接于FVIII蛋白的兩個XTEN可相同或不同。在一些實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的FVIII蛋白包含兩個插入FVIII蛋白中的XTEN序列，緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745的下游插入的第一XTEN序列，以及緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸2332(C末端)的下游插入的第二XTEN序列。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸18、26、40、1656或1720的下游插入，并且第二XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸403的下游插入。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸18、26或40的下游插入，并且第二XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸599的下游插入。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656的下游插入，并且第二XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸18、26、40、399、403、1725、1720、1900、1905或2332的下游插入。在某些實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1900的下游插入，并且第二XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸18、26或40的下游插入。在一些實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸18、26或40的下游插入，并且第二XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸399的下游插入。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720的下游插入，并且第二XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸18、26或40的下游插入。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720的下游插入，并且第二XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸18的下游插入。在特定實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白包含兩個XTEN序列，緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745的下游插入的第一XTEN序列，以及緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸2332的下游插入的第二XTEN序列，其中所述FVIII蛋白進(jìn)一步具有從對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745至對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1685的缺失、在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1680處的突變或取代(例如Y1680F)、在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1648處的突變或取代(例如R1648A)、或在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1648(例如R1648A)和對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1680(例如Y1680F)處的至少兩個突變或取代。在特定實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白包含兩個XTEN序列，緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656的下游插入的第一XTEN，以及緊靠SEQ ID NO:65的氨基酸2332的下游插入的第二XTEN序列，其中FVIII蛋白進(jìn)一步具有從對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745至氨基酸1656的缺失。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白包含三個XTEN序列，插入第一XTEN插入位點(diǎn)中的第一XTEN序列、插入第二XTEN序列中的第二XTEN序列以及插入第三XTEN插入位點(diǎn)中的第三XTEN序列。第一、第二或第三XTEN序列可相同或不同。第一、第二和第三插入位點(diǎn)可選自本文公開的任一插入位點(diǎn)的組。在一些實(shí)施方案中，包含三個XTEN序列的FVIII蛋白可進(jìn)一步包含突變或取代，例如對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1648，例如R1648A。舉例來說，第一、第二和第三XTEN插入位點(diǎn)的非限制性實(shí)例列于表12中。

表12.三個XTEN的示例性插入位點(diǎn)

在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白包含三個XTEN序列，緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸26的下游插入的第一XTEN序列，插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸403的下游的第二XTEN序列，以及插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656、1720或1900的下游的第三XTEN序列。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸26的下游插入，第二XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656的下游，并且第三XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720或1900的下游。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸26的下游插入，第二XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720的下游，并且第三XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1900的下游。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸403的下游插入，第二XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656的下游，并且第三XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720或1900的下游。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸403或1656的下游插入，第二XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720的下游，并且第三XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1900的下游。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN序列緊靠對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸18、26、40、399、403、1711、1720、1725、1900、1905或1910的下游插入，第二XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸745的下游，并且第三XTEN序列插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸2332的下游。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明中的FVIII蛋白包含四個XTEN序列，插入第一插入位點(diǎn)中的第一XTEN序列、插入第二插入位點(diǎn)中的第二XTEN序列、插入第三插入位點(diǎn)中的第三XTEN序列以及插入第四插入位點(diǎn)中的第四XTEN序列。第一、第二、第三和第四XTEN序列可相同、不同或呈其組合形式。在一些實(shí)施方案中，包含四個XTEN序列的FVIII蛋白可進(jìn)一步包含突變或取代，例如對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1648，例如R1648A。第一、第二、第三和第四XTEN插入位點(diǎn)的非限制性實(shí)例列于表13中。

表13.四個XTEN的示例性插入位點(diǎn)

在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白包含五個XTEN序列，插入第一插入位點(diǎn)中的第一XTEN序列、插入第二插入位點(diǎn)中的第二XTEN序列、插入第三XTEN插入位點(diǎn)中的第三XTEN序列、插入第四XTEN插入位點(diǎn)中的第四XTEN序列以及插入第五XTEN插入位點(diǎn)中的第五XTEN序列。第一、第二、第三、第四或第五XTEN序列可相同、不同或呈其組合形式。第一、第二、第三、第四和第五插入位點(diǎn)的非限制性實(shí)例列于表14中。

表14.五個XTEN的示例性插入位點(diǎn)

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白包含六個XTEN序列，插入第一XTEN插入位點(diǎn)中的第一XTEN序列、插入第二XTEN插入位點(diǎn)中的第二XTEN序列、插入第三XTEN插入位點(diǎn)中的第三XTEN序列、插入第四XTEN插入位點(diǎn)中的第四XTEN序列、插入第五XTEN插入位點(diǎn)中的第五XTEN序列以及插入第六XTEN插入位點(diǎn)中的第六XTEN序列。第一、第二、第三、第四、第五或第六XTEN序列可相同、不同或呈其組合形式。六個XTEN插入位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于表15中所列的插入位點(diǎn)。

表15.六個XTEN的示例性XTEN插入位點(diǎn)

在一特定實(shí)例中，第一XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸26與27之間，并且第二XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65(全長成熟FVIII)的氨基酸1720與1721之間。在另一實(shí)例中，第一XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸403與404之間，并且第二XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720與1721之間。在一些實(shí)例中，第一XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656與1657之間，并且第二XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720與1721之間。在其它實(shí)例中，第一XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸26與27之間，第二XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656與1657之間，并且第三XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720與1721之間。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸403與404之間，第二XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656與1657之間，并且第三XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720與1721之間。在其它實(shí)施方案中，第一XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸403與404之間，第二XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656與1657之間，并且第三XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720與1721之間。在某些實(shí)施方案中，第一XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸26與27之間，第二XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720與1721之間，并且第三XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1900與1901之間。在一些實(shí)施方案中，第一XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸26與27之間，第二XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1656與1657之間，第三XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的氨基酸1720與1721之間，并且第四XTEN插入在對應(yīng)于SEQ ID NO:65的1900與1901之間。

在特定實(shí)施方案中，XTEN序列插入在全長因子VIII的氨基酸745與746之間或插入B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的相應(yīng)插入位點(diǎn)。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含兩個多肽序列，第一多肽序列包含與選自FVIII-161(SEQ ID NO:69)、FVIII-169(SEQ ID NO:70)、FVIII-170(SEQ ID NO:71)、FVIII-173(SEQ ID NO:72)、FVIII-195(SEQ ID NO:73)、FVIII-196(SEQ ID NO:74)、FVIII199(SEQ ID NO:75)、FVIII-201(SEQ ID NO:76)、FVIII-203(SEQ ID NO:77)、FVIII-204(SEQ ID NO:78)、FVIII-205(SEQ ID NO:79)、FVIII-266(SEQ ID NO:80)、FVIII-267(SEQ ID NO:81)、FVIII-268(SEQ ID NO:82)、FVIII-269(SEQ ID NO:83)、FVIII-271(SEQ ID NO:84)或FVIII-272(SEQ ID NO:85)的序列至少約80％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列，并且第二多肽序列包含與選自VWF031(SEQ ID NO:86)、VWF034(SEQ ID NO:87)或VWF-036的序列至少約80％、90％、95％或100％同一的氨基酸序列。

II.D.Ig恒定區(qū)或其一部分

本發(fā)明的嵌合蛋白也包括兩個Ig恒定區(qū)或其一部分，通過任選接頭融合于FVIII蛋白的第一Ig恒定區(qū)或其一部分，以及通過具有小于288個氨基酸的XTEN序列融合于VWF蛋白的第二Ig恒定區(qū)或其一部分。Ig恒定區(qū)或其一部分可與XTEN序列和VWF蛋白組合改進(jìn)嵌合蛋白的藥物動力學(xué)或藥力學(xué)性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，Ig恒定區(qū)或其一部分延長融合于Ig恒定區(qū)或其一部分的分子的半衰期。

Ig恒定區(qū)包含表示為CH(恒定重)結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2等)的結(jié)構(gòu)域。視同種型(即IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)而定，恒定區(qū)可包含三個或四個CH結(jié)構(gòu)域。一些同種型(例如IgG)恒定區(qū)也含有鉸鏈區(qū)。參見Janeway等2001,Immunobiology,Garland Publishing,N.Y.,N.Y。

用于產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合蛋白的Ig恒定區(qū)或其一部分可從許多不同來源獲得。在一些實(shí)施方案中，Ig恒定區(qū)或其一部分源于人Ig。然而，應(yīng)了解Ig恒定區(qū)或其一部分可源于另一哺乳動物物種的Ig，所述物種包括例如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。此外，Ig恒定區(qū)或其一部分可源于任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何Ig同種型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。在一個實(shí)施方案中，使用人同種型IgG1。

多種Ig恒定區(qū)基因序列(例如人恒定區(qū)基因序列)可以公開可得的寄存物形式獲得。可選擇具有特定效應(yīng)物功能(或缺乏特定效應(yīng)物功能)或具有用以降低免疫原性的特定修飾的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域序列。許多抗體和抗體編碼基因序列已被公開，并且可使用本領(lǐng)域認(rèn)可的技術(shù)從這些序列獲得適合Ig恒定區(qū)序列(例如鉸鏈、CH2和/或CH3序列或其部分)。使用任何前述方法獲得的遺傳物質(zhì)可接著加以改變或合成以獲得本發(fā)明的多肽。應(yīng)進(jìn)一步了解本發(fā)明的范圍涵蓋恒定區(qū)DNA序列的等位基因、變體和突變。

Ig恒定區(qū)或其一部分的序列可例如使用被選擇用以擴(kuò)增目標(biāo)結(jié)構(gòu)域的聚合酶鏈反應(yīng)和引物來克隆。為從抗體克隆Ig恒定區(qū)或其一部分的序列，可從雜交瘤、脾或淋巴細(xì)胞分離mRNA，逆轉(zhuǎn)錄成DNA，并且通過PCR擴(kuò)增抗體基因。PCR擴(kuò)增方法詳細(xì)描述于美國專利號4,683,195；4,683,202；4,800,159；4,965,188中；以及例如"PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications"Innis等編,Academic Press,San Diego,CA(1990)；Ho等1989.Gene 77:51；Horton等1993.Methods Enzymol.217:270)中。PCR可通過共有恒定區(qū)引物或通過基于公開的重鏈和輕鏈DNA和氨基酸序列的更特異性引物來引發(fā)。如上所討論，PCR也可用于分離編碼抗體輕鏈和重鏈的DNA克隆。在這個情況下，可通過共有引物或較大同源性探針(諸如小鼠恒定區(qū)探針)來篩選文庫。適于擴(kuò)增抗體基因的眾多引物組在本領(lǐng)域中是已知的(例如基于純化抗體的N末端序列的5'引物(Benhar和Pastan.1994.Protein Engineering 7:1509)；cDNA末端的快速擴(kuò)增物(Ruberti,F.等1994.J.Immunol.Methods 173:33)；抗體前導(dǎo)序列(Larrick等1989Biochem.Biophys.Res.Commun.160:1250)。對抗體序列的克隆進(jìn)一步描述于Newman等,1995年1月25日提交的美國專利號5,658,570中，所述專利以引用的方式并入本文。

本文所用的Ig恒定區(qū)可包括所有結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)或其部分。在一個實(shí)施方案中，Ig恒定區(qū)或其一部分包含CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，即Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體。

如本文所用，術(shù)語“Fc區(qū)”定義為多肽的對應(yīng)于天然Ig的Fc區(qū)的部分，即如通過它的兩個重鏈的相應(yīng)Fc結(jié)構(gòu)域的二聚締合所形成。天然Fc區(qū)與另一Fc區(qū)形成同二聚體。相反，如本文所用的術(shù)語“遺傳融合Fc區(qū)”或“單鏈Fc區(qū)”(scFc區(qū))是指合成二聚Fc區(qū)，其包含在單一多肽鏈內(nèi)遺傳連接的Fc結(jié)構(gòu)域(即在單一連續(xù)遺傳序列中編碼)。

在一個實(shí)施方案中，“Fc區(qū)”是指單一Ig重鏈的一部分，其在恰好在木瓜蛋白酶(papain)裂解位點(diǎn)(即IgG中的殘基216，將重鏈恒定區(qū)的第一殘基視為114)上游的鉸鏈區(qū)中開始，并且在抗體的C末端結(jié)束。因此，完全Fc結(jié)構(gòu)域包含至少鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。

視Ig同種型而定，Ig恒定區(qū)的Fc區(qū)可包括CH2、CH3和CH4結(jié)構(gòu)域以及鉸鏈區(qū)。包含Ig的Fc區(qū)的嵌合蛋白對嵌合蛋白賦予若干合乎需要的性質(zhì)，包括穩(wěn)定性增加、血清半衰期增加(參見Capon等,1989,Nature 337:525)以及結(jié)合Fc受體，諸如新生兒Fc受體(FcRn)(美國專利號6,086,875、6,485,726、6,030,613；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，所述文獻(xiàn)和專利以引用的方式整體并入本文。

Ig恒定區(qū)或其一部分可為FcRn結(jié)合配偶體。FcRn在成人上皮組織中具有活性，并且在腸腔、肺氣道、鼻表面、陰道表面、結(jié)腸和直腸表面中表達(dá)(美國專利號6,485,726)。FcRn結(jié)合配偶體是Ig的結(jié)合FcRn的部分。

已從包括人的若干哺乳動物物種分離FcRn受體。已知人FcRn、猴FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列(Story等1994,J.Exp.Med.180:2377)。FcRn受體在相對較低pH下結(jié)合IgG(但不結(jié)合其它Ig類別，諸如IgA、IgM、IgD和IgE)，以細(xì)胞腔至漿膜方向跨細(xì)胞主動轉(zhuǎn)運(yùn)IgG，接著在見于間隙液中的相對較高pH下釋放IgG。它在成人上皮組織(美國專利號6,485,726、6,030,613、6,086,875；；WO 03/077834；US2003-0235536A1)，包括肺和腸上皮(Israel等1997,Immunology 92:69)、腎近端管狀上皮(Kobayashi等2002,Am.J.Physiol.Renal Physiol.282:F358)以及鼻上皮；陰道表面；和膽系表面中表達(dá)。

適用于本發(fā)明中的FcRn結(jié)合配偶體涵蓋可由FcRn受體特異性結(jié)合的分子，包括完整IgG、IgG的Fc片段和包括FcRn受體的完全結(jié)合區(qū)的其它片段。已基于X射線結(jié)晶學(xué)描述IgG的Fc部分的結(jié)合FcRn受體的區(qū)域(Burmeister等1994,Nature 372:379)。Fc與FcRn的主要接觸區(qū)域接近CH2結(jié)構(gòu)域與CH3結(jié)構(gòu)域的接合點(diǎn)。Fc-FcRn接觸都在單一Ig重鏈內(nèi)。FcRn結(jié)合配偶體包括完整IgG、IgG的Fc片段和IgG的包括FcRn的完全結(jié)合區(qū)域的其它片段。主要接觸位點(diǎn)包括CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基385-387、428和433-436。對Ig或Ig片段的氨基酸編號所作的提及都基于Kabat等1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda,Md。

結(jié)合于FcRn的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體可通過FcRn有效地跨越上皮屏障穿梭，由此提供一種全身性施用所需治療分子的非侵入性手段。另外，包含F(xiàn)c區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體的融合蛋白由表達(dá)FcRn的細(xì)胞胞飲。但替代被標(biāo)記以進(jìn)行降解，這些融合蛋白再次再循環(huán)進(jìn)入循環(huán)中，由此增加這些蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期。在某些實(shí)施方案中，Ig恒定區(qū)的部分是Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體，其通常通過二硫鍵和其它非特異性相互作用與另一Fc區(qū)或另一FcRn結(jié)合配偶體締合以形成二聚體和更高級多聚體。

兩個FcRn受體可結(jié)合單一Fc分子。結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)表明各FcRn分子結(jié)合Fc同二聚體的單一多肽。在一個實(shí)施方案中，使FcRn結(jié)合配偶體(例如IgG的Fc片段)連接于生物活性分子會提供一種口服、經(jīng)頰、舌下、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道、以經(jīng)鼻或通過肺途徑施用的氣霧劑形式、或通過眼途徑遞送所述生物活性分子的手段。在另一實(shí)施方案中，可侵入性施用嵌合蛋白，例如皮下、靜脈內(nèi)。

FcRn結(jié)合配偶體區(qū)域是可由FcRn受體特異性結(jié)合，隨后由Fc區(qū)的FcRn受體主動轉(zhuǎn)運(yùn)的分子或其一部分。特異性結(jié)合是指兩個分子形成在生理?xiàng)l件下相對穩(wěn)定的復(fù)合物。特異性結(jié)合的特征在于親和力較高而能力較低至中等，如與通常親和力較低而能力中等至較高的非特異性結(jié)合相區(qū)分。通常，當(dāng)親和常數(shù)KA高于10⁶M^-1或高于10⁸M^-1時，結(jié)合被視為是特異性的。必要時，可通過改變結(jié)合條件來降低非特異性結(jié)合而不實(shí)質(zhì)上影響特異性結(jié)合。諸如分子濃度、溶液的離子強(qiáng)度、溫度、允許結(jié)合時間、阻斷劑(例如血清白蛋白、乳酪蛋白)濃度等的適當(dāng)結(jié)合條件可由熟練技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)加以優(yōu)化。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含一個或多個截短Fc區(qū)，盡管如此，所述Fc區(qū)仍然足以對Fc區(qū)賦予Fc受體(FcR)結(jié)合性質(zhì)。舉例來說，F(xiàn)c區(qū)的結(jié)合FcRn的部分(即FcRn結(jié)合部分)包含IgG1的約氨基酸282-438(EU編號)，(其中主要接觸位點(diǎn)是CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基385-387、428和433-436。因此，本發(fā)明的Fc區(qū)可包含F(xiàn)cRn結(jié)合部分或由FcRn結(jié)合部分組成。FcRn結(jié)合部分可源于包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4的任何同種型的重鏈。在一個實(shí)施方案中，使用來自具有人同種型IgG1的抗體的FcRn結(jié)合部分。在另一實(shí)施方案中，使用來自具有人同種型IgG4的抗體的FcRn結(jié)合部分。

在另一實(shí)施方案中，“Fc區(qū)”包括Fc結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或源于Fc結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包含以下中的至少一個：鉸鏈(例如上、中和/或下鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域(抗體Fc區(qū)的約氨基酸216-230，根據(jù)EU編號)、CH2結(jié)構(gòu)域(抗體Fc區(qū)的約氨基酸231-340，根據(jù)EU編號)、CH3結(jié)構(gòu)域(抗體Fc區(qū)的約氨基酸341-438，根據(jù)EU編號)、CH4結(jié)構(gòu)域、或其變體、部分或片段。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包含完全Fc結(jié)構(gòu)域(即鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域)。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：融合于CH3結(jié)構(gòu)域(或其一部分)的鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其一部分)、融合于CH2結(jié)構(gòu)域(或其一部分)的鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其一部分)、融合于CH3結(jié)構(gòu)域(或其一部分)的CH2結(jié)構(gòu)域(或其一部分)、融合于鉸鏈結(jié)構(gòu)域(或其一部分)與CH3結(jié)構(gòu)域(或其一部分)兩者的CH2結(jié)構(gòu)域(或其一部分)。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)缺乏CH2結(jié)構(gòu)域的至少一部分(例如CH2結(jié)構(gòu)域的全部或一部分)。在特定實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)包含以下或由以下組成：對應(yīng)于EU編號221至447的氨基酸。

在本文中表示為F、F1或F2的Fc區(qū)可從許多不同來源獲得。在一個實(shí)施方案中，多肽的Fc區(qū)源于人Ig。然而，應(yīng)了解Fc區(qū)可源于另一哺乳動物物種的Ig，所述物種包括例如嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)或非人靈長類動物(例如黑猩猩、獼猴)物種。此外，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域或其部分的多肽可源于任何Ig類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何Ig同種型(包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4)。在另一實(shí)施方案中，使用人同種型IgG1。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體賦予由包含所述野生型Fc結(jié)構(gòu)域的Fc區(qū)賦予的至少一種效應(yīng)物功能的變化(例如Fc區(qū)結(jié)合Fc受體(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或補(bǔ)體蛋白(例如C1q)、或觸發(fā)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDCC)的能力改進(jìn)或降低)。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c變體提供工程改造的半胱氨酸殘基。

本發(fā)明的Fc區(qū)可采用本領(lǐng)域認(rèn)可的已知會賦予效應(yīng)物功能和/或FcR或FcRn結(jié)合變化(例如增強(qiáng)或降低)的Fc變體。具體來說，本發(fā)明的結(jié)合分子可包括例如在以下中公開的一個或多個氨基酸位置處的變化(例如取代)：國際PCT公布WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO04/044859、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2；美國專利公布號US2007/0231329、US2007/0231329、US2007/0237765、US2007/0237766、US2007/0237767、US2007/0243188、US20070248603、US20070286859、US20080057056；或美國專利5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；7,083,784；7,404,956和7,317,091，其各自以引用的方式并入本文。在一個實(shí)施方案中，可在一個或多個公開的氨基酸位置處進(jìn)行特定變化(例如特定取代本領(lǐng)域中公開的一個或多個氨基酸)。在另一實(shí)施方案中，可在一個或多個公開的氨基酸位置處進(jìn)行不同變化(例如對本領(lǐng)域中公開的一個或多個氨基酸位置的不同取代)。

IgG的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體可根據(jù)充分認(rèn)可的程序(諸如定點(diǎn)誘變等)加以修飾以產(chǎn)生將由FcRn結(jié)合的修飾的IgG或其Fc片段或部分。所述修飾包括保持或甚至增強(qiáng)與FcRn的結(jié)合的遠(yuǎn)離FcRn接觸位點(diǎn)的修飾以及在接觸位點(diǎn)內(nèi)的修飾。舉例來說，人IgG1Fc(Fcγ1)中的以下單一氨基酸殘基可被取代而不顯著損失Fc對FcRn的結(jié)合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、P331A、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A和K447A，其中例如P238A表示野生型脯氨酸在位置編號238處被丙氨酸取代。舉例來說，一特定實(shí)施方案并有N297A突變，從而移除高度保守的N-糖基化位點(diǎn)。除丙氨酸之外，其它氨基酸也可在以上指定的位置處取代野生型氨基酸。突變可單一引入Fc中，從而產(chǎn)生超過一百個不同于天然Fc的Fc區(qū)。另外，兩個、三個或更多個這些個別突變的組合可一起引入，從而再產(chǎn)生數(shù)百個Fc區(qū)。此外，本發(fā)明的構(gòu)建體的一個Fc區(qū)可被突變，并且所述構(gòu)建體的另一Fc區(qū)完全不突變，或它們兩者均可被突變，但突變不同。

某些以上突變可對Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體賦予新功能性。舉例來說，一個實(shí)施例并有N297A，從而移除高度保守的N-糖基化位點(diǎn)。這個突變的作用在于降低免疫原性，由此增強(qiáng)Fc區(qū)的循環(huán)半衰期，以及在不損害對FcRn的親和力下致使Fc區(qū)不能結(jié)合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA(Routledge等1995,Transplantation 60:847；Friend等1999,Transplantation 68:1632；Shields等1995,J.Biol.Chem.276:6591)。作為由上述突變而產(chǎn)生的新功能性的另一實(shí)例，對FcRn的親和力在一些情況下可增加超過野生型對FcRn的親和力。這個親和力增加可反映“締合”速率增加、“解離”速率降低、或“締合”速率增加與“解離”速率降低兩者。據(jù)信會賦予對FcRn的親和力增加的突變的實(shí)例包括但不限于T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等2001,J.Biol.Chem.276:6591)。

另外，至少三種人Fcγ受體似乎識別IgG上在下鉸鏈區(qū)內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)，通常是氨基酸234-237。因此，新功能性和潛在免疫原性降低的另一實(shí)例可由這個區(qū)域的突變而產(chǎn)生，如例如通過將人IgG1的氨基酸233-236“ELLG”置換成來自IgG2的相應(yīng)序列“PVA”(有一個氨基酸缺失)。已顯示當(dāng)已引入所述突變時，介導(dǎo)各種效應(yīng)物功能的FcγRI、FcγRII和FcγRIII將不結(jié)合IgG1。Ward和Ghetie 1995,Therapeutic Immunology 2:77以及Armour等1999,Eur.J.Immunol.29:2613。

在一個實(shí)施方案中，Ig恒定區(qū)或其一部分(例如Fc區(qū))是包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO:89或美國專利號5,739,277的SEQ ID NO:3)，并且任選進(jìn)一步包括選自HQSLGTQ(SEQ ID NO:90)、HQNLSDGK(SEQ ID NO:91)、HQNISDGK(SEQ ID NO:92)或VISSHLGQ(SEQ ID NO:93)(或美國專利號5,739,277的分別SEQ ID NO:11、1、2和31)的序列的多肽。

在另一實(shí)施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)或其一部分包含在鉸鏈區(qū)或其一部分中的與另一免疫球蛋白恒定區(qū)或其一部分形成一個或多個二硫鍵的氨基酸序列。由免疫球蛋白恒定區(qū)或其一部分達(dá)成的二硫鍵將包含F(xiàn)VIII的第一多肽和包含VWF片段的第二多肽放置在一起以使內(nèi)源性VWF不置換VWF片段，并且不結(jié)合FVIII。因此，第一免疫球蛋白恒定區(qū)或其一部分與第二免疫球蛋白恒定區(qū)或其一部分之間的二硫鍵會防止內(nèi)源性VWF與FVIII蛋白之間的相互作用。對VWF與FVIII蛋白之間的相互作用的這個抑制允許嵌合蛋白的半衰期超過兩倍限制。鉸鏈區(qū)或其一部分可進(jìn)一步連接于以下一個或多個結(jié)構(gòu)域：CH1、CH2、CH3、其片段及其任何組合。在特定實(shí)施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)或其一部分是鉸鏈區(qū)和CH2。

在某些實(shí)施方案中，Ig恒定區(qū)或其一部分被半糖基化。舉例來說，包含兩個Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體的嵌合蛋白可含有第一糖基化Fc區(qū)(例如糖基化CH2區(qū))或FcRn結(jié)合配偶體和第二無糖基化Fc區(qū)(例如無糖基化CH2區(qū))或FcRn結(jié)合配偶體。在一個實(shí)施方案中，接頭可插入在糖基化Fc區(qū)與無糖基化Fc區(qū)之間。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體被完全糖基化，即所有Fc區(qū)都被糖基化。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)可為無糖基化的，即無Fc部分被糖基化。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含對Ig恒定區(qū)或其一部分的氨基酸取代(例如Fc變體)，其改變Ig恒定區(qū)的抗原非依賴性效應(yīng)物功能，特別是蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期。

當(dāng)相較于缺乏這些取代的蛋白質(zhì)時，所述蛋白質(zhì)展現(xiàn)與FcRn的結(jié)合增加或降低，并且因此在血清中的半衰期分別增加或降低。預(yù)期對FcRn的親和力改進(jìn)的Fc變體會具有較長血清半衰期，并且所述分子在治療哺乳動物的方法(其中施用的多肽的長久半衰期例如為治療慢性疾病或病癥所需)中具有適用應(yīng)用(參見例如美國專利7,348,004、7,404,956和7,862,820)。相反，預(yù)期FcRn結(jié)合親和力降低的Fc變體會具有較短半衰期，并且所述分子也適用于例如在循環(huán)時間縮短可為有利時向哺乳動物施用，例如對于體內(nèi)診斷成像或在起始多肽在持續(xù)延長時期存在于循環(huán)中時具有毒性副作用的情況下。FcRn結(jié)合親和力降低的Fc變體跨越胎盤的可能性也較小，并且因此也適用于治療妊娠婦女的疾病或病癥。此外，其中可需要FcRn結(jié)合親和力降低的其它應(yīng)用包括其中需要定位于腦、腎和/或肝的那些應(yīng)用。在一個示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白展現(xiàn)從血管結(jié)構(gòu)跨越腎小球的上皮的轉(zhuǎn)運(yùn)降低。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白展現(xiàn)從腦跨越血腦屏障(BBB)進(jìn)入血管間隙中的轉(zhuǎn)運(yùn)降低。在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)cRn結(jié)合改變的蛋白質(zhì)包含至少一個在Ig恒定區(qū)的“FcRn結(jié)合環(huán)”內(nèi)具有一個或多個氨基酸取代的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體(例如一或兩個Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體)。FcRn結(jié)合環(huán)包含野生型全長Fc區(qū)的氨基酸殘基280-299(根據(jù)EU編號)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白中具有改變的FcRn結(jié)合親和力的Ig恒定區(qū)或其一部分包括至少一個在FcRn“接觸區(qū)”內(nèi)具有一個或多個氨基酸取代的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體。如本文所用，術(shù)語FcRn“接觸區(qū)”包括在野生型全長Fc部分的以下位置處的殘基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU編號)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有改變的FcRn結(jié)合親和力的Ig恒定區(qū)或其一部分包括至少一個在對應(yīng)于任一以下EU位置的氨基酸位置處具有一個或多個氨基酸取代的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如N434A或N434K)和438。改變FcRn結(jié)合活性的示例性氨基酸取代公開于國際PCT公布號WO05/047327中，所述公布以引用的方式并入本文。

本發(fā)明中使用的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體也可包含本領(lǐng)域認(rèn)可的改變嵌合蛋白的糖基化的氨基酸取代。舉例來說，嵌合蛋白的連接于VWF片段或FVIII蛋白的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體可包括具有導(dǎo)致糖基化(例如N連接或O連接的糖基化)降低的突變的Fc區(qū)，或可包括糖形式改變(例如低海藻糖(fucose)或無海藻糖聚糖)的野生型Fc部分。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的未加工嵌合蛋白可包含遺傳融合Fc區(qū)(即scFc區(qū))，所述Fc區(qū)的組成Ig恒定區(qū)或其一部分中的兩個或更多個獨(dú)立地選自本文所述的Ig恒定區(qū)或其一部分。在一個實(shí)施方案中，二聚Fc區(qū)的Fc區(qū)是相同的。在另一實(shí)施方案中，至少兩個Fc區(qū)是不同的。舉例來說，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體包含相同數(shù)目的氨基酸殘基，或它們可在長度方面相差一個或多個氨基酸殘基(例如約5個氨基酸殘基(例如1、2、3、4或5個氨基酸殘基)、約10個殘基、約15個殘基、約20個殘基、約30個殘基、約40個殘基或約50個殘基)。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體可在序列方面在一個或多個氨基酸位置處不同。舉例來說，至少兩個Fc區(qū)或FcRn結(jié)合配偶體可在約5個氨基酸位置(例如1、2、3、4或5個氨基酸位置)、約10個位置、約15個位置、約20個位置、約30個位置、約40個位置、或約50個位置處不同。

II.E.接頭

本發(fā)明的嵌合蛋白進(jìn)一步包含一個或多個接頭。一種接頭類型是可裂解接頭，其在體內(nèi)向受試者施用，例如在凝血部位處施用時可由各種蛋白酶裂解。在一個實(shí)施方案中，可裂解接頭允許在凝血級聯(lián)部位處從XTEN序列，由此從嵌合蛋白裂解部分(例如VWF蛋白)，由此使活化FVIII(FVIIIa)具有它的FVIIIa活性。另一接頭類型是可加工接頭，其含有細(xì)胞內(nèi)裂解位點(diǎn)，并且因此可由宿主細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)加工酶裂解，從而允許適當(dāng)表達(dá)多肽和形成嵌合蛋白。

一個或多個接頭可存在于嵌合蛋白中的任何兩個蛋白質(zhì)之間。在一個實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)第一Ig恒定區(qū)或其一部分；和第二多肽，所述第二多肽包含(iii)VWF蛋白，(iv)接頭(例如可裂解接頭)，(v)XTEN序列，和(vi)第二Ig恒定區(qū)或其一部分。在另一實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)第一Ig恒定區(qū)或其一部分；和第二多肽，所述第二多肽包含(iii)VWF蛋白，(iv)XTEN序列，(v)接頭(例如可裂解接頭)，和(vi)第二Ig恒定區(qū)或其一部分。在其它實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含第一多肽，所述第一多肽包含(i)FVIII蛋白和(ii)第一Ig恒定區(qū)或其一部分；和第二多肽，所述第二多肽包含(iii)VWF蛋白，(iv)第一接頭(例如可裂解接頭)，(v)XTEN序列，(vi)第二接頭(例如可裂解接頭)，和(vii)第二Ig恒定區(qū)或其一部分。在一些實(shí)施方案中，第一多肽進(jìn)一步在FVIII蛋白與第一Ig恒定區(qū)之間包含接頭，例如可裂解接頭。

在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含單鏈，其包含(i)FVIII蛋白，(ii)第一Ig恒定區(qū)或其一部分，(iii)接頭(例如可加工接頭)，(iv)VWF蛋白，(v)XTEN序列，和(vi)第二Ig恒定區(qū)或其一部分。在其它實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含單鏈，其包含(i)FVIII蛋白，(ii)第一Ig恒定區(qū)或其一部分，(iii)第一接頭(例如可加工接頭)，(iv)VWF蛋白，(v)第二接頭(例如可裂解接頭)，(vi)XTEN序列，和(vii)第二Ig恒定區(qū)或其一部分。在嵌合蛋白在宿主細(xì)胞中表達(dá)之后，可加工接頭可被加工；因此在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的嵌合蛋白可呈包含兩個或三個多肽鏈的最終形式。

適用于本發(fā)明中的接頭可包括任何有機(jī)分子。在一個實(shí)施方案中，接頭包括聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或羥乙基淀粉(HES)。在另一實(shí)施方案中，接頭包括氨基酸序列。接頭可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000個氨基酸。接頭可包含1-5個氨基酸、1-10個氨基酸、1-20個氨基酸、10-50個氨基酸、50-100個氨基酸、100-200個氨基酸、200-300個氨基酸、300-400個氨基酸、400-500個氨基酸、500-600個氨基酸、600-700個氨基酸、700-800個氨基酸、800-900個氨基酸或900-1000個氨基酸。在一個實(shí)施方案中，接頭包括XTEN序列。XTEN的其它實(shí)例可根據(jù)本發(fā)明加以使用，并且公開于美國專利公布號2010/0239554 A1、2010/0323956 A1、2011/0046060 A1、2011/0046061 A1、2011/0077199 A1或2011/0172146 A1或國際專利公布號WO 2010091122 A1、WO 2010144502 A2、WO 2010144508 A1、WO 2011028228 A1、WO 2011028229 A1或WO 2011028344 A2中。在另一實(shí)施方案中，接頭是PAS序列。

在一個實(shí)施方案中，接頭是聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或羥乙基淀粉(HES)。在另一實(shí)施方案中，接頭是氨基酸序列。接頭可包含至少約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000個氨基酸。接頭可包含1-5個氨基酸、1-10個氨基酸、1-20個氨基酸、10-50個氨基酸、50-100個氨基酸、100-200個氨基酸、200-300個氨基酸、300-400個氨基酸、400-500個氨基酸、500-600個氨基酸、600-700個氨基酸、700-800個氨基酸、800-900個氨基酸或900-1000個氨基酸。

接頭的實(shí)例在本領(lǐng)域中是熟知的。在一個實(shí)施方案中，接頭包含序列G_n。接頭可包含序列(GA)_n。接頭可包含序列(GGS)_n。在其它實(shí)施方案中，接頭包含(GGGS)_n(SEQ ID NO:101)。在其它實(shí)施方案中，接頭包含序列(GGS)_n(GGGGS)_n(SEQ ID NO:95)。在這些情況下，n可為整數(shù)1-100。在其它情況下，n可為整數(shù)1-20，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。接頭的實(shí)例包括但不限于GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO:96)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO:97)、GGSGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:98)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO:99)或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:100)。接頭不消除或減弱VWF蛋白活性或因子VIII的凝結(jié)活性。任選地，接頭增強(qiáng)VWF蛋白活性或因子VIII蛋白的凝結(jié)活性，例如通過進(jìn)一步減弱空間位阻效應(yīng)，以及使VWF蛋白或因子VIII部分更易于到達(dá)它的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)。

在一個實(shí)施方案中，適用于嵌合蛋白的接頭的長度是15-25個氨基酸。在另一實(shí)施方案中，適用于嵌合蛋白的接頭的長度是15-20個氨基酸。在一些實(shí)施方案中，用于嵌合蛋白的接頭的長度是10-25個氨基酸。在其它實(shí)施方案中，用于嵌合蛋白的接頭的長度是15個氨基酸。在其它實(shí)施方案中，用于嵌合蛋白的接頭是(GGGGS)_n(SEQ ID NO:94)，其中G表示甘氨酸，S表示絲氨酸，并且n是整數(shù)1-20。

II.F.裂解位點(diǎn)

可裂解接頭可并有能夠以化學(xué)方式(例如水解酯鍵)、以酶促方式(即并有蛋白酶裂解序列)或以光解方式(例如發(fā)色團(tuán)，諸如3-氨基-3-(2-硝基苯基)丙酸(ANP))裂解的部分以使一種分子從另一分子釋放。

在一個實(shí)施方案中，可裂解接頭在N末端或C末端或兩者處包含一個或多個裂解位點(diǎn)。在另一實(shí)施方案中，可裂解接頭基本上由一個或多個可裂解位點(diǎn)組成或由一個或多個可裂解位點(diǎn)組成。在其它實(shí)施方案中，可裂解接頭包含本文所述的異源性氨基酸接頭序列或聚合物和一個或多個可裂解位點(diǎn)。

在某些實(shí)施方案中，可裂解接頭包含一個或多個可在宿主細(xì)胞中裂解的裂解位點(diǎn)(即細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn))。裂解位點(diǎn)的非限制性實(shí)例包括RRRR(SEQ ID NO:102)、RKRRKR(SEQ ID NO:103)和RRRRS(SEQ ID NO:104)。

在一些實(shí)施方案中，可裂解接頭包括來自FVIII的a1區(qū)、來自FVIII的a2區(qū)、來自FVIII的a3區(qū)、包含X-V-P-R(SEQ ID NO:105)和PAR1外結(jié)合位點(diǎn)相互作用基序的凝血酶可裂解位點(diǎn)(其中X是脂族氨基酸)或其任何組合。包括a2區(qū)，其包含與對應(yīng)于全長FVIII的Glu720至Arg740至少約80％、約85％、約90％、約95％或100％同一的氨基酸序列，其中所述a2區(qū)能夠由凝血酶裂解。在特定實(shí)施方案中，適用于本發(fā)明的可裂解接頭包括a2區(qū)，其包含ISDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:106)。在其它實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的可裂解接頭包括a1區(qū)，其包含與對應(yīng)于全長FVIII的Met337至Arg372至少約80％、約85％、約90％、約95％或100％同一的氨基酸序列，其中所述a1區(qū)能夠由凝血酶裂解。在特定實(shí)施方案中，a1區(qū)包含ISMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSV(SEQ ID NO:107)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的可裂解接頭包括a3區(qū)，其包含與對應(yīng)于全長FVIII的Glu1649至Arg1689至少約80％、約85％、約90％、約95％或100％同一的氨基酸序列，其中所述a3區(qū)能夠由凝血酶裂解。在特定實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的可裂解接頭包括a3區(qū)，其包含ISEITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQ(SEQ ID NO:108)。

在其它實(shí)施方案中，可裂解接頭包括凝血酶裂解位點(diǎn)，其包含X-V-P-R(SEQ ID NO:105)和PAR1外結(jié)合位點(diǎn)相互作用基序，并且其中所述PAR1外結(jié)合位點(diǎn)相互作用基序包含S-F-L-L-R-N(SEQ ID NO:109)。PAR1外結(jié)合位點(diǎn)相互作用基序可進(jìn)一步包含選自以下的氨基酸序列：P、P-N、P-N-D、P-N-D-K(SEQ ID NO:110)、P-N-D-K-Y(SEQ ID NO:111)、P-N-D-K-Y-E(SEQ ID NO:112)、P-N-D-K-Y-E-P(SEQ ID NO:113)、P-N-D-K-Y-E-P-F(SEQ ID NO:114)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W(SEQ ID NO:115)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E(SEQ ID NO:116)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D(SEQ ID NO:117)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E(SEQ ID NO:118)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E(SEQ ID NO:119)、P-N-D-K-Y-E-P-F-W-E-D-E-E-S(SEQ ID NO:120)或其任何組合。在一些實(shí)施方案中，脂族氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸。

在其它實(shí)施方案中，可裂解接頭包含一個或多個在向受試者施用包含所述可裂解接頭的嵌合蛋白之后由蛋白酶裂解的裂解位點(diǎn)。在一個實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)由選自由以下組成的組的蛋白酶裂解：因子XIa、因子XIIa、胰舒血管素、因子VIIa、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、MMP-12、MMP-13、MMP-17和MMP-20。在另一實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)選自由以下組成的組：FXIa裂解位點(diǎn)(例如KLTR↓AET(SEQ ID NO:121))、FXIa裂解位點(diǎn)(例如DFTR↓VVG(SEQ ID NO:122))、FXIIa裂解位點(diǎn)(例如TMTR↓IVGG(SEQ ID NO:123))、胰舒血管素裂解位點(diǎn)(例如SPFR↓STGG(SEQ ID NO:124))、FVIIa裂解位點(diǎn)(例如LQVR↓IVGG(SEQ ID NO:125))、FIXa裂解位點(diǎn)(例如PLGR↓IVGG(SEQ ID NO:126))、FXa裂解位點(diǎn)(例如IEGR↓TVGG(SEQ ID NO:127))、FIIa(凝血酶)裂解位點(diǎn)(例如LTPR↓SLLV(SEQ ID NO:128))、彈性蛋白酶-2裂解位點(diǎn)(例如LGPV↓SGVP(SEQ ID NO:129))、粒酶-B裂解(例如VAGD↓SLEE(SEQ ID NO:130))、MMP-12裂解位點(diǎn)(例如GPAG↓LGGA(SEQ ID NO:131))、MMP-13裂解位點(diǎn)(例如GPAG↓LRGA(SEQ ID NO:132))、MMP-17裂解位點(diǎn)(例如APLG↓LRLR(SEQ ID NO:133))、MMP-20裂解位點(diǎn)(例如PALP↓LVAQ(SEQ ID NO:134))、TEV裂解位點(diǎn)(例如ENLYFQ↓G(SEQ ID NO:135))、腸激酶裂解位點(diǎn)(例如DDDK↓IVGG(SEQ ID NO:136))、蛋白酶3C(PRESCISSION^TM)裂解位點(diǎn)(例如LEVLFQ↓GP(SEQ ID NO:137))和分選酶A裂解位點(diǎn)(例如LPKT↓GSES)(SEQ ID NO:138)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)XIa裂解位點(diǎn)包括但不限于例如TQSFNDFTR(SEQ ID NO:1)和SVSQTSKLTR(SEQ ID NO:3)。非限制性示例性凝血酶裂解位點(diǎn)包括例如DFLAEGGGVR(SEQ ID NO:4)、TTKIKPR(SEQ ID NO:5)、LVPRG(SEQ ID NO:6)、DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNA IEPRSFS(SEQ ID NO:88)或IEPRSFS(SEQ ID NO:194)以及包含ALRPR(SEQ ID NO:7)、基本上由ALRPR(SEQ ID NO:7)組成或由ALRPR(SEQ ID NO:7)組成的序列(例如ALRPRVVGGA(SEQ ID NO:145))。

在特定實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)是TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO:146)。在另一實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:88)或其片段。在一個特定實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含IEPRSFS(SEQ ID NO:194)。在另一實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含EPRSFS(SEQ ID NO:195)，其中所述裂解位點(diǎn)不是FVIII的全長a2區(qū)。在另一實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含IEPR(SEQ ID NO:200)。在另一實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含IEPR(SEQ ID NO:200)，其中所述裂解位點(diǎn)不是FVIII的全長a2區(qū)，或不包含F(xiàn)VIII的全長a2區(qū)。在其它實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:88)、KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:139)、NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:140)、TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:141)、GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:142)、DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:143)、YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:144)、YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:176)、EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:177)、DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:178)、SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:179)、YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:180)、EDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:181)、DISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:182)、ISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:183)、SAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:184)、AYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:185)、YLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:186)、LLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:187)、LSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:188)、SKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:189)、KNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:190)、NNAIEPRSFS(SEQ ID NO:191)、NAIEPRSFS(SEQ ID NO:192)、AIEPRSFS(SEQ ID NO:193)或IEPRSFS(SEQ ID NO:194)。在其它實(shí)施方案中，裂解位點(diǎn)包含DKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:88)、KNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:139)、NTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:140)、TGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:141)、GDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:142)、DYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:143)、YYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:144)、YEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:176)、EDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:177)、DSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:178)、SYEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:179)、YEDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:180)、EDISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:181)、DISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:182)、ISAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:183)、SAYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:184)、AYLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:185)、YLLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:186)、LLSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:187)、LSKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:188)、SKNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:189)、KNNAIEPRSFS(SEQ ID NO:190)、NNAIEPRSFS(SEQ ID NO:191)、NAIEPRSFS(SEQ ID NO:192)、AIEPRSFS(SEQ ID NO:193)或IEPRSFS(SEQ ID NO:194)，其中所述裂解位點(diǎn)不是全長FVIII a2區(qū)。在某些實(shí)施方案中，在如本文提供或如本領(lǐng)域中已知的凝血酶裂解測定中，可裂解接頭是可裂解的。

III.多核苷酸、載體和宿主細(xì)胞

本發(fā)明中也提供一種編碼本發(fā)明的嵌合蛋白的多核苷酸。在一個實(shí)施方案中，第一多肽鏈和第二多肽鏈可由單一多核苷酸鏈編碼。在另一實(shí)施方案中，第一多肽鏈和第二多肽鏈由兩個不同多核苷酸(即第一核苷酸序列和第二核苷酸序列)編碼。在另一實(shí)施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列在兩個不同多核苷酸(例如不同載體)上。

本發(fā)明包括一種編碼單一多肽鏈(例如FVIII(X2)-F1-L3-F2-L2-X1-L1-V)的多核苷酸，其中FVIII(X2)包括其中在一個或多個插入位點(diǎn)處插入XTEN序列的FVIII蛋白，F(xiàn)1包括第一Ig恒定區(qū)或其一部分，例如第一Fc區(qū)，L1包括第一接頭，V包括VWF蛋白，X1包括在長度方面具有小于288個氨基酸的XTEN序列，L2包括第二接頭，L3包括第三接頭，并且F2包括第二Ig恒定區(qū)或其一部分，例如第二Fc區(qū)。本發(fā)明也包括兩個多核苷酸，第一多核苷酸序列編碼包含融合于第一Ig恒定區(qū)或其一部分的FVIII蛋白的第一多肽，并且第二多核苷酸序列編碼包含VWF蛋白、在長度方面具有小于288個氨基酸的XTEN序列以及第二Ig恒定區(qū)或其一部分的第二多肽。在一些實(shí)施方案中，包含兩個多肽鏈或三個多肽鏈的嵌合蛋白可由單一多核苷酸鏈編碼，接著加工成兩個或三個(或更多個)多肽鏈。在其它實(shí)施方案中，包含這些多肽鏈的嵌合蛋白可由兩個或三個多核苷酸鏈編碼。

在其它實(shí)施方案中，多核苷酸組進(jìn)一步包含編碼蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶的另外的核苷酸鏈(例如當(dāng)嵌合多肽由單一多核苷酸鏈編碼時的第二核苷酸鏈或當(dāng)嵌合蛋白由兩個多核苷酸鏈編碼時的第三核苷酸鏈)。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶可選自由以下組成的組：原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 5型(PCSK5或PC5)、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 7型(PCSK7或PC5)、酵母Kex 2、原蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 3型(PACE或PCSK3)及其兩個或更多個組合。在一些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶是PACE、PC5或PC7。在特定實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶是PC5或PC7。參見國際申請?zhí)朠CT/US2011/043568。

如本文所用，表達(dá)載體是指含有在引入適當(dāng)宿主細(xì)胞中時，為轉(zhuǎn)錄和翻譯插入編碼序列所必需的元件，或在RNA病毒載體的情況下，為復(fù)制和翻譯所必需的元件的任何核酸構(gòu)建體。表達(dá)載體可包括質(zhì)粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。

本發(fā)明的表達(dá)載體將包括編碼本文所述的嵌合蛋白的多核苷酸。在一個實(shí)施方案中，包含F(xiàn)VIII蛋白和第一Ig恒定區(qū)的第一多肽；包含VWF蛋白、具有小于288個氨基酸的XTEN序列以及第二Ig恒定區(qū)或其一部分的第二多肽；或兩者的編碼序列中的一個或多個被可操作地連接于表達(dá)控制序列。如本文所用，當(dāng)兩個核酸序列以允許各組成核酸序列保留它的功能性的方式共價連接時，它們被可操作地連接。當(dāng)編碼序列和基因表達(dá)控制序列以將編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄和/或翻譯置于基因表達(dá)控制序列的影響或控制下的方式共價連接時，它們被稱為被可操作地連接。如果誘導(dǎo)5'基因表達(dá)序列中的啟動子導(dǎo)致編碼序列轉(zhuǎn)錄，并且如果兩個DNA序列之間的鍵聯(lián)的性質(zhì)不(1)導(dǎo)致引入框移突變，(2)干擾啟動子區(qū)域引導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾相應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄物被翻譯成蛋白質(zhì)的能力，那么兩個DNA序列被稱為被可操作地連接。因此，如果基因表達(dá)序列能夠?qū)崿F(xiàn)編碼核酸序列的轉(zhuǎn)錄以使所得轉(zhuǎn)錄物翻譯成所需蛋白質(zhì)或多肽，那么所述基因表達(dá)序列將被可操作地連接于那個編碼核酸序列。

如本文所用的基因表達(dá)控制序列是有助于它所可操作地連接的編碼核酸的高效轉(zhuǎn)錄和翻譯的任何調(diào)控核苷酸序列，諸如啟動子序列或啟動子-增強(qiáng)子組合?；虮磉_(dá)控制序列可例如是哺乳動物或病毒啟動子，諸如組成性或誘導(dǎo)性啟動子。組成性哺乳動物啟動子包括但不限于以下基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)、腺苷脫氨酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子和其它組成性啟動子。在真核細(xì)胞中組成性起作用的示例性病毒啟動子包括例如來自巨細(xì)胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如SV40)、乳頭狀瘤病毒(papilloma virus)、腺病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、勞斯肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、莫洛尼白血病病毒(Moloney leukemia virus)的長末端重復(fù)序列(LTR)和其它逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。其它組成性啟動子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。適用作本發(fā)明的基因表達(dá)序列的啟動子也包括誘導(dǎo)性啟動子。誘導(dǎo)性啟動子在誘導(dǎo)劑存在下表達(dá)。舉例來說，誘導(dǎo)金屬硫蛋白啟動子以促進(jìn)在某些金屬離子存在下的轉(zhuǎn)錄和翻譯。其它誘導(dǎo)性啟動子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。

一般來說，基因表達(dá)控制序列在必要時將包括分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯啟始的5'非轉(zhuǎn)錄和5'非翻譯序列，諸如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。尤其地，所述5'非轉(zhuǎn)錄序列將包括啟動子區(qū)域，所述區(qū)域包括用于對可操作地接合的編碼核酸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動子序列?；虮磉_(dá)序列任選包括如所需的增強(qiáng)子序列或上游活化子序列。

病毒載體包括但不限于來自以下病毒的核酸序列：逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如莫洛尼鼠類白血病病毒、哈維(Harvey)鼠類肉瘤病毒、鼠類乳腺腫瘤病毒和勞斯肉瘤病毒；腺病毒、腺相關(guān)病毒；SV40型病毒；多型瘤病毒；艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)；乳頭狀瘤病毒；皰疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒；和RNA病毒，諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒?？梢子诓捎帽绢I(lǐng)域中熟知的其它載體。某些病毒載體基于其中非必需基因已被目標(biāo)基因置換的非細(xì)胞病變真核病毒。非細(xì)胞病變病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，其生命周期涉及基因組病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA，隨后前病毒整合至宿主細(xì)胞DNA中。逆轉(zhuǎn)錄病毒已被核準(zhǔn)用于人基因療法試驗(yàn)。最適用的是具有復(fù)制缺陷性的那些逆轉(zhuǎn)錄病毒(即能夠引導(dǎo)合成所需蛋白質(zhì)，但不能制造感染性粒子)。所述遺傳改變的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體具有用于在體內(nèi)高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的一般效用。用于產(chǎn)生復(fù)制缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒的標(biāo)準(zhǔn)方案(包括以下步驟：將外源性遺傳物質(zhì)并入質(zhì)粒中，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，由所述包裝細(xì)胞系產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，從組織培養(yǎng)基收集病毒粒子，以及用病毒粒子感染靶標(biāo)細(xì)胞)提供于Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman Co.,New York(1990)以及Murry,E.J.,Methods in Molecular Biology,第7卷,Humana Press,Inc.,Cliffton,N.J.(1991)中。

在一個實(shí)施方案中，病毒是腺相關(guān)病毒，其是一種雙鏈DNA病毒。腺相關(guān)病毒可被工程改造以具有復(fù)制缺陷性，并且能夠感染廣泛范圍的細(xì)胞類型和物種。它進(jìn)一步具有諸如以下的優(yōu)勢：熱和脂質(zhì)溶劑穩(wěn)定性；在不同譜系的細(xì)胞(包括造血細(xì)胞)中具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率；以及缺乏重復(fù)感染抑制，因此允許進(jìn)行多級轉(zhuǎn)導(dǎo)。據(jù)報(bào)道，腺相關(guān)病毒可以位點(diǎn)特異性方式整合至人細(xì)胞DNA中，由此使逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的插入誘變的可能性和插入基因表達(dá)特征的可變性最小。此外，野生型腺相關(guān)病毒感染已在不存在選擇壓力下在組織培養(yǎng)中進(jìn)行大于100繼代，從而暗示腺相關(guān)病毒基因組整合是相對穩(wěn)定事件。腺相關(guān)病毒也可以染色體外方式起作用。

其它載體包括質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體已在本領(lǐng)域中廣泛描述，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。參見例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。在過去數(shù)年中，已發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒載體由于不能在宿主基因組內(nèi)復(fù)制以及整合至宿主基因組中而特別有利于在體內(nèi)將基因遞送至細(xì)胞中。然而，具有可與宿主細(xì)胞相容的啟動子的這些質(zhì)?？蓮目刹僮鞯鼐幋a于質(zhì)粒內(nèi)的基因表達(dá)肽。一些可從商業(yè)供應(yīng)商獲得的通常使用的質(zhì)粒包括pBR322、pUC18、pUC19、各種pcDNA質(zhì)粒、pRC/CMV、各種pCMV質(zhì)粒、pSV40和pBlueScript。特定質(zhì)粒的其它實(shí)例包括pcDNA3.1，目錄號V79020；pcDNA3.1/hygro，目錄號V87020；pcDNA4/myc-His，目錄號V86320；和pBudCE4.1，目錄號V53220，全部來自Invitrogen(Carlsbad,CA.)。其它質(zhì)粒為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知。另外，可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)定制設(shè)計(jì)質(zhì)粒以移除和/或添加特定DNA片段。

在一種可用于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核多角體病病毒(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus，AcNPV)用作表達(dá)外來基因的載體。病毒生長在草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞中。編碼序列可被克隆至病毒的非必需區(qū)域(例如多角體基因)中，并且置于ACNPV啟動子(例如多角體啟動子)的控制下。成功插入編碼序列將導(dǎo)致多角體基因失活，以及產(chǎn)生非封閉重組病毒(即缺乏由多角體基因編碼的蛋白質(zhì)外殼的病毒)。這些重組病毒接著用于感染其中表達(dá)插入基因的草地貪夜蛾細(xì)胞。(參見例如Smith等(1983)J Virol 46:584；美國專利號4,215,051)。這個表達(dá)系統(tǒng)的其它實(shí)例可見于Ausubel等編(1989)Current Protocols in Molecular Biology,第2卷,Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience中。

可用于表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的另一系統(tǒng)是谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)系統(tǒng)，也被稱為“GS表達(dá)系統(tǒng)”(Lonza Biologics PLC,Berkshire UK)。這個表達(dá)系統(tǒng)詳述于美國專利號5,981,216中。

在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可利用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在其中腺病毒用作表達(dá)載體的情況下，編碼序列可連接于腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，例如晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。這個嵌合基因可接著通過體外或體內(nèi)重組插入腺病毒基因組中。插入在病毒基因組的非必需區(qū)域(例如區(qū)域E1或E3)中將產(chǎn)生在受感染宿主中具有活力，并且能夠表達(dá)肽的重組病毒。參見例如Logan和Shenk(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81:3655)?；蛘?，可使用痘苗7.5K啟動子。參見例如Mackett等(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79:7415；Mackett等(1984)J Virol 49:857；Panicali等(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79:4927。

為增加產(chǎn)生效率，多核苷酸可被設(shè)計(jì)以編碼由酶裂解位點(diǎn)分開的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的多個單元。所得多肽可被裂解(例如通過用適當(dāng)酶處理)以回收多肽單元。這可增加由單一啟動子驅(qū)動的多肽的產(chǎn)量。當(dāng)用于適當(dāng)病毒表達(dá)系統(tǒng)中時，由mRNA編碼的各多肽的翻譯在轉(zhuǎn)錄物內(nèi)部受引導(dǎo)；例如由內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES引導(dǎo)。因此，多順反子構(gòu)建體引導(dǎo)單一大型多順反子mRNA的轉(zhuǎn)錄，此轉(zhuǎn)而引導(dǎo)多個個別多肽的翻譯。這個方法消除多聚蛋白的產(chǎn)生和酶促加工，并且可顯著增加由單一啟動子驅(qū)動的多肽的產(chǎn)量。

轉(zhuǎn)化中使用的載體將通常含有用于鑒定轉(zhuǎn)化體的可選擇標(biāo)記。在細(xì)菌系統(tǒng)中，此可包括抗生素抗性基因，諸如氨芐青霉素或卡那霉素。用于培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中的可選擇標(biāo)記包括賦予對諸如新霉素(neomycin)、潮霉素和甲氨蝶呤(methotrexate)的藥物的抗性的基因?？蛇x擇標(biāo)記可為可擴(kuò)增可選擇標(biāo)記。一種可擴(kuò)增可選擇標(biāo)記是二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因。Simonsen C C等(1983)Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9?？蛇x擇標(biāo)記由Thilly(1986)Mammalian Cell Technology,Butterworth Publishers,Stoneham,Mass.綜述，并且對可選擇標(biāo)記的選擇完全屬于本領(lǐng)域中的普通技能水平。

可選擇標(biāo)記可于單獨(dú)質(zhì)粒上與目標(biāo)基因同時引入細(xì)胞中，或它們可于同一質(zhì)粒上引入。如果于同一質(zhì)粒上，那么可選擇標(biāo)記和目標(biāo)基因可在不同啟動子或相同啟動子控制下，后述排列會產(chǎn)生雙順反子信息。這個類型的構(gòu)建體在本領(lǐng)域中是已知的(例如美國專利號4,713,339)。

表達(dá)載體可編碼允許對重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)進(jìn)行簡易純化的標(biāo)簽。實(shí)例包括但不限于載體pUR278(Ruther等(1983)EMBO J 2:1791)，其中待表達(dá)的蛋白質(zhì)的編碼序列可與lac z編碼區(qū)同框連接至載體中以使標(biāo)簽化融合蛋白得以產(chǎn)生；pGEX載體可用于表達(dá)具有谷胱甘肽(glutathione)S轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)通常是可溶性的，并且可易于通過吸附于谷胱甘肽-瓊脂糖珠粒，隨后在游離谷胱甘肽存在下洗脫來從細(xì)胞純化。載體包括用于在純化之后簡易移除標(biāo)簽的裂解位點(diǎn)(凝血酶或因子Xa蛋白酶或PRESCISSION PROTEASE^TM(Pharmacia,Peapack,N.J.))。

一種或多種表達(dá)載體接著轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)染至將表達(dá)多肽的適合靶標(biāo)細(xì)胞中。本領(lǐng)域中已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)包括但不限于磷酸鈣沉淀(Wigler等(1978)Cell 14:725)、電穿孔(Neumann等(1982)EMBO J 1:841)和基于脂質(zhì)體的試劑。多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用于表達(dá)本文所述的蛋白質(zhì)，所述系統(tǒng)包括原核細(xì)胞與真核細(xì)胞兩者。這些系統(tǒng)包括但不限于微生物，諸如用含有適當(dāng)編碼序列的重組噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌(例如大腸桿菌(E.coli))；用含有適當(dāng)編碼序列的重組酵母或真菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母或絲狀真菌；用含有適當(dāng)編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；用重組病毒表達(dá)載體(例如花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)或煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus))感染或用含有適當(dāng)編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動物細(xì)胞系統(tǒng)，包括哺乳動物細(xì)胞(例如HEK 293、CHO、Cos、HeLa、HKB11和BHK細(xì)胞)。

在一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。如本文所用，真核細(xì)胞是指具有定形細(xì)胞核的任何動物或植物細(xì)胞。動物的真核細(xì)胞包括脊椎動物(例如哺乳動物)的細(xì)胞和無脊椎動物(例如昆蟲)的細(xì)胞。植物的真核細(xì)胞可明確包括不限于酵母細(xì)胞。真核細(xì)胞不同于例如細(xì)菌的原核細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞是源于哺乳動物的任何細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞明確包括但不限于哺乳動物細(xì)胞系。在一個實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是人細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是HEK 293細(xì)胞，其是一種人胚腎細(xì)胞系。HEK293細(xì)胞可以CRL-1533從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,Manassas,VA)以及以293-H細(xì)胞(目錄號11631-017)或293-F細(xì)胞(目錄號11625-019)從Invitrogen(Carlsbad,Calif.)獲得。在一些實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是細(xì)胞，其是一種源于視網(wǎng)膜的人細(xì)胞系。細(xì)胞可從Crucell(Leiden,The Netherlands)獲得。在其它實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。CHO細(xì)胞可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,VA.)獲得(例如CHO-K1；CCL-61)。在其它實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是幼小倉鼠腎(BHK)細(xì)胞。BHK細(xì)胞可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas,Va.)獲得(例如CRL-1632)。在一些實(shí)施方案中，哺乳動物細(xì)胞是HKB11細(xì)胞，其是HEK293細(xì)胞與人B細(xì)胞系的雜交細(xì)胞系。Mei等,Mol.Biotechnol.34(2):165-78(2006)。

在一個實(shí)施方案中，將包括FVIII(X2)-Fc融合物編碼序列、VWF蛋白-L1-X1-L2-Fc編碼序列或兩者和可選擇標(biāo)記(例如博萊霉素(zeocin)抗性)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞中以產(chǎn)生嵌合蛋白。

在另一實(shí)施方案中，將包括FVIII-Fc融合物編碼序列、VWF蛋白-L1-X-L2-Fc編碼序列或兩者和可選擇標(biāo)記(例如博萊霉素(zeocin)抗性)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞中以產(chǎn)生嵌合蛋白。

在一些實(shí)施方案中，將包括FVIII(X2)-Fc融合物編碼序列和第一可選擇標(biāo)記(例如博萊霉素抗性基因)的第一質(zhì)粒以及包括VWF蛋白-L1-X1-L2-Fc編碼序列和第二可選擇標(biāo)記(例如新霉素抗性基因)的第二質(zhì)粒和包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶編碼序列和第三可選擇標(biāo)記(例如潮霉素抗性基因)的第三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞中以產(chǎn)生嵌合蛋白。第一和第二質(zhì)?？梢韵嗟攘?即1:1摩爾比)引入，或它們可以不等量引入。

在其它實(shí)施方案中，將包括FVIII-Fc融合物編碼序列和第一可選擇標(biāo)記(例如博萊霉素抗性基因)的第一質(zhì)粒以及包括VWF蛋白-L1-X-L2-Fc編碼序列和第二可選擇標(biāo)記(例如新霉素抗性基因)的第二質(zhì)粒和包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶編碼序列和第三可選擇標(biāo)記(例如潮霉素抗性基因)的第三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞中以產(chǎn)生嵌合蛋白。第一和第二質(zhì)粒可以相等量(即1:1摩爾比)引入，或它們可以不等量引入。

在其它實(shí)施方案中，將包括FVIII(X2)-Fc融合物編碼序列和第一可選擇標(biāo)記(例如博萊霉素抗性基因)的第一質(zhì)粒以及包括VWF蛋白-L1-X1-L2-Fc融合物編碼序列和第二可選擇標(biāo)記(例如新霉素抗性基因)的第二質(zhì)粒和包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶編碼序列和第三可選擇標(biāo)記(例如潮霉素抗性基因)的第三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞中以產(chǎn)生嵌合蛋白。第一和第二質(zhì)粒可以相等量(即1:1摩爾比)引入，或它們可以不等量引入。

在某些實(shí)施方案中，將包括嵌合蛋白編碼FVIII(有或無XTEN)-F1-L3-F2-L2-X-L1-V編碼序列和第一可選擇標(biāo)記(例如博萊霉素抗性基因)的第一質(zhì)粒和包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶編碼序列和第二可選擇標(biāo)記(例如潮霉素抗性基因)的第二質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK 293細(xì)胞中以產(chǎn)生嵌合蛋白。FVIII(X)-F1編碼序列的啟動子和V-L2-X-L1-F2編碼序列的啟動子可不同，或它們可相同。

在其它實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)，這些細(xì)胞可被選擇并維持為穩(wěn)定細(xì)胞系。

使含有蛋白質(zhì)的DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞在適當(dāng)生長培養(yǎng)基中生長。如本文所用，術(shù)語“適當(dāng)生長培養(yǎng)基”意指含有為細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基。為細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物可包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和生長因子。任選地，培養(yǎng)基可含有一種或多種選擇因子。任選地，培養(yǎng)基可含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。在一個實(shí)施方案中，培養(yǎng)基大致上不含有IgG。生長培養(yǎng)基將通常通過例如藥物選擇或缺乏必需營養(yǎng)物來選擇含有DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，所述必需營養(yǎng)物由DNA構(gòu)建體上或與DNA構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的可選擇標(biāo)記補(bǔ)充。通常使培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞生長在可商購獲得的含血清或無血清培養(yǎng)基(例如MEM、DMEM、DMEM/F12)中。在一個實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是CD293(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。在另一實(shí)施方案中，培養(yǎng)基是CD17(Invitrogen,Carlsbad,CA.)。對適于所用特定細(xì)胞系的培養(yǎng)基的選擇屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平。

為共同表達(dá)嵌合蛋白的兩個多肽鏈，在允許表達(dá)兩個鏈的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。如本文所用，培養(yǎng)是指在體外維持活細(xì)胞至少一定時間。維持可但無需包括活細(xì)胞群體增加。舉例來說，培養(yǎng)中維持的細(xì)胞可在群體方面是靜態(tài)的，但仍然具有活力，并且能夠產(chǎn)生所需產(chǎn)物，例如重組蛋白或重組融合蛋白。適用于培養(yǎng)真核細(xì)胞的條件在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包括適當(dāng)選擇培養(yǎng)基、培養(yǎng)基補(bǔ)充劑、溫度、pH、氧飽和度等。出于商業(yè)目的，培養(yǎng)可包括使用各種類型的按比例擴(kuò)大系統(tǒng)中的任一個，所述系統(tǒng)包括振蕩器燒瓶、滾瓶、中空纖維生物反應(yīng)器、攪拌槽生物反應(yīng)器、氣升生物反應(yīng)器、搖袋式生物反應(yīng)器(Wave bioreactor)和其它系統(tǒng)。

也選擇細(xì)胞培養(yǎng)條件以允許VWF片段與FVIII蛋白締合。允許表達(dá)VWF片段和/或FVIII蛋白的條件可包括存在維生素K來源。舉例來說，在一個實(shí)施方案中，在補(bǔ)充有4mM谷氨酰胺的CD293培養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,CA)或OptiCHO培養(yǎng)基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞。

在一個方面，本發(fā)明涉及一種表達(dá)、制備或產(chǎn)生本發(fā)明的嵌合蛋白的方法，其包括a)轉(zhuǎn)染包含編碼所述嵌合蛋白的多核苷酸的宿主細(xì)胞以及b)在適于表達(dá)所述嵌合蛋白的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，其中所述嵌合蛋白得以表達(dá)。

在其它實(shí)施方案中，含有連接于第一Ig恒定區(qū)或其一部分的FVIII蛋白和/或通過XTEN序列融合于第二Ig恒定區(qū)或其一部分的VWF蛋白的蛋白質(zhì)產(chǎn)物被分泌至培養(yǎng)基中。使培養(yǎng)基與細(xì)胞分離，濃縮，過濾，接著穿過兩個或三個親和柱，例如蛋白質(zhì)A柱和一個或兩個陰離子交換柱。

在某些方面，本發(fā)明涉及通過本文所述的方法產(chǎn)生的嵌合蛋白。

體外生產(chǎn)允許按比例擴(kuò)大以產(chǎn)生本發(fā)明的大量所需改變多肽。用于在組織培養(yǎng)條件下進(jìn)行哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并且包括例如在氣升反應(yīng)器中或在連續(xù)攪拌器反應(yīng)器中進(jìn)行均質(zhì)懸浮培養(yǎng)，或例如在中空纖維、微囊中、在瓊脂糖微珠粒或陶瓷柱筒上進(jìn)行固定或包埋細(xì)胞培養(yǎng)。必要和/或需要時，多肽的溶液可通過慣用色譜方法純化，所述方法例如凝膠過濾、離子交換色譜法、疏水性相互作用色譜法(HIC、經(jīng)DEAE-纖維素的色譜法或親和色譜法。

IV.藥物組合物

含有本發(fā)明的嵌合蛋白的組合物可含有適合藥學(xué)上可接受的載體。舉例來說，它們可含有有助于將活性化合物加工成被設(shè)計(jì)用于遞送至作用部位的制劑的賦形劑和/或助劑。

藥物組合物可被配制以用于通過快速濃注進(jìn)行胃腸外施用(即靜脈內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi))。注射用制劑可以例如于安瓿中或于多劑量容器中的添加有防腐劑的單位劑型提供。組合物可采用諸如于油性或水性媒介物中的混懸液、溶液或乳液的形式，并且可含有配制劑，諸如混懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，活性成分可呈用于用適合媒介物(例如無熱原水)復(fù)原的粉末形式。

適于胃腸外施用的制劑也包括呈水溶性形式(例如水溶性鹽)的活性化合物的水溶液。此外，可施用呈適當(dāng)油性注射混懸液形式的活性化合物混懸液。適合親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射混懸液可含有增加混懸液的粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和右旋糖苷。任選地，混懸液也可含有穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體也可用于囊封本發(fā)明的分子以遞送至細(xì)胞或間質(zhì)間隙中。示例性藥學(xué)上可接受的載體是生理可相容溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和吸收延遲劑、水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等。在一些實(shí)施方案中，組合物包含等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。在其它實(shí)施方案中，組合物包含增強(qiáng)活性成分的儲存期限或有效性的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)，諸如濕潤劑或少量輔助物質(zhì)，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。

本發(fā)明的組合物可呈多種形式，包括例如液體(例如可注射和可輸注溶液)、分散液、混懸液、半固體和固體劑型。優(yōu)選形式取決于施用模式和治療應(yīng)用。

組合物可被配制成溶液、微乳液、分散液、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其它有序結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^將活性成分以所需量根據(jù)需要與以上列舉的一種成分或成分的組合一起并入適當(dāng)溶劑中，隨后進(jìn)行過濾滅菌來制備無菌可注射溶液。通常，通過將活性成分并入含有基本分散介質(zhì)和來自以上列舉的成分的所需其它成分的無菌媒介物中來制備分散液。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分外加來自先前無菌過濾溶液的任何另外所需成分的粉末。溶液的適當(dāng)流動性可例如通過使用包衣劑(諸如卵磷脂(lecithin))，在分散液的情況下通過維持所需粒度以及通過使用表面活性劑加以維持?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來達(dá)成。

活性成分可與控制釋放制劑或裝置一起配制。所述制劑和裝置的實(shí)例包括植入物、經(jīng)皮貼片和微囊封遞送系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾纳锵嗳菪跃酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備所述制劑和裝置的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。

可通過形成藥物于諸如聚丙交酯-聚乙交酯的可生物降解的聚合物中的微囊封基質(zhì)來制備可注射儲槽制劑。視藥物與聚合物的比率和所用聚合物的性質(zhì)而定，可控制藥物釋放速率。其它示例性可生物降解的聚合物是聚原酸酯和聚酸酐。儲槽可注射制劑也可通過將藥物包埋在脂質(zhì)體或微乳液中來制備。

補(bǔ)充性活性化合物可并入組合物中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白與另一凝結(jié)因子或其變體、片段、類似物或衍生物一起配制。舉例來說，凝結(jié)因子包括但不限于因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、凝血酶原、纖維蛋白原、范威爾邦德因子或重組可溶性組織因子(rsTF)或任何前述各物的活化形式。止血劑的凝結(jié)因子也可包括抗纖維蛋白溶解藥物，例如ε-氨基-己酸、氨甲環(huán)酸。

可調(diào)整劑量方案以提供最優(yōu)所需響應(yīng)。舉例來說，可施用單次大丸劑，可隨時間施用若干分次劑量，或可如通過治療情況的緊急性所指示，按比例降低或增加劑量。有利的是以劑量單位形式配制胃腸外組合物以易于施用和達(dá)成劑量均一性。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,Easton,Pa.1980)。

除活性化合物之外，液體劑型也可含有惰性成分，諸如水、乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯。

適合藥物載體的非限制性實(shí)例也描述于由E.W.Martin所著的Remington's Pharmaceutical Sciences中。賦形劑的一些實(shí)例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。組合物也可含有pH緩沖試劑和濕潤劑或乳化劑。

對于口服施用，藥物組合物可采用通過常規(guī)手段制備的片劑或膠囊形式。組合物也可制備成液體，例如糖漿或混懸液。液體可包括混懸劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯膠(acacia))、非水性媒介物(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾植物油)和防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)。制劑也可包括調(diào)味劑、著色劑和甜味劑?；蛘?，組合物可以用于用水或另一適合媒介物復(fù)原的干燥產(chǎn)品形式提供。

對于經(jīng)頰施用，組合物可采用根據(jù)常規(guī)方案的片劑或糖錠形式。

對于通過吸入施用，供根據(jù)本發(fā)明使用的化合物宜以有或無賦形劑的霧化氣霧劑形式或以來自任選具有推進(jìn)劑的加壓包裝或霧化器的氣霧噴霧劑形式遞送，所述推進(jìn)劑例如是二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其它適合氣體。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過提供用以遞送計(jì)量數(shù)量的閥來確定?？膳渲朴糜谖肫骰虼等肫髦械睦缑髂z的膠囊和藥筒，其含有化合物與諸如乳糖或淀粉的適合粉末基質(zhì)的粉末混合物。

藥物組合物也可以例如含有常規(guī)栓劑基質(zhì)(諸如可可脂或其它甘油酯)的栓劑或滯留灌腸劑形式配制用于經(jīng)直腸施用。

在一個實(shí)施方案中，藥物組合物包含嵌合蛋白、編碼所述嵌合蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的載體或包含所述載體的宿主細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體。相較于野生型FVIII蛋白或無VWF片段的相應(yīng)FVIII蛋白，嵌合蛋白中的FVIII蛋白具有延長的半衰期。在一個實(shí)施方案中，其中嵌合蛋白的半衰期比野生型FVIII延長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。在另一實(shí)施方案中，因子VIII的半衰期是至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。

在一些實(shí)施方案中，通過選自由以下組成的組的途徑施用組合物：局部施用、眼內(nèi)施用、胃腸外施用、鞘內(nèi)施用、硬膜下施用和口服施用。胃腸外施用可為靜脈內(nèi)或皮下施用。

在其它實(shí)施方案中，組合物用于治療有需要的受試者的流血疾病或病狀。流血疾病或病狀選自由以下組成的組：流血凝血病癥、關(guān)節(jié)積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸流血、顱內(nèi)出血、腹內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)流血、咽后隙中流血、腹膜后隙中流血、髂腰肌鞘中流血及其任何組合。在其它實(shí)施方案中，受試者預(yù)定經(jīng)受手術(shù)。在其它實(shí)施方案中，治療是防治性的或按需進(jìn)行。

V.基因療法

本發(fā)明的其嵌合蛋白可在例如人患者的哺乳動物中體內(nèi)產(chǎn)生，使用用以治療選自由以下組成的組的流血疾病或病癥的基因療法方法將是治療有益的：流血凝血病癥、關(guān)節(jié)積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸流血、顱內(nèi)出血、腹內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)流血、咽后隙中流血、腹膜后隙中流血和髂腰肌鞘中流血。在一個實(shí)施方案中，流血疾病或病癥是血友病。在另一實(shí)施方案中，流血疾病或病癥是甲型血友病。這涉及施用可操作地連接于適合表達(dá)控制序列的適合嵌合蛋白編碼核酸。在某一實(shí)施方案中，這些序列并入病毒載體中。適用于所述基因療法的病毒載體包括腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、艾伯斯坦巴爾病毒載體、乳多泡病毒載體(papovaviral vector)、痘苗病毒載體、單純性皰疹病毒載體和腺相關(guān)病毒(AAV)載體。病毒載體可為復(fù)制缺陷性病毒載體。在其它實(shí)施方案中，腺病毒載體在它的E1基因或E3基因中具有缺失。當(dāng)使用腺病毒載體時，哺乳動物可不暴露于編碼可選擇標(biāo)記基因的核酸。在其它實(shí)施方案中，將序列并入本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的非病毒載體中。

VI.使用嵌合蛋白的方法

本發(fā)明涉及一種使用本文所述的嵌合蛋白來防止或抑制內(nèi)源性VWF結(jié)合FVIII蛋白的方法。本發(fā)明也涉及一種使用具有連接于XTEN和Ig恒定區(qū)或其一部分的FVIII蛋白的嵌合蛋白的方法。

本發(fā)明的一個方面涉及通過阻斷或遮蔽FVIII上的VWF結(jié)合位點(diǎn)免遭內(nèi)源性VWF來防止或抑制FVIII與內(nèi)源性VWF相互作用，以及同時使用與也可為半衰期延長物的Ig恒定區(qū)或其一部分組合的XTEN序列來延長嵌合蛋白的半衰期。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種構(gòu)建半衰期長于野生型FVIII的FVIII蛋白的方法。適用于方法中的嵌合蛋白包括本文所述的任何一種或多種嵌合蛋白。

本發(fā)明的另一方面包括一種向有需要的受試者施用包含半衰期長于野生型FVIII的FVIII蛋白的嵌合蛋白的方法，其中所述方法包括向所述受試者施用本文所述的嵌合蛋白。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種使用XTEN序列和Ig恒定區(qū)或其一部分來改進(jìn)包含F(xiàn)VIII蛋白和VWF蛋白的嵌合蛋白的半衰期的方法，其防止或抑制內(nèi)源性VWF與FVIII蛋白相互作用。連接于XTEN序列(例如FVIII(X))，接著與融合于XTEN和Ig恒定區(qū)或其一部分的VWF蛋白結(jié)合或締合的FVIII蛋白被遮蔽或保護(hù)免遭VWF的清除路徑，并且因此相較于未結(jié)合于VWF蛋白的FVIII蛋白，清除率降低。因此，相較于未與XTEN序列和VWF蛋白結(jié)合或締合的FVIII蛋白，遮蔽的FVIII蛋白的半衰期得以最大延長。在某些實(shí)施方案中，與VWF蛋白締合或由VWF蛋白保護(hù)，并且連接于XTEN序列的FVIII蛋白不由VWF清除受體清除。在其它實(shí)施方案中，與VWF蛋白締合或由VWF蛋白保護(hù)，并且連接于XTEN序列的FVIII蛋白從系統(tǒng)被清除慢于未與VWF蛋白締合或由VWF蛋白保護(hù)，并且連接于XTEN序列的FVIII蛋白。

在一個方面，包含連接于XTEN序列的FVIII蛋白或與連接于XTEN的VWF蛋白結(jié)合或締合的FVIII蛋白的嵌合蛋白從循環(huán)的清除率降低，因?yàn)閂WF蛋白不含有VWF清除受體結(jié)合位點(diǎn)。VWF蛋白防止或抑制與VWF蛋白結(jié)合或締合的FVIII通過VWF清除路徑從系統(tǒng)清除。適用于本發(fā)明的VWF蛋白也可提供至少一種或多種由內(nèi)源性VWF提供的VWF樣FVIII保護(hù)性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，VWF蛋白或XTEN序列也可掩蔽一個或多個FVIII清除受體結(jié)合位點(diǎn)，由此防止FVIII通過它自身的清除路徑清除。

在一些實(shí)施方案中，由VWF蛋白或XTEN序列防止或抑制FVIII蛋白結(jié)合內(nèi)源性VWF可發(fā)生在體外或體內(nèi)。

也提供一種增加嵌合蛋白的半衰期的方法，其包括向有需要的受試者施用本文所述的嵌合蛋白。與全長VWF結(jié)合或締合的非活化FVIII在血漿中的半衰期是約12至14小時。其中在循環(huán)中幾乎不存在VWF的3型VWD中，F(xiàn)VIII的半衰期僅為約六小時，從而由于FVIII濃度降低而在所述患者中產(chǎn)生輕度至中度甲型血友病的癥狀。本發(fā)明的與VWF片段或XTEN序列連接或締合的嵌合蛋白的半衰期可比與全長VWF結(jié)合或締合的非活化FVIII的半衰期增加高至少約1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.6倍、2.7.倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍或4.0倍。

在一個實(shí)施方案中，包含第一多肽(其包含F(xiàn)VIII蛋白和第一Ig恒定區(qū)或其一部分)和第二多肽(其包含VWF蛋白、具有小于288個氨基酸的XTEN以及Ig恒定區(qū)或其一部分)的嵌合蛋白展現(xiàn)的半衰期比包含相同第一多肽和無所述XTEN序列的第二多肽的相應(yīng)嵌合蛋白或野生型FVIII高至少約2倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在另一實(shí)施方案中，包含第一多肽(其包含F(xiàn)VIII蛋白和第一Ig恒定區(qū)或其一部分)和第二多肽(其包含VWF蛋白、具有小于288個氨基酸的XTEN以及Ig恒定區(qū)或其一部分)的嵌合蛋白展現(xiàn)的半衰期比包含相同第一多肽和無所述XTEN序列的第二多肽的相應(yīng)嵌合蛋白或野生型FVIII高約2至約5倍、約3至約10倍、約5至約15倍、約10至約20倍、約15至約25倍、約20至約30倍、約25至約35倍、約30至約40倍、約35至約45倍。在特定實(shí)施方案中，在FVIII和VWF雙重敲除小鼠中，本發(fā)明的嵌合蛋白的半衰期比野生型FVIII的半衰期增加高至少約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40倍。

在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白在小鼠中展現(xiàn)約40小時的半衰期。

在一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白的半衰期長于與內(nèi)源性VWF締合的FVIII的半衰期。在其它實(shí)施方案中，嵌合蛋白的半衰期是野生型FVIII或與內(nèi)源性VWF締合的FVIII蛋白的半衰期的至少約1.5倍、2倍、2.5倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4.0倍、4.5倍或5.0倍。

在一些實(shí)施方案中，作為本發(fā)明的結(jié)果，相較于無VWF蛋白的FVIII蛋白或野生型FVIII，嵌合蛋白的半衰期得以延長。本發(fā)明的嵌合蛋白的半衰期比無VWF蛋白的嵌合蛋白或野生型FVIII的半衰期長至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約12倍。在一個實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII的半衰期比野生型FVIII的半衰期長約1.5倍至約20倍、約1.5倍至約15倍、或約1.5倍至約10倍。在另一實(shí)施方案中，相較于野生型FVIII或無VWF蛋白的FVIII蛋白，F(xiàn)VIII的半衰期延長約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、約2倍至約5倍、約2倍至約4倍、約2倍至約3倍、約2.5倍至約10倍、約2.5倍至約9倍、約2.5倍至約8倍、約2.5倍至約7倍、約2.5倍至約6倍、約2.5倍至約5倍、約2.5倍至約4倍、約2.5倍至約3倍、約3倍至約10倍、約3倍至約9倍、約3倍至約8倍、約3倍至約7倍、約3倍至約6倍、約3倍至約5倍、約3倍至約4倍、約4倍至約6倍、約5倍至約7倍、或約6倍至約8倍。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白的半衰期是至少約17小時、至少約18小時、至少約19小時、至少約20小時、至少約21小時、至少約22小時、至少約23小時、至少約24小時、至少約25小時、至少約26小時、至少約27小時、至少約28小時、至少約29小時、至少約30小時、至少約31小時、至少約32小時、至少約33小時、至少約34小時、至少約35小時、至少約36小時、至少約40小時、至少約48小時、至少約60小時、至少約72小時、至少約84小時、至少約96小時或至少約108小時。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白的半衰期是約15小時至約兩周、約16小時至約一周、約17小時至約一周、約18小時至約一周、約19小時至約一周、約20小時至約一周、約21小時至約一周、約22小時至約一周、約23小時至約一周、約24小時至約一周、約36小時至約一周、約48小時至約一周、約60小時至約一周、約24小時至約六天、約24小時至約五天、約24小時至約四天、約24小時至約三天或約24小時至約兩天。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白根據(jù)受試者的平均半衰期是約15小時、約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小時、約24小時(1天)、約25小時、約26小時、約27小時、約28小時、約29小時、約30小時、約31小時、約32小時、約33小時、約34小時、約35小時、約36小時、約40小時、約44小時、約48小時(2天)、約54小時、約60小時、約72小時(3天)、約84小時、約96小時(4天)、約108小時、約120小時(5天)、約六天、約七天(一周)、約八天、約九天、約10天、約11天、約12天、約13天或約14天。

此外，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防流血疾病或病癥的方法，其包括施用有效量的嵌合蛋白。在一個實(shí)施方案中，流血疾病或病癥選自由以下組成的組：流血凝血病癥、關(guān)節(jié)積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸流血、顱內(nèi)出血、腹內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)流血、咽后隙中流血、腹膜后隙中流血和髂腰肌鞘中流血。在特定實(shí)施方案中，流血疾病或病癥是甲型血友病。

通過本發(fā)明制備的包含與本文所述的VWF蛋白(其防止或抑制FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF相互作用)組合的XTEN序列和Ig恒定區(qū)或其一部分的嵌合蛋白具有如將由本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到的許多用途，包括但不限于治療患有止血病癥的受試者的方法和治療需要一般性止血劑的受試者的方法。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種治療患有止血病癥的受試者的方法，其包括施用治療有效量的嵌合蛋白。

嵌合蛋白中的FVIII蛋白部分通過在帶負(fù)電荷磷脂表面上充當(dāng)因子IX的輔因子，由此形成X酶復(fù)合物來治療或預(yù)防止血病癥?；罨蜃咏Y(jié)合磷脂表面使這個過程定位于血管損害部位。在磷脂表面上，因子VIIIa使由因子IXa達(dá)成的因子X活化的最大速度增加約200,000倍，從而導(dǎo)致凝血酶產(chǎn)生的大規(guī)模瞬間爆發(fā)。

本發(fā)明的嵌合蛋白可用于治療任何止血病癥?？赏ㄟ^施用本發(fā)明的嵌合蛋白治療的止血病癥包括但不限于甲型血友病以及與因子VIII相關(guān)的缺乏癥或結(jié)構(gòu)異常。在一個實(shí)施方案中，止血病癥是甲型血友病。

本發(fā)明的嵌合蛋白可防治性用于治療患有止血病癥的受試者。本發(fā)明的嵌合蛋白可用于治療患有止血病癥的受試者的急性流血發(fā)作。在另一實(shí)施方案中，止血病癥可為缺陷性凝結(jié)因子，例如范威爾邦德氏因子的結(jié)果。在一個實(shí)施方案中，止血病癥是遺傳病癥。在另一實(shí)施方案中，止血病癥是獲得性病癥。獲得性病癥可由潛伏繼發(fā)性疾病或病狀所致。無關(guān)病狀可為例如但不限于癌癥、自體免疫疾病或妊娠。獲得性病癥可由老齡或用以治療潛伏繼發(fā)性病癥的藥物治療(例如癌癥化學(xué)療法)所致。

本發(fā)明也涉及治療不患有先天性止血病癥，但患有導(dǎo)致獲得止血病癥(例如由于產(chǎn)生抗FVIII抗體或手術(shù))的繼發(fā)性疾病或病狀的受試者的方法。因此，本發(fā)明涉及一種治療需要一般性止血劑的受試者的方法，其包括施用治療有效量的通過本發(fā)明方法制備的嵌合蛋白。

本發(fā)明也涉及降低FVIII的免疫原性或誘導(dǎo)針對FVIII的較小免疫原性的方法，其包括施用有效量的本文所述的嵌合蛋白或其編碼多核苷酸。

在一個實(shí)施方案中，需要一般性止血劑的受試者正經(jīng)受或即將經(jīng)受手術(shù)。本發(fā)明的嵌合蛋白可在手術(shù)之前、期間或之后作為防治性方案加以施用。本發(fā)明的嵌合蛋白可在手術(shù)之前、期間或之后施用以控制急性流血發(fā)作。

本發(fā)明的嵌合蛋白可用于治療具有急性流血發(fā)作，未患有止血病癥的受試者。急性流血發(fā)作可由嚴(yán)重創(chuàng)傷，例如手術(shù)、車禍、傷口、槍射擊裂傷或?qū)е铝餮皇芸刂频娜魏纹渌鼊?chuàng)傷事件所致。流血發(fā)作的非限制性實(shí)例包括流血凝血病癥、關(guān)節(jié)積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷、胃腸流血、顱內(nèi)出血、腹內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)流血、咽后隙中流血、腹膜后隙中流血、髂腰肌鞘中流血及其任何組合。

在防治性應(yīng)用中，向尚未處于疾病狀態(tài)中的患者施用一種或多種含有本發(fā)明的嵌合蛋白或其混合物的組合物以增強(qiáng)所述患者的抗性或減輕與疾病或病癥相關(guān)的癥狀。這種量定義為“防治有效劑量”。在治療性應(yīng)用中，有時需要在相對較短間隔下的相對較高劑量(例如每劑約1至400mg/kg的多肽，其中5至25mg的劑量更通常用于放射免疫綴合物，并且更高劑量用于細(xì)胞毒素藥物修飾的多肽)直至疾病進(jìn)展降低或終止，以及直至患者顯示部分或完全疾病癥狀改善。此后，可向患者施用防治性方案。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白或組合物用于按需治療，其包括治療流血發(fā)作、關(guān)節(jié)積血、肌肉流血、口腔流血、出血、向肌肉中出血、口腔出血、創(chuàng)傷、頭創(chuàng)傷(頭部創(chuàng)傷)、胃腸流血、顱內(nèi)出血、腹內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)流血、咽后隙中流血、腹膜后隙中流血或髂腰肌鞘中流血。受試者可需要手術(shù)防治、圍手術(shù)期管理或手術(shù)治療。所述手術(shù)包括例如小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹鏈溝疝切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全部膝蓋置換、開顱術(shù)、骨縫合術(shù)、創(chuàng)傷手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白是靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)施用或通過任何粘膜表面施用，例如口服、舌下、經(jīng)頰、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸、經(jīng)陰道或通過肺途徑施用。本發(fā)明的包含VWF片段和FVIII蛋白的嵌合蛋白可植入在允許嵌合蛋白緩慢釋放至流血部位的生物聚合物固體載體內(nèi)或連接于所述生物聚合物固體載體，或植入繃帶/敷料中。嵌合蛋白的劑量將視受試者和所用特定施用途徑而變化。劑量可在0.1至100,000μg/kg體重的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，劑量范圍是0.1-1,000μg/kg。在另一實(shí)施方案中，劑量范圍是0.1-500μg/kg?？蛇B續(xù)或在特定時間間隔下施用蛋白質(zhì)?？刹捎皿w外測定來確定最優(yōu)劑量范圍和/或施用時程。測量凝結(jié)因子活性的體外測定在本領(lǐng)域中是已知的，例如STA-CLOT VIIa-rTF凝結(jié)測定或ROTEM凝結(jié)測定。另外，可從由動物模型(例如血友病狗)獲得的劑量-響應(yīng)曲線外推有效劑量(Mount等2002,Blood 99(8):2670)。

現(xiàn)已詳細(xì)描述本發(fā)明，通過參照以下實(shí)施例將更明確了解本發(fā)明，所述實(shí)施例僅出于說明目的包括于此，并且不意圖限制本發(fā)明。本文提及的所有專利、公布和文章都以引用的方式明確和特定并入本文。

實(shí)施例

除非另外陳述，否則在整篇實(shí)施例中，使用以下材料和方法。

材料和方法

一般來說，除非另外指示，否則本發(fā)明的實(shí)施采用常規(guī)化學(xué)技術(shù)、生物物理學(xué)技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、重組DNA技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)(尤其例如抗體技術(shù))和標(biāo)準(zhǔn)電泳技術(shù)。參見例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology),510,Paul,S.,Humana Pr(1996)；Antibody Engineering:A Practical Approach(Practical Approach Series,169),McCafferty編,Irl Pr(1996)；Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow等,CS.H.L.Press,Pub.(1999)；以及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等編,John Wiley&Sons(1992)。

實(shí)施例1：FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體

本發(fā)明涉及產(chǎn)生一種通過IgG的Fc結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)于范威爾邦德因子(VWF)蛋白的D’D3結(jié)構(gòu)域的嵌合FVIII分子。連接的D’D3結(jié)構(gòu)域防止FVIII與內(nèi)源性VWF多聚體相互作用。這個分子充當(dāng)合并其它半衰期延長技術(shù)以改進(jìn)嵌合蛋白的藥物動力學(xué)的平臺。XTEN序列被并入FVIII B結(jié)構(gòu)域中以及D’D3與Fc區(qū)之間以增加FVIII/VWF異二聚體的半衰期。

D’D3與Fc之間的凝血酶裂解位點(diǎn)允許在由凝血酶活化FVIII分子后釋放D’D3結(jié)構(gòu)域。

實(shí)施例2：FVIII-XTEN-Fc/D’D3-Fc異二聚體的質(zhì)粒構(gòu)建

克隆VWF050-含IHH三重突變的VWF031

Fc中的IHH三重突變防止與FcRn相互作用，因此不存在通過FcRn路徑使含有Fc的分子再循環(huán)。Fc中的3個突變是I253A、H310A、H435A。

通過在RsRII限制位點(diǎn)與Not 1限制位點(diǎn)之間用含有IHH三重突變的Fc片段交換VWF031質(zhì)粒的Fc區(qū)來產(chǎn)生VWF050。

克隆VWF057-克隆具有144AE XTEN+35aa凝血酶可裂解接頭的VWF-Fc。

寡聚物

ESC 155-針對VWF034中的144AE XTEN的寡聚物-反向

CCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGAACCTCCACCGCCGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTC

ESC 156-針對VWF034中的144AE XTEN-GS接頭的寡聚物-反向

GGGGAAGAGGAAGACTGACGGTCCGCCCAGGAGTTCTGGAGCTGGGCACGGTGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGCCTCCGCTGCCCCGGGGGACCAGGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCCACCGGATCCCCCGCC

ESC 157-針對VWF031中的144AE XTEN的寡聚物-正向

GTGAAGCCTGCCAGGAGCCGATATCGGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGC

進(jìn)行兩次PCR以獲得144AE-XTEN+具有凝血酶裂解位點(diǎn)的35aa GS接頭。

使用作為模板的144-AE XTEN編碼DNA以及ESC 157/ESC 155引物對進(jìn)行第一PCR反應(yīng)。由這個反應(yīng)獲得的約550bp長的PCR產(chǎn)物用作第二PCR反應(yīng)的模板，并且使用ESC 157/156引物對加以擴(kuò)增。這個反應(yīng)產(chǎn)生約700bp長的產(chǎn)物。接著用EcoRV-HF和RsRII消化這個700bp PCR產(chǎn)物和VWF034質(zhì)粒。消化質(zhì)粒骨架。

接著使用VWF034連接700bp PCR產(chǎn)物。

克隆VWF058-VWF034中的IHH三重突變

Fc中的IHH三重突變防止與FcRn相互作用，因此不存在通過FcRn路徑使含有Fc的分子再循環(huán)。Fc中的3個突變是I253A、H310A、H435A。

通過在RsRII限制位點(diǎn)與Not 1限制位點(diǎn)之間用含有IHH三重突變的Fc片段交換VWF034質(zhì)粒的Fc區(qū)來產(chǎn)生VWF058。

克隆FVIII-263-具有IHH三重突變的FVIII 205

Fc中的IHH三重突變防止與FcRn相互作用，因此不存在通過FcRn路徑使含有Fc的分子再循環(huán)。Fc中的3個突變是I253A、H310A、H435A。

通過在RsRII限制位點(diǎn)與Not 1限制位點(diǎn)之間用含有IHH三重突變的Fc片段交換FVIII 205質(zhì)粒的Fc區(qū)來產(chǎn)生FVIII-263。

克隆FVIII-282-在B結(jié)構(gòu)域中具有144AE XTEN的FVIII-Fc

ESC 158-針對B結(jié)構(gòu)域中的144AE XTEN的寡聚物-正向

AAGAAGCTTCTCTCAAAACGGCGCGCCAACATCAGAGAGCGCCACCCCTGAAAGTGGTCCCGGGAGCGAGCCAGCCACATCTGGGTCGGAAACGCCAGGC

ESC 159-針對B結(jié)構(gòu)域中的144AE XTEN的寡聚物-反向

GGTATCATCATAATCGATTTCCTCTTGATCTGACTGAAGAGTAGTACGAGTTATTTCAGCTTGATGGCGTTTCAAGACTGGTGGGCTCGAGGCACCTTCTTCAGTGCTGGTGGGCGAGCCCGCTGGTGACCCTTCCTCAGTGGACGTAGG

使用作為模板的144-AE XTEN編碼DNA以及ESC 158/ESC 159引物對進(jìn)行第一PCR反應(yīng)。接著用AscI和Clal消化由這個反應(yīng)獲得的約550bp長的PCR產(chǎn)物和FVIII 169質(zhì)粒。由消化的FVIII 169獲得的質(zhì)粒骨架接著用于連接550bp PCR產(chǎn)物以獲得FVIII 282。

克隆FVIII-283-具有IHH三重突變的FVIII 169

Fc中的IHH三重突變防止與FcRn相互作用，因此不存在通過FcRn路徑使含有Fc的分子再循環(huán)。Fc中的3個突變是I253A、H310A、H435A。

通過在RsRII限制位點(diǎn)與Not 1限制位點(diǎn)之間用含有IHH三重突變的Fc片段交換FVIII 169質(zhì)粒的Fc區(qū)來產(chǎn)生FVIII-283。

實(shí)施例3：在HEK293細(xì)胞中產(chǎn)生FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc

圖2.顯示FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc構(gòu)建體的表達(dá)的示意圖。使用聚乙烯亞胺(PEI)在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。第一質(zhì)粒獲得FVIII-XTEN-Fc的表達(dá)，第二質(zhì)粒表達(dá)D1D2D’D3-XTEN-Fc，并且第三質(zhì)粒表達(dá)PACE/弗林蛋白酶，其為從D1D2D’D3-XTEN-Fc酶促移除原肽(即D1D2結(jié)構(gòu)域)所需。這個三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)物包括FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體、D’D3-XTEN-Fc同二聚體和微量FVIII-XTEN-Fc半合子樣貌物質(zhì)。

實(shí)施例4：純化FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體

為純化FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體，切向流過濾(TFF)步驟用于使條件培養(yǎng)基首先濃縮10倍。接著依次使用親和色譜法和脫鹽柱來進(jìn)一步純化濾液中的產(chǎn)物。根據(jù)HPLC-SEC，分子的純度是可接受的，并且通過蛋白質(zhì)印跡加以進(jìn)一步確認(rèn)。分子的比活性與B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII類似，如通過FVIII活性測定(實(shí)施例5)和OD280測量所測量。

實(shí)施例5：FVIII-XTEN-Fc/D'D3-XTEN-Fc異二聚體的比活性

通過FVIII顯色測定和活化部分凝血激素時間(aPTT)測定來測量FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體的活性。SQ BDD-FVIII、rFVIII169/VWF034和rFVIII169/VWF057的比顯色活性和比aPTT活性列于表16中。相較于SQ BDD-FVIII，對于rFVIII169/VWF034和rFVIII169/VWF057，我們已觀察到類似比顯色活性以及比aPTT活性降低60％。

表16：異二聚體變體的比活性

FVIII顯色測定

使用來自DiaPharma的COATEST SP FVIII試劑盒(產(chǎn)品號：K824086)測量FVIII活性，并且所有孵育都在振蕩下在37℃板加熱器上進(jìn)行。

凝血因子VIII:C的WHO第8國際標(biāo)準(zhǔn)物(濃縮物，代號07/350)用作測定標(biāo)準(zhǔn)物，所述標(biāo)準(zhǔn)物的范圍是100mIU/mL至0.78mIU/mL。一式兩份添加匯合的正常人血漿測定對照和測試樣品(用1X Coatest緩沖液稀釋)至Immulon 2HB 96孔板中(25μL/孔)。依序添加新鮮制備的IXa/FX/磷脂混合物(50μL)、25μL 25mM CaCl₂和50μL FXa底物至各孔中，其中在各次添加之間孵育5分鐘。在與底物一起孵育之后，添加25μL 20％乙酸以終止顯色反應(yīng)，并且用SpectraMAX plus(Molecular Devices)儀器測量OD405的吸光度。用SoftMax Pro軟件(5.2版)分析數(shù)據(jù)。最低定量水平(LLOQ)是7.8mIU/mL。

FVIII aPTT測定

如下在Sysmex CA-1500凝血分析器上進(jìn)行FVIII aPTT測定：首先，通過儀器添加50uL含手動稀釋的樣品、標(biāo)準(zhǔn)物和對照的aPTT緩沖液(50mM Tris、100mM NaCl、1％HSA，pH 7.4)至反應(yīng)杯中，隨后添加50uL缺乏FVIII的血漿(George King Bio-Medical，產(chǎn)品號：0800)。在37℃下孵育1分鐘之后，添加50uL aPTT試劑( FSL活化腦透明質(zhì)試劑-Dade Behring，參考號B4219-2)至反應(yīng)混合物中，并且在37℃下孵育4分鐘。隨后，添加50ul 20mM CaCl₂(Dade Behring，參考號ORFO37)，并且將反應(yīng)杯立刻轉(zhuǎn)移至四個分光光度計(jì)通道位置中的一個中以測量混合物中折射光的量，其通過儀器的軟件算法被轉(zhuǎn)換成凝結(jié)的發(fā)生。報(bào)道的凝結(jié)時間是從添加CaCl₂開始直至發(fā)生凝塊形成的時長。通過以100mIU/ml至0.78mIU/ml的范圍將WHO第8國際FVIII標(biāo)準(zhǔn)物稀釋于aPTT緩沖液中來產(chǎn)生測定標(biāo)準(zhǔn)物。在MS Excel中將標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制為作為Y軸的凝結(jié)時間(以秒計(jì))相對于作為X軸的FVIII活性對數(shù)(以10為底)(mIU/mL)，并且使用針對這個標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸線的公式計(jì)算個別樣品的活性?；跍y定性能，量化下限(LLOQ)是7.8mIU/mL。

實(shí)施例6：XTEN插入物對異二聚體的半衰期延長的累加作用

將XTEN插入物并入異二聚體中以達(dá)成半衰期延長。在FVIII B結(jié)構(gòu)域處插入單一288氨基酸(aa)AE-XTEN導(dǎo)致異二聚體在HemA小鼠中的半衰期是16.7小時，如圖3中通過rFVIII169/VWF031所證明。為進(jìn)一步改進(jìn)異二聚體的半衰期，將長度是144aa或288aa的第二XTEN插入物分別在FVIII A1結(jié)構(gòu)域中或緊靠D’D3片段的下游并入FVIII169/VWF031中，異二聚體變體被命名為FVIII205/VWF031和FVIII169/VWF034。

通過在200IU/kg劑量下單次靜脈內(nèi)施用測試分子來在缺乏FVIII的(HemA)小鼠中評估rFVIII169/VWF031、rFVIII205/VWF031和rFVIII169/VWF034的半衰期。在如圖3中指示的指定時間點(diǎn)收集血漿樣品，通過FVIII顯色測定來測定樣品的FVIII活性，使用WinNonlin-Phoenix程序計(jì)算PK參數(shù)并列于表17中。

如圖3和表17中所示，在FVIII的A1結(jié)構(gòu)域處或在D’D3的下游添加第二XTEN插入物分別進(jìn)一步改進(jìn)異二聚體的半衰期至29.45或31.10。此外，也由于兩種XTEN插入物而觀察到清除率和AUC改進(jìn)大于2倍。

表17：異二聚體在HemA小鼠中的PK參數(shù)

實(shí)施例7：當(dāng)插入在D’D3與Fc結(jié)構(gòu)域之間時，144aa AE-XTEN比288aa AE-XTEN賦予更佳半衰期益處。

構(gòu)建另一異二聚體-FVIII169/VWF057以試圖鑒定XTEN插入物在D’D3-XTEN-Fc鏈內(nèi)的最優(yōu)長度，其中使XTEN插入物的長度從288aa降低至144aa。如圖4中所示，相較于rFVIII169/VWF034，rFVIII169/VWF057的半衰期從31小時增加至42小時。也觀察到rFVIII169/VWF057的清除率和AUC改進(jìn)，數(shù)據(jù)列于表18中。因此，當(dāng)插入在FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體的D’D3與Fc結(jié)構(gòu)域之間時，144aa AE-XTEN插入物比AE-288aa XTEN更優(yōu)。

表18：rFVIII169/VWF034和rFVIII169/VWF057在HemA小鼠中的PK參數(shù)

實(shí)施例8：Fc結(jié)構(gòu)域延長異二聚體的半衰期

Fc結(jié)構(gòu)域通過FcRn介導(dǎo)的再循環(huán)路徑來延長它的融合蛋白的半衰期。為確認(rèn)Fc結(jié)構(gòu)域?qū)Ξ惗垠w的半衰期延長的必要性，用三重突變體(I253A/H310A/H435A；IHH)置換rFVIII205/VWF031中的野生型Fc結(jié)構(gòu)域以形成rFVIII263/VWF050，并且通過表面等離子體共振(Biacore)測定確認(rèn)rFVIII263/VWF050的FcRn結(jié)合被完全消除。相較于rFVIII205/VWF031在HemA小鼠中評估FVIII263/VWF050的半衰期。觀察到rFVIII263/VWF050的清除率增加以及半衰期和AUC降低，如圖5和表19中所示。這個結(jié)果證明除確保FVIII和D’D3共價結(jié)合之外，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域也為異二聚體的半衰期改進(jìn)所必需。

表19：rFVIII205/VWF031和rFVIII263/VWF040在HemA小鼠中的PK參數(shù)

實(shí)施例9：FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體在HemA小鼠尾部鉗夾流血模型中的急性功效

使用HemA小鼠尾部鉗夾流血模型評估先導(dǎo)異二聚體候選物的急性功效。

將8-12周齡雄性HemA小鼠隨機(jī)分入4個治療組中，并且分別以單次靜脈內(nèi)施用SQ BDD-FVIII、rFVIII169/VWF034、rFVIII169/VWF057或媒介物溶液治療。為模擬FVIII的陣發(fā)性治療(以恢復(fù)正常FVIII血漿水平的50-100％)，所選FVIII治療劑量是如通過FVIII aPTT活性衡量的75IU/kg。在這個劑量水平下，所有測試FVIII變體都將在給藥后5分鐘恢復(fù)正常鼠類血漿FVIII活性的約70％。

將研究中各個別動物的失血體積繪制于圖6中。相較于媒介物治療的動物，觀察到所有FVIII治療組的失血體積都顯著降低。在三個FVIII治療組內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)失血降低有統(tǒng)計(jì)顯著差異，從而表明異二聚體分子關(guān)于按需治療可潛在地與SQ BDD-FVIII同樣有效。

將研究中各個別動物的失血體積繪制于圖6中。相較于媒介物治療的動物，觀察到所有FVIII治療組的失血體積都顯著降低。在三個FVIII治療組內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)失血降低有統(tǒng)計(jì)顯著差異，從而表明異二聚體分子關(guān)于按需治療可潛在地與SQ BDD-FVIII同樣有效。

此外，用較低劑量(37.5IU/kg)的rBDD-FVIII或rFVIII169/VWF034治療HemA小鼠，并且結(jié)果顯示于圖6B中。與75IU/kg劑量相同，在尾部鉗夾損傷后，rFVIII169/VWF034對HemA小鼠提供與BDD-FVIII類似的保護(hù)，從而指示所述分子在約35％的正常鼠類循環(huán)FVIII水平下仍然有效治療HemA小鼠的嚴(yán)重流血發(fā)作。

如下進(jìn)行尾部鉗夾程序。簡要來說，在尾部損傷之前用50mg/kg氯胺酮(Ketamine)/0.5mg/kg右旋美托咪啶(Dexmedetomidine)混合物使小鼠麻醉，并且放置在37℃加熱板上以幫助維持體溫。接著使小鼠的尾部在37℃鹽水中浸漬10分鐘以擴(kuò)張側(cè)靜脈。在靜脈擴(kuò)張之后，通過尾部靜脈注射FVIII變體或媒介物溶液，并且接著在給藥后5分鐘使用直邊11號解剖刀切斷遠(yuǎn)端5mm尾部。持續(xù)30分鐘將流出的血液收集至13ml 37℃鹽水中，并且通過血液收集管的重量變化來測定失血體積：失血體積＝(收集管結(jié)束重量-開始重量+0.10)ml。使用t檢驗(yàn)(曼惠特尼檢驗(yàn)(Mann Whitney test))和單因素ANOVA(克魯斯凱-沃利斯檢驗(yàn)(KRUSKAL-Wallis test)，事后檢驗(yàn)：鄧氏多重比較檢驗(yàn)(Dunns multiple comparison test))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

實(shí)施例10：FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體在HemA小鼠尾部靜脈橫切流血模型中的防治性功效

在HemA小鼠尾部靜脈橫切(TVT)模型中測試FVIII169/VWF057的防治性功效。TVT模型通過將損傷引入小鼠尾部的側(cè)靜脈中來誘發(fā)流血，此模擬患有血友病流血病癥的患者的自發(fā)性流血發(fā)作。

將8-10周齡雄性HemA小鼠隨機(jī)分入四個治療組中，并且在尾部靜脈損傷之前72小時用FVIII169/VWF057治療，或在損傷之前24小時或48小時用SQ BDD-FVIII治療。媒介物治療的動物用作陰性對照。將損傷后24小時內(nèi)的再流血或歸因于過度失血的安樂死的事件繪制于圖7中。

如圖7中所示，不同于在TVT之前48小時用SQ BDD-FVIII治療的小鼠(其中在損傷后觀察到僅僅有限保護(hù))，相較于在TVT之前24小時接受SQ BDD-FVIII治療的小鼠，在尾部損傷之前72小時接受rFVIII169/VWF057的小鼠具有關(guān)于再流血和存活的類似保護(hù)，從而指示在TVT模型中，rFVIII169/VWF057可對HemA小鼠提供長久至少3倍或更多倍(例如4倍)的保護(hù)。因此，rFVIII169/VWF057可能顯著降低當(dāng)前FVIII防治的治療頻率。

類似地，在尾部靜脈損傷之前24或96小時用FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體：rFVIII169/VWF034和rFVIII169/VWF057治療HemA小鼠。將治療的再流血和存活數(shù)據(jù)與通過rBDD-FVIII(在損傷之前24或48小時)和媒介物獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。盡管在尾部靜脈損傷之前24小時用rBDD-FVIII治療的小鼠的再流血類似于用媒介物治療的小鼠，但在損傷之前24小時用異二聚體治療的小鼠的再流血數(shù)據(jù)顯著好于媒介物治療組。此外，在損傷之前96小時用異二聚體治療的小鼠的再流血數(shù)據(jù)與在損傷之前24小時接受rBDD-FVIII的小鼠類似。就TVT損傷后24小時的存活率而言，與用rBDD-FVIII治療的小鼠的存活率小于50％相對比，當(dāng)在損傷之前24小時施用FVIII分子時，在FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體治療下，大于90％的小鼠存活于TVT損傷。此外，當(dāng)相較于在損傷之前24小時接受rBDD-FVIII治療的小鼠時，在尾部靜脈損傷之前96小時用FVIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體治療的小鼠的存活更佳(在rFVIII169/VWF034的情況下)或類似(在rFVIII169/VWF057的情況下)。再流血數(shù)據(jù)與存活數(shù)據(jù)兩者均已指示相對于rBDD-FVIII治療，F(xiàn)VIII-XTEN-Fc/D’D3-XTEN-Fc異二聚體治療的功效延長4倍。

HemA小鼠尾部靜脈橫切模型

如下進(jìn)行尾部靜脈橫切程序。用含有50mg/kg氯胺酮、0.125mg/kg右旋美托咪啶和0.1mg/kg布諾啡(Buprenex)的混合物使小鼠麻醉。在足夠麻醉深度處，用直邊11號手術(shù)刀片在尾部的直徑是約2.7mm所處的區(qū)域處橫切小鼠的側(cè)向尾部靜脈。用溫?zé)猁}水洗去流血以確保清晰觀察傷口。接著持續(xù)下一24小時將治療的小鼠單獨(dú)舍飼在具有白色紙墊料的清潔籠中。每小時觀察并記錄尾部再流血和小鼠的身體活動直至尾部損傷后12小時。立刻使瀕死小鼠安樂死，并且在尾部損傷后24小時進(jìn)行最終觀察。為模擬血友病患者的流血情況以及為確保動物從麻醉完全恢復(fù)，給予1mg/kg阿替美唑(Atipamezole)溶液以逆轉(zhuǎn)在尾部靜脈橫切開始時的右旋美托咪啶作用。在12小時觀察時期結(jié)束時另外施用0.1mg/kg劑量的布諾啡以用于過夜疼痛管理。產(chǎn)生時間相對于再流血以及時間相對于安樂死的存活曲線以進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并且對數(shù)秩(曼特爾-考克斯(Mantel-COX))檢驗(yàn)用于統(tǒng)計(jì)評估。

實(shí)施例11：制備FVIII169/VWF059和其它構(gòu)建體

pSYN FVIII 310克隆：

以商業(yè)手段制備側(cè)接有在N末端的BamH1位點(diǎn)和在C末端的Cla 1位點(diǎn)的合成DNA片段。這個合成DNA用于置換pSYN FVIII 169構(gòu)建體(SEQ ID NO:155)中的BamH1至Cla1區(qū)域。合成DNA與pSYN FVIII 169DNA兩者均用BamH1和Cla1雙重消化，將消化的合成DNA插入消化的pSYN FVIII 169中以產(chǎn)生pSYN FVIII 310(SEQ ID NO:168；表20)。

克隆pSYN FVIII 312：

以商業(yè)手段制備側(cè)接有在N末端的BamH1位點(diǎn)和在C末端的Afe 1位點(diǎn)的合成DNA片段。這個合成DNA用于置換pSYN FVIII 169構(gòu)建體(SEQ ID NO:155)中的BamH1至Afe1區(qū)域。合成DNA與pSYN FVIII 169DNA兩者均用BamH1和Afe1雙重消化，將消化的合成DNA插入消化的pSYN FVIII 169中以產(chǎn)生pSYN FVIII 312(SEQ ID NO:169；表20)。從pSYN FVIII312產(chǎn)生pSYN FVIII 312A(SEQ ID NO:2；表20)以移除在FVIII和XTEN的接合點(diǎn)處的編碼氨基酸殘基GAP的AscI位點(diǎn)。

表20：合成FVIII構(gòu)建體。

克隆pSYN VWF059和VWF073：

制備編碼在D’D3-XTEN與Fc之間的不同接頭區(qū)域的各種合成DNA片段。這些合成DNA片段側(cè)接有在N末端的Asc1位點(diǎn)和在C末端的Not 1位點(diǎn)。這些合成DNA用于置換pSYN VWF057構(gòu)建體(SEQ ID NO:152)中的Asc1至Not1區(qū)域。pSYN VWF059構(gòu)建體(表21)包含接頭區(qū)域(SEQ ID NO:13)，其包括整個FVIII酸性區(qū)2(a2)。這個位點(diǎn)被報(bào)道由凝血酶裂解，并且在FVIII活化后，D’D3XTEN被釋放。pSYN VWF073構(gòu)建體(表21)僅含有FVIII酸性區(qū)2(a2)的凝血酶裂解位點(diǎn)(即IEPRSFS)(SEQ ID NO:23)。合成DNA與pSYN VWF057DNA兩者均用Asc1和Not1雙重消化。將消化的合成DNA插入消化的pSYN VWF057中以產(chǎn)生pSYN VWF059和pSYN VWF073。通過移除EcoRV限制位點(diǎn)來從pSYN VWF059產(chǎn)生pSYN VWF59A構(gòu)建體(表21)。通過在HEK293細(xì)胞中共同表達(dá)FVIII169和VWF057或VWF059來產(chǎn)生FVIII169/VWF057和FVIII169/VWF059異二聚體蛋白。

表21：合成VWF構(gòu)建體–可裂解接頭區(qū)域

實(shí)施例12：凝血酶消化FVIII異二聚體以分析D'D3從Fc釋放

在凝血酶消化實(shí)驗(yàn)中測試兩種FVIII異二聚體蛋白，并且考查由凝血酶對它們的裂解速率。這個實(shí)驗(yàn)中使用的兩種異二聚體構(gòu)建體是FVIII169/VWF057異二聚體和FVIII169/VWF059異二聚體，連同F(xiàn)VIIIFc一起。以上描述FVIII169/VWF057和FVIII169/VWF059異二聚體。進(jìn)行三個消化反應(yīng)：i)FVIIIFc ii)FVIII169/VWF057(圖11)，和iii)FVIII 169/VWF059(圖12)。以FVIII:凝血酶的摩爾比約22:1，用人α-凝血酶處理測試樣品。在37℃水浴中孵育各反應(yīng)。在各指示的時間點(diǎn)(t＝5、15、30、45、60分鐘)，取出22.5μL樣品，用22.5μL非還原性2x SDS裝載染料終止，并且加熱3分鐘。接著在SDS-PAGE凝膠上操作消化的蛋白質(zhì)。利用LICOR系統(tǒng)，使用抗FVIII重鏈(GMA012)和抗VWF-D3(Ab96340)抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。

如圖11中所示，F(xiàn)VIII169/VWF057暴露于凝血酶導(dǎo)致D'D3-XTEN-Fc的檢測水平逐漸降低，同時關(guān)聯(lián)有裂解產(chǎn)物D'D3-144 XTEN的水平增加。在15分鐘之后剩余有未裂解的FVIII169/VWF057。相反，圖12顯示FVIII 169/VWF059由凝血酶更快速裂解，如通過在5分鐘之后有少許乃至無可檢測的未裂解FVIII 169/VWF059所證實(shí)。因此，F(xiàn)VIII 169/VWF059顯示相較于FVIII169/VWF057，在凝血酶活化后，D’D3從Fc更佳釋放。

進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)以使用質(zhì)譜分析(MS)探究凝血酶裂解。根據(jù)MS，F(xiàn)VIII 169/VWF059再次顯示相較于VWF057，D’D3從Fc更佳釋放。

實(shí)施例13：FVIII169/VWF059在HemA小鼠中的體內(nèi)評估

為進(jìn)一步評估FVIII169/VWF059的藥物動力學(xué)概況和體內(nèi)效價，通過在150IU/kg劑量下靜脈內(nèi)施用來用FVIII169/VWF059治療HemA小鼠。在注射后5分鐘、24、48、72、96和120小時通過腔靜脈血液收集來收集血漿樣品。通過FVIII顯色測定來測量血漿樣品中的FVIII活性，并且使用Phoenix程序計(jì)算PK參數(shù)。如表22中所示，相較于FVIII169/VWF057，觀察到FVIII169/VWF059的類似PK概況，從而指示a2凝血酶裂解接頭對異二聚體的PK概況不具有負(fù)面影響。

表22：FVIII169/VWF057和FVIII169/VWF059在HemA小鼠中的PK概況

在HemA小鼠尾部鉗夾模型(描述于實(shí)施例9中)中相較于野生型BDD-FVIII評估FVIII169/VWF059的急性功效。用75IU/kg的FVIII169/VWF059或BDD-FVIII治療HemA小鼠，并且將各實(shí)驗(yàn)小鼠的失血體積繪制于圖13中。相較于BDD-FVIII，F(xiàn)VIII169/VWF059對HemA小鼠提供相同保護(hù)程度(p＝0.9883)，從而指示FVIII169/VWF059在體內(nèi)具有完全功能性。

FVIII-XTEN-Fc/D’D3-Fc異二聚體的質(zhì)粒構(gòu)建

VWF031核苷酸序列(SEQ ID NO:147)

VWF031蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO:86)

VWF034核苷酸序列(SEQ ID NO:148)

VWF034蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO：87)

VWF050核苷酸序列(IHH三重突變體)(SEQ ID NO:149)

VWF050蛋白質(zhì)序列(IHH三重突變體)(SEQ ID NO：150)

VWF057核苷酸序列(SEQ ID NO：151)

VWF057蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO：152)

VWF058核苷酸序列(具有IHH突變的VWF034)(SEQ ID NO：153)

VWF058蛋白質(zhì)序列(具有IHH突變的VWF034)(SEQ ID NO：154)

FVIII 169核苷酸序列(SEQ ID NO：155)

FVIII 169蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO：70)

FVIII 263核苷酸序列(IHH三重突變體)(SEQ ID NO：156)

FVIII 263蛋白質(zhì)序列(IHH三重突變體)(SEQ ID NO：157)

FVIII 282核苷酸序列(SEQ ID NO：158)

FVIII 282蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO：159)

FVIII 283核苷酸序列(具有IHH三重突變的FVIII 169)(SEQ IDNO:160)

FVIII 283蛋白質(zhì)序列(具有IHH三重突變的FVIII 169)(SEQ IDNO:161)

pSYNFVIII 010核苷酸序列-(雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO:162)

pSYNFVIII 010蛋白質(zhì)序列-(雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：163)

FVIII 195蛋白質(zhì)序列(在氨基酸1656和1900處具有兩個144AEXTEN的雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO:73)

pSYN-FVIII-173成熟蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO:72)：

FVIII 196蛋白質(zhì)序列(在氨基酸26、1656和1900處具有三個144AE XTEN的雙鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO：74)

FVIII 199蛋白質(zhì)序列(在氨基酸1656和1900處具有三個144AEXTEN的單鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO:75)

FVIII 201蛋白質(zhì)序列(在氨基酸26、1656和1900處具有三個144AE XTEN的單鏈FVIIIFc)(SEQ ID NO:76)

FVIII 203蛋白質(zhì)序列(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個288AE XTEN在B結(jié)構(gòu)域中，并且一個144AE XTEN在氨基酸1900處)(SEQ ID NO:77)

FVIII 204蛋白質(zhì)序列(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個288AE XTEN在B結(jié)構(gòu)域中，并且一個144AE XTEN在氨基酸403處)(SEQ ID NO:78)

FVIII 205蛋白質(zhì)序列(具有兩個AE XTEN的單鏈FVIIIFc；一個288AE XTEN在B結(jié)構(gòu)域中，并且一個144AE XTEN在氨基酸18處)(SEQ ID NO:79)

pSYN FVIII 266蛋白質(zhì)序列(具有在氨基酸18處的42 AE-XTEN和在B結(jié)構(gòu)域中的288AE XTEN的FVIII Fc)(SEQ ID NO:80)

pSYN FVIII 267蛋白質(zhì)序列(具有在氨基酸18處的72AE-XTEN和在B結(jié)構(gòu)域中的288AE XTEN的FVIII Fc)(SEQ ID NO：81)

pSYN FVIII 268蛋白質(zhì)序列(在氨基酸18處具有144AE-XTEN的FVIII Fc)(SEQ ID NO:82)

pSYN FVIII 269蛋白質(zhì)序列(在氨基酸18處具有72AE-XTEN的FVIII Fc)(SEQ ID NO：83)

pSYNFVIII 271蛋白質(zhì)序列(在氨基酸18處具有42AE-XTEN的FVIII Fc)(SEQ ID NO:84)

pSYN FVIII蛋白質(zhì)序列272(具有在氨基酸18處的144AEXTEN和在B結(jié)構(gòu)域中的244AE XTEN的FVIII-無Fc)(SEQ ID NO：85)

pSYN-FVIII-161蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO:69)(FVIII序列氨基酸位置1-1457；加下劃線區(qū)域表示Fc區(qū)；彎曲下劃線表示在第一Fc與VWF片段之間的可裂解接頭；加雙下劃線區(qū)域表示VWF片段；粗體區(qū)域表示在VWF片段與Fc之間的可裂解接頭)。

pSYN-FVIII-170蛋白質(zhì)序列(SEQ ID NO:71)

pSYN FVIII 310核苷酸序列(編碼除2個氨基酸殘基之外，B結(jié)構(gòu)域完全缺失，并且在aa 742之后插入288AE-XTEN的FVIII)(SEQID NO:170)

pSYN FVIII 310蛋白質(zhì)序列(除2個氨基酸殘基之外，B結(jié)構(gòu)域完全缺失，并且在aa 742之后插入288AE-XTEN的FVIII)(SEQ IDNO:171)

pSYN FVIII 312核苷酸序列(編碼除5個氨基酸殘基之外，B結(jié)構(gòu)域完全缺失，并且在aa 745之后插入288AE-XTEN的FVIII-B5形式)(SEQ ID NO:172)

pSYN FVIII 312蛋白質(zhì)序列(除5個氨基酸殘基之外，B結(jié)構(gòu)域完全缺失，并且在aa 745之后插入288AE-XTEN的FVIII-B5形式)(SEQ ID NO:173)

pSYN VWF059核苷酸序列(編碼在接頭中具有酸性區(qū)2(a2)凝血酶位點(diǎn)的VWF D’D3-Fc)(SEQ ID NO:196)

pSYN VWF059蛋白質(zhì)序列(在接頭中具有a2區(qū)FVIII凝血酶位點(diǎn)的VWF D’D3-Fc)-粗體加下劃線區(qū)域顯示a2區(qū)(SEQ ID NO：197)

pSYN VWF062核苷酸序列(編碼在接頭中不具有凝血酶位點(diǎn)的VWF D’D3-Fc)(SEQ ID NO：198)

pSYN VWF062蛋白質(zhì)序列(在接頭中不具有凝血酶位點(diǎn)的VWFD’D3-Fc)(SEQ ID NO:199)

pSYN VWF073核苷酸序列-(編碼VWFD1D2D’D3-144AEXTEN-FVIII截短a2凝血酶位點(diǎn)-Fc)(SEQ ID NO：174)

pSYN VWF073蛋白質(zhì)序列-(VWFD1D2D’D3-144AE XTEN-截短a2凝血酶位點(diǎn)-Fc)(SEQ ID NO:175)

對特定實(shí)施方案的上文描述將如此充分揭示本發(fā)明的一般性特性以致他人可在不脫離本發(fā)明的一般性概念下，在不進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)下，通過應(yīng)用本領(lǐng)域的技能內(nèi)的知識而易于針對各種應(yīng)用來修改和/或改適所述特定實(shí)施方案。因此，基于本文呈現(xiàn)的教導(dǎo)和指導(dǎo)，所述改適和修改意圖在公開的實(shí)施方案的等效物的含義和范圍內(nèi)。應(yīng)了解本文的措辭或術(shù)語是出于描述而非限制目的，因此本說明書的術(shù)語或措辭應(yīng)由熟練技術(shù)人員根據(jù)教導(dǎo)和指導(dǎo)加以解釋。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案將由考慮本文公開的本發(fā)明的說明書和實(shí)施而為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易知。意圖說明書和實(shí)施例僅被視為具有示例性，其中本發(fā)明的真正范圍和精神由以下權(quán)利要求指示。

本文引用的所有專利和出版物都以引用的方式整體并入本文。