本發(fā)明涉及用于治療沙-馬-圖病(Charcot-Marie-Toothdisease)和相關(guān)病癥、尤其是機(jī)械性神經(jīng)元損傷的組合物和方法。
背景技術(shù)：
：：沙-馬-圖病(“CMT”)是一種遺傳性外周多發(fā)性孤兒神經(jīng)病。約2500個(gè)體中有1人患有這種疾病，它是外周神經(jīng)系統(tǒng)最常見的遺傳性病癥。它的發(fā)作典型地出現(xiàn)在生命的第一或第二個(gè)十年中，盡管在嬰兒期也可以檢測到它。疾病過程是慢性的，具有逐漸的神經(jīng)肌肉變性。在伴隨有神經(jīng)痛和極度肌無力的病例中，疾病可造成殘廢。CMT是研究得最深入的遺傳病之一，在法國使用了大約30,000個(gè)病例。盡管大多數(shù)CMT患者帶有含有髓磷脂基因PMP22的17號(hào)染色體片段的重復(fù)(CMT1A形式)，但有兩打以上的基因與不同形式的CMT相關(guān)。因此，盡管起源是單基因的，但由于可能的調(diào)節(jié)基因，該疾病表現(xiàn)出臨床異質(zhì)性。CMT患者中突變的基因，簇集在緊密關(guān)聯(lián)的影響施旺細(xì)胞或神經(jīng)元的分化、或在外周神經(jīng)中改變這些細(xì)胞的相互作用的分子途徑周圍。挖掘公用數(shù)據(jù)，描述CMT1A疾病的分子機(jī)制和病理表現(xiàn)，允許我們對(duì)幾個(gè)功能性細(xì)胞組件——PMP22基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、PMP22蛋白的折疊/降解、施旺細(xì)胞的增殖和凋亡、神經(jīng)元死亡、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和重塑，免疫應(yīng)答——作為CMT相關(guān)治療性干預(yù)的潛在合理的靶，按優(yōu)先順序進(jìn)行排列。這些失調(diào)控的功能性組件對(duì)沙-馬-圖病的病理表現(xiàn)的發(fā)生和發(fā)展的組合影響，為組合CMT療法的潛在效能提供了證明。國際專利申請(qǐng)n°PCT/EP2008/066457描述了通過建立病理的動(dòng)態(tài)模型并靶向與CMT疾病的調(diào)控相關(guān)的功能性細(xì)胞途徑，來鑒定用于沙-馬-圖病治療的藥物候選物的方法。國際專利申請(qǐng)n°PCT/EP2008/066468描述了用于治療沙-馬-圖病的組合物，其包含選自多種藥物候選物的至少兩種化合物。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供使用特定藥物組合的、用于治療CMT和相關(guān)病癥、尤其是外傷性神經(jīng)病的新的治療藥劑組合。更具體來說，本發(fā)明的一個(gè)目的涉及包含巴氯芬、山梨糖醇以及選自毛果蕓香堿、甲巰咪唑、米非司酮、納曲酮、雷帕霉素、氟比洛芬和酮洛芬的化合物、他們的鹽或前體藥物，用于同時(shí)、分別或相繼給藥于哺乳動(dòng)物對(duì)象。本發(fā)明的具體目的涉及包含巴氯芬、山梨糖醇和納曲酮的組合物，其用于同時(shí)、分別或相繼給藥于哺乳動(dòng)物對(duì)象。本發(fā)明的另一個(gè)目的是如上所公開的組合物，其還包含一種或幾種可藥用賦形劑或載體(即藥物組合物)。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及如上所公開的組合物，其用于治療機(jī)械性神經(jīng)元損傷或外傷性神經(jīng)病。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及使用如上公開的化合物的組合，用于制造治療機(jī)械性神經(jīng)元損傷或外傷性神經(jīng)病的藥物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療外傷性神經(jīng)病或機(jī)械性神經(jīng)元損傷的方法，所述方法包含向需要的對(duì)象給藥有效量的如上定義的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備藥物組合物的方法，所述方法包含將上述化合物混合在適合的賦形劑或載體中。本發(fā)明的一個(gè)更具體目的是在患有外傷性神經(jīng)病或機(jī)械性神經(jīng)元損傷的對(duì)象中促進(jìn)或改善神經(jīng)再生的方法，所述方法包含向需要的對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是在患有外傷性神經(jīng)病的對(duì)象中促進(jìn)神經(jīng)再生的方法，所述方法包含向需要的對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及如上所公開的組合物，其用于治療外傷性神經(jīng)病。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是在需要的對(duì)象中促進(jìn)或改善神經(jīng)再生的方法，所述方法包含向所述對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是在需要的對(duì)象中促進(jìn)或改善神經(jīng)髓鞘形成的方法，所述方法包含向所述對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是在需要的對(duì)象中恢復(fù)軸突形態(tài)、生長或電生理功能的方法，所述方法包括向所述對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明特別適合于治療患有神經(jīng)失用癥、軸突斷傷(axonometsis)、或神經(jīng)斷傷的對(duì)象，以及患有外傷性腦損傷、脊髓損傷或外周神經(jīng)的機(jī)械性損傷的對(duì)象。本文中公開的各種應(yīng)用或治療方法中的任一項(xiàng)，還可以包括對(duì)患有機(jī)械性損傷的患者進(jìn)行診斷的任選步驟。就此而言，本發(fā)明的另一個(gè)目的是治療機(jī)械性神經(jīng)損傷的方法，所述方法包含(1)評(píng)估對(duì)象是否患有機(jī)械性神經(jīng)損傷，以及(2)用有效量的上述化合物的組合治療患有機(jī)械性神經(jīng)損傷的對(duì)象，所述治療導(dǎo)致神經(jīng)再生。確定對(duì)象是否患有機(jī)械性神經(jīng)損傷可以通過本
技術(shù)領(lǐng)域：
：中本身已知的各種測試來進(jìn)行。本發(fā)明可用于任何哺乳動(dòng)物對(duì)象、特別是人類對(duì)象。附圖說明圖1.藥物組合的協(xié)同效應(yīng)，劑量1：A)混合物7(劑量1，第10日)，B)D-山梨糖醇(SRB，500μM，第10日)，C)(R/S)-巴氯芬(BCL，5μM，第10日)和D)納曲酮(NTX，5μM，第10日)對(duì)MBP表達(dá)的影響。*：p<0.05：與對(duì)照(＝抗環(huán)血酸)顯著差異(單向ANOVA然后進(jìn)行Fisher事后檢驗(yàn))；ns：無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異圖2.藥物組合的協(xié)同效應(yīng)，劑量6：A)混合物7(劑量6，第10日)，B)SRB(160nM，第10日)，C)BCL(1.6nM，第10日)和D)NTX(1.6nM，第10日)對(duì)MBP表達(dá)的影響。*：p<0.05：與對(duì)照(＝抗環(huán)血酸)顯著差異(單向ANOVA然后進(jìn)行Fisher事后檢驗(yàn))；ns：無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異圖3.在PMP22TG共培養(yǎng)物中與抗環(huán)血酸共溫育的A)第10日和B)第11日，混合物7(7種劑量)對(duì)MBP表達(dá)的正效應(yīng)，以對(duì)照(＝抗環(huán)血酸)的百分率表示。單向ANOVA然后進(jìn)行Fisher事后檢驗(yàn)。圖4.使用桿試驗(yàn)測量的用混合物1處理3和6周對(duì)雄性大鼠的正效應(yīng)。等待時(shí)間用試驗(yàn)的前兩次測定的平均值度量(白色條表示用安慰劑處理的對(duì)照大鼠；黑色條表示用安慰劑處理的轉(zhuǎn)基因大鼠；灰色條表示用混合物1處理的轉(zhuǎn)基因大鼠。**p<0.01。統(tǒng)計(jì)使用Student雙向檢驗(yàn)來實(shí)現(xiàn))。圖5.用混合物1組合物處理3和6周(分別為左圖和右圖)對(duì)雄性大鼠步態(tài)的正效應(yīng)(白色條表示流暢步態(tài)；灰色條表示不流暢步態(tài)；黑色條表示大鼠具有嚴(yán)重的行走失能。統(tǒng)計(jì)使用Student雙向檢驗(yàn)來實(shí)現(xiàn))。圖6.使用斜面試驗(yàn)(25°)，大鼠中混合物1組合物對(duì)雄性大鼠的正效應(yīng)。在處理3、6、9和12周后對(duì)大鼠進(jìn)行檢查(白色條表示用安慰劑處理的對(duì)照大鼠；黑色條表示用安慰劑處理的轉(zhuǎn)基因大鼠；灰色條表示用混合物1處理的轉(zhuǎn)基因大鼠。*p<0.05。統(tǒng)計(jì)使用Student雙向檢驗(yàn)來實(shí)現(xiàn))。圖7.使用斜面試驗(yàn)，在大鼠中用混合物2組合物處理3周后對(duì)雌性大鼠的正效應(yīng)(白色條表示用安慰劑處理的對(duì)照大鼠；黑色條表示用安慰劑處理的轉(zhuǎn)基因大鼠；灰色條表示用混合物2處理的轉(zhuǎn)基因大鼠。**p<0.01。統(tǒng)計(jì)使用Student雙向檢驗(yàn)來實(shí)現(xiàn))。圖8.在奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病后，混合物1對(duì)雄性大鼠的保護(hù)效應(yīng)(白色條表示用安慰劑處理的野生型大鼠；黑色條表示用參比產(chǎn)品加巴噴丁處理的野生型大鼠；灰色條表示用混合物1處理的野生型大鼠。*p<0.05；**p<0.01。統(tǒng)計(jì)使用Student雙向檢驗(yàn)來實(shí)現(xiàn))。圖9.在用混合物7-劑量3處理9周后觀察到的在處理的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中與PMP22轉(zhuǎn)基因大鼠相比pmp22RNA表達(dá)的顯著降低(MPZ作為參比基因，Sereda等，1996)(p＝0.0015)。轉(zhuǎn)基因的整合和pmp22基因的過表達(dá)也已被證實(shí)；轉(zhuǎn)基因PMP22大鼠中pmp22RNA與其野生型同窩仔畜對(duì)照相比過表達(dá)1.8倍(p<110-4)。在16周齡的雄性大鼠的坐骨神經(jīng)上進(jìn)行pmp22RNA提取(對(duì)于野生型來說n＝18，對(duì)于轉(zhuǎn)基因大鼠來說n＝20，對(duì)于使用混合物7-劑量3處理的TG來說n＝18)。統(tǒng)計(jì)分析使用Welcht-檢驗(yàn)來進(jìn)行。圖10.對(duì)35°下的斜面試驗(yàn)分值進(jìn)行聚類分析，以分配到在所有評(píng)估的時(shí)間點(diǎn)時(shí)(處理3、6和9周在一起進(jìn)行分析)的不良、中等和練好表現(xiàn)類別。在WT和TG安慰劑之間觀察到顯著差異：68％的WT屬于良好表現(xiàn)組，而只有5％的TG安慰劑屬于該組(p＝0.0003)?；旌衔?-劑量2和劑量3改進(jìn)了TG大鼠的表現(xiàn)。通過以5％顯著性水平應(yīng)用趨勢檢驗(yàn)來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(對(duì)于WT安慰劑大鼠來說n＝18，對(duì)于TG安慰劑大鼠來說n＝20，對(duì)于混合物7-劑量2處理的TG來說n＝17，對(duì)于混合物7-劑量3處理的TG來說n＝18)。圖11.使用采用夾心方差估計(jì)的Cox模型分析了用混合物7-劑量3處理9周后TG大鼠在桿試驗(yàn)中的跌落等待時(shí)間，并通過以5％顯著性水平使用時(shí)序檢驗(yàn)與參比的TG安慰劑組進(jìn)行比較。在處理9周后混合物7-劑量3顯著增加了TG大鼠的跌落等待時(shí)間。圖12.在處理后的所有時(shí)間范圍內(nèi)(3、6和9周)，使用采用夾心方差估計(jì)的Cox模型對(duì)野生型組、轉(zhuǎn)基因安慰劑組和用混合物7-劑量3每日處理共9周的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組的抓握力量進(jìn)行建模，并通過以5％顯著性水平使用時(shí)序檢驗(yàn)與參比的TG安慰劑組進(jìn)行比較。相應(yīng)的p-值顯示在Kaplan-Meier曲線上。觀察到了轉(zhuǎn)基因安慰劑大鼠(黑色素線，n＝21)與WT大鼠(灰色素線，p＝1.4510-5，n＝19)相比前爪抓握力量的顯著降低。用混合物7-劑量3處理顯著增加了前爪的力量(黑色虛線，p＝0.03，n＝18)。圖13.Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)顯示出桿試驗(yàn)中的跌落等待時(shí)間(在處理9周后)與pmp22RNA表達(dá)水平之間的顯著相關(guān)性：p＝1.610-4(WT、TG安慰劑和混合物7-劑量3處理的TG在一起進(jìn)行分析)；p＝0.07(TG安慰劑和混合物7-劑量3處理的TG在一起進(jìn)行分析)。pmp22RNA表達(dá)越低，桿試驗(yàn)表現(xiàn)越好。雄性大鼠為16周齡(對(duì)于WT大鼠來說n＝18，白色圓圈；對(duì)于TG安慰劑來說n＝20，黑色圓圈；對(duì)于混合物7-劑量3處理的TG來說n＝18，白色三角形)。圖14.Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)顯示出桿試驗(yàn)中的跌落等待時(shí)間(在處理9周后)與敏感神經(jīng)的傳導(dǎo)速度(NCV)之間的顯著相關(guān)性：p＝1.3410-6(WT、TG安慰劑和混合物7-劑量3處理的TG在一起進(jìn)行分析)；p＝0.04(TG安慰劑和混合物7-劑量3處理的TG在一起進(jìn)行分析)。傳導(dǎo)速度越高，桿試驗(yàn)中的表現(xiàn)越好。雄性大鼠為16周齡(對(duì)于WT大鼠來說n＝18，白色圓圈；對(duì)于TG安慰劑來說n＝20，黑色圓圈；對(duì)于混合物7-劑量3處理的TG來說n＝18，白色三角形)。圖15.用混合物7(劑量3)處理神經(jīng)夾傷的(crushed)小鼠恢復(fù)了神經(jīng)生理機(jī)能并改善了軸突和髓鞘完整性。A)用混合物7口服處理三周增加了坐骨神經(jīng)夾傷的雄性小鼠的CMAP(坐骨神經(jīng)/腓腸肌)的波幅。(對(duì)于每個(gè)假手術(shù)組、夾傷/介質(zhì)組和夾傷/混合物7組來說n＝10)。B)混合物7口服處理6周顯著改善了軸突口徑尺寸。C)根據(jù)夾傷小鼠中軸突直徑的G-比率(軸突內(nèi)徑與軸突和髓鞘總外徑的比率)的分布顯示較小軸突的高髓鞘形成和較大軸突的低髓鞘形成。用混合物7口服處理6周顯著改善了夾傷小鼠(B)和C)，每組n＝6)的G-比率分布(t-檢驗(yàn).*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。所有數(shù)據(jù)均以平均值+s.e.m.示出)。圖16.在12個(gè)月的試驗(yàn)中，混合物7顯著改善了(p<0.05)CMT1A患者中的神經(jīng)病失能(平均值±s.e.m.)。在混合物7處理組(實(shí)線)中，當(dāng)與基線分值比較時(shí)，ONLS的改進(jìn)高于10％，而在安慰劑組(虛線)中，當(dāng)與基線分值比較時(shí)，ONLS降低了約5％。圖17.用混合物7處理的神經(jīng)夾傷的小鼠恢復(fù)了功能性行為。A)手術(shù)過的小鼠無法合適地放下它們受影響的爪子以進(jìn)行正常的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致表面承重比降低。B)在處理13天后，混合物7(巴氯芬(BCL)600μg/kg，納曲酮(NTX)70μg/kg，D-山梨糖醇(SRB)21mg/kg)能夠?qū)⒃摴δ苋毕萃耆；?，而單個(gè)藥物對(duì)表面承重比沒有作用(C),D),E))每個(gè)組n＝10。(數(shù)據(jù)以平均值+s.e.m.示出，相對(duì)于夾傷介質(zhì)，*p<0.05,**p<0.01(t-檢驗(yàn))；ns:不顯著)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于治療CMT或CMT相關(guān)病癥的新的治療方法。本發(fā)明公開了新的藥物組合，其允許這種疾病的有效矯正并可以用于任何哺乳動(dòng)物對(duì)象。在本發(fā)明的背景內(nèi)，CMT包括CMT1A、CMT1B、CMT1C、CMT1D、CMT1X、CMT2A、CMT2B、CMT2D、CMT2E、CMT2-P0、CMT4A、CMT4B1、CMT4B2、CMT4D、CMT4F、CMT4或AR-CMT2A，更優(yōu)選為CMT1a。在本發(fā)明的背景內(nèi)，術(shù)語“CMT相關(guān)病癥”是指與引起髓鞘形成異常和神經(jīng)元喪失的PMP22異常表達(dá)相關(guān)的其他疾病。更具體來說，“CMT相關(guān)病癥”是指阿茨海默氏病(AD)，AD型老年癡呆癥(SDAT)，帕金森氏癥，路易體癡呆，血管性癡呆，孤獨(dú)癥，輕度認(rèn)知病癥(MCI)，增齡性記憶病癥(AAMI)以及與衰老相關(guān)的問題，腦炎后帕金森氏癥，精神分裂癥，抑郁癥，雙相病癥和其他情緒病癥，亨廷頓舞蹈癥，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病包括肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)，多發(fā)性硬化癥，青光眼，吉蘭-巴雷綜合征，細(xì)長軸突營養(yǎng)不良，神經(jīng)病，包括特發(fā)性神經(jīng)病，糖尿病性神經(jīng)病，中毒性神經(jīng)病，包括由藥物治療誘導(dǎo)的神經(jīng)病，由HIV、輻射、重金屬或維生素缺乏狀態(tài)引起的神經(jīng)病和癡呆，或外傷性神經(jīng)病(例如，由機(jī)械性神經(jīng)元損傷導(dǎo)致)，基于朊病毒的神經(jīng)變性，包括克羅伊茨費(fèi)爾特－雅各布病(CJD)、牛海綿狀腦病(BSE)、GSS、FFI、庫魯病和Alper’s綜合征。在優(yōu)選實(shí)施方案中，“CMT相關(guān)病癥”是指中毒性或外傷性神經(jīng)病、特別是藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)病，ALS或由機(jī)械性神經(jīng)元損傷導(dǎo)致的神經(jīng)病。在本發(fā)明的情形下，“機(jī)械性神經(jīng)元損傷”是指對(duì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或在外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的神經(jīng)的直接物理損害。對(duì)PNS的損害可以根據(jù)神經(jīng)元損傷的階段進(jìn)行分級(jí)。本發(fā)明適合于治療分級(jí)為神經(jīng)失用癥(僅有神經(jīng)的信號(hào)傳導(dǎo)能力受損的癥狀)、軸突斷傷(暗示損害軸突而不影響神經(jīng)的周圍結(jié)締組織的損傷)、以及神經(jīng)斷傷(損害了軸突和周圍組織二者的損傷)的神經(jīng)損傷。機(jī)械性神經(jīng)元損傷可以具有偶發(fā)性的來源，或者由手術(shù)或由其他病癥如分娩相關(guān)的尿失禁導(dǎo)致。對(duì)CNS的損害包括脊髓損傷以及外傷性腦損傷。外傷性腦損傷可以是原發(fā)性損傷(即由外傷直接產(chǎn)生)或繼發(fā)性損傷(即作為外傷的結(jié)果)。脊髓損傷可以根據(jù)感覺和運(yùn)動(dòng)失能的程度來分級(jí)，如在脊髓損傷的神經(jīng)病學(xué)分類國際標(biāo)準(zhǔn)(InternationalStandardsforNeurologicalClassificationofSpinalCordInjury)(Kirshblum等，2011)中設(shè)定的。在本文中使用時(shí)，疾病的“治療”包括治療、防止、預(yù)防、阻滯或減輕由疾病引起的疼痛。術(shù)語治療特別包括控制疾病的發(fā)展和相關(guān)癥狀。特別地，根據(jù)本發(fā)明的CMT或相關(guān)神經(jīng)病的治療包括防止或阻滯或減輕或改善由這些疾病引起的運(yùn)動(dòng)、自主神經(jīng)和/或感覺損傷。運(yùn)動(dòng)癥狀包括不受控的收縮、自發(fā)性收縮弱、或由受損神經(jīng)支配的肌肉的完全無反應(yīng)性。自主神經(jīng)癥狀可以影響心血管系統(tǒng)、催汗、熱調(diào)節(jié)、泌尿、胃腸、和/或生殖系統(tǒng)。感覺癥狀包括疼痛、麻木、或在由受損神經(jīng)支配的區(qū)域中喪失感覺?！吧窠?jīng)再生”包括促進(jìn)髓鞘形成、軸突生長和/或恢復(fù)神經(jīng)的形態(tài)或功能特征。此外，術(shù)語“化合物”是指在本申請(qǐng)中具體命名的化學(xué)化合物，以及任何帶有其可接受的鹽、水合物、酯、醚、異構(gòu)體、消旋體、偶聯(lián)物和前體藥物的藥物組合物。本申請(qǐng)中列出的化合物也可以用其相應(yīng)的CAS號(hào)識(shí)別。因此，在本發(fā)明中使用的優(yōu)選化合物是巴氯芬(CAS1134-47-0)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物；山梨糖醇(CAS50-70-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物；納曲酮(CAS16590-41-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物；米非司酮(CAS84371-65-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物；毛果蕓香堿(CAS54-71-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物；甲巰咪唑(CAS60-56-0)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物；酮洛芬(CAS22071-15-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物；氟比洛芬(5104-49-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物，以及雷帕霉素(CAS53123-88-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體、前體藥物和衍生物。在本發(fā)明中使用的其他化合物是乙酰唑胺(CAS59-66-5)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；沙丁胺醇(CAS18559-94-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；阿米洛利(CAS2016-88-8)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；氨魯米特(CAS125-84-8)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；胺碘酮(CAS1951-25-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；氨曲南(CAS78110-38-0)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；巴氯芬(CAS1134-47-0)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；巴柳氮(CAS80573-04-2)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；甜菜堿(CAS107-43-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；氨基甲酰甲基膽堿(CAS674-38-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；比卡魯胺(CAS90357-06-5)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；溴隱亭(CAS25614-03-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；布美他尼(CAS28395-03-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；丁螺環(huán)酮(CAS36505-84-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；卡巴膽堿(CAS51-83-2)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；卡馬西平(CAS298-46-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；卡比馬唑(CAS22232-54-8)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；西維美林(CAS107233-08-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；環(huán)丙沙星(CAS85721-33-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；可樂定(CAS4205-90-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；姜黃素(CAS458-37-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；環(huán)孢菌素A(CAS59865-13-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；地西泮(CAS439-14-5)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；雙氯芬酸(CAS15307-86-5)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；地諾前列酮(CAS363-24-6)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；雙硫侖(CAS97-77-8)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；D-山梨糖醇(CAS50-70-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；度他雄胺(CAS164656-23-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；雌二醇(CAS50-28-2)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；依西美坦(CAS107868-30-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；非爾氨酯(CAS25451-15-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；非諾貝特(CAS49562-28-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；非那雄胺(CAS98319-26-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；氟馬西尼(CAS78755-81-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；氟硝西泮(CAS1622-62-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；氟比洛芬(CAS5104-49-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；呋塞米(CAS54-31-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；加巴噴丁(CAS60142-96-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；加蘭他敏(CAS357-70-0)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；氟哌啶醇(CAS52-86-8)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；布洛芬(CAS15687-27-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；異丙腎上腺素(CAS7683-59-2)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；酮康唑(CAS65277-42-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；酮洛芬(CAS22071-15-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；L-肉毒堿(CAS541-15-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；碘塞羅寧(T3)(CAS6893-02-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；鋰(CAS7439-93-2)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；氯沙坦(CAS114798-26-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；洛沙平(CAS1977-10-2)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；美洛昔康(CAS71125-38-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；異丙喘寧(CAS586-06-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；間羥胺(CAS54-49-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；二甲雙胍(CAS657-24-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；醋甲膽堿(CAS55-92-5)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；甲巰咪唑(CAS60-56-0)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；甲基麥角新堿(CAS113-42-8)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；美托洛爾(CAS37350-58-6)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；美替拉酮(CAS54-36-4)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；咪康唑(CAS22916-47-8)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；米非司酮(CAS84371-65-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；納多洛爾(CAS42200-33-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；納洛酮(CAS465-65-6)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；納曲酮(CAS16590-41-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；諾氟沙星(CAS70458-96-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；噴他佐辛(CAS359-83-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；苯氧芐胺(CAS59-96-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；丁酸苯酯(CAS1821-12-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；毛果蕓香堿(CAS54-71-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；匹格列酮(CAS111025-46-8)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；哌唑嗪(CAS19216-56-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；丙基硫尿嘧啶(CAS51-52-5)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；雷洛昔芬(CAS84449-90-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；雷帕霉素(CAS53123-88-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；利福平(CAS13292-46-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；辛伐他汀(CAS79902-63-9)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；螺內(nèi)酯(CAS52-01-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；他克莫司(CAS104987-11-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；他莫昔芬(CAS10540-29-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；海藻糖(CAS99-20-7)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；曲洛司坦(CAS13647-35-3)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物；丙戊酸(CAS99-66-1)及其可能的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、前體藥物和衍生物。術(shù)語“組合”是指將幾種藥物共同給藥于對(duì)象以引起生物學(xué)效應(yīng)的處理方法。在組合療法中，藥物可以一起或分開、同時(shí)或相繼給藥。此外，藥物也可以通過不同的途徑和方案給藥。現(xiàn)在，本發(fā)明公開了為外傷性神經(jīng)病和機(jī)械性神經(jīng)元損傷提供有效治療的具體藥物組合的鑒定和活性。更具體來說，本發(fā)明公開了新的三元組合，其在體外和體內(nèi)提供了對(duì)神經(jīng)再生的顯著影響。就此而言，本發(fā)明涉及組合物，其包含巴氯芬、山梨糖醇以及選自毛果蕓香堿、甲巰咪唑、米非司酮、納曲酮、雷帕霉素、氟比洛芬和酮洛芬的化合物，以及他們的鹽、對(duì)映異構(gòu)體、消旋體或前體藥物。更具體來說，本發(fā)明涉及組合物，其包含巴氯芬、山梨糖醇以及選自毛果蕓香堿、甲巰咪唑、米非司酮、納曲酮和酮洛芬的化合物。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含納曲酮、巴氯芬和山梨糖醇的組合物，其用于同時(shí)、分別或相繼給藥于哺乳動(dòng)物對(duì)象。優(yōu)選情況下，在上述組合物中，山梨糖醇是D-山梨糖醇，巴氯芬是RS-巴氯芬或S-巴氯芬、更優(yōu)選為RS-巴氯芬。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選目標(biāo)涉及組合物，其包含：(a)雷帕霉素,(b)米非司酮或納曲酮，以及(c)PMP22調(diào)節(jié)劑，用于同時(shí)、分別或相繼給藥于哺乳動(dòng)物對(duì)象。.本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選目的是組合物，其包含：(a)雷帕霉素,(b)米非司酮，以及(c)PMP22調(diào)節(jié)劑，用于同時(shí)、分別或相繼給藥于哺乳動(dòng)物對(duì)象。.PMP22調(diào)節(jié)劑可以是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PMP22途徑并在本質(zhì)上引起或有助于髓磷脂組織的正?；?或神經(jīng)元喪失的抑制的任何化合物。PMP22調(diào)節(jié)劑可以選自乙酰唑胺、沙丁胺醇、阿米洛利、氨魯米特、胺碘酮、氨曲南、巴氯芬、巴柳氮、甜菜堿、氨基甲酰甲基膽堿、比卡魯胺、溴隱亭、布美他尼、丁螺環(huán)酮、卡巴膽堿、卡馬西平、卡比馬唑、西維美林、環(huán)丙沙星、可樂定、姜黃素、環(huán)孢菌素A、地西泮、雙氯芬酸、地諾前列酮、雙硫侖、D-山梨糖醇、度他雄胺、雌二醇、依西美坦、非爾氨酯、非諾貝特、非那雄胺、氟馬西尼、氟硝西泮、氟比洛芬、呋塞米、加巴噴丁、加蘭他敏、氟哌啶醇、布洛芬、異丙腎上腺素、酮康唑、酮洛芬、L-肉毒堿、碘塞羅寧(T3)、鋰、氯沙坦、洛沙平、美洛昔康、異丙喘寧、間羥胺、二甲雙胍、醋甲膽堿、甲巰咪唑、甲基麥角新堿、美托洛爾、美替拉酮、咪康唑、米非司酮、納多洛爾、納洛酮、納曲酮；諾氟沙星、噴他佐辛、苯氧芐胺、丁酸苯酯、毛果蕓香堿、匹格列酮、哌唑嗪、丙基硫尿嘧啶、雷洛昔芬、雷帕霉素、利福平、辛伐他汀、螺內(nèi)酯、他克莫司、他莫昔芬、海藻糖、曲洛司坦、丙戊酸，及其鹽或前體藥物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，化合物(c)選自毛果蕓香堿、甲巰咪唑和巴氯芬。就此而言，本發(fā)明的最優(yōu)選組合物包含：(a)雷帕霉素，(b)米非司酮，以及(c)選自毛果蕓香堿、甲巰咪唑和巴氯芬的化合物，用于同時(shí)、分別或相繼給藥于哺乳動(dòng)物對(duì)象。這種組合物的具體實(shí)例包括包含下列組分的組合物：-雷帕霉素、米非司酮和毛果蕓香堿；-雷帕霉素、米非司酮和巴氯芬；-雷帕霉素、米非司酮和甲巰咪唑；或-雷帕霉素、納曲酮和甲巰咪唑。實(shí)驗(yàn)部分顯示，這些特定藥物組合能夠在體外有效矯正PMP22表達(dá)，以恢復(fù)正常的髓鞘形成和神經(jīng)元完整性，并因此在動(dòng)物體內(nèi)改善CMT。結(jié)果還顯示，這些組合能夠保護(hù)動(dòng)物免于化療誘導(dǎo)的或外傷性神經(jīng)病。因此，這些組合物可用于阻止或減輕化療誘導(dǎo)的神經(jīng)病，從而使患者能夠接受更長期的化療。另外，實(shí)驗(yàn)部分顯示了本發(fā)明的組合物的神經(jīng)再生促進(jìn)性質(zhì)。實(shí)際上，發(fā)明人已經(jīng)證明了本發(fā)明的組合的神經(jīng)營養(yǎng)活性，其特征為促進(jìn)軸突生長和髓鞘形成，這導(dǎo)致顯著恢復(fù)了神經(jīng)脈沖向肌肉的傳遞。因此，本發(fā)明的組合物可用于改善和/或加速任何神經(jīng)元損傷的恢復(fù)，所述神經(jīng)元損傷可以為遺傳、化學(xué)或機(jī)械來源(例如外傷)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是組合物，其包含納曲酮、巴氯芬以及如上定義的其他不同PMP22抑制劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是如上公開的組合物，其還包含一種或幾種可藥用賦形劑或載體(即藥物組合物)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在需要的對(duì)象中促進(jìn)神經(jīng)再生的方法，所述方法包括向所述對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及如上公開的組合物，其用于治療CMT或CMT相關(guān)病癥。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及如上公開的化合物組合的應(yīng)用，用于制造治療CMT或CMT相關(guān)病癥的藥物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于治療CMT或CMT相關(guān)病癥的方法，所述方法包含向需要的對(duì)象給藥有效量的如上定義的組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備藥物組合物的方法，所述方法包含將上述化合物混合在適合的賦形劑或載體中。本發(fā)明的一個(gè)更具體的目的是在對(duì)象中治療CMT1A的方法，所述方法包含向需要的對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是在對(duì)象中治療中毒性神經(jīng)病的方法，所述方法包含向需要的對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是在對(duì)象中治療ALS的方法，所述方法包含向需要的對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。本發(fā)明的另一個(gè)具體目的是在對(duì)象中治療外傷性神經(jīng)病的方法，所述方法包括向需要的對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，需要促進(jìn)神經(jīng)再生的對(duì)象正在患有或已經(jīng)患有機(jī)械性神經(jīng)元損傷如外傷性腦損傷、脊髓損傷或外周神經(jīng)損傷。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在需要的對(duì)象中改善和/或加速神經(jīng)元損傷的恢復(fù)的方法，所述方法包括向所述對(duì)象給藥有效量的如上公開的化合物或化合物組合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，需要改善和/或加速機(jī)械性神經(jīng)元損傷的恢復(fù)的對(duì)象正在患有或已經(jīng)患有外傷性腦損傷、脊髓損傷或外周神經(jīng)損傷。本發(fā)明的療法可以作為藥物組合進(jìn)行，和/或與任何其他療法聯(lián)合進(jìn)行。它可以在家、醫(yī)生辦公室、診所、醫(yī)院門診部或醫(yī)院提供，以便醫(yī)生可以密切觀察療法的效果，并作出任何需要的調(diào)整。療法的持續(xù)時(shí)間取決于所治療疾病的階段、患者的年齡和狀況以及患者對(duì)治療的響應(yīng)如何。此外，發(fā)生其他神經(jīng)病性疾病的風(fēng)險(xiǎn)較高的人(例如對(duì)例如糖尿病具有遺傳易感性或患有糖尿病的人，或正在進(jìn)行腫瘤病癥的治療的人等)，可以接受預(yù)防性治療，以緩解或延遲最終的神經(jīng)病性響應(yīng)。組合中每種組分的給藥劑量、頻率和方式可以獨(dú)立地進(jìn)行控制。例如，一種藥物可以口服，而第二種藥物可以肌肉內(nèi)給藥。組合療法可以包括休息期的斷續(xù)循環(huán)的方式進(jìn)行，以便患者的身體有機(jī)會(huì)從任何尚未預(yù)見到的副作用中恢復(fù)。藥物也可以配制到一起，以便一次給藥遞送這兩種藥物。藥物組合物的制劑組合的每種藥物的給藥可以通過任何適合的方式進(jìn)行，使得與其他組分組合后，藥物的濃度能夠改善患者的狀況(其可以例如在體外根據(jù)在到達(dá)外周神經(jīng)后對(duì)PMP22的表達(dá)升高的影響來確定)。盡管組合中的活性成分可以作為純的化學(xué)物質(zhì)給藥，但優(yōu)選情況下將它們作為藥物組合物提供，在本文中也稱為藥物制劑?？赡艿慕M合物包括適合于口服、直腸、表面(包括透皮、頰和舌下)或腸胃外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和真皮內(nèi))給藥的組合物。更通常情況下，這些藥物制劑以含有多個(gè)劑量單位的“患者包”的形式，或其他用于將不同治療時(shí)期內(nèi)使用的計(jì)量單位藥劑放置在單個(gè)包裝、通常為泡罩包裝中給藥的方式，開給患者?；颊甙c藥劑師從大包裝藥劑供應(yīng)品中分出患者的藥物供應(yīng)品的傳統(tǒng)處方藥相比，其優(yōu)點(diǎn)在于患者總是能夠得到患者包中包含的包裝說明書，它在傳統(tǒng)處方藥中一般是沒有的。包含包裝說明書已被顯示出能夠提高患者對(duì)醫(yī)生指令的順從性。因此，本發(fā)明還包括本文前述的藥物制劑與適合用于所述制劑的包裝材料的組合。在這樣的患者包中，用于組合治療的制劑的預(yù)期使用方法，可以從說明書、設(shè)備、供應(yīng)品、適應(yīng)癥和/或其他幫助使用制劑最適合地用于治療的手段，推斷出來。這樣的措施使得患者包特別適合并可改造以適用于以本發(fā)明的組合進(jìn)行的治療。藥物可以以任何適合的量包含在任何適合的載體物質(zhì)中，并可以以組合物總重量的重量計(jì)1-99％的量存在。組合物可以提供在適合于口服、腸胃外(例如靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi))、直腸、皮膚、鼻、陰道、吸入、皮膚(貼片)或眼給藥途徑的劑型中。因此，組合物可以采取例如片劑、膠囊、丸劑、粉劑、顆粒劑、懸液、乳液、溶液、凝膠包括水凝膠、糊劑、軟膏、油膏、膏藥、浸液、滲透性遞送裝置、栓劑、灌腸劑、注射劑、植入物、噴劑或氣溶膠的形式。藥物組合物可以按照常規(guī)的藥物實(shí)踐進(jìn)行配制(參見例如《Remington：藥物科學(xué)與實(shí)踐》(第20版)(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(20thed.))，A.R.Gennaro主編，LippincottWilliams&Wilkins,2000，以及《制藥技術(shù)百科》(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology)，J.Swarbrick和J.C.Boylan主編，1988-1999,MarcelDekker,NewYork)。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成在給藥后基本上立刻、或在給藥后任何預(yù)定的時(shí)間或時(shí)期釋放出活性藥物。受控釋放制劑包括(i)在體內(nèi)在較長時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生基本上恒定的藥物濃度的制劑；(ii)在預(yù)定的延遲時(shí)間后在體內(nèi)在較長時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生基本上恒定的藥物濃度的制劑；(iii)通過維持體內(nèi)相對(duì)恒定有效的藥物水平并在同時(shí)最小化與活性藥物物質(zhì)的血漿濃度波動(dòng)有關(guān)的不想要的副作用，在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)維持藥物作用的制劑；(iv)通過例如將受控釋放組合物空間放置在患病組織或器官附近或其中，使藥物作用局部化的制劑；以及(v)通過使用載體或化學(xué)衍生物將藥物遞送到特定靶細(xì)胞類型而使藥物作用定向的制劑。藥物以受控釋放制劑的形式給藥，在下列情況下是特別優(yōu)選的，在這些情況中，藥物組合地具有(i)狹窄的治療指數(shù)(即產(chǎn)生有害副作用或毒性反應(yīng)的血漿濃度與產(chǎn)生治療效果的血漿濃度之間的差異??；一般來說，治療指數(shù)TI被定義為中值致死劑量(LD50)與中值有效劑量(ED50)的比率)；(ii)在胃腸道中狹窄的吸收窗口；或(iii)非常短的生物學(xué)半衰期，使得在一天之內(nèi)必需頻繁用藥才能將血漿水平維持在治療水平。可以按照多種策略中的任一種來獲得其中釋放速度超過所討論藥物代謝速度的受控釋放。受控釋放可以通過適合地選擇各種不同的制劑參數(shù)和成分，包括例如各種不同類型的受控釋放組合物和包衣，來獲得。因此，將藥物用適合的賦形劑配制成給藥后以受控方式釋放出藥物的藥物組合物(單個(gè)或多個(gè)單位片劑或膠囊組合物、油溶液、懸液、乳液、微膠囊、微球、納米粒子、貼片和脂質(zhì)體)?？诜褂玫墓腆w劑型用于口服的制劑包括含有活性成分與無毒性可藥用賦形劑的混合物的片劑。這些賦形劑可以是例如惰性稀釋劑或填充劑(例如蔗糖、微晶體纖維素、淀粉包括土豆淀粉、碳酸鈣、氯化鈉、磷酸鈣、硫酸鈣或磷酸鈉)；成粒和崩解劑(例如纖維素衍生物包括微晶體纖維素、淀粉包括土豆淀粉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、藻酸鹽或藻酸)；黏合劑(例如阿拉伯樹膠、藻酸、藻酸鈉、明膠、淀粉、預(yù)明膠化淀粉、微晶體纖維素、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及潤滑劑、助流劑和抗黏附劑(例如硬脂酸、二氧化硅或滑石粉)。其他的可藥用賦形劑可以是著色劑、調(diào)味劑、增塑劑、保濕劑、緩沖劑等。片劑可以是無包衣的，或者它們可以通過已知技術(shù)任選地包衣，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，由此在較長時(shí)間內(nèi)提供持續(xù)的作用。包衣可以適合于以預(yù)定樣式釋放活性藥物物質(zhì)(例如以便獲得受控釋放制劑)，或者它可以適合于在通過胃之前不釋放活性藥物物質(zhì)(腸溶包衣)。包衣可以是糖包衣、薄膜包衣(例如基于羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素、甲基羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羧甲基纖維素、丙烯酸共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯吡咯烷酮)或腸溶包衣(例如基于甲基丙烯酸共聚物、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、琥珀酸乙酸羥丙基甲基纖維素、聚乙酸乙烯鄰苯二甲酸酯、蟲膠和/或乙基纖維素)?？梢允褂脮r(shí)間延遲材料例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。固體片劑組合物可以包含適合于保護(hù)組合物免于不想要的化學(xué)變化(例如活性藥物物質(zhì)釋放前的化學(xué)降解)的包衣。包衣可以按照與《制藥技術(shù)百科全書》(EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology)中描述的相似的方式施加到固體劑型上。藥物可以在片劑中混合在一起，或可以分隔開。例如，第一種藥物包含在片劑內(nèi)部，第二種藥物在外部，使得相當(dāng)部分的第二種藥物在第一種藥物釋放之前釋放。用于口服使用的制劑也可以表現(xiàn)為咀嚼片或作為硬質(zhì)明膠膠囊，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如土豆淀粉、微晶體纖維素、碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土)混合，或作為軟質(zhì)明膠膠囊，其中活性成分與水或油介質(zhì)例如液體石蠟或橄欖油混合。粉末和顆粒可以使用上面在片劑和膠囊下提到的成分，以常規(guī)方式制備?？诜褂玫氖芸蒯尫沤M合物，可以構(gòu)建成例如通過控制活性藥物物質(zhì)的溶解和/或擴(kuò)散來釋放活性藥物。溶解或擴(kuò)散受控釋放，可以通過藥物的片劑、膠囊、球?；蝾w粒制劑進(jìn)行適當(dāng)包衣，或通過將藥物摻入適合的基質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。受控釋放包衣可以包含一種或多種上面提到的包衣物質(zhì)，和/或例如蟲膠、蜂蠟、glycowax、蓖麻蠟、巴西棕櫚蠟、硬脂醇、單硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕櫚酰硬脂酸甘油酯、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纖維素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羥基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝膠、1,3-丁二醇、甲基丙烯酸乙二醇酯、和/或聚乙二醇。在受控釋放基質(zhì)劑型中，基質(zhì)材料也可以包含例如水合甲基纖維素、巴西棕櫚蠟和硬脂醇、丙烯酸聚合物934、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或鹵代氟烴。含有要求保護(hù)的組合的一種或多種藥物的受控釋放組合物，也可以采取漂浮片劑或膠囊的形式(即片劑或膠囊在口服后，在胃內(nèi)含物的頂部漂浮一定時(shí)間段)。藥物的漂浮片劑制劑，可以通過將藥物與賦形劑和20-75％w/w的水凝膠例如羥乙基纖維素、羥丙基纖維素或羥丙基甲基纖維素的混合物成粒來制備。然后可以將獲得的顆粒壓縮成片劑。當(dāng)與胃液接觸時(shí)，片劑在其表面周圍形成了基本上不透水的凝膠阻擋層。這種凝膠阻擋層參與了將密度維持在1以下，從而使片劑保持漂浮在胃液中?？诜o藥的液體適合于通過添加水來制備水性懸液的粉末、可分散粉末或顆粒，是用于口服給藥的方便的劑型。作為懸液的制劑提供了活性成分與分散或潤濕劑、懸浮劑以及一種或多種防腐劑的混合物。適合的懸浮劑是例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、藻酸鈉等。腸胃外組合物藥物組合物也可以通過以劑型、制劑形式注射、輸注或植入(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下等)，或通過適合的遞送裝置或含有常規(guī)的無毒可藥用載體和佐劑的植入物，進(jìn)行腸胃外給藥。這些組合物的制劑和制備對(duì)于藥物制劑領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是公知的。用于腸胃外使用的組合物可以單位劑型提供(例如在單劑安瓿中)，或提供在含有幾份藥劑的小瓶中，其中可以添加適合的防腐劑(參見下文)。組合物可以采取溶液、懸液、乳液、輸注裝置或用于植入的遞送裝置的形式，或者它可以干粉提供，可以在使用前用水或另一種適合的介質(zhì)重構(gòu)。除了活性藥物之外，組合物可以包含適合的腸胃外可接受的載體和/或賦形劑?；钚运幬锟梢該饺氲轿⑶颉⑽⒛z囊、納米粒子、脂質(zhì)體等中用于受控釋放。組合物可以包含懸浮劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、pH調(diào)節(jié)劑和/或分散劑。本發(fā)明的藥物組合物可以采用適合于無菌注射的形式。為了制備這樣的組合物，將適合的活性藥物溶解或懸浮在腸胃外可接受的液體介質(zhì)中?？梢允褂玫目山邮芙橘|(zhì)和溶劑包括水、通過加入適量的鹽酸、氫氧化鈉或適合的緩沖劑調(diào)整到適合的pH的水、1,3-丁二醇、Ringer's溶液和等滲氯化鈉溶液。水性制劑也可以包含一種或多種防腐劑(例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在其中一種藥物只能少量或略微溶解在水中的情況下，可以添加溶解增強(qiáng)劑或增溶劑，或溶劑可以包含10-60％w/w的丙二醇等。受控釋放的腸胃外組合物可以采取水性懸液、微球、微膠囊、磁性微球、油溶液、油懸液或乳液的形式。可選地，活性藥物可以摻入到可生物相容的載體、脂質(zhì)體、納米粒子、植入物或輸注裝置中。用于制備微球和/或微膠囊的材料是例如可生物降解/可生物侵蝕的聚合物，例如丙交酯乙交酯共聚物、聚(氰基丙烯酸異丁基酯)、聚(2-羥基乙基-L-谷氨酰胺)。在配制受控釋放腸胃外制劑時(shí)可以使用的可生物相容載體是糖類(例如葡聚糖)、蛋白(例如白蛋白)、脂蛋白或抗體。在植入物中使用的材料可以是不可生物降解的(例如聚二甲亞砜)或可生物降解的(例如(聚己內(nèi)酯)、聚(羥基乙酸)或聚(原酸酯))。直腸組合物對(duì)于直腸使用來說，適合用于組合物的劑型包括栓劑(乳劑或懸劑類型)以及直腸明膠膠囊(溶液或懸液)。在典型的栓劑制劑中，活性藥物與適合的可藥用栓劑基質(zhì)例如可可脂、酯化脂肪酸、甘油化明膠以及各種不同的水溶性或可分散的基質(zhì)例如聚乙二醇混合?？梢該饺敫鞣N不同的添加劑、增強(qiáng)劑或表面活性劑。經(jīng)皮和表面組合物藥物組合物也可以在皮膚上表面給藥，用于在含有常規(guī)的無毒可藥用載體和賦形劑的劑型或制劑、包括微球和脂質(zhì)體中經(jīng)皮吸收。制劑包括霜?jiǎng)?、軟膏、洗劑、搽劑、凝膠、水凝膠、溶液、懸液、黏貼劑、噴霧劑、糊劑、膏藥，以及其他種類的透皮藥物遞送系統(tǒng)?？伤幱幂d體或賦形劑可以包含乳化劑、抗氧化劑、緩沖劑、防腐劑、保濕劑、穿透增強(qiáng)劑、螯合劑、成膠劑、軟膏基質(zhì)、香料和皮膚保護(hù)劑。乳化劑可以是天然存在的樹膠(例如阿拉伯樹膠或黃耆樹膠)。防腐劑、保濕劑、穿透增強(qiáng)劑可以是對(duì)羥苯甲酸酯例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯，以及苯扎氯銨、甘油、丙二醇、尿素等。上面描述的用于在皮膚上表面給藥的藥物組合物也可用于在待治療身體部分上或附近表面給藥。組合物可以適用于直接施加，或通過特殊的藥物遞送裝置例如敷料或可選的膏藥、墊片、海綿、條帶或其他形式的適合的柔性材料施加。治療劑量和持續(xù)時(shí)間應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，組合中的藥物可以在相同或不同藥物制劑中同時(shí)或相繼給藥。如果相繼給藥，在第二種(或附加的)活性成分給藥時(shí)的延遲不應(yīng)該使活性成分組合的有效效應(yīng)的益處喪失。對(duì)于本說明書的組合來說，最低要求是組合應(yīng)該預(yù)期將活性成分組合的有效效應(yīng)的益處進(jìn)行組合應(yīng)用。組合的目標(biāo)應(yīng)用可以由設(shè)備、供應(yīng)品、適應(yīng)癥和/或有助于使用本發(fā)明的組合的其他手段推斷出來。治療有效量的作為本發(fā)明的主題的藥物可以一起使用來制備藥劑，所述藥劑可用于降低PMP22基因表達(dá)增加的效應(yīng)，恢復(fù)正常的髓鞘形成和神經(jīng)完整性，阻止或降低發(fā)生CMT疾病的風(fēng)險(xiǎn)，一旦CMT疾病變得臨床明顯后阻止或減緩其發(fā)展，以及阻止或降低神經(jīng)病性事件的初次或后續(xù)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。盡管本發(fā)明的活性藥物可以分次劑量給藥，例如每天2或3次，但組合中的每種藥物每天單次給藥是優(yōu)選的，其中所有藥物在單一藥物組合物(單位劑型)中每天單次給藥是最優(yōu)選的。給藥可以每天一次到幾次，持續(xù)幾天到幾年，甚至可以持續(xù)患者終生。在大多數(shù)情況下，將要求長期或至少周期性重復(fù)地長期給藥?！裥g(shù)語“單位劑型”是指適合作為單一劑量用于人類對(duì)象的物理上分離的單位(例如膠囊、片劑或裝好的注射器針筒)，每個(gè)單位含有經(jīng)計(jì)算可以產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性材料以及所需的藥物載體。優(yōu)選用于單位劑量的組合中每種藥物的量將依賴于幾種因素，包括給藥途徑、患者的體重和年齡、由CMT疾病引起的神經(jīng)病性損傷的嚴(yán)重性，或鑒于待治療的人的總體健康狀況的潛在副作用的風(fēng)險(xiǎn)。此外，關(guān)于具體患者的藥物基因組學(xué)(基因型對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)的影響或治療藥物的效用情況)信息，可以影響使用的劑量。除了在應(yīng)對(duì)特別傷害性CMT疾病的情況下可能需要較高劑量，或在治療兒童時(shí)應(yīng)該選擇較低劑量之外，組合中的每種藥物的優(yōu)選劑量，一般將在不超出通常為長期維持性治療所處方的劑量范圍或在大型3期臨床研究中被證明是安全的劑量范圍之內(nèi)。例如，●對(duì)于雷帕霉素來說，每天約1至約100μg/kg，典型為1至50μg/kg，例如5至30μg/kg/天之間。·對(duì)于米非司酮來說，每天約1至約300μg/kg，典型為10至200μg/kg，例如10至80μg/kg/天之間?！駥?duì)于納曲酮來說，每天約1至約100μg/kg，典型為1至50μg/kg，例如1至20μg/kg/天之間。●對(duì)于毛果蕓香堿來說，每天約1至約100μg/kg，典型為1至50μg/kg，例如1至20μg/kg/天之間?！駥?duì)于巴氯芬來說，每天約1至約300μg/kg，典型為10至200μg/kg，例如20至100μg/kg/天之間。●對(duì)于甲巰咪唑來說，每天約1至約100μg/kg，典型為1至50μg/kg，例如1至20μg/kg/天?！駥?duì)于山梨糖醇來說，每天約17μg/kg至約17mg/kg，典型為每天167μg/kg至7mg/kg，例如333μg/kg/天至3.5mg/kg/天。典型地，給藥的劑量對(duì)應(yīng)于向60kg的人類所施加的劑量。最優(yōu)選的劑量應(yīng)該相當(dāng)于通常為長期維持性治療所處方的量的1％直至10％。應(yīng)該理解，實(shí)際給藥的藥物量將由醫(yī)生根據(jù)相關(guān)的情況來確定，所述情況包括待治療的病癥、待給藥的具體組合物、個(gè)體患者的年齡、體重和響應(yīng)、患者癥狀的嚴(yán)重性、以及所選的給藥途徑。因此，上述的劑量范圍旨在為本文的講述提供一般性的指導(dǎo)和支持，而不打算限制本發(fā)明的范圍。給出了下面的實(shí)施例，其目的在于說明而不是限制。實(shí)施例A.藥物組合的制備制備了下列藥物組合：B.體外實(shí)驗(yàn)1.用混合物1-6處理的施旺細(xì)胞上的PMP22表達(dá)測定法1.1細(xì)胞培養(yǎng)1.1.1:可商購大鼠原代施旺細(xì)胞將大鼠施旺細(xì)胞(SC)原代培養(yǎng)物(Sciencell#R1700)的小瓶解凍，以10000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種在聚L-賴氨酸預(yù)包被的75cm2培養(yǎng)瓶中的“Sciencell施旺細(xì)胞培養(yǎng)基”中(來自Sciencell的基本培養(yǎng)基#R1701)。培養(yǎng)基由基本培養(yǎng)基、5％胎牛血清(3H-BiomedicalAB#1701-0025)、1％施旺細(xì)胞生長增補(bǔ)劑(3HBiomedicalAB#1701-1752)、1％慶大霉素(Sigma#G1397)和10μM毛喉素(Sigma#F6886)構(gòu)成，以促進(jìn)它們的增殖。在達(dá)到合生后(4到10天，取決于細(xì)胞批次)，通過輕柔攪拌或通過thy1.1免疫淘洗，使SC與黏附性成纖維細(xì)胞分離來純化施旺細(xì)胞，以產(chǎn)生至少95％純的培養(yǎng)物。然后對(duì)SC進(jìn)行計(jì)數(shù)(錐蟲藍(lán)方法)，并接種到聚L-賴氨酸預(yù)先包被的75cm2培養(yǎng)瓶中的同樣的SC培養(yǎng)基中。在合生時(shí)，將細(xì)胞洗滌，用胰蛋白酶處理(來自Invitrogen#1540054的胰蛋白酶-EDTA的1x稀釋液，在不含鈣和鎂的PBS中稀釋)，計(jì)數(shù)，鋪板于12孔板(140000個(gè)細(xì)胞/孔)中的Sciencell施旺細(xì)胞培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基還含有5％FBS、1％細(xì)胞生長增補(bǔ)劑(CGS)、40μg/ml慶大霉素和4μM毛喉素。1.1.2定制的大鼠原代施旺細(xì)胞從Sprague-Dawley新生大鼠(P0到P2之間)坐骨神經(jīng)建立原代施旺細(xì)胞培養(yǎng)物(SC)。將所有新生大鼠處死并在皮氏培養(yǎng)血中分離。解剖在無菌條件下進(jìn)行。從后爪和下部軀干除去背部皮膚。分離出坐骨神經(jīng)并轉(zhuǎn)移到含有冰冷的Leibovitz(L15,Invitrogen#11415)的培養(yǎng)皿中，Leibovitz中添加有1％青霉素/鏈霉素溶液(分別為50UI/ml和50μg/ml；Invitrogen#15070)和1％牛血清白蛋白(BSA，SigmaA6003)。將每只大鼠的兩根神經(jīng)都轉(zhuǎn)移到含有冰冷的L15的15ml試管中。然后除去L15培養(yǎng)基，用含有10mg/ml膠原酶(Sigma#A6003)的2.4mlDMEM(Invitrogen#21969035)代替。將神經(jīng)在該培養(yǎng)基中在37℃下溫育30分鐘。然后除去培養(yǎng)基，通過用不含鈣和鎂的PBS(Invitrogen#2007-03)稀釋的胰蛋白酶(10％胰蛋白酶-EDTA10x，Invitrogen#15400054)在37℃處理20分鐘，將兩根神經(jīng)解離。通過加入含有II級(jí)DNaseI(0.1mg/ml，Rochediagnostic#104159)和胎牛血清(FCS10％，Invitrogen#10270)的DMEM來終止反應(yīng)。將細(xì)胞懸液用10ml移液管研散，通過過濾器收集在50ml管中(Swinnex13mm過濾裝置，Millipore，使用20μm尼龍篩網(wǎng)濾膜，F(xiàn)isher)。將細(xì)胞懸液在室溫(RT)以350g離心10分鐘，并將沉淀懸浮在含有10％FCS和1％青霉素/鏈霉素的DMEM中。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(錐蟲藍(lán)方法)，并以5105到106個(gè)細(xì)胞/板的密度接種到Falcon100mmPrimaria組織培養(yǎng)板中。在培養(yǎng)1天后，將培養(yǎng)基用DMEM、10％FCS、1％青霉素/鏈霉素和10μM胞嘧啶b-D-呋喃阿拉伯糖苷(Sigma#C1768)更換。48小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，將細(xì)胞用DMEM洗滌3次。然后加入SC生長培養(yǎng)基，其由DMEM、10％FCS、1％青霉素/鏈霉素、2μM毛喉素(Sigma#F6886)、10μg/ml牛垂體提取物(PEX，Invitrogen#13028)構(gòu)成。每2-3天更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)8天后(4至10天，取決于細(xì)胞批次)，施旺細(xì)胞達(dá)到合生，將含有大量污染的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物通過thy1.1免疫淘洗方法進(jìn)行純化。純化后，將細(xì)胞以10000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度懸浮在聚L-賴氨酸預(yù)先包被的75cm2培養(yǎng)瓶中的生長培養(yǎng)基中。一旦它們達(dá)到合生，將細(xì)胞清洗，用胰蛋白酶處理(胰蛋白酶-EDTA)，計(jì)數(shù)，并鋪板于12孔板中(100000個(gè)細(xì)胞/孔)。1.1.3藥物溫育在將細(xì)胞鋪板于12孔板后，將培養(yǎng)基更換為確定成分培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有DMEM-F12混合物(Invitrogen#21331020)，并補(bǔ)充有1％N2補(bǔ)充劑(Invitrogen#17502)、1％L-谷氨酰胺(Invitrogen#25030024)、2.5％FBS(Sciencell#0025)、0.02μg/ml皮質(zhì)甾酮(Sigma#C2505)、4μM毛喉素和50μg/ml慶大霉素。沒有向該培養(yǎng)基中添加生長因子，以促進(jìn)SC分化。24小時(shí)后，將該培養(yǎng)基替換為確定成分培養(yǎng)基(DMEM-F12)，其補(bǔ)充有1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒–X(ITS，Invitrogen#51300)、16μg/ml丁二胺(Sigma#P5780)、0.02μg/ml皮質(zhì)甾酮和50μg/ml慶大霉素。在該步驟中，培養(yǎng)基中既不存在孕酮也不存在毛喉素。1天后，將施旺細(xì)胞用藥物組合刺激24小時(shí)(3個(gè)孔/條件)。每種化合物在將其添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中之前新鮮制備。將藥物添加到由DMEM-F12構(gòu)成的確定成分培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中補(bǔ)充有1％胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒–X(ITS，Invitrogen#51300)、16μg/ml丁二胺、0.02μg/ml皮質(zhì)甾酮、10nM孕酮和50μg/ml慶大霉素。在藥物刺激過程中不存在毛喉素，避免了腺甘酸環(huán)化酶飽和。1.2.通過Thy1.1免疫淘洗純化施旺細(xì)胞為了防止成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的污染，使用克隆Thy1.1(ATCCTIB-103TM)免疫淘洗方案對(duì)施旺細(xì)胞進(jìn)行了純化。抗體預(yù)包被的100mm細(xì)菌皮氏培養(yǎng)皿如下進(jìn)行制備：將這些平皿用PBS洗3次，用含有10μg/ml山羊抗小鼠IgMMU抗體(JacksonImmunoResearch#115-005-020)的20mlpH9.5的50mMTrisHCl溶液在4℃處理過夜；然后用PBS洗3次，用含有0.02％BSA和從T11D7e2雜交瘤培養(yǎng)物(ATCC#TIB-103)獲得的含有Thy1.1IgM抗體的上清液的PBS溶液，在室溫處理2小時(shí)。最后，將板用PBS洗3次，然后加入細(xì)胞懸液。SC用胰蛋白酶EDTA松開。一旦大部分細(xì)胞進(jìn)入懸液，立即用DMEM-10％FBS中和胰蛋白酶，并將細(xì)胞離心。將松解的細(xì)胞的沉淀以每ml0.66x106個(gè)細(xì)胞(最大值)的密度重新懸浮在15ml含有0.02％BSA的培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)移到皮氏培養(yǎng)皿中(大約660萬個(gè)細(xì)胞/10ml/100mm培養(yǎng)皿)。將細(xì)胞懸液在Thy1.1包被的皮氏培養(yǎng)皿中在37℃下溫育45分鐘，每15分鐘輕輕攪拌以防止非特異性結(jié)合。大部分表達(dá)Thy1.1的成纖維細(xì)胞黏附于培養(yǎng)皿上。在溫育結(jié)束時(shí)，回收細(xì)胞懸液并離心。該細(xì)胞懸液理論上只含有施旺細(xì)胞。將細(xì)胞離心，將細(xì)胞沉淀以16000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度懸浮在聚L-賴氨酸處理過的T75cm2培養(yǎng)瓶中含有10μM毛喉素的生長培養(yǎng)基中。1.3定量反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(Q-RT-PCR)定量RT-PCR被用于比較藥物刺激后PMP22mRNA相對(duì)于大鼠施旺細(xì)胞原代培養(yǎng)物中的管家核糖體L13AmRNA的水平。在用冷的無菌PBS清洗后，從SC中使用QiagenRNeasy微型試劑盒(Qiagen#74004)提取和純化的每個(gè)細(xì)胞樣品的總RNA。使用1μlRNA樣品，通過Nanodrop分光光度計(jì)對(duì)核酸進(jìn)行定量。RNA完整性通過BioAnalyzer(Agilent)裝置確定。按照標(biāo)準(zhǔn)方案將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用于PCR擴(kuò)增的cDNA模板從200ng總RNA合成，使用了SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen#18064-014)，在存在寡聚(dT)的情況下在42℃反應(yīng)60分鐘，終體積為20μl。使用《480》系統(tǒng)(RocheMolecularSystemsInc.)對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在用于PCR擴(kuò)增之前，將每個(gè)cDNA樣品稀釋5倍。將2.5μl該cDNA加入到PCR反應(yīng)溶液中(終體積10μl)。進(jìn)行了初步實(shí)驗(yàn)以確保在兩種序列的擴(kuò)增過程的指數(shù)期中進(jìn)行定量，并且參比基因的表達(dá)在不同培養(yǎng)條件下是一致的。PCR反應(yīng)通過大鼠PMP22(NM_017037)的500nM正向引物5-GGAAACGCGAATGAGGC-3(SEQIDNO:1)和500nM反向引物5-GTTCTGTTTGGTTTGGCTT-3(SEQIDNO:2)的擴(kuò)增來進(jìn)行(擴(kuò)增了148-bp)。通過使用500nM正向引物5-CTGCCCTCAAGGTTGTG-3(SEQIDNO:3)和500nM反向引物5-CTTCTTCTTCCGGTAATGGAT-3(SEQIDNO:4)，在分開的反應(yīng)中平行地?cái)U(kuò)增了RPL13A核糖體(NM_173340)RNA的152-bp的片段，用于對(duì)結(jié)果進(jìn)行歸一化。我們使用了FRET化學(xué)來進(jìn)行RT-Q-PCR分析。FRET探針由0.3μMPmp22-FL-5-GCTCTGAGCGTGCATAGGGTAC(SEQIDNO:5)或Rpl13A-FL-5-TCGGGTGGAAGTACCAGCC(SEQIDNO:6)構(gòu)成，在它們的3’末端用供體熒光團(tuán)染料(熒光素)標(biāo)記。0.15μMRed640探針定義如下：Pmp22-red-5'-AGGGAGGGAGGAAGGAAACCAGAAA(SEQIDNO:7)或Rpl13A-red-5'-TGACAGCTACTCTGGAGGAGAAACGGAA(SEQIDNO:8)，在它們的5’末端用受體熒光團(tuán)染料(羅丹明Red640)標(biāo)記。每個(gè)PCR反應(yīng)在總體積為10μl的主混合物試劑盒(Roche#04-887301001)中包含2.5μlcDNA模板。使用了下述PCR條件：95℃10秒，63℃10秒，72℃12秒和40℃30秒(40個(gè)擴(kuò)增循環(huán))。PMP22基因表達(dá)的相對(duì)水平通過測定從靶基因PMP22與內(nèi)源內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品RPL13A產(chǎn)生的產(chǎn)物之間的比率來計(jì)算。1.4通過流式細(xì)胞術(shù)(FACS)進(jìn)行PMP22蛋白表達(dá)分析在與藥物溫育8小時(shí)、24小時(shí)和48小時(shí)后，回收上清液，離心并冷凍。使用胰蛋白酶-EDTA分拆SC。一旦大部分細(xì)胞進(jìn)入懸液，立即用含有10％FCS的DMEM中和胰蛋白酶?；厥蘸屑?xì)胞的上清液并離心。將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移到微量管中，在PBS中清洗一次，使用特定溶液(AbCys#ReagentABUF09B)固定。10分鐘后，將細(xì)胞用PBS洗滌一次，并保持在4℃。細(xì)胞固定后5天，使用下面的方案，對(duì)所有溫育時(shí)間不同的細(xì)胞制備物進(jìn)行標(biāo)記。將細(xì)胞以7000rpm離心5分鐘，將沉淀懸浮在通透化溶液(AbCys#ReagentBBUF09B)中，用PMP22第一抗體(Abcam#ab61220,1/50)在室溫標(biāo)記1小時(shí)。然后將細(xì)胞以7000rpm離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀在PBS中洗滌一次。加入與AlexaFluor488偶聯(lián)的第二抗體(山羊抗兔IgG，MolecularProbes#A11008,1/100)，室溫反應(yīng)1小時(shí)。然后將細(xì)胞以7000rpm離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀在PBS中洗滌一次。加入與AlexaFluor488偶聯(lián)的第三抗體(雞抗山羊IgG，MolecularProbes#A21467,1/100)，在室溫溫育1小時(shí)，以增加標(biāo)記。然后將細(xì)胞在PBS中洗滌一次。執(zhí)行了不含任何抗體的對(duì)照(未標(biāo)記細(xì)胞)，以確定自身熒光的水平并調(diào)整光倍增器的靈敏度。執(zhí)行了使用第二和第三抗體但是不使用第一抗體的對(duì)照，以評(píng)估抗體的非特異性結(jié)合。數(shù)據(jù)獲取和分析使用FACS陣列細(xì)胞計(jì)數(shù)器和FACS陣列軟件(BectonDickinson)在5000個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行。分析了與細(xì)胞體積(尺寸)相關(guān)的正向散射(FSC)和依賴于細(xì)胞內(nèi)部復(fù)雜性(粒度)的側(cè)向散射。對(duì)于PMP22的表達(dá)來說，在總細(xì)胞中進(jìn)行分析，并計(jì)算陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。陽性細(xì)胞是熒光強(qiáng)度高于使用第二抗體的對(duì)照的細(xì)胞。為了對(duì)SC數(shù)量進(jìn)行定量，使用抗S100蛋白抗體分析了對(duì)照培養(yǎng)基中的細(xì)胞。細(xì)胞按照下列方案制備：將施旺細(xì)胞用抗S100蛋白抗體(Dako#S0311,1/100)在室溫染色1小時(shí)。該抗體按照上面描述的用于PMP22免疫染色的方案進(jìn)行標(biāo)記，但是不與第三抗體溫育。1.5.藥物溫育和活性將藥物在與上面描述的相同的確定成分培養(yǎng)基中溫育24小時(shí)或48小時(shí)(3個(gè)孔/條件)，所述培養(yǎng)基中不存在毛喉素以避免腺苷酸環(huán)化酶刺激的飽和，但是存在10nM孕酮。在與藥物溫育后，回收上清液，將施旺細(xì)胞冷凍用于RT-Q-PCR分析。這些實(shí)驗(yàn)概述在表1中。表1組合PMP22表達(dá)混合物1下調(diào)混合物2下調(diào)混合物3下調(diào)混合物4下調(diào)混合物5下調(diào)混合物6下調(diào)2.在CMT的共培養(yǎng)模型中評(píng)估混合物7中的化合物的協(xié)同效應(yīng)使用共培養(yǎng)模型作為CMT1A的體外模型。這種髓鞘形成模型由共培養(yǎng)的感覺神經(jīng)元和來自雄性PMP22轉(zhuǎn)基因大鼠(TG)分離的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的施旺細(xì)胞構(gòu)成。本研究的目的是評(píng)估3種測試化合物(+/-巴氯芬、納曲酮和山梨糖醇)和混合物7(這三種藥物的混合物)對(duì)髓鞘形成過程的影響。3種測試化合物及其混合物對(duì)髓鞘形成的影響，通過評(píng)估在抗環(huán)血酸存在下髓磷脂堿性蛋白(MBP)的表達(dá)來評(píng)價(jià)。2.1材料和方法通過頸椎錯(cuò)位法殺死妊娠15天的懷孕雌性大鼠。從子宮中取出胚胎，它們處于相同的胚胎發(fā)育階段。2.1.1基因分型將每個(gè)胚胎頭取一塊(3mm3)置于無DNase的2ml試管中。使用SYBRGreen提取物-N-Amp組織PCR試劑盒(Sigma，參考號(hào)XNATG-1KT)提取DNA。將120μl提取溶液(Sigma試劑盒，參考號(hào)XNATG-1KT)置于每塊胚胎頭上。將頭在室溫溫育10分鐘。在該溫育結(jié)束時(shí)，將頭在提取溶液中在95℃下溫育5分鐘。在這最后一次溫育后，立即加入100μl中和溶液，使用無菌超純水(Biosolve，參考號(hào)：91589)將每種DNA提取物以1/40稀釋，并儲(chǔ)存在+4℃直到使用。在DRG分離期間，使用試劑盒FastSYBRGreen主混合物(AppliedBiosystem,4385612)進(jìn)行雌性(F)和雄性(M)胚胎的基因分型。每個(gè)胚胎的性別使用雄性SRY基因來確定。SRY引物由Pharnext提供(SRY-F(SEQIDNO:9)：5'-GAGAGAGGCACAAGTTGGC-3'；SRY-R(SEQIDNO:10)：5'-GCCTCCTGGAAAAAGGGCC-3')。將SRY引物在無菌超純水(Biosolve，參考號(hào)：91589)中稀釋至3μM。用于PCR的混合物使用超純水(每個(gè)樣品4μl)、3μM引物(每個(gè)樣品2μl)和主混合物(每個(gè)樣品10μl)來制備。在96孔PCR板中，在每個(gè)孔中放置16μlPCR混合物。按照計(jì)劃設(shè)置加入4μl每種稀釋的DNA。使用7500快速RT-PCR系統(tǒng)(AppliedBiosystem)運(yùn)行PCR，使用了下列程序：開始：95℃–20秒45個(gè)循環(huán)：95℃–10秒，65℃–10秒，72℃–30秒(數(shù)據(jù)獲取)。熔解曲線：95℃–15秒，64℃–1分鐘，90℃–30秒(連續(xù)數(shù)據(jù)獲取)，60℃15秒。擴(kuò)增圖和熔解曲線使用7500軟件(AppliedBiosystems)進(jìn)行分析。將每個(gè)樣品的結(jié)果與陰性對(duì)照(超純水)和陽性對(duì)照(TG/雄性和WT/雌性)進(jìn)行比較，以對(duì)每個(gè)胚胎的基因型作出結(jié)論。2.1.2感覺神經(jīng)元和施旺細(xì)胞共培養(yǎng)物大鼠背根神經(jīng)節(jié)按照以前Cosgaya等，2002和Rangaraju等，2008的描述進(jìn)行培養(yǎng)。將每個(gè)胚胎在計(jì)數(shù)皮氏培養(yǎng)皿(直徑35mm)上處置。切下胚胎的頭，置于無DNAase的1.5ml試管中；使用提取物-N-Amp組織試劑盒(SigmaAldrich)提取AND。使用試劑盒FastSYBRGreen主混合物(AppliedBiosystem,4385612)進(jìn)行基因分型(雄性(M)和雌性(F)，野生型和PMP22轉(zhuǎn)基因的)。這種基因分型與背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的分離并行地進(jìn)行，以便在分離結(jié)束時(shí)，只進(jìn)行一種類型的培養(yǎng)(來自轉(zhuǎn)基因雄性的DRG)。收集每個(gè)胚胎的DRG，置于冰冷的Leibovitz培養(yǎng)基(L15，Invitrogen)中。在分離結(jié)束時(shí)，將TGM的DRG合并，并通過在37℃下用胰蛋白酶(胰蛋白酶EDTA，0.05％；Invitrogen)處理20分鐘將其松解。通過在DNAaseI(Roche)存在下加入含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM來終止反應(yīng)。將懸液用10ml移液管研散。然后將細(xì)胞在室溫下以350xg離心10分鐘。將松解后的細(xì)胞沉淀重懸浮在含有2％B27(Invitrogen)、1％青霉素-鏈霉素(Invitrogen)、1％的L-谷氨酰胺和50ng/mlNGF(Sigma)的神經(jīng)基本培養(yǎng)基(Invitrogen)中。這種培養(yǎng)基是神經(jīng)元培養(yǎng)基。使用錐蟲藍(lán)排斥試驗(yàn)(Sigma)在Neubauer細(xì)胞計(jì)數(shù)器中對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將其以每個(gè)孔10000個(gè)細(xì)胞的量接種在用聚L-賴氨酸處理的96孔板(Greiner)中。將板在加濕培養(yǎng)箱中、在空氣(95％)-CO2(5％)的氣氛中維持在37℃下。每隔一天更換一半的標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)元培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)基本培養(yǎng)基中維持7天，以允許施旺細(xì)胞移居到感覺神經(jīng)元軸突中。在第7天，向培養(yǎng)基供應(yīng)增補(bǔ)或未增補(bǔ)50μg/ml抗環(huán)血酸的標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)元培養(yǎng)基，以便起始基膜形成和髓鞘形成。2.1.3.藥物溫育在第7天，將下列測試化合物(單獨(dú)或組合地)添加到含有50μg/ml抗環(huán)血酸的培養(yǎng)基中：■(RS)-巴氯芬■納曲酮■D-山梨糖醇■混合物7＝該3種個(gè)體化合物的組合以下列濃度對(duì)化合物或化合物組合進(jìn)行測試(表2)：表2：用于TGDRG/SC共培養(yǎng)物中MBP表達(dá)的體外研究的個(gè)體藥物或組合的濃度將測試化合物溫育5種不同時(shí)間：5、9、10、11和13天。進(jìn)行了DRG(來自于TG雄性大鼠胚胎)的三份分開和獨(dú)立的培養(yǎng)。在抗環(huán)血酸存在下評(píng)估這些條件，每種條件6個(gè)孔。所有測試化合物的隨需隨用溶液從儲(chǔ)用溶液臨時(shí)制備，儲(chǔ)存在-20℃。該溶液一周制備一次。每隔一天更換一半的增補(bǔ)有測試化合物和抗環(huán)血酸(各以1X濃度)的標(biāo)準(zhǔn)神經(jīng)元培養(yǎng)基。2.1.4染色方案在溫育5、9、10、11和13天后，將細(xì)胞用冷的乙醇(95％)和乙酸(5％)溶液固定10分鐘。使用含0.1％皂角苷和10％山羊血清的PBS將細(xì)胞通透化和阻斷15分鐘。然后將細(xì)胞與髓磷脂的特異性標(biāo)志物、即多克隆抗體抗髓磷脂堿性蛋白(MBP)抗體(Sigma118K0431)溫育。該抗體用AlexaFluor568山羊抗兔IgG抗體和AlexaFluor488山羊抗小鼠IgG抗體(Molecularprobe687621、623962)檢測。神經(jīng)元的核用熒光標(biāo)志物(Hoechst溶液，SIGMArefB1155)標(biāo)記。2.1.5.數(shù)據(jù)處理對(duì)于每個(gè)孔，使用InCellAnalyzerTM1000(GEHealthcare)以20x放大倍數(shù)獲取20張照片。所有圖像在相同條件下獲取。有髓軸突的總長度分析使用Developer軟件(GEHealthcare)自動(dòng)進(jìn)行。所有的值表示成平均值+/-平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差。統(tǒng)計(jì)分析在不同條件下進(jìn)行(當(dāng)允許時(shí)，在ANOVA后進(jìn)行Fisher’sPLSD檢驗(yàn))。2.2.結(jié)果混合物7的效能中藥物的協(xié)同效應(yīng)在MBP表達(dá)上觀察到了由混合物7組合構(gòu)成的藥物的重要協(xié)同效應(yīng)。事實(shí)上，在第10日(＝培養(yǎng)的第17日)，(RS)-巴氯芬、納曲酮和D-山梨糖醇的組合在圖1A和2A中顯示的劑量1和6下顯著增加了MBP表達(dá)。相反，單獨(dú)使用上述藥物與對(duì)照相比沒有明顯效果(圖1B-D和2B-D)。在混合物7的劑量2、3、4、5和7下溫育10天后，也記錄了到對(duì)MBP表達(dá)的顯著效應(yīng)(圖3A)。使用劑量2-7，在第11天仍觀察到采取明顯鐘形曲線形式的這種效應(yīng)(圖3B)。C.在CMT動(dòng)物模型中的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)我們測試了化合物在大鼠模型中的治療效果。使用兩種性別的幼齡大鼠分別形成實(shí)驗(yàn)組。大鼠根據(jù)體重按照隨機(jī)方案分派到組中。在某些實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)大鼠在桿試驗(yàn)中的表現(xiàn)進(jìn)行隨機(jī)化。兩種性別由獨(dú)立的對(duì)照組表示，它們?cè)跀?shù)量上與處理組相同或更大。大鼠用藥物長期處理——在3或6周期間，根據(jù)每種藥物的生物利用度，通過強(qiáng)制喂食或使用Alzet滲透皮下泵(DURECTCorporationCupertino,CA)注射來進(jìn)行。在所有進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，混合物7通過管飼法給藥。動(dòng)物每周稱重兩次，以便根據(jù)體重的增長調(diào)節(jié)劑量。如果選擇了滲透泵進(jìn)行處理給藥，根據(jù)動(dòng)物在泵送期間(6周)的年齡所預(yù)計(jì)的估計(jì)平均體重來計(jì)算藥物的劑量。如果需要，可以使用適合的麻醉方案重新植入泵。行為測試每3或4周，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為測試。每次測試由同樣的研究人員在同樣的房間中，在一天的同樣時(shí)間進(jìn)行；在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中維持這種一致性。所有的處理和基因型確定對(duì)于研究人員來說都是盲法的。在整個(gè)研究中主要使用“桿試驗(yàn)(Bartest)”和“抓握力量(Gripstrength)”來評(píng)估行為。隨著動(dòng)物的生長，桿試驗(yàn)的方案可以改變(以避免由于例如學(xué)習(xí)而引起的偏差)。抓握力量的測定允許檢測抓握行為中的細(xì)微差異，抓握行為看來由肌肉力量、敏感性狀態(tài)(例如疼痛的觸覺感可能改變測量到的力量值)、行為成分(“動(dòng)機(jī)”)構(gòu)成。前后肢之間的值是不同的，并極大地依賴于動(dòng)物的年齡。抓握力量測試測量了動(dòng)物單獨(dú)地用其前爪或后爪握在握桿上的力量。與握桿放置在一起的肌力計(jì)測量力量(ForceGaugeFG-5000A)。大鼠由實(shí)驗(yàn)人員抓住，使它用其前爪或用其后爪握住握桿，并將大鼠輕輕向后拉，直到它放開握桿。記錄當(dāng)動(dòng)物釋放握桿時(shí)測量到的力。對(duì)于每只動(dòng)物，進(jìn)行兩次連續(xù)的測量前爪力量的試驗(yàn)和兩次連續(xù)的測量后爪力量的試驗(yàn)；只記錄最大的分值(前爪一個(gè)，后爪一個(gè))(單位為N)。桿實(shí)驗(yàn)桿試驗(yàn)評(píng)估大鼠握住固定桿的能力。顯示出肌肉虛弱的Pmp22大鼠在該試驗(yàn)中表現(xiàn)出成績不佳(Sereda等，1996)。將大鼠放置，使其四爪在桿的中間(桿直徑：2.5cm；長度：50cm；高于桌面30cm)。試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行；在我們的實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)的數(shù)量和持續(xù)時(shí)間取決于動(dòng)物的批次。這種測試中的變化性的引入，是為了確定在實(shí)驗(yàn)過程中適合于最好地檢測CMT大鼠中運(yùn)動(dòng)缺陷的方案。記錄每一期的表現(xiàn)指數(shù)：-在桿上保持60秒(或?qū)τ诘谝慌牡谝黄诤偷诙趤碚f30秒)所需的試驗(yàn)的數(shù)量。-每次試驗(yàn)在桿上度過的時(shí)間(即跌落等待時(shí)間)以及每一期的平均值。在大鼠在桿上停留了截止時(shí)間、即30或60秒后該期結(jié)束的實(shí)驗(yàn)程序中，將還未完成的試驗(yàn)設(shè)定為以截止時(shí)間(30秒或60秒)進(jìn)行(例如，對(duì)于第8批來說，對(duì)于在試驗(yàn)1、2和3中在條上停留不到10秒，然后在試驗(yàn)4和5中停留了60秒的動(dòng)物來說，將試驗(yàn)6到10設(shè)定為60秒)。-跌落的次數(shù)?？傮w健康評(píng)估在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測動(dòng)物的體重、外顯體征(毛皮外觀、身體姿勢、步態(tài)、震顫等)。使用等級(jí)評(píng)定量表進(jìn)行記錄：0＝正常，1＝異常。步態(tài)將每只大鼠在沒有雜物的新的鼠籠(尺寸為55x33x18cm)中觀察5分鐘。大鼠的步態(tài)使用4個(gè)參數(shù)來評(píng)估：-0分：正常步態(tài)(流暢)-1分：異常步態(tài)(不流暢或大鼠微跛)-2分：中度失能(大鼠拖著一條腿，并且能夠調(diào)整好它并行走)-3分：嚴(yán)重失能(大鼠拖著它的一個(gè)或兩個(gè)后爪，但是不能調(diào)整好它/它們)。斜面試驗(yàn)滑動(dòng)裝置具有30x50cm有機(jī)玻璃平面，其能夠以0°(水平)至60°的角度傾斜。一開始，將每只大鼠以頭向上位置(頭朝上方向)置于25°角斜面上；執(zhí)行兩次相隔1分鐘的試驗(yàn)。30分鐘后，在35°角斜面上、然后在40°角斜面上完成同樣的實(shí)驗(yàn)。在此期間，將大鼠放回籠子。在每次試驗(yàn)后清潔斜面。大鼠的表現(xiàn)通過4個(gè)不同分值評(píng)估：-0分：無滑動(dòng)-1分：少許滑動(dòng)(一只或兩只爪)-2分：中度滑動(dòng)(4只爪)，但是不滑到斜面底端-3分：大鼠一直滑到斜面最底端。其他測試在適合時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行電化學(xué)評(píng)估、組織學(xué)測量，并對(duì)坐骨神經(jīng)中pmp22RNA表達(dá)水平進(jìn)行定量。通過定量RT-PCR對(duì)坐骨神經(jīng)中的pmp22RNA進(jìn)行定量按照制造商的流程方案(Qiagen-RNeasy纖維組織手冊(cè))所述，使用Qiazol(參考號(hào)79306,QiagenGmbh，德國)，然后使用RNeasy小量試劑盒(參考號(hào)74106,QiagenGmbh，德國)通過單步純化方法，從左側(cè)坐骨神經(jīng)分離總RNA。使用DNA-free試劑盒(Qiagen-Rnase-freeDNaseset1500Kunits，參考號(hào)1023460)，通過用無RNase的DNaseI消化除去DNA污染。通過NanoDropND-1000估算RNA濃度，并在Agilent2100Bioanalyzer上通過AgilentRNA6000納米芯片進(jìn)行質(zhì)量控制試驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)PCR：定量RT-PCR(RT-Q-PCR)如下進(jìn)行：在20-μl反應(yīng)體積中，使用SuperScriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)和Oligo(dT)12-18(Invitrogen,Carlsbad,CA)，對(duì)80ng總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)PCR使用快速熱循環(huán)儀系統(tǒng)(480II，384孔，Roche，瑞士)執(zhí)行。擴(kuò)增在10μl總體積中使用130nM至1μM之間優(yōu)化的引物濃度進(jìn)行。向引物和模板添加480SYBRGreenI主混合物(2×濃度，Roche，目錄參考號(hào)04887352001)。在混合物中包含核苷酸、MgCL2、TaqDNA聚合酶和緩沖液。擴(kuò)增方案包括最初在95℃溫育10分鐘以激活TaqDNA聚合酶，然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的95℃變性10s、60℃退火40s和72℃延伸10s(在72℃延伸期結(jié)束時(shí)通過單次采集方式執(zhí)行熒光產(chǎn)物的檢測)，最后進(jìn)行熔解曲線循環(huán)，即95℃變性5s、63℃退火60s和95℃(從63℃至95℃升溫速率為0.11℃/s，并連續(xù)檢測熒光產(chǎn)物)。為了證實(shí)擴(kuò)增特異性，對(duì)來自每個(gè)引物對(duì)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析。根據(jù)每個(gè)PCR產(chǎn)物的交叉點(diǎn)(Cp值)進(jìn)行相對(duì)定量。樣品的熒光升高至高于背景熒光的點(diǎn)被稱為樣品的交叉點(diǎn)(Cp)。使用褐鼠(Rattusnorvegicus)髓磷脂蛋白Zero(MPZ)基因進(jìn)行歸一化(Sereda等，2006)。用于RT-Q-PCR分析的引物序列(由德國的EurofinsMWGOperon合成)是：PMP22–正向：5’-TGTACCACATCCGCCTTGG-3’(SEQIDNO:11)和PMP22–反向：5’-GAGCTGGCAGAAGAACAGGAAC-3’(SEQIDNO:12)。MPZ-正向：5’-TGTTGCTGCTGTTGCTCTTC-3’(SEQIDNO:13)和MPZ-反向：5’-TTGTGAAATTTCCCCTTCTCC-3’(SEQIDNO:14)。結(jié)果混合物1組合物在整個(gè)處理程序中改進(jìn)桿試驗(yàn)表現(xiàn)(圖4)。如圖5中所示，混合物1在處理3和6周后改進(jìn)了轉(zhuǎn)基因大鼠的步態(tài)分值。如圖6中所述，混合物1在處理3、6、9和12周后提高了轉(zhuǎn)基因大鼠在斜面試驗(yàn)中的表現(xiàn)。圖7顯示了混合物2對(duì)25、35和40°斜面試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因大鼠的步態(tài)分值的正效應(yīng)?；旌衔?(劑量3)顯著降低了pmp22轉(zhuǎn)基因大鼠的坐骨神經(jīng)中pmp22RNA的基因表達(dá)(圖9)。用混合物7(劑量2和劑量3)處理的pmp22大鼠在35°斜面試驗(yàn)中的表現(xiàn)得到提高(圖10)。更具體來說，29和33％的大鼠屬于表現(xiàn)良好組，與此相比對(duì)于TG安慰劑組來說為5％，并且29和11％的大鼠屬于表現(xiàn)不良組，與此相比對(duì)于TG安慰劑組來說為60％。對(duì)于用混合物7-劑量2處理的TG大鼠來說，P-值(與TG安慰劑組相比)等于0.0152，對(duì)于用混合物7-劑量3處理的TG大鼠來說，與TG安慰劑組相比的p-值等于0.002?；旌衔?-劑量3在處理9周后顯著增加了pmp22大鼠在桿試驗(yàn)中的跌落等待時(shí)間(圖11)：黑色虛線，p＝4.5610-2，n＝18。也觀察到了TG安慰劑大鼠(黑色素線，n＝20)與WT安慰劑大鼠(灰色素線，p＝3.8210-7，n＝18)之間的顯著差異。圖12顯示了用混合物7-劑量3處理的pmp22大鼠的抓握力量的改進(jìn)。圖13顯示了桿試驗(yàn)等待時(shí)間(在用混合物7-劑量3處理9周后)與pmp22RNA表達(dá)水平之間的顯著關(guān)聯(lián)性。圖14顯示了用混合物7-劑量3處理9周后的桿試驗(yàn)等待時(shí)間與敏感神經(jīng)(尾)的傳導(dǎo)速度之間的顯著關(guān)聯(lián)性。對(duì)于其他組合獲得了類似結(jié)果(參見表3)。表3組合PMP22大鼠疾病表型混合物1改進(jìn)混合物2改進(jìn)混合物3改進(jìn)混合物4改進(jìn)混合物5改進(jìn)混合物6改進(jìn)這些數(shù)據(jù)顯示，在體內(nèi)，本發(fā)明的組合和治療方式允許有效治療CMT。D.在中毒性神經(jīng)病模型中的體內(nèi)效應(yīng)藥物處理或治療方式是從第一次腹膜內(nèi)注射3mg/kg奧沙利鉑前一天(D-1)直到最后測試日的前一天(D16)進(jìn)行口服給藥。屬于奧沙利鉑處理組的動(dòng)物每日給藥蒸餾水(10ml/kg)。動(dòng)物每日在早晨給藥所測試的治療和蒸餾水，而奧沙利鉑在下午給藥。在測試日(即D1、D4、D10)期間，在測試后給藥處理和蒸餾水。對(duì)于包括化合物和介質(zhì)給藥以及奧沙利鉑注射的測試日(D4)來說，處理和蒸餾水在測試之后、奧沙利鉑注射之前給藥。來自參比處理組的動(dòng)物只在測試日(即D1、D4、D10和D17)期間給藥。通過在D1(第一次注射3mg/kg奧沙利鉑后24h(奧沙利鉑急性效應(yīng)))、D4、D10(奧沙利鉑的慢性效應(yīng))和D17(奧沙利鉑在處理完成后一周的殘余效應(yīng))測量對(duì)非傷害性熱刺激(丙酮試驗(yàn))的響應(yīng)，來評(píng)估冷痛覺異常。試驗(yàn)在參比物給藥后2小時(shí)使用丙酮試驗(yàn)來進(jìn)行。參比物質(zhì)是口服100mg/kg加巴噴丁(每日一次x4個(gè)測試日)。丙酮試驗(yàn)使用丙酮試驗(yàn)來評(píng)估冷痛覺異常。在該試驗(yàn)中，測量在向兩只后爪的跖面施加一滴丙酮后后爪回縮的等待時(shí)間(反應(yīng)時(shí)間)并對(duì)相應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行打分(冷分值)。在施加丙酮后20秒(截止時(shí)間)內(nèi)測量對(duì)丙酮的冷卻效應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間。對(duì)丙酮的響應(yīng)也按照下列4個(gè)點(diǎn)的等級(jí)進(jìn)行分級(jí)：0(無響應(yīng))；1(快速回縮，輕彈爪)；2(長時(shí)間回縮或顯著輕彈爪)；3(重復(fù)輕彈爪并伴有舔或咬)。使用大鼠進(jìn)行了6次試驗(yàn)。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果表示成累加冷分值，其被定義為每只大鼠的6個(gè)分值合在一起的總和±SEM。最小分值為0(對(duì)6次試驗(yàn)的任一次都無響應(yīng))，最大可能分值為18(對(duì)6次試驗(yàn)的每一次都重復(fù)輕彈并舔或咬爪)。加巴噴丁來源：中國浙江手性藥物化學(xué)公司(ZhejiangChiralMedicineChemicals,China)奧沙利鉑來源：Sigma，法國。結(jié)果描述在圖8中。它們清楚地顯示了本發(fā)明的組合物對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病的保護(hù)性效應(yīng)。E.在ALS模型中的體內(nèi)效應(yīng)動(dòng)物模型我們選擇SOD1G93A大鼠模型(由Howland等產(chǎn)生)來模擬肌萎縮性側(cè)索硬化癥病理。該模型在脊髓、許多腦區(qū)域以及外周組織中過表達(dá)突變的SOD1基因。該模型的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的發(fā)作在約115天時(shí)；它表現(xiàn)為后肢異常步態(tài)。在幾天內(nèi)，后肢麻痹上升。實(shí)驗(yàn)步驟我們通過將種畜SOD1G93A大鼠與SpragueDawley雌性大鼠雜交獲得了群體。使用hSOD1特異性引物，通過尾部DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒定雜合SOD1G93A大鼠[1]。將動(dòng)物維持在具有受控照明(在0500–1900h光照)和溫度(23±1℃)的房間中，并允許自由接近食物和水。本研究中的所有步驟按照動(dòng)物護(hù)理指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。每周進(jìn)行體重測量，行為試驗(yàn)在60日齡時(shí)開始并持續(xù)到終點(diǎn)。從5周齡開始每天通過口服或皮下方式進(jìn)行處理。1.觀察試驗(yàn)：一般性情況表征將每只大鼠在沒有雜物的新鼠籠(尺寸55x33x18cm)中觀察5分鐘。記錄了5種不同參數(shù)：步態(tài)-0分：正常步態(tài)(流暢)-1分：異常步態(tài)(不流暢或大鼠微跛)-2分：中度失能(大鼠拖著一條腿，并且能夠調(diào)整好它并行走)-3分：嚴(yán)重失能(大鼠拖著它的一個(gè)或兩個(gè)后爪，但是不能調(diào)整好它/它們。毛皮情況‐0分：干凈和絲滑毛皮‐1分：豎毛或骯臟毛皮震顫‐0分：無震顫‐1分：震顫體位‐0分：正常‐1分：異常(壓平或拱起它的背)后爪位置‐0分：正常‐1分：伸展后爪2.運(yùn)動(dòng)分值試驗(yàn)：運(yùn)動(dòng)缺陷的表征該試驗(yàn)評(píng)估大鼠在被翻到任一側(cè)后30秒內(nèi)將其自身正位的能力(正位反射)(Gale等)。使用了按照下面這些標(biāo)準(zhǔn)的非參數(shù)性計(jì)分系統(tǒng)(Matsumoto等，Thonhoff等)：-0分：大鼠不能在30秒內(nèi)從任一側(cè)將其自身正位-1分：大鼠只是不能在30秒內(nèi)從某一側(cè)將其自身正位-2分：大鼠能夠在30秒內(nèi)從兩側(cè)將其自身正位，但是不能站立在籠子中；它總是拖著身體的某些部分-3分：大鼠能夠在30秒內(nèi)從兩側(cè)將其自身正位，不能站立在籠子中，但是不拖著身體的某些部分-4分：大鼠能夠在30秒內(nèi)從兩側(cè)將其自身正位，能夠站立在籠子中，但是具有可見的功能缺陷-5分：大鼠能夠在30秒內(nèi)從兩側(cè)將其自身正位，能夠站立在籠子中，并且沒有可見的功能缺陷。疾病的終點(diǎn)被固定在0分；然后將大鼠安樂死。3.斜面試驗(yàn)：運(yùn)動(dòng)缺陷的表征滑動(dòng)裝置具有30x50cm有機(jī)玻璃平面，其能夠以0°(水平)至60°的角度傾斜。一開始，將每只大鼠以頭向上位置(頭朝上方向)置于25°角斜面上；執(zhí)行兩次相隔1分鐘的試驗(yàn)。30分鐘后，在35°角斜面上、然后在40°角斜面上完成同樣的實(shí)驗(yàn)。在此期間，將大鼠放回籠子。在每次試驗(yàn)后清潔斜面。大鼠的表現(xiàn)通過4個(gè)不同分值評(píng)估：-0分：無滑動(dòng)-1分：少許滑動(dòng)(一只或兩只爪)-2分：中度滑動(dòng)(4只爪)，但是不滑到斜面底端-3分：大鼠一直滑到斜面最底端。4.金屬絲網(wǎng)試驗(yàn)：困難形勢下運(yùn)動(dòng)能力的表征將金屬絲網(wǎng)放置成在頂部與箱子相接觸(以70°傾角)并在底部與桌子邊緣相接觸。將每只大鼠置于金屬絲網(wǎng)底部，并通過將其同窩仔畜放置在頂部的箱子中激勵(lì)它向上爬。每只大鼠每周訓(xùn)練一次(3次試驗(yàn))。記錄的參數(shù)是到達(dá)金屬絲網(wǎng)頂部的等待時(shí)間。5.開闊地試驗(yàn)：自主活動(dòng)能力表征自主活動(dòng)能力在具有沿著位于底面上方1和5cm處的兩個(gè)軸的16個(gè)光電管光束的有機(jī)玻璃箱子(45x45x30cm，Acti-Track，BIOSEB,Lyon，法國)中測量。在3小時(shí)內(nèi)評(píng)估每只大鼠的自發(fā)和探索性活動(dòng)。記錄4個(gè)參數(shù)(總移動(dòng)距離，用后肢站立次數(shù)，在開闊地中心移動(dòng)的距離和花費(fèi)的時(shí)間的百分?jǐn)?shù))。F.在機(jī)械性神經(jīng)元損傷-坐骨神經(jīng)夾傷模型中的體內(nèi)效應(yīng)坐骨神經(jīng)夾傷被廣泛認(rèn)可為評(píng)估神經(jīng)再生的有效模型。在該模型中，神經(jīng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)功能的快速破壞，正如通過測量通過刺激受損坐骨神經(jīng)而產(chǎn)生的誘發(fā)的肌肉動(dòng)作電位(CMAP)所證實(shí)的。神經(jīng)損傷被表征為信號(hào)的較低神經(jīng)傳導(dǎo)，其導(dǎo)致CMAP生成延遲增加和動(dòng)作電位強(qiáng)度受損，使得波幅和持續(xù)時(shí)間降低。這導(dǎo)致顯著的步態(tài)異常。1.神經(jīng)夾傷使用異氟烷(空氣中2.5-3％)麻醉CD-1小鼠(CharlesRiver，非疾病小鼠)。將右大腿剃毛，坐骨神經(jīng)暴露在大腿中部水平(坐骨神經(jīng)分叉點(diǎn)近端5mm)并用微型外科鉗(Holtex,P35311)鉗夾10s兩次，每次鉗夾之間旋轉(zhuǎn)90°。對(duì)于假手術(shù)動(dòng)物，將坐骨神經(jīng)暴露但不鉗夾。最后，用縫合夾固定皮膚切口。在鉗夾后30min進(jìn)行首次給藥混合物7-劑量3。從第1天至第42天，每天進(jìn)行一次給藥。在測試日，在CMAP記錄前1.5h對(duì)小鼠進(jìn)行處理(10ml/kg)。對(duì)于承重實(shí)驗(yàn)，向動(dòng)物給藥混合物7、巴氯芬600μg/kg、納曲酮70μg/kg、D-山梨糖醇21mg/kg，在第13天進(jìn)行測試。2.電生理測量在鉗夾后30天使用Keypoint肌動(dòng)電流描記器(EMG)(Medtronic,France)進(jìn)行電生理記錄。通過2.5-3％異氟烷麻醉小鼠，并使用皮下單極針電極以進(jìn)行刺激和記錄兩者。傳遞0.2ms的超大(12.8mA)方波脈沖以刺激坐骨神經(jīng)(鉗夾的近側(cè))。用施加至坐骨切跡的單次脈沖刺激右側(cè)坐骨神經(jīng)(同側(cè))。通過放置在腓腸肌處的針電極記錄CMAP。測定反映肌肉的去神經(jīng)支配和再支配水平的動(dòng)作電位的波幅(μV)(圖15，圖A)。3.形態(tài)測定分析在鉗夾后42天，從每組6只小鼠(如上所述)取出脛神經(jīng)以進(jìn)行如下的形態(tài)測定分析：使用裝配有數(shù)碼相機(jī)(NikonDS-Fi1)的光學(xué)顯微鏡(Nikonoptiphot-2)獲得每個(gè)樣品的完整神經(jīng)段的合成圖像。使用Image-ProPlus軟件(MediaCyberneticsInc.,USA)，用數(shù)碼圖像進(jìn)行形態(tài)測定分析，該軟件通過甲苯胺藍(lán)染色的髓鞘的灰度水平將每個(gè)有髓鞘纖維個(gè)體化后計(jì)算出軸突和髓鞘的像素尺寸。這使得可以測定軸突口徑(圖15，圖B)和G-比率，其是軸突內(nèi)徑與神經(jīng)元纖維外徑(即，軸突+髓鞘的厚度)之間的比率。G-比率和軸突直徑之間的平衡指示了神經(jīng)元的髓鞘形成(圖15，圖C)。4.后肢承重在第13天使用動(dòng)態(tài)承重測試(BioSeb,France)評(píng)估了動(dòng)物(CD1小鼠)在四肢上的體重分布。這種失能測試包括持續(xù)測量自由移動(dòng)的動(dòng)物施加的所有壓力點(diǎn)，使得可以定量評(píng)價(jià)由神經(jīng)損傷引起的體重失衡。將每只小鼠置于11x11x22cm籠中，在籠地板上具有44x44傳感器單元網(wǎng)格。在5min時(shí)間段內(nèi)以10Hz的頻率記錄動(dòng)物的爪子施加到傳感器單元上的壓力。通過動(dòng)態(tài)承重(Dynamicweightbearing)1.3.2h軟件(Bioseb,France)自動(dòng)測定每只動(dòng)物的壓力和表面檢測閾值。在將每個(gè)壓力點(diǎn)手動(dòng)歸屬于相應(yīng)的爪子后，計(jì)算每個(gè)爪子上施加的平均重量以得到表面比。最后通過同側(cè)/對(duì)側(cè)后爪重量和表面比來評(píng)估單側(cè)步態(tài)異常(圖17，圖A)。5.結(jié)果當(dāng)與夾傷但未處理的動(dòng)物及早至處理3周時(shí)的動(dòng)物相比，注意到CMAP波幅的顯著改善(約84％，圖15，圖A)，從而顯示了神經(jīng)的加速功能恢復(fù)。形態(tài)測定分析同樣顯示軸突口徑的顯著增加(處理6周后約30％，圖15，圖B)，其是促進(jìn)神經(jīng)生長的標(biāo)記。神經(jīng)的形態(tài)和電生理特征的這種改善表征了由混合物7觸發(fā)的神經(jīng)再生。在用本發(fā)明的組合物處理后也觀察到了軸突髓鞘形成的正?；?。正常髓鞘形成狀態(tài)的特征為軸突的幾乎一致的髓鞘形成，其特征為不論軸突的直徑如何，G-比率恒定(圖15，圖C，黑色橫線)。通過如上所述的鉗夾導(dǎo)致的神經(jīng)損傷使得軸突的髓鞘形成受到顯著干擾。鉗夾后42天，當(dāng)與假手術(shù)動(dòng)物相比，注意到小軸突(低直徑)的高髓鞘形成以及大軸突的低髓鞘形成；這由G-比率與軸突直徑之間的正相關(guān)導(dǎo)致(圖15，圖C，正斜率的黑色虛線)。在用混合物7處理后，在鉗夾后42天觀察到了軸突髓鞘形成的正?；?圖15，圖C，灰線)，這由當(dāng)與假手術(shù)動(dòng)物(黑線)和未處理的夾傷的動(dòng)物(黑色虛線)相比，顯示出中等斜率的根據(jù)軸突直徑的G-比率的分布所示出。這些結(jié)果預(yù)示了本發(fā)明的組合物通過作用于髓鞘(對(duì)于有髓鞘的神經(jīng)元)或軸突的電生理功能和/或完整性，在改善和/或加快神經(jīng)元損傷的恢復(fù)中的高的潛力。如圖7(圖B)所示，混合物7也有效地恢復(fù)了被夾傷小鼠的功能性行為，而單種藥物并沒有顯示對(duì)神經(jīng)夾傷誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)失能的任何效應(yīng)(圖C,D,E)，從而預(yù)示了巴氯芬-山梨糖醇-納曲酮組合療法的特殊效力。因此，本發(fā)明的組合物在通過促進(jìn)神經(jīng)再生而矯正神經(jīng)損傷上特別有效。G.在臨床試驗(yàn)中評(píng)估本發(fā)明的組合物的體內(nèi)效應(yīng)本發(fā)明的組合物對(duì)CMT疾病的正效應(yīng)通過ClinicalTrials.gov數(shù)據(jù)庫中登記為EudraCT2010-023097-40和NCT10401257的臨床試驗(yàn)所證實(shí)。該試驗(yàn)是一年期、雙盲、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照的2期臨床研究。本發(fā)明的首要目的是評(píng)估混合物7在患有CMT疾病的患者中的安全性和耐受性。次要目的在于探索性分析混合物7的效力以用于在患者中組織進(jìn)一步的研究。1.方法患者、隨機(jī)和盲法在篩選訪視時(shí)對(duì)可能符合條件的對(duì)象進(jìn)行評(píng)估，其尤其包括證實(shí)CMT1A基因分型、記錄沙-馬-圖神經(jīng)病得分(CMTNS,Shy等，2005)、總體神經(jīng)病限制等級(jí)(ONLS,Graham等，2006)以確定CMT1A診斷。以1:1:1:1的比例將年齡18-65歲、根據(jù)臨床檢查并通過基因分型證實(shí)的診斷患有CMT1A、至少足背屈虛弱、以及沙-馬-圖神經(jīng)病得分(CMTNS)≤20的女性和男性患者隨機(jī)分配以每天接受安慰劑或混合物7((RS)-巴氯芬：6mg/天、納曲酮：0.7mg/天、D-山梨糖醇：210mg/天)一年。使用區(qū)組隨機(jī)化分組方案，由研究中心分層。所有研究者和患者并不知曉治療分組。安全性、耐受性、依從性基于患者和實(shí)驗(yàn)室測試報(bào)告的不良事件，監(jiān)測在研究、包括混合物7給藥最后一天后的1個(gè)月隨訪期間混合物的安全性。在每次訪問時(shí)(1、3、9和12個(gè)月)通過返回的空瓶計(jì)數(shù)和體積測量來監(jiān)測依從性。平均(SD)暴露時(shí)間總體為11.69(1.53)個(gè)月，并且各組之間是相似的，對(duì)研究藥物的平均(SD)依從性為97.3(9.41)％。電生理測試在皮膚溫度32℃下使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)研究。在非主導(dǎo)上肢的正中和尺神經(jīng)上測試感覺和運(yùn)動(dòng)功能二者。對(duì)于運(yùn)動(dòng)參數(shù)(復(fù)合肌肉動(dòng)作電位的波幅(CMAP，毫伏)和末端運(yùn)動(dòng)潛伏期(DML，毫秒))，在腕部、肘窩處刺激正中神經(jīng)，并記錄拇短展肌上的響應(yīng)。在腕部處和肘部下方刺激尺神經(jīng)，并記錄小指展肌上的響應(yīng)。對(duì)于感覺參數(shù)(感覺神經(jīng)動(dòng)作電位的波幅(SNAP，毫伏)和感覺傳導(dǎo)速度(SCV，米/秒))，使用了逆向方法，并通過放置在腕部的環(huán)電極刺激神經(jīng)。對(duì)于正中神經(jīng)，將活性電極放置在第二指的根部上并將參比電極放置在第二指的第四和第五掌骨之間。對(duì)于尺神經(jīng)，將活性電極放置在第五指的根部，將參比電極放置在第五指的第四和第五掌骨之間。沙-馬-圖神經(jīng)病得分(CMTNS)由Shy等(2005)提出和驗(yàn)證了CMTNS以提供CMT嚴(yán)重性的單個(gè)和可靠的測量22。目前這是唯一的CMT特異性結(jié)果測量方法(盡管不是特異性針對(duì)CMT1A)。CMTNS是基于9個(gè)項(xiàng)目的36-分量表，所述9個(gè)項(xiàng)目包括5個(gè)損傷(感覺癥狀、針敏感度、振動(dòng)、手臂力量和腿力量)、2個(gè)活性限制(手臂和腿運(yùn)動(dòng)癥狀)和2個(gè)電生理學(xué)(尺骨CMAP和SNAP的波幅)。更高的得分指示了惡化的功能，并且得分將失能分類為輕微(0-10)、中度(11-20)和嚴(yán)重(21-36)?？傮w神經(jīng)病限制量表(ONLS)ONLS源自于Graham和Hughes(2006)的ODSS并從其改進(jìn)而來，以測量上肢(按5分評(píng)級(jí))和下肢(按7分評(píng)級(jí))的每日活動(dòng)中的限制23?？偟梅謴?(＝無失能)到12(＝最大失能)。盡管外周神經(jīng)病患者的功能性除他/她們的身體能力外還可能受其他因素影響，ONLS測量感知到的患者移動(dòng)和完成正常生活的能力，因此被預(yù)期與生活質(zhì)量相關(guān)。統(tǒng)計(jì)分析使用R3.0.1或之后版本(http://cran.r-project.org)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。初步評(píng)估數(shù)據(jù)分布及組內(nèi)差異以指導(dǎo)方法學(xué)選擇(Markowski等，1990；Sawilowski&Blair；Vickers,2005)。假設(shè)數(shù)據(jù)為隨機(jī)缺失(MAR,Little&Rubin,2002)，通過被認(rèn)為是用于意向性治療縱向研究的最合適的技術(shù)的混合模型方法(Chakraborty&Gu,2009)，進(jìn)行缺失數(shù)據(jù)插補(bǔ)。出于靈敏度目的，對(duì)無缺失數(shù)據(jù)插補(bǔ)的結(jié)果進(jìn)行比較。以5％顯著水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。群體分析通過包括已知服用了至少一劑混合物7的所有隨機(jī)化的患者，在意向性治療基礎(chǔ)上在全分析集上進(jìn)行所有分析，并且提供至少一個(gè)基線后效力測量。基線分析在組間描述性地比較基線處的患者特性，并通過Fisher精確檢驗(yàn)法或方差分析(ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)。安全性和耐受性分析安全性和耐受性分析基于報(bào)告的治療中出現(xiàn)的不良事件和其他安全信息(實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、生命體征、和ECG)。在組間描述性地比較治療中出現(xiàn)的不良事件(TEAE)的發(fā)生率，并通過Fisher精確檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)。效力分析通過調(diào)節(jié)基線值對(duì)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化值進(jìn)行協(xié)方差分析(ANCOVA)，進(jìn)行組間差異的評(píng)估。以相對(duì)于基線的平均變化百分比提供估值。這一分析在不同的效力結(jié)果上獨(dú)立地進(jìn)行。由于結(jié)果多樣性，通過O'Brien'sOLS檢驗(yàn)(O’Brien,1984；Logan&Tamhane,2006)檢驗(yàn)治療效果對(duì)兩種主要結(jié)果CMTNS和ONLS的顯著性。對(duì)其他效力結(jié)果(DML，SCV)重復(fù)該分析。將治療響應(yīng)者限定為在12個(gè)月治療期間未惡化的患者。以相對(duì)于基線的改變百分率在CMTNS和ONLS上平均來評(píng)價(jià)惡化情況。使用邏輯回歸模型比較每組中響應(yīng)者的比例。從比值比估計(jì)36推導(dǎo)出相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)效力分析的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)為單側(cè)檢驗(yàn)。在臨床基礎(chǔ)上(由于將商業(yè)上使用高得多的劑量的化合物以極低劑量使用，而對(duì)效力或安全性二者不太可能有害的假設(shè))和統(tǒng)計(jì)有效性(Lewis等，2013；Parikh等，2011；DeJager等，2010)上對(duì)所述單側(cè)檢驗(yàn)方法進(jìn)行調(diào)整。2.結(jié)果安全性和耐受性混合物7的安全性和耐受性良好，因?yàn)橹委煹臄z入并未指示對(duì)生命體征(血壓、心率和體重)、心電圖測量和實(shí)驗(yàn)室異常(生化和血液學(xué))的結(jié)果的任何影響。在安慰劑和混合物7組之間治療中出現(xiàn)的不良事件的發(fā)生率并沒有顯著不同(分別為47％和31％)。此外，大多數(shù)治療中出現(xiàn)的不良事件是溫和及良性的。效力與安慰劑組相比，用混合物7處理導(dǎo)致CMTNS的改善(表4，傾向，P<0.20)。與安慰劑相比，混合物7組中的ONLS得分也得以改善(表4，14.4％改善，P<0.05)。實(shí)際上，盡管安慰劑中的ONLS得分在一年后降低(圖16，虛線)，它在混合物7處理組中顯著增加(圖16，實(shí)線)。當(dāng)考慮到通過O’Brien’sOLS的顯著性(P<0.05)的與安慰劑相比混合物7組中CMTNS和ONLS的改善時(shí)，患者整體狀況得分的改善得以證實(shí)。有趣的是，正如通過感覺傳導(dǎo)速度和運(yùn)動(dòng)末端潛伏期所評(píng)估的，當(dāng)與安慰劑相比時(shí)混合物7組中也顯示了髓鞘功能的改善。當(dāng)與安慰劑相比時(shí)混合物7組中末端運(yùn)動(dòng)潛伏期(DML)顯著降低(表4，8％，P<0.05)，并且當(dāng)與安慰劑相比時(shí)混合物7組中的感覺傳導(dǎo)速度(SCV)顯著增加(表4，26.6％，P<0.001)。這些結(jié)果與混合物7對(duì)施旺細(xì)胞功能的影響一致，并且確實(shí)支持本發(fā)明的組合物在神經(jīng)纖維再生中的有效性，正如通過上述體外和體內(nèi)臨床前研究所觀察到的。表4.四項(xiàng)檢測中安慰劑相對(duì)于治療組的平均改善百分率(平均值±S.D.)最后，在混合物7組中以12個(gè)月治療期間未惡化的患者所限定的治療響應(yīng)者的比例顯著更高(79％，相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)1.66，P＝0.01)。表5.安慰劑相對(duì)于混合物7組響應(yīng)者?；颊邤?shù)后面為括號(hào)中的相應(yīng)百分率。相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)后面為區(qū)間范圍。通過考慮響應(yīng)者和非響應(yīng)者之間的基線特性(在研究開始時(shí)記錄)，看上去響應(yīng)者總體上受疾病的影響較不嚴(yán)重。本發(fā)明的組合物不僅可用于減緩處在疾病晚期階段的患者中疾病的進(jìn)展，還被預(yù)期具有減緩受影響較弱的或處在疾病的早期階段如兒童的患者中的疾病的特別益處。參考文獻(xiàn)AmiciSA,DunnWAJr,MurphyAJ,AdamsNC,GaleNW,ValenzuelaDM,YancopoulosGD,NotterpekL.Peripheralmyelinprotein22isincomplexwithalpha6beta4integrin,anditsabsencealterstheSchwanncellbasallamina.(外周髓磷脂蛋白22與α6β4整合蛋白形成復(fù)合物，并且其缺乏改變施旺細(xì)胞的基膜)JNeurosci.2006；26(4):1179-1189.AmiciSA,DunnWAJr,NotterpekL.Developmentalabnormalitiesinthenervesofperipheralmyelinprotein22-deficientmice.(外周髓磷脂蛋白22缺陷型小鼠的神經(jīng)中的發(fā)育異常)JNeurosciRes.2007；85(2):238-249.AtanasoskiS,SchererSS,NaveK-A,SuterU.ProliferationofSchwannCellsandRegulationofCyclinD1ExpressioninanAnimalModelofCharcot-Marie-ToothDiseaseType1A.(1A型沙-馬-圖病動(dòng)物模型中施旺細(xì)胞的增殖和周期蛋白D1表達(dá)的調(diào)控)JNeurosciRes.2002；67(4):443-449.Basta-KaimA,BudziszewskaB,Jaworska-FeilL,TetichM,M,KuberaM,LasońW.Chlorpromazineinhibitstheglucocorticoidreceptor-mediatedgenetranscriptioninacalcium-dependentmanner.(氯丙嗪以鈣依賴性方式抑制糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄)Neuropharmacology.2002；43(6):1035-1043BattyIH,FlemingIN,DownesCP.Muscarinic-receptor-mediatedinhibitionofinsulin-likegrowthfactor-1receptor-stimulatedphosphoinositide3-kinasesignallingin1321N1astrocytomacells.(1321N1星形細(xì)胞瘤細(xì)胞中蕈毒堿能受體介導(dǎo)的胰島素類生長因子-1受體刺激的磷酸肌醇3-激酶信號(hào)傳導(dǎo)的抑制)BiochemJ.2004；379(Pt3):641-651.BogoyevitchMA,KettermanAJ,SugdenPH.Cellularstressesdifferentiallyactivatec-JunN-terminalproteinkinasesandextracellularsignal-regulatedproteinkinasesinculturedventricularmyocytes.(細(xì)胞應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