提供了使用抗CD40LdAb治療移植物排斥，特別是腎移植物排斥的方法。還提供了適合的抗CD40LdAb劑量和施用方案。另外，提供了使用抗CD40LdAb和CTLA4抗體的用于移植物排斥，特別是腎移植物排斥的聯(lián)合治療。對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的引用本申請(qǐng)要求2014年3月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/955,588的優(yōu)先權(quán)，其特此以其整體并入用于所有目的。對(duì)序列表的引用本申請(qǐng)含有序列表，其已經(jīng)以ASCII格式電子提交，并特此通過(guò)提述以其整體并入。所述ASCII拷貝，創(chuàng)建于2015年3月19日，命名為200896_522603_SL.txt且大小為30,328字節(jié)。發(fā)明背景移植是對(duì)于終末階段器官衰竭的療法，其中在美國(guó)每年進(jìn)行超過(guò)25,000例實(shí)體器官移植。從近30年前鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)抑制劑的引入起，由于急性排斥所致的早期移植物失敗的幾率已經(jīng)大大降低。然而，長(zhǎng)期移植物存活仍然不太理想。免疫和非免疫介導(dǎo)的慢性移植物損傷可以導(dǎo)致同種移植物功能的逐步喪失。慢性移植物損傷可以部分歸因于與目前免疫抑制療法，特別是鈣調(diào)磷酸酶抑制劑相關(guān)聯(lián)的非免疫副作用。近年來(lái)，已經(jīng)闡明了參與T細(xì)胞活化和功能的許多途徑，包括牽涉參與T細(xì)胞共刺激的細(xì)胞表面蛋白的途徑。致力于更特異性地抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥并且避免與目前的免疫抑制劑相關(guān)聯(lián)的副作用，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)參與T細(xì)胞活化的途徑的新的生物試劑。這些試劑之一是抗CD40L抗體。在免疫和炎癥反應(yīng)中，CD40-CD40L相互作用的作用使得它們成為用于病原性免疫-炎癥過(guò)程的治療中有希望的靶標(biāo)。通過(guò)特異性CD40L單克隆抗體(mAbs)對(duì)CD40-CD40L相互作用的阻斷在靈長(zhǎng)類(lèi)中成功地預(yù)防了同種移植物排斥，并在動(dòng)物模型中治療了自身免疫病和動(dòng)脈粥樣硬化。Montgomery等，Transplantation74:1365-1369(2002)。在人中，在臨床試驗(yàn)中已經(jīng)使用了兩種不同的抗CD40L單克隆抗體(mAb)，用于不同自身免疫病的治療。Maribelet等，Mol.Immunol.45:937-44(2008)。然而，單克隆抗體可以顯示高得不尋常的血栓栓塞(TE)并發(fā)癥，如動(dòng)脈粥樣硬化性中樞神經(jīng)系統(tǒng)事件，心肌梗塞，肺栓塞和深靜脈血栓的發(fā)生率。例如，抗CD40LmAb克隆hu5c8(抗CD40LmAb，Biogen)的有用性受限于高得不尋常的的TE并發(fā)癥的發(fā)生率。由這些抗體誘導(dǎo)的TE并發(fā)癥認(rèn)為是源自形成mAb與血小板上的膜結(jié)合CD40L，或從血小板上脫落的sCD40L的高階免疫復(fù)合物(IC)，其可以通過(guò)它們的FcgRIIa受體連接并從而聚集鄰近的血小板，導(dǎo)致血栓形成。血栓栓塞的風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)導(dǎo)致所有正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的停止。Boumpas等，Arthritis&Rheumatism48:719-727(2003)因此，本發(fā)明通過(guò)提供使用靶向靶向CD40L，但不引起例如血栓栓塞(TE)的域抗體治療移植物排斥的方法，滿(mǎn)足了本領(lǐng)域中的需要。發(fā)明概述對(duì)于臨床用途，仍然需要治療移植物排斥，特別是腎移植物排斥的方法，其不引起血栓栓塞(TE)或具有較低的血栓栓塞(TE)風(fēng)險(xiǎn)。此類(lèi)方法可以包括抗CD40L抗體拮抗物的劑量方案和施用途徑，所述抗CD40L抗體拮抗物不大可能引起血小板聚集且從而不大可能引起血栓栓塞。治療腎移植物排斥的方法可以包括向有此需要的患者施用治療有效量的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。移植物排斥可以是急性移植物排斥或慢性移植物排斥。治療腎移植物排斥的方法可以包括施用劑量從約2至約30mg/kg患者重量的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。治療腎移植物排斥的方法還可以包括施用劑量在約20至30mg/kg患者重量的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。腎移植物排斥的治療方法可以包括使用劑量約20mg/kg患者重量的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)可以與免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑一同施用。免疫抑制，免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑可以是CTLA4突變體分子。CTLA4突變體分子可以是L104EA29Y-Ig(貝拉西普(Belatacept))?？梢砸詣┝繌募s10至約20mg/kg患者重量施用L104EA29Y-Ig(貝拉西普)?；蛘?，可以以劑量為約20mg/kg患者重量施用L104EA29Y-Ig(貝拉西普)。在治療方案的持續(xù)期間，可以按周(onaweeklybasis)施用BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。在治療方案持續(xù)期間，可以按周與BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)一同施用免疫抑制，免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑。治療方案的持續(xù)時(shí)間可以為約70天。可以靜脈內(nèi)施用BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)?？梢造o脈內(nèi)施用免疫抑制，免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑?？梢詥为?dú)，或者與用于治療腎移植物排斥的常規(guī)療法組合施用BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。用于與BMS2h-572-633-CT-L2一同使用的示例性常規(guī)療法是抗IL-2R抗體，甲強(qiáng)龍(solumedrol)和嗎替麥考酚酯(mycophenolatemofetil,MMF)的組合。然后，可以隨著時(shí)間逐漸停止(taperoff)常規(guī)療法，如患者進(jìn)展所指示。免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑可以是抗CD28dAb。抗CD28dAb可以包括SEQIDNO:26，其可以任選地是PEG化的(pegylated)?？笴D28dAb的一個(gè)例子是BMS-931699(另外也稱(chēng)作1h-239-891(D70C)P30L-PEG或239-891-D70CP30LPEG)，其為PEG化的抗CD28dAb。該P(yáng)EG部分可以是40kDa支鏈聚乙二醇?？梢砸约s1mg/kg至約10mg/kg患者重量的劑量與BMS2h-572-633-CT-L2組合施用抗CD28dAb。一個(gè)示例性劑量是約3mg/kg的抗CD28dA并可以以每周間隔施用?；蛘撸梢哉J(rèn)為本文中描述的方法是BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)用于制備在有此治療需要的患者中治療腎移植物排斥的藥物的用途。BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)的用途可以應(yīng)用于上文和下文所述的任意方法和組合。附圖簡(jiǎn)述圖1A以帶(ribbon)形式描繪了域抗體，其包含融合至來(lái)自阿巴西普(Abatacept)IgG1的經(jīng)修飾的Fc尾的VH可變域BMS2h-572-633。圖1B示出了BMS2h-572-633-CT-L2的氨基酸序列(SEQIDNO:1)，包含可變域BMS2h-572-633(SEQIDNO:2)。該Fc融合蛋白是分子量77,984道爾頓的二聚體，其中每條多肽鏈由354個(gè)氨基酸組成。通過(guò)接頭將可變域融合至人IgG1的突變Fc構(gòu)建體，其中使用絲氨酸取代三個(gè)半胱氨酸殘基，并使用絲氨酸殘基取代一個(gè)脯氨酸(SEQIDNO:3)。圖2提供了N末端氨基酸序列(分別為SEQIDNO:1356-1361，連接至接頭的各種Fc域的頂部至底部。接頭區(qū)域在方框中示出。圖3示出了各種Fc形式的域抗體的例子(分別為SEQIDNOS1362-1365，按出現(xiàn)的順序)。方框指示接頭區(qū)域。圖4描繪了在25℃，12.5-0.39nMBMS-986004(2:1系列稀釋)結(jié)合至在鏈霉親合素SPR傳感器芯片上捕獲的biot-IZ-hCD40L的SPR傳感圖數(shù)據(jù)。彩色線(xiàn)示出了雙重參照(double-referenced)傳感圖數(shù)據(jù)，而黑線(xiàn)示出了對(duì)數(shù)據(jù)的1:1Langmuir擬合，其中親合力影響的表觀(guān)Kd為0.11nM。圖5示出了19μMIZ-hCD40L向2μMBMS-986004中(黑色)或18μMBMS-986004向2μMIZ-hCD40L中(藍(lán)色)滴定的ITC數(shù)據(jù)。限定每摩爾IZ-hCD40L三聚體和每摩爾二價(jià)BMS-986004Fc二聚體的摩爾比率(表觀(guān)化學(xué)計(jì)量)。在橫坐標(biāo)上以等當(dāng)點(diǎn)(equivalencepoints)獲得的摩爾比率值提示大于1摩爾的BMS-986004可以結(jié)合每摩爾IZ-hCD40L三聚體；然而，單獨(dú)從ITC數(shù)據(jù)不能確定該復(fù)合物的精確結(jié)構(gòu)模型。正方形表示結(jié)合數(shù)據(jù)的整合熱(integratedheat)，而實(shí)線(xiàn)表示“2組位點(diǎn)模型(2setsofsitesmodel)”的最佳擬合。圖6示出了小鼠CD40L替代(surrogate)dAb-Fc(KLH誘導(dǎo)的抗體反應(yīng))2組)的體內(nèi)效力。圖7證明了小鼠dAbBMS-2m-126-24-Fc和抗體MR-1抑制小鼠中TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎(4組)。圖8示出了BMS-2m-126-24-Fc和CTLA4-Ig協(xié)同作用以延長(zhǎng)心臟同種移植物的存活。圖9A示出了在猴中11mg/kgIV給藥后BMS-986004的血漿濃度對(duì)時(shí)間概況。圖9B表明了在猴子中2mg/kgIV給藥后BMS-986003的血漿濃度對(duì)時(shí)間概況。圖10呈現(xiàn)了BMS-986003(在猴中以0.2,2.0和20mg/kgSC給藥后)和5c8IgG1(在猴中以20mg/kgIV給藥后)的血漿濃度對(duì)時(shí)間概況。圖11示出了在小鼠中1mg/kgIV和SC給藥，和10mg/kgSC給藥后，BMS-2m-126-24-CT的血漿濃度對(duì)時(shí)間概況。圖12表明了BMS-986003和5c8-IgG1血漿暴露和抗KLH抗體反應(yīng)(IgG滴度)的PK/PD建模(4組)。圖13示出了BMS-986004血漿暴露的PK/PD建模(左邊)和對(duì)外周血單核細(xì)胞(PBMC)的離體RO(右邊)。圖14表明了IV.3阻斷了5c8/sCD40LIC介導(dǎo)的人血中血小板的活化。圖15示出了Fc變體對(duì)人血中血小板活化的影響。圖16證明了來(lái)自人供體的血液中用5c8-CT/sCD40LIC對(duì)血小板的活化，所述人供體對(duì)于FcgRIIa多態(tài)性基因型分型。圖17圖解了在來(lái)自人供體的血液中，通過(guò)多種抗體的血小板活化。圖18示出了在表達(dá)hFcgRIIa的轉(zhuǎn)基因小鼠中，通過(guò)多種抗體，包括BMS-986003的血小板活化的水平。圖19呈現(xiàn)了使用高劑量(20mg/kg靜脈內(nèi))的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)處理的腎移植猴的血清肌酸酐(mg/dL)曲線(xiàn)。圖20呈現(xiàn)了使用中等劑量(10mg/kg靜脈內(nèi))的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)處理的腎移植猴的血清肌酸酐(mg/dL)曲線(xiàn)。圖21呈現(xiàn)了使用低劑量(2mg/kg靜脈內(nèi))的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)處理的腎移植猴的血清肌酸酐(mg/dL)曲線(xiàn)。圖22呈現(xiàn)了使用高劑量(30mg/kg靜脈內(nèi))的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)處理的腎移植猴的血清肌酸酐(mg/dL)曲線(xiàn)。圖23呈現(xiàn)了使用高劑量(20mg/kg靜脈內(nèi))的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)處理的腎移植猴子的血清肌酸酐(mg/dL)曲線(xiàn)。圖24呈現(xiàn)了流式細(xì)胞儀圖，示出了使用20mg/kgBMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)處理的腎移植猴中，外周血中的白細(xì)胞組分(免疫表型)和與免疫活化一致的其它外周血細(xì)胞標(biāo)志物(CD3+,CD4+,CD8+T細(xì)胞)。圖25呈現(xiàn)了圖24的細(xì)胞術(shù)圖的流式組(flowpanels)。圖26示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)靜脈內(nèi)處理的腎移植獼猴(rhesusmonkey)的外周血中CD4+/CD8+未免疫T細(xì)胞組分。圖27示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)靜脈內(nèi)處理的腎移植獼猴的外周血中CD4+/CD8+記憶T細(xì)胞組分。圖28示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)靜脈內(nèi)處理的腎移植獼猴的外周血中CD4+/CD8+記憶T細(xì)胞組分。圖29示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)靜脈內(nèi)和20mg/kg的貝拉西普處理的腎移植獼猴的外周血中CD4+/CD8+未免疫的T細(xì)胞組分。圖30示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)靜脈內(nèi)和20mg/kg的貝拉西普處理的腎移植獼猴的外周血中CD4+/CD8+記憶T細(xì)胞組分。圖31示出了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)靜脈內(nèi)和20mg/kg的貝拉西普處理的腎移植獼猴的外周血中CD4+/CD8+記憶T細(xì)胞組分。圖32表明了使用20mg/kg的BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)處理的獼猴中巨細(xì)胞病毒(CMV)病毒再活化率(拷貝/mL)。發(fā)明詳述提供了使用特異性結(jié)合人CD40L的抗體多肽的治療移植物排斥的方法。抗體多肽不太可能引起血小板聚集并因此不太可能引起血栓栓塞。如本文所使用的，“特異性結(jié)合”指抗體多肽以解離常數(shù)(Kd)為約1μM或更低結(jié)合抗原，如通過(guò)例如表面等離振子共振(SPR)測(cè)量的。適合的測(cè)定系統(tǒng)包括BIAcoreTM表面等離振子共振系統(tǒng)和BIAcoreTM動(dòng)力學(xué)評(píng)估軟件(例如，版本2.1)。對(duì)于特異性結(jié)合相互作用的親和力或Kd可以是約1μM或更低，約500nM或更低，或約300nM或更低。術(shù)語(yǔ)“約”將為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解且在使用該術(shù)語(yǔ)的情形下將有一定程度的變化。一般而言，約涵蓋所提及值加上/減去10％的數(shù)值范圍。根據(jù)此詳細(xì)描述，以下縮寫(xiě)及定義適用。須注意，如本文所用，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”及“該”包括復(fù)數(shù)個(gè)提及物，除非上下文另外明確規(guī)定。因此，舉例而言，提及“抗體”包括復(fù)數(shù)個(gè)此類(lèi)抗體，且提及“該劑量”包括提及一個(gè)或多個(gè)劑量及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其等同物，等等。如本文所使用的，“BMS-986004”指代二聚體融合多肽，由抗體多肽的兩個(gè)分子構(gòu)成，所述抗體多肽具有連接到dAbBMS2h-572-633的C末端的IgG1的經(jīng)修飾的Fc片段，所述連接通過(guò)具有氨基酸序列AST的接頭序列。BMS2h-572-633dAb具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。BMS2h-572-633dAb的示例性編碼序列為SEQIDNO:27。經(jīng)修飾的Fc片段具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。見(jiàn)圖1A和1B。本文使用的BMS-986004的其它名稱(chēng)包括BMS2h-572-633-CT-L2,2h-572-633-CT-L2,BMS2h-572-633-CT-長(zhǎng),和2h-572-633-CT-長(zhǎng)。應(yīng)當(dāng)理解本文列出的范圍之間的任何或全部整個(gè)或部分整數(shù)包括在本文中。1.CD40L及CD40L活性提供結(jié)合人類(lèi)CD40L的抗體多肽。CD40L也稱(chēng)為CD154、gp39、TNF相關(guān)活化蛋白(TRAP)、5c8抗原或T-BAM?？梢栽诶鏤niProt登錄號(hào)P29965下發(fā)現(xiàn)人類(lèi)CD40L的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息?！叭祟?lèi)CD40L”是指包含以下氨基酸序列的CD40L：(SEQIDNO:3)CD40L也已在野豬(Susscrofa)、小家鼠(Musmusculus)、家犬(Canisfamiliaris)、Bosffini、獼猴(Macacamulatta)、夜猴(Aotustivirgatus)、普通狨(Callithrixjacchus)、白領(lǐng)灰須白眉猴(Cercocebustorquatusatys)、豚尾猴(Macacanemestrina)、挪威鼠(Rattusnorvegicus)、原雞(Gallusgallus)、家貓(Feliscatus)及野豬(Susscrofa)中測(cè)序。本發(fā)明的抗體多肽與CD40L的結(jié)合拮抗CD40L活性。“CD40L活性”包括(但不限于)與APC上的MHC分子對(duì)T細(xì)胞受體的刺激聯(lián)合共刺激及活化APC、在細(xì)胞因子存在下分泌所有免疫球蛋白同種型、刺激B細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子產(chǎn)生、抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換及親和力成熟。舉例而言，具有X連鎖高IgM綜合征(X-linkedhyper-IgMsyndrome)的患者在其B細(xì)胞上表達(dá)功能性CD40，但其活化的T細(xì)胞具有缺陷的CD40L蛋白，導(dǎo)致其不能活化B細(xì)胞且誘導(dǎo)免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換。Aruffo等人，Cell72:291-300(1993)。CD40L活性可通過(guò)與其它分子相互作用而介導(dǎo)?！癈D40活性”包括CD40L與以下分子之間的功能性相互作用：CD40(CD40L受體)、α5β1整合蛋白及αIIbβ3。舉例而言，CD40L結(jié)合其受體CD40，CD40在多種APC(諸如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞)上以及在基質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血小板上表達(dá)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“活化”是指給定的可測(cè)量的CD40L活性相對(duì)于參照物增加至少10％，例如至少10％、25％、50％、75％或甚至100％或更多。若活性相對(duì)于拮抗劑的缺乏降低至少10％，且在一個(gè)例示性實(shí)施例中降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％或甚至100％(也即檢測(cè)不到活性)，則CD40L活性被“拮抗”。例如，抗體多肽可拮抗一些或全部CD40L活性。抗體多肽可以不活化B細(xì)胞增殖?？贵w多肽可以不活化T細(xì)胞或樹(shù)突細(xì)胞(DC)的細(xì)胞因子分泌，其中細(xì)胞因子為選自下組的至少一種細(xì)胞因子：IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ。2.抗體多肽抗體多肽包含可變域?？贵w多肽可以是含有單個(gè)可變域的dAb形式。抗體多肽可以是包含由雙硫鍵互相連接的兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的全長(zhǎng)抗CD40L免疫球蛋白分子。各鏈的氨基末端部分包括約100-120個(gè)氨基酸的可變域(VL或VH)。其中所含的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別，盡管框架殘基可在表位結(jié)合中起作用。每條重鏈的羧基末端“半部(half)”確定主要負(fù)責(zé)效應(yīng)器功能的恒定區(qū)(Fc)?！坝蚩贵w”(dAb)包含能夠特異性并單價(jià)地結(jié)合抗原，如CD40L的單個(gè)可變(VL或VH)域。例如，dAb可以具有駱駝科動(dòng)物(camelid)dAb所特有的VHH結(jié)構(gòu)。如本文所用的“VH域”表示包括VHH結(jié)構(gòu)。VH域(包括如本文實(shí)施方案所呈現(xiàn)的全部特征及特征組合)不同于VHH域。dAb可在溶液中形成均二聚體或異二聚體。盡管不受任何特定理論限制，但據(jù)信本文所揭示的dAb不引起血小板凝集，因?yàn)楹型蛔冃虵c構(gòu)建體的抗體不結(jié)合血小板表面上的FcγRIIa(也稱(chēng)為CD32a)且不活化血小板。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“可變域”是指由Kabat等人，SequencesofImmunologicalInterest,第5版，美國(guó)健康與人類(lèi)服務(wù)部，Washington,D.C.(1991)所定義的免疫球蛋白可變域?？勺冇騼?nèi)CDR氨基酸殘基的編號(hào)及定位是依照熟知的Kabat編號(hào)慣例?？贵w多肽也可以是包含全長(zhǎng)抗CD40L免疫球蛋白分子中包含特異性結(jié)合CD40L的可變域的一部分的“片段”。因此，術(shù)語(yǔ)“抗體多肽”包括例如抗原結(jié)合重鏈、輕鏈、重鏈-輕鏈二聚體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、單鏈Fv(scFv)及dAb。因此術(shù)語(yǔ)“抗體多肽”包括通過(guò)重組工程化及表達(dá)所制造的多肽，以及通過(guò)天然重組及雜交瘤細(xì)胞克隆分泌所產(chǎn)生的單克隆抗體。如本領(lǐng)域中已知，輕鏈分類(lèi)為卡帕(κ)或拉姆達(dá)(λ)，且由特定恒定區(qū)CL表征。重鏈分類(lèi)為γ、μ、α、δ或ε，且定義抗體的同種型分別為IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。對(duì)于IgG、IgD及IgA，重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2及CH3)；且對(duì)于IgM及IgE，包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、CH3及CH4)?？笴D40L抗體可具有選自任一免疫球蛋白類(lèi)別(IgA、IgD、IgG、IgM及IgE)的重鏈恒定區(qū)。每個(gè)輕鏈可變域(VL)及重鏈可變域(VH)由三個(gè)CDR及四個(gè)框架區(qū)(FR)構(gòu)成，自氨基末端至羧基末端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。輕鏈的三個(gè)CDR稱(chēng)為“LCDR1、LCDR2及LCDR3”，且重鏈的三個(gè)CDR稱(chēng)為“HCDR1、HCDR2及HCDR3”。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“Fc域”是指包含CH2及CH3恒定域的恒定區(qū)抗體序列，如根據(jù)Kabat等人，SequencesofImmunologicalInterest,第5版，美國(guó)健康與人類(lèi)服務(wù)部(U.S.Dept.Health&HumanServices),Washington,D.C.(1991)所界定。Fc區(qū)可以衍生自人IgG。例如，F(xiàn)c域可以衍生自人IgG1或人IgG4Fc區(qū)。示例性的經(jīng)修飾的人IgG1Fc域?yàn)椋篍PKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:3)。SEQIDNO:3衍生于人IgG1Fc，并在位置5，11和14包括Ser代替Cys，和位置23包含Ser代替Pro。制得該半胱氨酸-至-絲氨酸點(diǎn)突變以消除Fc鉸鏈中的二硫鍵。另一種示例性Fc區(qū)是SEQIDNO:5，其衍生于人IgG4Fc，具有以下氨基酸序列：ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:5)。SEQIDNO:5衍生于人IgG4Fc并包含位置10的修飾以包含Pro。可變域可以融合至Fc域。當(dāng)可變域融合至Fc域時(shí)，可變域的羧基末端(VL或VH域，包括dAb)可連接或融合至FcCH2域的氨基末端?；蛘撸勺冇虻聂然┒丝蛇B接或融合至CH1域的氨基末端，其自身融合至FcCH2域。蛋白質(zhì)可整體或部分包含CH1與CH2域之間的鉸鏈區(qū)。各種Fc形式的域抗體及其效能的例子提供在表4中。圖2提供連接至接頭區(qū)的本文所提供的各種Fc域的N-末端序列。接頭區(qū)顯示在方框中。如表2中所用，“Fc”指示dAb融合至人類(lèi)IgG1短Fc?！癈T長(zhǎng)Fc”也稱(chēng)為CT-L2，CT長(zhǎng)，和CT，具有氨基酸序列SEQIDNo:3?！癈T短”也稱(chēng)為CT-S1，與CT長(zhǎng)相比在N-末端短7個(gè)氨基酸?！癗297Q長(zhǎng)Fc”也稱(chēng)為N297Q-L4，是具有為除去Fc中的N-連接碳水化合物所進(jìn)行的N297Q突變的人類(lèi)IgG1的Fc域?！癗297Q短Fc”也稱(chēng)為N297Q-S3，在N-末端比N297Q長(zhǎng)Fc短7個(gè)氨基酸，且為具有為除去Fc域中的N-連接碳水化合物所進(jìn)行的N297Q點(diǎn)突變的人類(lèi)IgG1?！癈T-FcSP5”為CT長(zhǎng)Fc，其中SP5是指用于從哺乳動(dòng)物表達(dá)宿主分泌的octeonectin信號(hào)肽。切割位點(diǎn)由“^”表示。圖3進(jìn)一步提供各種Fc域形式的例子。融合抗體多肽的抗體多肽可以通過(guò)“氨基酸接頭”或“接頭”連接。例如，dAb可以融合至氨基酸接頭的N-末端，而Fc域可以融合至接頭的C-末端。盡管氨基酸接頭可以是任意長(zhǎng)度并由氨基酸的任意組合組成，接頭的長(zhǎng)度可以是相對(duì)短的(例如，五個(gè)以下的氨基酸)以降低連接的域之間的相互作用。也可以調(diào)整接頭的氨基酸組成以降低具有大體積的側(cè)鏈的氨基酸或可能引入二級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸的數(shù)量。適合的氨基酸接頭包括但不限于，長(zhǎng)度多達(dá)3,4,5,6,7,10,15,20,或25個(gè)氨基酸的那些。代表性氨基酸接頭序列包括GGGGS(SEQIDNO:6)，以及包括GGGGS的2,3,4,或5個(gè)拷貝的接頭(分別為SEQIDNOs:7-10)。下表為用于本公開(kāi)中的適合的接頭序列。包含BMS2h-572-633(SEQIDNO:2)的氨基酸序列的第一可變域融合至人Fc域。見(jiàn)圖1A和1B?？梢詮纳媳碇械娜我饨宇^列表選擇接頭。例如，接頭可以包含或是AS(SEQIDNO:11)。另外，使用抗體多肽的方法可以包含可變域，其中可變域的氨基酸序列包含BMS2h-572-633(SEQIDNO:2)，包含AST(SEQIDNO:12)的接頭，和選自SEQIDNO:3的人Fc域。另一種公開(kāi)的方法，抗體多肽包含可變域，其中可變域的氨基酸序列包含BMS2h-572-633(SEQIDNO:2)，包含AS(SEQIDNO:11)的接頭，和包含SEQIDNO:5的氨基酸序列的人Fc域。術(shù)語(yǔ)“人類(lèi)”當(dāng)應(yīng)用于抗體多肽時(shí)，表示抗體多肽具有源自人類(lèi)免疫球蛋白的序列，例如框架區(qū)及/或CH域。當(dāng)序列：(a)自人類(lèi)個(gè)體或自人類(lèi)個(gè)體的細(xì)胞或細(xì)胞株分離而得；(b)自經(jīng)克隆的人類(lèi)抗體基因序列文庫(kù)或人類(lèi)抗體可變域序列文庫(kù)分離而得；或(c)通過(guò)自一種或多種以上多肽突變和選擇而多樣化時(shí)，該序列是“源自”人類(lèi)免疫球蛋白編碼序列。如本文所用的“分離的”化合物表示該化合物是從在自然界中與該化合物天然相關(guān)的至少一種組分中移出。可將抗體多肽施用至人類(lèi)患者，同時(shí)在很大程度上避免通常通過(guò)施用來(lái)自其它物種(例如小鼠)的抗體所引起的抗抗體免疫反應(yīng)。例如，根據(jù)本領(lǐng)域中公知的程序，可通過(guò)將鼠類(lèi)CDR移植至人類(lèi)可變域FR上來(lái)使鼠類(lèi)抗體“人源化”。然而，可在不需要基因操作鼠類(lèi)抗體序列的情況下產(chǎn)生如本文所公開(kāi)的人類(lèi)抗體?？勺冇蚩梢园哂信c由人類(lèi)種系抗體基因區(qū)段編碼的相應(yīng)框架區(qū)相同的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)FR。例如，域抗體可包含VH種系基因區(qū)段DP47、DP45或DP38，Vκ種系基因區(qū)段DPK9，JH區(qū)段JH4b，或Jκ區(qū)段Jκ1?？筛淖兛贵w多肽序列，同時(shí)保留特異性結(jié)合CD40L的能力。特別地，抗體多肽(例如dAb)可以包含保留與dAbBMS2h-572-633一樣的特異性結(jié)合CD40L的功能的變體可變域。變體可變域可以與BMS2h-572-633競(jìng)爭(zhēng)對(duì)CD40L的特異性結(jié)合?？贵w多肽可以通過(guò)PEG化格式化(formatted)以增加其體內(nèi)半衰期。PEG為共價(jià)連接的?；蛘?，PEG在半胱氨酸或賴(lài)氨酸殘基處連接至抗體多肽。PEG連接的抗體多肽可以具有至少24kD的水動(dòng)力大小(hydrodynamicsize)。一般來(lái)說(shuō)，總PEG大小為從20至60kD，包括端點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，PEG連接的域抗體具有至少200kD的水動(dòng)力大小。可以使用幾種PEG附著部分實(shí)現(xiàn)PEG化，包括(但不限于)N-羥基琥珀酰亞胺活性酯、丙酸琥珀酰亞胺酯、馬來(lái)酰亞胺、乙烯砜或硫醇。PEG聚合物可連接至抗體多肽的預(yù)定位置，或可隨機(jī)地連接至域抗體分子。PEG化也可經(jīng)由附著至域抗體的肽接頭來(lái)介導(dǎo)。也就是說(shuō)，PEG部分可連接至融合至抗體多肽的肽接頭，其中該接頭提供用于PEG附著的位點(diǎn)(例如游離的半胱氨酸或賴(lài)氨酸)。使抗體PEG化的方法在本領(lǐng)域中試是已知的，例如由Chapman等人,“PEGylatedantibodiesandantibodyfragmentsforimprovedtherapy:areview”,Adv.DrugDeliv.Rev.54(4):531-45(2002)中公開(kāi)。3.藥物組合物及治療方法方法包括向患者施用抗體多肽?？贵w多肽可以配制為藥物組合物。藥物組合物包含治療有效量的一種或多種抗體多肽和任選地藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體包括例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類(lèi)似物以及其組合。藥學(xué)上可接受的載體可進(jìn)一步包含少量可延長(zhǎng)融合蛋白的貨架期或有效性的輔助物質(zhì)，諸如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。組合物可以經(jīng)配制以使活性成分在投藥之后快速、持續(xù)或延遲釋放。合適的藥物組合物及其制備方法是本領(lǐng)域中所熟知的。參見(jiàn)例如Remington,THESCIENCEANDPRACTICEOFPHARMACY,A.Gennaro等人編，第21版，MackPublishing公司(2005)。藥物組合物進(jìn)一步可包含免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑。治療需要此類(lèi)治療的患者中的移植物排斥的方法可以包括向該患者施用治療有效量的藥物組合物。移植物可以是腎移植物。拮抗CD40L介導(dǎo)的T細(xì)胞活化可抑制移植物排斥期間不想要的T細(xì)胞反應(yīng)。抑制CD40L介導(dǎo)的T細(xì)胞活化可減緩移植物排斥的進(jìn)展和/或嚴(yán)重程度。如本文所用，“患者”表示動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)。患者可經(jīng)診斷患有免疫疾病。“治療”是指涉及減輕癥狀、病癥、狀況或疾病的進(jìn)展或嚴(yán)重程度的過(guò)程。藥物組合物可單獨(dú)施用或以與免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑的療法組合(即同時(shí)，序貫或與共同配制)施用。不同免疫疾病可以需要使用可用于治療免疫疾病的特定輔助化合物，其可以基于不同患者來(lái)確定。例如，公開(kāi)的藥物組合物可與細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA4)突變分子，如L104EA29Y-Ig(貝拉西普)伴隨(同時(shí)或與其共同配制)或序貫共施用。CTLA4以比CD28高的親合力結(jié)合至CD80(B7-1)及CD86(B7-2)，且其在活化之后的T細(xì)胞上短暫表達(dá)，其中CTLA4中斷CD28與CD80/86之間的相互作用。Oosterwegel等人，Curr.Opin.Immunol.11:294-300(1999)。這創(chuàng)建T細(xì)胞活化的負(fù)反饋信號(hào)。相比于野生型CTLA4，CTLA4突變分子，包括L104EA29Y-Ig，具有對(duì)CD80/86的增強(qiáng)的結(jié)合親合力。已成功實(shí)行了通過(guò)L104EA29Y-Ig對(duì)CD28-CD80/86途徑的干預(yù)，單獨(dú)或與其它免疫抑制劑組合，例如以治療非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物移植物模型中的移植物相關(guān)疾病。Larsen等人，Amer.J.Transplant.5:443(2005)。美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?010/0166774描述了L104EA29Y-Ig的結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生L104EA29Y-Ig的方法，和包含CTLA4分子的配制劑；且該申請(qǐng)案以引用的方式并入本文。美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,094,874和7,482,327進(jìn)一步公開(kāi)L104EA29Y-Ig的施用(包括與一種或多種其它藥物共施用)及劑量日程表，且這些專(zhuān)利的公開(kāi)內(nèi)容以引用的方式并入本文中?？墒褂萌魏芜m當(dāng)方法或途徑來(lái)施用抗體多肽或藥物組合物。施用途徑包括例如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)施用。施用的抗體多肽的治療有效劑量取決于許多因素，包括例如所治療的免疫疾病的類(lèi)型及嚴(yán)重程度、組合療法的使用、抗體多肽或藥物組合物的施用途徑，和患者的體重。域抗體的治療有效量的非限制性范圍為約0.1mg/kg至約30mg/kg，或約2mg/kg至約30mg/kg，或約20mg/kg至約30mg/kg，相對(duì)于患者的體重。域抗體的治療有效量可以是約20mg/kg。BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)的治療有效量可以是約0.1mg/kg至約30mg/kg，或約2mg/kg至約30mg/kg，或約20mg/kg至約30mg/kg，或約20mg/kg。治療有效量可以靜脈內(nèi)施用。在治療方案的持續(xù)時(shí)間，可以按周施用治療有效量。治療方案的持續(xù)時(shí)間可以變化。持續(xù)時(shí)間可以長(zhǎng)約70天。域抗體可與免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑，例如CTLA4突變分子(例如貝拉西普)一同施用(同時(shí)，序貫或與其共同配制)。免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)和/或抗炎劑可以以約20mg/kg施用。代表性模型描述于下文及實(shí)施例中。腎移植患者在他們的治療過(guò)程期間可以施用幾種免疫抑制劑的一種或多種。這些可以包括糖皮質(zhì)激素。免疫抑制劑還可以包括小分子藥物包括免疫親和素(immunophilin)結(jié)合藥物(例如，鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如親環(huán)素結(jié)合藥物包括環(huán)孢素和ISA(TX)247；FKBP12結(jié)合藥物例如他克莫司(tacrolimus)和緩釋(modified-release)他克莫司；和雷帕霉素靶標(biāo)抑制劑(target-of-rapamycininhibitor)，如西羅莫司(sirolimus)和依維莫司(everolimus))，核苷酸合成抑制劑(例如嘌呤合成抑制劑(IMPDH)例如嗎替麥考酚酯(mycophenolatemofetil)，腸溶包被的霉酚酸(enteric-coatedmycophenolicacid)，和咪唑立賓(mizoribine)；嘧啶合成抑制劑(DHODH)例如Lefunomide和FK778)，抗代謝物(例如咪唑硫嘌呤)和鞘氨醇-1-磷酸受體拮抗劑(例如FTY720)。免疫抑制劑還可以包括蛋白藥物例如耗竭性抗體(例如，針對(duì)T細(xì)胞，B細(xì)胞，或兩者，并可以包括馬或兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白，小鼠單克隆抗CD3抗體例如muromonab-CD3，人源化的單克隆抗CD52抗體(alemtuzaumab)，B細(xì)胞耗竭單克隆抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗(rituximab))，和靜脈內(nèi)免疫球蛋白。對(duì)于這些藥物的綜述參見(jiàn)Halloran,“ImmunosuppressiveDrugsforKidneyTransplantation,”NewEngl.J.Med.351:27152729(2004)。考慮的是單一療法中范圍從2mg/kg至30mg/kg的單獨(dú)BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)的組合?；蛘?，可以在組合療法中與CTLA4突變分子例如L104EA29Y-Ig(貝拉西普)一同施用BMS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)。在組合療法中，可以以約10mg/kg,15mg/kg,20mg/kg,25mg/kg,或30mg/kg的量(或其間的任意整數(shù)量)施用貝拉西普?；蛘撸珺MS2h-572-633-CT-L2(SEQIDNO:1)可以與抗CD28Dab組合施用。優(yōu)選的抗CD28dAB是BMS-931699，其包含可變域BMS1h-239-891(D70C)(SEQIDNO:26)并為PEG化的。BMS1h-239-891(D70C)描述于例如題為“CompositionsMonovalentforCD28BindingandMethodsofUse”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,168,759中。可以以從1mg/kg至約10mg/kg的量施用抗CD28dAB，例如約3mg/kg。4.同種移植物排斥體內(nèi)模型可以在幾種可用的體外或體內(nèi)模型系統(tǒng)的一種中測(cè)試本公開(kāi)的抗體多肽拮抗CD40L的能力。下文描述了適合的人，動(dòng)物，和細(xì)胞模型系統(tǒng)。進(jìn)一步的細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)描述于實(shí)施例中。對(duì)于預(yù)防實(shí)體器官移植(SOT)的排斥，靶向CD40-CD40L途徑長(zhǎng)期以來(lái)備受關(guān)注，特別是鑒于來(lái)自大量發(fā)表的非人靈長(zhǎng)類(lèi)中移植研究的有希望的數(shù)據(jù)。已經(jīng)證明了離體的活化CD4+T淋巴細(xì)胞上降低的CD40L表達(dá)與極好的腎同種移植物功能相關(guān)。Lederer等人,Int.Arch.AllergyImmunol.133:276-284(2004)。此外，幾項(xiàng)研究已經(jīng)證明了抗CD40LmAb可以既預(yù)防又逆轉(zhuǎn)靈長(zhǎng)類(lèi)中的急性同種移植物排斥。例如，Kirk等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:8789-8794(1997)報(bào)道了在使用腎移植物移植的獼猴中，抗CD40LmAb5C8單獨(dú)或與CTLA4-Ig組合顯著延長(zhǎng)了無(wú)排斥存活(rejection-freesurvival)。CD40L特異性mAbhu5c8單獨(dú)也允許獼猴中的同種異體胰島移植和長(zhǎng)期胰島素依賴(lài)性，所述獼猴移植了足夠數(shù)量的可活胰島。Kenyon等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8132-8137(1999)。Preston等人,Amer.J.Transplantation5:1032-1041(2005)在MHC(主要組織相容性復(fù)合物)錯(cuò)配的獼猴中進(jìn)行了腎移植，并使用CD40L特異性mAbIDEC-131和/或雷帕霉素(sirolimus)，和/或移植前供體特異性輸血的組合治療受體。IDEC-131在靈長(zhǎng)類(lèi)中的腎同種異體抑制排斥的預(yù)防中高度有效。在經(jīng)歷腎異體移植的食蟹猴中，使用抗CD40LmAbABI793有效地預(yù)防了移植物排斥。Schuler等人，Transplantation77:717-726(2004)。除預(yù)防異體移植物排斥外，CD40L特異性mAb在靈長(zhǎng)類(lèi)移植模型中誘導(dǎo)供體特異性耐受。Preston等人，Amer.J.Transplantation5:1032-1041(2005)；Kenyon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8132-8137(1999)。在肝或小腸移植后經(jīng)歷急性移植物排斥的兒童人類(lèi)患者中，觀(guān)察到CD8+T細(xì)胞上CD40L的表達(dá)和移植物排斥風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性。Ashokkumar等人，Amer.J.Transplantation9:179-191(2009)和Ashokkumar等人，Surgery146:166-173(2009)。相似地，在肝或腎移植后經(jīng)歷同種移植物排斥的成年患者中，組織學(xué)分析揭示了CD40L表達(dá)和急性或慢性排斥之間的關(guān)聯(lián)。Bartlett等人，Amer.J.Transplantation3:1363-1368(2003)和Biancone等人，Nephrol.Diall.Translpant.13:716-722(1998)。幾項(xiàng)研究支持靶向CD40L超過(guò)CD40以實(shí)現(xiàn)移植中更好的效力。例如，相比于CD40，當(dāng)選擇性阻斷CD40L時(shí)，移植物存活更長(zhǎng)且更持久。Gilson等人，J.Immunol.183:1625-35(2009)。此外，最近的數(shù)據(jù)提示CD40L阻斷可以提高對(duì)Treg和/或抑制細(xì)胞的誘導(dǎo)以促進(jìn)移植物存活。Garcia等人，J.Clin.Inv.120:2486-96(2010)。另外，CD40L，而不是CD40的阻斷，已經(jīng)證明誘導(dǎo)長(zhǎng)期的免疫耐受，導(dǎo)致無(wú)限期的移植物存活，特別是當(dāng)與B7途徑的阻斷組合時(shí)。Kenyon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8132-8137(1999)；Kawai等人，Amer.J.Transplantation4:1391-1398(2004)；Preston等人，Amer.J.Transplantation5:1032-1041(2005)；Adams等人，J.Immunol.174:542-50(2005)。阻斷CD40-40L和B7-CD28途徑在提高移植物存活中的協(xié)同性是特別重要的，因?yàn)槠涮岢隽四壳肮_(kāi)的域抗體作為與貝拉西普(L104EA29Y-Ig)組合的自然選擇用于實(shí)體器官移植物(SOT)。示例性氨基酸序列對(duì)于抗體多肽有用的代表性抗人CD40LVH域氨基酸序列公開(kāi)于美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/955,588中的表1中。編碼表1的VH域序列的代表性核酸列在美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/955,588的表2中。如本領(lǐng)域中公知的，多種密碼子可以編碼相同的氨基酸。因此，編碼蛋白序列的核酸包括具有密碼子簡(jiǎn)并性的核酸。美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/955,588中公開(kāi)的抗體多肽特異性結(jié)合CD40L。使用反復(fù)起始/初步篩選(reiterativeinitial/primaryscreening)制成它們，如共同轉(zhuǎn)讓的2014年11月15日公告的題為“ANTIBODYPOLYPEPTIDESTHATANTAGONIZECD40L”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,895,010中詳細(xì)描述的。實(shí)施例實(shí)施例1克隆BMS2h-572的dAb選擇針對(duì)由Bristol-MyersSquibb提供的生物素化的(1.42摩爾生物素/摩爾三聚體)人異亮氨酸拉鏈-CD40L(IZ-hCD40L)，使用降低濃度的抗原(第1輪300nM；第2輪30nM；第3輪3nM)平行進(jìn)行三輪選擇。在啟動(dòng)選擇之前，將來(lái)自未處理4G和6GDomantisdAb文庫(kù)的噬菌體合并到如下所示的合并物a)至h)中:a)長(zhǎng)度在7-9個(gè)氨基酸之間的4GVHCDR3b)長(zhǎng)度在10-12個(gè)氨基酸之間的4GVHCDR3c)長(zhǎng)度在13-15個(gè)氨基酸之間的4GVHCDR3d)4GVKe)長(zhǎng)度在7-9個(gè)氨基酸之間的6GVHCDR3f)長(zhǎng)度在10-12個(gè)氨基酸之間的6GVHCDR3g)長(zhǎng)度在13-15個(gè)氨基酸之間的6GVHCDR3h)6GVK每輪選擇涉及向1000μl的2％MPBS(含有2％(w/v)Marvel的磷酸鹽緩沖鹽水[PremierFoods,UK])中的噬菌體的混合物(來(lái)自上文所示的未處理的文庫(kù)合并物的一個(gè)，或后續(xù)選擇輸出噬菌體)添加期望濃度的生物素化的CD40L，并通過(guò)翻滾式(end-over-end)混合在室溫孵育1小時(shí)。接著，通過(guò)添加100μl重懸的M-280鏈霉親合素[Invitrogen,UK](第1和3輪)或50μl已經(jīng)偶聯(lián)了NeutrAvidin[ThermoFisherScientific,UK]的M-280甲苯磺?；罨?Invitrogen)(第2輪)捕獲生物素化的抗原噬菌體復(fù)合物，并在室溫使用翻滾式混合孵育5分鐘。接著，使用KingFisher磁力分離器[ThermoFisherScientific,UK]回收并使用1mLPBST(含有0.1％(v/v)聚氧乙烯山梨醇單月桂酸20[Sigma-Aldrich,UK]的PBS)洗滌7次，接著1mLPBS(磷酸鹽緩沖鹽水)清洗1次。通過(guò)使用500μl胰蛋白酶-PBS(50μl溶解于添加至450μLPBS的50mMTris-HClpH7.4,1mMCaCl2的10mg/ml胰蛋白酶)孵育，洗脫保留在經(jīng)洗滌的上的結(jié)合噬菌體。將含有噬菌體的溶液回收并將250μL用于在37℃感染1.75mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大腸桿菌TG1(OD600為約0.4)30分鐘。以11,600xg在微型離心機(jī)中離心大腸桿菌TG1噬菌體感染的培養(yǎng)物1分鐘，并將所得的細(xì)胞團(tuán)塊重懸于1mL2XTY(1升中的16g蛋白胨，10g酵母提取物和5gNaCl，在121℃高壓滅菌處理15分鐘)中并鋪板到含有使用15μg/ml四環(huán)素補(bǔ)充的TYE培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)皿上。將平板在37℃孵育過(guò)夜，接著向每個(gè)平板添加2ml使用15％甘油補(bǔ)充的2XTY，使用玻璃涂布器松散細(xì)胞，并充分混合。將五十微升刮下的細(xì)菌用于接種50ml使用15μg/mL四環(huán)素補(bǔ)充的2XTY，并在37℃以250rpm搖動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜的培養(yǎng)物在3,300g離心15分鐘以沉淀細(xì)菌。為了沉淀噬菌體，將10mlPEG/NaCl(20％聚乙二醇8000,2.5MNaCl)添加至40ml上清?；旌鲜删w/PEG溶液并放置在冰上1h，接著在4℃以3,300g離心30分鐘并棄去上清。將團(tuán)塊重懸于2mlPBS并在微型離心機(jī)中以11,600xg離心10分鐘以去除剩余的細(xì)菌碎片。然后所得的含有噬菌體的上清用于針對(duì)適當(dāng)濃度的生物素化IZ-hCD40L的下一輪選擇。噬菌體ELISA：在第2和3輪選擇后，進(jìn)行了單克隆噬菌體ELISA。使用250μlPBST的3次洗滌，接著250μlPBS的3次洗滌進(jìn)行所有洗滌。使用50μl/孔溶解于PBS的1μg/mlIZ-hCD40L在4℃包被平板過(guò)夜。洗滌平板并接著使用2％MPBS(修改的磷酸鹽緩沖鹽水)在室溫封閉1小時(shí)。洗滌平板并添加25μl/孔噬菌體上清至2％MPBS的相等體積，并在室溫孵育1小時(shí)。洗滌平板，并使用50μl/孔1:5000稀釋于2％MPBS的抗M13-HRP(辣根過(guò)氧化物酶)綴合物[GEHealthcare,UK]檢測(cè)結(jié)合的噬菌體并在室溫孵育1小時(shí)。洗滌平板，并使用50μl/孔SureBlue1-ComponentTMB微孔過(guò)氧化物酶溶液[KPLInc,USA]對(duì)ELISA顯色。通過(guò)添加等體積的1MHCl終止比色反應(yīng)，且ELISA平板在450nm讀數(shù)。通過(guò)與沒(méi)有包被抗原但其它方面相同處理的孔比對(duì)，鑒定特異性噬菌體。從pDOM4質(zhì)?；厥誨Ab基因通過(guò)對(duì)噬菌體載體pDOM4進(jìn)行SalI和NotI限制性酶消化回收來(lái)自2和3輪輸出的dAbV-基因，并且連接到SalI和NotI雙重消化的pDOM5表達(dá)載體中?？扇苄詃AbELISA如下鑒定結(jié)合dAb。從每個(gè)輸出挑取96個(gè)含有克隆到可溶性dAb表達(dá)載體pDOM5中的dAbV-基因的個(gè)別克隆到200μl含有OnEx自誘導(dǎo)培養(yǎng)基[Novagen,UK]的TerrificBroth(TB)中并在使用透氣性粘結(jié)塑料條密封的Costar96WellCellCultureClusters[CorningIncorporated,USA]中使用250rpm搖動(dòng)在37℃孵育過(guò)夜。離心培養(yǎng)物以沉淀細(xì)胞，且上清通過(guò)抗原結(jié)合ELISA測(cè)定結(jié)合至IZ-hCD40L的dAb。MaxiSorp96孔免疫板[Nunc,USA]使用50μl/孔溶于PBS的1μg/mlIZ-hCD40L在4℃包被過(guò)夜。所有的洗滌如對(duì)于噬菌體ELISA所描述的。使用200μl含有1％Tween20的PBS在室溫封閉平板1小時(shí)。洗滌ELISA板并通過(guò)在4℃以1,800xg離心10分鐘使含有dAb的培養(yǎng)上清澄清，接著添加到ELISA板(30μL/孔)，向其添加等體積的PBST。平板在室溫孵育1小時(shí)，然后洗滌。通過(guò)添加50μl/孔1:2000稀釋于PBST的9E10[抗-mycIgG,Sigma-Aldrich,UK]檢測(cè)結(jié)合的dAb，并在室溫孵育1小時(shí)；接著洗滌ELISA板并添加50μl/孔1:2000稀釋于PBST的抗小鼠Fc-HRP[Sigma-Aldrich,UK]并在室溫孵育1小時(shí)。洗滌平板并使用50μl/孔SureBlue1-ComponentTMB微孔過(guò)氧化物酶溶液[KPLInc,USA]顯現(xiàn)ELISA，并且允許顯現(xiàn)顏色。通過(guò)添加等體積的1MHCl終止比色反應(yīng)，且ELISA平板在450nm讀數(shù)。通過(guò)將來(lái)自IZ-hCD40L孔的信號(hào)強(qiáng)度與不含有抗原的對(duì)照孔比較，鑒定結(jié)合抗原的dAb。實(shí)施例2克隆BMS2h-572-6的鑒定使BMS2h-572dAb經(jīng)過(guò)易錯(cuò)親和力成熟(error-proneaffinitymaturation)以生成BMS2h-572譜系。這使用隨機(jī)誘變進(jìn)行，其中每dAb引入平均3.6個(gè)氨基酸改變。使用生物素化的單體和三聚人CD40L選擇噬菌體文庫(kù)(平均大小6x108)，其中交替鏈霉親合素/neutravidin珠捕獲抗原(如所述)。進(jìn)行了使用降低濃度的抗原(第1輪以100nM；第2輪以10nM；第3輪以1nM)的三輪選擇。使用測(cè)序來(lái)監(jiān)控每輪選擇后的多樣性。將選擇輸出(對(duì)于BMS2h-572在CD40L三聚體上選擇的第2輪)亞克隆到可溶性表達(dá)載體pDOM13中(無(wú)C末端標(biāo)簽)(如所述)并作為單克隆細(xì)菌微量培養(yǎng)物上清，在單體和三聚體CD40L兩者上通過(guò)BIAcore篩選與親本克隆相比篩選改進(jìn)的解離率。DNA測(cè)序經(jīng)鑒定改進(jìn)的變體，并表達(dá)，純化獨(dú)特的dAb，然后使用BMS2h珠RBA以及細(xì)胞CD40L驅(qū)動(dòng)測(cè)定法(如所述)測(cè)定。這些dAb的活性列于以下表1中。格式化BMS2h-572-6為Fc融合將BMS2h-572-6dAb克隆到含有源自人IgG1的Fc尾的pDOM38載體中以創(chuàng)建DMS0502。也將BMS2h-572-6dAb克隆到含有源自人IgG4的Fc尾的pDOM38載體中以創(chuàng)建DMS0505。將構(gòu)建體在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)并使用蛋白A純化蛋白。通過(guò)Biacore在對(duì)單體和三聚CD40L的結(jié)合方面以及在多個(gè)細(xì)胞測(cè)定(如所述)中分析純化的Fc融合?？寺MS2h-572-608,BMS2h-572-614和BMS2h-572-619的鑒定BMS2h-572-6dAb使用摻雜的寡聚物方法(dopedoligoapproach)經(jīng)過(guò)親和力成熟。對(duì)于該dAb構(gòu)建了四個(gè)摻雜的文庫(kù)：文庫(kù)1–CDR1中的5個(gè)殘基多樣化文庫(kù)2–CDR2中的6個(gè)殘基多樣化文庫(kù)3–CDR2中的13殘基多樣化文庫(kù)4–CDR3中的7個(gè)殘基多樣化在每個(gè)文庫(kù)中，使用nnS密碼子進(jìn)行多樣化，其中n保留了親本堿基的大部分(85％)而將剩余部分在等摩爾量的剩余三個(gè)堿基(每個(gè)5％)之間分開(kāi)，且S表示G或C。使用生物素化的單體和三聚人CD40L選擇噬菌體文庫(kù)(平均大小8x108)，交替鏈霉親合素/neutravidin珠捕獲抗原(如所述)。在選擇過(guò)程期間，將文庫(kù)2和3拉到一起。進(jìn)行了使用降低濃度的抗原(第1輪50nM；第2輪5nM；第3輪1nM，使用200倍過(guò)剩的競(jìng)爭(zhēng)物-非生物素化的CD40L三聚體)的三輪選擇。每輪選擇后使用測(cè)序以監(jiān)控多樣性。將選擇輸出(第2輪和第3輪)亞克隆到可溶性表達(dá)載體pDOM13(無(wú)C末端標(biāo)簽)中(如所述)并作為單克隆細(xì)菌微量培養(yǎng)物上清，在單體和三聚體CD40L兩者上通過(guò)BIAcore篩選與親本克隆相比改進(jìn)的解離率。DNA測(cè)序經(jīng)鑒定改進(jìn)的變體，并表達(dá)，純化獨(dú)特的dAb，然后使用BMS2h珠RBA以及細(xì)胞CD40L驅(qū)動(dòng)測(cè)定法(如所述)測(cè)定。作為結(jié)果，鑒定了成熟dAbsBMS2h-572-608,BMS2h-572-614和BMS2h-572-619?？寺MS2h-572-633的構(gòu)建序列分析揭示了BMS2h-572-608和親本dAbBMS2h-572-6之間的所有氨基酸差異定位于CDR1中，且BMS2h-572-614和親本dAbBMS2h-572-6之間的差異定位于CDR3中。兩種成熟的dAb都與親本dAbBMS2h-572-6共享CDR2。這創(chuàng)造了構(gòu)建組合突變體的機(jī)會(huì)，所述組合突變體具有BMS2h-572-608的CDR1和BMS2h-572-614的CDR3。首先，PCR擴(kuò)增BMS2h-572-608的CDR1區(qū)。其次，PCR擴(kuò)增BMS2h-572-614的CDR2+CDR3片段。這接著是兩個(gè)片段的SOEPCR(剪接重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))組裝以創(chuàng)建組合突變體BMS2h-572-633。將組裝的dAbPCR產(chǎn)物克隆到可溶性表達(dá)載體pDOM13(無(wú)C末端標(biāo)簽)中，測(cè)序驗(yàn)證，表達(dá)，純化，然后使用BMS2h珠RBA以及細(xì)胞CD40L驅(qū)動(dòng)測(cè)定法(如所述)測(cè)定。格式化BMS2h-572-633為Fc融合將BMS2h-572-633dAb克隆到含有來(lái)源于人IgG1的Fc尾的pDOM38載體中以創(chuàng)建DMS0507。將構(gòu)建體在HEK293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)并使用蛋白A純化蛋白。通過(guò)Biacore在對(duì)單體和三聚CD40L的結(jié)合方面以及在多個(gè)細(xì)胞測(cè)定(如所述)中分析純化的Fc融合。實(shí)施例3CD40活性細(xì)胞測(cè)定對(duì)抗人CD40LdAb功能性測(cè)定它們拮抗CD40L活性的能力。測(cè)試的CD40L活性是由hCD40L驅(qū)動(dòng)的原代單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞(DC)活化的B細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生。除非另有說(shuō)明，所有測(cè)定在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行。如下文詳細(xì)描述的多種測(cè)定的結(jié)果示于表1和表2中?？扇苄訧Z-hCD40L驅(qū)動(dòng)的原代人B細(xì)胞增殖在96孔圓底板中，以終體積200μL/孔將1x105個(gè)扁桃體人B細(xì)胞與0.6μg/ml的IZ-hCD40L連同不同滴度的dAb或mAb孵育。平板在37℃孵育72小時(shí)，接著添加胸苷(3H；0.5μci/孔)6小時(shí)?；谛剀論饺攵緽細(xì)胞增殖。除非另有說(shuō)明，所有測(cè)定在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行。CHO-hCD40L驅(qū)動(dòng)的原代B細(xì)胞增殖使用人CD40L轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞以生成在細(xì)胞表面上表達(dá)高水平的CD40L的穩(wěn)定細(xì)胞系。與人B細(xì)胞孵育前，CHO-CD40L細(xì)胞以10,000Rads照射。將1x105個(gè)扁桃體人B細(xì)胞與1x103個(gè)CHO-CD40L細(xì)胞(CHO-CD40L：人B細(xì)胞1：100比率)以及各種滴度的dAb或mAb在96孔圓底平板中以200μl/孔的終體積進(jìn)行孵育。平板在37℃孵育72小時(shí)，接著添加胸苷(3H；0.5μci/孔)6小時(shí)。基于胸苷摻入定量B細(xì)胞增殖。除非另有說(shuō)明，所有測(cè)定在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行。原代T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的人B細(xì)胞增殖從人外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離T細(xì)胞并使用通過(guò)山羊紅細(xì)胞(SRBC)親和力富集。將富集的人T細(xì)胞與PM-LCL(EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系；以10,000Rads照射)以5：1比率(T：LCL)在37℃培養(yǎng)6天以生成異基因的T細(xì)胞群體。在第6天，分離擴(kuò)增的T細(xì)胞并以3000Rad照射，然后與原代人扁桃體B細(xì)胞(1x105B細(xì)胞/孔)以1:2比率培養(yǎng)(5x104T細(xì)胞/孔)，所述培養(yǎng)在使用抗CD3mAb(OKT3)包被的96孔平底平板中進(jìn)行。向每個(gè)孔添加不同滴度的dAb/mAb；每個(gè)孔中的終體積為200μl。測(cè)試平板在37℃孵育3天。通過(guò)在最后18個(gè)小時(shí)向培養(yǎng)物添加胸苷(3H；0.5μci/孔)確定人B細(xì)胞增殖。除非另有說(shuō)明，所有測(cè)定在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行。在一些情況中，收獲上清并測(cè)量IL-6的存在。CHO-hCD40L驅(qū)動(dòng)的原代人單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的活化：通過(guò)經(jīng)由SRBC(山羊紅細(xì)胞)重置(resetting)耗竭T細(xì)胞，將對(duì)人PBMC(外周血單核細(xì)胞)富集單核細(xì)胞。在6孔板中將單核細(xì)胞富集的PBMC與10ng/mlGM-CS(粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落-刺激因子)和5ng/mlIL-4在37℃孵育六天。在第2天和第5天，將培養(yǎng)的平板使用新鮮培養(yǎng)基(具有GM-CSF和IL-4)補(bǔ)充。在第6天將未成熟的DC(樹(shù)突狀細(xì)胞)用于細(xì)胞測(cè)定。在96孔平底板中，將8x104個(gè)未成熟的DC與4x103個(gè)CHO-hCD40L細(xì)胞(以10,000Rads照射)連同不同滴度的dAbs/mAbs培養(yǎng)。24小時(shí)后，收獲上清并測(cè)試多種細(xì)胞因子(IL-12,TNF,IL-23)的存在。通過(guò)細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平確定DC活化。除非另有說(shuō)明，所有測(cè)定在補(bǔ)充有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培養(yǎng)基中進(jìn)行。表1單體dAb分子在多種原代細(xì)胞測(cè)定中的效能實(shí)施例4各種抗體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和CD40L親和力BMS-986004是一種二聚的融合蛋白，由連接至dAbBMS2h-572-633的C末端的IgG1的經(jīng)修飾的Fc片段組成。表面等離振子共振(SPR)用于表征BMS-986004或單價(jià)組分域抗體BMS2h-572-633結(jié)合值CD40L的動(dòng)力學(xué)和親和力。將BMS-986004值與基準(zhǔn)抗體5c8-IgG1和5c8-CT和單價(jià)組分5c8FAB片段的那些比較。該SPR實(shí)驗(yàn)利用含有N-末端異亮氨酸拉鏈基序的hCD40L構(gòu)建體(IZ-hCD40L)，其促進(jìn)CD40L分子特異性組裝為天然三聚體形式。對(duì)于一些SPE實(shí)驗(yàn)，也利用具有等價(jià)結(jié)合活性的IZ-hCD40L的生物素化的版本(biot-IZ-hCD40L)。單價(jià)BMS2h-572-633域抗體以7.8nM的Kd結(jié)合biot-IZ-hCD40L，相比于單價(jià)5c8FAB片段的5.4nM的親和力，表3。因?yàn)锽MS-986004是雙價(jià)的，而IZ-hCD40L靶標(biāo)是三價(jià)的，該SPR結(jié)合數(shù)據(jù)被親合力(avidity)所影響，不論CD40L靶標(biāo)是在芯片上或在溶液中。為了評(píng)估親合力影響的結(jié)合親和力，將BMS-986004結(jié)合至biot-IZ-hCD40L表面的SRP數(shù)據(jù)擬合至1：1Langmuir模型，提示小于1nM的解離常數(shù)，表3。對(duì)于5c8-IgG1和5c8-CT，獲得了相似的數(shù)據(jù)。表3如使用SPR(Biacore)測(cè)定的IZ-hCD40L動(dòng)力學(xué)和親和力值*值由于分析物的雙價(jià)性受到親合力的影響圖4示出了在25℃，12.5-0.39nM的BMS-986004(2：1系列稀釋)對(duì)鏈霉親合素SPR傳感器芯片上捕獲的biot-IZ-hCD40L結(jié)合的SPR傳感圖數(shù)據(jù)。有色線(xiàn)示出了雙重參照傳感圖數(shù)據(jù)，而黑線(xiàn)示出了對(duì)數(shù)據(jù)的1:1Langmuir擬合，其中親合力影響的表觀(guān)Kd為0.11nM。使用等溫滴定量熱法(ITC)在范圍15–37℃的溫度，在溶液中還表征了BMS-986004對(duì)CD40L結(jié)合的親和力和熱力學(xué)。這些數(shù)據(jù)表明，存在多個(gè)熱力學(xué)上不同的結(jié)合模式(圖3)，其中不同模式的Kd值超過(guò)了高親和力檢測(cè)限(Kd<2nM)(表4)，與SPR數(shù)據(jù)一致。通過(guò)ITC確定的單價(jià)5c8FAB片段對(duì)IZ-hCD40L的親和力也與通過(guò)SPR確定的值一致。表4使用ITC確定的IZ-hCD40L親和力ITC注射器中的分子ITC細(xì)胞中的分子Kd(nM)BMS-986004IZ-hCD40L<25c8-CTIZ-hCD40L<2IZ-hCD40LBMS-986004<2IZ-hCD40L5c8-CT<2IZ-hCD40L5c8FAB片段3.5實(shí)施例5各種抗體的Fc受體親和力從野生型IgG1Fc域工程化BMS-986004的Fc域(稱(chēng)為“CT-L2”；SEQIDNO:3)以保留結(jié)合FcRn但破壞對(duì)Fcγ受體的結(jié)合的能力。為了確認(rèn)經(jīng)工程化的分子具有期望的Fc受體結(jié)合概況，使用SPR測(cè)量了BMS-986004對(duì)人FcRn，和人Fcγ受體CD64(FcγRI),CD32a(FcγRIIa),CD32b/c(FcγRIIb/c),CD16a(FcγRIIIa),CD16b(FcγRIIIb)的結(jié)合親和力，與5c8-IgG1和5c8-CT比較。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，BMS-986004通過(guò)域抗體域捕獲在biot-IZ-hCD40L傳感器表面上，并測(cè)試可溶性Fc受體蛋白對(duì)暴露的Fc域的結(jié)合。相似的，5c8-IgG1和5c8-CT通過(guò)FAB域捕獲在biot-IZ-hCD40L上，其中可溶性FcR結(jié)合。在pH6.0(其為內(nèi)體中結(jié)合的相關(guān)pH)，BMS-986004以670nM的Kd結(jié)合FcRn，表5。然而，在中性pH，結(jié)合顯著降低(Kd>5000nM)，提示在這些條件下從FcRn的高效釋放。BMS-986004以0.6nM的Kd結(jié)合CD64，并對(duì)于CD32a,CD32b/c,CD16a和CD16b具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上弱的親和力(Kd>3000nM)。5c8-IgG1和5c8-CT兩者都與BMS-986004具有相似的FcRn親和力。5c8-CT，其具有與BMS-986004相同的“CT”Fc區(qū)，也具有與BMS-98600相似的FcγR結(jié)合特性，而具有野生型IgG1Fc域的5c8-IgG1對(duì)FcγRs更強(qiáng)的結(jié)合，表5。表5使用SPR(Biacore)確定的Fc受體親和力*CD32a對(duì)5c8-IgG1結(jié)合是雙相性的(biphasic)。甚至基于對(duì)優(yōu)勢(shì)結(jié)合的穩(wěn)態(tài)擬合，估算Kd為～10-7M(Kdwasestimatedas～10-7Mbasedonsteadystatefittodominantbindingeven)。該Kd在CD32a對(duì)IgG1結(jié)合的文獻(xiàn)報(bào)道的KD范圍內(nèi)。實(shí)施例6基于細(xì)胞的體外測(cè)定在多種原代免疫細(xì)胞測(cè)定中評(píng)估了BMS-986004的效能，以確保在不同細(xì)胞類(lèi)型之間強(qiáng)勁的效能。以?xún)煞N方式進(jìn)行了原代人B細(xì)胞增殖測(cè)定，如實(shí)施例3中詳細(xì)描述的：(1)重組CD40L三聚體用于驅(qū)動(dòng)B細(xì)胞增殖；和(2)在膜上表達(dá)CD40L的CHO細(xì)胞(CHO-CD40L)用于誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖。CHO-CD40L細(xì)胞的效用是特別重要的，以確保當(dāng)與可溶性CD40L三聚體相比時(shí)，來(lái)自膜結(jié)合的CD40L的信號(hào)被同樣好地抑制。CHO-CD40L細(xì)胞也用于驅(qū)動(dòng)原代人DC的活化，所述DC在GM-CSF和IL-4的存在下從培養(yǎng)的PBMC來(lái)源的單核細(xì)胞分化。相似的，T-BMLR(混合的白細(xì)胞反應(yīng))測(cè)定測(cè)量由活化的T細(xì)胞上存在的CD40L驅(qū)動(dòng)的B細(xì)胞的活化。在所有的上述主要測(cè)定中，BMS-986004與基準(zhǔn)5c8mAb效能相等；取決于測(cè)定，效能范圍從個(gè)位數(shù)nM至亞nM(sub-nM)(表6)。表6多種原代細(xì)胞測(cè)定中BMS-986004的效能實(shí)施例7全血受體占有率(RO)的評(píng)估開(kāi)發(fā)了受體占有率(occupancy)方法以測(cè)量獼猴全血樣品中BMS-986003，和隨后在人全血樣品中BMS-986004對(duì)CD40L靶標(biāo)的接合(engagement)。BMS-986003是除了在其氨基末端的非天然甘氨酸殘基外，與BMS-986004共享相同氨基酸序列的dAb。使用抗CD40LmAb通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)在CD4+T細(xì)胞上測(cè)量了占有率，所述抗CD40LmAb與BMS-986003/BMS-986004競(jìng)爭(zhēng)對(duì)CD40L的結(jié)合。在結(jié)合的dAb存在下，以濃度依賴(lài)的方式對(duì)該抗CD40L檢測(cè)mAb阻斷結(jié)合CD40L，提供了靶標(biāo)占有率的測(cè)量?？紤]到在外周血中的靜息T細(xì)胞上，基礎(chǔ)CD40L以低水平表達(dá)，在未刺激的血液樣品和使用植物凝集素(PHA)誘導(dǎo)T細(xì)胞表面上CD40L上調(diào)的樣品兩者中都評(píng)估了RO。使用BMS-986003和BMS-986004處理離體全血后，生成了結(jié)合效能曲線(xiàn)。得到的平均EC50和EC90示于表7中。表7離體全血受體占有率測(cè)定中BMS-986003和BMS-986004在CD4+T細(xì)胞上的結(jié)合效能BMS-986003n平均EC50,nM平均EC90,nM人(基礎(chǔ))10.93人(PHA誘導(dǎo)的)60.89Cyno(基礎(chǔ))30.63Cyno(PHA誘導(dǎo)的)30.42BMS-986004人(基礎(chǔ))30.43人(PHA誘導(dǎo)的)30.75對(duì)于BMS-986003和BMS-98600，全血中的靶標(biāo)結(jié)合效能在人和獼猴之間緊密相關(guān)。當(dāng)結(jié)合至基礎(chǔ)和PHA誘導(dǎo)的CD40L時(shí)，BMS-986003和BMS-98600的EC50值也相似。另外，這些值與基于人體外細(xì)胞的測(cè)定中獲得的那些相當(dāng)(見(jiàn)表4)?；跍y(cè)量的EC90值，應(yīng)當(dāng)在濃度≤10nM達(dá)到外周血中充分靶標(biāo)飽和。為了支持BMS-986003和BMS-986004的臨床前PK/PD概況，在使用BMS-986003的獼猴KLH研究(使用鑰孔戚血藍(lán)素免疫)和使用BMS-986004的IV橋接研究?jī)烧咧卸荚u(píng)估了RO。這些發(fā)現(xiàn)的進(jìn)一步細(xì)節(jié)可以在以下實(shí)施例中找到。實(shí)施例8體內(nèi)藥理學(xué)為了顯示CD40LdAb在小鼠疾病模型中的效力，使用小鼠IgG1Fc格式化小鼠CD40LdAb，2m126-24，所述IgG1Fc具有D265A點(diǎn)突變以進(jìn)一步降低Fc效應(yīng)器功能。該小鼠替代dAb2m126-24-Fc表現(xiàn)出與BMS-986004和MR-1(一種倉(cāng)鼠抗小鼠CD40L抗體)可比的效能(表8)。表8體外效能比較小鼠CD40LdA對(duì)KLH誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)的抑制在第0天，雌性BALB/c小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)注射250μgKLH。在第-1和第6天，以指定劑量對(duì)小鼠皮下(s.c.)給藥MR-1或BMS-2m-126-24-Fc。收集血液并通過(guò)ELISA分析血清第7天的抗KLHIgM和第14天的IgG。將使用KLH免疫后第14天收集的來(lái)自BALB/c小鼠的血清匯集，并用作陽(yáng)性比較物，且數(shù)據(jù)表示為測(cè)試血清的滴度對(duì)匯集的BALB/c血清的滴度的比率。如圖6中所示，BMS-2m-126-24-Fc表現(xiàn)出對(duì)IgG滴度的劑量依賴(lài)的抑制，其中在3mg/kg表現(xiàn)出最大效果，其中EC50計(jì)算為0.26mg/kg。CD40LdAb和該抗體兩者都以1mg/kg測(cè)試，分別顯示出IgG反應(yīng)中70％相對(duì)于30％的降低。在1mg/kg觀(guān)察到了dAb和該抗體的相似的暴露，提示dAb比抗體在抑制KLH誘導(dǎo)的IgG反應(yīng)方面稍有效力?？傊?，在抑制T細(xì)胞依賴(lài)的抗體反應(yīng)方面，CD40LdAb已經(jīng)表現(xiàn)出與抗CD40L抗體至少相同水平的效力。小鼠CD40LdAb對(duì)TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的抑制雄性SJL/J小鼠通過(guò)插于肛門(mén)遠(yuǎn)端4cm的導(dǎo)管直腸內(nèi)施用2.5mg溶于50％EtOH的三硝基苯磺酸(TNBS)。在TNBS注射前4小時(shí)，小鼠使用MR-1或BMS-2m-126-24-Fc以指示的劑量s.c.給藥一次。圖7呈現(xiàn)了使用PBS/IgG或不同劑量水平的MR-1或dAb處理的小鼠組的平均體重和百分比存活的變化。阿巴西普用作陽(yáng)性對(duì)照(20mg/kg,i.p.每隔一天)。IgG對(duì)照組中示出TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的典型概貌：體重減輕，在第3-4天達(dá)到頂峰；在第3天和以上發(fā)生結(jié)腸炎相關(guān)的死亡；且存活的小鼠在第4天后顯示出恢復(fù)的跡象。使用CD40LdAb或抗體處理(兩者都以2,8和20mg/kg測(cè)試)導(dǎo)致劑量依賴(lài)的對(duì)體重減輕的抑制和存活率的增加；8mg/kg的兩種化合物產(chǎn)生一定程度的效力，其與20mg/kg的阿巴西普可比?？偟膩?lái)說(shuō)，在急性TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，小鼠CD40LdAbBMS-2m-126-24-Fc已經(jīng)表現(xiàn)出與抗CD40L抗體MR-1可比的效力。小鼠“心臟至耳朵”移植物模型中CTLA4Ig和小鼠CD40LdAb之間的協(xié)同效果將來(lái)自新生(48-72hrs)C57Bl/6小鼠的心臟移植物移植到BALB/c小鼠耳廓中創(chuàng)建的皮下口袋中。小鼠使用指示劑量的CTLA4-Ig(i.p.2x/wk),BMS-2m126-24-Fc(皮下,s.c.1x/wk)或兩者的組合處理，其中在移植前一天起始第一次給藥。通過(guò)連續(xù)三天心肌收縮力的缺失定義排斥前的時(shí)間，如通過(guò)同種移植物的心電圖(ECG)裝置每天評(píng)估的。如預(yù)期的，沒(méi)有任何治療的情況下，接受新生BALB/c心臟的C57BL/6小鼠在此不久之后排斥移植物，其中中值存活時(shí)間(MST)為12天。使用3,20mg/kg的dAb或25mg/kg的CTLA4-Ig的單一療法在延長(zhǎng)同種移植物的存活方面無(wú)影響或影響不大(MST：分別為12，15和13天)。然而，在使用20mg/kg的dAb和25mg/kg的CTLA4-Ig的組合處理的組中，移植物的存活顯著延長(zhǎng)，表現(xiàn)出35天的MST(圖8)。該數(shù)據(jù)提供了在人腎移植患者中組合CD40LdAb與貝拉西普的基本原理。實(shí)施例9體內(nèi)非臨床藥代動(dòng)力學(xué)(PK)和藥效學(xué)(PD)在非臨床設(shè)置中，進(jìn)行了多種體內(nèi)研究以表征BMS-986004,BMS-986003，和小鼠CD40LdAb-F替代物，BMS-2m-126-24-CT的PK和PD。關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)總結(jié)如下。測(cè)量BMS-986004dA的ELISA開(kāi)發(fā)了基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)的生物分析方法以支持小鼠中的PK研究，急性和慢性效力研究，和采用獼猴的探索性PK/PD研究。在所有的情況下，獲得全血并在EDTA的存在下制備血漿，然后該樣品進(jìn)行ELISA分析。使用ELISA測(cè)定測(cè)量BMS-986004的血漿濃度，所述ELISA測(cè)定利用人CD40L抗原以從測(cè)試樣品中捕獲分析物。測(cè)試樣品在4℃解凍，充分混合，并以1:100稀釋到測(cè)定稀釋液中，所述稀釋液由1×PBS,0.05％Tween-20,和1％BSA(PTB)組成。使用1％正常猴血漿/PTB作為稀釋液完成樣品的后續(xù)稀釋。這允許測(cè)試分析物在幾種稀釋度(102–105)測(cè)定同時(shí)將樣品基質(zhì)保持在1％。從ProteinStructureandScience(PSS)，LVL獲得重組三聚體人CD40L并以終濃度2μg/mL的終濃度結(jié)合至96孔板。使用以下項(xiàng)檢測(cè)測(cè)試樣品，質(zhì)量控制(QC)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品：在PTB中稀釋至0.25μg/mL濃度的親和純化的兔抗重鏈(Vh)域框架多克隆抗體(CovanceResearchProducts,Denver,PA)，然后辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔多克隆二抗(JacksonImmunoresearch,WestGrove,P)和添加的底物(TMB–四甲基聯(lián)苯胺)，并使用1M磷酸終止酶促反應(yīng)。在450nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行測(cè)試樣品中BMS-986004的分析。在每次運(yùn)行的當(dāng)天在1％猴血漿中制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)校正器用于確定生物分析方法的動(dòng)態(tài)范圍。在100％血漿中所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的范圍為10-1200ng/mL。從BiologicsProcessandProductDevelopment(BPPD),HPW獲得BMS-986004的參考標(biāo)準(zhǔn)。參考標(biāo)準(zhǔn)材料是制造批次的代表并用于研究方案。使用≤20％(認(rèn)為其對(duì)于測(cè)定表現(xiàn)是可以接受的)的準(zhǔn)確度和精確度標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和QC。使用4參數(shù)邏輯擬合回歸模型定量測(cè)試樣品，所述模型通過(guò)源自校正器的倒數(shù)濃度(1/x)加權(quán)。QC樣品的性能(其通過(guò)計(jì)算的濃度與其名義值的偏差來(lái)測(cè)量)表明參考材料當(dāng)在-70℃儲(chǔ)存超過(guò)2個(gè)月時(shí)，以30-1000ng/ml的濃度在純的猴血漿中穩(wěn)定。非臨床藥代動(dòng)力學(xué)表9總結(jié)了在非臨床動(dòng)物物種中，BMS-986004,BMS-986003,和小鼠BMS-2m-126-24-CT的PK參數(shù)。表9來(lái)自?xún)煞N非臨床動(dòng)物物種的單劑量PK參數(shù)(平均值±SD)在猴中，BMS-986004和BMS-986003表現(xiàn)出可比的PK概況(圖9A和圖9B)。IV施用后，BMS-986004和BMS-986003的血漿濃度表現(xiàn)出雙指數(shù)(bi-exponential)下降，分別直至504和408h。在參與兩項(xiàng)研究的猴的50％中后來(lái)觀(guān)察到了加速的清除。對(duì)BMS-986004處理后38天收集的血漿樣品的免疫原性測(cè)試提示所有的猴形成了抗藥物抗體(ADA)；且具有較高ADA水平的猴表現(xiàn)出較快的清除。盡管沒(méi)有對(duì)使用BMS-986003的IVPK研究進(jìn)行免疫原性測(cè)試，在PK/PD研究中使用BMS-986003皮下給藥后的猴中觀(guān)察到了相似水平的免疫原性，提示兩種蛋白在猴中都是免疫原性的。因此，測(cè)定BMS-986004和BMS-986003的124和106h的終末半衰期，其僅使用收集直至兩周(336h)的暴露進(jìn)行。因此，BMS-986004和BMS-986003的分布穩(wěn)態(tài)體積(Vss)分別為0.098和0.074L/kg。該值比血漿體積(0.06L/kg)大但比細(xì)胞外液的體積(0.2L/kg)小，提示該蛋白很大程度上存在于細(xì)胞外空間中。BMS-986004和BMS-986003的總機(jī)體血漿清除(CLTp)分別為0.59和0.65mL/h/kg。將BMS-986004在猴中的PK參數(shù)與阿巴西普，一種相似大小的蛋白(78.5對(duì)78-kDaBMS-986004，基于氨基酸序列)的那些比較，所述阿巴西普具有相同的經(jīng)修飾的人IgG1Fc形式。如預(yù)期的，BMS-986004的參數(shù)與阿巴西普的那些幾乎相同(CLTp為0.6mL/h/kg,Vss為0.087L/kg,T1/2為5d)，提示BMS-986004和阿巴西普的人PK很可能相似。在猴PK/PD研究中評(píng)估了皮下(SC)施用后BMS-986003的吸收。在使用鑰孔戚血藍(lán)素，一種T細(xì)胞依賴(lài)抗原免疫前24h，所述猴施用作為0(載體對(duì)照),0.2,2和20mg/kg的單皮下劑量的BMS-986003。給藥后，BMS-986003被緩慢吸收，其中Tmax范圍從6-96h(圖10)。BMS-986003的暴露似乎小于所有劑量水平間的劑量比例。使用1:10:100的劑量比率，平均Cmax和AUC0-inf比率分別為1:12:80和1:7:44。使用IV劑量(2mg/kg)后的暴露作為參考，并假設(shè)IV給藥后的線(xiàn)性PK，0.2,2,和20mg/kg的BMS-986003的SC生物可用性分別為88％,74％,和44％。終末T1/2被在給藥后2至5周時(shí)在大多數(shù)猴的情況中觀(guān)察到的免疫原性混淆。因此，估算在0.2,2和20mg/kg，T1/2分別為85,66,和105h。在20mg/kgIV施用后，評(píng)估5c8-IgG1，在PK/PD研究中用作陽(yáng)性對(duì)照的抗人CD40L單克隆抗體的PK(圖11)。當(dāng)與相同劑量SC給予的BMS-986003比較時(shí)，5c8-IgG1表現(xiàn)出高10倍的血漿暴露和長(zhǎng)4倍的T1/2(表9)。在單次IV和SC施用后，在小鼠中評(píng)估了小鼠替代物dAb-Fc融合蛋白BMS-2m-126-24-CT的PK(表9)。單次IV(1mg/kg)后，血漿濃度遵循單指數(shù)下降，其中終末T1/2為101h(圖11)。CLTp為1.85mL/h/kg；而Vss在0.26L/kg，指示細(xì)胞外分布。在1和10mg/kg單次SC給藥后，BMS-2m-126-24-CT被緩慢吸收，其中Tmax為24h。系統(tǒng)性暴露以劑量成比例的方式增加。使用1：10的劑量比率，Cmax和AUC0-inf以1：11的比例增加。1和10mg/kg的終末T1/2分別為100和120h。SC和IV施用后，劑量調(diào)整的暴露(AUC0-inf)的比率大于1，提示SC施用后的完全吸收。藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)建模在PK/PD研究中，作為對(duì)抗KLH抗體反應(yīng)的抑制測(cè)量BMS-986003的PD。在最高的劑量20mg/kg，BMS-986003抑制了70％的對(duì)KLH的抗體反應(yīng)在2和0.2mg/kg，發(fā)生微小的(15％)對(duì)抗體反應(yīng)的抑制和無(wú)對(duì)抗體反應(yīng)的抑制。作為對(duì)比，5c8-IgG1表現(xiàn)出比相同劑量水平(20mg/kg)的BMS-986003高10倍的血漿暴露和長(zhǎng)4倍的T1/2。因此，5c8-IgG1抑制97％抗KLH抗體反應(yīng)。為了比較BMS-986003和5c8-IgG1之間的體內(nèi)效能，使用SAAMII(版本1.2.1,Seattle,WA)進(jìn)行了PK/PD建模。使用與2室模型(2-compartmentmodel)偶聯(lián)的一階吸收動(dòng)力學(xué)描述了SC施用后BMS-986003的血漿濃度，其中在中央和周?chē)鷧^(qū)室兩者中發(fā)生消除。由于來(lái)自免疫原性和可能的非線(xiàn)性吸收的復(fù)雜性，在每個(gè)劑量個(gè)別擬合PK數(shù)據(jù)。對(duì)于5c8-IgG1，使用了具有中央消除的二室模型。使用6室信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型對(duì)抗KLH抗體反應(yīng)(表示為IgG滴度的平均值)進(jìn)行建模。將機(jī)體中的KLH的動(dòng)力學(xué)假設(shè)為1室模型。使用Imax模型描述BMS-986003和5c8-IgG1對(duì)IgG產(chǎn)生的抑制，其中最大抑制等于100％。如圖12中所示，該模型擬合的曲線(xiàn)能夠描述PK和PD概況兩者。對(duì)于抑制KLH誘導(dǎo)的IgG產(chǎn)生，BMS-986003和5c8-IgG1的血漿IC50分別估算為74±14和60±18nM。這些結(jié)果證明了這兩種分子的效能在體內(nèi)可比。在IVPK模型中測(cè)量了BMS-986004的CD40L受體占有率(RO)。11mg/kgIV施用后，BMS-986004在外周血單核細(xì)胞上(PBMC)的RO是時(shí)間和濃度依賴(lài)的。進(jìn)行了PK/PD建模以評(píng)估ROEC50。使用修改的二室模型對(duì)血漿濃度進(jìn)行建模，其中在給藥后504h引入另外的ADA介導(dǎo)的一階消除常數(shù)；且使用Emax模型對(duì)RO進(jìn)行建模。如圖13中所示，擬合的曲線(xiàn)能夠描述暴露和RO兩者，其中估算的ROEC50為3.4±0.3nM，而γ(hill因子)為3.1±0.1。作為對(duì)比，ROEC50比74±14nM的抗KLH抗體反應(yīng)低約22倍，提示為了實(shí)現(xiàn)察覺(jué)的(>50％)抗KLH抗體抑制，需要>95％RO。實(shí)施例10TE/血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估據(jù)推測(cè)與抗CD40L單克隆抗體的施用相關(guān)的TE是由抗CD40mAb-CD40L免疫復(fù)合物(IC)介導(dǎo)的血小板的交聯(lián)所介導(dǎo)的，由IC對(duì)FcgRIIa(一種IgGFc受體)的結(jié)合推動(dòng)，引起活化和聚集。因此，阻斷IgG的Fc部分與FcgRIIa的相互作用預(yù)期減輕血小板交聯(lián)和血栓形成。設(shè)計(jì)了以下方法和辦法來(lái)評(píng)估TE和/或血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。體外血小板活化測(cè)定進(jìn)行了幾種體外測(cè)定以測(cè)試血小板被CD40LMab/sCD40LIC以FcgRIIa依賴(lài)的方式活化的假設(shè)。陽(yáng)性對(duì)照5c8-IgG1用于在測(cè)試BMS-986003和BMS-986004之前驗(yàn)證測(cè)定。來(lái)自人類(lèi)供體或在血小板上表達(dá)hFcgRIIa受體的小鼠的血液用于這些研究。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)使用針對(duì)良好驗(yàn)證的血小板活化標(biāo)志物P-選擇素(CD62P)和PAC-1(活化的GPIIb/IIIa)檢測(cè)血小板活化。簡(jiǎn)短的說(shuō)，將血液以1:25稀釋于含有1mMCaCl2的經(jīng)修改的Tyrodes-HEPES中，向其添加檢測(cè)抗體和測(cè)試試劑，孵育，并分析血小板活化。初始實(shí)驗(yàn)確定了sCD40L或5c8IgG1單獨(dú)不活化血小板，但5c8:sCD40L的1：1至1：8的不同免疫復(fù)合物比率顯著活化血小板。后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用5c8-IgG1或5c8-mIgG2aIC，主要以5c8:sCD40L為1：3的摩爾比率。通過(guò)5c8/sCD40LIC的血小板活化可以被抗FcgRIIa抗體阻斷使用FcgRIIa阻斷抗體IV.3進(jìn)行了研究以測(cè)試通過(guò)5c8/sCD40LIC的血小板活化是否確實(shí)是FcgRIIA介導(dǎo)的。將來(lái)自人供體的血液與0.5μg/μl的FcgRIIa阻斷抗體IV.3預(yù)孵育，之后稀釋和與檢測(cè)抗體孵育，如上文描述。腺苷二磷酸(ADP)，一種通過(guò)不同機(jī)制的血小板活化子，用作陽(yáng)性對(duì)照。如圖14中所示，通過(guò)5c8/sCD40IC的血小板活化被IV.3完全阻斷，而通過(guò)ADP的活化不被阻斷抗體抑制，指示通過(guò)IC的活化是FcgRIIa介導(dǎo)的。惰性Fc尾的選擇對(duì)于潛在的候選分子的要求是不存在對(duì)FcgRIIa的結(jié)合以防止?jié)撛诘难“寤罨１磉_(dá)了含有來(lái)源于IgG1(例如，5c8-CT和N297Q)或IgG4(例如5c8-S228P)的不同突變的幾種5c8構(gòu)建體并篩選不活化血小板的Fc尾，使用不同的sCD40L比mAbs的摩爾比率。野生型和大多數(shù)突變的構(gòu)建體活化血小板，除了5c8-CT和5c8-N297Q之外(圖15)。Fc(5c8-Fab2)的缺乏也不活化血小板，進(jìn)一步確認(rèn)了IC-血小板活化是Fc介導(dǎo)的。選擇了CT尾來(lái)格式化dab候選物BMS-986003和BMS-986004。FcgRIIa多態(tài)性對(duì)血小板活化的影響FcgRIIa的基因在密碼子131處可變，導(dǎo)致His-Arg(CAT/CGT)多態(tài)性。在約100個(gè)個(gè)體(具有約相等的高加索人和非洲裔美國(guó)人分布)中的基因型分布為對(duì)于高加索美國(guó)人為A/A(His純合；14％),A/G(His/Arg雜合；60％),和G/G(精氨酸純合；26％)和對(duì)于非洲裔美國(guó)人為A/A(30％),A/G(51％),和G/G(19％)。Reilly等人，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1:640-644(1994)。當(dāng)使用mIgG2或mIgG1Fc形式的抗CD9處理時(shí)，注意到來(lái)自R131個(gè)體的樣品中Fc依賴(lài)的血小板聚集，而來(lái)自H131個(gè)體的血小板僅在使用mIgG2形式的抗CD9時(shí)聚集；這提示使用IgG1mAb的Fc依賴(lài)的聚集可以潛在地將患者群體分離為低和高響應(yīng)者，這先前已經(jīng)報(bào)道為具有這種多態(tài)性。Tomiyama等人，Blood80:2261-2268(1992)。為了解決使用IgG1和CTFc尾的血小板活化中的任何潛在差異，將19名供體對(duì)hFcgRIIa多態(tài)性進(jìn)行基因型分型，并對(duì)樣品測(cè)試血小板活化。供體合并物多態(tài)性(RR；42％,HH；21％,HR；37％)足以評(píng)估對(duì)IgG1形式的血小板活化中的任意潛在差異。代表性的文獻(xiàn)報(bào)道，使用5c8-IgG1/sCD40LIC的血小板活化在所有基因型分析的個(gè)體中相似。使用5c8-CT/sCD40LIC沒(méi)有發(fā)現(xiàn)活化(圖16)，提示使用經(jīng)CT尾格式化的抗體在患者群體中無(wú)增加的TE風(fēng)險(xiǎn)或最小化的增加的TE風(fēng)險(xiǎn)。BMS-986004：人血液供體中的血小板活化使用5c8的上述實(shí)驗(yàn)支持選擇CT-尾作為BMS-986004的最佳形式(也稱(chēng)為BMS2h-572-633-CT-L2)。從6名供體獲得的血液使用5c8-IgG1,5c8-CT,F(ab)2,和BMS-986004處理。血小板被5c8-IgG1活化，但不被任意其它構(gòu)建體活化，包括BMS-986004(圖17)，提示該dAb對(duì)于在臨床研究中導(dǎo)致血小板活化和TE無(wú)風(fēng)險(xiǎn)或具有低風(fēng)險(xiǎn)。BMS-986003：來(lái)自表達(dá)hFcgRIIa的小鼠的血液中的血小板活化為了進(jìn)一步確認(rèn)通過(guò)抗CD40L抗體的血小板活化是由FcgRIIa介導(dǎo)的，來(lái)自表達(dá)人受體(R131基因型)的轉(zhuǎn)基因小鼠的血液使用5c8-IgG1,5c8-IgG2a,dAb-IgG1,5c8-CT,和BMS-986003(也稱(chēng)為BMS-2h572-633-CT)處理。在來(lái)自表達(dá)hFcgRIIa的小鼠，而不是野生型同窩小鼠(littermates)的血液中，血小板被5c8-IgG1,5c8-IgG2a,和dAb-IgG1/sCD40LIC特異性活化。5c8-CT和BMS-986003不活化血小板，進(jìn)一步確認(rèn)了使用現(xiàn)在公開(kāi)的抗體對(duì)于TE的低風(fēng)險(xiǎn)(圖18)。實(shí)施例11免疫抑制方案在獼猴中進(jìn)行了移植研究以評(píng)估在非人靈長(zhǎng)類(lèi)腎移植模型中單獨(dú)以及與貝拉西普組合的BMS-98600的效力。對(duì)于這些研究，將猴分為以下劑量反應(yīng)組和治療方案：第1階段-第1部分：僅BMS-986004的劑量反應(yīng)(猴的n＝9)A組(高劑量)：BMS-986004，20mg/kg靜脈內(nèi)(n＝6)在手術(shù)后天數(shù)(POD)0,7,14,21,28,35,42,49,56和70時(shí)施用(每周一次)在POD77時(shí)處死B組：(中等劑量)：BMS-986004，10mg/kg靜脈內(nèi)(n＝1)在POD0,7,14,21,28,35,42,49,56,63,和70時(shí)施用(每周一次)C組：(低劑量)：BMS-986004dAb，2mg/kg靜脈內(nèi)(n＝2)每周施用直到POD70第1階段-第2部分：與貝拉西普的組合治療(n＝6)BMS-986004單獨(dú)，20mg/kg靜脈內(nèi)在POD0,7,14,21,28,35,42,49,56,63,和70時(shí)施用(每周一次)BMS-986004，20mg/kg靜脈內(nèi)+貝拉西普，20mg/kg靜脈內(nèi)在POD0,7,14,21,28,4256,和70時(shí)施用第2階段-第1部分：對(duì)僅BMS-986004的劑量反應(yīng)(n＝5)A組(高劑量)：BMS-986004，20mg/kg靜脈內(nèi)(n＝3)在POD0,7,14,21,28,35,42,49,56,63,和70施用(每周一次)B組(高劑量)：BMS-986004，30mg/kg靜脈內(nèi)(n＝2)在POD0,7,14,21,28,35,42,49,56,63,和70施用(每周一次)跟蹤動(dòng)物的存活直到端點(diǎn)。如以下實(shí)施例中所證明的，有些猴沒(méi)有存活到期望的端點(diǎn)。這些動(dòng)物不能完成計(jì)劃的劑量方案。在以下實(shí)施例中討論了結(jié)果。實(shí)施例12移植物功能在獼猴中進(jìn)行了移植研究以評(píng)估CD40LdAbBMS-986004的合適給藥。為了理解根本機(jī)制，完成了BMS-986004對(duì)存活的影響的評(píng)估和任意排斥反應(yīng)的表征。實(shí)驗(yàn)室評(píng)估進(jìn)行了血清肌酸酐研究以測(cè)試在使用BMS-986004治療的獼猴中隨時(shí)間的同種移植物功能。同種移植物失效定義為腎衰竭的形成，所述腎衰竭在臨床設(shè)置中足以要求透析(即，BUN>100mg/dL或高血鉀癥>7.0伴隨升高的肌酸酐)，其中BUN和血清肌酸酐水平用作腎衰竭的生物標(biāo)志物。圖19-21示出了第1階段-第1部分使用高劑量(20mg/kg)，中等劑量(10mg/kg)，和低劑量(2mg/kg)的BMS-986004治療的腎移植獼猴的血清肌酸酐水平。在移植后約6天后，低劑量和中等劑量組表現(xiàn)出高血鉀癥>6.0，伴隨著升高的肌酸酐水平。在移植后60天以前，高劑量組中沒(méi)有一只猴表現(xiàn)出高血鉀癥>7.0。記錄了接受體存活時(shí)間，并在同種移植物失效的時(shí)候?qū)ΛJ猴實(shí)施安樂(lè)死。以下表10提供了第1階段-第1部分接受體存活數(shù)據(jù)和臨床評(píng)估：表10接受體存活-低，中等，和高劑量*計(jì)劃的Sac＝計(jì)劃的處死對(duì)于第1階段-第2部分使用甚至更高劑量(30mg/kg)治療的腎移植的獼猴進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)。圖22提供了治療的獼猴的肌酸酐曲線(xiàn)。以下表11提供了第1階段-第2部分接受體存活數(shù)據(jù)和臨床評(píng)估：表11接受體存活-劑量遞增在另外的研究中，在五個(gè)接受體中觀(guān)察到了以下結(jié)果。對(duì)于使用20mg/kgBMS-986004組或20mg/kgBMS-986004+20mg/kg貝拉西普處理的階段2腎移植的獼猴進(jìn)行了相似的研究。圖23提供了處理的猴的肌酸酐曲線(xiàn)。以下表12提供了第II階段-第1部分接受體存活數(shù)據(jù)和臨床評(píng)估。最后一劑抗CD154dAb在移植后第70天，而最后一劑貝拉西普在移植后第168天。表12接受體存活-組合療法腎同種移植物活組織檢查為了進(jìn)一步評(píng)估同種移植物功能，獼猴在移植后第35和70天進(jìn)行那個(gè)了經(jīng)皮腎活組織檢查。由具有腎移植專(zhuān)業(yè)知識(shí)的獸醫(yī)病理學(xué)家進(jìn)行了初步組織學(xué)分析。通過(guò)用于鑒定腎同種移植物排斥的標(biāo)準(zhǔn)化的Banff標(biāo)準(zhǔn)表征活組織檢查。該Banff標(biāo)準(zhǔn)定義于以下表13-16中：表13急性T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥的標(biāo)準(zhǔn)表14單核細(xì)胞間質(zhì)性炎癥的量化標(biāo)準(zhǔn)(“i分?jǐn)?shù)”)i0無(wú)或微不足道的間質(zhì)性炎癥(<10％的無(wú)疤痕薄壁組織)i110至25％的發(fā)炎的薄壁組織i226至50％的發(fā)炎的薄壁組織i3大于50％的發(fā)炎的薄壁組織表15小管炎的量化標(biāo)準(zhǔn)(“t分?jǐn)?shù)”)表16動(dòng)脈內(nèi)膜炎的量化標(biāo)準(zhǔn)(“v分?jǐn)?shù)”)經(jīng)皮腎活組織檢查的結(jié)果包括在下表中。表17經(jīng)皮腎活組織檢查組織學(xué)分析*Bx＝活組織檢查；*Sac＝處死實(shí)施例13通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞表型確定從第II階段獼猴收集外周血樣品并進(jìn)行細(xì)胞表型分析以評(píng)估白細(xì)胞組分(免疫表型)和與免疫活化一致的其它細(xì)胞標(biāo)志物。第II階段-20mg/kgBMS-986004組和20mg/kgBMS-986004+20mg/kg貝拉西普組的初步均值組T細(xì)胞亞群流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)示于圖24-31中。在實(shí)施安樂(lè)死的時(shí)候，也收集了腎同種移植物，脾，淋巴結(jié)和骨髓樣品。同種移植物薄壁組織經(jīng)處理用于組織浸潤(rùn)細(xì)胞的提取，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和基因陣列表達(dá)序型分析來(lái)分析。實(shí)施例14BMS-986004和貝拉西普的水平進(jìn)行了研究以確定從第I階段-第1部分使用2mg/kg(n＝2),10mg/kg(n＝1),或20mg/kg(n＝6)的BMS-986004和貝拉西普的獼猴收集的血漿樣品中抗BMS-986004和抗貝拉西普的水平。在各個(gè)劑量給予前即刻獲得樣品，所述劑量在第0天(移植前)；在移植結(jié)束時(shí)(移植前輸注后2hrs)；移植后第4、7、14、28和此后兩周一次給予。實(shí)施例15病毒載量測(cè)定已經(jīng)顯示了當(dāng)患者處于免疫抑制的狀態(tài)時(shí)，移植后發(fā)生病毒再活化。使用先前已經(jīng)描述的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，監(jiān)控使用20mg/kg的BMS-986004治療的獼猴的巨細(xì)胞病毒(CMV)病毒再活化的存在。在任意治療的猴中，沒(méi)有巨細(xì)胞病毒(CMV)病毒再活化的證據(jù)。(見(jiàn)圖32)。該數(shù)據(jù)提供了進(jìn)一步的支持，即免疫系統(tǒng)被BMS-986004充分地抑制而不存在CMV的再活化。通過(guò)分析獼猴全血，監(jiān)控使用20mg/kg的BMS-986004治療的獼猴的獼猴巨細(xì)胞病毒(RhCMV)，猴腎病毒40(SV30)，和淋巴細(xì)胞隱病毒(LCV)的存在。實(shí)施例16血栓栓塞潛力的分析分析來(lái)自多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的獼猴血漿樣品的分析D-Dimer，纖維蛋白原，和抗凝血酶水平，以及PT/aPTT(凝血酶原時(shí)間/活化部分凝血原酶時(shí)間)。每周從完全血液計(jì)數(shù)(CBC)記錄血小板計(jì)數(shù)。還記錄血小板分布寬度。血小板分布寬度是用作血栓栓塞診斷的標(biāo)志物的指數(shù)。血小板分布寬度由于與血栓栓塞相關(guān)的血小板活化增加。收集時(shí)間最初集中于手術(shù)程序左右，然后貫穿猴的剩余生命以定期時(shí)間點(diǎn)間隔。在腎切除術(shù)前的兩個(gè)時(shí)間；腎切除術(shù)后第1和7天；移植后第0,1,4,7,14,21,28天，然后每2周一次直到安樂(lè)死時(shí)并包括安樂(lè)死時(shí)收集血漿樣品。實(shí)施例17尸體剖檢評(píng)估在獼猴上進(jìn)行尸體剖檢以確認(rèn)它們是否表現(xiàn)出任何血栓栓塞綜合癥樣的癥狀。進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)的總體檢查(grossexamination)。從所有的猴收集組織，包括腎同種移植物，腎上腺，腦，結(jié)腸，十二指腸，心臟，回腸，腹股溝淋巴結(jié)，縱膈淋巴結(jié)，空腸，肝臟，肺，腸系膜淋巴結(jié)，胰腺，甲狀旁腺，皮膚，脾，胃，胸腺，甲狀腺組織。在10％中性緩沖的福爾馬林中收集這些樣品。收集并儲(chǔ)存腎同種移植物，心臟，皮膚，肺，脾，胸腺，縱膈淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)的另外的組織。還收集任何嚴(yán)重異常的組織區(qū)，以及如果可能的話(huà)來(lái)自正常對(duì)照猴的組織的對(duì)應(yīng)區(qū)域。處死后，沒(méi)有血栓栓塞(TE)的總體或組織學(xué)證據(jù)。測(cè)定的多種T細(xì)胞分析證明維持了動(dòng)物的保護(hù)性免疫。發(fā)現(xiàn)治療是安全且有效的，并具有與先前的抗CD154療法相似的效能。實(shí)施例18單一療法，單一療法+常規(guī)療法，和組合療法遵循如上文所述的相同的指導(dǎo)方針和使用相同的動(dòng)物，施用單獨(dú)或在一些組合療法中的20mg/kg抗CD28dAb。對(duì)于使用單獨(dú)貝拉西普的單一療法或與常規(guī)療法組合或與抗CD28dAb組合，在腎移植前以10mg/kg的劑量施用貝拉西普，接著在腎移植后第4天以15mg/kg和第7,14,18,42,56,84,112,140和168天以20mg/kg再次施用。常規(guī)療法由以下組成：A)在第0天和此后不久施用抗IL-2R；B)從第0天至第28天開(kāi)始20mg/天的甲強(qiáng)龍，第29天至第84天降低至2mg/天的甲強(qiáng)龍，在這一點(diǎn)甲強(qiáng)龍降低到1mg/天；和C)從第0天至第28天b.i.d.(一天兩次)施用15mg嗎替麥考酚酯(MMF)然后此后15mg.q.d.(每天一次)。對(duì)于施用各種療法的動(dòng)物，結(jié)果示于表18-20中。表18表19表20對(duì)于組合的抗CD154dAb和常規(guī)療法，從POD0至POD70每周30mg/kg靜脈內(nèi)施用抗CD154dAb，然后從POD70至POD140兩周一次施用抗CD154dAb而沒(méi)有常規(guī)療法。然后在POD140之后以30mg/kg每月靜脈內(nèi)施用抗CD154dAb。抗CD28dAb在本文中稱(chēng)為BMS-931699，其為共同轉(zhuǎn)讓的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)8,168,759中所述的PEG化的抗CD28dAb。PEG部分為40kDa支鏈聚乙二醇。抗CD28dAb的序列如下：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRPIWPFLEWYQQKPGKAPKLLIYFTSRLRHGVPSRFSGSGSGTCFTLTISSLQPEDFATYYCLQNVANPATFSQGTKVEIKR(SEQIDNO:26)盡管參考以上實(shí)施例描述了實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解不偏離這些實(shí)施方案的精神可以完成多種修改，并將是本領(lǐng)技術(shù)人員容易知道的。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3