本發(fā)明涉及向細胞提供光感受器功能的改進的方法，所述方法例如用于在治療視網(wǎng)膜退化中使用。本發(fā)明還涉及組合物和試劑盒，所述組合物和試劑盒特別是用于在此類方法中使用。

背景

脊椎動物眼睛的視網(wǎng)膜充當與相機中的膠片相同的功能，接收由貫穿通過眼睛的晶狀體和角膜的光產(chǎn)生的視覺圖像。接收的圖像被轉(zhuǎn)化成經(jīng)由視神經(jīng)被傳送到腦的化學信號和電信號。

視網(wǎng)膜是個復雜的結(jié)構(gòu)，包含不同細胞類型的十個清楚的層。這些層中，光感受器層負責將進入的光轉(zhuǎn)化成可被腦閱讀并且解釋成圖像的化學信號和/或電信號。光感受器層包含被稱為視桿細胞和視錐細胞的兩種類型的光敏細胞。這些細胞類型二者都負責與進入的光反應并且產(chǎn)生電信號，但它們在視網(wǎng)膜內(nèi)的定位以及與它們反應的光的類型是不同的。具體地，視桿細胞主要在弱光中發(fā)揮功能，并且主要在周邊視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)。視錐細胞對強光(即白天視覺)更有反應，負責顏色視覺，并且被發(fā)現(xiàn)在中央視網(wǎng)膜中呈最高密度。視網(wǎng)膜還含有第三類較少數(shù)目的光感受器細胞-光敏神經(jīng)節(jié)細胞，其負責測量背景光，但不負責圖像處理。

視網(wǎng)膜的光感受器層的視桿細胞和視錐細胞能夠與光反應，并且由于其中的光敏色素(被稱為光色素)的存在能夠?qū)⒐廪D(zhuǎn)化成電信號，當細胞被暴露于光時，所述光敏色素經(jīng)歷化學變化。這些光色素是G蛋白偶聯(lián)的受體。光色素包含與被稱為視黃醛的發(fā)色團輔因子偶聯(lián)的蛋白部分。暴露于光引起視黃醛輔因子從順式視黃醛到反式視黃醛的異構(gòu)化，其轉(zhuǎn)而引起視蛋白中的構(gòu)象變化，被稱為光褪色。這是信號級聯(lián)中的第一步，導致信號沿著視神經(jīng)被傳送。為了保持光敏性，視蛋白因此需要順式視黃醛的持續(xù)的供應。視桿和視錐光感受器細胞二者自身均不能產(chǎn)生順式視黃醛。視網(wǎng)膜中順式視黃醛的主要來源是RPE(視網(wǎng)膜色素上皮)，其從褪色的視蛋白獲取所有反式視黃醛并且產(chǎn)生順式視黃醛。在完整的視網(wǎng)膜中，視桿和視錐細胞臨近RPE，允許視桿和視錐細胞接近此再生的發(fā)色團。

人類中，存在若干密切相關(guān)的光色素，被稱為視蛋白家族。人類中，這些光色素包含對不同波長(顏色視覺的來源)敏感的3種視錐視蛋白、在視桿細胞中發(fā)現(xiàn)的視紫紅質(zhì)、和在神經(jīng)節(jié)細胞光感受器中發(fā)現(xiàn)的視黑素。視錐視蛋白包括用于黃綠色的LWS視蛋白、用于綠色的MWS視蛋白和用于藍紫色的SWS視蛋白。這些視蛋白顯示高度的序列同一性。

諸如視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的狀況由于外部視網(wǎng)膜中的光感受器(即視錐和視桿)的破壞引起失明。這些狀況可以是直接損傷光感受器的結(jié)果，或光感受器作為在視網(wǎng)膜色素上皮和/或脈絡膜中的病理結(jié)果被間接破壞。在退化的晚期階段常見嚴重視覺損傷。目前，這些狀況是不可治愈的。視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良可分成視桿視錐營養(yǎng)不良(也被稱為視網(wǎng)膜色素變性)、視錐視桿營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良。在視桿視錐營養(yǎng)不良中，視桿光感受器退化，導致周邊視覺和夜視覺的喪失，并且經(jīng)常地此后是視錐破壞，導致中央視覺和顏色視覺的喪失。相反地，在視錐視桿營養(yǎng)不良中，最初存在視錐光感受器的喪失，導致精細的和顏色視覺的喪失，并且然后隨后是視桿退化，導致周邊視覺的喪失和夜盲癥。兩種形式可以導致伴隨著視野的大范圍的或完全的喪失的失明。另一種類型的被稱為黃斑營養(yǎng)不良的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良導致中央視覺的喪失，但周邊視覺被保留。

然而，盡管外部視網(wǎng)膜光感受器的喪失，包括雙極細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元可以存活并且保持它們向腦發(fā)送視覺信息的能力。因此，這些神經(jīng)元為新興的光遺傳(optogenetic)療法提供了有希望的機會(niche)，所述光遺傳療法旨在直接地將內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元轉(zhuǎn)化成視覺光感受器并且重建已隨著退化喪失的光敏感性。若干治療策略已顯示了試圖替換或復活這些內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元并且恢復視覺的有希望的結(jié)果。移植光感受器細胞或其前體細胞系在臨床前的研究下是主要的方法，并且已經(jīng)顯示恢復在完全喪失光感受器后處于退化的晚期階段的失明小鼠的視覺。在復活內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的嘗試中，可移植的電子假體已通過外部相機觸發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGC)激發(fā)(firing)并且對至少一些患者已提供了粗略的空間區(qū)分(Zrenner E,等2011，Proc Biol Sci 278(1711):1489-1497；Humayun MS,等2012,Ophthalmology 119,779-788)。另一個策略使用微生物視蛋白作為神經(jīng)元活性的光開關(guān)并且它們已被用于在退化的視網(wǎng)膜中引起光誘發(fā)的活性。在這種意義上，已經(jīng)顯示，在rd1小鼠中視網(wǎng)膜內(nèi)注射攜帶通道視紫紅質(zhì)2基因(ChR2)的AAV-2載體導致光激活的去極化或在RGC中的“給光”響應以及在皮質(zhì)中視覺上激發(fā)的潛能。由Bi等領(lǐng)導的此研究(Bi A,等2006,Neuron.2006；6；50(1):23-33.)提供了可使用光遺傳學恢復視網(wǎng)膜功能(Lagali PS,等2008,Nat Neurosci.2008Jun；11(6):667-75；Cronin T,等2014,EMBO Mol Med.2014Aug 4；6(9):1175-90；MacéE等2014,Mol Ther.2015Jan；23(1):7-16)的第一個原理驗證，并且視錐光感受器(Busskamp V,等2010,Science.2010Jul 23；329(5990):413-7.)已被成功地轉(zhuǎn)化成人工光傳感器，導致失明小鼠中視覺功能的部分恢復。另外，最近開發(fā)的合成的光開關(guān)在失明小鼠中已顯示了挽救視力的有希望的結(jié)果?！耙唤M分”基于偶氮苯的光開關(guān)使用小分子AAQ或DENAQ(Polosukhina A,等2012,Neuron.2012Jul 26；75(2):271-82；Tochitsky I,等2014,Neuron.2014Feb 19；81(4):800-13.)，小分子AAQ或DENAQ直接地使神經(jīng)元的天然的離子通道光敏感。“二組分”光開關(guān)LiGluR/MAG(Caporale N,等2011,Mol Ther.2011Jul；19(7):1212-9；Gaub BM,等2014,Proc Natl Acad Sci U S A.2014Dec 23；111(51):E5574-83)首先在視網(wǎng)膜中遺傳地表達合成地工程化的光學門控的離子型谷氨酸受體(LiGluR)，并且然后需要添加用于激活的光開關(guān)分子(MAG)。兩種系統(tǒng)都已顯示將光敏感性賦予失明的小鼠和犬(Gaub BM,等2014,Proc Natl Acad Sci U S A.2014Dec 23；111(51):E5574-83)視網(wǎng)膜以及恢復嚙齒動物中的基礎(chǔ)視覺功能。

然而，在這些狀況的治療中的改進仍是必需的。

本發(fā)明旨在克服或改善與治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)的問題。

發(fā)明概述

因此，在本發(fā)明的第一方面中，提供了向細胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括向眼睛的玻璃體腔內(nèi)引入i)編碼光敏蛋白的核酸序列；和ii)細胞外基質(zhì)降解酶。

在本發(fā)明的第二方面中，提供了組合物，所述組合物包含i)編碼光敏蛋白的核酸序列；和ii)細胞外基質(zhì)降解酶。優(yōu)選地，所述組合物是治療性的。

在本發(fā)明的第三方面中，提供了i)編碼光敏蛋白的核酸序列；和ii)細胞外基質(zhì)降解酶，用于在向細胞提供光感受器功能的方法中使用。

在本發(fā)明的第四方面中，提供了向細胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括將包含編碼人類光感受器蛋白的核酸的核酸載體引入到眼睛內(nèi)。在該方面，優(yōu)選地，引入載體而不施用細胞外基質(zhì)降解酶(例如，引入載體而不共施用酶，其中共施用包括在同一治療期間，單獨的、順序的或組合的施用)。方法還可包括在內(nèi)層視網(wǎng)膜細胞中表達載體，其中人類光感受器蛋白的表達致使內(nèi)層視網(wǎng)膜細胞感光。

在本發(fā)明的第五方面中，提供了包含編碼人類光感受器蛋白的核酸的核酸載體。

附圖說明

本發(fā)明的實施方案參考附圖在下文被進一步描述，其中：

圖1示出了眼內(nèi)注射和經(jīng)由AAV的基因遞送；

圖2示出了視紫紅質(zhì)治療之后，瞳孔對光反射的恢復；

圖3A-E示出了來自體內(nèi)電生理記錄的數(shù)據(jù)；F)來自Rd1小鼠(n＝5)的代表性的體內(nèi)dLGN光響應的熱圖，其中一只眼睛已用視桿視蛋白CAG-hRho(B)處理，并且另一只眼睛用GFP CAG-GFP處理(C)，描繪了恢復響應的多樣性：持續(xù)的、瞬時的、給光和撤光。根據(jù)在2秒光刺激展示(15.4log光子/cm²/s)的最初1秒期間的持續(xù)的響應的振幅將響應排序；G-J)代表性的刺激后時間直方圖(PSTH)，顯示針對持續(xù)的給光(G)、瞬時的給光(H)、撤光(I)和給光-撤光(J)對多個全視野閃光的展示(15.4log光子/cm²/s)的平均響應。相應的試驗箱計數(shù)(trial bin counts，TBC)顯示在每個PSTH的頂部。

圖4示出了來自體外MEA記錄的數(shù)據(jù)；

圖5示出了光刺激之后，觀察的響應與通常存在于rd1小鼠視網(wǎng)膜中的天然的光響應明顯不同。

圖6示出了在受到視桿視蛋白驅(qū)動的rd1小鼠中的dLGN響應，處理的眼睛在一系列的光強度下并且在光適應的條件中響應A)利用在不同光強(ND2＝13.4、ND1＝14.4和ND0＝15.4log光子/cm²/s)的全視野閃光展示的來自Rd1-CAG-hRho小鼠的五個代表性的dLGN單位的敏感度響應譜特征(PSTH和TBC)；B)在光適應的條件下記錄的來自Rd1-CAG-hRho小鼠的四個代表性的dLGN單位的對比敏感度響應反應譜特征(PSTH和TBC)(邁克爾遜對比(Michelson contrast)96％，@ND0＝15.4log光子/cm2/s)。

圖7示出了視桿視蛋白至給光雙極細胞的靶向表達恢復了失明的rd1視網(wǎng)膜中的視覺響應：A)在Grm6啟動子下AAV2載體DNA構(gòu)建體驅(qū)動人類視桿視蛋白的靶向表達；B、C)在玻璃體內(nèi)遞送與分解細胞外基質(zhì)(B)的糖苷酶聯(lián)合的A中的病毒載體之后，貫穿小鼠視網(wǎng)膜的切片的示例熒光顯微圖像。高放大倍數(shù)的熒光圖像描繪了在INL細胞的細胞體中的視桿視蛋白的膜定位(C)。用α-hRho抗體(紅色)處理視網(wǎng)膜并且用DAPI(藍色)染色細胞核。校正條＝50μm。GCL＝神經(jīng)節(jié)細胞層，IPL＝內(nèi)網(wǎng)層，INL＝內(nèi)核層。

圖8示出了代表性的刺激后時間直方圖(PSTH)，其顯示了對于給光(A)和撤光(B)響應，對@ND0＝15.4log光子/cm²/s的5秒全視野閃光的多個展示的平均響應。

圖9示出了代表性的刺激后時間直方圖(PSTH)，其顯示了對@較低的光水平(ND2-13.4log光子/cm²/s)的2秒全視野閃光的多個展示的平均響應。

圖10示出了代表性的刺激后時間直方圖(PSTH)，其顯示了在光適應的條件下-邁克爾遜對比96％，對5秒全視野閃光的多個展示的平均響應。

圖11示出了視桿視蛋白的異位表達恢復了被處理的失明rd1小鼠中的視覺行為：A)在一定系列的光強(A)的10秒白光期間，對于最大瞳孔收縮的輻射照度響應曲線。用視桿視蛋白處理的rd1眼睛(非靶向CAG表達，紅色)相比于注射GFP的rd1眼睛(綠色)示出了視覺敏感度的顯著改進。對于靶向表達(Grm6，藍色)，瞳孔對光反射仍然大部分受損。用PBS/酶混合物注射的野生型小鼠的數(shù)據(jù)被顯示用于比較(黑色)。數(shù)據(jù)被對即將開始光之前的瞳孔尺寸標準化。數(shù)值是平均值±SEM，其中n指示檢查的動物的數(shù)目；B)在暗中(基線)、在ND4(11.8log光子/cm²/s)和在ND0(15.8log光子/cm²/s)對WT、Rd1-GFP、Rd1-CAG-hRho、Rd1-grm6-hRho小鼠測量的瞳孔區(qū)域的代表性的遠紅外圖像；C、D)在ND4(11.8log光子/cm2/s；C)和ND0(15.8log光子/cm²/s；D)所有四組小鼠群體中的平均最大瞳孔收縮。檢查的動物的數(shù)目：WT n＝6；Rd1-GFP n＝16；Rd1-CAG-hRho n＝10；Rd1-grm6-hRho n＝6。誤差條是SEM。

圖12示出了對四組小鼠(WT n＝5；Rd1-GFP n＝6；Rd1-CAG-hRho n＝6；Rd1-grm6-hRho n＝5)從暗(深色陰影)到光(白色區(qū)域)的開放盒活性圖。圖中的數(shù)值是在前面的30秒盒中行進的距離的總體平均值±SEM。右邊的直方圖示出了對于從暗(臨近光之前30秒；黑色條)到光(緊接在光之后30秒；白色條)的轉(zhuǎn)變階段，群體中經(jīng)過的平均距離。誤差條是SEM。*p<0.05，**p<0.005，配對的Student t-檢驗。

圖13對于Rd1-grm6-hRho(n＝5)，從灰色屏幕光到4Hz閃爍光的開放盒活性圖。數(shù)值是在前面的30秒盒中行進的距離的總體平均值±SEM。B)對Rd1-GFP(n＝6)、Rd1-CAG-hRho(n＝6)和Rd1-grm6-hRho(n＝5)小鼠的4Hz閃爍光響應。對于每組的小鼠示出了成對的直方圖，僅描繪了來自整個活性圖(如F中對于Rd1-grm6-hRho示出的)從灰色光(臨近4Hz閃爍光之前30秒)到4Hz閃爍光(緊接在4Hz閃爍光之后30秒)的轉(zhuǎn)變階段。數(shù)據(jù)是行進的距離的總體平均值±SEM。**p<0.005，配對的Student t-檢驗。

圖14示出了Rd1-grm6-hRho小鼠(n＝5)的對比敏感度響應，示出了在不同的邁克爾遜對比下，在4Hz閃爍光之前和之后行進的距離。對于每個對比性能，僅示出了來自活性圖的轉(zhuǎn)變階段，描述了在閃爍光展示之前的30秒(白色條)和之后的30秒(網(wǎng)格條)中經(jīng)過的距離。數(shù)據(jù)是行進的距離的總體平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.005，配對的Student t-檢驗。

圖15示出了Rd1-grm6-hRho小鼠(n＝5)的閃爍光頻率響應，示出了不同頻率的全視野閃爍光展示之前和之后行進的距離。對于每個閃爍光響應，僅示出了來自活性圖的轉(zhuǎn)變階段，比較在閃爍光展示之前的30秒中的距離(灰色條)與之后的30秒中的距離(網(wǎng)格條)。數(shù)據(jù)是行進的距離的總體平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.005，配對的Student t-檢驗。

圖16示出了靶向的視桿視蛋白表達恢復了對自然電影場景的響應：A、B)來自Rd1-CAG-hRho(A)和Rd1-Grm6-hRho(B)小鼠的代表性的響應的dLGN單位的柵格圖，Rd1-CAG-hRho(A)和Rd1-Grm6-hRho(B)小鼠暴露于30秒自然電影的多個展示(小鼠在水平視野的開放場地中移動)；C)Rd1-Grm6-hRho(n＝5)的從灰色屏幕光(粗糙的灰色)到隱約可見的貓頭鷹電影(綠色陰影)的開放盒活性圖。數(shù)據(jù)是在前面的30秒盒中行進的距離的總體平均值±SEM；

圖17示出了Rd1-GFP(n＝6)、Rd1-CAG-hRho(n＝6)和Rd1-grm6-hRho(n＝5)小鼠的自然電影響應。示出了每組小鼠的成對直方圖，僅描繪來自完整活性圖的從灰色光(臨近電影展示之前的30秒；白色條)到貓頭鷹電影(緊接電影之后的30秒；黑色條)的轉(zhuǎn)變階段。數(shù)據(jù)是行進的距離的總體平均值±SEM。**p<0.005，配對的Student t-檢驗。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及人類光感受器蛋白用于向細胞提供光感受器功能，以恢復在退化的或部分退化的視網(wǎng)膜中的光敏感性的用途。此類天然的光感受器功能隨著光感受器的退化喪失。本發(fā)明是基于以下驚人發(fā)現(xiàn)：內(nèi)視網(wǎng)膜中人類光感受器蛋白的表達可以向內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞提供光感受器功能。內(nèi)視網(wǎng)膜中人類光感受器蛋白的轉(zhuǎn)基因表達分別與使用微生物視蛋白和電子陣列相對比，具有使?jié)撛诘拿庖咴圆焕绊懽钚』膬?yōu)勢。另外，光感受器之外，此GPCR具有劫持細胞機器并且提供完全地自給的感光機制的潛能，能夠自身支持光檢測而無任何另外的干預，這與合成的光開關(guān)不同，該合成的光開關(guān)需要恒定的光開關(guān)外源供應用于激活。此外，視桿視蛋白需要可見光用于激活，并且通過天然的GPCR放大級聯(lián)，視桿蛋白具有在低光強下發(fā)揮功能的潛能，與不能在蛋白水平放大信號的目前基于通道的或合成的光開關(guān)系統(tǒng)不同。

玻璃體內(nèi)注射作為用于基因療法的方法在以下的方面具有特別的優(yōu)勢：在接近視網(wǎng)膜方面在技術(shù)上是較低挑戰(zhàn)性的，并且減少施用期間并發(fā)癥的風險，特別是當視網(wǎng)膜經(jīng)過退化已經(jīng)變薄時。

本發(fā)明部分基于以下的發(fā)現(xiàn)：基因療法中細胞外基質(zhì)降解酶的共施用導致視網(wǎng)膜細胞的增加的傳導，因此改進在增加的視力恢復方面的結(jié)果。本發(fā)明代表了優(yōu)于之前的玻璃體內(nèi)基因治療方法的改進，借助于通過減少使外來的遺傳材料與靶細胞接觸的障礙使增加的傳導成為可能。

基因療法和細胞外基質(zhì)降解酶的組合的應用已導致驚人的結(jié)果，特別是當基因療法包括向眼睛的玻璃體引入編碼視紫紅質(zhì)的核酸序列時。視紫紅質(zhì)需要在視覺傳導之后產(chǎn)生的全反式視黃醛被運輸?shù)揭暰W(wǎng)膜色素上皮(RPE)用于將全反式視黃醛轉(zhuǎn)化成全順式視黃醛，然后全順式視黃醛被運輸回視桿細胞用于另外的視覺響應。此循環(huán)已被認為依賴于視桿細胞和RPE間的緊密接觸。內(nèi)視網(wǎng)膜細胞，即使在其中視桿和視錐退化的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的存在下，將不與RPE以相同的方式生理上相關(guān)。本發(fā)明人已出人意料地觀察到，盡管缺少功能性內(nèi)視網(wǎng)膜細胞和RPE間的接觸，通過基因療法向內(nèi)視網(wǎng)膜細胞提供視紫紅質(zhì)產(chǎn)生視覺響應。另外，認為內(nèi)視網(wǎng)膜細胞不具有與視紫紅質(zhì)協(xié)同工作以產(chǎn)生然后可經(jīng)由神經(jīng)節(jié)細胞向腦傳送的電信號所需的細胞內(nèi)機制。

結(jié)果是進一步驚人的，因為視紫紅質(zhì)通過響應光超極化細胞來工作(轉(zhuǎn)換細胞“撤光(OFF)”的腦等價物)，其中可以設(shè)想，視覺將要求內(nèi)視網(wǎng)膜細胞通過光被去極化(轉(zhuǎn)換“給光(ON)”)。

本發(fā)明提供了與編碼光敏蛋白的核酸序列組合施用細胞外基質(zhì)降解酶，以對視網(wǎng)膜恢復光敏感功能。視網(wǎng)膜和玻璃體包含一系列細胞外基質(zhì)分子，包括蛋白多糖(具有不同類別的糖胺聚糖(GAG)鏈)諸如硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)、硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPG)和硫酸皮膚素蛋白多糖(DSPG)；透明質(zhì)酸、膠原諸如在視網(wǎng)膜內(nèi)界膜中的IV型膠原；層粘連蛋白；巢蛋白1和2，以及多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他蛋白和糖蛋白。

設(shè)想，本發(fā)明可利用任何能夠降解存在于玻璃體內(nèi)和/或視網(wǎng)膜內(nèi)和/或內(nèi)界膜中的細胞外基質(zhì)蛋白或碳水化合物(諸如糖胺聚糖)、和/或視網(wǎng)膜細胞外基質(zhì)的酶。特別地，用于在本發(fā)明中使用的酶可以是能夠降解在視網(wǎng)膜中被提供的細胞外基質(zhì)蛋白或碳水化合物、或在玻璃體與視網(wǎng)膜的細胞間的路徑中被提供的細胞外基質(zhì)蛋白或碳水化合物，并且因此可以影響核酸序列的轉(zhuǎn)導的酶。優(yōu)選的是降解糖胺聚糖(GAG)的酶。

細胞外基質(zhì)降解蛋白可選自由以下組成的組：膠原酶、透明質(zhì)酸裂解酶、肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、軟骨素ABC裂解酶、軟骨素AC裂解酶、金屬蛋白酶、ADAMTS、纖溶酶(絲氨酸蛋白酶纖溶酶或其截短的形式微纖溶酶(Ocriplasmin))、中性粒細胞彈性蛋白酶和組織蛋白酶G、神經(jīng)氨酸酶、N-聚糖酶、O-聚糖酶和鏈霉蛋白酶。特別優(yōu)選的酶可選自由以下組成的組：來自透明質(zhì)酸鏈霉菌(Streptomyces hyalurolyticus)的透明質(zhì)酸裂解酶(EC 4.2.2.1；在Genbank登錄號CP003990中包含)；來自牛睪丸的透明質(zhì)酸酶(EC 3.2.1.35)；來自普通變形桿菌(Proteus vulgaris)的軟骨素ABC裂解酶(EC 4.2.2.4)和來自肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)的肝素酶III(EC 4.2.2.8；Genbank登錄號L12534，優(yōu)選地版本L12534.1)。用于在本發(fā)明中使用的酶從商業(yè)來源例如Sigma Aldritch可得。

“降解”或“降解酶”意指能夠分解蛋白或碳水化合物的酶。蛋白通過例如肽鍵的水解可被分解成肽序列或氨基酸。碳水化合物可被分解成寡糖或單糖單位。蛋白和/或碳水化合物可被完全或部分降解，意指蛋白和/或碳水化合物的一部分可被分解成更小的片段，而蛋白和/或碳水化合物的其余部分可以呈其天然形式。優(yōu)選地，降解的細胞外基質(zhì)蛋白或碳水化合物喪失了一些向細胞提供結(jié)構(gòu)和/或生化支持的能力，以使得被引入玻璃體內(nèi)的核酸序列可以更好地接近視網(wǎng)膜細胞。特別地，降解的細胞外基質(zhì)蛋白喪失了其阻礙玻璃體內(nèi)的核酸序列(例如基因遞送載體，諸如病毒載體)移動并且進入以及穿過視網(wǎng)膜的能力的一些或全部。細胞外基質(zhì)功能中的任何喪失是足夠地最低的，以使得其對眼睛或視力不具有任何顯著的不利影響。

本文中，對細胞外基質(zhì)降解酶的提及包括其的活性片段?；钚云慰梢允翘烊幻傅囊徊糠只蜉^短版本，其保持了作為細胞外基質(zhì)降解酶發(fā)揮功能的能力，即其保持了降解細胞外基質(zhì)蛋白或碳水化合物的能力，如本文定義的。活性片段可以包含天然酶的序列的70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

本文中，對酶的提及包括一種或更多種酶。因此，本發(fā)明提供了單一酶或兩種或更多種酶的組合的共施用。優(yōu)選地，當提供兩種或更多種酶時，它們每個均選自以上定義的組。當施用兩種或更多種酶時，它們可以被單獨地、順序地提供，或兩種或更多種可以以組合被提供。優(yōu)選地，兩種酶被組合施用。當兩種或更多種單獨劑量的酶被提供時，這些酶中的任何一種或更多種可以與核酸序列組合被提供。

用于在本發(fā)明中使用的酶可源自任何合適的來源。所述來源可以是哺乳動物或非哺乳動物。用于在本發(fā)明中使用的酶可以源自動物、植物、細菌或古細菌來源。當源自哺乳動物時，優(yōu)選地，其是人類酶。其可以從此類來源中被分離或純化。其可以作為重組蛋白產(chǎn)生。可選地，其可以被合成地產(chǎn)生。

用于在本發(fā)明中使用的酶的核酸和氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的。

本文中，酶包括天然酶的片段和衍生物。優(yōu)選地，片段或衍生物與天然酶沿著天然酶的長度的50％、60％、70％、80％、90％或至少95％的長度共有至少70％、75％、80％、85％或90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。

序列同一性通過沿著預定的比較窗(其可以是參考核苷酸序列或蛋白的長度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比較兩個對齊的序列，并且確定出現(xiàn)相同的殘基的位置的數(shù)目來確定。通常地，這表示為百分比。核苷酸序列的序列同一性的測量是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，使用計算機實現(xiàn)的數(shù)學算法，諸如ALIGN(版本2.0)、GAP、BESTFIT、BLAST(Altschul等J.Mol.Biol.215:403(1990))、FASTA和TFASTA(Wisconsin Genetic Software Package Version 8，從Genetics Computer Group,Accelrys Inc.San Diego,California可得)和CLUSTAL(Higgins等Gene 73:237-244(1998))，使用缺省參數(shù)。

用于在本發(fā)明中使用的酶可以以包括脫水的或凍干的形式的干燥形式被提供。通常地，酶將被以凍干的形式提供?？蛇x地，酶可以作為水性溶液被提供，例如以預定的濃度和體積預溶解在水中。盡管設(shè)想本發(fā)明的產(chǎn)品或試劑盒可以適合供應干燥形式的酶，為了施用，水性形式是優(yōu)選的，任選地帶有用于溶解的說明書。因此，本發(fā)明的方法可以包括使用干燥的酶來產(chǎn)生酶溶液。優(yōu)選地，這通過在水性或非水性溶劑中溶解或重構(gòu)酶來實現(xiàn)。合適的溶劑是無毒的、并且適用于對人類或動物使用的那些溶劑。優(yōu)選地，合適的溶劑是無菌的。合適的溶劑的一個實例是無菌的磷酸鹽緩沖鹽水。用于溶解干燥的蛋白的方法在本領(lǐng)域是已知的。

本發(fā)明提供了向視網(wǎng)膜施用編碼光敏蛋白的核酸序列，以對視網(wǎng)膜恢復光感受能力。光敏蛋白是通過經(jīng)歷化學或物理變化與光反應的蛋白。光感受，意指光敏或包含光敏蛋白的細胞。術(shù)語光感受或光感受器和光敏可互換地使用。

用于在本發(fā)明中使用的核酸序列可編碼任何光敏蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸序列編碼哺乳動物或非哺乳動物光敏蛋白。其可以是哺乳動物、非哺乳動物、植物、細菌或古細菌來源的。當是哺乳動物來源的時，其優(yōu)選地編碼人類蛋白。用于在本發(fā)明中使用的核酸序列可選自由以下組成的組：視紫紅質(zhì)、視黑素、視椎視蛋白(特別是LWS視蛋白、MW視蛋白和SWS視蛋白)、神經(jīng)視蛋白(Opn5)、腦視蛋白(Opn3)、松果體旁的視蛋白、VA視蛋白、parapinopsin；parietopsin、pinopsin、TMT視蛋白、水母視蛋白、C-視蛋白、隱花色素和任何無脊椎動物視網(wǎng)膜視蛋白和/或通常支持動物中視網(wǎng)膜外的光敏性的視蛋白。

取決于要被治療的受試者，可以選擇用于在本發(fā)明中使用的核酸序列，以使得核酸序列編碼對要被治療的受試者的視網(wǎng)膜是天然的光敏蛋白。因此，例如，當受試者是人類時，核酸序列將優(yōu)選地編碼人類光敏蛋白，例如視紫紅質(zhì)。然而，設(shè)想在某些實施方案中，可以提供編碼光敏蛋白的核酸序列，所述光敏蛋白對要被治療的受試者不是天然的，但優(yōu)選地其不引起受試者中的免疫反應。

許多光敏蛋白的核酸序列和氨基酸序列在本領(lǐng)域是已知的。例如，優(yōu)選的光敏蛋白的核酸序列提供如下：

視黑素：智人視蛋白4(OPN4)、mRNA(cDNA克隆MGC：142118IMAGE:8322610)、GenBank：BC113558、版本BC113558.1；

視紫紅質(zhì)：智人視紫紅質(zhì)(RHO)、GenBank：BC111451.3、登錄號NM_000539、版本NM_000539.3GI：169808383；

視錐智人視蛋白1：智人視蛋白1，長波敏感，OPN1LW-NCBI參考序列：登錄號：NM_020061、版本NM_020061.5；

智人視蛋白1，中波敏感OPN1MW-NM_000513，版本NM_000513.2；

智人視蛋白1短波敏感(OPN1SW)NM_001708，版本NM_001708.2。

parapinopsin(Genbank登錄號NM_001200073，版本NM_001200073.1GI:318056020)；

parietopsin(Genbank登錄號DQ100320，版本DQ100320.1GI:73666459)；

pinopsin(Genbank登錄號AF487546，版本AF487546.1GI:20805654)；

VA視蛋白(Genbank登錄號AF233520，版本AF233520.1GI:8272567)；

TMT視蛋白(Genbank登錄號AH011520AF349943AF349944AF349945，版本AH011520.2GI:339511123)；

水母視蛋白(Genbank登錄號AB435549，版本AB435549.1GI:210049957)；

OPN3(Genbank登錄號NM_014322，版本NM_014322.2GI:71999130)；

OPN5(Genbank登錄號AY377391，版本AY377391.1GI:38482095)；

C-視蛋白(Genbank登錄號HF566407，版本HF566407.1GI：543581059)；和

隱花色素(Genbank登錄號NM_169852，版本NM_169852.1GI:24648151)。

在以上描述的發(fā)明的第四或第五方面，光感受器蛋白是人類光感受器蛋白。人類光感受器蛋白可以是人類視紫紅質(zhì)(還被稱作Rh1、OPN2、RHO)或光視蛋白。光視蛋白可以選自由以下組成的組：長波敏感(OPN1LW)視蛋白、中波敏感(OPN1MW)視蛋白和短波敏感(OPN1SW)視蛋白。

長波敏感(OPN1LW)視蛋白具有在電磁光譜的黃-綠色區(qū)域的560nm的λ_最大。長波敏感(OPN1LW)視蛋白還被稱作“紅色視蛋白”、“L視蛋白”或“LWS視蛋白”。中波敏感(OPN1MW)視蛋白具有在電磁光譜的綠色區(qū)域的530nm的λ_最大。中波敏感(OPN1MW)視蛋白還被稱作“綠色視蛋白”、“M視蛋白”或“MWS視蛋白”。短波敏感(OPN1SW)視蛋白具有在電磁光譜的藍色區(qū)域的430nm的λ_最大。短波敏感(OPN1SW)視蛋白還被稱作“藍色視蛋白”、“S視蛋白”或“SWS視蛋白”。

編碼人類光感受器蛋白的核酸序列可以是智人視紫紅質(zhì)(RHO)基因(GenBank：BC111451.3，登錄號NM_000539，版本NM_000539.3GI:169808383)或其片段或衍生物。

編碼人類光感受器蛋白的核酸序列可以是視錐智人視蛋白1，長波敏感OPN1LW基因(NCBI參考序列：登錄號：NM_020061，版本NM_020061.5)或其片段或衍生物。

編碼人類光感受器蛋白的核酸序列可以是視錐智人視蛋白1：中波敏感OPN1MW(NCBI參考序列：登錄號：NM_000513.2；(Science 232(4747)，193-202(1986))或其片段或衍生物。

編碼人類光感受器蛋白的核酸序列可以是視錐智人視蛋白1：短波敏感(OPN1SW)NM_001708，版本NM_001708.2或其片段或衍生物。

對編碼光敏蛋白的核酸序列的提及包括核酸序列，所述核酸序列是本文描述的序列的衍生物或編碼光敏蛋白的較短的版本或片段，其中所述衍生物或片段保持與天然光敏蛋白大體上相同的光敏感功能。大體上相同意指天然蛋白的光敏感功能的至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。片段可以包含天然蛋白的序列的70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

優(yōu)選地，核酸序列的片段或衍生物與參考核酸序列沿著參考核酸序列的長度的50％、60％、70％、80％、90％或至少95％的長度，共有至少70％、75％、80％、85％或90％、至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的序列同一性。衍生物優(yōu)選地是活性的，并且相比于天然序列可以包括取代和/或缺失和/或添加。衍生物還可以包括向光敏蛋白提供期望的活性或功能的其他基因序列的一部分。

序列同一性通過沿著預定的比較窗(其可以是參考核苷酸序列或蛋白的長度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比較兩個對齊的序列，并且確定出現(xiàn)相同的殘基的位置的數(shù)目來確定。通常地，這表示為百分比。核苷酸序列的序列同一性的測量是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，使用計算機實現(xiàn)的數(shù)學算法，諸如ALIGN(版本2.0)、GAP、BESTFIT、BLAST(Altschul等J.Mol.Biol.215:403(1990))、FASTA和TFASTA(Wisconsin Genetic Software Package Version 8，從Genetics Computer Group,Accelrys Inc.San Diego,California可得)和CLUSTAL(Higgins等Gene 73:237-244(1998))，使用缺省參數(shù)。

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因組的、重組的或合成的。核酸序列可以是分離的或純化的。核酸序列可以是單鏈或雙鏈的。優(yōu)選地，核酸序列將編碼如本文描述的光敏蛋白。核酸序列可以通過克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、連接、凝膠電泳的標準的分子克隆技術(shù)，例如如在Sambrook等Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbour laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分離的，例如使用PCR技術(shù)分離的。此類技術(shù)可以采用基于要被擴增的核酸序列的序列的引物。分離意指從任何雜質(zhì)和從被自然地發(fā)現(xiàn)與其來源中的核酸序列締合的其他核酸序列和/或蛋白中分離核酸序列。因此可以從側(cè)翼核酸序列，或從染色體材料或序列中分離核酸序列。優(yōu)選地，其還將不含細胞材料、培養(yǎng)基或來自純化/生產(chǎn)過程的其他化學物質(zhì)。核酸序列可以是合成的，例如通過直接的化學合成產(chǎn)生，例如使用磷酸三酯的方法(Narang等Meth Enzymol 68:109-151 1979)。核酸序列可以作為裸露的核酸被提供，或可與蛋白或脂質(zhì)復合提供。

序列可被改變(例如通過截短C-末端或引入靶向基序)以改進表達效率，或以改變光反應的特征(例如通過移除或添加作為信號終止過程的一部分的被視紫紅質(zhì)激酶靶向的殘基)。

通過提供的序列信息，熟練的技術(shù)人員可以使用可用的克隆技術(shù)以產(chǎn)生適于轉(zhuǎn)導進入細胞的核酸序列或載體。

優(yōu)選地，編碼光敏蛋白的核酸序列作為載體，優(yōu)選地表達載體被提供。優(yōu)選地，其可作為優(yōu)選地適用于在靶視網(wǎng)膜細胞中轉(zhuǎn)導和表達的基因治療載體被提供。載體可以是病毒的或非病毒的(例如質(zhì)粒)。病毒載體包括源自以下的那些病毒載體：腺病毒、包括突變的形式的腺相關(guān)病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。優(yōu)選地，病毒載體是復制缺陷的(replication defective)，盡管設(shè)想其可以是復制缺乏的(replication deficient)、能夠復制或條件性復制的。病毒載體通?？梢员３秩旧w外狀態(tài)而不整合進入靶視網(wǎng)膜細胞的基因組。用于向視網(wǎng)膜靶細胞引入編碼光敏蛋白的核酸序列的優(yōu)選的病毒載體是AAV載體，例如自身互補的腺相關(guān)病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或這些血清型中的任何一個的修飾的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8載體)可以實現(xiàn)選擇性靶向。在通過玻璃體內(nèi)施用提供載體的本發(fā)明的方面中，載體可以是已被修飾以使得其不與一個或更多個ECM蛋白結(jié)合的載體。例如，優(yōu)選的載體可以包含修飾的硫酸肝素結(jié)合位點，以使得其具有減少的硫酸肝素結(jié)合或不能與硫酸肝素結(jié)合，諸如AAV 7m8(Dalkara D等Sci Transl Med 2013；5:189ra76)。

病毒載體可被修飾以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修飾以缺失全部或部分的IX基因、E1a和/或E1b基因。對于野生型AAV，沒有輔助病毒諸如腺病毒的存在，復制是非常低效率的。對于重組的腺相關(guān)病毒，優(yōu)選地，復制基因和衣殼基因以反式被提供(在pRep/Cap質(zhì)粒中)，并且僅AAV基因組的2ITR被保留并且包裝進入病毒體，同時需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一個質(zhì)粒提供。也可對慢病毒載體做出類似的修飾。

病毒載體具有進入細胞的能力。然而，非病毒載體諸如質(zhì)?？膳c劑復合以有利于病毒載體被靶細胞的攝取。此類劑包括聚陽離子劑。可選地，遞送系統(tǒng)諸如基于脂質(zhì)體的遞送系統(tǒng)可被使用。

用于在本發(fā)明中使用的載體優(yōu)選地適于在體內(nèi)或體外使用，并且優(yōu)選地適于在人類中使用。

載體將優(yōu)選地包含一個或更多個調(diào)節(jié)序列以指導核酸序列在靶視網(wǎng)膜細胞中的表達。調(diào)節(jié)序列可以包括與核酸序列可操作地連接的啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止信號、多腺苷酸化序列、復制起點、核酸限制性位點、和同源重組位點。載體還可包括選擇性標記，例如來確定載體在生長系統(tǒng)(例如細菌細胞)中或在靶視網(wǎng)膜細胞中的表達。

“可操作地連接”意指，核酸序列在功能上與其可操作地連接的序列相關(guān)，以使得它們以使得它們影響彼此的表達或功能的方式連接。例如，與啟動子可操作地連接的核酸序列將具有被啟動子影響的表達模式。

啟動子介導與其連接的核酸序列的表達。啟動子可以是組成型的或可以是誘導型的。啟動子可以指導在內(nèi)視網(wǎng)膜細胞中遍在的表達，或神經(jīng)元特異的表達。在后一種情況中，啟動子可以指導細胞類型特異的表達，例如對給光雙極細胞或撤光雙極細胞。合適的啟動子將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如，合適的啟動子可以選自由以下組成的組：L7、thy-1、恢復蛋白、鈣結(jié)合蛋白、人類CMV、GAD-67、雞β肌動蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增強子-SV40融合蛋白。使用細胞特異的啟動子可以實現(xiàn)靶向，例如例如Grm6-SV40用于選擇性靶向給光雙極細胞。Grm6啟動子是Grm6基因的200堿基對增強子序列和SV40真核啟動子的融合體，Grm6基因編碼給光雙極細胞特異的代謝型谷氨酸受體mGluR6。Grm6基因的優(yōu)選的來源是小鼠和人類。使用泛-神經(jīng)元的啟動子可以實現(xiàn)遍在的表達，其的實例在本領(lǐng)域是已知的并且可得的。一個此類實例是CAG。CAG啟動子是CMV早期增強子和雞β肌動蛋白啟動子的融合體。

本發(fā)明提供了治療組合物，所述治療組合物包含i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶。組合物可被提供于藥學上可接受的賦形劑中。

本發(fā)明還提供了包含編碼人類光感受器蛋白的核酸的核酸載體。人類光感受器蛋白可以是人類視紫紅質(zhì)(還被稱作Rh1、OPN2、RHO)或光視蛋白。光視蛋白可以選自由以下組成的組：長波敏感(OPN1LW)視蛋白、中波敏感(OPN1MW)視蛋白和短波敏感(OPN1SW)視蛋白。載體可作為組合物被提供用于向受試者施用。

組合物可以是液體或固體，例如粉末、凝膠或糊劑。優(yōu)選地，組合物是液體，優(yōu)選地可注射液體。合適的賦形劑將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

在本發(fā)明的涉及施用包含編碼人類光感受器蛋白的核酸的核酸載體的第四和第五方面中，所述載體可通過視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)施用向眼睛施用。在任一種施用模式中，優(yōu)選地，載體作為可注射液體被提供。優(yōu)選地，可注射液體作為膠囊或注射器被提供。在此方面，優(yōu)選地，引入核酸而不施用如本文定義的細胞外基質(zhì)降解酶(即引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治療期間單獨的、順序的或組合的施用)。在此方面，優(yōu)選地，可注射液體不包含細胞外基質(zhì)降解酶。

在本發(fā)明的包含施用細胞外基質(zhì)降解酶的方面中，酶可被單獨地或與核酸序列組合即作為單一的組合物施用。當單獨地提供時，酶和核酸序列可在相同的賦形劑中或在不同的賦形劑中被提供。在此類實施方案中，酶和核酸序列可被單獨地保存，例如在單獨的微膠囊中。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包含i)第一可注射液體，所述第一可注射液體包含編碼光敏蛋白的核酸序列；和ii)第二可注射液體，所述第二可注射液體包含細胞外基質(zhì)降解酶。優(yōu)選地，第一和第二可注射液體被提供在單獨的容器中，諸如膠囊或注射器，優(yōu)選地，在同一包裝內(nèi)。

優(yōu)選地，本發(fā)明的第一、第二和第三方面的組合物被提供用于向受試者單獨的、順序的或組合的施用核酸和酶。

本發(fā)明的組合物可被提供用于在向細胞提供光感受器功能的方法中使用。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可被提供用于在對視網(wǎng)膜恢復光感受器功能的方法中使用。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可被提供用于在對受試者恢復視力的方法中使用。在一個實施方案中，本發(fā)明的組合物可被提供用于在治療視網(wǎng)膜退化的狀況的方法中使用，所述視網(wǎng)膜退化的狀況例如視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；其他形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病，例如視網(wǎng)膜色素變性。

本發(fā)明提供了包含核酸載體的試劑盒，所述核酸載體包含編碼人類光感受器蛋白的核酸。人類光感受器蛋白可以如以上描述的。核酸載體可作為組合物被提供，如本文描述的。組合物可以是可注射液體。在此方面，優(yōu)選地，試劑盒不包含細胞外基質(zhì)降解酶。

本發(fā)明提供了試劑盒，所述試劑盒包含i)編碼光敏蛋白的核酸序列；和ii)細胞外基質(zhì)降解酶。在本發(fā)明的試劑盒中，細胞外基質(zhì)降解酶和核酸序列可被單獨的或組合提供。它們每個可以獨立地作為組合物被提供，例如如本文描述的。因此，本發(fā)明的試劑盒可包含i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶，其中核酸序列和/或酶作為組合物被提供。核酸序列和酶可被組合提供、以單一組合物提供或可作為單獨的組合物被提供。當單獨地提供時，酶和核酸序列可被提供在相同的賦形劑中或在不同的賦形劑中。在此類實施方案中，酶和核酸序列可被單獨地保存，例如在單獨的微膠囊中。

在優(yōu)選的實施方案中，試劑盒可包含i)第一可注射液體，所述第一可注射液體包含編碼光敏蛋白的核酸序列；和ii)第二可注射液體，所述第二可注射液體包含細胞外基質(zhì)降解酶。優(yōu)選地，第一和第二可注射液體被提供在單獨的容器中，諸如膠囊或注射器，優(yōu)選地，在同一包裝內(nèi)。

本發(fā)明的試劑盒還可包含使用說明、給藥方案、一個或更多個細針、一個或更多個注射器和溶劑。

本發(fā)明的試劑盒可被提供用于在向細胞提供光感受器功能的方法中使用。在一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可被提供用于在對視網(wǎng)膜恢復光感受器功能的方法中使用。在一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可被提供用于在對受試者恢復視力的方法中使用。在一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可被提供用于在治療視網(wǎng)膜退化的狀況的方法中使用，所述視網(wǎng)膜退化的狀況例如視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；其他形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病。

本發(fā)明提供了向細胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括將包含編碼人類光感受器蛋白的核酸的核酸載體引入到眼睛內(nèi)。人類光感受器蛋白可以如以上描述的。所述方法可包括向眼睛的內(nèi)視網(wǎng)膜細胞視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)施用核酸載體。在此方面，優(yōu)選地，所述方法不包括施用細胞外基質(zhì)降解酶。本發(fā)明提供了用于通過向細胞提供光感受器功能在治療視網(wǎng)膜退化的方法中使用的核酸載體，所述核酸載體包含編碼人類光感受器蛋白的核酸。在此方面，優(yōu)選地，不使用細胞外基質(zhì)降解酶(即引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治療期間單獨的、順序的或組合的施用)。

本發(fā)明提供了向細胞提供光感受器功能的方法，所述方法包括將以下引入到眼睛的玻璃體腔內(nèi)：i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶。本發(fā)明提供了i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶，用于在向細胞提供光感受器功能的方法中使用。

本發(fā)明還提供了擴大視網(wǎng)膜中的光感受器功能的方法，特別是在視桿和/或視錐細胞退化之后擴大視網(wǎng)膜中的光感受器功能的方法，所述方法包括將核酸載體引入到眼睛的玻璃體腔內(nèi)，所述核酸載體包含編碼人類光感受器蛋白的核酸。人類光感受器蛋白可如以上描述的。所述方法可包括向眼睛的內(nèi)視網(wǎng)膜細胞，視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)施用核酸載體。在此方面，優(yōu)選地，所述方法不包括施用細胞外基質(zhì)降解酶。本發(fā)明提供了用于通過擴大視網(wǎng)膜中的光感受器功能在治療視網(wǎng)膜退化中使用的核酸載體，所述核酸載體包含編碼人類光感受器蛋白的核酸。人類光感受器蛋白可如以上描述的。在此方面，優(yōu)選地，不使用細胞外基質(zhì)降解酶(即，引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治療期間單獨的、順序的或組合的施用)。

本發(fā)明還提供了擴大視網(wǎng)膜中的光感受器功能的方法，特別是在視桿和/或視錐細胞退化之后擴大視網(wǎng)膜中的光感受器功能的方法，所述方法包括如本文描述的向細胞提供光感受器功能。本發(fā)明提供i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶，用于在擴大視網(wǎng)膜中的光感受器功能的方法中使用，特別是在視桿和/或視錐細胞退化之后擴大視網(wǎng)膜中的光感受器功能的方法中使用，其中所述方法包括如本文描述的向細胞提供光感受器功能。

本發(fā)明還提供了對受試者恢復視力的方法，所述方法包括將包含編碼人類光感受器蛋白的核酸的核酸載體引入到眼睛內(nèi)。人類光感受器蛋白可如以上描述的。方法可包括視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)施用核酸載體到眼睛的內(nèi)視網(wǎng)膜細胞。在此方面，優(yōu)選地，方法不包括施用細胞外基質(zhì)降解酶。本發(fā)明提供了用于在對受試者恢復視力中使用的核酸載體，所述核酸載體包含編碼人類光感受器蛋白的核酸。人類光感受器蛋白可如以上描述的。在此方面，優(yōu)選地，不使用細胞外基質(zhì)降解酶(即，引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治療期間單獨的、順序的或組合的施用)。

本發(fā)明還提供了對受試者恢復視力的方法，所述方法包括如本文描述的向細胞提供光感受器功能。本發(fā)明提供i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶，用于在對受試者恢復視力的方法中使用，其中所述方法包括如本文描述的向細胞提供光感受器功能。

本發(fā)明還提供了治療受試者中的視網(wǎng)膜疾病的方法，所述方法包括將包含編碼人類光感受器蛋白的核酸的核酸載體引入到眼睛內(nèi)。人類光感受器蛋白可如以上描述的。方法可包括視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)施用核酸載體到眼睛的內(nèi)視網(wǎng)膜細胞。在此方面，優(yōu)選地，方法不包括施用細胞外基質(zhì)降解酶。本發(fā)明提供了用于在治療受試者中的視網(wǎng)膜疾病中使用的核酸載體，所述核酸載體包含編碼人類光感受器蛋白的核酸。人類光感受器蛋白可如以上描述的。在此方面，優(yōu)選地，不使用細胞外基質(zhì)降解酶(即，引入核酸而不共施用酶，其中共施用包括在同一治療期間單獨的、順序的或組合的施用)。疾病可以是視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；其他形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病。

本發(fā)明還提供了治療視網(wǎng)膜退化性疾病的方法，所述方法包括如本文描述的向細胞提供光感受器功能。因此，本發(fā)明提供了i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶，用于在治療如本文定義的疾病的方法中使用。疾病可以是視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；其他形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病。

向細胞提供光感受器功能意指，之前不具有光感受器能力或其的光感受器能力已經(jīng)完全地或部分地退化的細胞，在其中表達編碼光敏蛋白的外來核酸序列后，變成感光的。此類細胞在本文中可被稱作轉(zhuǎn)化的細胞，因為其在其中包含非天然的核酸。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化的視網(wǎng)膜細胞展現(xiàn)天然的感光細胞的一些或全部的光感受器能力。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化的細胞展現(xiàn)天然的視網(wǎng)膜光感受器細胞的至少相同或大體上相同的感光能力。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化的細胞展現(xiàn)比患病的或正在退化的天然的視網(wǎng)膜光感受器細胞高的感光能力。因此，轉(zhuǎn)化的細胞相比于來自同一來源、保持在同一條件下、未經(jīng)處理的退化的或患病的細胞，將優(yōu)選地具有增加的光感受器。轉(zhuǎn)化的細胞通過其中的外源核酸的存在可與天然的細胞區(qū)分。

擴大光感受器功能意指通過增加光感受器細胞諸如視桿或視錐細胞中的功能和/或通過向細胞提供光感受器功能，增加視網(wǎng)膜的光感受器功能。因此，視網(wǎng)膜相比于未用如本文描述的方法處理的視網(wǎng)膜，將具有增加的接收光信號并且傳送此類信號的能力。增加可以是任何量，優(yōu)選地到野生型水平。

恢復受試者中的視力意指，受試者相比于治療之前，例如使用如本文描述的視力測試，顯示改進的視力。恢復包括任何程度的改進，包括視力的完全恢復到完美的或接近完美的視力。

治療疾病意指施用如本文描述的核酸和細胞外降解酶以改善或減輕疾病的一種或更多種癥狀，所述疾病選自由以下組成的組：視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；另一種形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病。改善或減輕可導致外周或中央視力、和/或白天或夜間視力的改善。

本發(fā)明的方法包括將編碼光敏蛋白的核酸序列引入到眼睛的玻璃體腔內(nèi)。優(yōu)選地，方法包括使細胞與編碼光敏蛋白的核酸序列接觸。優(yōu)選地，細胞是視網(wǎng)膜細胞，優(yōu)選地給光雙極細胞、撤光雙極細胞、水平細胞、神經(jīng)節(jié)細胞和/或無長突細胞。

優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括靶向編碼光敏蛋白的核酸序列到眼睛的視網(wǎng)膜，優(yōu)選地到視網(wǎng)膜的非感光細胞，優(yōu)選地到給光雙極細胞、撤光雙極細胞、水平細胞、神經(jīng)節(jié)細胞和/或無長突細胞。因此，接觸細胞包括細胞的轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)導。

當施用酶時，酶不必內(nèi)化進入視網(wǎng)膜細胞，但可保持在玻璃體腔中或在視網(wǎng)膜中，在玻璃體腔中或在視網(wǎng)膜中酶降解細胞外基質(zhì)蛋白以改進核酸序列對視網(wǎng)膜細胞的接近。

本發(fā)明的方法優(yōu)選地在體內(nèi)進行。

編碼光敏蛋白的核酸序列和酶可被單獨地或順序地或組合地提供。當同時提供時(即組合地)，核酸序列和酶可作為被引入到玻璃體腔內(nèi)的單一的組合物被提供，或可作為單獨的組合物被提供但同時向玻璃體腔提供。如果單獨地提供，核酸序列和酶可被提供在單獨的組合物中，并且可被同時或順序提供。當順序提供時，可在核酸序列之前或之后提供酶，優(yōu)選地之前提供。在第四和第五方面中，酶不通過以上描述的方法被共施用。

當提供兩種或更多種酶時，它們可以以組合的單一劑量或以多種劑量被引入。酶劑量可以與核酸序列組合或另外單獨地被提供。當引入多種酶劑量時，任何一個或更多個劑量可以是組合的酶/核酸序列劑量。優(yōu)選的方法包括引入以下：i)組合的酶劑量和ii)核酸序列的順序劑量。在優(yōu)選的實施方案中，酶劑量包含肝素酶III和透明質(zhì)酸裂解酶。

任何合適的方法可被用于將核酸序列和酶引入到視網(wǎng)膜下或玻璃體腔。優(yōu)選的方法是注射。因此，核酸序列和/或酶的劑量可作為注射劑被提供。本發(fā)明的方法可包括將包含編碼人類光感受器蛋白的核酸序列的核酸載體視網(wǎng)膜下注射或注射進入玻璃體腔內(nèi)。優(yōu)選地，方法向細胞提供光感受器功能，例如以恢復視力，優(yōu)選地用于治療視網(wǎng)膜退化性狀況，例如視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；另一種形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎、和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病。

方法可包括單獨地、同時地或順序地將以下注射進入玻璃體腔內(nèi)：i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法包括注射包含以下的單一劑量進入眼睛的玻璃體腔內(nèi)：i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶。優(yōu)選地，方法包括注射包含以下的單一劑量進入眼睛的玻璃體腔內(nèi)：i)編碼視紫紅質(zhì)的核酸序列；和ii)酶肝素酶III和透明質(zhì)酸裂解酶。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了單一可注射劑量，所述單一可注射劑量包含i)編碼光敏蛋白的核酸序列和ii)細胞外基質(zhì)降解酶，用于引入眼睛的玻璃體腔內(nèi)以向細胞提供光感受器功能，例如以恢復視力，優(yōu)選地用于治療視網(wǎng)膜退化性狀況例如視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；另一種形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病。優(yōu)選地，本發(fā)明提供單一可注射劑量，所述單一可注射劑量包含i)編碼視紫紅質(zhì)的核酸序列；和ii)酶肝素酶III和透明質(zhì)酸裂解酶，用于引入眼睛的玻璃體腔內(nèi)以向細胞提供光感受器功能，例如以恢復視力，優(yōu)選地用于治療視網(wǎng)膜退化性狀況例如視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；另一種形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病。

當核酸序列和一種或更多種酶以多個(兩個或更多個)劑量被提供時，這些劑量可分隔合適的時間間隔，例如30秒到若干小時或1天或更多天。

每個劑量可包含有效量的核酸序列和/或酶。核酸序列的有效劑量可以在每治療方案1×10⁹到1×10¹⁴或7.5×10¹⁵，優(yōu)選地1×10¹¹到7.5×10¹³核酸序列(例如載體或病毒顆粒的數(shù)目)的范圍。酶可以以每只眼睛0.075-0.125單位或更多的劑量被提供。

本發(fā)明的方法可以包括診斷受試者視網(wǎng)膜退化性狀況，例如視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良、黃斑營養(yǎng)不良；另一種形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化、缺血性狀況、葡萄膜炎和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病的步驟。診斷步驟可包括視覺測試，例如瞳孔對光反射(PLR)測試、視敏度測試(LogMAR)、臨床診斷測試例如活組織顯微術(shù)/裂隙燈眼睛/視網(wǎng)膜臨床檢查；顏色視力測試、視野測試、對比/全磁場敏感度；電診法測試，包括例如EGG、VEP；成像、視網(wǎng)膜眼底照相、OCT和自適應光學激光掃描檢眼鏡(AOSLO)。其他合適的測試將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

本發(fā)明的方法可包括擴散要被治療的眼睛的瞳孔的步驟，例如通過施用擴瞳劑，例如托品酰胺和/或苯腎上腺素和/或環(huán)戊通。本發(fā)明的方法可包括接近視網(wǎng)膜的步驟，例如通過手術(shù)。

本發(fā)明的方法可包括監(jiān)測已為了視力的任何改善被治療的受試者的視力。視力的改善可以是以下的任何一個或更多個：增加的瞳孔對光反射(PLR)、增加的對比敏感度、增加的低頻或高頻閃光的分辨率和增加的移動圖像的檢測。另外，增加的光誘導的運動活性在動物諸如小鼠中可被改善。視力的改善可以是響應或檢測為10¹⁵-10¹³光子/cm²/s角膜輻射照度的光的能力。視力的改善可以包括給光持續(xù)的、給光瞬時的、撤光興奮的、撤光抑制的或給光-撤光響應。優(yōu)選地，監(jiān)測改善可以包括定量受試者主觀視覺經(jīng)歷或光反應的客觀量度的方法，例如瞳孔對光反射(PLR)測試、LogMAR視敏度、臨床檢查裂隙燈活組織顯微術(shù)；顏色視力測試、視野測試、對比/全磁場敏感度；電診法-ERG、VEP；成像：視網(wǎng)膜眼底照相、OCT、自適應光學激光掃描檢眼鏡(AOSLO)或迷宮導航任務。

可以每6小時、8小時、10小時、12小時或24小時，或每2天、3天、4天、5天監(jiān)測受試者。這可在1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月或一年或更長時間之后被重復。

術(shù)語“體內(nèi)”指自然環(huán)境(例如，動物或細胞中)和在所述自然環(huán)境(例如在受試者的身體上)中發(fā)生的過程或反應。

本發(fā)明是基于靶向編碼光敏蛋白的核酸序列到視網(wǎng)膜細胞，以補償視網(wǎng)膜中光感受器細胞的退化。核酸序列被靶向至的細胞是視網(wǎng)膜的細胞，其是活的并且能夠表達外來核酸序列。本文，視網(wǎng)膜細胞是視網(wǎng)膜的細胞，其是神經(jīng)或神經(jīng)元細胞并且能夠變興奮并傳送電信號。優(yōu)選地，靶視網(wǎng)膜細胞將能夠產(chǎn)生電信號并且起始信號級聯(lián)，導致信號向視神經(jīng)的傳送。優(yōu)選地，靶視網(wǎng)膜細胞是內(nèi)視網(wǎng)膜的細胞。靶細胞可以是視桿或視錐細胞，和/或可以是非光感受器細胞(即呈其天然形式的對光不響應的視網(wǎng)膜細胞)。靶視網(wǎng)膜細胞可以包括一種或更多種細胞類型，所述細胞類型選自由以下組成的組：視桿細胞、視錐細胞、給光雙極細胞、撤光雙極細胞、水平細胞、神經(jīng)節(jié)細胞、米勒細胞和/或無長突細胞。

因此，當靶視網(wǎng)膜細胞是靶向視網(wǎng)膜的給光雙極細胞、撤光雙極細胞、水平細胞、神經(jīng)節(jié)細胞和/或無長突細胞時，編碼光敏蛋白的核酸的表達可以被稱作異位表達。因此，本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括在非光感受器細胞中異位表達編碼光敏蛋白的核酸序列的方法。此類異位表達通過其中的異源光敏蛋白的表達，具有向細胞提供光感受器功能的作用。這用于增加觀察到退化的視網(wǎng)膜的感光能力。細胞外基質(zhì)降解酶與核酸序列的共施用用于改進核酸序列進入靶視網(wǎng)膜細胞的轉(zhuǎn)導。

細胞可以是原核的或真核的。其可以是細菌細胞諸如大腸桿菌(E.coli)，或可以是哺乳動物或非哺乳動物細胞，例如昆蟲細胞、酵母細胞、細胞系或無細胞表達系統(tǒng)，例如用于在產(chǎn)生本發(fā)明的載體或組合物中使用。靶視網(wǎng)膜細胞可以是給光雙極細胞、撤光雙極細胞、水平細胞、神經(jīng)節(jié)細胞和/或無長突細胞。

水平細胞是內(nèi)視網(wǎng)膜細胞，參與信號加工和反饋到光感受器細胞；雙極細胞是內(nèi)視網(wǎng)膜細胞并且在視桿/視錐細胞和無長突和/或神經(jīng)節(jié)細胞間通信；無長突細胞發(fā)現(xiàn)于內(nèi)視網(wǎng)膜并且允許在光感受器途徑和神經(jīng)節(jié)細胞間的通信；神經(jīng)節(jié)細胞是最內(nèi)部的視網(wǎng)膜細胞，其將信號從光感受器細胞傳遞到視神經(jīng)。

本文對細胞的提及包括細胞的后代。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的對細胞的修飾還發(fā)生在轉(zhuǎn)化的宿主細胞以后的代中。后代細胞可以不與最初的靶向細胞一致，但優(yōu)選地將也展現(xiàn)非天然的光敏蛋白的表達。

本發(fā)明可被用于治療特征在于眼睛中的光感受器細胞的退化的任何紊亂，通常所述退化足以導致視力的部分或完全喪失。可被本發(fā)明治療或改善的狀況的實例包括視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良(視網(wǎng)膜色素變性)，包括視桿營養(yǎng)不良、視桿視錐營養(yǎng)不良、視錐視桿營養(yǎng)不良、視錐營養(yǎng)不良和黃斑營養(yǎng)不良；其他形式的視網(wǎng)膜或黃斑退化(例如年齡相關(guān)的黃斑退化)、缺血性狀況、水腫(黃斑的或視網(wǎng)膜的)、葡萄膜炎、和由光感受器能力的喪失導致的任何其他疾病。

如本文使用的，術(shù)語“受試者”指任何哺乳動物或非哺乳動物。哺乳動物包括但不限于人類、脊椎動物諸如嚙齒類、非人類靈長類、牛、馬、狗、貓、豬、綿羊、山羊、長頸鹿、牦牛、鹿、駱駝、美洲鴕(llama)、羚羊、野兔和家兔。

本文對“一個(a)”或“一個(an)”的提及在其范圍內(nèi)包括單數(shù)和復數(shù)二者，即一個或更多個。

除非另外說明，每方面的特征和實施方案加以必要修改適用于本發(fā)明的其他方面。

遍及本說明書的說明和權(quán)利要求，單詞“包括”和“包含”和其的變化形式意指“包括但不限于”并且其不意圖(并且不)排除其他部分、添加劑、組分、整數(shù)或步驟。遍及本說明書的說明和權(quán)利要求，單數(shù)涵蓋復數(shù)，除非上下文另外要求。特別地，當使用不定冠詞時，說明書被理解為預期復數(shù)以及單數(shù)，除非上下文另外要求。

與本發(fā)明的特定的方面、實施方案或?qū)嵗?lián)合描述的特征(feature)、整數(shù)、特性(characteristic)、化合物、化學部分或基團要理解為適用于本文描述的任何其他方面、實施方案或?qū)嵗?，除非與其不相容。本說明書(包括任何所附的權(quán)利要求、摘要和附圖)中公開的全部的特征、和/或如此公開的任何方法或過程的全部的步驟，可以組合成任何組合，除了至少一些此類特征和/或步驟是互相排斥的組合之外。本發(fā)明不限于任何前述的實施方案的細節(jié)。本發(fā)明擴展到本說明書(包括任何伴隨的權(quán)利要求、摘要和附圖)中公開的特征的新的任何一個、或新的任何組合，或到如此公開的任何方法或過程的步驟的新的任何一個、或新的任何組合。

實施例

在本研究中，研究了通過使用玻璃體內(nèi)AAV基因治療，在存活的內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中表達人類視桿視蛋白，對失明的rd1視網(wǎng)膜恢復光響應性的可行性。研究了非靶向的(神經(jīng)元非選擇性的)和靶向的(對ONBP細胞選擇性的)遞送二者。此外，檢查了體內(nèi)恢復的響應的性質(zhì)和經(jīng)治療的失明小鼠解析更復雜的圖像處理的能力，該圖像處理包括全視野閃光、對比檢測和自然場景。發(fā)現(xiàn)非靶向的和靶向的異位視桿視蛋白二者通過包括給光和撤光途徑二者的多種視覺編碼，成功地恢復了視力?；謴偷捻憫粋魉驮竭^視網(wǎng)膜進入CNS視覺途徑，并且在正常視錐(和視桿)視力的光強范圍下以及在光適應條件下發(fā)揮功能。響應是足夠穩(wěn)健的以在室內(nèi)空間照明的等效照度下引起經(jīng)治療的小鼠的光誘導的運動行為。此外，結(jié)果顯示，具有特異地靶向的給光雙極細胞的小鼠能夠解析更復雜的視覺功能，包括全視野閃光、對比檢測和自然電影場景的空間模式和物體運動的特征變化。

1、眼內(nèi)注射和經(jīng)由AAV的基因遞送(圖1)

本研究中使用了成年C3H/HeJ(rd1)小鼠。具體地，rd1小鼠中的無義突變pe65b導致通過p90的光感受器的完全喪失(Crater-Dawson等,1978,Farber db等1994)。(重要提示，突變不影響視紫紅質(zhì)自身)。為了回答視桿視蛋白是否能夠在體內(nèi)在光感受器外部表達，將基因表達盒玻璃體內(nèi)注射進入成年rd1小鼠(圖1A)。考慮到此方法的轉(zhuǎn)化潛能，使用了臨床安全的AAV2/2載體和視桿視蛋白的人源化版本。采用玻璃體內(nèi)注射以實現(xiàn)更廣泛的視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)導并且使與載體的可選的視網(wǎng)膜下遞送相關(guān)的可能的并發(fā)癥最小化。視網(wǎng)膜下方法通常導致轉(zhuǎn)導定位在注射位點。共注射優(yōu)化的糖苷酶組合以增強轉(zhuǎn)導并且允許載體更深地透入視網(wǎng)膜。天然光感受器外部的哪種細胞類型(如果存在)將表達視桿視蛋白是未知的。首先使用強的泛-神經(jīng)元啟動子CAG研究了非靶向的表達。

注射后四到六個月收獲視網(wǎng)膜，并且用針對人類視桿視蛋白的抗體免疫標記視網(wǎng)膜冷凍切片。使用熒光顯微術(shù)證實表達。視桿視蛋白在光感受器外部表達良好，如由強烈標記的細胞體證實的(圖1B)。表達定位到質(zhì)膜并且在RGC層(圖1C)和INL(圖1D)二者中觀察到?？赡芡ㄟ^非選擇性啟動子，INL中的若干不同的細胞類型被轉(zhuǎn)導，包括一些水平和無長突細胞，盡管INL中轉(zhuǎn)導的細胞體大體上具有雙極細胞的特征(圖1D)。視桿視蛋白的表達是泛-視網(wǎng)膜的，雖然在INL中由于可變深度的透入，其是不完整的。相比之下，在我們的對照PBS注射組，未看到熒光。另外，用針對視桿視蛋白的抗體處理的未注射的野生型視網(wǎng)膜在光感受器外部切片中顯示清楚的熒光，指示抗體對視桿視蛋白特異，而無脫靶標記。

結(jié)果：

瞳孔測量法：

圖2.視紫紅質(zhì)處理之后瞳孔對光反射的恢復。以中性密度濾光片ND4(最暗)到ND0(最亮)在10秒白光期間最大瞳孔收縮的輻射照度響應曲線。視紫紅質(zhì)處理的眼睛(Rd RHO)相比于GFP注射的眼睛(Rd GFP)，顯示視覺敏感度的顯著改進。顯示用PBS/酶混合物注射的野生型C57小鼠的數(shù)據(jù)(WT PBS)用于比較。數(shù)據(jù)被對即將開始光之前的瞳孔尺寸標準化。數(shù)值是平均值±SEM，其中n指示檢查的眼睛的數(shù)目。

體內(nèi)電生理學：

圖3.來自體內(nèi)電生理學記錄的數(shù)據(jù)。許多記錄通道(sig)的事件后直方圖的代表性樣品，顯示LGN細胞對2秒的405nm光的刺激的平均激發(fā)率，該刺激以遞增的強度呈遞到對側(cè)的視紫紅質(zhì)處理的眼睛(圖3A-ND2、B-ND1、C-ND0；ND2＝最暗、ND0＝最亮)。許多通道(例如sig50、sig52在ND0和ND1)顯示穩(wěn)健的“快速開始”光響應，當打開光后，具有“給光峰”且當關(guān)閉光時具有“撤光峰”。刺激對側(cè)的眼睛后，觀察到的響應明顯地與通常存在于rd1小鼠LGN中的天然的光響應不同(圖3)。這些天然的響應從視紫紅質(zhì)或GFP處理的眼睛二者觀察到，并且顯示典型的“慢開始”持續(xù)的響應(來自視黑素視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，圖3D)和非常瞬時的快速響應(來自存活的視錐光感受器，圖3E)。因此，“恢復的”響應(圖3A-C)來自具有誘導的感光性質(zhì)的視網(wǎng)膜細胞(視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)或雙極細胞)，所述誘導的感光性質(zhì)來自視紫紅質(zhì)的異位表達。

MEA體外記錄：

圖4.來自體外MEA記錄的數(shù)據(jù)。許多記錄通道(sig)的事件后直方圖的代表性樣品，顯示視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞對2秒的405nm光的刺激的平均激發(fā)率，該刺激以遞增的強度應用到分離的視網(wǎng)膜(圖4A-ND2、B-ND1、C-ND0；ND2＝最暗、ND0＝最亮)。許多通道顯示穩(wěn)健的“快速開始”光響應，一些通道(例如sig35、sig36在ND0和ND1)當打開光后顯示“給光峰”且當關(guān)閉光時顯示“撤光峰”。光刺激之后，觀察到的響應明顯地與通常存在于rd1小鼠視網(wǎng)膜中的天然的光響應不同(圖5)。這些天然的響應從視紫紅質(zhì)或GFP處理的眼睛二者觀察到，并且顯示典型的“慢開始”持續(xù)響應(來自視黑素視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞，例如圖5，sig37)。因此，新的響應(圖4A-C)來自具有導致的感光性質(zhì)的視網(wǎng)膜細胞，所述感光性質(zhì)來自視紫紅質(zhì)的異位表達。

恢復視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞中的光引起的活性-體外視桿視蛋白響應的功能評價

下一步，期望證實，異位地表達的視桿視蛋白能夠驅(qū)動失明視網(wǎng)膜中的功能性光響應。將視網(wǎng)膜移植物安裝到多電極陣列上以測試光引起的活性。來自rd1小鼠(4-6月齡)的視桿視蛋白注射的(CAG-hRho)視網(wǎng)膜顯示光響應細胞，所述光響應細胞當用廣譜白光的以15.4log光子/cm2/s 2秒全視野閃光刺激后，具有穩(wěn)健的初始激發(fā)率。然而，若干重復的展示后，光引起的活性減少到低頻尖峰，表明了褪色效應。對于9-順式的內(nèi)源供應被快速耗盡的體外制品，這不令人驚奇。然而，向制品中添加9-順式引起穩(wěn)健的神經(jīng)元活性伴隨強的可重復的響應。另外，在光響應細胞的群體中(n＝6視網(wǎng)膜)注意到多種響應譜，包括給光持續(xù)的、給光瞬時的和撤光響應。與之相比，GFP注射的(CAG-GFP)年齡匹配的對照視網(wǎng)膜顯示在展示相同的光刺激之后，無光引起的活性，與不存在光感受器一致(n＝2視網(wǎng)膜)。(在視桿視蛋白處理的視網(wǎng)膜中以較低的光強度(14.4log光子/cm2/s圖1H和13.4log光子/cm2/s)驅(qū)動光反應也是可能的)相比于使用比激活天然的視錐視力必需的光強高至少5-6log單位的其他光遺傳策略(Gaub,Lagali等)，代表光敏感性的顯著的改進。

異位的視桿視蛋白介導的響應被傳送到LGN-體內(nèi)恢復的響應的表征(圖3)

由于視桿視蛋白褪色，體外實驗沒有發(fā)色團(9-順式視黃醛)的恒定的外源供應是問題，在體內(nèi)測試神經(jīng)元活性以確定在完整的視網(wǎng)膜中是否將存在足夠的視黃醛以允許發(fā)色團再循環(huán)并且防止褪色。另外，研究了恢復的響應是否足夠穩(wěn)健以激活在正在退化和重塑視網(wǎng)膜的情況下的較高的視覺中心。來自背外側(cè)膝狀核dLGN的神經(jīng)元響應被同時記錄自兩個半球，其中一只眼睛之前用視桿視蛋白處理而另一只用GFP注射充當內(nèi)部對照。dLGN是腦的主要視網(wǎng)膜接受部分并且包含向視覺皮層分程傳遞信號的神經(jīng)元。研究來自dLGN(RGC的第一個突觸連接)的響應，以獲得恢復的響應的性質(zhì)的最好想法。以15.4log光子/cm2/s的410nm光的2秒全視野閃光之后，相比于內(nèi)部對照(4)，發(fā)現(xiàn)dLGN中的光響應的數(shù)目(157)的顯著地增加。根據(jù)客觀標準，在Neuroexplorer(Nex Technologies)中使用刺激后時間直方圖(PSTH)分析鑒定光響應細胞，其中在刺激起始或抵消之后，相比于基線，平均激發(fā)率必須跨95％CI。用于2秒刺激的PSTH時間間隔是-2秒到5秒，并且箱(bin)尺寸250ms。排除導致假陽性的明顯的偽跡。生成“熱圖”以包括來自每個組的全部的光響應細胞，并且根據(jù)在2秒刺激展示的最初1秒期間持續(xù)的響應的幅度將響應排序。綠色(+1)代表高激發(fā)率且粉色/紫色(-1)代表低激發(fā)率。圖3F清楚地描繪了恢復的響應的多種性質(zhì)，包括持續(xù)的、瞬時的、給光和撤光響應，如在WT視網(wǎng)膜中通常發(fā)現(xiàn)的。與之相比，在對照組中發(fā)現(xiàn)的光響應細胞(n＝4)都是低起始給光持續(xù)的，可能起源于天然的ipRGC。發(fā)現(xiàn)褪色對于體內(nèi)光響應不是問題，其在許多重復的試驗間顯示穩(wěn)健的激發(fā)。

為了捕獲在單一的單位水平上看到的(但測試的全部的視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn))恢復的響應的多樣性，單獨的響應通過其刺激后時間直方圖(PSTH)和相應的試驗箱計數(shù)(TBC)被系統(tǒng)地研究。考慮到一些細胞被光打開激發(fā)(給光響應)，一些被光打開抑制(撤光抑制響應)，一些被光關(guān)閉激發(fā)(撤光興奮的)且一些被光打開和關(guān)閉二者興奮(給光-撤光細胞)，在細胞群體中的平均將是困難的。在治療的眼睛中引起持續(xù)的(10秒和2秒光步驟，圖3G)和更瞬時的響應(2秒光步驟，圖3H)二者，與那些來自WT視網(wǎng)膜的相當(插圖)。除了給光響應，我們還發(fā)現(xiàn)許多撤光響應(圖3I)和一些給光-撤光響應(圖3J)。在光響應細胞的群體中，發(fā)現(xiàn)99/157(63.1％)的給光細胞、46/157(29.3％)的撤光細胞和(7.6％)的給光-撤光細胞(圖3E)。這些細胞被寬泛地分類成給光持續(xù)的細胞(51/157；32.5％)、給光瞬時的細胞(48/157；30.6％)、撤光興奮的細胞(29/157；18.5％)、撤光抑制的細胞(17/157；10.8％)和給光-撤光細胞(12/157；7.6％)。在恢復的響應中，平均激發(fā)率范圍在20-100Hz。發(fā)現(xiàn)響應具有短潛伏期(在50-100ms內(nèi)開始-2D，細胞1；2E細胞1)和較長的潛伏期(在500ms內(nèi)開始-2D，細胞3)。對于大多數(shù)持續(xù)的響應，激發(fā)率快速地返回到基線(關(guān)掉光刺激的幾百毫秒，2D細胞3)，盡管發(fā)現(xiàn)一些細胞具有更持久的激發(fā)(關(guān)掉光之后幾秒，2D細胞2)。(與其他研究相似，lagali，flannery，wt響應)

恢復的LGN響應的敏感度和對比特征

目前基于ChR(10¹⁵-10¹⁷光子/cm²/s)的光遺傳策略和光合成的開關(guān)(10¹⁵-10¹⁸光子/cm²/s)需要高光強用于激發(fā)，并且這些光強的長期暴露對視網(wǎng)膜可能是有害的。在我們的實驗中，恢復的神經(jīng)元在動態(tài)范圍的等價于自然日光照度(10¹³-10¹⁵光子/cm²/s)的光強下操作(圖6)。重要地，在這些光強度中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)健的、可重復的持續(xù)的和瞬時的、給光和撤光響應，指示系統(tǒng)是多么敏感。在較低的光強(10¹²和10¹¹)也發(fā)現(xiàn)一些光響應，盡管這些光響應是不容易/良好/不太可重現(xiàn)的(數(shù)據(jù)未顯示)。當刺激未處理的rd1視網(wǎng)膜時，在低于10¹⁵光子/cm²/s的水平，未記錄到令人信服的光響應。

到目前為止，對新的光遺傳工具的研究使用來自黑暗的全視野光步驟都表征了在暗適應條件下恢復的響應。盡管這增加了引起強的神經(jīng)元響應的可能性，這些條件在真實的生活場景中很少存在。在更加自然的條件下在光適應狀態(tài)測試系統(tǒng)。在光適應條件、邁克爾遜對比96％下，記錄了穩(wěn)健的、高振幅、可重復的響應(圖6B)。未發(fā)現(xiàn)響應于對照rd1視網(wǎng)膜光適應刺激的對比檢測細胞。

(低對比(66％和33％))，也引起可測量的響應，盡管這些響應在重復的試驗中不是高度可重現(xiàn)的(參見補充/或未顯示)。

使用細胞特異的啟動子限制視桿視蛋白的異位表達

用視桿視蛋白的未限制的異位表達生成的視覺編碼的多樣性是令人鼓舞的。然而，決定研究，如果視桿視蛋白的表達僅限于“給光途徑”，是否將存在對此編碼的任何變化。因此，使用細胞特異的Grm6啟動子在給光雙極細胞中表達視桿視蛋白(圖7A-C)。

圖8-10顯示了已用靶向ONBP細胞的視桿視蛋白處理的小鼠在多種光條件下恢復的dLGN光響應。表明敏感度下降到正常光條件。引用的輻射照度的圖用于角膜測量。視網(wǎng)膜輻射照度將低大約一個數(shù)量級。

在用410nm的光以15.4log光子/cm²/s全視野閃光(2秒)刺激之后，相比于內(nèi)部對照(n＝6)，來自這些小鼠的體內(nèi)LGN記錄還顯示光響應的數(shù)目顯著增加(n＝100)。再次，在視桿視蛋白處理組中觀察到一系列的響應譜-持續(xù)的、瞬時的、給光和撤光(興奮的和抑制的)。相比于非靶向的響應，來自靶向的ON-BP細胞的光響應更均勻地分布在給光和撤光類型之間。在光響應細胞的群體中，我們觀察到48/84(57.1％)的給光響應和36/84(42.9％)的撤光響應。這些細胞被寬泛地細分成給光持續(xù)的細胞(34/84；40.5％)、給光瞬時的細胞(14/84；16.6％)、撤光興奮的細胞(6/84；7.1％)和撤光抑制的細胞(30/84；35.7％)?；謴偷墓忭憫母敿毜谋碚黠@示快的給光瞬時的、給光持續(xù)的和撤光瞬時的響應(在幾百毫秒內(nèi)起始)和較慢的撤光抑制響應(在幾秒內(nèi)起始)。這些延遲的穩(wěn)健的撤光抑制響應是靶向的視桿視蛋白表達的特異性特征(4G細胞2和3)。

下一步研究給光雙極驅(qū)動響應的敏感度和對比檢測是否與我們的非靶向組類似。發(fā)現(xiàn)給光雙極驅(qū)動響應的敏感度譜與非選擇性/非靶向組相當并且在13.4log光子/cm²/s的水平記錄光響應(圖4H)。類似的，在光適應條件中，我們還發(fā)現(xiàn)細胞對邁克爾遜對比水平(96％，圖4I)的響應。

(在較低的對比水平(66％和33％)記錄了較低的振幅和較少的可重現(xiàn)的響應，類似于從非靶向的視網(wǎng)膜觀察到的那些(數(shù)據(jù)未顯示))。

光誘導的行為響應

下一步，研究被非靶向的和靶向的異位視桿視蛋白二者的轉(zhuǎn)導驅(qū)動的、傳送到腦的視覺信息是否能夠恢復失明的rd1小鼠中喪失的視覺功能。首先，測試了對光的簡單的行為響應，瞳孔對光反射(PLR)。此反射通常由表達視黑素的ipRGC介導(Lucas RJ等Science.2003Jan 10；299(5604):245-7.)并且在在光感受器退化之后的rd1小鼠中保持高閾值(Lucas RJ,等Nat Neurosci.2001Jun；4(6):621-6.，Lin B,Proc Natl Acad Sci U S A.2008Oct 14；105(41):16009-14.)。在以一系列光強的10秒白光期間，記錄用于最大瞳孔收縮的輻射照度響應曲線(圖11A)。在注射GFP的對照小鼠中發(fā)現(xiàn)受損的PLR，確定了之前的發(fā)現(xiàn)。非限制的視桿視蛋白的表達恢復PLR至與野生型行為相當(圖11A-D)。然而，對于靶向的表達，PLR仍然大大受損(圖11A-C)。

然后，對恢復的光遺傳視覺編碼是否能夠在行為水平支持更復雜的視覺區(qū)分提出疑問。通過經(jīng)典的開放視野光/暗盒測試激發(fā)(Bourin M,M(2003),Eur J Pharmacol 463(1-3):55-65.)，測量響應多種人工和自然光刺激的運動行為。將小鼠放置在開放視野的改進的光/暗盒中，并且允許在兩個場地之間經(jīng)由在分隔墻中的開口自由移動。每個場地外部的平面屏幕計算機顯示器被用于顯示多種視覺刺激。我們的刺激的光強等同于室內(nèi)光照水平(范圍從對于黑屏的0.00132W/m2到對于白屏的0.1 16W/m2)。首先測試簡單的暗-光區(qū)分。在初始適應于新的環(huán)境(3min)之后，允許小鼠在暗中探索盒子持續(xù)5分鐘(黑屏輻射亮度＝0.004072Wsr^-1m^-2；輻射照度＝0.00132W/m2)，隨后在白光中5分鐘(白屏輻射亮度＝0.06526Ws r^-1m^-2；輻射照度＝0.116W/m2)。首先在野生型小鼠中評價運動測定，其中活性圖顯示在從暗到光轉(zhuǎn)變的最初30秒中運動顯著增加(圖12，暗中的平均距離＝24.46±7.00cm；光中的平均距離＝147.5±5.09cm；p＝0.0066)。在此暗-光轉(zhuǎn)變期間，失明的rd1小鼠未顯示顯著的活動變化(暗中的平均距離＝91.75±7.70cm；光中的平均距離＝100.2±8.145cm；p＝0.5541)。然而，對于處理組rd1-hRho-CAG和rd1-hRho-grm6，活性圖顯示了當打開光時，運動活性的突然減少。此光誘導的“凍結(jié)”行為在從暗到光轉(zhuǎn)變的最初30秒中是顯著的(對于rd1-hRho-CAG，暗中的平均距離＝98.40±16.12cm；光中的平均距離＝69.73±13.32cm；p＝0.0070；對于rd1-hRho-grm6，暗中的平均距離＝112.9±21.47cm；光中的平均距離＝68.37±16.81cm；p＝0.0224)。

在確定處理的小鼠能夠區(qū)分光和暗之后，測試它們響應于更動態(tài)的視覺刺激的行為。將在光適應條件(暴露于灰色屏幕光5分鐘，輻射亮度＝0.03342Wsr^-1m^-2；輻射照度＝0.0663W/m2)中的運動活性與在4Hz的全視野閃光比較(圖13A)。Rd1-hRho-grm6組能夠解析此閃光頻率(灰色中的平均距離＝151.3±34.95cm；閃光中的平均距離＝83.7±13.76cm；p＝0.0466)，而rd1-hRho-CAG和未處理的失明小鼠未顯示行為變化(圖13B)。然后，我們在較低的頻率以2Hz測試rd1-hRho-CAG，并且發(fā)現(xiàn)它們確實響應(此系統(tǒng)的可能限值)(數(shù)據(jù)未顯示)。

由于靶向的Rd1-hRho-grm6小鼠具有以全視野閃光的最好響應，此組被進一步測試，以觀察小鼠是否能夠區(qū)分更細微的光變化并且檢測對比。實際上，顯示小鼠以不同的邁克爾遜對比響應(圖14；以68.6％對比，灰色中的平均距離＝179.3±17.34cm；閃光中的平均距離＝127.2±16.29cm；p＝0.0238和以100％對比，灰色中的平均距離＝151.3±34.95cm；閃光中的平均距離＝83.7±13.76cm；p＝0.0466)。

在Rd1-hRho-grm6小鼠中還在10Hz和20Hz的較高的閃光頻率觀察。在20Hz未發(fā)現(xiàn)響應，但在10Hz有令人信服的響應(圖15，在10Hz，灰色中的平均距離＝93.64±26.39cm；閃光中的平均距離＝162.6±18.57cm；p＝0.039)。

對自然場景的響應

已經(jīng)描述了使用多種人工刺激的恢復的響應的特征，開始要確定在具有空間性質(zhì)的更自然的場景下，異位視桿視蛋白是否能夠在腦水平驅(qū)動視覺響應。為了這個目的，向Rd1-CAG-hRho和Rd1-grm6-hRho麻醉的小鼠投射自然電影(小鼠圍繞開放的場地移動)，并且記錄來自LGN的體內(nèi)響應。30秒的電影被重復地呈現(xiàn)超過30分鐘階段，允許鑒定經(jīng)許多展示具有可重現(xiàn)的激發(fā)模式的細胞。在刺激非靶向和靶向的視網(wǎng)膜之后，觀察到激發(fā)率被電影場景的特定特征調(diào)節(jié)的單獨的神經(jīng)元(圖16A到C)；無來自對照眼睛的“電影響應”神經(jīng)元。

然后，研究小鼠是否能夠看到自然場景？在開放視野行為運動測定中，向測試盒中的小鼠呈現(xiàn)特征為隱約可見的貓頭鷹的自然電影。實際上，發(fā)現(xiàn)rd1-hRho-grm6小鼠對隱約可見的貓頭鷹響應(圖6C)，在從均勻光到電影場景的30秒轉(zhuǎn)變中，顯示運動行為的顯著變化(圖14；灰色中的平均距離＝67.68±22.05；自然電影中的平均距離＝110.2±19.44；p＝0.0079)。有趣的是，它們不展現(xiàn)凍結(jié)行為，但確實增加它們的運動活性，可能試圖逃脫捕食者。在失明的Rd1小鼠或Rd1-hRho-CAG小鼠中，未發(fā)現(xiàn)響應電影的行為變化。

材料和方法

動物

這些小鼠是重度和快速形式的視網(wǎng)膜退化的模型，類似于人類中的一些形式的視網(wǎng)膜色素變性(McLaughlin等,1993)。全部的動物實驗根據(jù)英國內(nèi)政部針對實驗動物的護理和使用條例、英國動物法案(科學程序)和曼徹斯特大學的動物福利團體進行。在12小時光：暗循環(huán)下保持動物，并且任意供應食物和水。

經(jīng)由AAV的基因遞送

在使用異氟烷的一般麻醉下，在六周齡的小鼠中進行眼內(nèi)注射。在注射之前，用托品酰胺和苯腎上腺素擴散瞳孔。將客戶定制的超細針(Hamilton RN針34gauge，由ESSLAB供應)附接到5μl Hamilton玻璃注射器，并且以45度傳遞通過平坦部進入玻璃體腔，小心地避開晶狀體和血管。在手術(shù)顯微鏡下通過封片眼睛直接查看針尖，進行注射。在強的遍在的泛-神經(jīng)元啟動子(CAG)或給光雙極細胞特異的(Grm6)啟動子的控制下表達視桿視蛋白或GFP的rAAV血清型2(rAAV2/2，或簡單的AAV2)載體從Vector Biolabs,Philadelphia,USA獲得。CAG啟動子是CMV早期增強子和雞β肌動蛋白啟動子的融合體。Grm6啟動子是小鼠的Grm6基因的200個堿基對的增強子序列和SV40真核啟動子的融合體，所述Grm6基因編碼給光雙極細胞特異的代謝型谷氨酸受體mGluR6。每種情況中，感興趣的基因側(cè)翼為反向末端重復(ITR)結(jié)構(gòu)域且被多腺苷酸化信號序列(polyA)和土撥鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件(WPRE)穩(wěn)定。

每只小鼠的一只眼睛用視桿視蛋白表達構(gòu)建體(用于非靶向表達的AAV2-ITR-CAG-hRho-polyA-WPRE-ITR或用于靶向表達的AAV2-ITR-grm6-hRho-polyA-WPRE-ITR)注射，且另一只用GFP表達構(gòu)建體(用于非靶向表達的AAV2-ITR-CAG-GFP-polyA-WPRE-ITR或用于靶向表達的AAV2-ITR-grm6-GFP-polyA-WPRE-ITR)注射。每只眼睛接收含有1×10¹³基因組計數(shù)的3μl的病毒構(gòu)建體與含有0.125單位的肝素酶III(E.C.4.2.2.8)和透明質(zhì)酸裂解酶(E.C.4.2.2.1)的0.5μl的糖苷酶溶液的組合，所述肝素酶III(E.C.4.2.2.8)和透明質(zhì)酸裂解酶(E.C.4.2.2.1)從Sigma-Aldrich,Dorset,UK獲得。在注射當天通過將酶溶解在無菌的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中新鮮配制酶溶液。在臨近眼睛注射前在注射器中混合載體和酶，并且以單一的組合的注射液提供。

組織處理、免疫組織化學和生物成像

對于組織處理，將取回的視杯(retrieved eyecup)(載體注射后>6周)在4℃固定在4％的多聚甲醛(PFA)中持續(xù)24小時。然后，在PBS中洗滌組織，并且在4℃進一步固定在PBS中的30％蔗糖中過夜。將固定的眼睛冷凍保護在最佳切片溫度培養(yǎng)基(Raymond A Lamb Ltd.,Eastbourne,UK)中并且在-80℃冷凍直到進一步處理。在恒冷切片機(Leica,Microsystems)上水平地通過眼杯以8-10μm厚從腹側(cè)向背側(cè)切冷凍保護的視網(wǎng)膜部分，以使得每個切片含有完整的視網(wǎng)膜的鼻顳橫截面。在每個載玻片上收集10到12個含有整個視網(wǎng)膜的代表性截面的切片。將載玻片儲存在-80℃。

關(guān)于免疫組織化學，將載玻片從冰箱取出并且允許在室溫空氣干燥持續(xù)1小時。通過在室溫將載玻片浸沒在具有0.2％Triton的PBS中持續(xù)20分鐘，使切片被透化處理。這之后，將切片在室溫用含有10％驢血清(D9663；Sigma,UK)的具有0.2％Triton X-100的PBS背景封閉持續(xù)1小時。在室溫施加在封閉緩沖液(具有0.2％Triton X-100和2.5％驢血清的PBS)中1:200稀釋的一抗(兔抗人視紫紅質(zhì)，Abcam,Ab112576)持續(xù)3小時。在tween 0.05％PBS中洗滌四次持續(xù)10分鐘之后，在室溫將切片與在具有0.2％Triton X-100和2.5％驢血清的PBS中1:200稀釋的二抗(Alexa546驢抗兔IgG(H+L)抗體,Life technologies,貨號:1504518)孵育持續(xù)2小時。然后，在0.05％tween PBS中洗滌載玻片四次持續(xù)10分鐘，隨后是用dH₂O的一次最后洗滌。當移除過量的液體之后，用含有DAPI的熒光封固培養(yǎng)基(Vectashield,Vector Laboratories Ltd.,Peterborough,UK)封固載玻片來染色細胞核。

關(guān)于生物成像，在Olympus BX51直立顯微鏡下使用×4、×10和×20Plan Fln物鏡分析切片，并且使用Coolsnap ES相機(Photometries,Tucson,AZ)通過MetaVue軟件(Molecular Devices Ltd.Wokingham,UK)捕獲。在特定的帶通濾波器組下獲取圖像，并且顏色組合的圖像被用于使用ImageJ的進一步處理。

多電極陣列記錄

對視桿視蛋白處理的rd1小鼠(n＝6)和GFP注射的rd1對照(n＝2)進行多電極陣列記錄。將摘除的眼睛放置在由碳氧化的(carboxygenated)(95％CO₂/5％CO₂)aCSF(人工腦脊液，濃度以nM計：118NaCl、25NaHCO₃、1NaH₂PO₄、3KCl、1MgCl₂、2CaCl₂、10C₆H₁₂O₆、0.5L-谷氨酰胺)填充的皮氏培養(yǎng)皿中。然后在漫射紅光中在解剖顯微鏡下小心地分離視網(wǎng)膜，并且以神經(jīng)節(jié)細胞在下安裝到60通道或256通道多電極陣列上(Multi Channel Systems,Reutlingen,Germany)。視網(wǎng)膜移植物在適當?shù)奈恢门c加重的(weighted)透析膜偶聯(lián)，并且使用蠕動泵(SCI400,Watson Marlow,UK)以2.2ml每分鐘用碳氧化的aCSF持續(xù)灌注，并且使用調(diào)節(jié)用于aCSF流入的內(nèi)聯(lián)加熱器的Universal Serial Bus溫度控制器被保持在32℃。通過定制的光引擎源(Lumencor,USA)呈現(xiàn)光刺激(白光)。在最亮強度，LED為@15Log光子/cm²/s。被寫在LabVIEW(版本8.6,National Instruments,TX,USA)中的程序控制的National Instruments卡(USB-6229)通過改變LED輸出和調(diào)整含有中性密度濾光片(Cairn Research Ltd)的濾光輪，被用于控制刺激持續(xù)時間和強度。以具有20秒刺激間間隔的2秒的光脈沖遞送ND0(15Log光子/cm²/s)到ND4的刺激持續(xù)20-30個重復。在獲得自發(fā)的和引起的活性二者期間，在25kHz頻率對數(shù)據(jù)取樣并且記錄該數(shù)據(jù)用于使用Offline Sorter(Plexon)離線分選。移除全部通道共同的明顯的偽跡后，主組分分析被用于區(qū)分單一單位，所述單一單位被鑒定為主組分空間內(nèi)的尖峰的不同的簇，在峰間間隔分布中具有明顯的休復期。分選尖峰，然后使用Neuroexplorer(Nex Technologies)和MATLAB R2010a(The Mathworks Inc.)進一步分析單一單位數(shù)據(jù)。

瞳孔測量法：

對注射后六到八周的野生小鼠(6)、rd1-CAG-GFP小鼠(n＝16)、rd1-CAG-hRho小鼠(n＝10)和rd1-grm6-hRho小鼠(n＝6)進行瞳孔對光反射(PLR)。記錄之前，使小鼠暗適應持續(xù)1小時。光刺激通過石英鹵素燈提供并且沿著光纖束傳送到整合的反射球，該整合的反射球在小鼠角膜提供均勻的光。在遠紅外條件下用配備有10×微距鏡頭和遠紅外濾光片的遠紅外敏感的CCD相機，在未麻醉的輕輕握持頸部的小鼠中記錄交感PLR。介入快門控制刺激時機。單一試驗持續(xù)20秒：5秒撤光、10秒給光、5秒撤光。光的強度被中性密度(ND)濾光片控制，并且小鼠經(jīng)歷以遞增強度系列的白光暴露，其中單獨的試驗被間隔至少5分鐘。用于ND的光子發(fā)射值的log光子/cm²/s范圍為在ND0的15.85到在ND5的10.85。通過使用Virtual Dub和ImageJ軟件將瞳孔響應從視頻圖像定量，并且數(shù)據(jù)被對即將開始光之前的瞳孔區(qū)域標準化。

體內(nèi)電生理學：

對野生型小鼠(n＝2)、rd1-CAG-hRho小鼠(n＝7)和rd1-grm6-hRho(n＝5)進行體內(nèi)電生理學。注射后六周并且測量PLR之后，用尿烷麻醉小鼠(腹膜內(nèi)注射1.7g/kg；30％w/v；Sigma Aldrich,Poole,UK)。將動物約束在立體定位架上(SR-15M；Narishige International Ltd,London,UK)，并且經(jīng)由恒溫加熱毯(Harvard Apparatus,Edenbridge,UK)使核心身體溫度保持在37℃。用阿托品擴散瞳孔，并且施加礦物油(Sigma Aldrich)來保持角膜濕度。根據(jù)小鼠地圖集(Paxinos和Franklin,2001；孔中心＝前囪:-2.46mm；中線:-2.8)，使用立體定位坐標直接地在每個外側(cè)膝狀體核(LGN)上方進行小的穿顱術(shù)和硬腦膜切開(～1mm²)。32通道電極(NeuroNexus Technologies Inc.,Ml,USA)被引入到孔中心的每個LGN(中間柄：相對于中線-2.5mm；深度：以18度角相對于腦表面-2.6mm)用于從兩個LGN同時記錄。在記錄之前，使小鼠保持30min來暗適應，并且以允許神經(jīng)元活性在電極插入后穩(wěn)定。由UV LED(Thorlabλmax:405nm)提供視覺刺激，并且視覺刺激經(jīng)由光纖向遞送至為特定目的制作的緊密定位到每個眼睛上的眼睛視錐以使任何潛在的光泄露最小化。被寫在LabVIEW(版本8.6,National Instruments,TX,USA)中的程序控制的National Instruments卡(USB-6229)通過改變LED輸出和調(diào)整含有中性密度(ND)濾光片(Cairn Research Ltd)的濾光輪，被用于控制刺激持續(xù)時間和強度。在最亮強度(ND0)，LED是在47W/m2或15.4log光子/cm²/s的用于視桿視蛋白的有效流量。使用具有被20×增益AC偶聯(lián)的探頭(Plexon,TX)信號放大，隨后提供3500×總增益的預放大條件的Recorder64系統(tǒng)(Plexon,TX,USA)，獲得數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)被高通(300Hz)過濾，并且時間標記的神經(jīng)波形被同時從全部的通道以40kHz的頻率數(shù)字化。然后，儲存多單位數(shù)據(jù)用于離線分選和分析，如以上對MEA數(shù)據(jù)描述的。最亮強度LED是～15Log光子/cm²/s。根據(jù)由2部分組成的光方案遞送刺激。部分1包括來自暗的閃光：2秒給光、20秒撤光，每只眼睛之間具有10秒的偏差(offset)。此范例被在范圍從最暗(ND3＝12.4log光子/cm²/s)到最亮(ND0＝15.4log光子/cm²/s)的每個ND濾光片重復30×。較長的刺激長度還被用于更持續(xù)的響應：10秒給光、30秒撤光，每只眼睛之間具有15秒偏差。此范例在ND3到ND0被重復10-20×。

光方案的部分2包括在光適應條件中記錄，在該光適應條件中5秒的光步驟被應用于96％的邁克爾遜對比的穩(wěn)定的背景照明。存在20秒的刺激間間隔和在兩只眼睛之間10秒的偏差。此范例被重復10次。

(光方案的部分2包括在光適應條件中記錄，在該光適應條件中遞增的光對比被應用于穩(wěn)定的背景照明。33％、66％和96％的邁克爾遜對比被應用于具有20秒刺激間間隔和兩只眼睛間10秒偏差的5秒步驟。此范例循環(huán)被重復10次。)

還記錄了對自然電影的響應。為此，從視桿視蛋白處理的眼睛對側(cè)的dLGN獲得了單獨的記錄集(rd1-CAG-hRho小鼠；n＝2和rd1-grm6-hRho；n＝3)。為了使使用的波長和電影的強度最大化，使用了不同的實驗裝備，包括數(shù)字鏡裝置投影機(LightCommanderTM；Logic PD Inc.)。用含有四個獨立控制的LED(λmax為405nm、455nm、525nm和630nm；Phlatlight PT-120Series(Luminus Devices))的多光譜LED光源代替投影機的內(nèi)在光引擎。來自LED的光與一系列的二向色鏡(Thorlabs)組合并且指向投影機上。使用Python running PsychoPy Version 1.70.00軟件展示電影。它的特征是小鼠圍繞包括移動和隱約可見的不同尺寸的物體(對向視覺角度范圍從0.5°到36°)以一系列的方向、速度和對比(最大邁克爾遜對比＝96％)的行動場地移動。電影缺少顏色差異，并且跨時間的輻射照度變化最小(輻射照度的標準偏差＝5.94％)。野生型小鼠中之前的驗證已顯示對于散焦的版本的展示的不可檢測的響應，指示大多數(shù)活性由空間模式的變化和物體運動引起。

使用具有被20×增益AC偶聯(lián)的探頭(Plexon,TX)信號放大，隨后提供3500×總增益的預放大條件的Recorder64系統(tǒng)(Plexon,TX,USA)，獲得數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)被高通(300Hz)過濾，和時間標記的神經(jīng)波形被同時從全部的通道以40kHz的頻率數(shù)字化，并且被儲存用于離線分析。

為了證實記錄位點的位置，在插入腦中之前將記錄電極浸入熒光染料里(Cell Tracker CM-Dil；Invitrogen)。體內(nèi)記錄之后，將小鼠的腦取出并且在4％多聚甲醛中后固定過夜，隨后在30％蔗糖中冷凍保護持續(xù)24小時。然后使用滑動式切片機，切出100μm冠狀切片，將所述冠狀切片安裝到玻璃載玻片上并且使用Vectashield(Vector Laboratories,Inc.)封片。

多電極陣列(MEA)記錄：

緊隨體內(nèi)電生理學記錄之后，將小鼠安樂死并且摘出眼球。將眼睛放置在由碳氧化(95％CO₂/5％CO₂)aCSF(人工腦脊液，濃度以nM計：118NaCl、25NaHCO₃、1NaH₂PO₄、3KCl、1MgCl₂、2CaCl₂、10C₆H₁₂O₆、0.5L-谷氨酰胺)填充的皮氏培養(yǎng)皿中。然后在漫射紅光中在解剖顯微鏡下小心地分離視網(wǎng)膜，并且以神經(jīng)節(jié)細胞在下地安裝到60通道多電極陣列上(Multi Channel Systems,Reutlingen,Germany)。視網(wǎng)膜移植物在適當?shù)奈恢门c加重的透析膜偶聯(lián)，并且使用蠕動泵(SCI400,Watson Marlow,UK)以2.2ml/分鐘用碳氧化的aCSF持續(xù)灌注，并且使用調(diào)節(jié)用于aCSF流入的內(nèi)聯(lián)加熱器的Universal Serial Bus溫度控制器被保持在32℃。通過呈現(xiàn)UV光(λmax:405nm)的定制的光引擎(Lumencor,USA)提供光刺激。在最亮強度，LED是～15Log光子/cm²/s。被寫在LabVIEW(版本8.6,National Instruments,TX,USA)中的程序控制的National Instruments卡(USB-6229)通過改變LED輸出和調(diào)整含有中性密度濾光片(Cairn Research Ltd)的濾光輪，被用于控制刺激持續(xù)時間和強度。根據(jù)光方案遞送刺激，如以上對體內(nèi)電生理學數(shù)據(jù)描述的。在獲得自發(fā)的和引起的活性二者期間，在25kHz頻率對數(shù)據(jù)取樣并且記錄該數(shù)據(jù)用于離線分析。

行為

目前，通常使用的視覺區(qū)分任務需要大量的訓練、壓力環(huán)境或是基于反射而不是目標導向的行為。為了解決這些不足，已經(jīng)開發(fā)了評價基于自發(fā)行為的視力的簡單、基于開放視野的方法。使用修改的光/暗盒(尺寸：長＝40cm寬＝40cm和高＝30cm，頂部開口)，允許小鼠經(jīng)由分隔墻中的開口在兩個相等的場地(東半邊和西半邊)之間自由移動。盒由Perspex玻璃制成并且盒的壁被漆成白色，除了每個場地的兩個長邊保持透明之外。將兩個相同的遠紅燈放置在每個場地中心之上，以允許在黑暗條件下的查看。視覺刺激顯示自兩個17寸平面屏幕計算機監(jiān)視器，其面向每個場地的透明的壁，使用DualHead2Go Digital Edition外部多顯示適配器(Matrox Graphics Inc.)。這允許對照和測試刺激二者同時顯示在單獨的顯示器上。顯示了多種視覺刺激，包括全視野均勻光(黑色、灰色和白色)、全視野閃光和自然電影。使用自定義編寫的程序創(chuàng)建這些刺激，允許同時在兩個不同的窗口中形成兩個不同的刺激，同時保持二者單獨地操作的能力。程序允許刺激的白色(255)、黑色(0)和灰色(128)組分的值改變以實現(xiàn)期望的亮度和對比水平。

對野生型小鼠(5)、rd1-CAG-GFP小鼠(n＝6)、rd1-CAG-hRho小鼠(n＝6)和rd1-grm6-hRho(n＝5)進行行為實驗。在實驗階段之前，小鼠被處理并且經(jīng)5天，每天在相同的時間，以以下的方式習慣其新環(huán)境：將動物帶到在其居住籠中的測試房間中，放置進入實驗盒內(nèi)，并且允許與其的同窩仔畜一起自由移動持續(xù)30分鐘。

習慣階段之后，每天在相同的時間在完全黑暗的房間進行行為實驗若干周。允許每組的小鼠每天僅經(jīng)歷一個測試條件。在每個測試日，將小鼠帶到在其居住籠中的測試房間中，允許適應測試房間條件持續(xù)30分鐘，并且然后單獨地測試每只小鼠。將小鼠放置進入開放視野盒內(nèi)(隨機地到東半邊或西半邊)并且允許在兩個場地之間自由移動。在遠紅光條件下通過裝備有遠紅光過濾片(λ＝665nm)的攝錄像機記錄全部的測試試驗。在每個測試試驗之后，用70％乙醇將盒徹底清潔，并且在將下一只小鼠放置進盒內(nèi)之前允許空氣干燥。

3分鐘的習慣之后開始記錄試驗。每個試驗運行由5分鐘的對照刺激、之后的測試刺激組成，所述每個試驗運行呈現(xiàn)在面對在此時間點含有小鼠的場地的屏上。對于暗適應實驗，對照刺激由5分鐘在暗中(屏開到暗；輻射亮度＝0.004072Wsr^-1m^-2，輻射照度＝0.00132W/m2)、隨后5分鐘在光中(白屏；輻射亮度＝0.06526Wsr^-1m^-2，輻射照度＝0.116W/m2)并且然后1分鐘回到暗中組成。對于光適應實驗，對照刺激由5分鐘在均勻灰屏光中(灰色屏；輻射亮度＝0.03342Wsr^-1m^-2，輻射照度＝0.0663W/m2)、隨后5分鐘的全視野閃光(閃光屏；輻射亮度＝0.03342Wsr^-1m^-2，輻射照度＝0.0663W/m2)隨后1分鐘在均勻光中組成。對于對比敏感性實驗，調(diào)整屏輸出以允許在2個場地間的不同的測試對比(邁克爾遜對比：100％、68.6％、37.3％、13.7％和0％對比)。對于自然電影實驗，對照刺激由5分鐘的均勻灰色光、隨后1分鐘的電影呈現(xiàn)和1分鐘回到對照條件組成。(彩色)電影以隱約可見的貓頭鷹為特征。

儲存記錄的試驗用于使用視頻跟蹤軟件裝置(EthoXT 10.1Noldus,Tracksys Ltd.,UK)離線分析。我們分析了整個盒中每只小鼠行進的距離并且輸出結(jié)果在30秒箱中。小鼠看到視覺刺激的能力被評價為在從對照到測試刺激的1分鐘轉(zhuǎn)變階段期間運動活性的變化(即我們分析了臨近測試刺激之前在對照條件下30秒中行進的距離和緊接測試刺激之后30秒中行進的距離)。雙向配對t檢驗被用于在1分鐘轉(zhuǎn)變階段期間在測試刺激呈現(xiàn)之前和之后同一組小鼠的比較。

總之，將人類視紫紅質(zhì)引入由于重度視網(wǎng)膜退化和視桿和視錐光感受器的喪失導致失明的小鼠的內(nèi)視網(wǎng)膜細胞中導致視力的恢復，如由瞳孔響應以及腦(外側(cè)膝狀體核)和視網(wǎng)膜中視覺響應的恢復證明的。

討論

此研究中，表明人類視桿視蛋白的表達能夠通過包括給光、撤光、瞬時的和持續(xù)的途徑的多種視覺編碼，將光敏感性賦予失明的視網(wǎng)膜。在內(nèi)源的視錐/PR視力等同的光強下，在體外和體內(nèi)觀察到穩(wěn)健的視覺響應，并且能夠驅(qū)動復雜的視網(wǎng)膜回路功能諸如對比檢測。處理的失明小鼠在自然室內(nèi)環(huán)境典型的照明下顯示恢復的光誘導的運動活性，并且能夠解析光適應條件中的低頻閃光。另外，隨著靶向的視桿視蛋白處理，小鼠檢測到較低對比，能夠解析較高頻率全視野閃光并且檢測自然電影場景。

將微生物視蛋白通道和泵以及化學光開關(guān)引入到存活的視網(wǎng)膜神經(jīng)元能夠恢復光敏感性。此處，基因治療可被用于向失明小鼠遞送人類視桿視蛋白。然而，光遺傳治療中的主要挑戰(zhàn)之一是在視網(wǎng)膜中通過臨床相關(guān)遞送方法實現(xiàn)穩(wěn)定和有效水平的視蛋白表達。目前，病毒遞送方法需要侵入性視網(wǎng)膜下注射，其中轉(zhuǎn)導限于在注射位點處的一小部分視網(wǎng)膜。通過注射進入玻璃體內(nèi)可以實現(xiàn)更全面的轉(zhuǎn)導，進入玻璃體內(nèi)是通常在常規(guī)眼科實踐中使用的更為安全的技術(shù)。然而，由視網(wǎng)膜細胞的細胞外基質(zhì)產(chǎn)生的生理屏障限制了從此途徑的病毒轉(zhuǎn)導。已經(jīng)出現(xiàn)了具有更深地透入視網(wǎng)膜組織的能力的若干新的突變的AAV載體(4YF和7m8)，但目前需要非常高的病毒效價(10¹⁴)，以及著潛在的高的免疫源性和脫靶效應。在本方法中，使用了AAV2載體的玻璃體內(nèi)遞送，其在臨床試驗中已被證明是安全的。另外，已經(jīng)鑒定了靶向細胞外基質(zhì)蛋白的酶的組合，所述酶的組合破壞病毒顆粒從玻璃體到達視網(wǎng)膜的物理屏障。共注射這些酶大大地增加了被病毒感染的神經(jīng)元的數(shù)目和空間擴展。

在完整的視網(wǎng)膜中，哺乳動物視桿視蛋白通常發(fā)現(xiàn)于特化的視桿光感受器中。其屬于通過信號級聯(lián)中間體起作用的G蛋白偶聯(lián)的受體(GPCR)家族。光激活后，視桿視蛋白與轉(zhuǎn)導蛋白(Gt；Gi/o亞家族的成員)偶聯(lián)用于體內(nèi)視覺信號的傳導(Palczewski,K.G.Annu.Rev.Biochem.(2006)75,743-767)，導致K+電流的增加、膜超極化和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的抑制。光感受器和其二級神經(jīng)元、雙極細胞間的符號轉(zhuǎn)化突觸(sign inverting synapse)將此抑制響應轉(zhuǎn)化成正電信號，該正電信號經(jīng)由神經(jīng)節(jié)向腦傳送用于視覺認知。

視蛋白通道(ChR)和泵(HaloR)已經(jīng)在失明的視網(wǎng)膜中功能性地表達，分別導致去極化和超極化。另外，脊椎動物視桿視蛋白已經(jīng)表達于細胞培養(yǎng)物和體內(nèi)視網(wǎng)膜外部(小腦浦肯野細胞)，并且顯示當被光激活時，抑制神經(jīng)元的興奮性(Li X,等Proc Natl Acad Sci U S A.2005Dec 6；102(49):17816-21；Gutierrez DV,等J Biol Chem.2011Jul 22；286(29):25848-58.)。然而，現(xiàn)在已知當直接地在二級或三級神經(jīng)元(RGC)中表達時，GPCR類視桿視蛋白將能夠在天然的光感受器外部發(fā)揮功能，并且施加其抑制作用以產(chǎn)生視覺信號。推斷，在去掉了正常的光感受器輸入的失明的視網(wǎng)膜，中，存活的輸出神經(jīng)元的基礎(chǔ)活性存在整體增加，并且視桿視蛋白能夠起作用抑制此“超活化”并且改進信噪比，以支持視覺區(qū)分。

這里，顯示異位的視桿視蛋白能夠在內(nèi)視網(wǎng)膜細胞中表達并且在天然的光感受器外部發(fā)揮功能。實際上，如預測的，在靶向的(全部光響應的35.7％)和非靶向的(10.8％)視桿視蛋白處理二者中在體內(nèi)觀察到抑制性撤光響應(激發(fā)率隨著給光刺激減少)。這些通常不在WT響應中觀察到，并且在我們的體外制品中我們還沒有觀察到此類響應。然而，出人意外地，在體外和體內(nèi)，均發(fā)現(xiàn)許多正“正響應”。實際上，對于非靶向的和靶向的處理二者，均發(fā)現(xiàn)多種的響應集，包括給光持續(xù)的、給光瞬時的和撤光興奮的(激發(fā)率隨著撤光增加)響應、以及體內(nèi)撤光抑制信號。另外，對于非靶向的處理，在體內(nèi)觀察到小量的給光撤光響應。這將表明，視桿視蛋白能夠以去極化和超極化光依賴方式二者調(diào)節(jié)細胞行為。這將表明，給光雙極細胞中視桿視蛋白的表達足夠強以驅(qū)動突觸后三級神經(jīng)元并且刺激無長突抑制環(huán)(全部細胞)，導致撤光雙極細胞的激活并且因此導致雙抑制或興奮的給光響應。

在完整的系統(tǒng)中，通過兩條平行的途徑，給光途徑和撤光途徑視覺視覺信息。在給光途徑中，細胞對光增加響應，而在撤光途徑中，細胞對光減少響應。在失明視網(wǎng)膜中我們的給光和撤光途徑的恢復支持之前已經(jīng)特異地靶向ChR和LiGluR到ON-BP細胞的其他研究。然而，使用遍在的啟動子(Lin B,等Proc Natl Acad Sci U S A.2008Oct 14；105(41):16009-14)或僅特異地靶向RGC的之前的研究，已經(jīng)報道電生理上更均勻的信號(例如對于異位視黑素持續(xù)的給光)并且沒有給光和撤光途徑二者的同時恢復(RGC中的ChR僅驅(qū)動給光途徑，而RGC中的HaloR僅驅(qū)動撤光途徑)?？赡軆HRGC中的表達不夠強至直接地激活對細胞的正常的興奮性和抑制性輸出。除了此情況之外，甚至用非靶向處理，在INL細胞中(可能的BP細胞)發(fā)現(xiàn)視桿視蛋白的表達，這可以解釋全部環(huán)的二級激活和將響應分成抑制性和興奮性信號二者。

使用視桿視蛋白作為光遺傳工具來恢復視力的主要優(yōu)勢之一在于其提供自身含有的光感受作用的簡單性和其使用內(nèi)源的發(fā)色團(視黃醛或順式視黃醛)作為天然的光開關(guān)的能力。然而，對于視覺響應，視桿視蛋白需要通常被光褪色的視黃醛的恒定的再循環(huán)。認為此再循環(huán)依賴于視桿和RPE間的緊密接觸。實際上，與之前的研究一致(Li X,等Proc Natl Acad Sci U S A.2005Dec 6；102(49):17816-21；Gutierrez DV,等J Biol Chem.2011Jul 22；286(29):25848-58)，發(fā)現(xiàn)在體外光刺激后視桿視蛋白易于褪色，并且其需要發(fā)色團(9-順式視黃醛)的恒定的外源供應以維持光依賴的響應。然而在體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)褪色成為明顯的問題。重要的是，許多光響應是穩(wěn)健的并且經(jīng)多次試驗可重復的。因此，可能退化的視網(wǎng)膜提供了視黃醛的良好的內(nèi)源供應，并且在通常吸收視黃醛的光感受器的不存在下，在內(nèi)視網(wǎng)膜細胞中的視桿視蛋白接近通過RPE或穆勒式細胞再循環(huán)的發(fā)色團，以產(chǎn)生視覺響應。

視桿視蛋白治療的另一個重要的方面是其的在生理光條件下發(fā)揮功能的能力，與目前的需要非常高的光強用于激活的基于微生物視蛋白和合成的光開關(guān)的策略不同。發(fā)現(xiàn)給光和撤光、瞬時的和持續(xù)的細胞類型在落入內(nèi)源的視錐敏感度范圍下的動態(tài)范圍的測試光強下(10¹³-10¹⁵光子/cm²/s)在體內(nèi)發(fā)揮功能。之前報道的研究使用高的多的光強用于激活：LiGluR>1.7×10¹⁷光子/cm²/s(Gaub BM,等2014,Proc Natl Acad Sci U S A.2014Dec 23；111(51):E5574-83)、ChR>3×10¹⁵-10¹⁷光子/cm²/s(Lagali PS,等2008,Nat Neurosci.2008Jun；11(6):667-75；)、RGC中的HaloR>5.1×10¹⁸光子/cm²/s(Zhang Y,等J Neurosci.2009Jul 22；29(29):9186-96)和在視錐內(nèi)部部分中的HaloR>10¹⁶光子/cm²/s(Busskamp V,等2010,Science.2010Jul 23；329(5990):413-7.)。敏感性是細胞內(nèi)機制的一個因素并且我們的數(shù)據(jù)表明，視桿視蛋白能夠通過GPCR光放大級聯(lián)在低光強下發(fā)揮功能。這與微生物離子通道(ChR2)、泵(HaloR)或光開關(guān)(LiGluR)不同，離子通道(ChR2)、泵(HaloR)或光開關(guān)(LiGluR)不能在蛋白水平放大信號。

體內(nèi)恢復的響應的動力學的另外的表征顯示，對于非靶向的和靶向的方法二者，光響應的開始、結(jié)束和持續(xù)時間在細胞類型之間變化。發(fā)現(xiàn)等待時間不同的響應；一些快一些較慢，與之前的研究一致(Caporale N,等2011,Mol Ther.2011Jul；19(7):1212-9；Gaub BM,等2014,Proc Natl Acad Sci U S A.2014Dec 23；111(51):E5574-83)。視桿視蛋白光開關(guān)本質(zhì)上是快的并且較慢的光響應可能是細胞內(nèi)信號級聯(lián)的動力學的作用，并且依賴于表達視桿視蛋白的天然的細胞類型。另外，較慢的響應開始可能是由于不飽和的光輸入和一些細胞中視桿視蛋白的較低水平的表達(一些快的視桿視蛋白響應可能是通過ONBP細胞中的天然的mgluR6受體級聯(lián)的快速動力學)。

眼睛對從暗(晚上)視力到光(白天)視力的寬范圍的光強是敏感的。此敏感性可通過引起視力必需的最小閾值強度來測量。我們的視力的重要方面之一是亮光暴露之后眼睛多快恢復其在暗中的敏感性(暗適應)或更重要的，眼睛多快適應背景照明以能夠區(qū)分在此背景中的物體(光適應)。到目前為止，大多數(shù)光遺傳研究已經(jīng)研究了簡單的視覺刺激，包括來自黑暗的光步驟。這當然是非自然的場景，并且在真實世界中物體具有對比，這是恒定的并且不依賴于環(huán)境照明。因此，提出了異位的視桿視蛋白是否能夠在光適應的條件下工作，并且針對輻射照度的改變保持恢復的視覺編碼的疑問。實際上，在與背景照明相比增加的測試光刺激呈現(xiàn)之后，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)健的dLGN響應。(可能的是觀察的分為給光和撤光途徑的穩(wěn)健的分隔能夠有利于此光適應并且增強對比敏感度)。

研究了非靶向的和靶向的表達兩者。首先，使用強的泛-神經(jīng)元的啟動子CAG的非選擇性非靶向的方法穿過存活的內(nèi)視網(wǎng)膜遞送基因。哪種神經(jīng)元(如果存在)將表達視桿視蛋白，并且是否其將在一種特定類型的神經(jīng)元中表達多于另一種，或?qū)o光或撤光途徑具有偏好性或同樣地靶向二者是未知的。希望給光和撤光途徑間表達的不平衡將意味著，即使一些信號將彼此取消，傳送到腦的視覺信息將存在整體增加。此方法的優(yōu)勢還將意味著，存活最久的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Mazzoni F,)J Neurosci 28(52):14282-14292)也被靶向，并且此方法可以在雙極細胞變得妥協(xié)的(cronin)晚期退化中使用。第二，測試將表達限制到僅“給光”途徑是否將導致電生理和行為二者上視覺信號的改善。使用最小細胞特異啟動子Grm6，視桿視蛋白特異地靶向視網(wǎng)膜給光雙極細胞(Masu M等,Cell 1995)。

在非靶向的和靶向的視桿視蛋白處理之間觀察到驚人的電生理相似性?；謴偷木幋a同樣地復雜和多樣。對于兩種處理，響應動力學、敏感度和對比響應是類似的。有趣的是，靶向的處理導致更多的撤光響應(主要是撤光抑制)。

然而，行為上存在重要的差別。首先，觀察到簡單的視覺功能PLR的恢復差別。非選擇性表達的視桿視蛋白恢復了對RGC途徑的驅(qū)動，介導PLR到接近WT水平。這與視黑素和RGC中的第一代LiGluR一致，其導致PLR的接近完全的(Lin B,Proc Natl Acad Sci U S A.2008Oct 14；105(41):16009-14.)或部分的恢復(Caporale N,等2011,Mol Ther.2011Jul；19(7):1212-9；)。有趣的是，當表達被限制到ON-BP細胞時，此途徑仍然大部分被損壞?？赡芤晽U視蛋白的非靶向表達直接地激活ipRGC(與Gs/Gq級聯(lián)偶聯(lián))，導致刺激，而ON-BP細胞中的選擇性表達繞開了途徑的直接激活和此非視覺反射的恢復。

圖像形成途徑如何？我們創(chuàng)造的此視覺編碼可在生理光水平下被用于改進圖像形成視力嗎？特異地靶向更遠的視網(wǎng)膜神經(jīng)元的優(yōu)勢之一將是保持內(nèi)視網(wǎng)膜加工、細調(diào)恢復的響應成更連貫的信號以及實現(xiàn)更好質(zhì)量的視力。到目前為止，光遺傳研究已解決了簡單的視覺任務包括暗光區(qū)分，并且沒有報道系統(tǒng)是否能夠追蹤相對于背景照明或響應自然場景的變化。發(fā)現(xiàn)以兩種處理，在等同于室內(nèi)光的照明下恢復的體內(nèi)響應能夠支持簡單的暗光區(qū)分。另外，以非靶向的和靶向的視桿視蛋白處理處理的小鼠能夠相對于均勻的背景照明解析在2Hz的全視野閃光。另外，發(fā)現(xiàn)靶向處理的小鼠相對于均勻的背景照明解析較高頻率的閃光，包括4Hz和10Hz。此外，具有ONBP細胞中視桿視蛋白的特異表達的小鼠能夠在相對于背景照明的較低對比水平檢測4Hz閃光(邁克爾遜對比66.7％)。

人類擅長自然視覺場景的加工。盡管時常地改變視覺場景，我們的腦能夠在幾百毫秒內(nèi)將落在我們視網(wǎng)膜上的復雜模式的光和準確的相關(guān)信息轉(zhuǎn)化成連貫的感知?？紤]到轉(zhuǎn)化潛能，提出了異位視桿視蛋白是否能夠足夠穩(wěn)健地驅(qū)動信號來保存許多水平的視覺加工，產(chǎn)生小鼠能夠在室內(nèi)照明典型的水平的光強中用以追蹤自然時空調(diào)節(jié)的視覺編碼的疑問。電生理上，以兩種處理，開始鑒定單獨的能夠追蹤在自然電影場景中發(fā)生的空間和時間上的光水平變化的神經(jīng)元。這表明，視覺系統(tǒng)(具有其可塑性)能夠開發(fā)時間和空間上匯集的恢復的響應，攜帶關(guān)于給光和撤光信號以及對比的簡單信息，以加工真實的自然場景。另外，我們發(fā)現(xiàn)，靶向的視桿視蛋白處理后的小鼠增加了它們響應于自然電影場景的運動行為。這表明，相比于非靶向處理，用靶向處理改進了感知視力的質(zhì)量，這可能由于從雙極細胞到RGC的更連貫的信號會聚，這對于更復雜的時空區(qū)分是必需的。

總之，結(jié)果顯示，存活的內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中的人類視桿視蛋白是有希望恢復由于光感受器的喪失所致的視網(wǎng)膜退化中的視力和反轉(zhuǎn)晚期失明的策略。作為人類蛋白，其在倫理和安全性考慮方面提供了優(yōu)于目前基于微生物治療的優(yōu)勢。其提供了自身含有的光感受策略，該策略通過細胞內(nèi)級聯(lián)放大信號并且相比于目前的光遺傳策略能夠給予改進的敏感性。當在內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)元中異位表達時，其產(chǎn)生基于給光和撤光響應的多種視覺編碼，能夠追蹤高于背景照明和在自然電影場景中的光強度的變化。行為上，處理的失明小鼠能夠區(qū)分暗和光并且在室內(nèi)光典型的照明下，能夠解析光適應的條件下的2Hz全視野閃光。另外，將表達限制到ONBP細胞，導致體內(nèi)視覺感知的改進，并且處理的小鼠能夠解析較高頻率的閃光，檢測較低的對比和解析自然場景。