本申請要求2014年1月13日提交的美國臨時(shí)專利申請No.61/926,913，2014年6月9日提交的美國臨時(shí)專利申請No.62/009,783和2015年1月7日提交的美國臨時(shí)專利申請No.62/100,881的優(yōu)先權(quán)，將其每篇的內(nèi)容全部按引用并入本文中。

序列表的提交

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背景技術(shù)：

隨著血糖水平在餐后升高，胰島素分泌并刺激外周組織(骨骼肌和脂肪)的細(xì)胞主動地從血液吸收葡萄糖作為能量源。作為胰島素分泌或機(jī)能失調(diào)的結(jié)果而喪失葡萄糖穩(wěn)態(tài)通常導(dǎo)致代謝障礙，如糖尿病，其可能由肥胖共同引發(fā)或由肥胖進(jìn)一步加劇。因?yàn)檫@些病癥可能降低生活質(zhì)量或甚至是致命的，因此需要恢復(fù)從血流中適當(dāng)清除葡萄糖的策略。

盡管糖尿病可能由于引起胰腺大范圍損傷的任何病癥(例如，胰腺炎、腫瘤、特定藥物(如皮質(zhì)類固醇或噴他脒)的施用、鐵超負(fù)荷(即，血色素沉著)、獲得性或遺傳性內(nèi)分泌病和外科手術(shù)切除)而繼發(fā)產(chǎn)生，但最常見形式的糖尿病通常由胰島素信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的原發(fā)性失調(diào)產(chǎn)生。存在兩種主要類型的糖尿病，即1型糖尿病(也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM))和2型糖尿病(也稱為胰島素?zé)o關(guān)性或非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM))，盡管它們的發(fā)病機(jī)理不同，但都有共同的長期并發(fā)癥。

1型糖尿病，其占到所有原發(fā)性糖尿病病例的大約10％，是特征在于胰腺的胰島素產(chǎn)生β細(xì)胞的大范圍破壞的器官特異性自身免疫疾病。隨之發(fā)生的胰島素產(chǎn)生的降低不可避免地導(dǎo)致葡萄糖代謝的失調(diào)。盡管胰島素的施用給患有這種病癥的患者提供了相當(dāng)大的益處，但胰島素的短血清半衰期是維持正常血糖的主要障礙?？商娲闹委熓且葝u移植，但這種策略只獲得了有限的成功。

2型糖尿病，其影響較大比例的人群，特征在于胰島素分泌的失調(diào)和/或外周組織對胰島素的應(yīng)答降低，即，胰島素抵抗。盡管2型糖尿病的發(fā)病機(jī)理仍然不清楚，但流行病學(xué)研究表明這種形式的糖尿病由多重遺傳缺陷的集合或多態(tài)性產(chǎn)生，其各自引起其自身的易感風(fēng)險(xiǎn)并由環(huán)境因素改變，包括超重、飲食、不活動、藥物和過量飲酒。盡管各種治療性處理可以用于控制2型糖尿病，但它們與各種使人衰弱的副作用相關(guān)。因此，常常建議診斷為患有2型糖尿病或處于患2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)中的患者采用更健康的生活方式，包括減輕體重、改變飲食、鍛煉和適當(dāng)?shù)娘嬀?。然后，這樣的生活方式改變不足以逆轉(zhuǎn)由糖尿病引起的血管和器官損傷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于遞送至肌肉的包含烯醇酶1(Eno1)或其片段的組合物。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了用于在血糖升高的受試者中使血糖正?；姆椒?，所述方法包括將包含Eno1或其片段的組合物施用于受試者，由此使受試者中的血糖正常化。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了治療受試者的一種或多種病癥的方法，所述病癥包括受損的葡萄糖耐量、胰島素抵抗、前驅(qū)糖尿病和糖尿病，尤其是2型糖尿病，所述方法包括將包含Eno1或其片段的組合物施用于受試者，由此治療受試者的病癥。在本發(fā)明的特定方法中，將Eno1遞送至肌肉。

本發(fā)明提供了用于遞送至肌細(xì)胞的包含Eno1或其片段的藥物組合物。

在特定實(shí)施方案中，Eno1包括Eno1多肽或其片段。在特定實(shí)施方案中，Eno1包括Eno1核酸或其片段。在特定實(shí)施方案中，Eno1包括人Eno1，例如，人Eno1多肽或人Eno1核酸，或其片段。

在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括微粒。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括納米顆粒。在特定實(shí)施方案中，Eno1或其片段是生物活性的。在特定實(shí)施方案中，Eno1或其片段具有純化內(nèi)源性人Eno1多肽的至少90％的活性。

在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括原位形成的組合物。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括脂質(zhì)體。在特定實(shí)施方案中，組合物包括樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括表達(dá)載體，例如，編碼Eno1或其片段。在特定實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括病毒載體。

在特定實(shí)施方案中，組合物包括含有Eno1或其片段(例如，Eno1多肽，例如，人Eno1多肽)和肌肉靶向部分的復(fù)合物。在特定實(shí)施方案中，肌肉靶向部分包括骨骼肌和/或平滑肌靶向肽(MTP)。在特定實(shí)施方案中，MTP包含選自ASSLNIA；WDANGKT；GETRAPL；CGHHPVYAC和HAIYPRH的氨基酸序列。在特定實(shí)施方案中，復(fù)合物包含連接物，例如，連接Eno1和SMTP。在特定實(shí)施方案中，連接物選自共價(jià)連接物、非共價(jià)連接和可逆連接物。在特定實(shí)施方案中，復(fù)合物包括藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物是PAMAN樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物是G5樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物是不帶電的樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物是?；瘶錉罹酆衔铩Ｔ谔囟▽?shí)施方案中，樹狀聚合物是PEG化樹狀聚合物或乙酰化樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，復(fù)合物包括脂質(zhì)體。在特定實(shí)施方案中，復(fù)合物包括微?；蚣{米顆粒。在特定實(shí)施方案中，組合物包括原位形成的組合物。

在特定實(shí)施方案中，Eno1在遞送至肌細(xì)胞時(shí)從復(fù)合物釋放。

在特定實(shí)施方案中，Eno1或其片段和靶向部分以約1:1至約1:30的比率存在于復(fù)合物中。

在特定實(shí)施方案中，組合物配制成通過注射或輸注來施用。在特定實(shí)施方案中，組合物配制成用于口服施用。在特定實(shí)施方案中，組合物配制成用于腸胃外施用。在特定實(shí)施方案中，組合物配制成用于肌肉內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用或皮下施用。

本發(fā)明提供了降低血糖升高的受試者的血糖的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物包括本文中提供的任一藥物組合物。

本發(fā)明提供了提高葡萄糖耐量降低的受試者的葡萄糖耐量的方法，該方法包括將包含Eno1的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物包括本文中提供的任一藥物組合物。

本發(fā)明提供了提高胰島素敏感性降低和/或具有胰島素抵抗的受試者的胰島素反應(yīng)的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物包括本文中提供的任一藥物組合物。

本發(fā)明提供了治療受試者糖尿病的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，糖尿病是2型糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病是前驅(qū)糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病是1型糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病是妊娠糖尿病。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物包括本文中提供的任一藥物組合物。

本發(fā)明提供了降低Hb1Ac水平升高的受試者的Hb1Ac水平的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物包括本文中提供的任一藥物組合物。

本發(fā)明提供了改善血糖水平控制異常的受試者的血糖水平控制的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物包括本文中提供的任一藥物組合物。

在特定實(shí)施方案中，通過注射或輸注來施用Eno1或其片段。在特定實(shí)施方案中，腸胃外施用Eno1或其片段。在特定實(shí)施方案中，口服施用Eno1或其片段。在特定實(shí)施方案中，通過選自肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下的途徑來施用Eno1或其片段。

本發(fā)明提供了用于診斷受試者的血糖水平升高的方法，包括：(a)檢測受試者的生物樣品中的Eno1水平，和(b)將生物樣品中的Eno1水平與預(yù)定的閾值進(jìn)行比較，其中低于預(yù)定閾值的Eno1水平指示受試者中升高的血糖的存在。在特定實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測血糖升高的一種或多種診斷指標(biāo)的水平。在特定實(shí)施方案中，血糖升高的一種或多種其他診斷指標(biāo)選自HbA1c、空腹血糖、餐后血糖和葡萄糖耐量。在特定實(shí)施方案中，生物樣品是血液或血清。在特定實(shí)施方案中，通過免疫分析或ELISA測定Eno1的水平。在特定實(shí)施方案中，步驟(a)包括(i)將生物樣品接觸選擇性地結(jié)合Eno1以形成生物標(biāo)志物復(fù)合物的試劑，和(ii)檢測生物標(biāo)志物復(fù)合物。在特定實(shí)施方案中，試劑是選擇性地結(jié)合Eno1的至少一個(gè)表位的抗-Eno1抗體。

在特定實(shí)施方案中，步驟(a)包括測定生物樣品中Eno1 mRNA的量。在特定實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)用于測定生物樣品中Eno1 mRNA的量。在特定實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)是(a)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；(b)基于核酸序列的擴(kuò)增試驗(yàn)(NASBA)；(c)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)；(d)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)；或(e)鏈置換擴(kuò)增(SDA)。在特定實(shí)施方案中，將雜交試驗(yàn)用于測定生物樣品中Eno1 mRNA的量。在特定實(shí)施方案中，將與Eno1 mRNA的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸用于雜交試驗(yàn)中來檢測Eno1 mRNA。

在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，升高血糖的診斷是選自2型糖尿病、前驅(qū)糖尿病、妊娠糖尿病和1型糖尿病的疾病或病癥的診斷。

本發(fā)明提供了用于診斷受試者中升高血糖的存在的方法，包括：

(a)將生物樣品接觸選擇性地結(jié)合Eno1的試劑；

(b)允許試劑與Eno1之間形成復(fù)合物；

(c)檢測復(fù)合物的水平，和

(d)將復(fù)合物的水平與預(yù)定的閾值進(jìn)行比較，其中高于預(yù)定閾值的復(fù)合物水平指示患者正遭受升高的血糖。在特定實(shí)施方案中，試劑是抗-Eno1抗體。在特定實(shí)施方案中，抗體包含可檢測標(biāo)記。在特定實(shí)施方案中，檢測復(fù)合物水平的步驟進(jìn)一步包括將復(fù)合物接觸可檢測的二抗并測量二抗的水平。在特定實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括檢測一種或多種其他的升高血糖的指標(biāo)的水平。在特定實(shí)施方案中，一種或多種其他的血糖指標(biāo)選自HbA1c水平、空腹血糖、餐后血糖和葡萄糖耐量。在特定實(shí)施方案中，生物樣品是血液或血清。

在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，通過免疫分析或ELISA測定復(fù)合物的水平。在特定實(shí)施方案中，升高的血糖指示前驅(qū)糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病或妊娠糖尿病。在特定實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括施用其中診斷表明受試者存在升高的血糖的治療方案，其中治療方案選自藥物治療和行為治療，或其組合。在特定實(shí)施方案中，藥物治療包括用選自(a)美格列奈，(b)磺酰脲，(c)二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑，(d)雙胍，(e)噻唑烷二酮類，(f)α-葡糖苷酶抑制劑，(g)胰淀素(amylin)模擬物；(h)腸促胰島素模擬物；(i)胰島素；和(j)其任意組合的藥劑的治療。

在特定實(shí)施方案中，之前的任一方法進(jìn)一步包括選擇懷疑具有升高的血糖或處于具有升高的血糖的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。

在特定實(shí)施方案中，之前的任一方法進(jìn)一步包括從懷疑具有升高的血糖或處于具有升高的血糖的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者獲得生物樣品。

在特定實(shí)施方案中，之前的任一方法進(jìn)一步包括將生物樣品中一種或多種血糖升高相關(guān)的指標(biāo)的水平與對照樣品中一種或多種血糖升高相關(guān)的指標(biāo)的水平進(jìn)行比較，所述對照樣品選自：在比該生物樣品早的時(shí)間點(diǎn)從同一受試者獲得的樣品，來自具有正常血糖的受試者的樣品，來自前驅(qū)糖尿病受試者的樣品，來自2型糖尿病受試者的樣品，來自妊娠糖尿病受試者的樣品和來自1型糖尿病受試者的樣品。

本發(fā)明提供了用于監(jiān)控受試者的血糖升高的方法，該方法包括：

(1)測定在第一時(shí)間從血糖升高的受試者獲得的第一生物樣品中的Eno1水平；

(2)測定在第二時(shí)間從該受試者獲得的第二生物樣品中的Eno1水平，其中第二時(shí)間晚于第一時(shí)間；和

(3)將第二樣品中的Eno1水平與第一樣品中的Eno1水平進(jìn)行比較，其中Enol水平的改變指示受試者中血糖升高狀態(tài)的改變。

在特定實(shí)施方案中，測定步驟(1)和(2)進(jìn)一步包括測定選自HbA1c水平、空腹血糖、餐后血糖和葡萄糖耐量的一種或多種其他血糖指標(biāo)的水平。

在特定實(shí)施方案中，在獲得第二樣品之前，受試者用針對血糖升高的藥物進(jìn)行治療。在特定實(shí)施方案中，與第一生物樣品相比第二生物樣品中降低的Eno1水平指示受試者中血糖的升高。在特定實(shí)施方案中，與第一生物樣品相比第二生物樣品中提高或相等的Eno1水平指示受試者中血糖的正?；?。在特定實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括基于受試者的血糖水平選擇和/或施用用于該受試者的不同治療方案。在特定實(shí)施方案中，治療方案選自藥物治療和行為矯正治療。在特定實(shí)施方案中，藥物治療包括用選自(a)美格列奈，(b)磺酰脲，(c)二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑，(d)雙胍，(e)噻唑烷二酮類，(f)α-葡糖苷酶抑制劑，(g)胰淀素模擬物；(h)腸促胰島素模擬物；(i)胰島素；和(j)其任意組合的藥劑的治療。

本發(fā)明提供了治療受試者的升高的血糖的方法，包括：(a)從懷疑具有血糖升高的受試者獲得生物樣品，(b)提交生物樣品以獲得關(guān)于Eno1水平的診斷信息，(c)如果Eno1水平高于閾值水平，施用治療有效量的抗糖尿病治療。

本發(fā)明提供了治療受試者的升高的血糖的方法，包括：(a)獲得生物樣品中關(guān)于Eno1水平的診斷信息，和(b)如果Eno1水平高于閾值水平，施用治療有效量的抗糖尿病治療。

本發(fā)明提供了治療受試者的升高的血糖的方法，包括：

(a)從懷疑血糖升高的受試者獲得生物樣品用于鑒定關(guān)于Eno1水平的診斷信息，

(b)測量生物樣品中的Eno1水平，

(c)如果Eno1水平低于閾值水平，給健康護(hù)理提供者推薦施用血糖降低治療。

在特定實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括獲得關(guān)于血糖升高的一種或多種其他指標(biāo)水平的診斷信息。

在特定實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括測量血糖升高的一種或多種其他指標(biāo)的水平。

在特定實(shí)施方案中，血糖升高的一種或多種其他指標(biāo)選自HbA1c水平、空腹血糖水平、餐后血糖水平和葡萄糖耐量。

在特定實(shí)施方案中，如果Eno1的水平低并檢測了血糖升高的至少一種其他指標(biāo)，步驟(c)進(jìn)一步包括施用治療有效量的葡萄糖降低治療。在特定實(shí)施方案中，如果Eno1的水平低于閾值水平并且存在血糖升高的至少一種其他指標(biāo)，步驟(c)進(jìn)一步包括向健康護(hù)理提供者推薦施用葡萄糖降低治療。

在特定實(shí)施方案中，生物樣品是血液或血清。在特定實(shí)施方案中，通過免疫分析或ELISA來測定Eno1的水平。在特定實(shí)施方案中，通過(i)將生物樣品接觸選擇性地結(jié)合Eno1以形成生物標(biāo)志物復(fù)合物的試劑，和(ii)檢測生物標(biāo)志物復(fù)合物來測定Eno1的水平。在特定實(shí)施方案中，試劑是選擇性地結(jié)合Eno1的至少一個(gè)表位的抗-Eno1抗體。

在特定實(shí)施方案中，通過測量生物樣品中Enol mRNA的量來測定Enol的水平。在特定實(shí)施方案中，將擴(kuò)增反應(yīng)用于測量生物樣品中Enol mRNA的量。在特定實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)是(a)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；(b)基于核酸序列的擴(kuò)增試驗(yàn)(NASBA)；(c)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)；(d)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)；或(e)鏈置換擴(kuò)增(SDA)。在特定實(shí)施方案中，將雜交試驗(yàn)用于測量生物樣品中Eno1 mRNA的量。在特定實(shí)施方案中，將與Eno1 mRNA的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸用于雜交試驗(yàn)中來檢測Eno1 mRNA。

本發(fā)明提供了用于檢測生物樣品中的Eno1的試劑盒，其包括至少一種用于測量生物樣品中的Eno1水平的試劑，和一套用于測量Eno1水平的說明。在特定實(shí)施方案中，試劑是抗-Eno1抗體。在特定實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括檢測抗Eno1抗體的工具。在特定實(shí)施方案中，檢測抗Eno1抗體的工具是可檢測的二抗。在特定實(shí)施方案中，試劑是與Eno1 mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸。在特定實(shí)施方案中，說明列出了用于檢測生物樣品中的Eno1水平的免疫分析或ELISA。在特定實(shí)施方案中，說明列出了用于分析生物樣品中的Eno1 mRNA水平的擴(kuò)增反應(yīng)。在特定實(shí)施方案中，將擴(kuò)增反應(yīng)用于測量生物樣品中Enol mRNA的含量。在特定實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)是(a)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；(b)基于核酸序列的擴(kuò)增試驗(yàn)(NASBA)；(c)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)；(d)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)；或(e)鏈置換擴(kuò)增(SDA)。在特定實(shí)施方案中，說明列出了用于測定生物樣品中Enol mRNA的量的雜交試驗(yàn)。在特定實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括至少一種與Enol mRNA的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。在特定實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括至少一種用于測量生物樣品中的HbA1c和/或血糖水平的試劑。在特定實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括用于測量從其獲得生物樣品的受試者中選自HbA1c水平、餐后血糖水平、空腹血糖水平和葡萄糖耐量的至少一種水平的說明。

本發(fā)明提供了用于檢測血糖升高的方法中的試劑組，該試劑組包括用于Eno1和HbA1c的檢測試劑。

本發(fā)明提供了用于治療血糖升高的方法中的試劑組，該試劑組包括用于Eno1和HbA1c的檢測試劑。

本發(fā)明提供了用于監(jiān)控血糖升高的治療的方法中的試劑組，該試劑組包括用于Eno1和HbA1c的檢測試劑。

本發(fā)明提供了含有本文中提供的試劑組和一套用于獲得關(guān)于一種或多種血糖升高指標(biāo)的水平的診斷信息的說明的試劑盒。

本發(fā)明提供了試劑組的用途，所述試劑組包括多種對于在用于診斷和/或治療血糖升高的方法中檢測血糖升高的標(biāo)志物特異性的檢測試劑，其中所述試劑組的至少一種檢測試劑對于檢測Eno1是特異性的，和其中其余的一種或多種檢測試劑對于檢測選自HbA1c和葡萄糖的血糖升高標(biāo)志物指示劑是特異性的。

在上述方法的特定實(shí)施方案中，受試者骨骼肌細(xì)胞中的葡萄糖流量增加。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了提高受試者的葡萄糖流量的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，施用于受試者的藥物組合物是上述任一種藥物組合物。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了提高受試者骨骼肌細(xì)胞中的糖酵解活性或能力的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，施用于受試者的藥物組合物是上述任一種藥物組合物。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了提高受試者骨骼肌細(xì)胞中線粒體游離脂肪酸氧化的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，施用于受試者的藥物組合物是上述任一種藥物組合物。

在特定實(shí)施方案中，受試者具有血糖升高、葡萄糖耐量降低、胰島素敏感性降低和/或胰島素抵抗、糖尿病、Hb1Ac水平升高和異常血糖水平控制中的任何一種或多種。

在上述任一種方法的特定實(shí)施方案中，受試者是人。

在特定方面中，本發(fā)明涉及包含治療有效量的Eno1或其片段的藥物組合物。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物是用于遞送至肌細(xì)胞。在特定方面中，本發(fā)明涉及包含Eno1或其片段和肌肉靶向肽的藥物組合物。在特定實(shí)施方案中，藥物組合物是用于遞送至肌細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，Eno1包括Eno1多肽或其片段。在特定實(shí)施方案中，Eno1包括Eno1核酸或其片段。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括編碼Eno1或其片段的表達(dá)載體。在特定實(shí)施方案中，Eno1或其片段是生物活性的。在特定實(shí)施方案中，Eno1或其片段具有純化內(nèi)源人Eno1多肽的至少90％的活性。在特定實(shí)施方案中，Eno1是人Eno1。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括微粒。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括納米顆粒。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括原位形成組合物。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括脂質(zhì)體。在特定實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，組合物包括含有Eno1多肽和肌肉靶向肽的復(fù)合物。在特定實(shí)施方案中，Eno1多肽是人Eno1多肽。在特定實(shí)施方案中，肌肉靶向肽包含選自ASSLNIA；WDANGKT；GETRAPL；CGHHPVYAC和HAIYPRH的氨基酸序列。在特定實(shí)施方案中，復(fù)合物進(jìn)一步包含連接物。在特定實(shí)施方案中，連接物選自共價(jià)連接物、非共價(jià)連接和可逆連接物。在特定實(shí)施方案中，復(fù)合物進(jìn)一步包括藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物是PAMAN樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物是G5樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物是不帶電的樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物是酰化樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物是PEG化樹狀聚合物或乙?；瘶錉罹酆衔?。

在前述的組合物的特定實(shí)施方案中，復(fù)合物進(jìn)一步包括脂質(zhì)體。在特定實(shí)施方案中，復(fù)合物進(jìn)一步包括微粒。在特定實(shí)施方案中，復(fù)合物進(jìn)一步包括原位形成的組合物。在特定實(shí)施方案中，Eno1在遞送至肌細(xì)胞時(shí)從復(fù)合物釋放。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物和ENO1以約1:1至約10:1的比率存在于復(fù)合物中。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物和ENO1以約3:1至約5:1的比率存在于復(fù)合物中。在特定實(shí)施方案中，肌肉靶向部分和樹狀聚合物以約0.1:1至約10:1的比率存在于復(fù)合物中。在特定實(shí)施方案中，肌肉靶向部分和樹狀聚合物以約1:1至約3:1的比率存在于復(fù)合物中。在特定實(shí)施方案中，Eno1和肌肉靶向部分以約1:1至約1:30的比率存在于復(fù)合物中。

在前述的組合物的特定實(shí)施方案中，組合物配制用于腸胃外施用。在特定實(shí)施方案中，組合物配制用于口服施用。在特定實(shí)施方案中，組合物配制用于肌肉內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用或皮下施用。

在特定方面中，本發(fā)明涉及降低血糖升高的受試者的血糖的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此降低受試者的血糖。

在特定方面中，本發(fā)明涉及提高葡萄糖耐量降低的受試者的葡萄糖耐量的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此提高受試者的葡萄糖耐量。

在特定方面中，本發(fā)明涉及提高具有胰島素敏感性降低和/或胰島素抵性的受試者的胰島素反應(yīng)的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此提高受試者的胰島素反應(yīng)。

在特定方面中，本發(fā)明涉及治療受試者的糖尿病的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此治療受試者的糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病是2型糖尿病或1型糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病是前驅(qū)糖尿病。

在特定方面中，本發(fā)明涉及降低Hb1Ac水平升高的受試者中的Hb1Ac水平的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此降低受試者的Hb1Ac水平。

在特定方面中，本發(fā)明涉及改善具有異常血糖水平控制的受試者的血糖水平控制的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此改善受試者的血糖水平控制。在上述方法的特定實(shí)施方案中，受試者的骨骼肌細(xì)胞中的葡萄糖流量增加。

在特定方面中，本發(fā)明涉及提高受試者的葡萄糖流量的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此提高受試者的葡萄糖流量。

在特定方面中，本發(fā)明涉及提高受試者骨骼肌細(xì)胞中的糖酵解活性或能力的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此提高受試者骨骼肌細(xì)胞中的糖酵解活性或能力。

在特定方法中，本發(fā)明涉及提高受試者骨骼肌細(xì)胞中的線粒體游離脂肪酸氧化的方法，該方法包括將上述任一組合物施用于受試者，由此提高受試者骨骼肌細(xì)胞中的線粒體游離脂肪酸氧化。

在上述方法的特定實(shí)施方案中，通過腸胃外施用Eno1。在上述方法的特定實(shí)施方案中，口服施用Eno1。在特定實(shí)施方案中，通過選自肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下的途徑施用Eno1。在上述方法的特定實(shí)施方案中，受試者具有血糖升高、葡萄糖耐量降低、胰島素敏感性降低和/或胰島素抵抗、糖尿病、Hb1Ac水平升高和異常血糖水平控制中的任何一種或多種。

在特定實(shí)施方案中，上述方法進(jìn)一步包括選擇具有血糖升高、葡萄糖耐量降低、胰島素敏感性降低和/或胰島素抵抗、糖尿病、Hb1Ac水平升高和異常血糖水平控制中的任何一種或多種的受試者。

在前述方法的特定實(shí)施方案中，受試者是人。

下文中提供了其他實(shí)施方案。

附圖說明

圖1A是顯示了用或未用Eno1和胰島素處理的平滑肌成肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的圖。圖1B顯示了用0、500或1000ug/ml Eno1處理但未用胰島素處理的平滑肌成肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取。

圖2A和2B顯示了用0、500或1000μg/ml Eno1處理的人骨骼肌肌管中的Eno1蛋白質(zhì)水平。圖2C顯示了用0、500或1000μg/ml Eno1處理的人骨骼肌肌管中的Eno1活性。

圖3A顯示了原始和熱滅活的Eno1的Eno1活性。圖3B顯示了活性和熱滅活的Eno1的葡萄糖攝取的誘導(dǎo)。

圖4A和4B顯示了用或未用Eno1蛋白處理后，膳食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)小鼠模型中葡萄糖耐量測試的葡萄糖清除的(A)時(shí)間過程和(B)曲線下面積(AUC)。

圖5顯示了通過SDS-PAGE分析的含有各種濃度的Eno1的聚丙烯酰胺凝膠的考馬斯藍(lán)染色。L1：Precision Plus Protein Standard Dual Color，L2：Eno1(10.0μg)，L3：Eno1(1.0μg)，L4：Eno1(0.1μg)。

圖6顯示了通過SDS-PAGE分析的含有各種濃度的Eno1的聚丙烯酰胺凝膠的銀染。L1：Precision Plus Protein Standard Dual Color，L2：Eno1(10.0μg)，L3：Eno1(1.0μg)，L4：Eno1(0.1μg)。

圖7顯示了Eno1的Western印跡分析。L1：Precision Plus Protein Standard Dual Color，L2：Eno1(10.0μg)，L3：Eno1(1.0μg)，L4：Eno1(0.1μg)。

圖8顯示了用2:1比例的Eno1與樹狀聚合物SMTP制得的Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP的Zeta(ζ)電位測量。

圖9顯示了在各種溫度下儲存后，單獨(dú)的Eno1(單獨(dú)烯醇酶)和Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP(烯醇酶/G5-SMC)溶液的標(biāo)準(zhǔn)化活性。

圖10A和10B是(A)熒光標(biāo)記的Eno1-G5-PAMAN樹狀聚合物復(fù)合物和(B)熒光標(biāo)記的肌肉靶向的Eno-1-G5-PAMAM樹狀聚合物復(fù)合物在小鼠中的組織分布的代表性熒光圖像。

圖11是用溶媒、G5-PAMAM樹狀聚合物、G5-PAMAM樹狀聚合物+SMTP、G5-PAMAM樹狀聚合物+Enol、G5-PAMAM樹狀聚合物+Eno1+SMTP中的一種處理的瘦小鼠或DIO小鼠的體重的圖。

圖12是顯示了注射鹽水或G5-PAMAM樹狀聚合物+Eno1+SMTP(50ug/kg)后，在注射后1、4和24小時(shí)具有膳食誘導(dǎo)的肥胖癥的小鼠中血糖水平的圖。

圖13A顯示了用G5-PAMAM樹狀聚合物+SMTP(DIO NP+SMTP)或G5-PAMAM樹狀聚合物+Enol+SMTP(DIO烯醇酶-1+NP+SMTP)處理1周后，瘦小鼠和膳食誘導(dǎo)肥胖癥(DIO)的糖尿病小鼠模型中葡萄糖耐量測試的結(jié)果。圖13B顯示了圖13A中每個(gè)處理組的曲線下面積(AUC)。圖13C和13D顯示了用溶媒、G5-PAMAM樹狀聚合物(G5)、G5-PAMAM樹狀聚合物+SMTP、G5-PAMAM樹狀聚合物+Enol、G5-PAMAM樹狀聚合物+Eno1+SMTP中的一種處理兩周后，瘦小鼠或DIO小鼠的葡萄糖耐量測試中的葡萄糖清除的(C)時(shí)間過程和(D)曲線下面積(AUC)。

圖14A和14B顯示了用溶媒、G5-PAMAM樹狀聚合物、G5-PAMAM樹狀聚合物+SMTP、G5-PAMAM樹狀聚合物+Enol、G5-PAMAM樹狀聚合物+Eno1+SMTP中的一種處理四周后，瘦小鼠或DIO小鼠的葡萄糖耐量測試中葡萄糖清除的(A)時(shí)間過程和(B)曲線下面積(AUC)。

圖15顯示了8周治療后，瘦小鼠、膳食誘導(dǎo)的肥胖癥(DIO)小鼠、用G5-樹狀聚合物處理的DIO小鼠(DIO+NP)和用Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP復(fù)合物處理療的DIO小鼠(DIO+Eno-1+NP+SMTP)中的血清乳酸鹽水平。

圖16A和16B顯示了用溶媒、G5-PAMAM樹狀聚合物(G5)+SMTP和G5-PAMAM樹狀聚合物+Eno1+SMTP(25ug/kg或50ug/kg)中的一種處理一周后，db/db小鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb/J)的腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測試中葡萄糖清除的(A)時(shí)間過程和(B)曲線下面積(AUC)。

圖17A和17B顯示了注射溶媒、所示劑量的G5-PAMAM樹狀聚合物+SMTP和G5-PAMAM樹狀聚合物+Eno1+SMTP后立即開始的時(shí)間過程中獲得的用溶媒、G5-PAMAM樹狀聚合物(G5)+SMTP和G5-PAMAM樹狀聚合物+Eno1+SMTP(25ug/kg或50ug/kg)中的一種處理兩周后db/db小鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb/J)的葡萄糖水平的時(shí)間過程。圖17A顯示了來自全部四個(gè)給藥方案的結(jié)果。圖17B顯示了來自G5-PAMAM樹狀聚合物+SMTP(G5+SMTP)和G5-PAMAM樹狀聚合物+Eno1+SMTP(Eno1+G5+SMTP)50ug/kg的結(jié)果，以顯示30分鐘時(shí)間點(diǎn)時(shí)葡萄糖水平的顯著差異。

圖18顯示了處理兩周后，每日一次皮下注射25μg/kg體重或50μg/kg體重的Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP復(fù)合物對db/db糖尿病小鼠模型的餐后血糖水平的作用。Eno1注射后24小時(shí)在沒有禁食的情況下測量餐后葡萄糖。“NP”是G5-樹狀聚合物。

圖19顯示了每日兩次(早晨和晚上)皮下注射100μg/kg體重或200μg/kg體重的Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP復(fù)合物對db/db糖尿病小鼠模型的餐后血糖水平的作用。

圖20顯示了用G5-PAMAM樹狀聚合物(G5)、G5-PAMAM樹狀聚合物+SMTP(G5-SMC)和?；疓5-PAMAM樹狀聚合物+SMTP(G5-SMC-Ac)處理后檢測的肌酸激酶和半胱天冬酶3活性。

圖21顯示了用或未用Eno1和胰島素處理的人骨骼肌肌管中的p-Akt蛋白水平。

圖22A顯示了用或未用純化的Eno1處理的人骨骼肌肌管中的Glut1、Glut4、HK2和成肌素mRNA水平。圖22B顯示了用或未用純化的Eno1處理的人骨骼肌肌管中的Glut1蛋白水平。Glut1蛋白水平是通過核糖體蛋白中值標(biāo)準(zhǔn)化的相對單位。

圖23顯示了用或未用純化的Eno1處理的葡萄糖饑餓(上圖)和葡萄糖刺激(下圖)的人骨骼肌肌管中的葡萄糖-6-磷酸(G6P)水平。

圖24顯示了用或未用純化的Eno1處理的葡萄糖饑餓(上圖)和葡萄糖刺激(下圖)的人骨骼肌肌管中的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)水平。

圖25顯示了用或未用純化的Eno1處理的，順序地用棕櫚酸鹽、CCCP和乙莫克舍(etomoxir)處理的人骨骼肌肌管(HSMM)培養(yǎng)物中的氧消耗率(OCR)。

圖26顯示了用或未用純化的Eno1處理的，順序地用葡萄糖、寡霉素(oligomycin)和2-DG處理的人骨骼肌肌管(HSMM)培養(yǎng)物中的細(xì)胞外酸化率(ECAR)。

圖27A顯示了用500μg/ml或1000μg/ml Eno1處理的人骨骼肌肌管中相對于未處理的對照人骨骼肌肌管的線粒體含量。線粒體含量通過在Eno1處理48小時(shí)后將Mitotracker Green(一種綠色熒光線粒體染料)加入細(xì)胞中來測定。

圖27B顯示了用500μg/ml或1000μg/ml Eno1處理的人骨骼肌肌管中相對于未處理的對照人骨骼肌肌管(Eno1 0ug/ml)的線粒體活性氧物質(zhì)(Mito-ROS)產(chǎn)生。通過用二氫若丹明123處理細(xì)胞來測定Mito-ROS，二氫若丹明123是一種不帶電的和非熒光的活性氧物質(zhì)(ROS)指示劑，其可以被動跨膜擴(kuò)散，在此處其氧化成陽離子若丹明123(其定位于線粒體中并且呈現(xiàn)綠色熒光)。二氫若丹明123處理后，將肌管胰蛋白酶化、洗滌并接受流式細(xì)胞分析以測定Mito-ROS水平。

圖28A顯示了用0、500或1000μg/ml Eno1處理的骨骼肌肌管中的5’AMP激活蛋白激酶(AMPK)和磷酸化AMPK(pAMPK)水平。將核纖層蛋白A/C用作加樣對照。

圖28B顯示了用0、500或1000μg/ml Eno1處理的基礎(chǔ)或血清饑餓的骨骼肌肌管中的pAMPK(p-AMPK)與AMPK的比例。

圖29顯示了描述Nampt在Eno1作用模式中的潛在作用的工作模型的示意圖。

圖30顯示了相對于未處理的對照人骨骼肌肌管(Eno1 0ug/ml)，在4天分化后在分化培養(yǎng)基中用500ug/ml或1000μg/ml Eno1處理48小時(shí)的人骨骼肌肌管中的Nampt活性。

圖31顯示了用重組細(xì)胞外Nampt(eNampt)處理的血清饑餓人骨骼肌肌管中的2-DG攝取。

圖32顯示了在存在或不存在Nampt抑制劑FK866的情況下，在4天分化后在分化培養(yǎng)基中用0、500或1000μg/ml Eno1處理48小時(shí)的人骨骼肌肌管中的葡萄糖攝取。在開始Eno1處理后24小時(shí)加入FK866，并且用FK866處理肌管24小時(shí)。在3小時(shí)血清饑餓后測量2-DG攝取。FK866的Nampt抑制消除了Eno1誘導(dǎo)的葡萄糖攝取。

圖33顯示了糖酵解途徑的示意圖。

圖34A和34B顯示了人Eno1，變體1(NCBI登錄號NM_001428.3)的(A)氨基酸序列(SEQ ID NO:2)和(B)核酸編碼序列(SEQ ID NO:1)。

圖35A和35B顯示了人Eno1，變體2(NCBI登錄號NM_001201483.1)的(A)氨基酸序列(SEQ ID NO:4)和(B)核酸編碼序列(SEQ ID NO:3)。人Eno1，變體2蛋白也稱為MBP-1。

圖36A顯示了ENO2mRNA的核酸序列(SEQ ID NO:5)。圖36B顯示了Eno2的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。

圖37A和37B分別顯示了ENO3mRNA的變體1(SEQ ID NO:7)和變體2(SEQ ID NO:8)的核酸序列。圖37C顯示了Eno3蛋白的異形體1(SEQ ID NO:9)，其由變體1和變體2兩者編碼。圖37D顯示了ENO3mRNA的變體3的核酸序列(SEQ ID NO:10)。圖37E顯示了Eno3的異形體2的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)，其由變體3編碼。與變體1相比，ENO3mRNA的變體3在5’UTR中不同并且在5’編碼區(qū)缺少兩個(gè)外顯子。Eno3蛋白的異形體2比異形體1短，但具有相同的N-和C-末端。

具體實(shí)施方式

使用發(fā)現(xiàn)平臺技術(shù)來描繪驅(qū)動糖尿病的病理生理的明顯不同的分子印記。通過這種發(fā)現(xiàn)平臺技術(shù)將Eno1鑒別為在人原發(fā)性體外糖尿病模型中被顯著調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。本文中隨后討論的體外和體內(nèi)研究證實(shí)了Eno1在胰島素依賴性和非胰島素依賴性葡萄糖攝取、葡萄糖耐受性、胰島素敏感性和/或糖尿病中的作用，所述糖尿病例如為1型糖尿病、2型糖尿病、前驅(qū)糖尿病和妊娠糖尿病。更具體地，用Eno1蛋白處理人肌管證明了提高肌管中非胰島素依賴性和胰島素依賴性葡萄糖攝取兩者，表明Eno1在1型和2型糖尿病兩者的治療中以及在存在和不存在胰島素和/或胰島素反應(yīng)的兩種情況中的葡萄糖攝取中的作用。此外，Eno1蛋白的施用(單獨(dú)地或在骨骼肌靶向樹狀聚合物的環(huán)境中)改善了小鼠膳食誘導(dǎo)的肥胖癥模型中的葡萄糖耐受性，并且預(yù)期在1型和2型糖尿病的遺傳模型中具有相似結(jié)果。這些結(jié)果證明了Eno1在使葡萄糖和胰島素反應(yīng)正?；惺怯行У模⑶乙虼吮砻鱁no1可用于改善葡萄糖耐受性和提高胰島素敏感性/降低胰島素抵抗，因此可用于治療糖尿病。

I.定義

烯醇酶1，(α)，也稱為ENO1L、α-烯醇酶、烯醇酶-α、tau-晶體蛋白、非神經(jīng)烯醇酶(NNE)、α烯醇酶樣1、磷酸丙酮酸水合酶(PPH)、纖溶酶原結(jié)合蛋白、MYC啟動子結(jié)合蛋白1(MPB1)和2-磷酸-D-甘油酸水解酶，是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的三種烯醇酶同工酶中的一種。本文在圖34和35中提供了人Eno1異形體的蛋白質(zhì)和核酸序列。本申請?zhí)峁┝擞糜谌思膊≈委煹娜税被岷秃怂嵝蛄?。然而，將理解本發(fā)明的組合物和方法可以通過選擇待處理物種的Eno1容易地適應(yīng)于非人動物的治療。非人物種的Eno1的氨基酸和核酸序列是本領(lǐng)域已知的并且可以在例如ncbi.nlm.nih.gov/genbank/中找到。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法中使用的Eno1是哺乳動物Eno1。在優(yōu)選實(shí)施方案中，Eno1是人Eno1。

如本文中使用的，“Eno1的施用”，除非另外指出，理解為Eno1蛋白或用于Eno1蛋白表達(dá)的核酸構(gòu)建體的施用。在特定實(shí)施方案中，Eno1蛋白可以包括Eno1蛋白片段或用于編碼Eno1蛋白片段的核酸。在特定實(shí)施方案中，Eno1的施用是Eno1蛋白的施用。在特定實(shí)施方案中，Eno1的施用是Eno1多核苷酸的施用。本文中提供了人Eno1的蛋白質(zhì)和核酸序列。在特定實(shí)施方案中，Eno1的施用包括人Eno1的第一變體或第二變體的施用。在特定實(shí)施方案中，Eno1的施用包括人Eno1的第一變體和第二變體的施用。在特定實(shí)施方案中，Eno1的施用包括人Eno1的第一變體的施用。在特定實(shí)施方案中，Eno1的施用包括人Eno1的第二變體的施用。在特定實(shí)施方案中，Eno1的施用包括僅人Eno1的第一變體的施用。在特定實(shí)施方案中，Eno1的施用包括僅人Eno1的第二變體的施用。

如本文中使用的，“生物活性的”是指具有內(nèi)源性Eno1蛋白的至少一種活性的Eno1分子或其片段。例如，在一些實(shí)施方案中，生物活性Eno1分子或其片段催化2-磷酸-D-甘油酸(PGA)脫水成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。在一些實(shí)施方案中，生物活性Eno1分子或其片段催化PEP水合成PGA。在一些實(shí)施方案中，生物活性Eno1分子或其片段提高細(xì)胞的葡萄糖攝取，所述細(xì)胞例如為肌細(xì)胞，優(yōu)選骨骼肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，生物活性Eno1分子或其片段降低血糖水平，例如，餐后血糖水平或葡萄糖耐量測試中的血糖水平。在一些實(shí)施方案中，生物活性Eno1分子或其片段結(jié)合Nampt，例如，細(xì)胞外Nampt(eNampt)。

如本文中使用的，“施用于肌肉”、“遞送至肌肉”或“遞送至肌細(xì)胞”包括骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等理解為將有效劑量的Eno1提供給肌肉，例如，肌細(xì)胞的制劑、方法或其組合，以提供所需的全身性效應(yīng)，例如，血糖異常受試者中血糖的正?；?，例如，通過提高葡萄糖耐量和/或胰島素敏感性，或治療糖尿病。在特定實(shí)施方案中，將Eno1配制用于直接施用于肌肉，并且優(yōu)選停留在肌肉中。在特定實(shí)施方案中，用于直接施用于肌肉(即，肌肉內(nèi)施用)的Eno1制劑，優(yōu)選是持續(xù)釋放制劑允許相對低的施用頻率(例如，每周一次或更少，每隔一周或更少，每月一次或更少，每隔一月一次或更少，每三個(gè)月一次或更少，每四個(gè)月一次或更少，每五個(gè)月一次或更少，每六個(gè)月一次或更少)。在特定實(shí)施方案中，Eno1連接于靶向部分以提高Eno1至肌肉的遞送，使得不是必需將Eno1直接遞送至肌肉(例如，皮下或靜脈內(nèi)遞送)。將理解施用于肌肉不需要將整個(gè)劑量的Eno1遞送至肌肉或肌細(xì)胞中。在特定實(shí)施方案中，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％的Eno1遞送至肌肉，優(yōu)選骨骼肌和/或平滑肌。在特定實(shí)施方案中，遞送至肌細(xì)胞的非肌肉內(nèi)施用肌肉靶向Eno1的量比遞送至肌肉的非靶向Eno1的量高約1.5倍或更高倍，2倍或更高倍，3倍或更高倍，4倍或更高倍，5倍或更高倍，或者6倍或更高倍。在特定實(shí)施方案中，將Eno1遞送至骨骼肌。在特定實(shí)施方案中，將Eno1遞送至平滑肌。在特定實(shí)施方案中，將Eno1遞送至骨骼肌和平滑肌。在特定實(shí)施方案中，與平滑肌相比，Eno1優(yōu)先或以更高量遞送至骨骼肌。在特定實(shí)施方案中，遞送至肌肉的至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多Eno1遞送至骨骼肌。在特定實(shí)施方案中，Eno1不遞送至平滑肌。測定通過靶向部分的有效載荷的相對靶向的試驗(yàn)是本領(lǐng)域已知的，并且例如在Samoylova等，1999,Muscle Nerve,22:460-466中提供，其按引用并入本文中。

如本文中使用的，“肌肉靶向部分”包括至少肌肉靶向肽(MTP)，例如，骨骼肌和/或平滑肌靶向肽(SMTP)。在特定實(shí)施方案中，靶向部分包括結(jié)合整聯(lián)蛋白αvβ5或αvβ3整聯(lián)蛋白的配體。在特定實(shí)施方案中，靶向部分包括CD-46配體。在特定實(shí)施方案中，靶向部分包括腺病毒peton蛋白，任選地結(jié)合腺病毒35纖維蛋白。在特定實(shí)施方案中，肌肉靶向Eno1的至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％通過肌肉靶向部分遞送至肌肉，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選骨骼肌和/或平滑肌。在特定實(shí)施方案中，遞送至肌細(xì)胞的非肌肉內(nèi)施用肌肉靶向Eno1的量比遞送至肌肉的非靶向Eno1的量高約1.5倍或更高倍，2倍或更高倍，3倍或更高倍，4倍或更高倍，5倍或更高倍，或者6倍或更高倍。

如本文中使用的，“肌肉靶向肽”或“MTP”理解為提高其有效載荷(例如，Eno1)遞送至肌細(xì)胞(優(yōu)選骨骼肌和/或平滑肌細(xì)胞)的肽序列。MTP是本領(lǐng)域已知的并且例如在美國專利No.6329501；美國專利公開No.20110130346和Samoylova等，1999,Muscle and Nerve 22:460-466中提供，將其每一篇全部按引用并入本文中。在特定實(shí)施方案中，MTP是骨骼肌靶向肽?！肮趋兰“邢螂摹笔翘岣咂溆行лd荷(例如，Eno1)遞送至骨骼肌細(xì)胞的肽序列。在特定實(shí)施方案中，MTP是平滑肌靶向肽。“平滑肌靶向肽”是提高其有效載荷(例如，Eno1)遞送至平滑肌細(xì)胞的肽序列。在特定實(shí)施方案中，MTP提高其有效載荷(例如，Eno1)遞送至骨骼細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞。在特定實(shí)施方案中，MTP，例如，骨骼肌靶向肽和/或平滑肌靶向肽，沒有提高其有效載荷遞送至心肌細(xì)胞。MTP，例如，骨骼肌靶向肽包括，但不限于，包含以下序列的肽：ASSLNIA；WDANGKT；GETRAPL；CGHHPVYAC和HAIYPRH。在優(yōu)選實(shí)施方案中，MTP包含氨基酸序列ASSLNIA。

如本文中使用的，“有效載荷”理解為用于通過靶向部分遞送至靶細(xì)胞的部分。在特定實(shí)施方案中，有效載荷是肽，例如，Eno1肽。在特定實(shí)施方案中，有效載荷是核酸，例如，編碼Eno1肽的核酸。在特定實(shí)施方案中，有效載荷進(jìn)一步包括與Enol有效載荷一起遞送至靶細(xì)胞的其他組分(例如，樹狀聚合物、脂質(zhì)體、微粒)或藥劑(例如，治療劑)。

如本文中使用的，“連接物”理解為將靶向部分和有效載荷足夠接近地并置以使得有效載荷通過靶向部分遞送至所需的位點(diǎn)的部分。在特定實(shí)施方案中，連接物是共價(jià)連接物，例如，交聯(lián)劑，包括可逆交聯(lián)劑；肽鍵，例如，其中有效載荷是與靶向部分共翻譯的蛋白質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，連接物共價(jià)連接于有效載荷或靶向部分之一，并與另一個(gè)非共價(jià)連接。在特定實(shí)施方案中，連接物包括樹狀聚合物。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物共價(jià)連接于靶向部分并且非共價(jià)連接于有效載荷，例如，Eno1。在特定實(shí)施方案中，連接物是脂質(zhì)體或微粒，并且靶向部分暴露于脂質(zhì)體的表面上，并且有效載荷(例如，Eno1)包封在脂質(zhì)體或微粒中。在特定實(shí)施方案中，連接物和Eno1存在于微粒連接物的表面上。在特定實(shí)施方案中，靶向部分存在于病毒顆粒的表面上并且有效載荷包括編碼Eno1的核酸。

如本文中使用的，“連接的”、“可操作地連接的”、“接合的”等是指其中所描述的組分存在于允許它們以預(yù)定的方式起作用的復(fù)合物中的并置。組分可以共價(jià)連接(例如，肽鍵、二硫鍵、非天然化學(xué)鍵)、通過氫鍵連接(例如，蛋白質(zhì)的鈕-扣(knob-into-holes)配對，參見，例如，美國專利5,582,996；Watson-Crick核苷酸配對)，或者直接或通過連接物(例如，肽序列，通常為短肽序列；核酸序列；或化學(xué)連接物，包括使用用于連接于高階或較大結(jié)構(gòu)(包括微粒、珠子或樹狀聚合物)的連接物)的離子結(jié)合(例如，螯合劑和金屬)。如本文中使用的，復(fù)合物的組分可以通過包裝在脂質(zhì)體和/或樹狀聚合物之中和/或之上而彼此連接，其中復(fù)合物的一些組分可以共價(jià)連接，而一些非共價(jià)連接。連接物可以用于提供活性分子之間的分離，使得通過將第一分子連接于第二分子而分子的活性基本上沒有受到抑制(低于10％，低于20％，低于30％，低于40％，低于50％)。連接物可以用于例如將Eno1連接于靶向部分。如本文中使用的，在其中使用本發(fā)明試劑的情況(即，通常是生理?xiàng)l件)下，連接的(但非共價(jià)接合的)分子具有低于10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11或10^-12，或那些值包括的任何范圍的彼此結(jié)合親和性(Kd)。

在特定實(shí)施方案中，有效負(fù)荷和靶向部分以約1:1摩爾比存在于復(fù)合物中。在特定實(shí)施方案中，靶向部分以相對于有效負(fù)荷的摩爾過量存在于復(fù)合物中。在特定實(shí)施方案中，有效負(fù)荷與靶向部分的比例為約0.1:1，約0.2:1，約0.3:1，約0.4:1，約0.5:1，約0.6:1，約0.7:1，約0.8:1，約0.9:1，約1:1，約2:1，約3:1，約4:1，約5:1，約6:1，約7:1，約8:1，約9:1，約10:1，約11:1，約12:1，約13:1，約14:1，約15:1，約16:1，約17:1，約18:1，約19:1或約20:1。

“樹狀聚合物”是由多個(gè)從中央核心徑向發(fā)射的分支單體組成的聚合分子。由于用于產(chǎn)生樹狀聚合物的結(jié)構(gòu)和合成方法，來自樹狀聚合物合成的產(chǎn)物理論上是單分散性的。當(dāng)除去樹狀聚合物的核心時(shí)，保留多個(gè)稱為樹突(dendron)的相同片段，樹突的數(shù)量取決于中央核心的多重性。從核心向外緣移向外緣時(shí)遇到的分支點(diǎn)的數(shù)量限定了其代數(shù)(generation)，例如，G-1、G2、G-3等，較高代的樹狀聚合物與較低代數(shù)的樹狀聚合物相比更大、分支更多并且具有更多的末端基團(tuán)。如本文中使用的，樹狀聚合物優(yōu)選是藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物。

如本文中使用的，“血糖升高的受試者”或“提高的血糖”理解為具有認(rèn)為是病理狀態(tài)的足夠持續(xù)時(shí)間和頻率的血糖升高的受試者，即沒有產(chǎn)生足夠的胰島素或?qū)σ葝u素不夠敏感的受試者而使得受試者的葡萄糖水平在進(jìn)食后的延長時(shí)間段內(nèi)保持升高，例如，進(jìn)食后持續(xù)超過兩小時(shí)，和/或具有升高的空腹血糖的受試者。在特定實(shí)施方案中，血糖升高的受試者理解為具有至少100mg/dl的空腹血糖和在75-g口服葡萄糖耐量測試中至少140mg/dl的2-小時(shí)血糖之一或兩者的受試者。在特定實(shí)施方案中，血糖升高的受試者理解為具有至少126mg/dl的空腹血糖；在75-g口服葡萄糖耐量測試中至少200mg/dl的2-小時(shí)血糖；或至少200mg/dl的隨機(jī)血糖中的一種或多種的受試者。在特定實(shí)施方案中，血糖升高的受試者理解為具有至少92mg/dl的空腹血糖；在75-g口服葡萄糖耐量測試中至少180mg/dl的1-小時(shí)血糖；和在75-g口服葡萄糖耐量測試中至少153mg/dl的2-小時(shí)血糖中的一種或多種的妊娠受試者。在如本文中使用的特定實(shí)施方案中，血糖升高的受試者不包括患有1型糖尿病或?qū)е陆^對胰島素缺陷的胰腺疾病的受試者。在如本文中使用的特定實(shí)施方案中，血糖升高的受試者包括患有1型糖尿病或?qū)е陆^對胰島素缺陷的胰腺疾病的受試者。

如本文中使用的，“HbA1c升高的受試者”或“A1c升高的受試者”理解為具有至少5.7％的HbA1c水平的受試者。在特定實(shí)施方案中，受試者具有至少6.5％的HbA1c水平。

如本文中使用的，“糖尿病”旨在指1型糖尿病或2型糖尿病，或1型和2型糖尿病兩者，任選地結(jié)合妊娠糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病包括2型糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病不包括1型糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病包括妊娠糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病不包括妊娠糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病包括前驅(qū)糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病包括前驅(qū)糖尿病、1型糖尿病和2型糖尿病。在特定實(shí)施方案中，糖尿病包括前驅(qū)糖尿病和2型糖尿病。

如本文中使用的，“胰島素抵抗”和“胰島素不敏感性”可以互換使用并指其中胰島素的量在降低血糖中的有效性比正常受試者低而導(dǎo)致血糖提高高于正常范圍(其不是由于胰島素的缺乏)的狀況，尤其是病理狀況。不希望受到機(jī)理的束縛，所述狀況通常與通過胰島素受體的信號傳導(dǎo)降低相關(guān)。通常，肌肉和脂肪細(xì)胞中的胰島素抵抗分別降低葡萄糖攝取以及作為糖原和甘油三酯的儲存。肝細(xì)胞中的胰島素抵抗導(dǎo)致降低的糖原合成并且不能抑制葡萄糖產(chǎn)生和釋放至血液中。

胰島素抵抗常常與“胰島素不足”一起存在于同一受試者中，其也導(dǎo)致非由于胰島素的缺乏引起的高于正常范圍的血糖提高，尤其是血糖的病理性提高。胰島素不足是與缺乏胰島素作用相關(guān)的狀況，其中胰島素存在并由身體產(chǎn)生。這與其中由于缺乏胰島細(xì)胞而不產(chǎn)生胰島素的1型糖尿病明顯不同。

對于本發(fā)明方法的目的，不需要區(qū)分受試者是否患有胰島素抵抗/不敏感性、胰島素不足或兩者。

術(shù)語“受損的葡萄糖耐量”(IGT)或“前驅(qū)糖尿病”用于描述在給予葡萄糖耐量測試時(shí)具有落入正常和高血糖之間的血糖水平的人員，即，具有異常的葡萄糖耐量，例如，病理上異常的葡萄糖耐量。這樣的人員處于產(chǎn)生糖尿病的較高風(fēng)險(xiǎn)中，盡管他們在臨床上沒有表征為患有糖尿病。例如，受損的葡萄糖耐量是指其中患者高于110mg/dl并低于126mg/dl(7.00mmol/L)的空腹血糖濃度或空腹血清葡萄糖濃度，或高于140mg/dl(7.78mmol/L)并低于200mg/dl(11.11mmol/L)的2小時(shí)餐后血糖或血清葡萄糖濃度的狀況。前驅(qū)糖尿病，也稱為受損的葡萄糖耐量或受損的空腹血糖是產(chǎn)生2型糖尿病、心血管疾病和死亡的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。許多焦點(diǎn)已經(jīng)放在研發(fā)通過有效治療前驅(qū)糖尿病來防止2型糖尿病發(fā)生的治療干預(yù)上(Pharmacotherapy,24:362-71,2004)。

如本文中使用的，“病理”狀況達(dá)到疾病或病癥的臨床上可接受的閾值。如果病理狀況沒有解決，例如，血糖和/或HbA1c沒有正常化，病理狀況可以導(dǎo)致對受試者的顯著的不良作用，特別是長期的。病理狀況可以通過治療劑、外科手術(shù)和/或生活方式改變來逆轉(zhuǎn)。病理狀況可以是或不是慢性的。病理狀況可以是或不是可逆的。病理狀況可以是或不是終末的。

“高胰島素血癥”定義為其中受試者具有胰島素抵抗而具有或不具有正常血糖的病癥，其中空腹或餐后血清或血漿胰島素濃度升高高于不具有胰島素抵抗的正常瘦個(gè)體的血清或血漿胰島素濃度(即，空腹血糖測試中>100mg/dl，或在口服葡萄糖耐量測試中>140mg/dl)。

“高血糖癥”(高血糖)的病癥是其中血糖水平太高的狀況。通常，在血糖水平升高高于180mg/dl時(shí)產(chǎn)生高血糖癥。高血糖癥的癥狀包括尿頻、煩渴以及在較長時(shí)間跨度內(nèi)的體重減輕。

“低血糖癥”(低血糖)的病癥是其中血糖水平太低的狀況。通常，在血糖水平下降低于70mg/dl時(shí)產(chǎn)生低血糖癥。低血糖癥的癥狀包括情緒化、四肢麻木(尤其是手和臂中)、混亂、顫抖和頭昏。由于這種狀況在存在超過可利用葡萄糖量的過量胰島素時(shí)產(chǎn)生，因此其有時(shí)候也稱為胰島素反應(yīng)。

如本文中使用的，“HbA1c水平”或“A1c水平”理解為從HbA1c測試測定的血紅蛋白A1c(HbA1c)水平，其評價(jià)了之前兩個(gè)和三個(gè)月期間的平均血糖水平。沒有糖尿病的人員通常具有4％至6％范圍中的HbA1c值。前驅(qū)糖尿病特征在于5.7％至6.5％的病理性HbA1c水平，其中高于6.5％的HbA1c水平指示糖尿病。HbA1c的每1％的提高反映出血糖水平提高大約30mg/dL，并且由于持久的血糖升高導(dǎo)致的提高的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明待治療的患者的HbA1c值降低至低于9％，低于7％，低于6％，并且最優(yōu)選至約5％。因此，待治療患者的過量HbA1c水平(即，超過5.7％的HbA1c水平)相對于治療前的該水平優(yōu)選降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多(即，治療前水平-治療后水平/治療前水平)。

如本文中使用的，術(shù)語“受試者”是指人和非人動物，包括獸醫(yī)學(xué)受試者。術(shù)語“非人動物”包括全部脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類、小鼠、兔、綿羊、狗、貓、馬、奶牛、雞、兩棲動物和爬行動物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人并且可以稱為患者。

如本文中使用的，術(shù)語“治療(treat)”、“處理(treating)”或“療法(treatment)”優(yōu)選是指獲得有益或所需臨床結(jié)果的活動，所述臨床結(jié)果包括但不限于，疾病或病癥的一個(gè)或多個(gè)體征或癥狀的緩解或改善、減弱疾病的程度、疾病的穩(wěn)定狀態(tài)(即，沒有惡化)、疾病狀態(tài)的改善或緩和。如本文中使用的，治療可以包括胰島素抵抗的減輕、提高胰島素敏感性、降低胰島素缺陷、提高或正?；疕bAc1水平、改善或正?；疕bAc1水平、改善或正?；撬?例如，餐后血糖水平、空腹血糖水平、葡萄糖耐量)和改善糖尿病的至少一種體征或癥狀中的一種或多種。糖尿病(包括2型糖尿病)治療中的治療目標(biāo)包括<6.5％的HbAc1水平；餐前血糖80-120mg/dl；和餐后2小時(shí)血糖<140mg/dl。前驅(qū)糖尿病治療的治療目標(biāo)包括將HbA1c、血糖水平和葡萄糖反應(yīng)降低至正常水平。治療不需要是治愈性的，或達(dá)到治療的理想治療目標(biāo)。治療結(jié)果不需要定量地測定。然而，在特定實(shí)施方案中，治療結(jié)果可以通過考慮朝向范圍末端的正常值的百分改善來定量。例如，代謝癥狀特征在于一些測量值(例如，血糖水平、HbA1c水平)的過量和其他測量值(例如，胰島素反應(yīng))的不足。具有150mg/dl空腹血糖水平的受試者將具有50mg/dl(150mg/dl-100mg/dl，最大正常血糖水平)的過量空腹血糖。過量血糖降低20％將是過量血糖的10mg/dl降低。對其他值可以進(jìn)行相似的計(jì)算。

如本文中使用的，“降低血糖水平”表示將過量的血糖降低至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高，以獲得正?；难撬剑?，不高于150mg/dl的血糖水平。理想地，餐前的血糖水平降低至正常血糖水平，即，150至60mg/dL，140至70mg/dL，130至70mg/dL，125至80mg/dL，并優(yōu)選120至80mg/dL?？梢酝ㄟ^提高與血液的葡萄糖清除相關(guān)的任一種生物活性來獲得這樣的血糖水平降低。因此，具有降低血糖水平能力的藥劑可以提高胰島素產(chǎn)生、分泌或作用。例如，可以通過提高外周組織的葡萄糖攝取和/或通過降低肝葡萄糖產(chǎn)生來提高胰島素作用。或者，藥劑可以降低腸的碳水化合物吸收，改變葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(例如，通過提高GLUT4表達(dá)、固有活性或易位)，增加胰島素敏感性組織的量(例如，通過提高肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞分化)或改變脂肪細(xì)胞或肌細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄(例如，改變從代謝途徑基因的脂肪細(xì)胞表達(dá)的因子分泌)。理想地，藥劑提高與葡萄糖清除相關(guān)的超過一種活性。

“改變胰島素信號傳導(dǎo)途徑使得血糖水平降低”表示改變(通過提高或降低)涉及胰島素信號傳導(dǎo)的任一種活性，使得整體結(jié)果是血漿的葡萄糖清除的提高和使血糖正?；?。例如，改變胰島素信號傳導(dǎo)途徑，由此引起胰島素產(chǎn)生、分泌或作用的提高，提高外周組織的葡萄糖攝取，降低肝葡萄糖產(chǎn)生或降低腸的碳水化合物吸收。

“治療有效量”是足以治療受試者的疾病的量?？梢栽谝淮位蚨啻问┯弥惺┯弥委熡行Я?。

用于2型糖尿病的多種治療是本領(lǐng)域已知的，包括藥物干預(yù)和行為干預(yù)兩者。用于2型糖尿病治療的藥物包括，但不限于，美格列奈類(瑞格列奈(Prandin)和那格列奈(Starlix))；磺酰脲類(格列甲嗪(Glucotrol)、格列美脲(Amaryl)和格列本脲(DiaBeta，Glynase))；二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑(沙格列汀(Onglyza)、西格列汀(Januvia)和利拉利汀(Tradjenta))；雙胍類(二甲雙胍(Fortamet，Glucophage))；噻唑烷二酮類(羅格列酮(Avandia)和匹格列酮(Actos))；和α-葡糖苷酶抑制劑(阿卡波糖(Precose)和米格列醇(Glyset))。胰島素通常只用于晚期2型糖尿病的治療中，并且包括速效胰島素(門冬胰島素(NovoLog)，谷賴胰島素(Apidra)和賴脯胰島素(Humalog)；短效胰島素(普通胰島素(Humulin R，Novolin R))；中效胰島素(人胰島素NPH(Humulin N，Novolin N))和長效胰島素(甘精胰島素(Lantus)和地特胰島素(Levemir))。用于糖尿病的治療還可以包括行為矯正，包括鍛煉和體重減輕，其可以通過使用藥物或外科手術(shù)來促進(jìn)。針對升高的血糖和糖尿病的治療可以結(jié)合。例如，藥物治療可以與行為矯正治療結(jié)合。

如本文中使用的“診斷”等是指基于觀察、檢驗(yàn)或情況對患者狀況的臨床或其他評價(jià)而用于基于至少一種指征的存在，如疾病、失調(diào)或病癥的體征或癥狀，鑒別受試者為患有疾病、失調(diào)或病癥。通常，使用本發(fā)明方法的診斷包括與本文中提供的方法結(jié)合的針對疾病、失調(diào)或病癥的多個(gè)指征對受試者的觀察。診斷方法提供疾病存在或不存在的指示。單一診斷測試通常不提供關(guān)于所測試受試者疾病狀況的確切結(jié)論。

如本文中使用的，“監(jiān)控”理解為在第一時(shí)間點(diǎn)和在之后的第二時(shí)間點(diǎn)評價(jià)受試者中疾病的至少一個(gè)體征或癥狀，比較病癥的體重或癥狀的嚴(yán)重程度，并確定病癥隨著時(shí)間加重或是減輕。

術(shù)語“用藥(administer)”、“給藥(administering)”或“施用(administration)”包括將藥物組合物或藥劑遞送至受試者系統(tǒng)中或者至受試者體內(nèi)或之上的特定區(qū)域的任何方法。在特定實(shí)施方案中，藥劑經(jīng)腸或腸胃外施用。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，藥劑通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)皮或經(jīng)粘膜施用。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過注射或輸注施用藥劑，例如，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下。在特定實(shí)施方案中，施用包括使用泵。在特定實(shí)施方案中，局部或全身性地施用藥劑?？梢酝ㄟ^協(xié)同工作的多名人員來進(jìn)行藥劑施用。施用藥劑包括，例如，對受試者開出待施用的藥劑和/或提供直接地或通過另一種手段服用特定的藥劑(通過自身遞送，例如，通過口服遞送、皮下遞送、通過中心線的靜脈內(nèi)遞送等；或用于通過受訓(xùn)人員的遞送，例如，靜脈內(nèi)遞送、肌肉內(nèi)遞送等)的說明。

如本文中使用的，術(shù)語“共同施用”是指在用于糖尿病、前驅(qū)糖尿病、葡萄糖不耐性或胰島素抵抗治療的藥劑施用前、同時(shí)或基本上同時(shí)、之后或與其間斷地施用Eno1。本文中提供的Eno1制劑可以用于與至少一種用于糖尿病、前驅(qū)糖尿病、葡萄糖不耐性或胰島素抵抗治療的其他治療劑的聯(lián)合療法中。Eno1和/或其藥物制劑及其他治療劑可以疊加地或更優(yōu)選地協(xié)同地發(fā)揮作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，Eno1和/或其制劑與用于糖尿病、前驅(qū)糖尿病、葡萄糖不耐性或胰島素抵抗治療的另一治療劑的施用同時(shí)施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在用于糖尿病、前驅(qū)糖尿病、葡萄糖不耐性或胰島素抵抗治療的另一治療劑的施用之前或之后施用Eno1和/或其制劑。

如本文中使用的術(shù)語“樣品”是指從受試者分離的相似流體、細(xì)胞或組織的集合。術(shù)語“樣品”包括來自受試者的任何體液(例如，尿液、血清、血液、淋巴、婦科流體、囊液、腹水液、眼內(nèi)液和通過支氣管灌洗和/或腹腔沖洗收集的流體)、腹水、組織樣品或細(xì)胞。其他受試者樣品包括淚滴、血清、腦脊液、糞便、痰液和細(xì)胞提取物。在特定的實(shí)施方案中，樣品是尿液或血清。在特定實(shí)施方案中，樣品包括細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，樣品不包括細(xì)胞。

如本文中使用的，術(shù)語“對照樣品”，是指任何臨床上相關(guān)的比較樣品，包括，例如，來自未患受損的葡萄糖耐量、提高的血糖、胰島素抵抗、糖尿病或前驅(qū)糖尿病中任何一種的健康受試者的樣品；或在受試者的較早時(shí)間點(diǎn)(例如，在治療前，在治療的較早階段)來自受試者的樣品。對照樣品可以是用試劑盒提供的純化樣品、蛋白質(zhì)和/或核酸。這樣的對照樣品可以例如在系列稀釋中稀釋以允許測試樣品中分析物的定量測量。對照樣品可以包括源自一名或多名受試者的樣品。對照樣品還可以是在較早時(shí)間點(diǎn)從待評價(jià)的受試者制得的樣品。例如，對照樣品可以是在異常血糖水平或A1c水平發(fā)作之前、在疾病的較早階段或者在施用治療或部分治療之前從待評價(jià)的受試者獲取的樣品。對照樣品還可以是來自動物模型或來自源自動物模型的組織或細(xì)胞系的樣品，所述動物模型是受損的葡萄糖耐量、提高的血糖、胰島素抵抗、糖尿病或前驅(qū)糖尿病的動物模型。可以測定由一組測量組成的對照樣品中Eno1活性或表達(dá)的水平，例如，基于任何合適的統(tǒng)計(jì)測量，如，例如，包括平均值、中值或眾數(shù)值的集中趨勢的測量。

術(shù)語“對照水平”是指受試者或受試者樣品中受損的葡萄糖耐量、提高的血糖、胰島素抵抗、糖尿病或前驅(qū)糖尿病的體征的公認(rèn)或預(yù)定的水平。以下水平認(rèn)為是正常水平：

--低于或等于100mg/dl的空腹血糖。

--低于或等于5.7％的HbA1c。

--低于或等于140mg/dl的口服葡萄糖耐量測試。

高于這些水平的水平理解為病理水平。

如本文中使用的，生物標(biāo)志物的“預(yù)定閾值”是指獲自正?；蚪】凳茉囌?例如，不具有異常血糖的受試者)的相應(yīng)對照/正常樣品或?qū)φ?正常樣品組中升高血糖的生物標(biāo)志物(例如，生物樣品中的表達(dá)水平或量(例如，ng/ml))或其他指示劑的水平。預(yù)定閾值可以在生物樣品中標(biāo)志物水平的測量之前或同時(shí)測定。對照樣品可以在之前時(shí)間來自同一受試者或者來自不同受試者。

如本文中使用的，在“較早時(shí)間點(diǎn)”獲得的樣品是在過去足夠的時(shí)間獲得的樣品，使得與較后時(shí)間點(diǎn)相比在來自較早時(shí)間點(diǎn)的樣品中可以獲得臨床上相關(guān)的信息。在特定實(shí)施方案中，較早時(shí)間點(diǎn)早至少四周。在特定實(shí)施方案中，較早時(shí)間點(diǎn)早至少六周。在特定實(shí)施方案中，較早時(shí)間點(diǎn)早至少兩個(gè)月。在特定實(shí)施方案中，較早時(shí)間點(diǎn)早至少三個(gè)月。在特定實(shí)施方案中，較早時(shí)間點(diǎn)早至少六個(gè)月。在特定實(shí)施方案中，較早時(shí)間點(diǎn)早至少九個(gè)月。在特定實(shí)施方案中，較早時(shí)間點(diǎn)早至少一年?？梢噪S著時(shí)間以規(guī)律或不規(guī)律的間隔獲得多個(gè)受試者樣品(例如，3、4、5、6、7或更多個(gè))，并分析標(biāo)志物水平變化的趨勢。用于測試特定受試者的合適間隔可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于常規(guī)考慮來確定。

如本文中使用的，術(shù)語“獲得”理解為是指制造、購買或以另外的方式擁有。

如本文中使用的，“檢測(detecting)”、“探測(detection)”等理解為是指為了鑒定樣品中的特定分析物進(jìn)行的試驗(yàn)，例如，樣品中的Eno1表達(dá)或活性水平。樣品中檢測的分析物或活性的量可以為零或低于試驗(yàn)或方法的檢測水平。檢測或探測還可以包括葡萄糖和/或HbAc1水平的測量。

術(shù)語“調(diào)節(jié)(modulate)”或“調(diào)控(modulation)”是指水平的上調(diào)(即，激活或刺激)、下調(diào)(即，抑制或遏制)或者兩者(結(jié)合或單獨(dú))?！罢{(diào)節(jié)劑”是執(zhí)行調(diào)控的化合物或分子，并且可以是例如激動劑、拮抗劑、激活劑、刺激劑、阻遏劑或抑制劑。

術(shù)語“表達(dá)”在本文中用來表示多肽通過其從DNA產(chǎn)生的過程。該過程包括基因轉(zhuǎn)錄成mRNA并且將這種mRNA翻譯成多肽。根據(jù)其中使用的上下文，“表達(dá)”可以指RNA、蛋白質(zhì)或兩者的產(chǎn)生。

術(shù)語“基因的表達(dá)水平”或“基因表達(dá)水平”是指由細(xì)胞中的基因編碼的mRNA以及前-mRNA新生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工中間體、成熟mRNA和降解產(chǎn)物的水平，或者蛋白質(zhì)的水平。

如本文中使用的，術(shù)語“擴(kuò)增”是指用于獲得靶核酸序列的多個(gè)拷貝(“擴(kuò)增子”)或其互補(bǔ)序列或片段的任何已知的體外過程。體外擴(kuò)增是指產(chǎn)生可能含有少于完整靶標(biāo)區(qū)域序列或其互補(bǔ)序列的擴(kuò)增核酸。已知的體外擴(kuò)增方法包括，例如，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增、復(fù)制酶介導(dǎo)的擴(kuò)增、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)擴(kuò)增和鏈置換擴(kuò)增(SDA，包括多鏈置換擴(kuò)增方法(MSDA))。復(fù)制酶介導(dǎo)的擴(kuò)增使用自身復(fù)制RNA分子和復(fù)制酶，如Q-β-復(fù)制酶(例如，Kramer等，美國專利No.4,786,600)。PCR擴(kuò)增是公知的并且使用DNA聚合酶、引物和熱循環(huán)以合成DNA或cDNA的兩條互補(bǔ)鏈的多個(gè)拷貝(例如，Mullis等，美國專利No.4,683,195、4,683,202和4,800,159)。LCR擴(kuò)增通過使用雜交、連接和變性的多個(gè)循環(huán)而使用至少四個(gè)單獨(dú)的寡核苷酸來擴(kuò)增靶標(biāo)及其互補(bǔ)鏈(例如，歐洲專利申請公開No.0 320 308)。SDA是其中引物含有用于限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)的方法，該識別位點(diǎn)允許核苷酸內(nèi)切酶切割包括靶序列的半修飾(hemimodified)DNA雙鏈體的一條鏈，接著以一系列的引物延伸和鏈置換步驟來擴(kuò)增(例如，Walker等，美國專利No.5,422,252)。兩種其他的已知鏈置換擴(kuò)增方法不需要核酸內(nèi)切酶切割(Dattagupta等，美國專利No.6,087,133和美國專利No.6,124,120(MSDA))。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解本發(fā)明的寡核苷酸引物序列可以容易地用于任一種基于通過聚合酶的引物延伸的體外擴(kuò)增方法中(一般參見Kwoh等，1990,Am.Biotechnol.Lab.8:14-25和Kwoh等，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1173-1177；Lizardi等，1988,BioTechnology 6:1197-1202；Malek等，1994,Methods Mol.Biol.,28:253-260和Sambrook等，2000,Molecular Cloning--A Laboratory Manual(分子克隆--實(shí)驗(yàn)室手冊)，第三版，CSH Laboratories)。如本領(lǐng)域公知的，設(shè)計(jì)寡聚物以在選定的條件下結(jié)合互補(bǔ)序列。

如本文中使用的，術(shù)語“抗原”是指引發(fā)受試者中的抗體反應(yīng)或被抗體識別并結(jié)合的分子，例如，肽、多肽、蛋白質(zhì)、片段或其他生物學(xué)部分。

如本文中使用的，術(shù)語“互補(bǔ)”是指兩個(gè)核酸鏈的區(qū)域之間或相同核酸鏈的兩個(gè)區(qū)域之間的序列互補(bǔ)的寬泛概念。已知第一核酸區(qū)域的腺嘌呤殘基能夠與第二核酸區(qū)域(其與第一個(gè)區(qū)域反平行)的殘基(如果該殘基是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特異性的氫鍵(“堿基配對”)。相似地，已知第一核酸鏈的胞嘧啶殘基能夠與第二核酸鏈(其與第一鏈反平行)的殘基(如果該殘基是鳥嘌呤)堿基配對。如果在兩個(gè)區(qū)域以反平行方式排列時(shí)第一區(qū)域的至少一個(gè)核苷酸殘基能夠與第二區(qū)域的殘基堿基配對，則核酸的第一區(qū)域與相同或不同核酸的第二區(qū)域互補(bǔ)。優(yōu)選地，第一區(qū)域包括第一部分和第二區(qū)域包括第二部分，由此當(dāng)?shù)谝缓偷诙糠忠苑雌叫蟹绞脚帕袝r(shí)，第一部分的至少約50％，并且優(yōu)選至少約75％，至少約90％，或至少約95％的核苷酸殘基能夠與第二部分中的核苷酸殘基堿基配對。更優(yōu)選地，第一部分的全部核苷酸殘基能夠與第二部分中的核苷酸殘基堿基配對。

如本文中使用的，短語“特異性結(jié)合”或“特異性地結(jié)合”在結(jié)合抗體與蛋白質(zhì)或肽的相互作用使用時(shí)表示該相互作用取決于蛋白質(zhì)上特定結(jié)構(gòu)(即，抗原決定簇或表位)的存在；換句話說，抗體識別并結(jié)合特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而不是總體的蛋白質(zhì)。例如，如果抗體對于表位“A”是特異性的，則在含有標(biāo)記的“A”和抗體的反應(yīng)中存在含有表位A(或游離的，未標(biāo)記的A)的蛋白質(zhì)將降低標(biāo)記的A結(jié)合于抗體的量。

短語“特異性鑒別”理解為以足夠低的分析背景和所用試劑的交叉反應(yīng)性檢測目標(biāo)標(biāo)志物，以使得檢測方法在診斷上是有用的。在特定實(shí)施方案中，用于標(biāo)志物的特異性鑒別的試劑只結(jié)合標(biāo)志物的一種異形體。在特定實(shí)施方案中，用于標(biāo)志物的特異性鑒別的試劑結(jié)合標(biāo)志物的超過一種異形體。在特定實(shí)施方案中，用于標(biāo)志物的特異性鑒別的試劑結(jié)合標(biāo)志物的全部已知的異形體。

如本文中使用的，短語“懷疑血糖升高的受試者”是指存在指示血糖升高或與血糖升高相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)體征或癥狀或者正針對血糖升高進(jìn)行篩選(例如，在常規(guī)體檢中)的受試者。懷疑血糖升高的受試者還可以具有一個(gè)或多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因子。懷疑血糖升高的受試者通常尚未測試過異常葡萄糖水平、代謝或反應(yīng)。然而，“懷疑血糖升高的受試者”包括已經(jīng)接受了初步診斷(例如，升高血糖的單次出現(xiàn)，但未確認(rèn))但其血糖升高的程度未知的個(gè)體。該術(shù)語進(jìn)一步包括曾經(jīng)血糖升高的人(例如，針對血糖升高治療的在延長時(shí)間段內(nèi)維持正常血糖和/或HbA1c水平的個(gè)體，例如，至少3個(gè)月，至少6個(gè)月等)。

冠詞“一個(gè)(a)”、“一種(an)”和“該(the)”在本文中用于指該冠詞的一個(gè)或超過一個(gè)(即，至少一個(gè))語法對象，除非另外清楚地指明相反的情況。例如，“一個(gè)要素”表示一個(gè)要素或超過一個(gè)要素。

術(shù)語“包括”在本文中用于表示短語“包括但不限于”，并且可以與其互換使用。

術(shù)語“或”在本文中用于表示術(shù)語“和/或”并且可以與其互換使用，除非文中清楚地表示另外的情況。

術(shù)語“如”在本文中用于表示短語“如但不限于”，并且可以與其互換使用。

除非特意聲明或從上下文中明顯看出，如本文中使用的，術(shù)語“約”理解為在本領(lǐng)域的正常容許范圍內(nèi)，例如，在平均值的2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)。約可以理解為在所陳述值的10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％或0.01％內(nèi)。除非另外從上下文中清楚看出，否則本文中提供的所有數(shù)值由術(shù)語約來修飾。

本文中變量的任何定義中的化學(xué)基團(tuán)列表的列舉包括該變量作為任何單一基團(tuán)或所列基團(tuán)的組合的定義。針對本文中的變量或方面的實(shí)施方案的列舉包括作為任何單一實(shí)施方案或與任何其他實(shí)施方案或其部分組合的實(shí)施方案。

本文中提供的任何組合物或方法可以與本文中提供的任何其他組合物和方法的一種或多種結(jié)合。

本文中提供的范圍理解為涵蓋范圍內(nèi)所有值。例如，1至50的范圍理解為包括來自由1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，15，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49或50組成的組的任何數(shù)字、數(shù)字的組合或子范圍。

現(xiàn)在將詳細(xì)描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。盡管本發(fā)明將結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案來描述，但將理解其不是打算將本發(fā)明限于那些優(yōu)選的實(shí)施方案。相反，意圖是的涵蓋替換方案、改變和等同方案，如可以包括在通過所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。

IIA.烯醇酶1

烯醇酶1，(α)，也稱為ENO1L、α-烯醇酶、烯醇酶-α、tau-晶體蛋白、非神經(jīng)烯醇酶(NNE)、α烯醇酶樣1、磷酸丙酮酸水合酶(PPH)、纖溶酶原結(jié)合蛋白、MYC啟動子結(jié)合蛋白1(MPB1)和2-磷酸-D-甘油水解酶，是哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的三種烯醇酶同工酶中的一種。每種同工酶是由2個(gè)α、2個(gè)γ或2個(gè)β亞基構(gòu)成的同型二聚體，并且作為糖酶解酶發(fā)揮作用。此外，α烯醇酶以單體形式作為結(jié)構(gòu)晶體狀蛋白(tau-晶體蛋白)發(fā)揮作用。這種基因的可變剪接獲得較短的異形體，其已經(jīng)證明結(jié)合c-myc啟動子并且作為腫瘤遏制劑發(fā)揮作用。已經(jīng)鑒別了幾種假基因，包括染色體1長臂上的一種。α-烯醇酶還已經(jīng)鑒別為橋本腦病中的自身抗原。關(guān)于人Eno1的更多信息可以例如依據(jù)Gene ID No.2023在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中找到(參見，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2023，以本申請?zhí)峤蝗湛色@得的版本按引用并入本文中)。

Eno1變體

人Eno1的兩種異形體是已知的。人烯醇酶1，(α)(ENO1)，轉(zhuǎn)錄物變體1，mRNA的蛋白質(zhì)和mRNA序列可以在GenBank登錄號No.NM_001428找到(參見www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001428.3，其以本申請?zhí)峤蝗湛色@得的版本按引用并入本文中)。這個(gè)變體編碼較長的異形體，其定位于細(xì)胞溶質(zhì)，并且具有α-烯醇酶活性。已經(jīng)報(bào)道了這種異形體的單體形式作為結(jié)構(gòu)晶體狀蛋白(tau-晶體蛋白)發(fā)揮作用，而二聚形式作為烯醇酶發(fā)揮作用。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，Eno1是Eno1的轉(zhuǎn)錄物變體。

人烯醇酶1，(α)(ENO1)，轉(zhuǎn)錄物變體2，mRNA的蛋白質(zhì)和mRNA序列可以在GenBank登錄號No.NM_001201483找到(參見www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_00001201483.1，其以本申請?zhí)峤蝗湛色@得的版本按引用并入本文中)。這個(gè)變體與變體1相比5’端不同，并且從框內(nèi)下游起始密碼子啟動翻譯，從而產(chǎn)生較短的異形體(MBP-1)。這種異形體定位于細(xì)胞核，并且通過結(jié)合其啟動子作為c-myc原癌基因的轉(zhuǎn)錄阻遏子發(fā)揮作用。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，Eno1是Eno1的轉(zhuǎn)錄物變體2。

例如，UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中登錄號No.P06733描述了Eno1蛋白的幾種其他變體。Eno1蛋白變體的實(shí)例顯示于以下的表1中。

表1.Eno1變體

在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，Eno1是表1中所列變體中的一種。

Eno1活性

Eno1是在糖酵解途徑的最后步驟中催化2-磷酸-D-甘油酸(PGA)脫水成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的關(guān)鍵糖酵解酶。Diaz-Ramos等，2012,J Biomed Biotechnol.2012:156795和圖33。烯醇酶在Emden Mayerhoff-Parnas糖酵解途徑(分解代謝方向)中催化PGA脫水成PEP。在糖異生過程中的合成代謝途徑(逆向反應(yīng))中，Eno1催化PEP水合成PGA。因此，Eno1也稱為磷酸丙酮酸水合酶。金屬離子是損害烯醇酶活性提高的輔因子；因此Eno1也稱為金屬激活的金屬酶。鎂是引起最高活性的天然輔因子，并且是酶具有催化活性所需要的。酶活性中涉及的其他金屬離子的相對活化強(qiáng)度譜顯示出以下順序：Mg²⁺>Zn²⁺>Mn²⁺>Fe(II)²⁺>Cd²⁺>Co²⁺、Ni²⁺、Sm³⁺、Tb³⁺和大部分的其他二價(jià)金屬離子。在由烯醇酶催化的反應(yīng)中，來自與PGA的羧酸基團(tuán)鄰近的碳的α-質(zhì)子被抽取，并且PGA轉(zhuǎn)化成烯醇化物陰離子中間體。這種中間體在各種化學(xué)反應(yīng)中被進(jìn)一步加工，包括外消旋、環(huán)異構(gòu)化以及水或氨的β-消除。參見Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology database,atlasgeneticsoncology.org/Genes/GC_ENO1.Html。

酶活性的烯醇酶以二聚形式(同型-或異二聚體)存在，并且由兩個(gè)以反平行方式彼此面對的亞基組成。已經(jīng)測定了來自酵母和人的烯醇酶的晶體結(jié)構(gòu)并且提出了催化機(jī)理。Diaz-Ramos等，以上引用的。參與這種酶的催化活性的五個(gè)殘基在整個(gè)進(jìn)化中是高度保守的。體外研究揭示了在位置Glu168、Glu211、Lys345、Lys396或His159處不同的突變烯醇酶顯示出顯著降低的活性水平。烯醇酶的組成和保守部分是參與烯醇酶活性位點(diǎn)的構(gòu)象變化的兩個(gè)Mg2+離子，并且使得能夠結(jié)合底物或其類似物。Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology database，以上引用的。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包含金屬離子輔因子。金屬離子輔因子可以提供Eno1在組合物中提高的穩(wěn)定性和/或提高的體內(nèi)Eno1活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子輔因子是二價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，二價(jià)金屬離子輔因子是Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe(II)²⁺、Cd²⁺、Co²⁺或Ni²⁺。在一個(gè)實(shí)施方案中，金屬離子輔因子是三價(jià)的，例如，Sm³⁺或Tb3⁺。

例如，可以使用丙酮酸激酶(PK)/乳酸脫氫酶(LDH)實(shí)驗(yàn)測定Eno1活性。以下顯示了用于這種烯醇酶試驗(yàn)的反應(yīng)。

2-磷酸-D-甘油酸(DPG)

可以通過例如使用來自Photon Technology International，Inc.(pti-nj.com)的PTI Quantamaster 40分光光度計(jì)測量NADH熒光的降低來測定NADH至NAD⁺轉(zhuǎn)化的反應(yīng)速率。用于通過比色丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶試驗(yàn)測量Eno1活性的試劑盒也是商業(yè)上可購得的，例如，從ABCAM(Cambridge，MA；目錄編號ab117994)。ABCAM Eno1活性試驗(yàn)進(jìn)一步描述于以下的實(shí)施例5中。

還如實(shí)施例2中所述的，通過測量Eno1對人骨骼肌肌管(HSMM)中的葡萄糖攝取的作用來測定Enol活性。

在特定實(shí)施方案中，Eno1或其片段具有純化內(nèi)源性人Eno1多肽的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％，200％，300％，400％或500％的活性。在特定實(shí)施方案中，通過上述的丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶試驗(yàn)或HSMM葡萄糖攝取試驗(yàn)測定Eno1、其片段和純化的內(nèi)源性人Eno1多肽的活性。

在特定實(shí)施方案中，如本文中所述的與樹狀聚合物復(fù)合的Eno1多肽具有未與樹狀聚合物復(fù)合的純化內(nèi)源性Eno1多肽的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％，200％，300％，400％或500％的活性。在特定實(shí)施方案中，通過上述的丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶試驗(yàn)或HSMM葡萄糖攝取試驗(yàn)測定與樹狀聚合物復(fù)合的Eno1多肽的活性和未與樹狀聚合物復(fù)合的純化內(nèi)源性Eno1多肽的活性。

在特定實(shí)施方案中，如本文中所述的與樹狀聚合物和靶向肽復(fù)合的Eno1具有未與樹狀聚合物和靶向肽復(fù)合的純化內(nèi)源性人Eno1多肽的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％，200％，300％，400％或500％的活性。在特定實(shí)施方案中，通過上述的丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶試驗(yàn)或HSMM葡萄糖攝取試驗(yàn)測定與樹狀聚合物和靶向肽復(fù)合的Eno1多肽的活性和未與樹狀聚合物和靶向肽復(fù)合的純化的內(nèi)源性人Eno1多肽的活性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中的Eno1或其片段(其中該組合物包含金屬離子輔因子(例如，二價(jià)金屬離子輔因子，如Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe(II)²⁺、Cd²⁺、Co²⁺或Ni²⁺，或者三價(jià)金屬離子輔因子，如Sm³⁺或Tb3⁺))具有純化的內(nèi)源性人Eno1多肽的至少10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％，200％，300％，400％或500％的活性。在特定實(shí)施方案中，通過上述的丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶試驗(yàn)或HSMM葡萄糖攝取試驗(yàn)測定如上所述在金屬離子輔因子的組合物中的Eno1或其片段的活性和純化的內(nèi)源性人Eno1多肽的活性。

葡萄糖流量

肌肉葡萄糖攝取的調(diào)節(jié)涉及三步驟的過程，其由以下組成：(1)葡萄糖至肌肉的輸送，(2)葡萄糖通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)至肌肉中和(3)肌肉內(nèi)葡萄糖通過己糖激酶(HK)的磷酸化。肌肉葡萄糖攝取的生理調(diào)節(jié)需要葡萄糖從血液移動至間質(zhì)并移動至胞內(nèi)空間，并且隨后磷酸化成G6P。血糖濃度、肌肉血流和毛細(xì)管至肌肉的募集決定了葡萄糖從血液至間質(zhì)的移動。質(zhì)膜GLUT4含量控制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中。肌肉己糖激酶(HK)活性、細(xì)胞HK區(qū)室化和HK抑制劑(G6P)的濃度決定了葡萄糖磷酸化的能力。這三個(gè)步驟-葡萄糖的輸送、轉(zhuǎn)運(yùn)和磷酸化-包括葡萄糖流，并且所有三個(gè)步驟對于葡萄糖流量控制都是重要的。然而，葡萄糖磷酸化下游的步驟也可以影響葡萄糖攝取。例如，糖酵解或糖原合成的加速可以減少G6P，提高HK活性，提高葡萄糖磷酸化的能力，并潛在刺激肌肉葡萄糖攝取。Wasserman等，2010，J Experimental Biology，Vol.214，pp.254-262。

本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：Eno1影響葡萄糖流途徑的幾個(gè)組成部分，包括提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT1和GLUT4以及己糖激酶HK2的表達(dá)，和提高糖酵解途徑中間體G6P和PEP的水平，因此表明Eno1處理起到提高葡萄糖流量的作用。

本發(fā)明還至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)：在來自正常受試者的肌細(xì)胞和來自患有2型糖尿病的受試者的肌細(xì)胞中Eno1被差異地調(diào)節(jié)。本發(fā)明進(jìn)一步基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)：用Eno1處理肌細(xì)胞提高葡萄糖攝取至細(xì)胞中并且將Eno1施用于膳食誘導(dǎo)肥胖癥的小鼠將葡萄糖耐量和胰島素反應(yīng)正常化。

因此，本發(fā)明提供了通過將Eno1施用于受試者來治療通常與糖尿病(包括至少1型糖尿病、前驅(qū)糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病)相關(guān)的血糖升高的方法。此外，本發(fā)明提供了用于在哺乳動物中診斷和/或監(jiān)控(例如，監(jiān)控疾病進(jìn)展或治療)和/或預(yù)后升高血糖狀態(tài)(例如，糖尿病)的方法。本發(fā)明還提供了基于關(guān)于血糖升高的受試者的血液或血清中的Eno1水平的診斷信息來治療或調(diào)節(jié)治療方案的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑組和試劑盒。

本發(fā)明還提供了用于提高受試者的葡萄糖流量的方法，包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，施用于受試者的藥物組合物是本文中所述的任一種藥物組合物。本發(fā)明還提供了提高受試者的骨骼肌細(xì)胞中的葡萄糖流量的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，施用于受試者的藥物組合物是本文中所述的任一種藥物組合物。

本發(fā)明還提供了提高受試者骨骼肌細(xì)胞中的糖酵解活性的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，施用于受試者的藥物組合物是本文中所述的任一種藥物組合物。

本發(fā)明還提供了提高受試者骨骼肌細(xì)胞中的線粒體游離脂肪酸氧化的方法，該方法包括將包含Eno1或其片段的藥物組合物施用于受試者。在特定實(shí)施方案中，施用于受試者的藥物組合物是本文中所述的任一種藥物組合物。

如本文中使用的“提高葡萄糖流量”理解為提高(1)葡萄糖至肌肉的輸送，(2)葡萄糖至肌肉中的轉(zhuǎn)運(yùn)和(3)肌肉內(nèi)葡萄糖的磷酸化中的至少一種或多種。在特定實(shí)施方案中，提高葡萄糖流量包括提高肌細(xì)胞中的糖酵解活性或線粒體游離脂肪酸氧化。

IIA.烯醇酶2和烯醇酶3

烯醇酶2(Eno2)也稱為γ烯醇酶、神經(jīng)元烯醇酶、神經(jīng)元特異性烯醇酶(NSE)或HEL-S-279并且由ENO2基因編碼。Eno2是磷酸丙酮酸磷酸酶，糖酵解酶。Eno2是同型二聚體并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的成熟神經(jīng)元和神經(jīng)元起源的細(xì)胞中找到。神經(jīng)元在各種類型應(yīng)激下將Eno2釋放至系統(tǒng)循環(huán)中。Yee等，2012，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.Vol.53,No.10,pp.6389-6392。ENO2mRNA的核酸序列和Eno2的氨基酸序列分別顯示于圖36A和36B中。

烯醇酶3(Eno3)也稱為β烯醇酶、肌肉烯醇酶、肌肉特異性烯醇酶(MSE)或GSD13并且由ENO3基因編碼。Eno3催化2-磷酸甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸的互變。Eno3在成人骨骼肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，它在此處在肌肉發(fā)育和再生中起著作用。在成人肌肉中，超過90％的烯醇酶活性由Eno3引起。編碼Eno3的基因中的突變與糖原貯積病有關(guān)。Comi等，2001,Ann Neurol.Vol.50,No.2,pp.202-207。已經(jīng)鑒定了ENO3mRNA的三個(gè)變體，變體1、2和3。變體1和2編碼Eno3蛋白的異形體1，而變體3編碼Eno3蛋白的異形體2。與變體1相比，ENO3mRNA的變體3在5’UTR不同并且在5’編碼區(qū)中缺少兩個(gè)外顯子。Eno3蛋白的異形體2比異形體1短，但具有相同的N-和C-末端。Eno3的變體1、2和3的核酸序列以及異形體1和2的氨基酸序列顯示于圖37A-37E中。

Eno2和/或Eno3也可以替代Eno1用于本文中所述的方法、藥物組合物、試劑組和試劑盒中。例如，Eno2和/或Eno3可以用于通過將包含Eno2和/或Eno3的藥物組合物施用于受試者而治療通常與糖尿病(包括至少1型糖尿病、前驅(qū)糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病)相關(guān)的血糖升高的方法中。此外，Eno2和/或Eno3可以用于在哺乳動物中診斷和/或監(jiān)控(例如，監(jiān)控疾病進(jìn)展或治療)和/或預(yù)后升高的血糖狀態(tài)(例如，糖尿病)的方法中。Eno2和/或Eno3還可以用于基于關(guān)于血糖升高的受試者的血液或血清中的Eno2或Eno3水平的診斷信息來治療或調(diào)節(jié)治療方案的方法中，以及用于實(shí)施本發(fā)明的試劑組和試劑盒中。本發(fā)明還涉及包含Eno2和/或Eno3的藥物組合物，例如，用于遞送至肌細(xì)胞。

III.糖尿病診斷和分類

糖尿病(diabetes mellitus)(DM)，常常簡稱為糖尿病(diabetes)，是其中個(gè)人具有高血糖的一組代謝疾病，不管是因?yàn)樯眢w沒有產(chǎn)生足夠的胰島素或是因?yàn)榧?xì)胞不能對產(chǎn)生的胰島素作出反應(yīng)。這種高血糖產(chǎn)生了多尿(頻繁排尿)、煩渴(增加的口渴)和多食(增加的饑餓)的經(jīng)典癥狀。

2型糖尿病由胰島素抵抗引起，這是其中細(xì)胞不能適當(dāng)?shù)厥褂靡葝u素的一種病癥，有時(shí)合并絕對的胰島素缺乏。身體組織對胰島素反應(yīng)性的缺陷據(jù)信至少部分地涉及胰島素受體。然而，具體的缺陷是未知的。

在2型糖尿病的早期階段，主要的異常是降低的胰島素敏感性。在這個(gè)階段，可以通過提高胰島素敏感性或降低肝臟的葡萄糖產(chǎn)生的多種措施和藥物來逆轉(zhuǎn)高血糖。前驅(qū)糖尿病表示個(gè)體的血糖水平高于正常但還不足夠高至進(jìn)行2型糖尿病的診斷時(shí)發(fā)生的病癥。

2型糖尿病是由于在胰島素抵抗的情況中β細(xì)胞的胰島素產(chǎn)生不足。胰島素抵抗(這是細(xì)胞不能適當(dāng)?shù)貙φＫ降囊葝u素作出反應(yīng))主要發(fā)生在肌肉、肝臟和脂肪組織內(nèi)。在肝臟中，胰島素通常抑制葡萄糖釋放。然而，在胰島素抵抗的情況中，肝臟不適當(dāng)?shù)貙⑵咸烟轻尫胖裂褐小Ｒ葝u素抵抗相對β細(xì)胞功能障礙的比例在個(gè)體之間是不同的，一些個(gè)體主要具有胰島素抵抗并且只具有胰島素分泌的很小缺陷，而其他個(gè)體具有輕微的胰島素抵抗且主要是缺乏胰島素分泌。

其他與2型糖尿病和胰島素抵抗相關(guān)的潛在重要機(jī)制包括：脂肪細(xì)胞內(nèi)提高的脂質(zhì)分解、對腸促胰島素的抗性和腸促胰島素的缺乏、血液中的高胰高血糖素水平、腎臟的鹽和水保留提高和中樞神經(jīng)系統(tǒng)對代謝的不當(dāng)調(diào)節(jié)。然而，不是所有具有胰島素抵抗的人員都發(fā)生糖尿病，因?yàn)檫€需要胰腺β細(xì)胞胰島素分泌的損害。

1型糖尿病由于身體不能產(chǎn)生胰島素而引起，并且目前需要用注射胰島素來治療。1型糖尿病的特征在于胰腺中郎罕氏胰島的產(chǎn)胰島素β細(xì)胞的損失，導(dǎo)致胰島素缺乏。大部分受影響的人在開始發(fā)作時(shí)其他方面是健康的并且具有健康體重。對胰島素的敏感性和反應(yīng)性通常是正常的，尤其是在早期階段。然而，特別是在后期階段，可能發(fā)生胰島素抵抗，包括由于免疫系統(tǒng)清除施用的胰島素引起的胰島素抵抗。

A.診斷標(biāo)準(zhǔn)

美國糖尿病協(xié)會在Diabetes Care，36:S67-74，2013中公開了糖尿病的診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)，將其按引用并入文本中，其提供了更詳細(xì)的各種類型糖尿病的定義。以下進(jìn)一步討論糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)如下分類1型糖尿病或2型糖尿?。?/p>

I.1型糖尿病(β-細(xì)胞破壞，通常導(dǎo)致絕對的胰島素缺陷)

A.免疫介導(dǎo)的

B.特發(fā)性的

II.2型糖尿病(范圍可以從具有相對胰島素缺陷的主要胰島素抵抗至具有胰島素抵抗的主要分泌缺陷)

III.其他特定類型

IV.妊娠糖尿病

本文中提供了用于進(jìn)行診斷或評價(jià)方法的方法。本文中提供的糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

用于糖尿病診斷的標(biāo)準(zhǔn)

*在不存在明確的高血糖的情況下，標(biāo)準(zhǔn)1-3應(yīng)當(dāng)通過重復(fù)測試來證實(shí)。

本文中提供的糖尿病/前驅(qū)糖尿病的提高風(fēng)險(xiǎn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

用于糖尿病(前驅(qū)糖尿病)的提高風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)準(zhǔn)*

*對于所有三個(gè)測試，風(fēng)險(xiǎn)是連續(xù)的，延伸低于范圍的下限并且在范圍的高端變得不成比例地高。

本文中提供的妊娠糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

妊娠糖尿病(GDM)的篩選和診斷

由于相對于進(jìn)食的特定時(shí)間需求(例如，空腹血糖)或進(jìn)行測試需要的時(shí)間量(例如，與口服葡萄糖耐量測試)，用于血糖升高或糖尿病的診斷和/或監(jiān)控的血糖測量可能是麻煩的。此外，診斷標(biāo)準(zhǔn)明確要求在不存在明確的高血糖的情況下，應(yīng)當(dāng)通過重復(fù)測試來確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)1-3。使用HbA1c水平作為診斷指標(biāo)可能是有利的，因?yàn)槠涮峁╇S著時(shí)間的血糖水平的指示，即，約之前1-2個(gè)月，并且不需要特殊的時(shí)間表來進(jìn)行測試。相似地，可以測定Eno1水平而沒有特別的時(shí)間表需求或者食物消耗限制或需求。

因此，在一些方面中，本發(fā)明涉及用于診斷受試者中血糖升高的存在的方法，包括：(a)將生物樣品接觸選擇性結(jié)合Eno1的試劑；(b)允許試劑和Eno1之間形成復(fù)合物；(c)檢測復(fù)合物的水平，和(d)將復(fù)合物的水平與預(yù)定的閾值進(jìn)行比較，其中樣品中復(fù)合物的水平低于預(yù)定閾值表明患者正遭受升高的血糖。在特定實(shí)施方案中，選擇性結(jié)合Eno1的試劑是抗Eno1抗體。在特定實(shí)施方案中，抗體包含可檢測的標(biāo)記。

在上述方法的一些實(shí)施方案中，檢測復(fù)合物水平的步驟進(jìn)一步包括將復(fù)合物接觸可檢測的二抗并且測量二抗的水平。該方法還可以進(jìn)一步包括檢測血糖升高的一個(gè)或多個(gè)其他指標(biāo)的水平。血糖的一個(gè)或多個(gè)其他指標(biāo)可以選自HbA1c水平、空腹葡萄糖水平、餐后葡萄糖水平和葡萄糖耐量。

在上述方法的一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液或血清。在一些實(shí)施方案中，通過免疫分析或ELIS檢測復(fù)合物的水平。在一些實(shí)施方案中，受試者中升高血糖的存在指示選自前驅(qū)糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病和妊娠糖尿病的疾病或病癥。

B.糖尿病、胰島素抵抗和胰島素不足的繼發(fā)病理

由糖尿病(1型和2型兩者)、胰島素抵抗和胰島素不足引起的異常血糖調(diào)控與繼發(fā)病理相關(guān)，其中許多由差的循環(huán)引起。這樣的繼發(fā)病理包括黃斑變性、周圍神經(jīng)病、潰瘍和降低的傷口愈合以及降低的腎功能。已經(jīng)表明將葡萄糖水平和/或HbAc1水平維持在正常范圍內(nèi)降低這些繼發(fā)病理的發(fā)生。應(yīng)理解血糖、胰島素和HbAc1水平的正?；瘜⑼ㄟ^限制原發(fā)性病理(例如，受損的葡萄糖耐量、提高的血糖)降低繼發(fā)病理的發(fā)生。在特定實(shí)施方案中，Eno1不用于治療與受損的葡萄糖耐量、提高的血糖、胰島素抵抗、胰島素不足、糖尿病或前驅(qū)糖尿病相關(guān)的繼發(fā)病理。在特定實(shí)施方案中，Eno1用于治療與受損的葡萄糖耐量、提高的血糖、胰島素抵抗、胰島素不足、糖尿病或前驅(qū)糖尿病相關(guān)的繼發(fā)病理。

IV.劑量和施用方式

施用的技術(shù)和劑量根據(jù)化合物的類型而改變(例如，蛋白質(zhì)和/或核酸，單獨(dú)的或與微粒、脂質(zhì)體或樹狀聚合物復(fù)合)，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的或容易確定的。

本發(fā)明的治療化合物可以與藥物學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑一起，以單位劑量形式來施用。施用可以是腸胃外、靜脈內(nèi)、皮下、口服、外部(topical)或局部(local)。在特定實(shí)施方案中，施用不是口服的。在特定實(shí)施方案中，施用不是外部的。在特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，施用是全身性的?？梢酝ㄟ^協(xié)同工作的多個(gè)人員來進(jìn)行藥劑施用。施用藥劑包括，例如，開出施用于受試者的藥劑的處方和/或直接地或通過另一人提供服用特定的藥劑的說明，其或者通過自我遞送，例如，作為口服遞送、皮下遞送、通過中心線的靜脈內(nèi)遞送等，或者通過受過訓(xùn)練的專業(yè)人士來遞送，例如，靜脈內(nèi)遞送、肌肉內(nèi)遞送、皮下遞送等。

組合物可以是用于口服施用的丸劑、片劑、膠囊、液體或持續(xù)釋放片劑的形式；或用于靜脈內(nèi)、皮下或腸胃外施用的液體；或用于全身性施用的聚合物或其他持續(xù)釋放溶媒。

本領(lǐng)域公知的用于制備制劑的方法可以在例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(第20版，編輯A.R.Gennaro,2000，Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa)中找到。用于腸胃外施用的制劑可以例如含有賦形劑、無菌水、鹽水、聚烷撐二醇(如聚乙二醇)、植物來源的油或氫化萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的釋放。納米顆粒制劑(例如，生物可降解的納米顆粒、固體脂質(zhì)納米顆粒、脂質(zhì)體)可以用于控制化合物的生物分布。其他潛在有用的腸胃外遞送系統(tǒng)包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入輸注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。制劑中化合物的濃度根據(jù)多種因素而改變，包括待施用藥物的劑量和施用途徑。

化合物可以任選地作為藥物學(xué)上可接受的鹽來施用，如制藥業(yè)中通常使用的非毒性酸式加成鹽或金屬絡(luò)合物。酸式加成鹽的實(shí)例包括有機(jī)酸，如乙酸、乳酸、撲酸、馬來酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等；聚合酸，如單寧酸、羧甲基纖維素等；和無機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等。金屬復(fù)合物包括鋅、鐵等。金屬絡(luò)合物包括鋅、鐵等。

用于口服使用的制劑包括含有在與無毒的藥物學(xué)上可接受的賦形劑的混合物中的活性成分的片劑。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填充劑(例如，蔗糖和山梨糖醇)、潤滑劑、助流劑和抗粘劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、硅石、氫化植物油或滑石)。用于口服使用的制劑也可以作為咀嚼片，或作為硬明膠膠囊(其中將活性成分與惰性固體稀釋劑混合)，或作為軟明膠膠囊(其中將活性成分與水或油介質(zhì)混合)來提供。

施用化合物的劑量和時(shí)機(jī)根據(jù)各種臨床因素而改變，包括受試者的整體健康和疾病(例如，糖尿病、前驅(qū)糖尿病)的癥狀的嚴(yán)重性。

A.用于長效注射藥物的制劑

經(jīng)受高首過清除率的生物制劑和其他藥劑可能不適用于口服施用而需要通過腸胃外途徑來施用。然而，用于注射藥物的治療方案的依從性可能是低的，因?yàn)槭茉囌叱３５钟|通過注射來自身施用藥劑，例如，皮下注射，特別是當(dāng)疾病沒有使受試者感到不舒服時(shí)。通過注射的其他施用途徑，例如，靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)，通常需要通過經(jīng)訓(xùn)練的專業(yè)人士來施用，使得頻繁的藥劑施用是不方便的并且常常是疼痛的。

已經(jīng)制備了提供注射藥劑的持續(xù)遞送的制劑，包括，但不限于，油基注射液、注射藥物懸浮液、注射微球和原位注射系統(tǒng)。與相同化合物的常規(guī)制劑相比，長效注射制劑給予了許多優(yōu)勢。這些優(yōu)勢包括至少以下：每次注射后限定時(shí)間段內(nèi)可預(yù)測的藥物釋放特性；更好的患者依從性；易于施用；通過避免首過代謝提高全身利用度；降低的給藥頻率(即，較少注射)而不損害治療的有效性；降低的副作用發(fā)生率；和醫(yī)療護(hù)理的總體成本降低。

1.油基注射液和注射藥物懸浮液。

常規(guī)長效注射由水性溶劑中的親脂性藥物組成(作為懸浮液)或由溶解于植物油中的親脂性藥物組成。商業(yè)上可購得的用于肌肉內(nèi)施用的油基注射藥物包括，但不限于，癸酸氟哌啶醇、癸酸氟非那嗪、庚酸睪酮和戊酸雌二醇。這些長效制劑的施用頻率大約為每幾周。在懸浮液制劑中，藥物吸收的速率限制步驟是藥物顆粒在制劑或藥物制劑周圍的組織流體中的溶解。形成水溶性差的鹽可以用于控制藥物顆粒的溶解速率以延長吸收。然而，幾種其他因素，如注射部位、注射體積、藥物存庫(depot)在注射部位的擴(kuò)散程度以及油溶媒本身的吸收和分布可能影響藥物的總體藥代動力學(xué)特性。調(diào)節(jié)這些因素以提供所需藥物釋放特性在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

2.基于聚合物的微球體和原位成型。

基于聚合物的長效注射劑的開發(fā)是用于大分子(如肽和蛋白質(zhì)藥物)的最適合策略之一。商業(yè)上可購得的微球制劑包括，但不限于，醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸奧曲肽、醋酸蘭瑞肽、利培酮和納曲酮。商業(yè)上可購得的原位形成植入物包括醋酸亮丙瑞林，并且含有紫杉醇和丁哌卡因的原位形成植入物正在臨床試驗(yàn)中。這些制劑用于肌肉內(nèi)施用。用于大分子的基于聚合物的制劑的優(yōu)勢包括：大分子的體外和體內(nèi)穩(wěn)定、全身利用度的提高、生物半衰期的延長、患者方便性和依從性的增強(qiáng)和給藥頻率的降低。

可注射微球和原位形成制劑的設(shè)計(jì)中的最關(guān)鍵因素是合適的生物可降解聚合物的選擇。藥物分子從生物可降解微球的釋放受到通過聚合物基質(zhì)的擴(kuò)散和聚合物降解的控制。聚合物的性質(zhì)，如共聚物組成比例、聚合物結(jié)晶度、玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度和親水性在釋放過程中起著關(guān)鍵作用。盡管結(jié)構(gòu)、固有聚合物特性、核心溶解度、聚合物親水性和聚合物分子量影響藥物釋放動力學(xué)，藥物從微球釋放的可能機(jī)制如下：初始從表面釋放、通過孔隙釋放、通過完整的聚合物屏障的擴(kuò)散、通過水溶脹屏障的擴(kuò)散、聚合物侵蝕和本體降解。所有這些機(jī)制一起在釋放過程中起作用。用于微球和原位形成制劑的聚合物包括，但不限于，過去數(shù)十年中廣泛研究的用于受控藥物遞送的多種生物可降解聚合物，包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(ε-己內(nèi)酯)(PCL)、聚葡糖酸酯、聚酸酐、聚原酸酯、聚(二噁烷酮)和聚烷基氰基丙烯酸酯。原位形成制劑中使用的熱誘導(dǎo)膠凝系統(tǒng)顯示出熱可逆溶膠/凝膠轉(zhuǎn)變，并且通過低臨界溶解溫度表征。它們在室溫下是液體并且在低臨界溶解溫度和更高溫度下產(chǎn)生凝膠。原位固化有機(jī)凝膠由水不溶性兩性液體組成，其在水中溶脹并形成各種類型的溶致液晶。

B.靶向藥物遞送

藥物至其作用位點(diǎn)的遞送可以通過降低提供所需全身性作用所需要的藥物量來提高治療指數(shù)?？梢酝ㄟ^使用將限制全身性暴露的方法或制劑，例如，肌肉內(nèi)注射、滑膜內(nèi)(intrasinovial)注射、鞘內(nèi)注射、眼內(nèi)注射，將藥物施用于靶組織而將藥物遞送至作用位點(diǎn)。以上討論的多種持續(xù)遞送制劑是用于肌肉內(nèi)施用的并且提供至肌肉組織的局部遞送?；蛘?，靶向部分可以與用于施用于靶位點(diǎn)的治療性有效載荷締合或連接。靶向部分可以包括結(jié)合特定細(xì)胞類型的多種部分中的任何一種。

1.靶向部分

本發(fā)明的特定實(shí)施方案包括使用靶向部分，包括如上討論的相對小的肽(例如，25個(gè)氨基酸或更少，20個(gè)氨基酸或更少，15個(gè)氨基酸或更少，10個(gè)氨基酸或更少)、肌肉靶向肽(MTP)包括平滑肌和/或骨骼肌靶向肽、αvβ3整聯(lián)蛋白配體(例如，RGD肽和肽類似物)、αvβ5整聯(lián)蛋白配體或CD46配體。將理解這樣的肽可以包括一個(gè)或多個(gè)化學(xué)修飾以允許與Eno1形成復(fù)合物，從而改變肽的藥代動力學(xué)和/或藥效學(xué)特性。在特定實(shí)施方案中，靶向部分可以是小分子，例如RGD肽模擬物。在特定實(shí)施方案中，靶向部分可以包括蛋白質(zhì)和任選地來自腺病毒35的纖維蛋白。在特定實(shí)施方案中，病毒蛋白質(zhì)存在于病毒顆粒上。在特定實(shí)施方案中，病毒蛋白質(zhì)不存在于病毒顆粒上。在特定實(shí)施方案中，靶向部分可以是抗體、抗體片段、抗體模擬物或T-細(xì)胞受體。

2.靶向復(fù)合物

可以通過肌肉內(nèi)注射以外的其他途徑(例如，皮下注射、靜脈內(nèi)注射)來施用靶向Eno1復(fù)合物，同時(shí)提供Eno1至肌肉的遞送。靶向復(fù)合物可以包括一個(gè)或多個(gè)直接或間接連接于Eno1的靶向部分。靶向復(fù)合物的形成沒有實(shí)質(zhì)性地或不可逆地抑制Eno1的活性及其對正?；撬胶鸵葝u素反應(yīng)的作用。在特定實(shí)施方案中，使用靶向復(fù)合物可以降低提供有效劑量需要的Eno1的總量。以下討論靶向復(fù)合物的一些示例性的、非限制性的實(shí)施方案。

在特定實(shí)施方案中，有效載荷和靶向部分以約1:1摩爾比存在于復(fù)合物中。在特定實(shí)施方案中，靶向部分相對于有效載荷以摩爾過量(例如，2:1，3:1，4:1，5:1，6:1，7:1，8:1，9:1，10:1，11:1，12:1，13:1，14:1，15:1，16:1，17:1，18:1，19:1，20:1，21:1，22:1，23:1，24:1，25:1，26:1，27:1，28:1，29:1，30:1或更高；或任何兩個(gè)值包括的任何范圍)存在于復(fù)合物中。在特定實(shí)施方案中，有效載荷與靶向部分為約1:5-1:15；約1:7-1:13，約1:8-1:12。

將理解本發(fā)明的組合物和方法包括超過一種靶向部分-有效載荷復(fù)合物(即，靶向部分-有效載荷復(fù)合物群體)的施用。因此，將理解每個(gè)有效載荷的靶向部分?jǐn)?shù)量可以表示復(fù)合物群體中每個(gè)有效載荷的平均靶向部分?jǐn)?shù)。在特定實(shí)施方案中，至少70％的復(fù)合物具有選定的靶向部分與有效載荷的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少75％的復(fù)合物具有選定的靶向部分與有效載荷的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少80％的復(fù)合物具有選定的靶向部分與有效載荷的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少85％的復(fù)合物具有選定的靶向部分與有效載荷的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少90％的復(fù)合物具有選定的靶向部分與有效載荷的摩爾比。

a.連接物

多種化學(xué)連接物是本領(lǐng)域已知的并且可從商業(yè)來源(例如，Pierce Thermo Fisher Scientific Inc.，參見，例如，www.piercenet.com/cat/crosslinking-reagents)獲得。這樣的試劑可以用于將一個(gè)或多個(gè)靶向部分可逆或不可逆地化學(xué)連接于Enol。連接物還可以用于將靶向部分和Eno1附接于某結(jié)構(gòu)，例如，微粒、樹狀聚合物，而不是將靶向部分直接連接于Eno1。在特定實(shí)施方案中，將Eno1與靶向復(fù)合物連接的連接物是可逆的，使得施用后Eno1從復(fù)合物釋放，優(yōu)選基本上是在肌肉處釋放。

b.肽鍵

如本文中使用的，靶向復(fù)合物可以包括Eno1用肽靶向部分的轉(zhuǎn)化。產(chǎn)生包括用于靶向Eno1的氨基酸序列的表達(dá)構(gòu)建體的方法完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。

c.脂質(zhì)體

脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，包括限制全身性暴露的制劑，由此降低全身性暴露和脫靶效應(yīng)。例如，是其中阿霉素包裹在長循環(huán)PEG化脂質(zhì)體中的用于治療特定類型癌癥的組合物，所述脂質(zhì)體進(jìn)一步包含膽固醇。兩性霉素B的各種脂質(zhì)體制劑(包括和)配制成用于在脂質(zhì)體或含有各種磷脂、膽固醇和硫酸膽甾醇酯的脂質(zhì)復(fù)合物中靜脈內(nèi)施用。是在卵磷脂酰甘油和DMPC中配制為脂質(zhì)體的維替泊芬(verteporfin)，用于靜脈內(nèi)施用。脂質(zhì)體制劑也已知用于肌肉內(nèi)注射。是滅活的甲肝病毒，而是滅活的流感病毒A株和B株的血細(xì)胞凝集素(hemaglutinine)。兩種病毒制劑都在DOPC和DOPE的組合中配制。這樣的脂質(zhì)體，或其他生理上可接受的脂質(zhì)體，可以用于Eno1的包裝并且隨后用靶向部分表面修飾以將Eno1遞送至肌肉。還可以包括調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)钠渌糠?。脂質(zhì)體攝取至細(xì)胞中時(shí)，脂質(zhì)體釋放Eno1，由此允許其具有其治療效果。

d.樹狀聚合物

樹狀聚合物可以用作用于將多個(gè)靶向部分與一個(gè)或多個(gè)Eno1分子連接的支架。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物在與Eno1偶聯(lián)之前用靶向部分修飾。

e.微粒

微?？梢杂米饔糜趯⒍鄠€(gè)靶向部分與一個(gè)或多個(gè)Eno1分子連接的支架，Eno1分子與微粒連接或包封在微粒中。在特定實(shí)施方案中，微粒在與Eno1偶聯(lián)之前用靶向部分修飾。

f.病毒載體

已經(jīng)長期研究病毒嗜性，并用于指引病毒至目標(biāo)細(xì)胞類型。Parker等，2013(Gene Therapy，20:1158-64)已經(jīng)研發(fā)了具有血清型35的纖維和peton的腺病毒血清型5帽位點(diǎn)(capsite)，以增強(qiáng)至骨骼肌和/或平滑肌的遞送。這樣的病毒載體和其他病毒載體可以用于將Eno1表達(dá)構(gòu)建體遞送至肌細(xì)胞。

C.樹狀聚合物

樹狀聚合物在本發(fā)明的情況中可以用作用于靶向復(fù)合物的骨架，而用于將非肌肉內(nèi)施用的Eno1遞送至肌肉?；蛘撸瑯錉罹酆衔锟梢杂糜谡{(diào)節(jié)肌肉內(nèi)施用的Eno1的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)特性。在本發(fā)明的組合物和方法中，樹狀聚合物理解為藥物學(xué)上可接受的樹狀聚合物。

基于樹狀聚合物的平臺已經(jīng)獲得了對用于藥物應(yīng)用中的關(guān)注。與其他聚合物載體相似，樹狀聚合物可以合成以避免結(jié)構(gòu)毒性和免疫原性。樹狀聚合物模擬人蛋白質(zhì)的大小、溶解性和形狀的能力使得該技術(shù)成為用于許多治療和診斷應(yīng)用的理想選擇。1-10納米的大小使得樹狀聚合物能夠有效地穿過血管內(nèi)皮擴(kuò)散，內(nèi)化至細(xì)胞中，并且通過腎臟快速清除。這有助于避免長期毒性并且降低對快速降解平臺的需求。多個(gè)反應(yīng)性表面基團(tuán)的可利用性使得樹狀聚合物能夠攜帶功能性分子的較高有效載荷，從而增強(qiáng)至作用位點(diǎn)的靶向遞送，由此提高功效。

已經(jīng)生產(chǎn)或正在商業(yè)研發(fā)針對幾種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的樹狀聚合物。局部的、基于聚賴氨酸樹狀聚合物的殺菌劑，VivaGel^TM，已經(jīng)由Starpharma研發(fā)。是用于基因轉(zhuǎn)染的基于樹狀聚合物的材料?；跇錉罹酆衔锏脑\斷工具包括Gadomer-17，一種含有用釓螯合物功能化的聚賴氨酸樹狀聚合物的磁共振成像(MRI)造影劑，以及CS，一種用于心臟標(biāo)志物以快速診斷心臟病發(fā)作的生物傳感劑。

樹狀聚合物通過其芯-殼結(jié)構(gòu)來限定，其中樹狀聚合物利用添加至芯的各個(gè)另外的殼(或代)使功能性表面基團(tuán)的大小和數(shù)量大約翻倍。外殼通過本領(lǐng)域公知的方式通過交替的單體反應(yīng)合成?？梢酝ㄟ^改變單體單元來合成專門的樹狀聚合物骨架。樹狀聚合物的生物學(xué)特性很大程度上受到化學(xué)骨架和表面終止(surface termination)的影響。對于成為用于體內(nèi)藥物遞送的合適載體的樹狀聚合物，它們必須是無毒的、非免疫原性的和能夠通過穿過合適的屏障而靶向和到達(dá)特定的位置，同時(shí)足夠穩(wěn)定以保留在循環(huán)中。文獻(xiàn)中合成和公開的絕大部分樹狀聚合物在生理?xiàng)l件下是不溶的或不能夠在添加功能性分子后保持可溶并且不適用于生物學(xué)應(yīng)用。然而，幾類樹狀聚合物已經(jīng)顯示出對于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用是有用的支架；實(shí)例包括聚酯、聚賴氨酸和聚丙烯亞胺(PPI或DAB)樹狀聚合物。

生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中最廣泛使用的樹狀聚合物是聚(酰胺胺)(PAMAM)樹狀聚合物。從丙烯酸甲酯和乙烯-二胺的重復(fù)反應(yīng)合成的聚酰胺骨架幫助大分子保持水溶性并最小化免疫原性。不同代的PAMAM樹狀聚合物還能夠模擬身體中容易發(fā)現(xiàn)的球狀蛋白的大小和特性。全代PAMAM樹狀聚合物的胺封端表面允許容易的表面修飾，使得平臺能夠在生理?xiàng)l件下攜帶和溶解疏水性治療分子，如氨甲喋呤。如果表面胺被中和或適當(dāng)修飾(例如，?；?，PAMAM樹狀聚合物呈現(xiàn)出很少的非特異性毒性。

主動靶向使用分子(如靶向部分)以通過結(jié)合于細(xì)胞特異性分子來介導(dǎo)其有效載荷(藥物或其他)遞送至細(xì)胞。靶向部分，如本文中提供的那些，常常通過靶細(xì)胞上高度表達(dá)的受體來結(jié)合。靶向配體和細(xì)胞表面受體之間的相互作用允許治療劑或有效載荷選擇性地到達(dá)肌細(xì)胞并且甚至通過受體介導(dǎo)的過程引導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)。

與單一配體相比，與在樹狀聚合物表面上呈現(xiàn)多個(gè)結(jié)合配體相關(guān)的多價(jià)效應(yīng)增強(qiáng)樹狀支架的攝取。由多個(gè)配體的同時(shí)結(jié)合引起的多價(jià)相互作用允許樹狀聚合物提高平臺的結(jié)合親合力，甚至在單個(gè)配體對靶向的受體具有低親和性時(shí)。PAMAM平臺已經(jīng)成功地用作用于連接多價(jià)靶向分子(包括抗體、肽、T-抗原和葉酸)的支架。靶向配體將樹狀聚合物錨定至其中特定受體在細(xì)胞表面上表達(dá)的位置。靶向的樹狀聚合物-藥物偶聯(lián)物特異性地遞送更高劑量至靶向的細(xì)胞而同時(shí)避開正常細(xì)胞，因此避免潛在的全身性毒性。

用乙?；泻蚉AMAM樹狀聚合物的表面胺最小化毒性和非特異性的樹狀聚合物攝取。樹狀聚合物的乙酰基加帽還允許提高從身體的清除，最小化長期治療的影響。氨基封端的PAMAM樹狀聚合物的PEG化降低免疫原性和提高溶解性。與陽離子母體材料相比，PEG封端的樹狀聚合物具有提高的血流半衰期。羥基和甲氧基封端的聚酯樹狀聚合物已經(jīng)顯示出在高達(dá)40mg/kg的濃度下在體內(nèi)是無毒的。已經(jīng)在體內(nèi)證實(shí)了陽離子和陰離子樹狀聚合物之間的毒性差異。使用斑馬魚胚模型，羧基封端的樹狀聚合物的毒性顯著低于G4胺封端的樹狀聚合物。在相同研究中，用RGD的表面修飾也降低了毒性。

將理解以上和本文中描述的所有樹狀聚合物可以用于本發(fā)明的Eno1組合物及其使用方法中。

在特定實(shí)施方案中，包含樹狀聚合物和Eno1的復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與Eno1分子數(shù)的比率為約1:1至約10:1，例如，約1:1，約2:1，約3:1，約4:1，約5:1，約6:1，約7:1，約8:1，約9:1或約10:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含樹狀聚合物和Eno1的復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與Eno1分子數(shù)的比率為約3:1至7:1，例如，3:1，4:1，5:1，6:1或7:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含樹狀聚合物和Eno1的復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與Eno1分子數(shù)的比率為4:1至6:1，例如，3:1，4:1或5:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含樹狀聚合物和Eno1的復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與Eno1分子數(shù)的比率為3:1至5:1，例如，3:1，4:1或5:1。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，包含樹狀聚合物和Eno1的復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與Eno1分子數(shù)的比率為4:1至5:1。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含樹狀聚合物和Eno1的復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與Eno1分子數(shù)的比率為3:1至4:1。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含樹狀聚合物和Eno1的復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與Eno1分子數(shù)的比率為約5:1。

可以通過使用本領(lǐng)域已知的任何常規(guī)方法，如，例如，丙酮酸激酶(PK)/乳酸脫氫酶(LDH)試驗(yàn)或本文中描述的任何其他試驗(yàn)，通過測定樹狀聚合物/Eno1復(fù)合物的Eno1活性(例如，與未復(fù)合的Eno1相比)來測試和選擇復(fù)合物中樹狀聚合物與Eno1的最佳比率。還可以通過在體外試驗(yàn)中評價(jià)樹狀聚合物/Eno1復(fù)合物對葡萄糖攝取的作用，例如，按照本文中實(shí)施例2所述的通過測量人骨骼肌微管(HSMM)中的葡萄糖攝取或本領(lǐng)域已知的任何相似試驗(yàn)，來測試和選擇樹狀聚合物與Eno1的最佳比率。還可以通過在體內(nèi)測量樹狀聚合物/Enol復(fù)合物對血糖水平的作用，例如，按照本文中實(shí)施例7和8中所述的通過測量糖尿病小鼠模型中樹狀聚合物/Eno1復(fù)合物對血糖的作用，或本領(lǐng)域已知的任何相似模型或試驗(yàn)，來測試和選擇樹狀聚合物與Eno1的最佳比率。復(fù)合物中樹狀聚合物與Eno1的最佳比率將優(yōu)選保留體外和/或體內(nèi)的Eno1活性，和/或提供Eno1至細(xì)胞的遞送。

將理解本發(fā)明的組合物和方法包括超過一種樹狀聚合物-Eno1-靶向肽復(fù)合物(即樹狀聚合物-Eno1-靶向肽復(fù)合物群體)的施用。因此，將理解每個(gè)Eno1分子的樹狀聚合物數(shù)可以表示復(fù)合物群體中每個(gè)Eno1的平均樹狀聚合物數(shù)。在特定實(shí)施方案中，至少70％的復(fù)合物具有選定的樹狀聚合物與Eno1的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少75％的復(fù)合物具有選定的樹狀聚合物與Eno1的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少80％的復(fù)合物具有選定的樹狀聚合物與Eno1的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少85％的復(fù)合物具有選定的樹狀聚合物與Eno1的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少90％的復(fù)合物具有選定的樹狀聚合物與Eno1的摩爾比。

在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物/Eno1/靶向肽復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與靶向肽數(shù)的比率為1:0.1至1:10，1:1至1:10，1:1至1:5，或1:1至1:3。在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物分子數(shù)與靶向肽數(shù)的比率為約1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，1:7，1:8，1:9或1:10。在優(yōu)選實(shí)施方案中，樹狀聚合物/Eno1/靶向肽復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與靶向肽數(shù)的比率為約1:1。在優(yōu)選實(shí)施方案中，樹狀聚合物/Eno1/靶向肽復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與靶向肽數(shù)的比率為約1:2。在優(yōu)選實(shí)施方案中，樹狀聚合物/Eno1/靶向肽復(fù)合物中樹狀聚合物分子數(shù)與靶向肽數(shù)的比率為約1:3。

在特定實(shí)施方案中，樹狀聚合物/Eno1/靶向肽復(fù)合物中靶向肽數(shù)與樹狀聚合物分子數(shù)的比率為至少1:1，至少2:1，至少3:1，至少4:1，至少5:1，至少6:1，至少7:1，至少8:1，至少9:1或至少10:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，樹狀聚合物/Eno1/靶向肽復(fù)合物中靶向肽數(shù)與樹狀聚合物分子數(shù)的比率為至少3:1。

將理解本發(fā)明的組合物和方法包括超過一個(gè)靶向肽-Eno1-樹狀聚合物復(fù)合物(即靶向肽-Eno1-樹狀聚合物復(fù)合物群體)的施用。因此，將理解每個(gè)樹狀聚合物的靶向肽數(shù)表示復(fù)合物群中每個(gè)樹狀聚合物的平均靶向肽數(shù)。在特定實(shí)施方案中，至少70％的復(fù)合物具有選定的靶向肽與樹狀聚合物的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少75％的復(fù)合物具有選定的靶向肽與樹狀聚合物的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少80％的復(fù)合物具有選定的靶向肽與樹狀聚合物的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少85％的復(fù)合物具有選定的靶向肽與樹狀聚合物的摩爾比。在特定實(shí)施方案中，至少90％的復(fù)合物具有選定的靶向肽與樹狀聚合物的摩爾比。

可以通過測量樹狀聚合物/Eno1/靶向肽在體內(nèi)對特定組織的靶向，例如，如本文中實(shí)施例6中所述的，通過測量可檢測地標(biāo)記的樹狀聚合物/Eno1/靶向肽復(fù)合物在體內(nèi)的靶向，來選擇樹狀聚合物與靶向肽的最佳比率。

V.血糖水平的指標(biāo)的檢測和測量及控制

用于檢測和測量血糖升高的指標(biāo)和血糖控制的方法可以根據(jù)待測量指標(biāo)的性質(zhì)而改變?？梢灾苯?例如，通過測定血液中葡萄糖的量)或間接(例如，通過檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)的量)測量升高的血糖，且由此測量血糖水平控制的喪失和糖尿病的嚴(yán)重性，糖化血紅蛋白是血紅蛋白和葡萄糖的反應(yīng)產(chǎn)物。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于使用Eno1檢測血糖控制的方法。

本發(fā)明考慮任何合適的手段、技術(shù)和/或程序用于檢測和/或測量本發(fā)明的血糖水平指標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解用于測量本發(fā)明指標(biāo)的方法將至少取決于所檢測或測量的指標(biāo)(例如，葡萄糖、酮類、mRNA或多肽，包括糖化多肽)和生物樣品(例如，全血、血清)的類型。特定的生物樣品在測量本發(fā)明的生物標(biāo)志物之前還可能需要特定的專門處理，例如，在待測量mRNA生物標(biāo)志物(例如，Eno1mRNA)的情況中mRNA的制備。

A.使用確定的指標(biāo)直接或間接測量血糖和血糖控制

血糖監(jiān)控是在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)直接測試血液中的葡萄糖濃度(血糖)的方式。在糖尿病的護(hù)理中特別重要的，血糖測試通過刺穿皮膚(通常，在手指上)以抽血，然后將血液施加于化學(xué)活性的一次性“測試條”上來進(jìn)行。不同的制造商使用不同的技術(shù)，但大部分系統(tǒng)測量電特征，并且使用這種電特征來測定血液中的葡萄糖水平。該測試通常稱作毛細(xì)血管血糖。用于周期性或連續(xù)使用的商業(yè)可購得的血糖監(jiān)測器是本領(lǐng)域已知的。用于周期性檢測血糖水平的葡萄糖監(jiān)測器包括，但不限于，TRUEResult血糖計(jì)(TRUE)、ACCU-CHEK血糖計(jì)(ACCU-CHEK)、OneTouch血糖計(jì)(ONETOUCH)和FreeStyle Lite Blood Glucose(FREESTYLE LITE)。將理解，直接測量的正常血糖水平將根據(jù)最后食用食物后的時(shí)間量而不同，正常的空腹血糖水平低于正常的餐后血糖水平。直接血糖監(jiān)控也用于葡萄糖耐量測試中以監(jiān)控對服用高劑量葡萄糖的反應(yīng)和葡萄糖從血液清除的速率。

糖化血紅蛋白(血紅蛋白A1c、HbA1c、A1C、Hb1C、HbA1c)是主要測量來鑒定延長時(shí)間段上平均血糖濃度的血紅蛋白形式，即血糖的間接測量。HbA1c通過血紅蛋白暴露于血糖而在非酶促糖化途徑中形成。當(dāng)存在正常血糖水平時(shí)，產(chǎn)生正常量的糖化血紅蛋白，其作為總血紅蛋白的百分比或特定的血液濃度測量。當(dāng)血糖水平高時(shí)，產(chǎn)生升高的糖化血紅蛋白水平。糖化是不可逆的反應(yīng)。因此，紅細(xì)胞內(nèi)糖化血紅蛋白的量反映出細(xì)胞已經(jīng)暴露于其中的葡萄糖的平均水平。測量糖化血紅蛋白通過監(jiān)控長期血清葡萄糖調(diào)控而非通過葡萄糖監(jiān)控提供的快照圖像來評價(jià)治療的有效性。HbA1c水平與之前四周至三個(gè)月內(nèi)的平均血糖濃度成比例。例如，可以使用高性能液相色譜(HPLC)或免疫分析來測量HbA1c水平。以下詳細(xì)討論用于檢測和測量蛋白質(zhì)分析物的方法。

B.核酸指示劑的檢測

在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及核酸生物標(biāo)志物(例如，Eno1 mRNA生物標(biāo)志物)的檢測，任選地結(jié)合血糖的其他指示劑，來監(jiān)控受試者中的糖尿病和/或血糖控制，例如，血糖、酮類和/或HbA1c的直接測量。

在各種不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明的診斷/預(yù)后方法通常涉及血樣中Eno1表達(dá)水平的測定。本發(fā)明方法實(shí)施中基因表達(dá)水平的測定可以通過任何合適的方法來進(jìn)行。例如，可以通過檢測從目標(biāo)基因表達(dá)的mRNA的表達(dá)和/或檢測由基因編碼的多肽的表達(dá)來進(jìn)行基因表達(dá)水平的測定。

對于檢測編碼Eno1的核酸，可以使用任何合適的方法，包括但不限于，Southern印跡分析、northern印跡分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(參見，例如，美國專利No.4,683,195；4,683,202和6,040,166；"PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(PCR實(shí)驗(yàn)方案：方法和應(yīng)用指導(dǎo))"，Innis等(編輯)；1990，Academic Press:New York)、逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、錨定PCR、競爭性PCR(參見，例如，美國專利No.5,747,251)、cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)(參見，例如，"Gene Cloning and Analysis:Current Innovations(基因克隆和分析：目前的創(chuàng)新)，1997，pp.99-115)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)(參見，例如，EP 01 320 308)；單邊PCR(Ohara等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1989，86:5673-5677)、原位雜交、基于Taqman的分析(Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.,1991,88:7276-7280)、差異顯示(參見，例如，Liang等，Nucl.Acid.Res.,1993,21:3269-3275)和其他RNA指紋技術(shù)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和其他基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(參見，例如，美國專利No.5,409,818和5,554,527)、Qbeta復(fù)制酶、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、修復(fù)鏈反應(yīng)(RCR)、核酸酶保護(hù)分析、基于減法的方法(subtraction-based method)、等。

在其他實(shí)施方案中，可以通過擴(kuò)增從mRNA產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA(cDNA)或互補(bǔ)RNA(cRNA)并使用微陣列對其進(jìn)行分析來測定Eno1的基因表達(dá)水平。多種不同的陣列構(gòu)造及其生產(chǎn)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見，例如，美國專利No.5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734和5,700,637。微陣列技術(shù)允許同時(shí)測量大量基因的穩(wěn)態(tài)mRNA水平。目前廣泛使用的微陣列包括cDNA陣列和寡核苷酸陣列。使用微陣列的分析通常是基于從標(biāo)記探針接收的信號強(qiáng)度的測量，所述標(biāo)記探針用于檢測來自樣品的與固定于微陣列上已知位置的核酸探針雜交的cDNA序列(參見，例如，美國專利No.6,004,755；6,218,114；6,218,122和6,271,002)?；陉嚵械幕虮磉_(dá)方法是本領(lǐng)域已知的并且在許多科學(xué)出版物以及專利中描述(參見，例如，M.Schena等，Science,1995,270:467-470；M.Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1996,93:10614-10619；J.J.Chen等，Genomics,1998,51:313-324；美國專利No.5,143,854；5,445,934；5,807,522；5,837,832；6,040,138；6,045,996；6,284,460和6,607,885)。

在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過擴(kuò)增和檢測對應(yīng)于Eno1的核酸，任選結(jié)合血糖升高的一種或多種其他指示劑，來鑒別遭受異常血糖的受試者的方法。

用作擴(kuò)增模板的核酸可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等，1989)從生物樣品中所含的細(xì)胞分離。核酸可以是基因組DNA或者片段化或全細(xì)胞RNA。在使用RNA的情況中，將RNA轉(zhuǎn)化成互補(bǔ)cDNA可能是需要的。在一個(gè)實(shí)施方案中，RNA是全細(xì)胞RNA，并且直接用作擴(kuò)增模板。

將與對應(yīng)于本文中鑒定的任一Eno1核苷酸序列的核酸選擇性雜交的引物對在允許選擇性雜交的條件下接觸分離的核酸。一旦雜交，將核酸:引物復(fù)合物接觸一種或多種促進(jìn)模板依賴性核酸合成的酶。進(jìn)行多輪擴(kuò)增，也稱為“循環(huán)”，直至產(chǎn)生足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。接著，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。在特定應(yīng)用中，可以通過視覺方式進(jìn)行檢測。或者，檢測可以涉及通過化學(xué)發(fā)光、摻入的放射性標(biāo)記或熒光標(biāo)記的放射性閃爍掃描法或甚至通過使用電或熱脈沖信號的系統(tǒng)(AFFYMAX技術(shù)；Bellus，1994)的間接產(chǎn)物鑒定。檢測后，可以將給定患者中看到的結(jié)果與正常患者和血糖升高患者(例如，前驅(qū)糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病或1型糖尿病患者)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著參照組進(jìn)行比較。以這種方式，有可能將檢測的核酸量與各種臨床狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。

如本文中限定的，術(shù)語引物表示包括能夠在模板依賴性方法中啟動新生核酸的合成的任何核酸。通常，引物是長度十至二十個(gè)，優(yōu)選十五至二十個(gè)核苷酸的寡核苷酸，但也可以使用更長的序列。引物以雙鏈或單鏈形式來提供，盡管優(yōu)選單鏈形式。

多種模板依賴性方法可用于擴(kuò)增給定模板樣品中存在的核酸序列。最佳的已知擴(kuò)增方法之一是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(稱為PCR)，其詳細(xì)描述于美國專利No.4,683,195，4,683,202和4,800,159以及Innis等，1990中，將其每篇全部按引用并入本文中。

在PCR中，制備兩個(gè)引物序列，其與靶核酸序列的相對互補(bǔ)鏈上的區(qū)域互補(bǔ)。將過量的三磷酸脫氧核苷酸連同DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)一起加入反應(yīng)混合物中。如果樣品中存在靶核酸序列，引物將結(jié)合靶核酸并且聚合酶將通過添加核苷酸引起引物沿著靶核酸序列延伸。通過升高和降低反應(yīng)混合物的溫度，延伸的引物將與靶核酸解離以形成反應(yīng)產(chǎn)物，過量引物將結(jié)合靶核酸和反應(yīng)產(chǎn)物，并且重復(fù)該過程。

可以進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增程序以定量擴(kuò)增的mRNA的量。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法是公知的并且描述于Sambrook等，1989中。逆轉(zhuǎn)錄的替代方法利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。這些方法描述于1990年12月21日提交的WO 90/07641中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法是本領(lǐng)域公知的。

用于擴(kuò)增的另一種方法是連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“LCR”)，公開于歐洲申請No.320 308中，將其全部按引用并入本文中。在LCR中，制備兩個(gè)互補(bǔ)探針對，并且在靶序列存在下，每個(gè)對結(jié)合靶標(biāo)的相對互補(bǔ)鏈，使得它們鄰接。在連接酶的存在下，兩個(gè)探針對連接以形成單個(gè)單元。通過溫度循環(huán)，如PCR中那樣，結(jié)合的連接單元從靶標(biāo)解離，并且隨后用作用于過量探針對連接的“靶序列”。美國專利No.4,883,750描述了一種與LCR類似的用于將探針對結(jié)合靶序列的方法。

Qbeta復(fù)制酶，描述于PCT申請No.PCT/US87/00880中，也可以用作本發(fā)明中的再另一種擴(kuò)增方法。在這種方法中，在RNA聚合酶存在下，將具有與靶標(biāo)的區(qū)域互補(bǔ)的區(qū)域的RNA的重復(fù)序列加入樣品中。聚合酶將復(fù)制該重復(fù)序列，其隨后可以被檢測到。

等溫?cái)U(kuò)增方法可以用于本發(fā)明的核酸擴(kuò)增中，其中使用限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶來獲得在限制性位點(diǎn)的一條鏈中含有核苷酸5’-[α-硫代]-三磷酸的靶分子的擴(kuò)增。Walker等(1992)，將其全部按引用并入本文中。

鏈置換擴(kuò)增(SDA)是進(jìn)行核酸的等溫?cái)U(kuò)增的另一種方法，其涉及多輪鏈置換和合成，即，缺口平移。相似的方法，稱為修復(fù)鏈反應(yīng)(PCR)，涉及在靶向用于擴(kuò)增的整個(gè)區(qū)域中使幾個(gè)探針退火，接著進(jìn)行修復(fù)反應(yīng)，其中只存在四種堿基中的兩種。為了易于檢測，其他兩種堿基可以作為生物素化的衍生物加入。相似的方法用于SDA中。也可以使用循環(huán)探針反應(yīng)(CPR)檢測靶特異性的序列。在CPR中，具有非特異性DNA的3’和5’序列以及特異性RNA的中間序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交時(shí)，用RNase H處理反應(yīng)，并且將探針的產(chǎn)物鑒別為截然不同的產(chǎn)物，其在消化后釋放。將原始模板與另一個(gè)循環(huán)探針退火并重復(fù)該反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明可以使用GB申請No.2 202 328和PCT申請No.PCT/US89/01025中描述的再另外的擴(kuò)增方法，每篇都以其全部按引用并入。在前一申請中，將“修飾的”引物用于PCR樣的、模板和酶依賴性合成中?？梢酝ㄟ^用捕獲部分(例如，生物素)和/或檢測部分(例如，酶)標(biāo)記來修飾引物。在后一申請中，將過量的標(biāo)記引物加入樣品中。在靶序列存在的情況下，探針結(jié)合并通過催化切割。切割后，靶序列完整釋放以被過量的探針結(jié)合。標(biāo)記探針的切割給出靶序列存在的信號。

其他考慮的核酸擴(kuò)增程序包括基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，包括基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和3SR。Kwoh等(1989)；Gingeras等，PCT申請WO 88/10315，將其全部按引用并入本文中。在NASBA中，核酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)苯酚/氯仿萃取、臨床樣品的熱變性、用裂解緩沖液和用于DNA和RNA分離的minispin柱處理或者RNA的鹽酸胍提取來制備用于擴(kuò)增。這些擴(kuò)增技術(shù)涉及使具有靶特異性序列的引物退火。聚合后，用RNase H消化DNA/RNA雜合體，同時(shí)將雙鏈DNA分子再次熱變性。在任一種情況中，通過添加第二靶特異性引物，接著聚合將單鏈DNA制成完全雙鏈的。然后通過聚合酶如T7或SP6多重轉(zhuǎn)錄雙鏈DNA分子。在等溫循環(huán)反應(yīng)中，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA，并用聚合酶如T7或SP6再轉(zhuǎn)錄一次。將所得到的產(chǎn)物(不管是截短的或完整的)表明靶特異性的序列。

Davey等，歐洲申請No.329 822(將其全部按引用并入本文中)公開了涉及循環(huán)合成的單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)的核酸擴(kuò)增方法，其可以根據(jù)本發(fā)明來使用。ssRNA是用于第一引物寡核苷酸的第一模板，其通過逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)來延伸。RNA然后通過核糖核酸酶H(RNase H，對于DNA或RNA雙鏈體中的RNA特異性的RNA酶)的作用從所得到的DNA:RNA雙鏈體除去。所得到的ssDNA是用于第二引物的第二模板，其也包括5’側(cè)與模板同源性的RNA聚合酶啟動子的序列(通過T7RNA聚合酶舉例說明)。然后這個(gè)引物通過DNA聚合酶(通過大腸桿菌DNA聚合酶1的大“Klenow”片段來舉例說明)延伸，從而形成雙鏈DNA(“dsDNA”)分子，具有與引物之間的原始RNA序列相同的序列，并且在一端另外具有啟動子序列。這種啟動子序列可以被合適的RNA聚合酶利用來制備DNA的許多RNA拷貝。這些拷貝隨后可以重新進(jìn)入循環(huán)，導(dǎo)致非常迅速的擴(kuò)增。通過酶的適當(dāng)選擇，可以等溫地進(jìn)行這種擴(kuò)增而不需要在每個(gè)循環(huán)添加酶。由于這種方法的循環(huán)性質(zhì)，可以選擇DNA或RNA形式的起始序列。

Miller等，PCT申請WO 89/06700(將其全部按引用并入本文中)公開了基于啟動子/引物序列與單鏈靶DNA(“ssDNA”)雜交接著轉(zhuǎn)錄該序列的許多RNA拷貝的核酸序列擴(kuò)增方案。這種方案不是循環(huán)的，即，新模板不是從所得到的RNA轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生。其他擴(kuò)增方法包括“race”和“單側(cè)PCR.TM.”。Frohman(1990)和Ohara等(1989)，將每篇都以其全部按引用并入本文中。

基于在具有所得到的“二-寡核苷酸”的序列的核酸存在下連接兩個(gè)(或更多個(gè))寡核苷酸而由此擴(kuò)增二-寡核苷酸的方法也可以用于本發(fā)明的擴(kuò)增步驟中。Wu等(1989)，將其全部按引用并入本文中。

根據(jù)特定的分析形式和特定的需求以及使用的靶向序列，本發(fā)明的寡核苷酸探針或引物可以是任何合適長度的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸探針或引物長度為至少10個(gè)核苷酸(優(yōu)選地，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32…)，優(yōu)選長度至少15個(gè)核苷酸(15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32…)，并且它們可以適應(yīng)地改變以尤其適合于選定的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)和/或使用的雜交系統(tǒng)。較長的探針和引物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)，如本領(lǐng)域公知的。具有超過30，超過40，超過50個(gè)核苷酸的引物和具有超過100，超過200，超過300，超過500，超過800和超過1000個(gè)核苷酸長度的探針也被本發(fā)明涵蓋。當(dāng)然，較長的引物具有更昂貴的缺陷，并且因此，本領(lǐng)域中通常設(shè)計(jì)和使用具有15至30個(gè)核苷酸長度的引物。如本領(lǐng)域公知的，在本發(fā)明的方法中可以使用長度范圍為10至超過2000個(gè)核苷酸的探針。對于上述％同一性，非特意描述的探針和引物的大小(例如，16，17，31，24，39，350，450，550，900，1240個(gè)核苷酸…)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸探針或引物與Eno1RNA(或其互補(bǔ)序列)或Eno1 mRNA特異性地雜交。更優(yōu)選，選擇Eno1引物和探針來檢測與血糖升高或異常血糖調(diào)控相關(guān)的Eno1RNA，該血糖升高或異常血糖調(diào)控與例如前驅(qū)糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病或妊娠糖尿病相關(guān)。

在其他實(shí)施方案中，檢測手段可以利用雜交技術(shù)，例如，其中選擇特異性的引物或探針與目標(biāo)靶生物標(biāo)志物(例如，Eno1)退火，并且此后進(jìn)行選擇性雜交的檢測。如本領(lǐng)域通常所知的，可以通過考慮其雜交的熔點(diǎn)及其靶向的序列來設(shè)計(jì)寡核苷酸探針和引物(參見下文和Sambrook等，1989，Molecular Cloning--A Laboratory Manual(分子克隆--實(shí)驗(yàn)室手冊)，第2版，CSH Laboratories；Ausubel等，1994，見Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)通用實(shí)驗(yàn)方案)，John Wiley&Sons Inc.,N.Y.)。

為了使得能夠在本發(fā)明的測試條件下發(fā)生雜交，寡核苷酸引物和探針應(yīng)當(dāng)包含與Eno1多核苷酸的一部分具有至少70％(至少71％，72％，73％，74％或更高)，優(yōu)選至少75％(75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％或更高)和更優(yōu)選至少90％(90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％)同一性的寡核苷酸序列。本發(fā)明的探針和引物是在嚴(yán)格雜交條件下雜交的那些和在至少中等嚴(yán)格條件下與Eno1同源物雜交的那些。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的探針和引物具有與Eno1基因序列(例如，cDNA或mRNA)的完全序列同一性。應(yīng)當(dāng)理解，通過使用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)比對和序列分析的方法(參考Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊)，第三版，由Cold Spring Harbor Laboratory編輯，2000)，可以基于本文中公開的Eno1序列容易地設(shè)計(jì)其他探針和引物并用于本發(fā)明中。

C.血糖控制的血糖多肽指示劑的檢測

本發(fā)明考慮用于檢測血糖的多肽指示劑(包括Eno1或HbA1c)的任何合適方法。在特定實(shí)施方案中，檢測方法是涉及特異性地結(jié)合Eno1和血紅蛋白中的一種或多種的抗體的免疫檢測方法，尤其是特異性地結(jié)合糖化血紅蛋白。各種有用的免疫檢測方法的步驟已經(jīng)描述于科學(xué)文獻(xiàn)中，如，例如，Nakamura等(1987)，將其按引用并入本文中。

通常，免疫檢測方法包括獲得懷疑含有血糖升高的蛋白質(zhì)或肽指示劑的樣品，并且根據(jù)具體情況，在有效地允許免疫復(fù)合物形成的條件下將樣品接觸根據(jù)本發(fā)明的抗體。

免疫結(jié)合方法包括用于檢測或定量樣品中的反應(yīng)性組分的量，該方法需要檢測或定量在結(jié)合過程中形成的任何免疫復(fù)合物。在此，將獲得懷疑含有血糖升高的蛋白質(zhì)或肽指示劑的樣品，并將樣品接觸抗體，然后檢測或定量在特定條件下形成的免疫復(fù)合物的量。

就血糖指標(biāo)的檢測而言，分析的生物樣品可以是懷疑含有血糖的蛋白質(zhì)或肽指示劑(如Eno1或HbA1c)的任何樣品。在HbA1c的情況中，生物樣品可以是例如血液，或在Eno1的情況中，可以是血液或血清。

在有效地允許免疫復(fù)合物(初級免疫復(fù)合物)形成的條件下并持續(xù)足夠的時(shí)間將選定的生物樣品接觸抗體(例如，作為結(jié)合生物樣品中的Eno1、HbA1c或血紅蛋白的檢測劑)。通常，復(fù)合物形成是將組合物簡單地加入生物樣品中并將混合物孵育對于抗體與存在的任何抗原形成復(fù)合物(即，結(jié)合存在的任何抗原)足夠長的時(shí)間的問題。在這個(gè)時(shí)間后，通常洗滌樣品-抗體組合物，如組織切片、ELISA平板、點(diǎn)印跡或western印跡，以除去任何非特異性結(jié)合的抗體物質(zhì)，從而只允許在初級免疫復(fù)合物內(nèi)特異性結(jié)合的那些抗體被檢測到。

通常，免疫復(fù)合物形成的檢測是本領(lǐng)域公知的并可以通過應(yīng)用多種途徑來實(shí)現(xiàn)。這些方法通?；跇?biāo)記或標(biāo)志物的檢測，如本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)用途的任何放射性、熒光、生物或酶標(biāo)簽或標(biāo)記。關(guān)于此類標(biāo)記使用的美國專利包括美國專利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，將每篇都按引用并入本文中。當(dāng)然，如本領(lǐng)域已知的，可以通過使用第二結(jié)合配體如第二抗體或生物素/抗生物素蛋白配體結(jié)合設(shè)置發(fā)現(xiàn)另外的優(yōu)勢。

檢測中使用的抗體(例如，抗Eno1抗體、抗血紅蛋白或抗糖化血紅蛋白抗體)可以自身連接于可檢測標(biāo)記，其中隨后可以簡單地檢測這種標(biāo)記，由此允許測定組合物中初級免疫復(fù)合物的量。

或者，可以通過對于結(jié)合的抗體具有結(jié)合親和性的第二結(jié)合配體來檢測成為結(jié)合在初級免疫復(fù)合物內(nèi)的第一添加組分。在這些情況中，第二結(jié)合配體可以連接于可檢測標(biāo)記。第二結(jié)合配體自身常常是抗體，其因此可以被稱為“第二”抗體。將初級免疫復(fù)合物在有效地允許次級免疫復(fù)合物形成的條件下接觸標(biāo)記的第二結(jié)合配體或抗體持續(xù)足夠的時(shí)間。然后通常洗滌次級免疫復(fù)合物以除去任何非特異性結(jié)合的標(biāo)記的第二抗體或配體，并且隨后檢測次級免疫復(fù)合物中保留的標(biāo)記。

更多的方法包括通過兩步法檢測初級免疫復(fù)合物。如上所述，將對編碼的蛋白質(zhì)、肽或相應(yīng)的抗體具有結(jié)合親和性的第二結(jié)合配體(如抗體)用于形成次級免疫復(fù)合物。洗滌后，將次級免疫復(fù)合物再次在有效地允許免疫復(fù)合物(三級免疫復(fù)合物)形成的條件下接觸對于第二抗體具有結(jié)合親和性的第三結(jié)合配體或抗體持續(xù)足夠的時(shí)間。第三配體或抗體連接于可檢測標(biāo)記，從而允許檢測由此形成的三級免疫復(fù)合物。該系統(tǒng)可以提供信號擴(kuò)大，如果這是希望的。

本發(fā)明的免疫檢測方法在病癥的診斷中具有明顯的實(shí)用性，所述病癥如升高的血糖、血糖控制的喪失和糖尿病。在此，使用懷疑含有編碼的蛋白質(zhì)或糖化肽的生物或臨床樣品。然而，這些實(shí)施方案對非臨床樣品也具有用途，如在抗原或抗體樣品的滴定中、在雜交瘤的選擇中等等。

本發(fā)明特別考慮了將ELISA用作一種免疫檢測分析類型的用途?？紤]了本發(fā)明的生物標(biāo)志物蛋白或肽將發(fā)現(xiàn)在診斷和預(yù)后監(jiān)控異常血糖和糖尿病的ELISA試驗(yàn)中作為免疫原的用途。免疫分析，以其最簡單和直接的意義，是結(jié)合測試。特定的優(yōu)選免疫分析是本領(lǐng)域已知的各種類型的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和放射免疫試驗(yàn)(RIA)。使用組織切片的免疫組織化學(xué)檢測可能是有用的。然而，將容易地認(rèn)識到檢測不限于這樣的技術(shù)，并且western印跡、點(diǎn)印跡等也可以使用。

在一個(gè)示例性的ELISA中，將與本發(fā)明的蛋白指示劑結(jié)合的抗體固定于呈現(xiàn)蛋白親和性的選定表面上，如聚苯乙烯微滴定平板的孔。然后，將懷疑含有血糖水平指示劑的測試組合物，如血液或血清樣品，加入孔中。在結(jié)合并洗滌除去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物后，可以檢測結(jié)合的抗原。通常通過添加與可檢測標(biāo)記連接的對于指示劑蛋白特異性的第二抗體來實(shí)現(xiàn)檢測。這種類型的ELISA是簡單的“夾心ELISA”。還可以通過添加第二抗體，接著添加對第二抗體具有結(jié)合親和性的第三抗體來實(shí)現(xiàn)檢測，所述第三抗體連接于可檢測標(biāo)記。

在另一個(gè)示例性的ELISA中，將懷疑含有血糖指示劑蛋白的樣品固定于孔表面上，并隨后接觸用于結(jié)合指示劑的特異性抗體。在結(jié)合并洗滌以除去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合物后，檢測結(jié)合的抗原。在初始抗體連接于可檢測標(biāo)記的情況中，可以直接檢測免疫復(fù)合物。再次，可以使用對第一抗體具有結(jié)合親和性的第二抗體來檢測免疫復(fù)合物，所述第二抗體連接于可檢測標(biāo)記。

與使用的形式無關(guān)，ELISA具有特定的共同特征，如涂覆、孵育或結(jié)合，洗滌以除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)，并檢測結(jié)合的免疫復(fù)合物。這些如下所述。

在用抗原或抗體涂覆平板中，通常將用抗原或抗體的溶液孵育平板的孔，孵育過夜或持續(xù)指定的時(shí)間段。然后洗滌平板的孔以除去未完全吸附的材料。然后用對于測試抗血清在抗原上是中性的非特異性蛋白“涂覆”任何剩余的可用孔表面。這些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。涂覆允許封閉固定表面上的非特異性吸附位點(diǎn)并由此降低由抗血清非特異性結(jié)合在表面上引起的背景。

在ELISA中，習(xí)慣上使用次級或三級檢測方式而不是直接程序。因此，蛋白質(zhì)或抗體與孔結(jié)合后，用非反應(yīng)性物質(zhì)涂覆來降低背景，并洗滌以除去未結(jié)合的物質(zhì)，固定表面與對照生物樣品接觸，例如來自具有正常血糖的受試者和/或足夠血糖控制的受試者的血液或血清，以在有效地允許免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的條件下測試。然后免疫復(fù)合物的檢測需要標(biāo)記的第二結(jié)合配體或抗體，或第二結(jié)合配體或抗體與標(biāo)記的第三抗體或第三結(jié)合配體結(jié)合。

短語“在有效地允許免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的條件下”表示所述條件優(yōu)選包括用溶液如BSA、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)/Tween稀釋抗原和抗體。這些添加的試劑也傾向于有助于非特異性背景的降低。

“合適的”條件也表示孵育是在足以允許有效結(jié)合的溫度下并持續(xù)足夠的時(shí)間段。孵育步驟通常為約1至約4小時(shí)，優(yōu)選在大約25至27℃的溫度下，或在約4℃下過夜等等。

在ELISA中的所有孵育步驟后，洗滌接觸的表面以除去非復(fù)合的物質(zhì)。優(yōu)選的洗滌程序包括用溶液洗滌，所述溶液如PBS/Tween或硼酸鹽緩沖液。測試樣品和初始結(jié)合的物質(zhì)之間形成特異性免疫復(fù)合物并隨后洗滌后，可以測定甚至極少量的免疫復(fù)合物的出現(xiàn)。

為了提供檢測手段，第二或第三抗體具有連接的標(biāo)記以允許檢測。優(yōu)選地，標(biāo)記是在用合適的發(fā)色底物孵育時(shí)導(dǎo)致生色的酶。因此，例如，初級或次級免疫復(fù)合物在有利于發(fā)生更多免疫復(fù)合物的形成的條件下用脲酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶或過氧化氫酶偶聯(lián)的抗體接觸和孵育一段時(shí)間(例如，在含有PBS的溶液如PBS-Tween中在室溫下孵育2h)。

用標(biāo)記的抗體孵育并隨后洗滌除去未結(jié)合的物質(zhì)后，將標(biāo)記的量定量，例如，通過用發(fā)色底物(如脲和溴甲酚紫)孵育來定量。然后通過測量顏色產(chǎn)生的程度來定量，例如，使用可見光譜分光光度計(jì)來定量。

也可以使用蛋白質(zhì)質(zhì)譜方法和儀器來測量、定量、檢測和另外分析本發(fā)明的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物/指示劑(例如，Eno1、HbA1c)。蛋白質(zhì)質(zhì)譜是指將質(zhì)譜應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)。盡管不意圖受到限制，兩種途徑通常使用質(zhì)譜來表征蛋白質(zhì)。在第一種中，將完整的蛋白質(zhì)電離，然后引入質(zhì)譜儀中。將這種途徑稱為蛋白質(zhì)分析的“自上而下”策略。用于完整蛋白質(zhì)電離的兩種主要方法是電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)。在第二種途徑中，使用蛋白酶如胰蛋白酶將蛋白質(zhì)酶促消化成較小的肽。隨后將這些肽引入質(zhì)譜儀中，并通過肽質(zhì)量指紋譜或串聯(lián)質(zhì)譜法來鑒定。因此，這后一種途徑(也稱為“自下而上”蛋白質(zhì)組學(xué))使用肽水平的鑒定來推斷蛋白質(zhì)的存在。

可以使用飛行時(shí)間(TOF)MS或傅立葉變換離子回旋共振(FT-ICR)來進(jìn)行本發(fā)明的生物標(biāo)志物的全蛋白質(zhì)質(zhì)量分析。因?yàn)樗鼈兊膶捹|(zhì)量范圍，并且在FT-ICR的情況中，由于其高質(zhì)量準(zhǔn)確性，這兩種類型的儀器是有用的。用于肽質(zhì)量分析的最廣泛使用的儀器是MALDI飛行時(shí)間儀器，因?yàn)樗鼈冊试S以高步幅獲取肽質(zhì)量指紋(PMF)(1PMF可以在大約10秒內(nèi)分析)。本申請中還可以使用多階段四極飛行時(shí)間和四極離子阱。

還可以在共同存在于生物介質(zhì)或樣品中的蛋白質(zhì)和分子的復(fù)雜混合物中測量蛋白質(zhì)指示劑，然而，本文中可能需要在考慮樣品的分級。將理解，蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物的電離可能導(dǎo)致其中更豐富的蛋白質(zhì)具有“淹沒”或遏制來自同一樣品中較不豐富的蛋白質(zhì)的信號的趨勢。此外，由于混合物組分的巨大數(shù)量，來自復(fù)雜混合物的質(zhì)譜可能難以解釋。在質(zhì)譜分析前，可以使用分級來首先分離蛋白質(zhì)的任何復(fù)雜混合物。有兩種方法廣泛用于將蛋白質(zhì)或其來自酶消化的肽產(chǎn)物分級。第一種方法將完整蛋白質(zhì)分級并且稱為二維凝膠電泳。第二種方法，高效液相色譜(LC或HPLC)，用于將酶消化后的肽分級。在一些情況中，結(jié)合這兩種技術(shù)可能是理想的。本文中也考慮了本領(lǐng)域已知的用于將蛋白質(zhì)混合物分級的任何其他合適的方法。

2D凝膠上確定的凝膠斑點(diǎn)通?？蓺w屬于一種蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)的身份是所需要的，通常應(yīng)用凝膠內(nèi)消化的方法，其中切除目標(biāo)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，并通過蛋白水解消化?？梢允褂秒馁|(zhì)量指紋譜通過質(zhì)譜測定從消化獲得的肽質(zhì)量。如果這種信息不允許蛋白質(zhì)的明確鑒定，則可以將其肽進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜法用于從頭測序。

使用HPLC/MS表征蛋白質(zhì)混合物在本領(lǐng)域中也可以稱為“鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)”和MuDPIT(多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù))。通過一個(gè)或兩個(gè)液相色譜(LC)步驟將從蛋白質(zhì)混合物的消化得到的肽混合物分級。來自色譜階段的洗脫液可以通過電噴霧電離直接引入質(zhì)譜儀，或設(shè)置在一系列斑點(diǎn)上用于之后使用MALDI的質(zhì)量分析。

可以利用各種技術(shù)使用MS來鑒定蛋白質(zhì)指示劑(例如，Eno1或Hb1Ac)，本文中考慮了全部這些技術(shù)。肽質(zhì)量指紋譜使用蛋白水解肽的質(zhì)量作為檢索數(shù)據(jù)庫的預(yù)測質(zhì)量的輸入，其從一系列已知蛋白質(zhì)的消化產(chǎn)生。如果參照列表中的蛋白質(zhì)序列產(chǎn)生了相當(dāng)大數(shù)量的匹配實(shí)驗(yàn)值的預(yù)測質(zhì)量，存在這種蛋白質(zhì)存在于原始樣品中的一些證據(jù)。將進(jìn)一步理解，用于自動化的、數(shù)據(jù)依賴性電噴霧電離(ESI)串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)結(jié)合微毛細(xì)管液相色譜(LC)和數(shù)據(jù)庫檢索的方法和儀器的開發(fā)已經(jīng)顯著提高了凝膠分離蛋白質(zhì)的鑒定靈敏度和速度。微毛細(xì)管LC-MS/MS已經(jīng)成功用于直接來自混合物的單個(gè)蛋白質(zhì)的大規(guī)模鑒定而沒有凝膠電泳分離(Link等，1999；Opitek等，1997)。

幾種最近的方法允許通過質(zhì)譜來定量蛋白質(zhì)。例如，碳(13C)或氮(15N)的穩(wěn)定的(例如，非放射性的)重同位素可以加入一個(gè)樣品中，同時(shí)另一個(gè)可以用相應(yīng)的輕同位素(例如，12C和14N)標(biāo)記。在分析前，將兩個(gè)樣品混合。由于其質(zhì)量差異，可以區(qū)分源自不同樣品的肽。其峰強(qiáng)度的比例對應(yīng)于肽(和蛋白質(zhì))的相對豐度比率。用于同位素標(biāo)記的最常用方法是SILAC(細(xì)胞培養(yǎng)物中通過氨基酸的穩(wěn)定同位素標(biāo)記)、胰蛋白酶催化的18O標(biāo)記、ICAT(同位素編碼的親和性標(biāo)簽)、iTRAQ(用于相對和絕對定量的同重同位素標(biāo)記)。可以進(jìn)行“半定量”質(zhì)譜而不需要樣品的標(biāo)記。通常，這使用MALDI分析來進(jìn)行(以線性模式)。來自單個(gè)分子(通常是蛋白質(zhì))的峰強(qiáng)度或峰面積在此與樣品中的蛋白質(zhì)量相關(guān)聯(lián)。然而，單個(gè)信號取決于蛋白質(zhì)的初級結(jié)構(gòu)、樣品的復(fù)雜性和儀器的設(shè)置。其他類型的“無標(biāo)記”定量質(zhì)譜使用消化蛋白質(zhì)的譜計(jì)數(shù)(或肽計(jì)數(shù))作為用于測定相對蛋白質(zhì)量的手段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可以根據(jù)以下示例性方法，使用質(zhì)譜從復(fù)雜生物樣品鑒別和定量任何一種或多種蛋白質(zhì)指示劑(例如，Enol，HbA1c)，所述示例性方法不是意圖限制本發(fā)明或其他基于質(zhì)譜的方法的使用。

在這個(gè)實(shí)施方案的第一個(gè)步驟中，(A)將包含蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物(包括至少一種目標(biāo)指示劑)的生物樣品，例如，懷疑血糖提高的生物樣品分級，并用穩(wěn)定的同位素X標(biāo)記。(B)接著，將已知量的內(nèi)標(biāo)加入生物樣品中，其中通過將與該至少一種目標(biāo)靶生物標(biāo)志物相同的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分級并用穩(wěn)定的同位素Y標(biāo)記來制備內(nèi)標(biāo)。(C)然后將獲得的這種樣品引入LC-MS/MS設(shè)備中，并且使用針對內(nèi)標(biāo)選擇的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)過渡進(jìn)行MRM分析以獲得MRM色譜圖。(D)然后觀察MRM色譜圖以鑒定源自生物樣品的顯示出與源自內(nèi)標(biāo)的肽(內(nèi)標(biāo)肽)相同的保留時(shí)間的靶肽生物標(biāo)志物，并通過將內(nèi)標(biāo)肽的峰面積與靶肽指示劑的峰面積進(jìn)行比較來定量測試樣品中的靶蛋白指示劑。

任何合適的生物樣品可以用作LC-MS/MS/MRM分析的起始點(diǎn)，包括源自血液、尿液、唾液、毛發(fā)、細(xì)胞、細(xì)胞組織、活檢材料及其處理產(chǎn)物的生物樣品；以及通過基因重組技術(shù)制備的含蛋白質(zhì)樣品。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案包括使用血液或血清樣品。

以下進(jìn)一步描述以上步驟(A)至(D)中的每一個(gè)。

步驟(A)(分級和標(biāo)記)。在步驟(A)中，將靶蛋白指示劑分級成肽的集合，其隨后用穩(wěn)定的同位素X來標(biāo)記。為了將靶蛋白分級，例如，可以使用用蛋白水解酶(蛋白酶)(如胰蛋白酶)和化學(xué)切割方法(如使用溴化氰的方法)消化靶蛋白的方法。優(yōu)選通過蛋白酶的消化。如果允許蛋白水解消化進(jìn)行完全，則已知給定摩爾量的蛋白質(zhì)對于每種胰蛋白酶肽切割產(chǎn)物產(chǎn)生相同的摩爾量。因此，測定給定蛋白質(zhì)的胰蛋白酶肽的摩爾量允許測定樣品中原始蛋白質(zhì)的摩爾量。可以通過測定蛋白酶消化中含有的靶蛋白衍生的肽(肽集合)的絕對量來完成靶蛋白的絕對定量。因此，為了允許蛋白水解消化進(jìn)行完全，優(yōu)選在用胰蛋白酶進(jìn)行蛋白酶消化前進(jìn)行還原和烷基化處理以還原并烷基化靶蛋白中所含的二硫鍵。

隨后，將獲得的消化產(chǎn)物(肽集合，包含生物樣品中靶生物標(biāo)志物的肽)進(jìn)行用穩(wěn)定的同位素X的標(biāo)記。穩(wěn)定的同位素X的實(shí)例包括氫原子的1H和2H、碳原子的12C和13C以及氮原子的14N和15N?？梢詮钠浜线m地選擇任何同位素?？梢酝ㄟ^將消化產(chǎn)物(肽集合)與含有穩(wěn)定同位素的試劑反應(yīng)來進(jìn)行穩(wěn)定同位素X的標(biāo)記。商業(yè)上可購得的此類試劑的優(yōu)選實(shí)例包括(由Applied Biosystems生產(chǎn))，其是胺特異性的穩(wěn)定同位素試劑盒。由2種或3種作為同位素標(biāo)記結(jié)果在其間具有恒定質(zhì)量差異并且結(jié)合肽的N-端或賴氨酸殘基的伯胺的試劑(-輕和-重；或-D0、-D4和-D8)組成。

步驟(B)(內(nèi)標(biāo)的添加)。在步驟(B)中，將已知量的內(nèi)標(biāo)加入步驟(A)獲得的樣品中。本文中使用的內(nèi)標(biāo)是通過將由與待測量的靶蛋白(靶生物標(biāo)志物)相同的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì))分級并用穩(wěn)定的同位素Y標(biāo)記獲得的消化產(chǎn)物(肽集合)而獲得的消化產(chǎn)物(肽集合)。分級處理可以與以上針對靶蛋白的相同方式來進(jìn)行。用穩(wěn)定的同位素Y標(biāo)記也可以與以上針對靶蛋白的相同方式來進(jìn)行。然而，本文中使用的穩(wěn)定同位素Y必須具有與用于標(biāo)記靶蛋白消化產(chǎn)物的穩(wěn)定同位素X不同的質(zhì)量。例如，在使用上述mTRAQ(注冊商標(biāo))(由Applied Biosystems生產(chǎn))的情況中，在將mTRAQ-輕用于標(biāo)記靶蛋白消化產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用mTRAQ-重來標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)蛋白消化產(chǎn)物。

步驟(C)(LC-MS/MS和MRM分析)。在步驟(C)中，首先將步驟(B)中獲得的樣品放置在LC-MS/MS設(shè)備中，然后使用針對內(nèi)標(biāo)選定的MRM過渡來進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)分析。通過使用LC-MS/MS設(shè)備的LC(液相色譜)，首先通過一維或多維高效液相色譜來分離步驟(B)中獲得的樣品(用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽集合)。這樣的液相色譜的特定實(shí)例包括陽離子交換色譜，其中通過利用肽之間的電荷差異來進(jìn)行分離；和反相色譜，其中通過利用肽之間的疏水性差異來進(jìn)行分離。這兩種方法可以結(jié)合使用。

隨后，將每種分離的肽通過使用包括兩臺串聯(lián)連接的質(zhì)譜儀的串聯(lián)質(zhì)譜儀(MS/MS質(zhì)譜儀)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。使用這樣的質(zhì)譜儀使得能夠檢測幾飛摩爾(fmol)水平的靶蛋白。此外，MS/MS分析使得能夠分析肽上的內(nèi)部序列信息，因此能夠?qū)崿F(xiàn)無假陽性的鑒別。其他類型的MS分析儀也可以使用，包括扇形磁場質(zhì)譜儀(Sector MS)、四極質(zhì)譜儀(QMS)、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOFMS)和傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(FT-ICRMS)，以及這些分析儀的組合。

隨后，將獲得的數(shù)據(jù)通過搜索引擎來進(jìn)行譜比對和列出針對每個(gè)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)檢測的肽。優(yōu)選將檢測的肽針對每個(gè)蛋白質(zhì)分組，并且優(yōu)選至少三個(gè)具有大于前體離子的m/z值的片段和至少三個(gè)具有優(yōu)選500或更大的m/z值的三個(gè)片段在譜上以信號強(qiáng)度遞減的順序選自各個(gè)MS/MS譜。以強(qiáng)度的遞減順序從這些選擇兩個(gè)或更多個(gè)片段，并且將強(qiáng)度的平均值限定為MRR過渡的預(yù)期靈敏度。當(dāng)從一個(gè)蛋白質(zhì)檢測到多個(gè)肽時(shí)，使用預(yù)期靈敏度作為指數(shù)選擇至少兩個(gè)具有最高靈敏度的肽作為標(biāo)準(zhǔn)肽。

步驟(D)(測試樣品中靶蛋白的定量)。步驟(D)包括在步驟(C)中檢測的MRM色譜圖中鑒別顯示出與源自內(nèi)標(biāo)的肽(內(nèi)標(biāo)肽)相同的保留時(shí)間的源自靶蛋白(目標(biāo)靶生物標(biāo)志物)的肽，并通過將內(nèi)標(biāo)肽的峰面積與靶肽的峰面積進(jìn)行比較來定量測試樣品中的靶蛋白?？梢酝ㄟ^利用之前制備的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的校準(zhǔn)曲線來定量靶蛋白。

可以通過以下方法來制備校準(zhǔn)曲線。首先，如上所述，用蛋白酶(如胰蛋白酶)消化由與靶生物標(biāo)志物蛋白相同的氨基酸序列組成的重組蛋白。隨后，用兩種不同類型的穩(wěn)定同位素單獨(dú)地標(biāo)記已知濃度的前體片段過渡選擇標(biāo)準(zhǔn)(PFTS)(即，一種用用于標(biāo)記內(nèi)標(biāo)肽的穩(wěn)定異構(gòu)體標(biāo)記(用IS標(biāo)記)，而另一種用用于標(biāo)記靶肽的穩(wěn)定異構(gòu)體標(biāo)記(用T標(biāo)記))。通過將特定量的IS標(biāo)記的PTFS與各種濃度的T標(biāo)記的PTFS混合來產(chǎn)生多個(gè)樣品。將這些樣品置于上述LC-MS/MS設(shè)備中以進(jìn)行MRM分析。將獲得的MRM色譜圖上的T-標(biāo)記的PTFS與IS-標(biāo)記的PTFS的面積比(T-標(biāo)記的PTFS/IS-標(biāo)記的PTFS)相對于T-標(biāo)記的PTFS的量進(jìn)行作圖以制備校準(zhǔn)曲線。可以通過參照校準(zhǔn)曲線來計(jì)算測試樣品中所含的靶蛋白的絕對量。

D.抗體和標(biāo)記(例如，熒光部分和染料)

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括用于本發(fā)明生物分子(例如，單獨(dú)或結(jié)合血糖和血糖控制的至少一種其他指示劑(例如，HbA1c、酮類)的Eno1)的高靈敏度檢測和定量或用于血糖的直接測量的標(biāo)記的方法和組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到許多策略可以用于標(biāo)記靶分子以使得其能夠在顆?；旌衔镏袡z測或區(qū)分(例如，標(biāo)記的抗Eno1抗體或標(biāo)記的二抗，或與Eno1 mRNA特異性地雜交的標(biāo)記的寡核苷酸探針)。標(biāo)記可以通過任何已知方式來連接，包括利用標(biāo)記和靶標(biāo)的非特異性或特異性相互作用的方法。標(biāo)記可以提供可檢測的信號或影響顆粒在電場中的移動性。此外，標(biāo)記可以直接地或通過結(jié)合伴體來完成。

在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記包括結(jié)合目標(biāo)指示劑的結(jié)合伴體，其中結(jié)合伴體連接于熒光部分。本發(fā)明的組合物和方法可以利用高熒光部分，例如，在通過所述部分激發(fā)波長下的激光發(fā)射光刺激時(shí)能夠發(fā)射至少約200個(gè)光子的部分，其中激光聚焦于含有所述部分的不小于約5微米直徑的點(diǎn)上，并且其中在所述點(diǎn)處由激光指引的總能量不超過約3微焦耳。以下更詳細(xì)地描述適用于本發(fā)明的組合物和方法的部分。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測生物分子的標(biāo)記，包括連接于熒光部分的生物分子的結(jié)合伴體，其中當(dāng)通過所述部分激發(fā)波長下的激光發(fā)射光刺激時(shí)，所述熒光部分能夠發(fā)射至少約200個(gè)光子，其中激光聚焦于含有所述部分的不小于約5微米直徑的點(diǎn)上，并且其中在所述點(diǎn)處由激光指引的總能量不超過約3微焦耳。在一些實(shí)施方案中，所述部分包含多個(gè)熒光實(shí)體，例如，約2至4，2至5，2至6，2至7，2至8，2至9，2至10，或約3至5，3至6，3至7，3至8，3至9，或3至10個(gè)熒光實(shí)體。在一些實(shí)施方案中，所述部分包括約2至4個(gè)熒光實(shí)體。在一些實(shí)施方案中，生物分子是蛋白質(zhì)或小分子。在一些實(shí)施方案中，生物分子是蛋白質(zhì)。熒光實(shí)體可以是熒光染料分子。在一些實(shí)施方案中，熒光染料分子包含至少一個(gè)取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)，其中吲哚環(huán)的3-碳上的取代基含有化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)或偶聯(lián)物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，染料分子是選自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 700的Alexa Fluor分子。在一些實(shí)施方案中，染料分子是選自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 700的Alexa Fluor分子。在一些實(shí)施方案中，染料分子是Alexa Fluor 647染料分子。在一些實(shí)施方案中，染料分子包括第一類型和第二類型的染料分子，例如，兩種不同的Alexa Fluor分子，例如，在第一類型和第二類型的染料分子具有不同發(fā)射譜的情況中。第一類型與第二類型染料分子的數(shù)量比可以為例如，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3或1:4。結(jié)合伴體可以是例如抗體。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于檢測本發(fā)明的生物指示劑的標(biāo)記，其中標(biāo)記包含指示劑的結(jié)合伴體和熒光部分，其中當(dāng)通過所述部分激發(fā)波長下的激光發(fā)射光刺激時(shí)，所述熒光部分能夠發(fā)射至少約200個(gè)光子，其中激光聚焦于含有所述部分的不小于約5微米直徑的點(diǎn)上，并且其中在所述點(diǎn)處由激光指引的總能量不超過約3微焦耳。在一些實(shí)施方案中，熒光部分包含熒光分子。在一些實(shí)施方案中，熒光部分包含多個(gè)熒光分子，例如，約2至10，2至8，2至6，2至4，3至10，3至8或3至6個(gè)熒光分子。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記包含約2至4個(gè)熒光分子。在一些實(shí)施方案中，熒光染料分子包含至少一個(gè)取代的吲哚環(huán)系統(tǒng)，其中吲哚環(huán)的3-碳上的取代基含有化學(xué)反應(yīng)性基團(tuán)或偶聯(lián)物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，熒光分子選自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 700。在一些實(shí)施方案中，熒光分子選自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 680或Alexa Fluor 700。在一些實(shí)施方案中，熒光分子是Alexa Fluor 647分子。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合伴體包括抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。在其他實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體。

在各種不同的實(shí)施方案中，用于檢測目標(biāo)指示劑(例如，Eno1或HbA1c)的結(jié)合伴體是抗體或其抗原結(jié)合片段。如本文中使用的術(shù)語“抗體”是寬泛術(shù)語并且以其普通含義來使用，包括，不限于，是指天然產(chǎn)生的抗體以及非天然產(chǎn)生的抗體，包括，例如，單鏈抗體、嵌合、雙功能和人源化抗體，及其抗原結(jié)合片段。抗體的“抗原結(jié)合片段”是指抗體參與抗原結(jié)合的部分。抗原結(jié)合位點(diǎn)由重(“H”)和輕(“L”)鏈的N-末端可變(“V”)區(qū)的氨基酸殘基形成。將認(rèn)識到抗體由其產(chǎn)生的表位或分子區(qū)域的選擇將決定其特異性，例如，對于分子的各種形式(如果存在)的特異性，或?qū)τ诳傮w(例如，全部，或基本上全部的分子)的特異性。

用于生產(chǎn)抗體的方法是良好確定的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到許多程序可用于抗體的生產(chǎn)，例如，如Antibodies,A Laboratory Manual(抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊)，Harlow和David Lane編輯，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)，Cold Spring Harbor，N.Y中描述的。本領(lǐng)域技術(shù)人員還理解，模擬抗體的結(jié)合片段或Fab片段也可以通過各種程序從遺傳信息制備(Antibody Engineering:A Practical Approach(抗體工程：實(shí)踐方法)(Borrebaeck,C.等)，1995，Oxford University Press，Oxford；J.Immunol.149,3914-3920(1992))。分子(例如，蛋白質(zhì))和標(biāo)志物的單克隆和多克隆抗體也可以從商業(yè)上購得(R and D Systems,Minneapolis,Minn.；HyTest,HyTest Ltd.,Turku Finland；Abcam Inc.,Cambridge,Mass.,USA,Life Diagnostics,Inc.,West Chester,Pa.,USA；Fitzgerald Industries International,Inc.,Concord,Mass.01742-3049USA；BiosPacific,Emeryville,Calif.)。

在一些實(shí)施方案中，抗體是多克隆抗體。在其他實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。

可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任何一種來制備抗體(參見，例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊)，Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。通常，可以通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)抗體，包括如本文中所述的單克隆抗體的產(chǎn)生，或通過抗體基因轉(zhuǎn)染至合適的細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞宿主中，以允許產(chǎn)生重組抗體。

可以使用雜交瘤方法，如Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol.6:511-519,1976)的技術(shù)，及其改進(jìn)來制備單克隆抗體。這些方法涉及能夠產(chǎn)生具有所需特異性的抗體的永生細(xì)胞系的制備。還可以通過重組DNA方法，如美國專利No.4,816,567中所述的那些，來制得單克隆抗體?？梢允褂贸Ｒ?guī)程序來分離和測序編碼所公開的方法中使用的抗體的DNA。重組抗體、抗體片段和/或其融合體可以在體外或在原核細(xì)胞(例如，細(xì)菌)或真核細(xì)胞(例如，酵母、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞)中表達(dá)，并進(jìn)一步按照需要使用公知方法來純化。

更特別地，可以通過使用公知技術(shù)，如美國專利No.4,196,265(按引用并入本文中)中舉例說明的那些，來容易地制備單克隆抗體(MAb)。通常，這種技術(shù)涉及用選定的免疫原組合物(例如，純化或部分純化的表達(dá)的蛋白質(zhì)、多肽或肽)免疫合適的動物。免疫組合物以有效刺激抗體產(chǎn)生細(xì)胞的方式來施用。用于產(chǎn)生單克隆抗體(MAb)的方法通常沿著與用于制備多克隆抗體的那些相同的路線開始。嚙齒動物，如小鼠和大鼠，是優(yōu)選的動物，然而，使用兔子、綿羊或青蛙細(xì)胞也是可能的。使用大鼠可以提供特定的優(yōu)勢(Goding，1986，pp.60-61)，但優(yōu)選是小鼠，BALB/c小鼠是最優(yōu)選的，因?yàn)檫@是最常規(guī)使用的并且通常給予較高百分比的穩(wěn)定融合體。

給動物注射如上所述的抗原。如果需要，抗原可以與載體分子如鑰孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)?？乖ǔＥc佐劑混合，如弗氏完全或不完全佐劑。用相同抗原的增強(qiáng)注射將以大約兩周間隔進(jìn)行。免疫后，選擇具有產(chǎn)生抗體潛能的體細(xì)胞，尤其是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)，用于MAb產(chǎn)生方案中。這些細(xì)胞可以獲自活檢的脾、扁桃體或淋巴結(jié)，或來自外周血樣品。脾細(xì)胞和外周血細(xì)胞是優(yōu)選的，前者是因?yàn)樗鼈兪翘幱诜至褲{母細(xì)胞期中的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的豐富來源，而后者是因?yàn)橥庵苎菀撰@得。通常，一組動物進(jìn)行免疫并去除具有最高抗體滴度的動物的脾，且通過用注射器均質(zhì)脾來獲得脾淋巴細(xì)胞。

然后將來自免疫動物的抗體產(chǎn)生B淋巴細(xì)胞與永生化骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合，通常是與免疫動物相同物種的細(xì)胞。適用于雜交瘤產(chǎn)生融合過程的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選是非抗體產(chǎn)生的，具有高融合效率和使得其不能夠在只支持所需融合細(xì)胞(雜交瘤)生長的特定選擇性培養(yǎng)基中生長的酶缺陷。

然后將選定的雜交瘤連續(xù)稀釋，并克隆至單個(gè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞系中，該克隆隨后可以無限繁殖以提供MAb?？梢砸詢煞N基本方式來利用細(xì)胞系用于MAb生產(chǎn)。可以將雜交瘤的樣品注射(常常是注射入腹膜腔中)到用于提供原始融合的體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的類型的組織相容性動物中。被注射的動物產(chǎn)生分泌由融合細(xì)胞雜合體產(chǎn)生的特異性單克隆抗體的腫瘤。然后可以汲取動物的體液，如血清或腹水，以提供高濃度的MAb。也可以在體外培養(yǎng)單獨(dú)的細(xì)胞系，其中MAb天然地分泌至培養(yǎng)基中，從其中可以容易地獲得高濃度的MAb。如果需要，通過任一種方式產(chǎn)生的MAb可以使用過濾、離心和各種色譜方法，如HPLC或親和性色譜來進(jìn)一步純化。

還可以通過在體內(nèi)繁殖雜交瘤細(xì)胞來獲得大量的本發(fā)明的單克隆抗體。將細(xì)胞克隆注射入與親本細(xì)胞組織相容的哺乳動物中，例如，同系小鼠，以引起抗體產(chǎn)生腫瘤的生長。任選地，在注射前，用烴，尤其是油，如姥鮫烷(四甲基十五烷)，刺激動物。

根據(jù)本發(fā)明，可以通過包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通過化學(xué)還原切割二硫鍵的方法從按照上述產(chǎn)生的單克隆抗體獲得本發(fā)明的單克隆抗體的片段?；蛘?，可以使用自動化肽合成儀來合成本發(fā)明包括的單克隆抗體片段。

抗體還可以源自基于氨基酸序列的重組抗體文庫，所述氨基酸序列在計(jì)算機(jī)(in silico)中設(shè)計(jì)并由合成產(chǎn)生的多核苷酸編碼。用于設(shè)計(jì)和獲得計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的序列的方法是本領(lǐng)域已知的(Knappik等，J.Mol.Biol.296:254:57-86,2000；Krebs等，J.Immunol.Methods254:67-84,2001；美國專利No.6,300,064)。

可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)來進(jìn)行抗體的消化以產(chǎn)生其抗原結(jié)合片段。例如，蛋白水解酶木瓜蛋白酶優(yōu)先切割I(lǐng)gG分子以產(chǎn)生幾個(gè)片段，其中兩個(gè)(“F(ab)”片段)各自包括共價(jià)異二聚物(其包括完整的抗原結(jié)合位點(diǎn))。胃蛋白酶能夠切割I(lǐng)gG分子以提供幾個(gè)片段，包括“F(ab’)₂”片段，其包括兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)?！癋v”片段可以通過IgM、IgG或IgA免疫球蛋白分子的優(yōu)先蛋白水解切割來產(chǎn)生，但更通常使用本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)來衍生。Fv片段包括非共價(jià)V_H::V_L異二聚體(其包括抗原結(jié)合位點(diǎn))，其保留天然抗體分子的許多抗原識別和結(jié)合能力(Inbar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2659-2662(1972)；Hochman等，Biochem.15:2706-2710(1976)和Ehrlich等，Biochem.19:4091-4096(1980))。

也可以使用已知技術(shù)，如美國專利No.5,885,793中描述的那些，從scFv文庫分離特異性地結(jié)合本文中公開的多肽指示劑的抗體片段。

廣泛的表達(dá)系統(tǒng)在本領(lǐng)域中可得而用于抗體片段的產(chǎn)生，包括Fab片段、scFv、VL和VH。例如，原核和真核兩者來源的表達(dá)系統(tǒng)可以用于抗體片段的大規(guī)模生產(chǎn)。特別有利的是允許大量抗體片段分泌至培養(yǎng)基中的表達(dá)系統(tǒng)。已經(jīng)描述了用于抗體片段和抗體融合蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)的真核表達(dá)系統(tǒng)，其基于哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物、轉(zhuǎn)基因動物和低等真核細(xì)胞。例如，可以在酵母發(fā)酵系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)抗體片段的經(jīng)濟(jì)的、大規(guī)模的生產(chǎn)。這些生物體的大規(guī)模發(fā)酵是本領(lǐng)域公知的并且目前用于幾種重組蛋白的大量生產(chǎn)。

結(jié)合本發(fā)明方法中使用的多肽生物標(biāo)志物的抗體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并且在一些情況能夠使商業(yè)上可購得的或不需要過度實(shí)驗(yàn)即可獲得。

在再其他實(shí)施方案中，特別是在其中將寡核苷酸用作結(jié)合伴體來檢測和與mRNA生物標(biāo)志物或其他基于核酸的生物標(biāo)志物雜交的情況中，結(jié)合伴體(例如，寡核苷酸)可以包括標(biāo)記，例如，熒光部分或染料。此外，本發(fā)明的任何結(jié)合伴體，例如，抗體，也可以用熒光部分來標(biāo)記。作為本文中使用的術(shù)語，“熒光部分”包括一種或多種其總熒光使得在本文中所述的單分子檢測儀中可以檢測所述部分的熒光實(shí)體。因此，熒光部分可以包括單個(gè)實(shí)體(例如，量子點(diǎn)或熒光分子)或多個(gè)實(shí)體(例如，多個(gè)熒光分子)。將認(rèn)識到作為本文中使用的術(shù)語，在“部分”是指一組熒光實(shí)體時(shí)，例如，多個(gè)熒光染料分子，每個(gè)單獨(dú)實(shí)體可以獨(dú)立地連接于結(jié)合伴體或所述實(shí)體可以一起連接，只要實(shí)體作為一組提供待檢測的足夠熒光。

通常，所述部分的熒光涉及量子效率和缺乏漂白的組合，足夠使得所述部分在單分子檢測器中高于背景水平而可檢測，具有對于試驗(yàn)的期望檢測限、準(zhǔn)確性和精確性所需要的一致性。例如，在一些實(shí)施方案中，熒光部分的熒光使得其允許在本文中所述的儀器中以低于約10，5，4，3，2，1，0.1，0.001，0.00001或0.000001pg/ml的檢測限和低于約20，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1％或更低的變異系數(shù)，例如，約10％或更低，檢測和/或定量分子，例如，標(biāo)志物。在一些實(shí)施方案中，熒光部分的熒光使得其允許在本文中所述的儀器中以低于約5，1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.001pg/ml的檢測限和低于約10％的變異系數(shù)檢測和/或定量分子，例如，標(biāo)志物。作為本文中使用的那些術(shù)語，“檢測限”或LoD，包括可以將樣品鑒定為含有目標(biāo)物質(zhì)的分子的最低濃度，例如，第一個(gè)非零值。其可以通過零位(zeros)的變化性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來定義。例如，可以通過運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線零值并給該值添加2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差來確定試驗(yàn)的檢測限?？梢援a(chǎn)生等于該值的信號的目標(biāo)物質(zhì)的濃度即為“檢測下限”濃度。

此外，所述部分具有與其在所選擇的試驗(yàn)中的使用一致的特性。在一些實(shí)施方案中，所述試驗(yàn)是免疫分析，其中熒光部分連接于抗體；所述部分必須具有使得其不會與其他抗體或蛋白聚集或不經(jīng)歷超過與所需的試驗(yàn)準(zhǔn)確性和精確性一致的聚集的特性。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的熒光部分是具有1)高吸收系數(shù)；2)高量子產(chǎn)率；3)高光穩(wěn)定性(低光漂白)；和4)與目標(biāo)分子(蛋白)的標(biāo)記的相容性的組合的熒光部分，例如，染料分子，使得其可以使用本發(fā)明的分析儀和系統(tǒng)進(jìn)行分析(例如，沒有引起目標(biāo)蛋白的沉淀、所述部分已經(jīng)連接的蛋白的沉淀)。

可以使用任何合適的熒光部分。實(shí)例包括，但不限于，Alexa Fluor染料(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)。Alexa Fluor公開于美國專利No.6,977,305；6,974,874；6,130,101和6,974,305中，將其全部按引用并入本文中。本發(fā)明的一些實(shí)施方案利用選自Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750的染料。本發(fā)明的一些實(shí)施方案利用選自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750的染料。本發(fā)明的一些實(shí)施方案利用選自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750的染料。本發(fā)明的一些實(shí)施方案利用Alexa Fluor 647分子，其具有約650至660nm之間的最大吸收和約660至670nm之間的最大發(fā)射。單獨(dú)或結(jié)合其他Alexa Fluor染料來使用Alexa Fluor 647染料。

在一些實(shí)施方案中，用于使用本發(fā)明的分析儀系統(tǒng)檢測樣品中的指示劑的熒光標(biāo)記部分是量子點(diǎn)。量子點(diǎn)(QD)，也稱為半導(dǎo)體納米晶體或人造原子，是含有100至1,000個(gè)之間的任何數(shù)目的電子并且范圍為2-10nm的半導(dǎo)體晶體。一些QD可以直徑為10-20nm。QD具有高量子產(chǎn)率，這使得它們對光學(xué)應(yīng)用特別有用。QD是通過形成激子而發(fā)熒光(這與傳統(tǒng)熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)相似)，但具有長達(dá)200納秒的長各多的壽命。這種特性提供了具有低光漂白的QD。QD的能量水平可以通過改變QD的大小和形狀以及QD電位的深度來控制。小的激子QD的一種光學(xué)特征是著色，其通過點(diǎn)的大小來決定。點(diǎn)越大，熒光越紅，或更朝向于光譜的紅光端。點(diǎn)約小，熒光越藍(lán)或更朝向于其藍(lán)光端。決定能量并因此決定熒光顏色的帶隙能量與QD的大小的平方成反比。越大的QD具有更高能量水平，其更緊密地間隔，因此允許QD吸收含有較低能量的光子，即更接近于光譜紅光端的那些。因?yàn)辄c(diǎn)的發(fā)射頻率取決于帶隙，有可能以極高精確性控制點(diǎn)的輸出波長。在一些實(shí)施方案中，使用單分子分析儀系統(tǒng)檢測的蛋白用QD標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，使用單分子分析儀來檢測用一個(gè)QD標(biāo)記的蛋白，并使用濾波器以允許在不同波長下檢測不同蛋白質(zhì)。

E.分離的大分子血糖指示劑

1.分離的多肽指示劑

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的指示劑蛋白及其生物活性部分，以及適宜用作免疫原來產(chǎn)生針對指示劑蛋白或其片段的抗體的多肽片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過合適的純化方案從細(xì)胞或組織源分離天然指示劑蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生包含完整指示劑蛋白或其區(qū)段的蛋白質(zhì)或肽。作為重組表達(dá)的替代方案，可以使用標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)通過化學(xué)方式合成這樣的蛋白質(zhì)或肽。重組蛋白可以被修飾，例如，糖化，以提供用于HbA1c檢測的合適抗原。相似地，血紅蛋白的非糖化片段可以用于產(chǎn)生結(jié)合單獨(dú)的非糖化血紅蛋白或總血紅蛋白的抗體。

“分離的”或“純化的”蛋白質(zhì)或其生物活性部分基本上不含來自蛋白質(zhì)從其衍生的細(xì)胞或組織源的細(xì)胞物質(zhì)或其他污染蛋白質(zhì)，或在化學(xué)合成時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。語言“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括其中蛋白質(zhì)與該蛋白質(zhì)從其分離或重組產(chǎn)生的細(xì)胞組分分離的蛋白質(zhì)制備物。因此，基本上不含細(xì)胞物質(zhì)的蛋白質(zhì)包括具有少于約30％，20％，10或5％(干重)的異源蛋白質(zhì)(在本文中也稱為“污染蛋白質(zhì)”)的蛋白質(zhì)制備物。當(dāng)重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其生物活性部分時(shí)，還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即，培養(yǎng)基占蛋白質(zhì)制備物的低于約20％，10％或5％體積。當(dāng)通過化學(xué)合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)時(shí)，優(yōu)選基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)，即，其與參與蛋白質(zhì)合成的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)分離。因此，這樣的蛋白質(zhì)制備物具有低于約30％，20％，10％，5％(干重)的除目標(biāo)多肽以外的化學(xué)前體或化合物。

指示劑蛋白的生物活性部分包括包含與指示劑蛋白的氨基酸序列足夠相同的或源自指示劑蛋白的氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，其包括少于全長蛋白質(zhì)的氨基酸，并且呈現(xiàn)出相應(yīng)全長蛋白的至少一種活性。通常，生物活性部分包含具有相應(yīng)全長蛋白的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。指示劑蛋白的生物活性部分可以是例如為長度10，25，50，100或更多個(gè)氨基酸的多肽。此外，其中標(biāo)志物蛋白的其他區(qū)域被刪除的其他生物活性部分可以通過重組技術(shù)來制備，并且針對天然形式的指示劑蛋白的一種或多種功能活性進(jìn)行評價(jià)。

優(yōu)選的指示劑蛋白由序列表中提供的核苷酸序列來編碼。其他有用的蛋白與這些序列之一基本上相同(例如，至少約40％，優(yōu)選50％，60％，70％，80％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)并且保留相應(yīng)的天然產(chǎn)生指示劑蛋白的功能活性，但由于天然等位基因變異或誘變，氨基酸序列不同。

為了測定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的百分同一性，序列為了最佳比較目的進(jìn)行比對(例如，為了與第二氨基酸或核酸序列最佳比對，可以在第一氨基酸或核酸序列中引入空位)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。在第一序列中的位置被與第二序列中相應(yīng)位置處相同的氨基酸殘基核苷酸占據(jù)時(shí)，那么分子在該位置處是相同的。優(yōu)選地，使用全局比對來計(jì)算兩個(gè)序列之間的百分同一性?；蛘?，使用局部比對來計(jì)算兩個(gè)序列之間的百分同一性。兩個(gè)序列之間的百分同一性是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即，％同一性＝相同位置#/總位置#(例如，重疊位置)×100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列是相同長度的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列是不同長度的。

可以使用數(shù)學(xué)算法來完成兩個(gè)序列之間百分同一性的測定。用于兩個(gè)序列比較的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的、非限制性實(shí)例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268的算法，如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877中改進(jìn)的。將這樣的算法結(jié)合至Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTN和BLASTX程序中。使用BLASTN程序進(jìn)行BLAST核苷酸檢索，評分＝100，字長＝12，以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢允褂肂ALSTP進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)檢索，評分＝50，字長＝3，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的空位比對，可以按照Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述的，利用稱為空位BLAST的BLAST算法的較新版本，其能夠進(jìn)行用于程序BLASTN,BLASTP和BLASTX的空位局部比對?；蛘?，可以使用PSI-Blast來進(jìn)行迭代檢索，其檢測分子之間的距離關(guān)系。利用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可以使用相應(yīng)程序(例如，BLASTX和BLASTN)的缺省參數(shù)。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一種優(yōu)選的非限制性實(shí)例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法。將這樣的算法結(jié)合至ALIGN程序(版本2.0)中，其是GCG序列比對軟件包的部分。當(dāng)利用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以使用PAM120加權(quán)殘差表，12的空位長度罰分和4的空位罰分。用于鑒定局部序列相似性的區(qū)域和比對的再另一個(gè)有用的算法是FASTA算法，如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448中所述的。當(dāng)使用FASTA算法比較核苷酸或氨基酸序列時(shí)，例如，PAM120加權(quán)殘差表可以與2的k-tuple值一起使用。

可以使用與上述那些相似的技術(shù)來測定兩個(gè)序列之間的百分同一性，具有或不具有允許的空位。在計(jì)算百分同一性時(shí)，只對精確匹配計(jì)數(shù)。

本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體特異性地結(jié)合標(biāo)志物蛋白或其片段。術(shù)語“抗體(antibody)”和“抗體類(antibodies)”在本文中可互換使用，是指免疫球蛋白分子及其包含免疫球蛋白分子的免疫活性部分的片段和衍生物，(即，這樣的部分含有特異性結(jié)合抗原(如標(biāo)志物蛋白，例如，標(biāo)志物蛋白的表位)的抗原結(jié)合位點(diǎn))。特異性地結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體是結(jié)合蛋白但基本上不結(jié)合天然地含有該蛋白質(zhì)的樣品(例如，生物樣品)中的其他分子的抗體。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實(shí)例包括，但不限于，單鏈抗體(scAb)、F(ab)和F(ab’)₂片段。

本發(fā)明的分離蛋白質(zhì)或其片段可以用作免疫原來產(chǎn)生抗體?？梢允褂萌L蛋白，或可選地，本發(fā)明提供用作免疫原的抗原性肽片段。本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗原性肽包含本發(fā)明蛋白質(zhì)之一的氨基酸序列的至少8個(gè)(優(yōu)選10、15、20或30或更多個(gè))氨基酸殘基，并且包括該蛋白質(zhì)的至少一個(gè)表位，使得針對該肽產(chǎn)生的抗體與蛋白質(zhì)形成特異性的免疫復(fù)合物。在特定實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是翻譯后修飾的?？乖噪陌ǖ膬?yōu)選表位是位于蛋白質(zhì)表面上的區(qū)域，例如，親水性區(qū)域。疏水性序列分析、親水性序列分析或相似分析可以用于鑒定親水性區(qū)域。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將分離的標(biāo)志物蛋白或其片段用作免疫原。

本發(fā)明提供了多克隆和單克隆抗體。如本文中使用的，術(shù)語“單克隆抗體組合物”或“多克隆抗體組合物”是指只含有能夠與特定表位免疫反應(yīng)的一個(gè)種類的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子群。優(yōu)選的多克隆和單克隆抗體組合物是針對本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體已經(jīng)選擇的那些組合物。特別優(yōu)選的多克隆和單克隆抗體制備物是只含有針對標(biāo)志物蛋白或其片段的抗體的制備物。制備多克隆、單克隆以及重組抗體和抗體片段的方法是本領(lǐng)域公知的。

2.分離的核酸指示劑

本發(fā)明的一個(gè)方面涉及分離的核酸分子，包括編碼Eno1或其一部分的核酸。本發(fā)明的分離的核酸還包括足以用作雜交探針來鑒定Eno1核酸分子及其片段的核酸分子，例如，適宜用作PCR引物用于標(biāo)志物核酸分子的特定產(chǎn)物或突變的擴(kuò)增的那些。如本文中使用的，術(shù)語“核酸分子”打算包括DNA分子(例如，cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA。

“分離的”核酸分子是與存在于核酸分子的天然來源中的其他核酸分子分離的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，“分離的”核酸分子(優(yōu)選蛋白編碼序列)是不含在所述核酸來源的生物體基因組DNA中天然側(cè)鄰該核酸的序列(即，位于該核酸5’和3’端的序列)。例如，在各種不同的實(shí)施方案中，分離的核酸分子可以含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在所述核酸來源的細(xì)胞基因組DNA中天然側(cè)鄰該核酸分子的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，“分離的”核酸分子(如cDNA分子)通過重組技術(shù)生產(chǎn)時(shí)，可以基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或在化學(xué)合成時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)?；旧喜缓?xì)胞物質(zhì)的核酸分子包括具有低于約30％、20％、10％或5％的異源核酸(在本文中也稱為“污染核酸”)的制備物。

可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)和本文中所述的數(shù)據(jù)庫記錄中的序列信息來分離本發(fā)明的核酸分子。使用這樣的核酸序列的全部或一部分，可以使用標(biāo)準(zhǔn)雜交和克隆技術(shù)(例如，如Sambrook等編輯，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中所述的)來分離本發(fā)明的核酸分子。

可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，使用cDNA、mRNA或基因組DNA作為模板和合適的寡核苷酸引物來擴(kuò)增本發(fā)明的核酸分子?？梢詫⒂纱藬U(kuò)增的核酸克隆至合適的載體中并通過DNA序列分析來表征。此外，可以通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)，例如，使用自動化DNA合成儀，來制備對應(yīng)于本發(fā)明的核酸分子的全部或一部分的核苷酸。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子包括具有與標(biāo)志物核酸的核苷酸序列或與編碼Eno1的核酸的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的Eno1分子。與給定的核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與與給定核苷酸序列充分互補(bǔ)使得其可以與給定的核苷酸序列雜交由此形成穩(wěn)定的雙鏈體的核酸分子。

此外，本發(fā)明的核酸分子可以只包含核酸序列的一部分，其中全長核酸序列包括Eno1核酸或其編碼Eno1蛋白。這樣的核酸可以用作例如探針或引物。探針/引物通常作為一個(gè)或多個(gè)基本上純化的寡核苷酸使用。寡核苷酸通常包含在嚴(yán)格條件下與至少約15個(gè)，更優(yōu)選至少約25，50，75，100，125，150，175，200，250，300，350或400個(gè)或更多個(gè)Eno1的連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)域。

基于Eno1序列的探針可以用于檢測對應(yīng)于Eno1的轉(zhuǎn)錄物或基因組序列。在特定實(shí)施方案中，探針與跨越剪接點(diǎn)的核酸序列雜交。探針包括與其連接的標(biāo)記基團(tuán)例如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。這樣的探針可以用作用于鑒定表達(dá)或錯表達(dá)Eno1蛋白的細(xì)胞、組織或個(gè)體的診斷測試試劑盒或試劑組的部分，如通過測量來自受試者的樣品中編碼Eno1的核酸分子的水平，例如，檢測mRNA水平或確定編碼Eno1的基因或其翻譯控制序列是否已經(jīng)突變或刪除。

本發(fā)明進(jìn)一步包括由于遺傳密碼的簡并性而不同于編碼Eno1蛋白(例如，具有序列表中提供的序列的蛋白質(zhì))的核酸的核苷酸序列的核酸分子，并由此編碼相同的蛋白。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到導(dǎo)致氨基酸序列變化的DNA序列多態(tài)性可以存在于群體(例如，人群)內(nèi)。由于天然的等位基因變異，這樣的遺傳多態(tài)性可以存在于群體內(nèi)的個(gè)體之間。等位基因是在給定的基因座處擇一地出現(xiàn)的一組基因之一。此外，將認(rèn)識到影響RNA表達(dá)水平的DNA多態(tài)性也可以存在，其可能影響該基因的整體表達(dá)水平(例如，通過影響調(diào)控或降解)。

如本文中使用的，短語“等位基因變體”是指在給定基因座處存在的核苷酸序列或由核苷酸序列編碼的多肽。

如本文中使用的，術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含編碼對應(yīng)于本發(fā)明指示劑的多肽的開放閱讀框的核酸分子。這樣的天然等位基因變異通常可以導(dǎo)致給定基因的核苷酸序列中1-5％的變異度?？梢酝ㄟ^將許多不同個(gè)體中的目標(biāo)基因測序來鑒定可選的等位基因。這可以通過使用雜交探針以鑒別多個(gè)個(gè)體中相同基因座來容易地進(jìn)行。作為天然等位基因變異的結(jié)果并且沒有改變功能活性的任何的所有這樣的核苷酸變異和所得到的氨基酸多態(tài)性或變異意圖在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離核酸分子長度為至少15，20，25，30，40，60，80，100，150，200，250，300，350，400，450，550，650，700，800或更多個(gè)核苷酸并且在嚴(yán)格條件下與Eno1核酸或編碼Eno1的核酸雜交。如本文中使用的，術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”是旨在描述至少60％(65％，70％，優(yōu)選75％)彼此相同的核苷酸序列通常保持彼此雜交的雜交和洗滌條件。這樣的嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology(分子生物學(xué)中的通用實(shí)驗(yàn)方案)，John Wiley&Sons,N.Y.(1989)的6.3.1-6.3.6章節(jié)中找到。嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選的、非限制性實(shí)例是在約45℃下在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，接著在50-65℃下在0.2×SSC，0.1％SDS中洗滌一次或多次。

F.指標(biāo)應(yīng)用

本發(fā)明提供了用于診斷受試者中升高的血糖的方法，例如，前驅(qū)糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病、妊娠糖尿病。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于預(yù)后或監(jiān)測血糖升高的受試者的進(jìn)展或監(jiān)測血糖升高的受試者對治療性處理的反應(yīng)的方法。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明構(gòu)成了結(jié)合分析、檢測和/或測量Eno1及至少一種血糖的其他指標(biāo)(例如，血糖，例如，餐后血糖、空腹血糖、葡萄糖耐量、酮水平)的水平和HbA1c水平通過本發(fā)明的方法可獲得的診斷信息的應(yīng)用。

例如，按照本文中所述的，當(dāng)進(jìn)行本發(fā)明的用于檢測和/或測量多肽指示劑的方法時(shí)，將生物樣品接觸選擇性地結(jié)合目標(biāo)指示劑的檢測試劑，例如，單克隆抗體，從而形成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，其隨后被直接(如果抗體包括標(biāo)記)或間接(如果使用第二檢測試劑，例如，第二抗體，其隨之被標(biāo)記)地進(jìn)一步檢測。因此，本發(fā)明的方法將本發(fā)明的多肽指示劑轉(zhuǎn)化成包括可檢測初級抗體或者初級抗體和進(jìn)一步第二抗體的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物。為了鑒定目標(biāo)生物標(biāo)志物的存在，需要形成這樣的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物，并且作為進(jìn)行本發(fā)明方法的結(jié)果，必定改變目標(biāo)指示劑的物理特征和特性。

當(dāng)進(jìn)行用于檢測Eno1核酸的本發(fā)明方法時(shí)，適用同樣的原理。特別地，將擴(kuò)增方法用于檢測Eno1 mRNA時(shí)，擴(kuò)增方法實(shí)際上導(dǎo)致形成新的擴(kuò)增子群體-即，新合成的并且不存在于初始生物樣品中的分子，由此物理轉(zhuǎn)化生物樣品。相似地，當(dāng)使用雜交探針來檢測Eno1時(shí)，實(shí)際上通過探針(任選包括標(biāo)記)與靶生物標(biāo)志物mRNA(或其他核酸)雜交形成了物理上新的分子物質(zhì)，其隨后檢測。作為進(jìn)行本發(fā)明方法的結(jié)果，有效地新產(chǎn)生或形成了這樣的多核苷酸產(chǎn)物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于診斷升高的血糖的方法，例如，前驅(qū)糖尿病、糖尿病(例如，2型糖尿病、1型糖尿病、妊娠糖尿病)。本發(fā)明的方法可以結(jié)合本領(lǐng)域技術(shù)人員用來預(yù)后血糖升高的發(fā)生或復(fù)發(fā)和/或?qū)Υ委熝巧叩氖茉囌叩闹委煾深A(yù)的反應(yīng)的任何其他方法來進(jìn)行。本文中提供的診斷和預(yù)后方法可以用來確定是否應(yīng)當(dāng)對受試者進(jìn)行其他和/或更多的復(fù)雜或麻煩的測試或監(jiān)測(例如，葡萄糖耐量測試、持續(xù)的葡萄糖監(jiān)測)。將理解很少能使用單一測試來診斷如前驅(qū)糖尿病或糖尿病這樣復(fù)雜的疾病。因此，將理解本文中提供的診斷、預(yù)后和監(jiān)測方法通常結(jié)合本領(lǐng)域已知的其他方法來進(jìn)行。例如，本發(fā)明提供的用于檢測Eno1水平的方法可以結(jié)合Hb1Ac水平的檢測、空腹或餐后條件下的血糖水平的檢測或葡萄糖耐量測試來進(jìn)行。

還提供了用于評價(jià)治療方案(例如，藥物治療、行為矯正、外科手術(shù)或用于治療受試者的升高血糖的任何其他治療途徑)的功效的方法。在這些方法中，評價(jià)了一對樣品(較早時(shí)間點(diǎn)或治療方案之前從受試者獲得的第一樣品和較后時(shí)間點(diǎn)(例如，受試者已經(jīng)經(jīng)歷至少一部分治療方案時(shí)的較后時(shí)間點(diǎn))從受試者獲得的第二樣品)中的Eno1量。將理解本發(fā)明的方法包括以規(guī)律或不規(guī)律的間隔獲得和分析超過兩個(gè)樣品(例如，3，4，5，6，7，8，9或更多個(gè)樣品)用于評價(jià)標(biāo)志物水平?？梢栽谶B續(xù)或非連續(xù)受試者樣品之間進(jìn)行成對比較?？梢葬槍θ魏蝺蓚€(gè)或更多個(gè)連續(xù)或非連續(xù)受試者樣品分析標(biāo)志物水平的趨勢和標(biāo)志物水平的變化率?？梢越Y(jié)合用于檢測血糖監(jiān)控的其他方法來進(jìn)行Eno1水平的測量。

本發(fā)明的方法還可以用于選擇能夠通過Eno1表達(dá)或活性的調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)血糖的化合物。在這種方法中，將細(xì)胞，優(yōu)選具有改變的胰島素敏感性或改變的葡萄糖攝取的細(xì)胞，接觸測試化合物，并且測定測試化合物調(diào)節(jié)細(xì)胞中的Eno1表達(dá)和/或活性的能力，由此選擇能夠調(diào)節(jié)Eno1表達(dá)或活性(優(yōu)選提高Eno1表達(dá)或活性，由此提高細(xì)胞中的葡萄糖攝取)的化合物。

使用本文中所述的方法，可以篩選多種分子以鑒別調(diào)節(jié)(優(yōu)選提高)Eno1的表達(dá)和/或活性的分子?？梢詫⒂纱髓b別的化合物提供給受試者以通過提高血糖攝取、提高胰島素敏感性和/或降低胰島素抵抗中的一種或多種使血糖標(biāo)準(zhǔn)化，由此治療升高的血糖，例如，前驅(qū)糖尿病或糖尿病，例如，2型糖尿病、1型糖尿病或妊娠糖尿病。

本發(fā)明涉及預(yù)測醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域，其中將診斷分析、預(yù)后分析、藥物基因組學(xué)和監(jiān)控臨床試驗(yàn)用于預(yù)后(預(yù)測)目的，以由此預(yù)防性地治療個(gè)體。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于測定Eno1蛋白或核酸表達(dá)水平的診斷分析，以確定個(gè)體是否處于產(chǎn)生與血糖升高相關(guān)的疾病或失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)中，所述疾病或失調(diào)如，不限于，前驅(qū)糖尿病或糖尿病，包括2型糖尿病、1型糖尿病或妊娠糖尿病。這樣的分析可以用于預(yù)后或預(yù)測目的，以由此在失調(diào)發(fā)作之前預(yù)防性地治療個(gè)體。

本發(fā)明的再另一個(gè)方面涉及監(jiān)控臨床試驗(yàn)中試劑(例如，藥物或其他治療化合物)或行為和/或膳食改變對Eno1的表達(dá)或活性的影響。在以下部分中將進(jìn)一步詳細(xì)地描述這些和其他應(yīng)用。

1.診斷分析

用于檢測生物樣品中指示劑蛋白質(zhì)或核酸的存在或不存在或變化的示例性方法包括從測試受試者獲得生物樣品(例如，血液或血清)并將生物樣品接觸能夠檢測多肽或核酸(例如，mRNA或cDNA)的化合物或試劑。因此本發(fā)明的檢測方法可以在體外以及在體內(nèi)檢測例如生物樣品中的mRNA、cDNA或蛋白質(zhì)，包括翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。

本文中提供的用于檢測生物樣品中的指示劑蛋白或核酸的存在、不存在、水平變化的方法包括從受試者獲得可能含有或不含待檢測標(biāo)志物蛋白或核酸的生物樣品，將樣品接觸能夠與待檢測的指示劑蛋白或核酸形成復(fù)合物的指示劑特異性的結(jié)合劑(例如，一種或多種標(biāo)志物特異性的結(jié)合劑)，并且將樣品接觸用于檢測指示劑-指示劑特異性結(jié)合劑復(fù)合物(如果形成)的檢測試劑。將理解本文中提供的用于檢測生物樣品中的指示劑水平的方法包括進(jìn)行所述分析的步驟。在檢測方法的特定實(shí)施方案中，樣品中的指示劑蛋白或核酸的水平為零或低于檢測閾值。

所述方法包括指示劑和指示劑特異性結(jié)合劑之間瞬時(shí)或穩(wěn)定復(fù)合物的形成。所述方法需要復(fù)合物(如果形成)形成足夠的時(shí)間以允許檢測試劑與復(fù)合物結(jié)合并產(chǎn)生可檢測信號(例如，熒光信號、來自酶促反應(yīng)的產(chǎn)物的信號，例如，過氧化物酶反應(yīng)、磷酸酶反應(yīng)、β-半乳糖苷酶反應(yīng)或聚合酶反應(yīng))。

在特定實(shí)施方案中，使用相同方法檢測全部指示劑。在特定實(shí)施方案中，使用相同生物樣品(例如，相同體液)檢測全部指示劑。在特定實(shí)施方案中，使用不同方法檢測不同指示劑。在特定實(shí)施方案中，在不同生物樣品(例如，血液和血清)中檢測指示劑。

2.蛋白質(zhì)檢測

在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，待檢測的指示劑是蛋白質(zhì)。在特定實(shí)施方案中，待檢測的指示劑是翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。使用多種分析來檢測蛋白質(zhì)，其中待檢測的指示劑蛋白和指示劑特異性結(jié)合劑之間的復(fù)合物不是天然存在的，例如，因?yàn)榻M分之一不是天然存在的化合物或者用于檢測的指示劑和指示劑特異性結(jié)合劑不是來自相同的生物體(例如，使用來自小鼠、大鼠或山羊的指示劑特異性結(jié)合抗體來檢測人指示劑蛋白)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于檢測的指示劑是人指示劑蛋白。在某些檢測分析中，用于檢測的人指示劑被指示劑特異性的非人抗體結(jié)合，因此，復(fù)合物在自然界中不會形成。指示劑蛋白的復(fù)合物可以直接檢測，例如，通過使用直接結(jié)合指示劑的經(jīng)標(biāo)記的指示劑特異性抗體，或者通過將進(jìn)一步的組分結(jié)合指示劑-指示劑特異性抗體復(fù)合物來檢測。在特定實(shí)施方案中，進(jìn)一步的組分是能夠在與第一指示劑特異性抗體同時(shí)結(jié)合指示劑的第二指示劑特異性抗體。在特定實(shí)施方案中，進(jìn)一步的組分是結(jié)合指示劑特異性抗體的第二抗體，其中第二抗體優(yōu)選連接可檢測標(biāo)記(例如，熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、生物素)。在第二抗體連接于酶學(xué)可檢測標(biāo)記(例如，過氧化物酶、磷酸酶、β-半乳糖苷酶)時(shí)，通過將酶學(xué)可檢測標(biāo)記接觸合適的底物以產(chǎn)生比色、熒光或其他可檢測的(優(yōu)選可定量檢測的)產(chǎn)物來檢測第二抗體。用于本發(fā)明的方法中的抗體可以是多克隆的，然而，在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用單克隆抗體。完整抗體或其片段或衍生物(例如，F(xiàn)ab或F(ab’)₂)可以用于本發(fā)明的方法中。指示劑蛋白的這類檢測策略可以用于例如ELISA、RIA、western印跡和免疫熒光分析方法中。

在特定檢測分析中，在用于檢測的生物樣品中存在的指示劑是酶，例如，Eno1，并且檢測試劑是酶底物(例如，2-磷酸甘油酸(2-PG)或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，或產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的任一化合物的類似物)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，與待檢測的指示劑酶形成復(fù)合物的底物不是人受試者中的酶的底物。

在特定實(shí)施方案中，將指示劑-指示劑特異性結(jié)合劑復(fù)合物連接于固體支持物用于指示劑的檢測。復(fù)合物可以在基質(zhì)上形成或在捕獲于基質(zhì)上之前形成。例如，在ELISA、RIA、免疫沉淀分析、western印跡、免疫熒光分析、凝膠酶學(xué)分析中，將用于檢測的指示劑直接或間接地連接于固體支持物。在ELISA、RIA或免疫熒光分析中，指示劑通常通過抗體或結(jié)合蛋白間接連接于固體支持物。在western印跡或免疫熒光分析中，指示劑通常直接連接于固體支持物。對于凝膠酶學(xué)分析，指示劑溶解于凝膠中，通常是丙烯酰胺凝膠，其中摻入了酶的底物。

3.核酸檢測

在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，指示劑是核酸，例如，Eno1核酸。使用多種分析來檢測核酸，其中待檢測的指示劑核酸和指示劑特異性探針之間的復(fù)合物不是天然存在的，例如，因?yàn)榻M分之一不是天然存在的化合物。在特定實(shí)施方案中，分析物包括核酸，而探針包括一個(gè)或多個(gè)合成的單鏈核酸分子，例如，DNA分子、DNA-RNA雜合體、PNA或含有一個(gè)或多個(gè)人造堿基、糖或主鏈部分的修飾核酸分子。在特定實(shí)施方案中，合成的核酸是單鏈的，是包括熒光標(biāo)記的DNA分子。在特定實(shí)施方案中，合成的核酸是約12至約50個(gè)核苷酸長的單鏈寡核苷酸分子。在特定實(shí)施方案中，待檢測核酸是mRNA，并且形成的復(fù)合物是與單鏈DNA分子雜交的mRNA，所述單鏈DNA分子與mRNA互補(bǔ)。在特定實(shí)施方案中，通過使用作為引物與RNA雜交的單鏈DNA首先從RNA模板產(chǎn)生DNA分子(即，cDNA分子)來檢測RNA，所述引物例如通用多聚-T引物以轉(zhuǎn)錄多聚A RNA。然后可以使用標(biāo)志物特異性的探針，將cDNA用作用于擴(kuò)增反應(yīng)的模板，例如，PCR、引物延伸試驗(yàn)。在特定實(shí)施方案中，標(biāo)記的單鏈DNA可以與樣品中存在的RNA雜交用于通過原位熒光雜交(FISH)的RNA檢測或用于通過northern印跡的RNA檢測。

例如，用于mRNA檢測的體外技術(shù)包括northern雜交、原位雜交和rtPCR。用于檢測基因組DNA的體外技術(shù)包括Southern雜交。用于mRNA檢測的技術(shù)包括PCR、northern雜交和原位雜交。方法包括定性和定量方法。

這樣的診斷、預(yù)后和監(jiān)測分析的一般原理涉及制備可能含有用于檢測的核酸和探針的樣品或反應(yīng)混合物，其在合適的條件下和足以允許指示劑核酸和探針相互作用并結(jié)合的時(shí)間，由此形成可以在反應(yīng)混合物中取出和/或檢測的復(fù)合物。這些分析可以以本領(lǐng)域已知的多種方式來進(jìn)行，例如，PCR、FISH、northern印跡。

4.表達(dá)水平的檢測

可以基于絕對表達(dá)水平或者標(biāo)準(zhǔn)化的或相對表達(dá)水平來檢測Eno1水平。在監(jiān)控受試者治療或確定受試者中血糖水平或血糖調(diào)節(jié)是否存在變化時(shí)，絕對Eno1水平的檢測可能是優(yōu)選的。例如，可以監(jiān)測正接受異常血糖治療的受試者的Enol的表達(dá)水平，例如，以規(guī)律的間隔來監(jiān)測，如每月間隔?？梢噪S著時(shí)間監(jiān)測Eno1水平的調(diào)節(jié)以觀察Eno1水平的變化趨勢。受試者中Eno1的表達(dá)水平可能高于正常樣品中的Eno1表達(dá)水平，但也可能高于之前的表達(dá)水平，因此表明治療方案對于受試者的益處。相似地，Eno1水平的變化率在用行為或膳食矯正而不是治療性干預(yù)治療的受試者中可能是重要的。個(gè)體受試者中Eno1水平的變化或無變化與群體中存在的Eno1水平相比，可能與針對受試者的治療決策更相關(guān)。另外顯示出具有正常血糖的受試者中Eno1水平的快速變化可能指示異常血糖或具有產(chǎn)生與異常血糖相關(guān)的病癥的傾向，即使標(biāo)志物在該群體的正常范圍內(nèi)?？梢越Y(jié)合一種或多種血糖升高的其他指示劑，例如，HbA1c，提高的血糖(包括提高的餐后或空腹血糖中的一種或多種)或葡萄糖耐量測試中降低的葡萄糖清除率，來測定或監(jiān)測Eno1水平。

作為基于Eno1的絕對表達(dá)水平做出決定的替代方案，表達(dá)水平可以基于Eno1的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平來決定。通過將指示劑的絕對表達(dá)水平與不是指示劑的基因(例如，組成型表達(dá)的管家基因)的表達(dá)進(jìn)行比較來標(biāo)準(zhǔn)化。用于標(biāo)準(zhǔn)化的合適基因包括管家基因如肌動蛋白基因，以及用于血液或血清中的標(biāo)準(zhǔn)化的合適蛋白質(zhì)包括白蛋白。這種標(biāo)準(zhǔn)化允許一個(gè)樣品(例如，來自血糖正常受試者的樣品)中的表達(dá)水平與另一個(gè)樣品(例如，來自懷疑具有或具有異常血糖的樣品)的比較，或來自不同來源的樣品之間的比較。

或者，表達(dá)水平可以作為與合適的對照(例如，群體對照、較早時(shí)間點(diǎn)對照等)比較的相對表達(dá)水平來提供。優(yōu)選地，基線測定中使用的樣品將來自正常血糖的受試者的樣品。細(xì)胞來源的選擇取決于相對表達(dá)水平的使用。此外，隨著更多數(shù)據(jù)累積，可以修正平均表達(dá)值，從而基于累積的數(shù)據(jù)提供改進(jìn)的相對表達(dá)值。

5.監(jiān)測臨床試驗(yàn)

監(jiān)測藥劑(例如，藥物化合物)對血糖指示劑水平的影響不僅可以應(yīng)用于基礎(chǔ)藥物篩選或監(jiān)測單一受試者的治療中，而且也可以應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中。例如，可以在接受針對血糖升高的治療的受試者的臨床試驗(yàn)中監(jiān)測藥劑影響Eno1表達(dá)的有效性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了監(jiān)測使用藥劑(例如，激動劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其他藥物候選物)治療受試者的有效性的方法，包括步驟(i)在施用藥劑前，從受試者獲得施用前樣品；(ii)檢測施用前樣品中的指示劑Eno1的表達(dá)水平和任選一種或多種其他的血糖指示劑(例如，血糖、酮或HbA1c)；(iii)從受試者獲得一個(gè)或多個(gè)施用后樣品；(iv)檢測施用后樣品中的指示劑的表達(dá)水平；(v)將施用前樣品中的指示劑水平與一個(gè)或多個(gè)施用后樣品中的指示劑水平進(jìn)行比較；和(vi)因此改變對受試者的藥劑施用。例如，在治療過程中降低的Eno1表達(dá)和缺少其他指示劑的正?；梢员砻鳠o效的劑量并希望提高劑量。相反，提高的Eno1表達(dá)和其他指示劑的正常化可以表明有效的治療并且不需要改變劑量。

VI.受損的血糖水平、受損的血糖水平控制和糖尿病的治療

如本文中證明的，Eno1蛋白的施用提高了葡萄糖攝取和反應(yīng)，從而使血糖水平和血糖水平的控制正常化。本發(fā)明提供了通過將Eno1施用于受試者來改善病癥的至少一個(gè)體征或癥狀治療患有受損的葡萄糖耐量、提高的血糖、胰島素抵抗、胰島素不足和糖尿病(例如，2型糖尿病、1型糖尿病、前驅(qū)糖尿病和妊娠糖尿病)的受試者的方法。在特定實(shí)施方案中，Eno1，優(yōu)選Eno1的轉(zhuǎn)錄物變體1，可以施用于受試者，其中將用于治療受損的葡萄糖耐量、提高的血糖、胰島素抵抗、胰島素不足或糖尿病的至少一種其他藥劑施用于受試者。如本文中使用的，藥劑可以以任何順序按序施用或同時(shí)施用。多種藥劑施用于受試者不需要藥劑的共同配制或相同的給藥方案。

使用Eno1治療受損的葡萄糖耐量、提高的血糖、胰島素抵抗、胰島素不足或糖尿病(尤其是2型糖尿病)的方法可以結(jié)合用于糖尿病治療的已知方法和藥劑。許多藥劑和方案目前可用于糖尿病的治療。選擇用于治療的特定藥劑取決于受試者、特定的癥狀和病況的嚴(yán)重性。例如，在特定實(shí)施方案中，Eno1可以結(jié)合膳食和/或行為矯正(例如，熱量限制)來施用(單獨(dú)地或結(jié)合減肥手術(shù)和/或增加的身體活動)。在特定實(shí)施方案中，Eno1可以與用于治療2型糖尿病的藥劑一起施用，例如，二甲雙胍(Glucophage、Glumetza、其他)、格列酮類，例如，匹格列酮(Actos)、格列吡嗪(Glucotrol)、格列本脲(Diabeta、Glynase)、格列美脲(Amaryl)、阿卡波糖(Precose)、二甲雙胍(Glucophage)、西格列汀(Januvia)、沙格列汀(Onglyza)、瑞格列奈(Prandin)、那格列奈(Starlix)、艾塞那肽(Byetta)、利拉魯肽(Victoza)或胰島素。胰島素通常只用于晚期2型糖尿病的治療中，并且包括速效胰島素(門冬胰島素(NovoLog)、賴谷胰島素(Apidra)和賴脯胰島素(Humalog))；短效胰島素(常規(guī)胰島素(Humulin R，Novolin R))；中效胰島素(胰島素NPH人(Humanlin N，Novolin N))和長效胰島素(甘精胰島素(Lantus)和地特胰島素(Levemir))。用于糖尿病的治療還可以包括行為矯正，包括鍛煉和減重，其可以通過使用藥物或外科手術(shù)來促進(jìn)?？梢越Y(jié)合用于升高的血糖和糖尿病的治療。例如，藥物治療可以結(jié)合行為矯正治療。用于1型糖尿病治療中的胰島素包括，但不限于，通常僅用于后期2型糖尿病治療中的胰島素，并且包括速效胰島素(門冬胰島素(NovoLog)、賴谷胰島素(Apidra)和賴脯胰島素(Humalog))；短效胰島素(常規(guī)胰島素(Humulin R，Novolin R))；中效胰島素(胰島素NPH人(Humanlin N，Novolin N))和長效胰島素(甘精胰島素(Lantus)和地特胰島素(Levemir))。

因此，在一些方面中，本發(fā)明涉及治療受試者的升高的血糖的方法，包括：(a)從懷疑具有升高血糖的受試者獲得生物樣品，(b)提交生物樣品以獲得關(guān)于Eno1水平的診斷信息，和(c)當(dāng)樣品中的Eno1水平高于閾值水平時(shí)，將治療有效量的抗糖尿病治療施用于受試者。

在一些方面中，本發(fā)明涉及治療受試者的升高的血糖的方法，包括：(a)獲得關(guān)于來自受試者的生物樣品中的Eno1水平的診斷信息，和(b)在樣品中的Eno1水平高于閾值水平時(shí)，將治療有效量的抗糖尿病治療施用于受試者。

在一些方面中，本發(fā)明涉及治療受試者的升高的血糖的方法，包括：(a)從懷疑具有升高血糖的受試者獲得生物樣品用于鑒定關(guān)于Eno1水平的診斷信息，(b)檢測生物樣品中的Eno1的水平，(c)在樣品中的Eno1水平低于閾值水平時(shí)，向健康護(hù)理提供者推薦血糖降低治療以施用于受試者。

上述的方法可以進(jìn)一步包括獲得關(guān)于升高血糖的一種或多種其他指示劑水平的診斷信息。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括測量升高血糖的一種或多種其他指示劑的水平。升高血糖的一種或多種其他指示劑可以選自HbA1c水平、空腹血糖水平、餐后血糖水平和葡萄糖耐量。

在上述方法的一些實(shí)施方案中，如果樣品中的Eno1水平低于閾值水平并且檢測到升高血糖的至少一種其他指標(biāo)，步驟(c)進(jìn)一步包括將治療有效量的葡萄糖降低治療施用于受試者。在一些實(shí)施方案中，如果樣品中的Eno1水平低于閾值水平并且檢測到升高血糖的至少一種其他指標(biāo)，步驟(c)進(jìn)一步包括對健康護(hù)理提供者推薦葡萄糖降低治療以施用于受試者。

在上述方法的一些實(shí)施方案中，生物樣品是血液或血清。在一些實(shí)施方案中，通過免疫分析或ELISA來測定Eno1的水平。在一些實(shí)施方案中，Eno1的水平通過(i)將生物樣品接觸選擇性地結(jié)合Eno1的試劑以形成生物標(biāo)志物復(fù)合物，和(ii)檢測生物標(biāo)志物復(fù)合物來測定。在一些實(shí)施方案中，選擇性地結(jié)合Eno1以形成生物標(biāo)志物復(fù)合物的試劑是選擇性地結(jié)合Eno1的至少一個(gè)表位的抗Eno1抗體。

在上述方法的一些實(shí)施方案中，通過測量生物樣品中的Eno1mRNA的量來檢測Eno1的水平。例如，可以通過擴(kuò)增反應(yīng)來檢測Eno1 mRNA的量。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)是(a)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；(b)基于核酸序列的擴(kuò)增試驗(yàn)(NASBA)；(c)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)；(d)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)；或(e)鏈置換擴(kuò)增(SDA)。

在一些實(shí)施方案中，將雜交分析用于檢測生物樣品中的Eno1mRNA的量。在一些實(shí)施方案中，將與Eno1 mRNA的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸用于雜交試驗(yàn)中來檢測Eno1 mRNA。

VI.糖尿病和胰島素抵抗的動物模型

本領(lǐng)域中充分表征了代謝癥狀(如1型糖尿病和2型糖尿病、胰島素抵抗、高脂血癥)的多種遺傳和誘導(dǎo)的動物模型。這樣的動物可以用于證明Eno1在胰島素抵抗和糖尿病治療中的作用。1型糖尿病的模型包括，但不限于，NOD小鼠以及大鼠和小鼠中鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病(1型糖尿病模型)。2型糖尿病的遺傳和誘導(dǎo)模型包括，但不限于，瘦素缺陷ob/ob小鼠，瘦素受體缺陷db/db小鼠和高脂飲食小鼠或大鼠模型。在每種模型中，產(chǎn)生特定疾病特征的時(shí)間線是公知的?？梢栽谔悄虿』蛞葝u素抵抗癥狀出現(xiàn)之前或之后施用Eno1，以證明Eno1在這些動物模型中預(yù)防或治療糖尿病和/或胰島素抵抗中的功效。

根據(jù)選擇的特定動物模型和干預(yù)時(shí)間，例如，在糖尿病和/或胰島素抵抗出現(xiàn)之前或之后，動物模型可以用于證明本文中提供的方法用于預(yù)防、治療、診斷和監(jiān)控糖尿病和/或胰島素抵抗的功效。

VII.藥物篩選

Eno1的施用導(dǎo)致具有誘導(dǎo)的糖尿病的動物中血糖的正?；沟肊no1成為用于通過篩選來檢測增強(qiáng)Eno1表達(dá)的化合物或?qū)嶓w而鑒定新治療劑的有吸引力的靶標(biāo)。因此，本發(fā)明提供了用于鑒定對于調(diào)節(jié)血糖和糖尿病潛在有用的化合物的方法。特別地，本發(fā)明提供了用于鑒定對于調(diào)節(jié)Eno1潛在有用的化合物的方法，其中所述化合物調(diào)節(jié)血糖和糖尿病。

這樣的分析通常包括Eno1和一種或多種分析組分(例如，測試化合物)之間的反應(yīng)。其他組分可以是測試化合物自身，或測試化合物和Eno1的天然結(jié)合伴體的組合。通過如本文中所述那些分析鑒定的化合物例如對于調(diào)節(jié)(例如，抑制、緩解、治療或預(yù)防)疾病是有用的。針對調(diào)節(jié)Eno1的表達(dá)水平鑒定的化合物優(yōu)選進(jìn)一步針對在異常血糖和/或糖尿病治療中有用的活性(例如，使餐后和/或空腹血糖正常化、在葡萄糖耐量測試中使葡萄糖清除和/或胰島素水平正?；⑹笻bA1c水平正?；?進(jìn)行測試。

本發(fā)明的篩選分析中使用的測試化合物可以獲自任何可用的來源，包括天然和/或合成化合物的系統(tǒng)文庫。還可以通過本領(lǐng)域已知的組合文庫方法中的多種途徑中的任何一種來獲得測試化合物，所述文庫包括：生物學(xué)文庫；類肽文庫(具有肽的功能性但具有抵抗酶降解的新的、非肽主鏈的分子的文庫，但所述分子仍然保留生物學(xué)活性；參見，例如，Zuchermann等，1994，J.Med.Chem.37:2678-85)；空間尋址的平行固相或液相文庫；需要去卷積的合成文庫方法；‘一珠一化合物’文庫方法；和使用親和性色譜選擇的合成文庫方法。生物學(xué)文庫和類肽文庫途徑限于肽文庫，而其他四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文庫(Lam，1997，Anticancer Drug Des.12:145)。

用于分子文庫合成的方法的實(shí)例可以在現(xiàn)有技術(shù)中找到，例如，在：DeWitt等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909；Erb等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422；Zuckermann等，(1994).J.Med.Chem.37:2678；Cho等，(1993)Science 261:1303；Carrell等，(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carell等，(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；和Gallop等，(1994)J.Med.Chem.37:1233。

化合物文庫可以存在于溶液中(例如，Houghten,1992,Biotechniques 13:412-421)，或者珠子(Lam,1991,Nature 354:82-84)、芯片(Fodor,1993,Nature 364:555-556)、細(xì)菌和/或孢子(Ladner,USP 5,223,409)、質(zhì)粒(Cull等，1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869)或噬菌體上(Scott和Smith,1990,Science249:386-390；Devlin,1990,Science 249:404-406；Cwirla等，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382；Felici,1991,J.Mol.Biol.222:301-310；Ladner，上文)。

本發(fā)明的篩選方法包括將細(xì)胞，例如，患病的細(xì)胞，尤其是具有異常胰島素反應(yīng)和/或葡萄糖攝取的細(xì)胞，接觸測試化合物并測定測試化合物調(diào)節(jié)細(xì)胞中Eno1的表達(dá)和/或活性的能力?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法，如本文中所述的那些，來測定Eno1的表達(dá)和/或活性，任選結(jié)合血糖水平的檢測方法。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選作為Eno1或其生物活性部分的底物的候選物或測試化合物的測試。在再另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于篩選結(jié)合Eno1或其生物活性部分的候選物或測試化合物的分析。例如，以通過本領(lǐng)域已知的任一種方法來完成測試化合物直接結(jié)合Eno1的能力的測定。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過上述篩選分析鑒定的新藥劑。因此，進(jìn)一步將按照本文中所述鑒定的藥劑用于合適的動物模型中在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，能夠調(diào)節(jié)Eno1的表達(dá)和/或活性的藥劑可以用于動物模型中來測定使用這樣的藥劑治療的功效、毒性或副作用?；蛘撸绫疚闹兴鲨b定的藥劑可以用于動物模型中來測定這種藥劑的作用機(jī)理。此外，本發(fā)明涉及通過上述篩選分析鑒定的新藥劑用于如上所述的治療中的用途。

在特定實(shí)施方案中，使用多孔分析平板的多個(gè)孔中所含的細(xì)胞來進(jìn)行篩選方法。這樣的分析平板是商業(yè)上可購得的，例如，從Stratagene Corp.(La Jolla,Calif.)和Corning Inc.(Acton,Mass.)購得，并且包括例如，48-孔、96-孔、384-孔和1536-孔平板。

通過使用相同濃度的相同候選化合物進(jìn)行超過一次的分析來測試結(jié)果的可重復(fù)性(例如，通過在分析平板的超過一個(gè)孔中孵育細(xì)胞)。另外，由于根據(jù)化合物的性質(zhì)及其作用機(jī)理的性質(zhì)，候選化合物在不同濃度下可能是有效的，因此可以測試候選化合物的不同濃度。通常，將1fM至約10mM的候選化合物濃度用于篩選。優(yōu)選的篩選濃度通常為約10pM至約100μM。

本發(fā)明的篩選方法將提供“命中物(hits)”或“先導(dǎo)物(leads)”，即，具有所需的但不是最佳的生物活性的化合物。對這些化合物進(jìn)行滿足臨床有用性需要的所有理化、藥代動力學(xué)和毒理學(xué)因素的先導(dǎo)優(yōu)化可以提高改進(jìn)的藥物候選物。本發(fā)明還包括這些改進(jìn)的藥物候選物及其作為用于調(diào)節(jié)血糖和胰島素反應(yīng)的治療劑的用途。

VIII.試劑盒/試劑組

本發(fā)明還提供了用于診斷、預(yù)后或監(jiān)控疾病或失調(diào)、失調(diào)的復(fù)發(fā)或待治療失調(diào)(例如，異常血糖和/或糖尿病)的受試者的存活的組合物。這些試劑盒包括以下的一個(gè)或多個(gè)：特異性地結(jié)合Eno1的可檢測抗體，特異性地結(jié)合Eno1的可檢測抗體，用于獲得和/或制備用于染色的受試者組織樣品的試劑和使用說明書。

本發(fā)明還包括用于檢測生物樣品中的Eno1蛋白或核酸的存在的試劑盒。這樣的試劑盒可以用于確定受試者是否患有異常血糖和/或糖尿病或處于產(chǎn)生異常血糖和/或糖尿病的提高風(fēng)險(xiǎn)中。例如，試劑盒可以包括能夠檢測生物樣品中的Eno1蛋白或核酸的標(biāo)記化合物或試劑和用于測定樣品中的蛋白或mRNA量的工具(例如，結(jié)合蛋白或其片段的抗體，或結(jié)合編碼蛋白的DNA或mRNA的寡核苷酸探針)。試劑盒還可以包括試劑盒用于實(shí)施本文中提供的任一種方法或基于本文中提供的教導(dǎo)解釋使用試劑盒獲得的結(jié)果的使用說明書。試劑盒還可以包括包括用于檢測樣品中與異常血糖不相關(guān)的對照蛋白的試劑，例如，組織樣品的肌動蛋白、用于對樣品中存在的Eno1量標(biāo)準(zhǔn)化的血液或血液衍生樣品中的白蛋白。試劑盒還可以包括用于檢測的純化標(biāo)志物，用作對照或用于使用試劑盒進(jìn)行的分析的定量。

試劑盒包括用于方法中以診斷受試者中的異常血糖(或鑒定易于產(chǎn)生異常血糖和/或糖尿病的受試者)的試劑組，所述試劑組包括至少兩種檢測試劑，其包括用于檢測Eno1水平的試劑和用于檢測血糖的另一種指標(biāo)(例如，HbA1c)的試劑。

對于基于抗體的試劑盒，試劑盒可以包括，例如：(1)結(jié)合Eno1的第一抗體(例如，連接于固體支持物)；和任選地(2)結(jié)合Eno1或第一抗體并與可檢測標(biāo)記偶聯(lián)的不同的第二抗體。在特定實(shí)施方案中，試劑盒包括(1)結(jié)合第二標(biāo)志物蛋白的第二抗體(例如，連接于固體支持物)；和任選地(2)結(jié)合HbA1c或血紅蛋白(總的或未修飾的血紅蛋白)或結(jié)合第二抗體并與可檢測標(biāo)記偶聯(lián)的不同的第二抗體。第一和第二標(biāo)志物蛋白是不同的。

對于基于寡核苷酸的試劑盒，試劑盒可以包括，例如：(1)與編碼Eno1的核酸序列雜交的寡核苷酸，例如，可檢測地標(biāo)記的寡核苷酸，或(2)一對可用于擴(kuò)增Eno1核酸分子的引物。在特定實(shí)施方案中，試劑盒包括對于每種核酸標(biāo)志物特異性的第三引物以允許使用定量PCR方法的檢測。在特定實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括直接或間接(例如，使用HbA1c水平)地測量受試者中的血糖的說明書。

對于色譜方法，試劑盒可以包括標(biāo)志物，包括標(biāo)記的標(biāo)志物，以允許通過色譜法檢測和鑒定一種或多種血糖指標(biāo)，例如，Eno1和HbA1c。在特定實(shí)施方案中，用于色譜方法的試劑盒包括用于一種或多種血糖指示劑衍生化的化合物。在特定實(shí)施方案中，用于色譜方法的試劑盒包括用于解析所述方法的指示劑的柱。

對于Eno1的檢測特異性的試劑允許檢測和定量復(fù)雜混合物(例如，血清、血液)中的標(biāo)志物。在特定實(shí)施方案中，試劑是物種特異性的。在特定實(shí)施方案中，Eno1試劑不是物種特異性的。在特定實(shí)施方案中，Eno1試劑是異形體特異性的。在特定實(shí)施方案中，Eno1試劑不是異形體特異性的。在特定實(shí)施方案中，試劑檢測總Eno1。

在特定實(shí)施方案中，用于升高的血糖和/或糖尿病的診斷、監(jiān)控或表征的試劑盒包括至少一種對于Eno1表達(dá)水平的檢測特異性的試劑。在特定實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括檢測(直接或間接或兩者)樣品中的血糖水平的說明書。在特定實(shí)施方案中，試劑盒包括至少一種用于檢測HbA1c水平的試劑。

在特定實(shí)施方案中，試劑盒還可以包括例如緩沖劑、防腐劑、蛋白穩(wěn)定劑、反應(yīng)緩沖劑。試劑盒可以進(jìn)一步包括檢測可檢測標(biāo)記(例如，酶或底物)所必需的組分。試劑盒還可以含有可以測定并與測試樣品比較的對照樣品或一系列對照樣品。對照可以是對照血清樣品或(適宜的話)純化蛋白或核酸的對照樣品，具有已知水平的指示劑。試劑盒的每種組分可以包裝在單個(gè)容器內(nèi)并且所有的各種不同容器可以在單一包裝內(nèi)，連同用于解釋使用試劑盒進(jìn)行的分析的結(jié)果的說明書一起。

本發(fā)明的試劑盒可以任選地包括可用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的其他組分。

例如，在一些方面中，本發(fā)明涉及用于檢測生物樣品中的Eno1的試劑盒，其包括至少一種用于測量生物樣品中的Eno1水平的試劑，和用于測量Eno1水平的一套說明。在一些實(shí)施方案中，試劑是抗Eno1抗體。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括檢測抗Eno1抗體的工具。在一些實(shí)施方案中，檢測抗Eno1抗體的工具是可檢測的第二抗體。在一些實(shí)施方案中，用于測量Eno1水平的試劑是與Eno1 mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸。

在上述試劑盒的一些實(shí)施方案中，說明書給出了用于檢測生物樣品中的Eno1水平的免疫分析或ELISA。在一些實(shí)施方案中，說明書給出了用于測定生物樣品中的Eno1 mRNA水平的擴(kuò)增反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)用于檢測生物樣品中的Eno1 mRNA的量。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增反應(yīng)是(a)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；(b)基于核酸序列的擴(kuò)增分析(NASBA)；(c)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)；(d)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)；或(e)鏈置換擴(kuò)增(SDA)。

在上述試劑盒的一些實(shí)施方案中，說明書給出了用于檢測生物樣品中的Eno1 mRNA的量的雜交分析。在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括至少一個(gè)與Eno1 mRNA的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于檢測受試者樣品中的一種或多種血糖指示劑的試劑組和至少一種對照試劑。在特定實(shí)施方案中，對照試劑用于檢測生物樣品中的指示劑，其中試劑組提供含有用作陽性對照以及任選用于定量生物樣品中存在的指示劑量的指示劑的對照樣品。在特定實(shí)施方案中，試劑組包括用于已知存在或不存在于生物樣品中的與異常血糖不相關(guān)的蛋白質(zhì)或核酸的檢測試劑以分別提供陽性或陰性對照。試劑組可以提供用于檢測樣品中與異常血糖不相關(guān)的對照蛋白的試劑，例如，血液或血液衍生樣品中的白蛋白，用于樣品中存在的指示劑量的標(biāo)準(zhǔn)化。試劑組可以提供純化的指示劑，例如，Eno1，用作對照用于檢測或用于使用所述試劑組進(jìn)行的分析的定量。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑組包括用于Eno1檢測的試劑，優(yōu)選結(jié)合對照試劑。在該試劑組中，通過對于該Eno1特異性的試劑來檢測Eno1。在特定實(shí)施方案中，試劑組進(jìn)一步包括用于HbA1c檢測的試劑。在特定實(shí)施方案中，試劑組包括重復(fù)孔、點(diǎn)或部分以允許各種稀釋度(例如，連續(xù)稀釋)的生物樣品和對照樣品的分析。在優(yōu)選實(shí)施方案中，試劑組允許血糖的一種或多種指示劑的定量檢測。

在特定實(shí)施方案中，試劑組是用于檢測一種或多種標(biāo)志物的蛋白質(zhì)芯片。在特定實(shí)施方案中，試劑組是用于檢測一種或多種標(biāo)志物的ELISA平板。在特定實(shí)施方案中，套組是用于檢測一種或多種標(biāo)志物的定量PCR的平板。

在特定實(shí)施方案中，在單一裝置上提供檢測試劑組，包括用于本發(fā)明的一種或多種標(biāo)志物的檢測試劑和至少一個(gè)對照樣品。在特定實(shí)施方案中，可以在單一裝置上提供檢測試劑組，包括用于本發(fā)明的兩種或更多種標(biāo)志物的檢測試劑和至少一個(gè)對照樣品。在特定實(shí)施方案中，用于檢測本發(fā)明的不同標(biāo)志物的多個(gè)試劑組提供有至少一種統(tǒng)一的對照樣品以有助于試劑組之間的結(jié)果比較。

在特定實(shí)施方案中，試劑組和試劑盒進(jìn)一步包括用于測量受試者中的血糖的說明或建議。在特定實(shí)施方案中，試劑盒或試劑組提供有一種或多種用于血糖測量的試劑或裝置。

本發(fā)明還提供了用于治療至少一種糖尿病的試劑盒，例如，1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、前驅(qū)糖尿病、胰島素抵抗、葡萄糖不耐性、異常血糖和血糖控制的喪失。試劑盒包括Eno1以及使用說明和(按照需要)用于施用的裝置中的一個(gè)或多個(gè)。

通過以下實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為限制。在整個(gè)申請中引用的所有參考文獻(xiàn)以及公開專利和專利申請的內(nèi)容在此按引用并入。

實(shí)施例

實(shí)施例1-使用平臺技術(shù)來鑒定作為糖尿病病因?qū)W中的重要活性節(jié)點(diǎn)的烯醇酶1(Eno1)

在這個(gè)實(shí)施例中，使用國際專利申請No.PCT/US2012/027615中詳細(xì)描述的平臺技術(shù)來整合獲自定制的糖尿病模型的數(shù)據(jù)和鑒定驅(qū)動糖尿病(特別是2型糖尿病)的發(fā)病機(jī)理的新蛋白質(zhì)/途徑。從這個(gè)分析獲得的關(guān)系圖已經(jīng)鑒定了Eno1作為糖尿病病因?qū)W中的重要活性節(jié)點(diǎn)。因此，Eno1是重要的糖尿病治療靶標(biāo)，以及與糖尿病相關(guān)的診斷/預(yù)后標(biāo)志物。

實(shí)施例2-肌管中葡萄糖攝取的Eno1調(diào)節(jié)

使用商業(yè)上可購得的表達(dá)載體，Eno1在大腸桿菌中作為6X HIS蛋白標(biāo)簽重組表達(dá)。使用本領(lǐng)域已知的親和性色譜方法純化標(biāo)記的Eno1。優(yōu)選地，切割6X HIS標(biāo)簽以產(chǎn)生用于本文中提供的方法中的蛋白質(zhì)。

人骨骼肌成肌細(xì)胞(HSMM)獲自PromoCell并且在零售商推薦的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)前，在96孔平板中用2％馬血清將HSMM成肌細(xì)胞(20,000細(xì)胞/孔)分化7天。用人Eno1(500ug/ml)處理細(xì)胞。用200μl含有0.1％BSA的MBSS改良平衡鹽溶液(MBSS)緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，然后用100ul MBSS 0.1％BSA進(jìn)行血清饑餓4小時(shí)。開始胰島素刺激時(shí)，將MBSS 0.1％BSA緩沖液中的100ul 2×試劑加入100ul饑餓培養(yǎng)基中以制得用于實(shí)驗(yàn)的1×濃度。2×試劑為：胰島素(0，20nM和200nM)；熒光葡萄糖類似物2-NBDG(500uM)。用胰島素和熒光脫氧-葡萄糖類似物2-NBDG處理細(xì)胞30min，然后用MBSS緩沖液洗滌兩次，然后將50ul MBSS緩沖液加入孔中。用熒光計(jì)檢測葡萄糖攝取，連同使用其中無細(xì)胞的孔的背景檢測。熒光計(jì)讀出后，將固定劑(福爾馬林，50ul)加入孔中的50ul MBSS中，然后將100ul 1Um DAPI加入100ul福爾馬林和MBSS混合物中。

如圖1A和1B中所示，用Eno1處理肌管顯著提高了不存在和存在胰島素的情況下的葡萄糖攝取(p＝0.025非胰島素依賴性葡萄糖攝取，未處理的vs.Enol處理的)。這些結(jié)果證明了Eno1在胰島素依賴性和非胰島素依賴性葡萄糖攝取中的作用。由Eno1誘導(dǎo)的胰島素依賴性葡萄糖攝取證明了Eno1在受試者中對于胰島素敏感的至少骨骼肌中與胰島素信號傳導(dǎo)途徑復(fù)雜地關(guān)聯(lián)。結(jié)果還證明了Eno1在非胰島素依賴性葡萄糖攝取中的作用。這種觀察對于1型和2型糖尿病受試者的治療是重要的，所述受試者患有胰島素抵抗且還具有高胰島素血癥，使得胰島素作用受損并且因此是非胰島素依賴性的。這些結(jié)果證明Eno1在刺激葡萄糖攝取中是有用的，即使在不再具有正常胰島素信號傳導(dǎo)的個(gè)體中。

用上述純化Eno1蛋白處理人骨骼肌肌管的細(xì)胞培養(yǎng)物48小時(shí)以測量Eno1攝取。然后通過Western印跡測定細(xì)胞中的Eno1水平。如圖2A和2B中所示，用500μg/ml Eno1或1000μg/ml Eno1處理的細(xì)胞中的Eno1水平相對于未處理細(xì)胞具有顯著較高的Eno1水平。用1000μg/ml Eno1處理的細(xì)胞中的Eno1水平也高于用500μg/ml Eno1處理的細(xì)胞中的水平。這些結(jié)果表明Eno1以劑量依賴性的方式遞送至人骨骼肌肌管中。

為了測定Eno1酶活性在葡萄糖攝取中的作用，通過在88℃下處理90秒來熱滅活純化的Eno1，并且比較原始的和熱滅活的Eno1的活性水平。使用來自Abcam(Cambridge，MA；Cat.No.ab117994)的Eno1人活性分析試劑盒通過比色分析測定Eno1活性。如圖3A中所示，熱滅活極大地降低了Eno1酶活性，但保留了一些殘留活性。

按照上述方法，在人骨骼肌肌管中比較了原始和熱滅活的Eno1對葡萄糖攝取的作用。如圖3B中所示，相對于未用Eno1處理的肌管，用原始(活性)Eno1處理的肌管呈現(xiàn)出顯著較高的葡萄糖攝取。與用活性Eno1處理的肌管相比，用熱滅活的Eno1處理的肌管呈現(xiàn)出顯著較低的葡萄糖攝取。這些結(jié)果表明Eno1對葡萄糖攝取的作用依賴于Eno1酶活性。熱滅活的Eno1相對于不含Eno1的對照觀察到的葡萄糖攝取的提高很可能是由于熱滅活酶的殘留Eno1活性。

實(shí)施例3-膳食誘導(dǎo)肥胖(DIO)小鼠的小鼠模型

將兩個(gè)基本上等同的膳食誘導(dǎo)肥胖癥模型用于本文中提供的方法中。

在第一種方法中，雄性C57BL/6J小鼠獲自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)并且最初4-5只/籠圈養(yǎng)在22℃下，使用12:12hr白天-黑夜循環(huán)。在6周齡開始，給小鼠飼喂高脂肪膳食(Research Diets Cat#:D12492；60kcal％脂肪、20kcal％蛋白和20kcal％碳水化合物)。還獲得了瘦的對照小鼠并飼喂標(biāo)準(zhǔn)膳食。實(shí)驗(yàn)前DIO小鼠的體重顯著重于瘦對照小組。在一個(gè)研究中，DIO小鼠稱重38.4±0.6g，而瘦小鼠稱重29.9±0.5g(p<0.05)。

在第二種方法中，膳食誘導(dǎo)肥胖雄性C57BL/6J小鼠(12周大)和對照瘦小鼠(12周大)獲自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)，并且最初4-5只/籠圈養(yǎng)在22℃下，使用12:12hr白天-黑夜循環(huán)。在處理前將小鼠在動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中適應(yīng)一周并對DIO組維持高脂肪膳食(Research Diets Cat#:D12492；60kcal％脂肪、20kcal％蛋白和20kcal％碳水化合物)或?qū)κ萁M維持低脂肪膳食(10％kcal％脂肪)。

實(shí)施例4-在膳食誘導(dǎo)肥胖癥(DIO)小鼠中用Eno1治療葡萄糖不耐性

在高脂肪膳食維持7周后小鼠(n＝10只/組)肥胖時(shí)，開始實(shí)驗(yàn)方案。按照制造商的指導(dǎo)，將微型滲透泵(型號1004，Alzet，Cupertino，CA)填充0.1ml Eno1肽或溶媒(磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，pH 7.0)。將泵在無菌鹽水中在4℃下準(zhǔn)備過夜。用異氟烷將小鼠麻醉(100％氧中1-3％)并在外科手術(shù)前用70％異丙醇和聚維酮碘溶液擦洗。在中肩胛區(qū)域中形成小的皮下切口，將泵插入并且縫合傷口。在返回其圈養(yǎng)籠子之前，使得動物恢復(fù)。皮下微型滲透泵的植入以0.11μl/hr的恒定速率持續(xù)灌注肽，持續(xù)四周。每4周進(jìn)行泵更換手術(shù)。通過泵灌注速率計(jì)算的純化Eno1處理劑量為10μg/kg體重。

在6h禁食后，使用常規(guī)方法進(jìn)行葡萄糖耐量測試(GTT)。簡而言之，測定了初始空腹血糖水平，接著以1.5g/kg體重的劑量腹膜內(nèi)(ip)注射20％右旋糖溶液。在葡萄糖注射后15，30，60，90和120分鐘，使用 Advantage血糖儀(Diagnostics，Indianapolis，IN)從尾靜脈測量血糖水平。使用Graphpad軟件計(jì)算GTT過程中的曲線下面積(AUC)，并且針對不同處理組之間的顯著性進(jìn)行了student t-檢驗(yàn)。結(jié)果顯示于圖4A和4B中。

如可以容易地觀察到的，用Eno1處理的小鼠與未處理小鼠相比，血糖曲線下面積顯著降低(p＝0.017)。這些數(shù)據(jù)證明了用Eno1蛋白處理肥胖小鼠提高了葡萄糖耐量，如通過葡萄糖耐量測試證明的，并且表明了Eno1在胰島素抵抗、葡萄糖不耐性和2型糖尿病的治療中是有效的。

實(shí)施例5-PAMAM樹狀聚合物、肌肉靶向Eno1的產(chǎn)生

已經(jīng)證明了全身施用時(shí)Eno1提高肌管中的葡萄糖攝取和提高葡萄糖耐量的功效，因此產(chǎn)生了肌肉靶向的Eno1來分析其提高葡萄糖耐量的功效。使用下文所述的方法產(chǎn)生了含有肌肉靶向肽(MTP)ASSLNIA和/或Eno1的可檢測地標(biāo)記的G5-PAMAM樹狀聚合物。評價(jià)了各種不同比率的MTP與樹狀聚合物，包括含有MTP的樹狀聚合物，其含有約10個(gè)MTP肽/樹狀聚合物，約3個(gè)MTP肽/聚合物或約1個(gè)MTP肽/樹狀聚合物。

制備Eno1樹狀聚合物復(fù)合物的過程包括試劑的最佳比例和濃度的鑒定。在緩沖液中制備了Eno1的原液，并將蛋白溶液以不同比率與G5樹狀聚合物-肌肉靶向肽(MTP)偶聯(lián)物混合。還評價(jià)了各種不同比率的樹狀聚合物與Eno1，包括含有Eno1的樹狀聚合物，其含有約一個(gè)樹狀聚合物/Eno1蛋白分子或約五個(gè)樹狀聚合物/Eno1蛋白分子。

在不同溫度下評價(jià)了Eno1-樹狀聚合物-SMTP復(fù)合物的穩(wěn)定性，并且使用商業(yè)上可購得的Eno1分析通過測量Eno1活性測定了在3-4個(gè)月的時(shí)間段內(nèi)的穩(wěn)定性。還是用生物物理技術(shù)，包括動態(tài)光散射(DLS)和UV-Vis光譜學(xué)，來評價(jià)選定的偶聯(lián)物以證實(shí)樹狀聚合物-肽偶聯(lián)物和Eno1之間的復(fù)合。

Eno1純度的測定：通過考馬斯和銀染以及Western印跡檢查了Eno1蛋白的5.32mg/L溶液的純度。制備了范圍從10μg/孔至100ng/孔的Eno1蛋白的幾個(gè)稀釋液并加載于12-孔，4-12％ TGX凝膠[BIO-RAD Cat#456-1095Lot#4000 79200]上。泳道分配如下：泳道1：梯(Precision Plus Protein Standard Dual Color[BIO-RAD Cat#161-0374]；泳道2：Eno1(10.0μg)；泳道3：Eno1(1.0μg)；泳道4：Eno1(0.1μg)；泳道5：梯(Precision Plus Protein Standard Dual Color[BIO-RAD Cat#161-0374]；泳道6：Eno1(10.0μg)；泳道7：Eno1(1.0μg)；泳道8：Eno1(0.1μg)；泳道9：梯(Precision Plus Protein Standard Dual Color[BIO-RAD Cat#161-0374]；泳道10：Eno1(10.0μg)；泳道11：Eno1(1.0μg)；泳道12：Eno1(0.1μg)。SDS-PAGE在200V下運(yùn)行20-25min。

考馬斯染色：跑膠后，將凝膠分割成3個(gè)相等部分。一個(gè)部分用考馬斯染色。簡而言之，將凝膠浸沒在100mL考馬斯染色液(40％甲醇和7％乙酸中的0.025％考馬斯染料)中并在微波爐中加熱一分鐘。然后，凝膠伴隨溫和攪拌使染色45分鐘。完成染色后，使用脫色液(40％甲醇和7％乙酸)將凝膠脫色直至背景染色可接受。

如圖5中所示，蛋白呈現(xiàn)為約47kDa的單個(gè)條帶，這與Eno1的大小一致。

銀染：由于考馬斯染色對于蛋白條帶的可視化不是一種靈敏的方法，另一部分的凝膠使用BIO-RAD的銀染試劑盒[BIO-RAD Cat#161-0443]用銀染來染色。遵循改良的銀染實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行。

如圖6中所示，在每個(gè)泳道中看到了額外的條帶，其對應(yīng)于梯的條帶。這是由于梯狀條帶漏入了鄰近泳道中。用箭頭標(biāo)記的三個(gè)條帶不是來自梯。最明顯的條帶為約47kDa，這與Eno1的大小一致。在純化蛋白中存在兩個(gè)額外條帶，但這些條帶微弱，表明Eno1的整體純度是相對高的。

Western印跡分析：通過Western印跡進(jìn)一步確認(rèn)Eno1的身份。為了這個(gè)目的，將最后部分的凝膠轉(zhuǎn)移至100mL Tris-甘氨酸緩沖液中并使用transblot SD半干式轉(zhuǎn)移裝置(BIO-RAD)在20V下轉(zhuǎn)移至0.2μm PVDF膜(BIO-RAD)上2.0h。通過觀察膜上預(yù)染色梯狀條帶的存在來檢查轉(zhuǎn)移的效率。將膜干燥1.0h。然后膜用甲醇潤濕1.0min，并用15.0mL封閉緩沖液(LICOR)在室溫下封閉2.0h。

封閉完成后，用15.0mL的含有30μL抗-ENOA-1 m-Ab(小鼠)(購自ABNOVA)的封閉緩沖液將膜在4℃下孵育過夜。然后用3×30mL的1×PBS-T洗滌膜，每次振蕩5分鐘。然后用15.0mL的含有5μL用800CW(購自LICOR)標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗的封閉緩沖液將膜在室溫下孵育2.0h。孵育后，用3×30mL的1×PBS-T，接著2×30mL的1×PBS洗滌膜，每次振蕩5分鐘。最后，使用LICOR ODYSSEY紅外成像儀將膜成像。如圖7中所示，Western印跡分析證實(shí)了47kDa的主要訂帶是Eno1。

烯醇酶-I/G5-PAMAM-SMTP的Zeta(ζ)-電位表征：以改變的比率復(fù)合Eno1和帶有2-3個(gè)骨骼肌靶向肽(SMTP)的5代PAMAM樹狀聚合物以形成Eno1/G5-SMTP蛋白/樹狀聚合物復(fù)合物。將樹狀聚合物的濃度保持恒定在1.0μM，而Eno1濃度在0.1μM-10.0μM之間變化。以下表2描述了怎樣制備烯醇酶-I/G5-樹狀聚合物/SMTP混合物。

表2.用于形成樹狀聚合物復(fù)合物的Eno1和G5-樹狀聚合物/SMTP的各種組合

通過將G5-樹狀聚合物/SMTP加入相應(yīng)量的PBS中制備了各個(gè)樣品。然后將烯醇酶以逐滴方式加入G5-樹狀聚合物/SMTP溶液中，同時(shí)低速渦旋。然后在分析前，將樣品在室溫下孵育20分鐘。

使用來自Malvern Instruments的Zetasizer Nano Z90s儀器進(jìn)行大小測量。使用缺省參數(shù)用于測量，并且收集每個(gè)樣品的三個(gè)單獨(dú)測量。圖8顯示了針對具有2:1的Eno1與樹狀聚合物/SMTP摩爾比的Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP復(fù)合物的三個(gè)樣品的Zeta(ζ)-電位數(shù)據(jù)。使用動態(tài)光散射測量Zeta(ζ)-電位。如圖8中所示，三個(gè)樣品的峰匹配，表明烯醇酶-SMTP樹狀聚合物復(fù)合物的均一電荷分布。

烯醇酶-I/G5-SMTP復(fù)合物的穩(wěn)定性：通過使用ENO1人活性分析試劑盒(ABCAM，Cambridge，MA；目錄No.ab117994)測量了烯醇酶-I/G5-樹狀聚合物/SMTP偶聯(lián)物的穩(wěn)定性。簡而言之，將樣品加入含有Eno1特異性的單克隆小鼠抗體的微平板中。將微平板在室溫下孵育2小時(shí)，并將Eno1免疫捕獲在微平板的孔內(nèi)。洗滌微平板的孔以除去所有其他酶。通過按照在包括丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)以及所需底物2-磷酸-D-甘油酸(2PG)和NADH的分析緩沖液中的NADH消耗來測定Eno1活性。Eno1將2PG轉(zhuǎn)化成磷酸烯醇丙酮酸，其通過PK轉(zhuǎn)化成丙酮酸。丙酮酸通過LDH轉(zhuǎn)化成乳酸，并且這種反應(yīng)需要NADH。作為340nm處吸光度的下降來監(jiān)測NADH的消耗。

使用上述分析測量了不同時(shí)間點(diǎn)在不同溫度下儲存的烯醇酶-I/G5-樹狀聚合物/SMTP偶聯(lián)物的活性。選擇500ng的Eno1濃度用于測試，因?yàn)檫@個(gè)濃度落入分析試劑盒的動態(tài)范圍的中間。制備了兩個(gè)不同組的溶液。一組(對照)僅含有Eno1(即，未偶聯(lián)的Eno1)，而另一組含有Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP混合物。然后將這些混合物保持在-80℃、-20℃、4℃、22℃和37℃。結(jié)果顯示出在第一周中，全部樣品是有活性的，并且Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP偶聯(lián)物看來具有略高于單獨(dú)的Eno1的活性。然而，溶液的活性，無論是否它們含有樹狀聚合物，在接下來的兩周中穩(wěn)定地降低。到第3周，儲存在4℃、22℃和37℃下的溶液未顯示出活性，而儲存在-80℃和-20℃的溶液顯示出顯著的穩(wěn)定性。在研究結(jié)束時(shí)(第10周)，保持在-80℃的Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP溶液保留約90％的活性，而單獨(dú)的Eno1僅有35％活性。另一方面，保持在-20℃的Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP溶液為約24％活性的，而儲存在-20℃的單獨(dú)Eno1無活性(圖9)。

實(shí)施例6-使用G5 PAMAM樹狀聚合物的體內(nèi)Eno1靶向研究

使用之前實(shí)施例中提供的方法制備了含有Eno1的可檢測地標(biāo)記的PAMAM樹狀聚合物并在皮下注射后分析在小鼠中的組織分布。具體地，在注射前72小時(shí)，給小鼠飼喂無苜蓿食物以限制背景熒光。給小鼠皮下注射3μg ENO1/小鼠，總共150μl(75μl左側(cè)，75μl右側(cè))。復(fù)合物中樹狀聚合物與Eno1的摩爾比為5:1。注射后1、4和24小時(shí)，將動物處死、去皮并取出器官準(zhǔn)備用于LI-COR成像。結(jié)果顯示于圖10A中。

如所示的，在1小時(shí)時(shí)，觀察到了Eno1-PAMAM樹狀聚合物的總體全身分布。4小時(shí)后，觀察到了Eno1-PAMAM樹狀聚合物在肝臟、腎臟和皮下脂肪以及在上部軀體中的明顯累積。24小時(shí)后，Eno1-樹狀聚合物基本上清除，并且基本上在肝臟和腎臟中觀察到。

使用骨骼肌靶向的含有SMTP“ASSLNIA”的Eno1-PAMAM樹狀聚合物復(fù)合物進(jìn)行了追蹤研究。使用之前實(shí)施例中提供的方法制備了含有Eno1和SMTP的可檢測地標(biāo)記的PAMAM樹狀聚合物復(fù)合物((烯醇酶-Vivo Tag680xl)-(G5-SMTP))。復(fù)合物中樹狀聚合物與SMTP的摩爾比為1:1?；旧习凑找陨纤龅倪M(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。以50μg/kg體重的劑量施用了骨骼肌靶向的Eno1-PAMAM樹狀聚合物復(fù)合物。在注射1hr后獲取了圖10B中的這些圖像。心臟以外的器官保留在體內(nèi)。如可以容易地觀察到的，肌肉靶向Eno1樹狀聚合物復(fù)合物靶向骨骼肌而不是心臟。這些結(jié)果證明了骨骼肌靶向Eno1-PAMAM樹狀聚合物復(fù)合物可以用于將Eno1遞送至骨骼肌細(xì)胞。

實(shí)施例7-用肌肉靶向Eno1在膳食誘導(dǎo)肥胖癥(DIO)小鼠中治療葡萄糖不耐性

膳食誘導(dǎo)肥胖雄性C57BL/6J小鼠(12周大)和對照瘦小鼠(12周大)獲自Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME)并且最初4-5只/籠圈養(yǎng)在22℃下，使用12:12hr白天-黑夜循環(huán)。在處理前將小鼠在動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中適應(yīng)一周并對DIO組維持高脂肪膳食(Research Diets Cat#:D12492；60kcal％脂肪、20kcal％蛋白和20kcal％碳水化合物)或?qū)κ萁M維持低脂肪膳食(10％kcal％脂肪)。

在13周大開始，所有小鼠接受每日皮下注射鹽水或具有G5樹狀聚合物、骨骼肌靶向肽(SMTP)和純化Eno1(50μg/kg體重)的組合的不同復(fù)合物，持續(xù)4周。在實(shí)驗(yàn)的處理部分的4周過程中，每周進(jìn)行了腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測試(IPGTT)。在處理期過程中，每周測量體重、餐后血糖和空腹血糖。處理組如下所示：

1.LFD-瘦對照-無注射

2.HFD-鹽水對照(體積等同于G5+SMTP+Eno1)

3.HFD-只有G5(等同于50μg/kg的G5+SMTP+Eno1)

4.HFD--G5+SMTP(等同于50μg/kg的G5+SMTP+Eno1)

5.HFD--G5+Eno1(50μg/kg體重)

6.HFD--G5+SMTP+Enol(50μg/kg體重)

復(fù)合物中樹狀聚合物與Eno1的摩爾比為5:1，復(fù)合物中樹狀聚合物與SMTP的摩爾比為1:1，并且樹狀聚合物是乙?；?。來自該研究的結(jié)果提供于圖11、12、13、14和15中。

在這個(gè)小群組中，發(fā)現(xiàn)沒有治療方案在研究過程中的任何時(shí)間對DIO小鼠的體重具有顯著影響(參見圖11)。

用單劑量的樹狀聚合物結(jié)合的肌肉靶向Eno1處理小鼠證明了在最早測試時(shí)間點(diǎn)對血糖水平具有作用。如圖12中所示的，在施用50μg/kg的G5+SMTP+Eno1后一小時(shí)，與鹽水對照相比觀察到血糖的降低，在4小時(shí)時(shí)觀察到最大降低。在單次注射后24小時(shí)時(shí)不再觀察到作用。

在開始施用樹狀聚合物結(jié)合的肌肉靶向Eno1后一周時(shí)，用Eno1樹狀聚合物SMTP復(fù)合物(DIO烯醇酶-1+NP+SMTP)處理的DIO小鼠中的葡萄糖耐量顯著低于用單獨(dú)的樹狀聚合物SMTP復(fù)合物(DIO NP+SMTP)處理的DIO小鼠中的葡萄糖耐量(參見圖13A和13B)。

在開始施用樹狀聚合物結(jié)合的肌肉靶向Eno1后兩周時(shí)，DIO小鼠中的葡萄糖耐量仍然顯著提高(參見圖6C和6D)。葡萄糖耐量的提高依賴于樹狀聚合物復(fù)合物中Eno1的存在(DIO G5+SMTP vs.DIO Eno1G5+SMTP，p＝5.7×10^-5，p＝0.002)。在單次注射后23小時(shí)不再觀察到作用(數(shù)據(jù)未顯示)。

在第1和第2周時(shí)觀察到的G5+SMTP+Eno1處理的有益作用持續(xù)至第4周(參見圖14A和14B)。具體地，DIO Eno1G5+SMTP處理小鼠中的葡萄糖耐量與瘦小鼠中的相似。葡萄糖耐量的提高是顯著的并且依賴于樹狀聚合物復(fù)合物中Eno1的存在(DIO G5+SMTP vs.DIO Eno1G5+SMTP，p＝0.0017)。在單次注射后23小時(shí)不再觀察到作用(數(shù)據(jù)未顯示)。

這些結(jié)果表明樹狀聚合物結(jié)合的肌肉靶向Eno1在提高膳食誘導(dǎo)肥胖癥模型中的葡萄糖耐量中是有效的，并且G5+SMTP+Eno1在使膳食誘導(dǎo)肥胖癥小鼠模型中的血糖正?；怯行У?。這些結(jié)果證明了Eno1在升高的血糖、葡萄糖不耐性和糖尿病，特別是2型糖尿病的治療中是有用的。

按照以上所述的將小鼠再處理4周(總共8周處理)，并且測定了瘦小鼠、膳食誘導(dǎo)肥胖癥(DIO)小鼠、用G5-樹狀聚合物處理的DIO小鼠和用Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP復(fù)合物處理的小鼠在處理8周后的血清乳酸鹽水平。使用來自Biovision(Milpitas，CA)的乳酸鹽比色分析試劑盒測量了血清中的乳酸鹽水平。如圖15中所示，Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP復(fù)合物顯著降低了乳酸鹽血清水平。這個(gè)結(jié)果表明用Eno1/G5-樹狀聚合物/SMTP復(fù)合物處理的DIO小鼠中觀察到的降低的葡萄糖水平是由于提高的葡萄糖氧化，而不是糖酵解至乳酸鹽的分流。這將最小化乳酸鹽酸中毒的不利影響。

實(shí)施例8-用肌肉靶向Eno1在肥胖的遺傳模型db/db小鼠中治療葡萄糖不耐性

雄性肥胖和糖尿病db/db小鼠(雄性BKS.Cg-m+/+Lepr^db/J)小鼠獲自商業(yè)零售商。所有小鼠2-3只/籠圈養(yǎng)在22℃下，使用12:12hr白天-黑夜循環(huán)，并且在動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料適應(yīng)3周。在8周大時(shí)，通過皮下施用(n＝6/組)，每日一次施用鹽水或具有G5樹狀聚合物、骨骼肌靶向肽(SMTP)和純化Eno1組合的不同復(fù)合物的以下皮下注射。處理組如下：

1.使用鹽水注射的db/db

2.使用G5+SMTP(體積等同于25ug/kg劑量的Eno1+G5+SMTP)的db/db

3.使用Eno1(25ug/kg體重)+G5+SMTP的db/db

4.使用Eno1(50ug/kg體重)+G5+SMTP的db/db

復(fù)合物中樹狀聚合物與Eno1的摩爾比為5:1，而復(fù)合物中樹狀聚合物與SMTP的摩爾比為1:1，并且樹狀聚合物是乙?；?。

在第7天，小鼠施用合適的藥劑并在按照以上實(shí)施例所述的施用IPGTT之前返回籠子6小時(shí)而沒有食物。結(jié)果顯示于圖16A和16B中。如可以容易地觀察到的，用Eno1+G5+SMTP處理小鼠導(dǎo)致葡萄糖負(fù)荷后葡萄糖耐量提高，與用G5+SMTP處理的小鼠相比用Eno1(50ug/kg體重)+G5+SMTP處理的小鼠中觀察到葡萄糖清除的顯著提高(p＝0.015)。

使用上述所列每個(gè)處理組中六只小鼠中的三只繼續(xù)研究。小鼠施用所示藥劑再一周(總共2周)。測試了Eno1對降低餐后血糖的作用。具體地，在不控制食物攝入的情況下，在施用活性劑后立即評價(jià)小鼠中的血糖水平兩小時(shí)。如所示的，Eno1(50ug/kg體重)+G5+SMTP的施用證明了降低餐后血糖并且導(dǎo)致與G5+SMTP的施用相比在施用后30分鐘血糖的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的降低。然而，Eno1+G5+SMTP處理后30分鐘觀察到的降低的血糖在Eno1注射后24小時(shí)時(shí)沒有維持(圖18)。

因此，還在db/db小鼠中評價(jià)了每日兩次給藥Eno1+G5+SMTP對血糖水平的作用。每日兩次通過皮下注射來給予處理，一次在早晨和一次在晚上，持續(xù)四周。處理組如下：

1.PBS

2.100μg/kg體重Eno1+G5+SMTP

3.200μg/kg體重Eno1+G5+SMTP

Eno1+G5+SMTP復(fù)合物中樹狀聚合物與Eno1的摩爾比為5:1，而Eno1+G5+SMTP復(fù)合物中樹狀聚合物與SMTP的摩爾比為1:1，并且樹狀聚合物是乙?；?。

處理組2的總?cè)談┝繛?00μg/kg體重Eno1+G5+SMTP，和處理組3的總?cè)談┝繛?00μg/kg體重Eno1+G5+SMTP。在不控制食物攝入的情況下，在晚上注射后16小時(shí)(即在早晨注射前)評價(jià)了小鼠中的餐后血糖水平。如圖19中所示，每日兩次注射200μg/kg體重Eno1+G5+SMTP相對于對照PBS處理降低了餐后血糖水平。

因此，用Eno1G5+SMTP處理小鼠顯示出使db/db小鼠中的葡萄糖反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)施例7和8中所述的數(shù)據(jù)一起證明了Eno1在提高2型糖尿病的誘導(dǎo)模型和遺傳模型中的葡萄糖耐量都是有效的。

實(shí)施例9-含樹狀聚合物的乙?；痸s.非乙?；疭MTP的比較毒性

使用肌氨酸激酶和半胱天冬酶3分析比較了含有乙?；头且阴；瘶錉罹酆衔锏腟MTP的毒性。給小鼠注射十字孢堿(staurosporine)(陽性對照)、十字孢堿+抑制劑(陰性對照)；G5 PAMAM樹狀聚合物、SMTP-G5 PAMAM樹狀聚合物和乙?；疭MTP-G5 PAMAM樹狀聚合物中的一種。復(fù)合物中樹狀聚合物與Eno1的摩爾比為5:1，而復(fù)合物中樹狀聚合物與SMTP的摩爾比為1:1。注射后，收集樣品并使用商業(yè)上可購得的試劑盒測定作為總細(xì)胞裂解物的百分比的肌氨酸激酶水平和半胱天冬酶3活性。結(jié)果顯示于圖20中。如圖20中所示，1uM和3uM濃度的G5 PAMAM樹狀聚合物的施用以及3uM濃度的SMTP-G5 PAMAM樹狀聚合物的施用導(dǎo)致肌氨酸激酶活性的顯著提高。使用乙?；疭MTP-G5 PAMAM樹狀聚合物觀察到?jīng)]有這種作用。相似地，3uM G5 PAMAM樹狀聚合物和SMTP-G5 PAMAM樹狀聚合物施用后，觀察到半胱天冬酶3活性的顯著提高。然而，施用乙?；疭MTP-G5 PAMAM樹狀聚合物時(shí)，沒有觀察到半胱天冬酶3活性的提高。這些結(jié)果證明了SMTP-G5 PAMAM樹狀聚合物的乙酰化降低了毒性。

實(shí)施例10-在2型和1型糖尿病的遺傳和誘導(dǎo)模型中用肌肉靶向Eno1治療葡萄糖不耐性

獲得或產(chǎn)生雄性肥胖小鼠、糖尿病db/db小鼠(雄性BKS.Cg-m+/+Lepr^db/J)小鼠、NOD1小鼠或鏈脲霉素處理的小鼠。所有小鼠2-3只/籠圈養(yǎng)在22℃下，使用12:12hr白天-黑夜循環(huán)，并且在動物實(shí)驗(yàn)設(shè)施中飼喂合適飼料(即，用于肥胖小鼠的高脂肪膳食，用于其他小鼠的正常飼料)適應(yīng)至少1周。在合適年齡時(shí)，通常約8周大時(shí)，每日施用鹽水或具有G5樹狀聚合物、骨骼肌靶向肽(SMTP)和純化Eno1(25或50μg/kg體重)的組合的不同復(fù)合物的皮下注射，持續(xù)1-2周?？梢詫⑷缟纤龅目芍踩氡?例如，ALZET泵)用于每日或持續(xù)的施用。或者，可以在不同配方中通過肌肉內(nèi)施用藥劑。通常以低于皮下注射的頻率來進(jìn)行肌肉內(nèi)注射(例如，通常約每周一次)。

在2周時(shí)間過程中，進(jìn)行了腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測試(IPGTT)，并監(jiān)控空腹和餐后血糖(隨機(jī)地或在藥劑施用后的時(shí)間過程中)。在處理期間，每周測量體重。處理組包括至少一個(gè)對照(例如，1或2)和至少一個(gè)來自以下所示列表中的Eno1處理：

1.鹽水注射

2.G5+SMTP(體積等同于25ug/kg體重/天的Eno1+G5+SMTP)

3.Eno1(25ug/kg體重/天)+G5+SMTP

4.Eno1(50ug/kg體重/天)+G5+SMTP

5.Eno1(25ug/kg體重/天)

6.Eno1(50ug/kg體重/天)

提供的劑量是示例性的并且不認(rèn)為是限制性的。

用Eno1 G5+SMTP處理小鼠證明使糖尿病小鼠中的葡萄糖反應(yīng)正常化。

實(shí)施例11-小鼠中血糖水平和葡萄糖反應(yīng)的評價(jià)

以上描述了腹膜內(nèi)葡萄糖耐量測試(IPGTT)并常規(guī)地用于評價(jià)葡萄糖耐量和胰島素反應(yīng)。以下提供了可以用來證實(shí)Eno1在正?；呛鸵葝u素反應(yīng)中的功效的其他示例性方法。以下還提供了評價(jià)身體組成和代謝的方法。

腹膜內(nèi)胰島素耐量測試(IPITT)

在禁食1小時(shí)后進(jìn)行胰島素耐量測試(ITT)來評價(jià)丙酮酸代謝。測定了初始的血糖水平，接著注射(ip)人胰島素(1-2U/kg；Humulin R；Eli Lilly，Indianapolis，IN)。在胰島素注射后15、30、60、90和120min時(shí)，如上所述從尾靜脈測量血糖水平。由于接受高脂肪膳食的小鼠中肝胰島素抗性的發(fā)作，胰島素注射量通過胰島素反應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。

腹膜內(nèi)丙酮酸耐受測試(IPPTT)

在禁食6h后給予丙酮酸耐受試驗(yàn)。測定了初始血糖水平，接著注射(ip)溶解于鹽水中的丙酮酸(2g/kg；Sigma，St.Louis，MO)。在丙酮酸注射后15、30、60、90和120min，如上所述從尾靜脈測量血糖水平。計(jì)算測試過程中的曲線下面積(AUC)。

餐后血糖水平

從自由進(jìn)食的小鼠獲得血液樣品(隨機(jī)地或在在目標(biāo)藥劑施用后限定的時(shí)間或時(shí)間間隔)。測量血糖水平。

空腹血糖水平

在禁食預(yù)定時(shí)間段(通常約6-8小時(shí))后，在目標(biāo)藥劑施用后的限定時(shí)間或時(shí)間間隔從小鼠獲得血液樣品。測量血糖水平。

指示劑水平的評價(jià)來評價(jià)血糖水平

用本發(fā)明的一種或多種藥劑和合適的對照處理1型或2型糖尿病的小鼠模型。監(jiān)測HbA1c和/或Eno1蛋白和/或RNA的水平來測定持續(xù)時(shí)間段內(nèi)的血糖水平。

雙能X-射線吸收測定法(DEXA)

按照制造商推薦的程序，使用LUNAR小鼠光密度計(jì)通過雙能x-射線吸收測定法(DEXA)掃描來測定不同處理組的身體質(zhì)量組成。記錄并分析了瘦體質(zhì)量、脂肪體質(zhì)量、總身體組織重量、骨密度和骨礦物質(zhì)含量。

綜合實(shí)驗(yàn)室動物監(jiān)控系統(tǒng)(CLAMS)

使用CLAMS(Columbus Instruments，Columbus，OH，USA)代謝監(jiān)測籠來同時(shí)監(jiān)測水平和垂直活動、進(jìn)食和飲水、氧消耗和CO₂產(chǎn)生。ASO注射的和對照小鼠單獨(dú)地置于CLAMS籠中并在籠中適應(yīng)1-2天后監(jiān)測4-天時(shí)間。在禁食和進(jìn)食條件下記錄各種參數(shù)。作為累積數(shù)據(jù)直接測量食物和水消耗。每小時(shí)文件顯示了針對每個(gè)參數(shù)的所有測量：消耗的氧的體積，ml/kg/h(VO₂)，產(chǎn)生的二氧化碳的體積，ml/kg/h(VCO₂)，呼吸交換率，熱量(kcal/h)，累積的食物(g)，累積的飲水(g)，XY總活動(全部水平束中斷計(jì)數(shù))，XY走動活動(最少三個(gè)不同的、連續(xù)水平束中斷計(jì)數(shù))和Z活動(全部垂直束中斷計(jì)數(shù))。在30-s取樣時(shí)間段中記錄數(shù)據(jù)。通過用瘦體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化來分析CLAMS數(shù)據(jù)。

實(shí)施例12-Eno1對人骨骼肌肌管中胰島素刺激的p-Akt的作用

在具有或不具有胰島素處理的情況下在人骨骼肌肌管的細(xì)胞培養(yǎng)物中測定了純化的Eno1對胰島素刺激的p-Akt(S473)蛋白水平的作用。通過ELISA測量p-Akt蛋白水平。如圖21中所示，在Enol處理不存在的情況下，胰島素處理提高了p-Akt蛋白水平，且胰島素對p-Akt蛋白水平的作用在具有或不具有Eno1處理的情況下是相似的。這些結(jié)果顯示Eno1不影響p-Akt蛋白水平的胰島素刺激，表明Eno1對肌細(xì)胞中的葡萄糖攝取的作用與胰島素?zé)o關(guān)并且將在呈現(xiàn)胰島素抵抗的細(xì)胞中出現(xiàn)。

實(shí)施例13-Eno1與人骨骼肌肌管中提高的葡萄糖流量相關(guān)

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glut1)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(Glut4)涉及葡萄糖跨越質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且是骨骼肌內(nèi)的主要促進(jìn)性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Jones等，1998,Journal of Applied Physiology,Vol.84,pp.1661-1666)。Glut4負(fù)責(zé)胰島素調(diào)節(jié)的至細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。肌細(xì)胞生成素是可以參與調(diào)節(jié)Glut1和Glut4表達(dá)的肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子(參見Jones等，上文)。己糖激酶2(HK2)將葡萄糖磷酸化以形成葡萄糖-6-磷酸(G6P)并且是骨骼肌中的主要己糖激酶。

在具有或不具有Eno1處理的情況下，在人骨骼肌肌管細(xì)胞培養(yǎng)物中測量了Glut1、Glut4、HK2和肌細(xì)胞生成素的表達(dá)。用按照實(shí)施例2中所述制備的純化Eno1處理肌管。通過定量PCR測定了Glut1、Glut4、HK2和肌細(xì)胞形成素mRNA水平。通過MS蛋白質(zhì)組學(xué)分析測定了Glut1蛋白水平。如圖22A和22B中所示，Eno1處理提高了Glut1、Glut4和HK2mRNA水平，以及Glut1蛋白水平。因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)參與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，這些結(jié)果表明Eno1處理與骨骼肌中提高的葡萄糖流量相關(guān)。

為了進(jìn)一步研究Eno1在葡萄糖流量中的作用，在具有或不具有純化Eno1處理的情況下測量葡萄糖饑餓和葡萄糖刺激的人骨骼肌肌管中G6P和磷酸烯醇丙酮酸(PEP)水平。通過在無葡萄糖DMEM中孵育肌管15min來進(jìn)行葡萄糖饑餓。通過用5mM葡萄糖處理肌管15min進(jìn)行葡萄糖刺激。使用來自Biovision的分析試劑盒(Milpitas，CA；Cat.No.K657-100和K365-100)測量了G6P和PEP水平。如圖23和24中所示，Eno1處理提高了葡萄饑餓和葡萄糖刺激的人骨骼肌肌管中的G6P和PEP水平，進(jìn)一步表明Eno1處理與骨骼肌中提高的葡萄糖流量相關(guān)。

實(shí)施例14-Eno1作用方式

為了進(jìn)一步研究在葡萄糖攝取中的Eno1作用方式，測量了人骨骼肌肌管細(xì)胞中的氧消耗率(OCR)和細(xì)胞外酸化率(ECAR)。OCR是線粒體呼吸的指示，而ECAR是糖酵解的指示。

對于OCR實(shí)驗(yàn)，將各種化合物按序添加到細(xì)胞以誘導(dǎo)OCR的變化。例如，加入棕櫚酸鹽和羰基氰化物m-氯苯基腙(CCCP，氧化磷酸化的解偶聯(lián)劑)以提高OCR，并加入乙莫克舍(脂肪酸氧化抑制劑)以降低OCR。將KHB緩沖劑(pH 7.4)加入每個(gè)孔中，并每3min進(jìn)行測量，具有2min的測量間混合。按序注射BSA偶聯(lián)的棕櫚酸鹽(終濃度200mmol/L)、CCCP(終濃度2μM)和乙莫克舍(終濃度50mmol/L)。如圖25中所示，Eno1處理提高了OCR。這些結(jié)果表明Eno1處理與人骨骼肌肌管中提高的線粒體游離脂肪酸氧化相關(guān)。

對于使用葡萄糖作為底物的ECAR實(shí)驗(yàn)，使用無碳酸鈉和葡萄糖/丙酮酸的DMEM培養(yǎng)基。按序注射葡萄糖、寡霉素和2-DG以獲得25mmol/L的終濃度。如圖26中所示，Eno1處理提高了ECAR，表明Eno1處理與提高的糖酵解活性和能力相關(guān)。

為了測定用Eno1處理的人骨骼肌肌管的線粒體含量，用500ug/ml或1000μg/ml Eno1處理肌管48小時(shí)，并隨后加入Mitotracker green(Invitrogen)，一種綠色熒光線粒體染料。15min染色后，將肌管胰蛋白酶化、洗滌并接受流式細(xì)胞術(shù)分析以測定線粒體含量。如圖27A中所示，Eno1處理沒有影響線粒體含量。

還檢測了上述Eno1處理的人骨骼肌肌管中的線粒體ROS。通過用二氫若丹明123(Life Technologies)處理細(xì)胞來測定線粒體ROS，二氫若丹明123是一種不帶電的和非熒光的反應(yīng)性氧物質(zhì)(ROS)指示劑，其可以被動跨膜擴(kuò)散，在其中氧化成陽離子若丹明123(其定位于線粒體中并呈現(xiàn)出綠色熒光)。然后將肌管胰蛋白酶化、洗滌并接受流式細(xì)胞術(shù)分析。用Eno1處理人骨骼肌肌管沒有影響線粒體的反應(yīng)性氧物質(zhì)產(chǎn)生(圖27B)。

這些結(jié)果表明Eno1的作用方式不是由于線粒體含量或ROS產(chǎn)生的變化。

為了進(jìn)一步研究Eno1的作用方式，在用0、500或1000μg/ml Eno1處理的基礎(chǔ)的和血清饑餓的人骨骼肌肌管中測量了非磷酸化的5’AMP激活的蛋白激酶(AMPK)和磷酸化AMPK(pAMPK)水平。用含有2％馬血清的正常分化培養(yǎng)基處理基礎(chǔ)人骨骼肌肌管，而血清饑餓的肌管在肌管裂解前用含有0.5％BSA的無血清DMEM饑餓3小時(shí)。使用對于激酶的磷酸化或非磷酸化形式特異性的抗體通過Western印跡測定了AMPK和pAMPK水平。將對于核纖層蛋白(Lamin)A/C特異性的抗體用于證實(shí)樣品之間均勻的加載。如圖28A和28B中所示，Eno1處理沒有影響基礎(chǔ)或血清饑餓肌管中的pAMPK水平。AMPK激活或磷酸化是調(diào)節(jié)骨骼肌中的葡萄糖攝取的主要非胰島素依賴性途徑之一，例如，在肌肉收縮過程中。因此，Eno1對pAMPK水平的作用的缺乏表明超越了常規(guī)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Eno1的新作用方式。

實(shí)施例15-人骨骼肌肌管中的Eno1結(jié)合伴體

為了進(jìn)一步研究Eno1的作用方式，在未處理的人骨骼肌肌管(含有內(nèi)源性Enol)和用50μg/ml或100μg/ml 6X組氨酸標(biāo)記的外源性Enol處理的人骨骼肌肌管中比較了Eno1的結(jié)合伴體。使用Eno1特異性的抗體在未處理肌管中免疫沉淀內(nèi)源性Eno1。使用6X組氨酸標(biāo)簽抗體將外源性Eno1免疫沉淀。通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定內(nèi)源性Eno1和外源性Eno1的結(jié)合伴體，并且通過Western印跡和/或反向免疫沉淀來證實(shí)結(jié)合伴體的性質(zhì)。

煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Nampt)被鑒定為內(nèi)源性和外源性Eno1兩者的結(jié)合伴體。Nampt催化從煙酰胺合成煙酰胺單核苷酸(NMN)并且參與肌肉收縮和分泌。Eno1可以與作為糖酵解復(fù)合物的部分的Nampt相互作用，如圖29中所示。

實(shí)施例16-Eno1和Nampt的相互作用

在4天分化后，在分化培養(yǎng)基中用500ug/ml或1000μg/ml Enol處理48小時(shí)的人骨骼肌肌管中測定了Nampt活性。將肌管裂解物使用IgG或來自Cyclex(Nagano，日本)的抗Nampt抗體(Clone AF-1E12)進(jìn)行免疫沉淀。將免疫沉淀的肌管裂解物使用Cyclex Nampt活性分析試劑盒(#CY-1251)進(jìn)行Nampt活性分析。如圖30中所示，Eno1處理提高了Nampt活性。Eno1處理還提高了人骨骼肌肌管中Nampt(eNampt)的分泌(數(shù)據(jù)未顯示)。

在已經(jīng)血清饑餓3小時(shí)并隨后用來自Abcam(Cambridge，MA)的重組細(xì)胞外Nampt(eNampt)處理的人骨骼肌肌管中測量2-DG攝取。使用來自Abcam的熒光葡萄糖攝取分析試劑盒(Cat.No.ab136956)測量了2-DG攝取。如圖31中所示，eNampt的添加提高了2-DG攝取。

為了測定Nampt在Eno1誘導(dǎo)的葡萄糖攝取中的作用，如上所述用Eno1處理人骨骼肌肌管48小時(shí)，并在Eno1處理開始后24小時(shí)加入Nampt抑制劑FK866，總的FK866處理時(shí)間為24小時(shí)。使用上述Abcam葡萄糖攝取分析試劑盒，在3小時(shí)血清饑餓后測量了2-DG攝取。如圖32中所示，通過FK866的Nampt抑制消除了Eno1誘導(dǎo)的葡萄糖攝取。這個(gè)結(jié)果表明Nampt在Eno1誘導(dǎo)的葡萄糖攝取中起著作用。

等同

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