本申請要求序號為61/935,569的2014年2月4日遞交的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，在這里通過參考引用其全部內(nèi)容。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種獨特的殼聚糖材料和用于制造其的方法，該方法使用碳酸溶解含水的殼聚糖，尤其獲得組合物的天然的最終形態(tài)，當(dāng)形成最終形態(tài)時其不需要酸性鹽洗脫就是實質(zhì)上無酸性鹽的最終形態(tài)。本發(fā)明使用的術(shù)語“天然的最終形態(tài)”包含由殼聚糖碳酸溶液獲得的固體和半固體的最終組合物。固體天然的最終形態(tài)是干燥的(包括溫度≤0℃)到包括≤70％w/w水，可以隨后用去離子水洗滌，在水分傳導(dǎo)度上沒有實質(zhì)性改變，顯示沒有鹽雜質(zhì)?；蛘呤前牍腆w的天然的最終形態(tài)，如水凝膠，殘留水合物到包含≥70％w/w的水。

不考慮水含量，天然的殼聚糖基材料的最終形態(tài)例如粉末、纖維、薄膜、基質(zhì)、海綿狀物、植入物、支架、填料和水凝膠由殼聚糖粉末生產(chǎn)，所述殼聚糖粉末已經(jīng)經(jīng)過i)溶解在含水的酸性溶液(<pH 6.5)中，ii)處理以形成高pH值(>pH 10.0)的水合殼聚糖凝膠沉淀材料，然后iii)通過在水中洗滌和/或另外的前置條件中和(即具有安全的生理學(xué)上的約≥5.0和約≤8.5的pH值)，和iv)隨后使用原始的碳酸或者由二氧化碳分壓施加于水中形成的碳酸，直接從洗滌后的水合凝膠沉淀再實質(zhì)地溶解形成殼聚糖碳酸溶液。

在一些實施例中，這些天然的殼聚糖基材料的最終形態(tài)可以包括親水聚合物，以產(chǎn)生具有可聚合的組合物的多相性的最終形態(tài)。這些親水聚合物可以混合在殼聚糖碳酸溶液中。

在一些實施例中，這些天然的殼聚糖基材料的最終形態(tài)可以包括一種或多種藥物活性劑，以在應(yīng)用位點實現(xiàn)從最終形態(tài)受控釋放活性物。該一種或多種藥物活性劑可以混合在殼聚糖碳酸溶液中。或者該一種或多種藥物活性劑可以滲透到用于在應(yīng)用位點受控釋放的最終形態(tài)中。

在一些實施例中，剪切力和冷凍相分離被用于從殼聚糖碳酸溶液直接制造具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的最終形態(tài)。令人驚訝地，當(dāng)再次暴露于原始溶劑時這些最終形態(tài)變得耐溶解。

在一些實施例中，附加過程如剪切力和冷凍相分離可以被用于對殼聚糖碳酸溶液中的部分或所有殼聚糖脫水，從而使其對碳酸耐溶解。

在一些實施例中，碳酸殼聚糖溶液中的額外的二氧化碳分壓可以在約pH 3.4(10個二氧化碳大氣壓)到pH 7.0(沒有二氧化碳壓力)之間調(diào)節(jié)。參見Butler,J.N.,二氧化碳平衡和它們的應(yīng)用，1991年，Lewis出版社,Chelsea,Michigan。該范圍允許方便地將pH值調(diào)節(jié)到例如在將pH敏感的分子引入到殼聚糖溶液的情況下為接近約7.0。

本發(fā)明的所述殼聚糖組合物的最終形態(tài)無須在它們的天然狀態(tài)/形式下進行酸性鹽洗脫就可以實質(zhì)上無酸性鹽，其對于特定的醫(yī)療應(yīng)用非常理想。這是因為在殼聚糖組合物中存在酸性鹽會對生物適應(yīng)性有不利影響，通過洗脫除去最終殼聚糖形式中的酸性鹽也同樣會除去包含的活性劑，并且酸性鹽的存在還會導(dǎo)致殼聚糖組合物強烈地粘附到濕的組織表面，使得其隨后的去除變困難，并潛在地導(dǎo)致對待處理的敏感的濕組織表面的破壞。

進一步有利的，本發(fā)明人已經(jīng)確定，本發(fā)明的殼聚糖組合物天然的最終形態(tài)可被用于傷口處理、可再生的藥品和藥品傳輸，可被用于濕的狀態(tài)下而沒有顯著變化，可以留在傷口上，或處理濕的組織表面，浸濕四到七天而沒有顯著變化，不溶于水、鹽水、血液或其它的生物流體，可被用于迅速地包含有效藥物成分，可被用于實現(xiàn)藥物成分受控釋放，或作為藥物傳輸介質(zhì)，能容易地適應(yīng)表面，可以被容易地除去，并且可以被完好地除去(沒有撕裂、分裂或分解成片)。

背景技術(shù)：

殼聚糖材料典型地通過使用乙酸的、鹽酸的、甲酸的、乙醇酸的、乳酸的和其他酸的稀釋水溶液迅速地溶解和溶液化殼聚糖粉末來生產(chǎn)。通常，這些在酸性溶液中溶液化的殼聚糖粉末之后被直接用于生產(chǎn)殼聚糖材料最終形態(tài)，這些被用于殼聚糖粉末增溶的酸繼續(xù)殘留，并成為殼聚糖材料最終形態(tài)的部分未經(jīng)進一步處理。所有的酸類包括但不限于乙酸、乳酸、鹽酸、乙醇酸和谷氨酸，那些在水溶液中溶液化的殼聚糖相互作用形成的酸性鹽配合物，其中所述鹽配合物的陽離子部分是殼聚糖的帶正電荷葡萄糖銨，對應(yīng)的陰離子部分由添加酸的陰離子提供。這些酸性鹽配合物的形成是因為殼聚糖在水中約pH≤6.5時溶液化。從殼聚糖酸性溶液除去水后，鹽配合物基本上保留，即，殼聚糖中存在約≥5.0％w/w影響它的生物適應(yīng)性和它的生物活性。

有害的、次級的、或后處理的殼聚糖材料最終形態(tài)要求去除或萃取出殘留的酸，來實現(xiàn)除了別的之外的非附著的殼聚糖最終形態(tài)，和減輕多余的酸的存在在生物適應(yīng)性上的不利影響。見Berscht P.C.,Nies,B.,Liebendorfer,A.,和Kreuter,J.《不同傷口涂劑材料的生物適應(yīng)性的體外評價》，《材料科學(xué)：藥品材料》，1995年第6期，第201-205頁(下稱“Berscht”)；Johnson,R.S.,Lewis T.W.,和Lampecht，E.G.,《體內(nèi)組織對植入殼聚糖谷氨酸的反應(yīng)》，C.J.Brine,P.Sandford,和J.P.Zikakis主編《甲殼素和殼聚糖的發(fā)展》，1992，期刊：阿姆斯特丹，第3-8頁(下稱"Johnson")；Cafaggi,S.,Leardi,R.,Parodi,B.,Caviglioli,G.,Russo,E.,和Bignardi,G.,《用于面頰的藥品傳輸?shù)臍ぞ厶躯}泊洛沙姆407基底的制備和評價》，《受控釋放》，2005年第1期，總第102期，第159-169頁(下稱"Cafaggi")；Grabovac,V.,Guggi,D.,和Bernkop-A.,《多種聚合物的粘附特性比較》，《藥品傳輸發(fā)展評論》，2005年第11期，總第57期，第1713-1723頁(下稱"Grabovac")；Sigurdsson,H.H.,Loftsson,T.,和Lehr,C.-M.,《通過共振鏡生物傳感器的粘附評定》，《國際制藥學(xué)期刊》，2006年第1-2期，總325期，第75-81頁(下稱"Sigurdsson")；He,Q.,Ao,Q.,Gong,Y.,和Zhang,X.,《使用不同的平衡溶液來改善內(nèi)皮細胞親和性的殼聚糖薄膜制備》，《材料科學(xué)：藥品材料》，2011年第12期，總第22期，2791-2802頁(下稱“He”)；

進一步，常規(guī)的殼聚糖材料最終形態(tài)除去酸類物質(zhì)步驟涉及溶劑萃取，或其它粗糙的處理，不必要地、消極地改變殼聚糖材料最終形態(tài)的特性，包括它的形狀、結(jié)構(gòu)、可行的藥品穩(wěn)定性能力、滯留量、和輸送、孔隙率、形態(tài)、及其它機械性能。其他的除去酸類物質(zhì)后處理工序也給常規(guī)的殼聚糖材料最終形態(tài)的制造增加了進一步的困難，復(fù)雜程度和成本。

本發(fā)明符合本技術(shù)領(lǐng)域長期存在的需要，在生產(chǎn)中制造殼聚糖材料天然的、生產(chǎn)中基本沒有酸性鹽的最終形態(tài)，即，不需要隨后的和附加的從殼聚糖材料最終形態(tài)中去除殘留酸類的工序。意外的是，本發(fā)明的發(fā)明人不僅為這一長期存在的問題提供了解決方案，還發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了耐用的和獨特的殼聚糖材料天然的最終形態(tài)，其與現(xiàn)有的殼聚糖材料最終形態(tài)不同，可以在潤濕情況下沒有重大變化地施用，可以在傷口上保持，或處理濕的組織表面，在濕潤情況下超過4到7天沒有重大變化，不溶于水、鹽水、血液或其它的生物流體，可用于迅速地容納有效藥物成分，可用于實現(xiàn)藥物成分的受控釋放，可以制成水凝膠來設(shè)計形狀，可以實現(xiàn)顯著的液體吸收性且基本上維持它們大致的形狀尺寸，或作為藥物輸送介質(zhì)，迅速地適應(yīng)到表面，可以容易地被去除，和/或可以沒有撕裂，分裂或裂成碎片地完好地去除。

具體實施方式

本發(fā)明的天然的殼聚糖材料最終形態(tài)和生產(chǎn)過程表現(xiàn)了與現(xiàn)有技術(shù)不同的幾點，包括使用碳酸來生產(chǎn)基本上沒有酸性鹽的殼聚糖組合物最終形態(tài)。半固體的和固體干燥殼聚糖材料最終形態(tài)當(dāng)它們含有≤約5％w/w的酸性鹽時被認為是“基本上沒有酸性鹽”，優(yōu)選的是≤約1％w/w的酸性鹽，更優(yōu)選的是≤約0.1％w/w的酸性鹽，和最優(yōu)選的是≤約0.01％w/w的酸性鹽。

在一個實施例中，純的干燥的碳酸殼聚糖最終形態(tài)(例如約0.07g)基本上不含酸性鹽，可在溫度≤0.0℃下從殼聚糖碳酸溶液中被干燥和/或冷凍相分離，或在溫度>0.0℃下干燥。這些干燥的碳酸殼聚糖最終形態(tài)隨后在23±2℃(電導(dǎo)率≤0.5微西門子/厘米)下用去離子水(例如約5.0g)清洗，使得在≤1小時的洗滌中，洗滌和控制去離子水之間的電導(dǎo)率差異≤1.5微西門子/厘米。

實施例在此著重描述了一種清潔和安全的酸類物質(zhì)碳酸的使用，所述酸可用來溶液化一種中和的或者事先準備的水合殼聚糖凝膠，作為殼聚糖碳酸溶液的一部分，以及允許基本沒有酸性鹽的殘基殘留的(即，鹽含量≤1.0％w/w，或者pH值≤8.0)、固體或半固體最終形態(tài)的干燥和形成。

在前置條件洗滌期間，可以加入在自我平衡的電解質(zhì)(等滲的)濃度的離子，使用離子水溶液洗滌調(diào)節(jié)至適合的生理學(xué)水平。這種離子和它們的濃度的例子包括但不限于，在水中約0.9％w/w氯化鈉、具有約0.8％w/w氯化鈉、約0.02％w/w氯化鉀、約0.144％w/w磷酸二鈉鹽和約0.024％w/w磷酸一鉀鹽的磷酸鹽緩沖溶液。

重要的是，一旦天然的殼聚糖材料最終形態(tài)形成固體或半固體，它們不會再溶于與最初溶解中和的或者預(yù)先準備的凝膠相同的酸溶液。

這里的術(shù)語“半固體”是指相分離的水凝膠天然的殼聚糖材料最終形態(tài)，如來自含水的冷凍相分離殼聚糖或剪切相分離的殼聚糖。這種水凝膠天然的殼聚糖材料最終形態(tài)在有水存在時，基本上保留水合形式，但在用于溶解中和的或預(yù)先準備的殼聚糖凝膠的酸性溶液中不溶。

這里的術(shù)語“中和的或預(yù)先準備的水合殼聚糖凝膠”是指水合凝膠(即可以再溶解的凝膠)，包含≥約95％w/w的水，這些凝膠是直接從基本上脫水的凝膠(難加工的凝膠；水凝膠)(≤70％w/w水)殼聚糖粉末溶解殼聚糖形成，或者通過在酸中溶解相似的殼聚糖固體來形成。所述酸可以包括但不限于甲酸、乙酸、乳酸、乙醇酸、鹽酸和谷氨酸。用于溶解殼聚糖粉末或類似殼聚糖固體的酸類物質(zhì)隨后通過添加過量的堿(優(yōu)選pH值≥約10)被中和到pH值約≥7。該堿包括但不限于氨水、氫氧化鈉和氫氧化鉀。合成的高毒性pH值和高含鹽量水合殼聚糖凝膠用水溶液洗滌，通過顯著地降低它的pH值到安全的生理學(xué)水平(8.5≥pH≥5.0)，和/或調(diào)節(jié)鹽離子濃度到生理學(xué)安全水平來中和凝膠。生理學(xué)安全的鹽濃度，優(yōu)選的是≤3.5％w/w的鹽溶液，更優(yōu)選的是≤2.0％w/w的鹽溶液，最優(yōu)選的是≤1.0％w/w的鹽溶液。

例如，優(yōu)選的安全的鹽濃度可以用純水洗滌來基本上去除所有在預(yù)先準備的水合殼聚糖凝膠中的鹽來獲得。鹽濃度可以在含水的鹽溶液中使用電導(dǎo)法來便捷計算，電導(dǎo)法可以敏感地測定水中存在的移動的導(dǎo)電離子在電流下的帶電能力。典型地電導(dǎo)率是在恒溫下測量，它的國際標準(SI)計量單位是西門子/厘米。在20℃下絕對的純水具有接近0.05微西門子/厘米的電導(dǎo)率。很高的質(zhì)量雨水具有接近1.0微西門子/厘米的電導(dǎo)率，而海水(3.0到3.5％含鹽量)具有40,000-50,000微西門子/厘米的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率能夠迅速地檢測存在在水中百萬分之一以下的離子。

因為殼聚糖粉末不溶于稀釋的碳酸水溶液，通過碳酸溶解殼聚糖粉末需要使殼聚糖以水基凝膠形態(tài)存在。參見Sakai,Y.,Hayano,K.,Yoshioka,H.,Fujieda,T.,Saito,K.,和Yoshioka,H.,《纖維素材料的殼聚糖涂層使用含水的殼聚糖二氧化碳溶液》，《聚合物》，2002年第3期，總第34期，第144-148頁(下稱“Sakai 1”)；Sakai,Y.,Hayano,K.,Yoshioka,H.,和Yoshioka,H.,《一種水溶解殼聚糖用于工業(yè)應(yīng)用的新方法》，《聚合物》，2001年第8期，總第33期，第640-642頁(下稱“Sakai 2”)。

根據(jù)本發(fā)明，在一般情況下，殼聚糖的含水凝膠形式是通過殼聚糖粉末在稀釋酸類條件下(典型的稀釋酸類包括但不限于乙酸、乙醇酸、乳酸和鹽酸)完全溶解，繼之以用堿(包括但不限于氫氧化鉀、氫氧化鈉、氨水、碳酸鈉和/或碳酸氫鈉)升高酸溶液的pH值到約≥10.0，從而沉淀含水凝膠來制備。然后殼聚糖凝膠沉淀通過在水中水洗中和。

典型地，殘留凝膠沉淀以約≥0.25毫米的凝膠顆?；蚣s≥0.5毫米長度的凝膠纖維形式存在，包含在洗滌工序中的可滲透的細網(wǎng)眼袋或者類似的機械過濾器中。用傾析析出殼聚糖自由液體的凝膠沉淀，可以被用作洗滌和收集水洗后沉淀的一種代替方法，或與過濾器組合用于洗滌。離心可用于加速將沉淀從它的含水的洗滌物中分離。這些方法均可實現(xiàn)最終結(jié)果，通過反復(fù)洗滌，可以從固定的、高分子量的、全水合的殼聚糖凝膠沉淀中除去移動的、水溶性的、低分子量的物種。對于醫(yī)療的或藥理學(xué)的應(yīng)用，中和和洗滌優(yōu)選是在適合的環(huán)境控制下進行的，比如國際標準組織(ISO)第7類及以下，用高純度的水洗滌適合于醫(yī)療的或腸胃外的用途。

洗滌工序工藝是典型地通過在有殼聚糖凝膠約≥4小時的情況下確定電導(dǎo)率或最終洗滌物的pH值來通知的。洗滌工序最終的洗滌物在23±2°C的目標電導(dǎo)率優(yōu)選值是約≤50微西門子/厘米，更優(yōu)選的是約≤10微西門子/厘米，最優(yōu)選約≤1微西門子/厘米。對于洗滌工序最終洗滌物，殼聚糖凝膠在23±2℃具有的電導(dǎo)率優(yōu)選值是約≤50微西門子/厘米，更優(yōu)選的是約≤10微西門子/厘米，最優(yōu)選約≤1微西門子/厘米，這對于本發(fā)明的目的而言，可認為是“中性的”或者“中和的”。對于洗滌工序最終洗滌物的目標pH值，安全生理學(xué)的pH滿足約8.5≥pH≥約5.0，優(yōu)選約8.0≥pH≥約5.5，更優(yōu)選的是約7.5≥pH≥約6.0，最優(yōu)選的是約7.0≥pH≥約6.5。

洗滌后的水合殼聚糖凝膠沉淀可以被視為中和凝膠。一旦酸性鹽殘基從水合凝膠沉淀中去除，或者中和凝膠，水合凝膠之后會通過碳酸酸化而再溶液化。

在本發(fā)明的一個實施例中，用于碳酸再溶解的中和凝膠制備可以包括通過剪切力誘發(fā)擠壓成形的機械脫水制備基本不溶解于碳酸的纖維凝膠沉淀，延長殼聚糖凝膠，以致碳酸溶解大多數(shù)凝膠，卻不溶解部分脫水的殼聚糖纖維。接著攪動和混合施加于碳酸溶解的過程，然后殼聚糖纖維可保持均勻地分散，不溶解地通過粘稠溶液(在25℃溶液/分散體粘度通常是約≥100cps)直至處理成最終形態(tài)。這些分散在殼聚糖溶液中的殼聚糖纖維材料可以在干燥和潮濕的完成顆粒中體現(xiàn)乳狀的/不透明的外觀。相比于沒有分散的不溶解的殼聚糖，用這些分散殼聚糖纖維材料加固的制成品具有改善濕法處理特性。濕法處理特性對應(yīng)用于傷口時需要變潤濕，或者在傷口應(yīng)用后從傷口滲出液或血液變潤濕，或傷口血液應(yīng)用的基體或修飾材料來說是重要的。

殼聚糖粉末原材料是可溶在1％w/w的乙酸水溶液的。它包括但不限于從蝦、蟹、魷魚或真菌類的獲得的材料。優(yōu)選的是15％到100％的脫乙酰度，更優(yōu)選的是78％到98％，最優(yōu)選的是85％到98％。數(shù)均分子量優(yōu)選從1到500,000kda，更優(yōu)選的是10到1,000kda，最優(yōu)選的是50到300kda。

本發(fā)明涉及揮發(fā)性的碳酸來再溶解中和的、清洗的殼聚糖凝膠的用途。碳酸濃度可以通過溶液中的二氧化碳的分壓來控制?；旧蠠o酸的成品殼聚糖制品可以通過在0.0度以下冷凍相分離形成，或者通過冷凍干燥(0.0度以下)和0度以上的鑄造、濺射、噴涂、紡紗工藝的熱干燥形成。在水溶液中，冷凍相分離是由純冰微區(qū)域的局部成核，進而增長使得原本溶解在水中(現(xiàn)在不溶于冰中)的所有非水成分形成微區(qū)域而導(dǎo)致的。See Hobbs,P.V.,Ice Physics.1974,New York:Oxford Univ.Press(“Hobbs”),

合成的天然殼聚糖材料最終形態(tài)可以包括不含或基本不含殘留酸性鹽的殼聚糖粉末、纖維、薄膜、基質(zhì)、海綿狀物、植入物、支架、填料和水凝膠。因為沒有或者基本沒有殘留酸類，合成的殼聚糖材料最終形態(tài)不需要二次處理，以去除殘留的酸。純的、干燥的碳酸殼聚糖的形式(例如，約0.07克)基本上不含殘留的酸性鹽，可以在溫度≤0.0℃下從溶液干燥和/或相分離；或者在溫度>0.0℃干燥，然后在23±2℃(電導(dǎo)率≤0.5微西門子/厘米)在去離子水中(例如，約5.0克)清洗，以至于在≤1小時的洗滌之后，洗滌物和對照的去離子水之間電導(dǎo)率差異≤1.5微西門子/厘米。

再溶解殼聚糖碳酸溶液的殼聚糖可以從約0.1％w/w到約7％w/w，優(yōu)選的是約0.5％w/w到約2.5％w/w。

在一個實施例中，再溶解殼聚糖碳酸溶液可通過澆注或噴涂穿過二氧化碳貧流體或氣體，和/或到加熱的表面上，加工成成品薄膜、粉末或纖維。

在另一個實施例中，殼聚糖碳酸溶液的殼聚糖典型地從約0.1％w/w到約7％w/w，優(yōu)選的是約0.5％w/w到約2.5％w/w，可以通過再壓力下溶液的脈沖噴涂、脈沖沉積或脈沖噴射液滴(通過可移動的受控小直徑，或類似的小尺寸型噴嘴)，加工成三維打印的支架/基質(zhì)。在離開噴嘴后，液滴在被收集到目標積累表面輪廓之前，可以通過二氧化碳貧流體或氣體。

為了有效干燥，三維積體可以通過傳導(dǎo)、輻射、對流的方式加熱?？梢栽谔妓釟ぞ厶且旱沃屑尤敕稚⒃鰪妱?。這些增強劑包括但不限于羥基磷灰石、碳納米管、粘土、石墨烯、金屬和金屬氧化物。在另一個實施例中，殼聚糖碳酸溶液中的殼聚糖從約0.1％w/w到約7％w/w，可以通過剪切下的連續(xù)擠壓通過微小的直徑，或類似的小尺寸輪廓的噴嘴，加工成成品纖維。在離開噴嘴后，連續(xù)纖維在被收集到表面之前，可以穿過二氧化碳的貧流體或氣體。為了加速纖維干燥，可以通過傳導(dǎo)、輻射、對流的方式加熱。

在另一個實施例中，殼聚糖多孔海綿狀物、支架、或基質(zhì)天然的殼聚糖材料最終形態(tài)通過再溶液化殼聚糖碳酸溶液的冷凍相分離制造成殼聚糖和冰薄層，通過超過60秒、基礎(chǔ)溫度維持在低于-20℃的梯度冷卻。初始溶液溫度0.0℃以上，海綿狀物/基質(zhì)/支架厚度約≥0.25毫米。合成的部分脫水冷凍相分離結(jié)構(gòu)保留了冰融化的結(jié)構(gòu)，提供一種新的純的高吸水性的殼聚糖結(jié)構(gòu)，其基本上沒有酸性鹽，不溶于水和碳酸。典型的，在本發(fā)明之前，這樣的殼聚糖凝固相分析的結(jié)構(gòu)只能通過冷凍干燥(升華)去除冰來保留，因為相分離的殼聚糖在再次暴露在解凍的酸溶液中(其原始溶劑)會導(dǎo)致溶解和結(jié)構(gòu)崩潰。在相分離之前，可以將分散增強劑加入碳酸殼聚糖溶液中。這些增強劑包括但不限于羥基磷灰石、碳納米管、粘土、石墨烯、金屬和金屬氧化物。出乎意料的是，本發(fā)明的殼聚糖碳酸溶液方法能夠有利地從含水殼聚糖碳酸溶液中，通過冷凍相分離或者三維打印技術(shù)，快速、高效地生產(chǎn)和保持復(fù)雜的多孔殼聚糖結(jié)構(gòu)，不需要冷凍干燥和/或二次處理殘留的酸。

(本發(fā)明)避免了冷凍干燥的常規(guī)要求，以保持復(fù)雜的多孔殼聚糖結(jié)構(gòu)，比如對于冷凍相分離的天然殼聚糖材料最終形態(tài)，提供了對現(xiàn)有技術(shù)重大的顯著性的改進。該不需要冷凍干燥的冷凍相分離能力具有高度的優(yōu)點，因其提供了廉價和高效生產(chǎn)低密度(例如，約0.005-0.25g/cm³)多孔基體、支架、海綿狀物和水凝膠的方法，以連續(xù)的方式消除了冷凍干燥的時間消耗和昂貴步驟。

用于生產(chǎn)醫(yī)療產(chǎn)品的凍干機通常耗費數(shù)十萬甚至數(shù)百萬美元去安裝、生產(chǎn)材料，單一個批次需要花費數(shù)天，維護費用也同樣昂貴。冷凍干燥制造的產(chǎn)品通常比連續(xù)過程方法制造的貴一個數(shù)量級(x10)。除了通過冷凍溶劑提取(本身是一個有問題的技術(shù))，沒有其他在先技術(shù)允許可以不使用冷凍干燥來實現(xiàn)和保持由冷凍相分離提供的獨特的結(jié)構(gòu)。

由于其高吸水性(接近1000％w/w)，碳酸殼聚糖冷凍相分離的天然殼聚糖材料最終形態(tài)可以在還保留有水時，以與水凝膠產(chǎn)品類似的方式使用。另外，可以使用干燥步驟代替冷凍干燥來生產(chǎn)。這種干燥步驟通常比冷凍干燥更有效，其包括但不限于機械壓縮和/或吸附填補。也可以加熱，包括但不限于通過傳導(dǎo)、輻射、對流來加熱。最終殼聚糖產(chǎn)品的干燥目標是使含水量減少到約≤70％w/w，優(yōu)選的是約≤10％，更優(yōu)選的是約≤5％，最優(yōu)選的是約≤2％。

“干燥”或者“干燥的”天然最終形態(tài)可以指組合物的濕氣或水含量約≤70％w/w，優(yōu)選的是約≤10％，更優(yōu)選的是約≤5％，最優(yōu)選的是約≤2％或者約≤0.5％。通常，水在滅菌完成的干燥產(chǎn)品中是不好的，尤其是在γ射線輻射滅菌的情況下，因為水促進了光化學(xué)誘導(dǎo)的有機分子的自由基降解。

碳酸殼聚糖的冷凍相分離或者可選的三維打印也為生產(chǎn)新的、定型的支架產(chǎn)品提供了一種方法。殼聚糖的冷凍相分離的殼聚糖碳酸溶液的冷凍干燥(升華)提供了基本沒有酸含量的成品干海綿，這種海綿不溶于生理中性條件，除非有另一種粘合劑添加到殼聚糖中，否則不依附在組織上。這種支架用不同水平的生長因子浸潤可被用于組織工程軟組織和硬組織的再生應(yīng)用。例如，這種組合物可被用于牙齒修復(fù)、上頜面的重構(gòu)、糖尿病患者潰瘍組織再生、心肌組織再生和整形外科的骨再生。

在殼聚糖基質(zhì)中包含的可溶的親水成分，以改變殼聚糖物理性能、殼聚糖基質(zhì)生物活性或用于離子性交叉耦合。本發(fā)明的組合物還可以進一步包含其他親水聚合物和/或更少的親水聚合物。其他聚合物可以包括但不限于膠原、膠原衍生物、動物膠、藻朊酸鹽、殼聚糖衍生物、角蛋白、親水的聚胺、親水的聚胺鹽、聚二烯丙基二甲基胺鹽、聚六亞甲基縮二胍、聚氨基丙基縮二胍、殼聚糖衍生物、聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、黃原膠、卡拉膠、季銨聚合物、軟骨素硫酸鹽、淀粉、改性纖維素聚合物、右旋糖酐、透明質(zhì)酸、羥乙烯聚合物、聚乙烯基吡咯烷酮、氫化植物油、石蠟、聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、支鏈淀粉、果膠或其混合物。淀粉可以包括但不限于淀粉酶，支鏈淀粉和支鏈淀粉與淀粉酶的組合。改性纖維素聚合物包括但不限于乙基纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、氧化纖維素或其混合物。

在冷凍相分離和冷凍干燥之前，在包含少量殼聚糖的殼聚糖碳酸溶液中包含或溶解藥物或其它的活性劑，提供從殼聚糖材料最終形態(tài)的藥物或活性劑的局部輸送。本發(fā)明適用的藥物和活性劑包括但不限于在受控部位輸送中使用的通常藥物，包括但不限于抗菌的、止痛的、抗纖維蛋白溶解的、和/或生長因子。本發(fā)明的組合物可以進一步包括活性成分?；钚猿煞挚梢园ǖ幌抻阝}、白蛋白、纖維蛋白原、凝血酶、凝血VIIa因子、凝血XIII因子、凝血噁烷A2、前列腺素-2a、活性化蛋白質(zhì)C、玻璃體結(jié)合蛋白、軟骨素硫酸鹽、乙酰肝素硫酸鹽、角質(zhì)素硫酸鹽、葡糖胺、肝素、核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖、睪丸蛋白聚糖、纖維蛋白聚糖、基膜聚糖、多能聚糖、神經(jīng)聚糖、聚集蛋白聚糖、基底膜聚糖、溶菌酶、賴氨酰氧化酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、膽固醇氧化酶、半乳糖氧化酶、吡喃糖氧化酶、膽堿氧化酶、丙酮酸鹽氧化酶、乙醇酸鹽氧化酶和/或氨基酸氧化酶、右旋葡萄糖、己糖、膽固醇、右旋半乳糖、吡喃糖、膽堿、丙酮酸鹽、乙醇酸鹽、氨基酸、表皮生長因子、血小板衍生生長因子、血管性血友病因子、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-α、轉(zhuǎn)化生長因子-β、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子(FGF)、角質(zhì)化細胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、神經(jīng)生長因子、骨形成蛋白(BMP)、肝癌衍生生長因子(HDGF)、白細胞介素、雙調(diào)蛋白、視黃酸、紅細胞生成素、磺胺米隆乙酸酯、磺胺嘧啶銀、硝酸銀、納米結(jié)晶銀、青霉素、氨芐青霉素、甲氧西林、阿莫西林、阿莫西林、克拉維酸、阿莫西林、氨曲南、亞胺培南、鏈霉素、卡那霉素、托普霉素、慶大霉素、萬古霉素、克林霉素、林可霉素、紅霉素、多粘菌素、桿菌肽、兩性霉素、制霉菌素、利福平、四環(huán)素、強力霉素、氯霉素、頭孢呋辛、頭孢拉定、氟氯西林、氟氯青霉素、雙氯青霉素、克拉維酸鉀、克霉唑、環(huán)吡司乙醇胺(cyclopiroxalomine)、特比萘芬(terbidifine)、酮康唑、紫杉醇、多烯紫杉醇、伊馬替尼、依西美坦、三苯氧胺、維羅菲尼、易普利姆瑪單抗、達卡巴嗪、白介素-2、阿比特龍、阿霉素、5-氟尿嘧啶、三苯氧胺、奧曲肽、索拉非尼、白藜蘆醇、氯胺酮、雙氯芬酸、布洛芬、撲熱息痛、可待因、氧可酮、氫可酮、雙氫嗎啡、哌替啶、丁丙諾啡、反胺苯環(huán)醇、文拉法辛、氟吡汀、酰胺咪嗪、加巴噴丁、普加巴林、利多卡因、自體細胞系、干細胞和其組合。

在本發(fā)明的一個實施例中，添加一定質(zhì)量分數(shù)的藥物或其它的活性劑到殼聚糖碳酸溶液中在溶液中混合或分散藥物和活性劑，通過從殼聚糖材料最終形態(tài)中擴散或溶解，提供用作藥劑的受控輸送和釋放。在有生物流體、或者局部施用之前或之后潤濕的情況下，預(yù)計藥物或其它的活性劑通過擴散或溶解從殼聚糖材料最終形態(tài)中釋放。活性劑從基質(zhì)的釋放速率可通過基質(zhì)的孔徑大小和互連性，通過活性劑的弱鍵合作用和氫鍵結(jié)合到不溶解的基質(zhì)聚合物上，通過基質(zhì)可潤濕性，通過基體密度，通過活性劑基質(zhì)分散體的水平，通過活性劑基質(zhì)均勻性的水平，以及通過結(jié)構(gòu)和表面聚合物層的溶解速度來控制。

在本發(fā)明的一個實施例中，改性的聚陽離子殼聚糖衍生物的添加可用于含有一定殼聚糖質(zhì)量分數(shù)的殼聚糖碳酸溶液，為接近pH值中性的(pH約7.0)殼聚糖材料最終形態(tài)提供抗菌的功效。這種改性的聚陽離子的殼聚糖衍生物包括但不限于可在生理學(xué)的pH(7.4)下溶于水的殼聚糖精氨酸和N-三甲基殼聚糖。

同時，控制的溶解成分可與醫(yī)藥活性劑一起使用，用于受控輸送的溶解方式。

本發(fā)明包括以下方法和組合物:(1)基本上不殘留鹽或污染物的殼聚糖碳酸溶液的制備方法；(2)具有纖維增強殼聚糖殘基和基本上不殘留鹽或污染物的殼聚糖碳酸溶液的制備方法；(3)基本上不殘留鹽或污染物的殼聚糖材料最終形態(tài)，以及這種不需要二次工序中和或萃取制成品的最終形態(tài)的制備方法；(4)基本上不殘留鹽或污染物的加強材料最終形態(tài)，以及這種不需要二次工序中和或萃取制成品的顆粒的制備方法；(5)基本上不殘留鹽或污染物的冷凍相分離碳酸溶液薄板的制備方法；(6)基本上不殘留鹽或污染物的殼聚糖相分離水凝膠模制的最終形態(tài)，和這種不需要冷凍干燥通過冷凍相分離的制品的制備方法；(7)包含活性藥物或活性劑組分、有或者沒有額外的賦形劑的殼聚糖材料最終形態(tài)，以及這種不需要二次工序中和或萃取制成品的制品的制備方法；(8)包含一定質(zhì)量分數(shù)的聚合陽離子改性的殼聚糖的殼聚糖材料最終形態(tài)本身，或具有活性藥物或其它的活性劑的殼聚糖材料最終形態(tài)，以及這種不需要二次工序中和或萃取制成品的制品的制備方法。

附圖說明

附圖是并入和組成本說明書一部分，說明各種示范性的實施例。

圖1提供了在密閉15ml離心管中浸于去離子水(5.0g)的殼聚糖顆粒(注：原文是article)D(0.075g)超過300小時萃取的電導(dǎo)率測量，對照樣品E也在密閉15ml離心管去浸潤于去離子水中。

圖2展示了聚(己二烯二甲基氯化銨)水溶液的電導(dǎo)率(10到750微西門子/厘米)和聚(己二烯二甲基氯化銨)(0.0-1,600ppm)(0.0-0.16％w/w)在溶液中的重量分數(shù)之間的線性關(guān)系。

圖3展示了兩份電導(dǎo)率圖像(表示1與2)，儲存7天的冷凍相分離和冷凍干燥碳酸殼聚糖薄板(有和沒有聚陽離子的，總干重接近0.05g，厚度3.5毫米)，100,000ppm(10.0％w/w)，25,000ppm(2.5％w/w)和0.0ppm(0％w/w)的聚(己二烯二甲基氯化銨)在包含在15ml離心管中的5.0g去離子水中洗脫超過4,320分鐘(72小時)。對照組在15ml離心管中超過4,320分鐘(72小時)的去離子水的電導(dǎo)率也包括在內(nèi)。

圖4展示了兩份電導(dǎo)率圖像，冷凍相分離和冷凍干燥碳酸殼聚糖薄板(干重0.072到0.085g，40毫米×40毫米×3.5毫米厚)經(jīng)過三個月儲存(23±2℃，濕氣≤5％w/w)，100,000ppm(10.0％w/w)，25,000ppm(2.5％w/w)，5,000ppm(0.5％w/w)和0.0ppm(0％w/w)殼聚糖精氨酸在包含在15ml離心管中的5.0g去離子水中，超過186小時洗脫的電導(dǎo)率圖。對照組在15ml離心管中的去離子水的電導(dǎo)率也包括在內(nèi)。

圖5展示了兩份超過420小時的電導(dǎo)率洗脫圖，在23±2℃經(jīng)過12個月儲存的40毫米×40毫米×3.5毫米殼聚糖外殼(干重0.072-0.085g)，殼聚糖賴氨酸100,000ppm(10.0％w/w)經(jīng)過γ射線符合的外殼(A1，A2)；殼聚糖賴氨酸100,000ppm(10.0％w/w)未經(jīng)γ射線符合的外殼(C1，C2)；殼聚糖賴氨酸25,000ppm(2.5％w/w)經(jīng)過γ射線符合的外殼(B1，B2)；殼聚糖賴氨酸25,000ppm(2.5％w/w)未經(jīng)過γ射線符合的外殼(D1，D2)；對照組(E1，E2)，沒有外殼的在相同的5.0g水中，有外殼的在15ml聚丙烯的離心管中。

圖6是電導(dǎo)率和殼聚糖賴氨酸的水溶液濃度之間的線性關(guān)系(y＝1.92±0.83+0.0966±.0016x，R2＝0.999，y是電導(dǎo)率，單位μS/cm，x是殼聚糖賴氨酸濃度，單位是ppm)。

圖7是40毫米×40毫米×3.5毫米冷凍相分離的100％w/w的殼聚糖，冷凍干燥的薄板的黑白數(shù)字照片：A)殼聚糖乙酸酯(左)和殼聚糖碳酸(右)同樣地在冷凍相分離，冷凍干燥制薄板的對比；B)冷凍相分離上表面視角的100％w/w的殼聚糖，冷凍干燥的薄板，C)冷凍相分離的鋁板基層視角的100％w/w的殼聚糖，冷凍干燥的薄板。

實施例

雖然這里的披露是具體到確保本領(lǐng)域技術(shù)人員實現(xiàn)發(fā)明，即制造天然的殼聚糖基材料的最終形態(tài)，但是此處披露的實施例僅僅用于舉例說明本發(fā)明，本發(fā)明還可以體現(xiàn)為其他具體的結(jié)構(gòu)。

對于下述的實驗，除非對特定的實驗另作說明，使用的材料和設(shè)備如下所述。使用的去離子水來自HemCon的Millipore去離子系統(tǒng)。二氧化碳是USP純度等級標準。使用的殼聚糖粉末是從Marinard獲得的“中等分子量”(典型的數(shù)均分子量≥100和≤350k道爾頓)的殼聚糖，通過傅里葉變換紅外光譜學(xué)(FTIR)確定脫乙酰度(DDA)為88％。方法來自Miya,M.,Iwamoto,R.,Yoshikawa,S.,和Seiichi,M.,高度?；臍ぞ厶侵械腃ONH含量的紅外光譜測定，INT.J.BIOL.LMACROMOL.,1980.2(5),第 323-324頁("Miya")；凝膠滲透色譜法測定的數(shù)均分子量(Mn)＝139kDa,聚合分散度＝2.6(凝膠滲透色譜法)，標準是National Institute of Standards and Technology(NIST)單分散聚環(huán)氧乙烷Mw標準。1％乙酸和1％殼聚糖在25℃下通過Brookfield系列液相體積比粘度計測量的粘度是>400cps。另一種使用的殼聚糖粉末是從AKBIOTECH獲得“低分子量殼聚糖”(典型的數(shù)均分子量≥30和≤70k道爾頓)，通過上述Miya方法確定脫乙酰度(DDA)為81％。在1％乙酸和1％殼聚糖在25℃通過Brookfield液相體積比粘度計測量的粘度是≤50cps。使用的冰醋酸來自Aldrich。使用的氫氧化鈉顆粒來自于British Drug Houses(BDH)、Americal Chemical Society Reagent(ACS)的試劑。

具有三腳架的洗滌用的去離子水尼龍網(wǎng)眼過濾器袋(接近500ml容積)來自Fox Run Craftsmen,Ivylands,PA,18974USA。電導(dǎo)率的測量是使用Thermo Orion 3Star電導(dǎo)率臺式系統(tǒng)去掉5ml測試樣品進行測量的。Gardco AP-99501101 11“Microm II doctors”型刮刀用于均勻地沉積厚凝固層(典型地是0.25毫米到5毫米厚)。使用的冷凍干燥器是Virtis Genesis 25XL冷凍干燥器。還用了一種噴霧器(粘膜的霧化裝置，Wolfe Tory Medical Inc.)和一個20ml塑料盧爾鎖注射器(HWS)(Henkesasswolf生產(chǎn))。

實驗1：干燥殼聚糖粉末不溶于碳酸

在23±2℃包含15g Marinard殼聚糖粉末的水分散系(765g)中，用槳式攪拌器以130rpm(rpm)機械攪拌在一升Ace玻璃反應(yīng)器中攪拌24小時，正壓(≥1psi)的二氧化碳泡沫以接近100ml/分的流量通過分散體，達到水溶液體系的粘度沒有明顯變化，或殼聚糖粉末溶解。

上述約300g二氧化碳的飽和水分散體放置于CO2中，沖洗，在室溫下1升的燒瓶中維持二氧化碳氣體內(nèi)壓接近60psi，經(jīng)過五天，用輥軋機以近20rpm的攪渾，直至水溶液的粘度沒有明顯變化，或殼聚糖粉末溶解。

實驗2：從中等分子量的殼聚糖分散體中制備中和的、沖洗的含水殼聚糖凝膠顆粒

一個包含15g中等分子量的殼聚糖和15g冰醋酸的水溶液(765g，BDH在室溫，23±2℃)，在以40rpm攪拌的輥式混合器上放置過夜之后，殼聚糖充分地溶解，形成粘稠的透明的殼聚糖乙酸酯溶液。殼聚糖溶液轉(zhuǎn)入兩升燒杯中，以近20ml/分鐘的速度加入接近100ml的10M NaOH水溶液，用機械槳以約130rpm攪拌。殼聚糖溶液的酸度(pH)用pH試紙檢測。

濃的含水的殼聚糖沉淀以細的水合凝膠顆粒(直徑估計≥0.25mm)形式被觀察到在pH值≥10時形成。另外，在接近1,000rpm速度的剪切攪拌下添加濃縮NaOH到殼聚糖溶液，在殼聚糖和氫氧化鈉界面可以觀察到伸展的、乳色的長度約25毫米到約1毫米的纖維束沉淀渦流，最終，混合3到5分鐘后，通過剪切混合裂成約0.5毫米到約10毫米的小碎片。繼續(xù)在攪拌下加入氫氧化鈉直至pH值>13.0。停止添加，將這一系統(tǒng)在室溫下放置過夜。經(jīng)12小時的沉淀后，有凝膠和纖維的沉淀的一些視覺證據(jù)。

輕輕倒出剩下的不含液體的殼聚糖，用尼龍網(wǎng)眼過濾器袋中收集水合的、沉淀的殼聚糖凝膠，讓水進一步倒出，保留殼聚糖凝膠顆粒和纖維。封住袋開口端，作用于袋子局部的手套壓強接近5psi，使得另外的20％w/w的水能從密閉的袋子中擠出。據(jù)估計，凝膠顆粒剩余質(zhì)量中至少有90％的水。因為脫水殼聚糖是不溶于碳酸的，洗滌的殼聚糖凝膠不允許在洗滌之間干燥。典型的，用至少三倍于洗滌和擠壓凝膠殘渣體積的水被用于洗滌15次，用來再水合和洗滌殘留氫氧化鈉和乙酸鈉的凝膠。

在室溫下的洗滌牽涉到約一升新鮮的去離子水對每次針對沉淀殼聚糖凝膠的洗滌的傾注，五天內(nèi)每天至少進行四次洗滌。在洗滌過程中，沉淀的殼聚糖凝膠顆粒通過槳緩慢攪拌，再懸浮進入尼龍網(wǎng)眼袋。在加入洗滌水的過程中，網(wǎng)眼袋通常部分地浸沒在一燒杯新鮮水中。浸沒于水中保證了殼聚糖凝膠一直是保持水合的。

經(jīng)過各項洗滌之后，我們發(fā)現(xiàn)電導(dǎo)率在最初的洗滌時顯著地改變，但是當(dāng)系統(tǒng)放置于室溫后，平衡回到接近原始的電導(dǎo)率。這表明從凝膠萃取殘留鹽的過程被限制擴散，需要花2-3個小時實現(xiàn)含鹽量在凝膠和水之間的平衡。因為在室溫下洗滌，電導(dǎo)率下降到小于10微西門子/厘米，平衡的時間增加到放置系統(tǒng)平衡過夜的程度，實現(xiàn)從凝膠中最好地萃取鹽。這一方法在室溫下5天洗滌后，允許凝膠的萃取低于3微西門子/厘米。更長時間的萃取(>10天)可以萃取到接近約1微西門子/厘米；新鮮水在室溫下具有接近約0.5微西門子/厘米的電導(dǎo)率。根據(jù)《化學(xué)物理學(xué)手冊》，89版，CRC Press，Boca Raton,Fl，2008,第5-73頁，1.0微西門子氫氧化鈉(最初2％w/w乙酸和5.2％w/w氫氧化鈉)表示氫氧化鈉濃度小于200ppb(十億分之一)，這意味著堿度(NaOH)基本被中和，離子性鹽也被除去了。用5.2％w/w的氫氧化鈉洗滌前的電導(dǎo)率根據(jù)《化學(xué)物理學(xué)手冊》的數(shù)據(jù)是>200,000微西門子。

洗滌工序通常通過測定電導(dǎo)率或有殼聚糖凝膠存在至少8小時的最終洗滌物的pH值來控制。在用純水洗滌工序(如前所述未調(diào)整為生理學(xué)的電解質(zhì))的情況下，洗滌工序最終的洗滌物在23±2℃目標電導(dǎo)率優(yōu)選的是約≤50微西門子/厘米，更優(yōu)選的是約≤10微西門子/厘米，最優(yōu)選的是約≤1微西門子/厘米。對于洗滌工序最終的洗滌物目標pH值，優(yōu)選為約8.5≥pH≥約5.0，優(yōu)選約8.0≥pH≥約5.5，更優(yōu)選的是約7.5≥pH≥約6.0，最優(yōu)選的是約7.0≥pH≥約6.5。

在室溫下最終洗滌含水凝膠保持顆粒的膠狀稠度，具有約≥0.25毫米的凝膠顆粒。外觀是乳狀的在殼聚糖凝膠洗滌物的末端，顯而易見干燥殼聚糖是更多的白色材料(與最初相比較更少黃色)，而且沒有可檢測的與洗滌殼聚糖有關(guān)的氣味，表明通過水洗除去了更多原始的殼聚糖萃取過程中的可溶著色劑和散發(fā)氣味的殘基。在網(wǎng)袋內(nèi)的含水殼聚糖顆粒在洗滌過程中存在一些殼聚糖的損失，損失取決于洗滌的注意程度。據(jù)估計，殼聚糖洗滌后的最終產(chǎn)率≥50％w/w，表明殼聚糖基本以細小顆粒凝膠和可溶的更低分子量殘基的形式損失了。

實驗3：從低分子量殼聚糖的分散體制備中和的、洗滌的含水殼聚糖凝膠顆粒

重復(fù)實驗2，除了用低分子量殼聚糖替換中等分子量殼聚糖。洗滌物的數(shù)量、用于獲得具有低電導(dǎo)率(<3微西門子/厘米)的含水凝膠顆粒分散體所需要的持續(xù)時間的結(jié)果非常相似，以及基本沒有酸性鹽也相似。低分子量殼聚糖時最終的含水凝膠顆粒直徑小于中等分子量凝膠顆粒(≥約0.1毫米)。這些尺寸和重量差異與中分子量殼聚糖相比，降低了洗滌低分子量殼聚糖的產(chǎn)率。低分子量殼聚糖似乎在殼聚糖的堿誘導(dǎo)沉淀過程中在殼聚糖和NaOH界面產(chǎn)生更少的纖維束，可能與實質(zhì)上較低粘稠的低分子量溶液攪拌中具有較低的剪切力有關(guān)。一旦洗滌完成，干燥的低分子量殼聚糖就如中等分子量的殼聚糖那樣，與洗滌前相比是更白(較少黃色)的物質(zhì)，沒有可檢測的與洗滌殼聚糖有關(guān)的氣味。

實驗4：洗滌凝膠在碳酸影響下的溶解：

在實驗2中，殼聚糖凝膠顆粒洗滌物(250g)在室溫下用二氧化碳凈化，轉(zhuǎn)入一升圓柱形容器中，用二氧化碳加壓到75磅/平方英寸(psi)。容器在室溫下放置以40rpm的輥式混合機，將內(nèi)容混合過夜。所述凝膠沉淀物經(jīng)過一夜混合后被發(fā)現(xiàn)溶解了。盡管凝膠溶液在過程中不是完全澄清，表示還剩下一些不溶物質(zhì)，但是觀測不到潤濕的和粘在容器側(cè)壁的顆粒，當(dāng)豎立時也沒有任何的沉淀物。

實驗5：冷凍相分離的、冷凍干燥的水不溶純殼聚糖海綿天然的最終形態(tài)的制備：

Marinard殼聚糖粉末(18g)的水溶液(1018g)置于1升圓筒形容器中，在室溫下添加20g乙酸，通過40rpm輥式混合機在室溫下過夜，將其溶液化。所述殼聚糖溶液轉(zhuǎn)入兩升燒杯，以接近20ml/分鐘流速，加入接近100ml的10M NaOH水溶液，用130rpm機械的槳攪拌5到10分鐘。所述殼聚糖溶液的酸度(pH值)由pH試紙監(jiān)測。

如先前發(fā)現(xiàn)，濃的含水的殼聚糖以沉淀被觀察到在室溫下從原始的殼聚糖溶液在pH值≥10時形成。另外，在攪拌剪切下添加濃縮NaOH到殼聚糖溶液，殼聚糖和氫氧化鈉界面可以觀察到伸展的、乳白色的、長度約25毫米到約1毫米的殼聚糖纖維束沉淀渦流被引發(fā)，最終通過剪切混合，分裂成約0.5毫米到約10毫米的小碎片。繼續(xù)在接近1,000rpm的攪拌下加入氫氧化鈉直至pH值≥13.0。然后，如實驗2操作，用至少三份≥15洗滌物的水加入凝膠一部分，超過至少7天，重復(fù)地洗滌溶液直至經(jīng)洗滌后的沉淀物的電導(dǎo)率到達1.05微西門子/厘米。在室溫下加入水(255g)到洗滌含水的殼聚糖凝膠濃縮物(560g)中，將混合物轉(zhuǎn)移到1升用二氧化碳凈化的壓力容器中，二氧化碳壓強45psi。以40rpm輥式混合機混合三天后，發(fā)現(xiàn)厚(約≥500cps)的乳狀的殼聚糖溶液形成。釋放CO₂壓力，濃的碳酸殼聚糖溶液從反應(yīng)容器傾倒入具有額外的370g二氧化碳凈化水的2升燒杯，用于清洗壓力容器的剩余物。在室溫下，1185g碳酸殼聚糖溶液混合物被保存在一個大氣壓的二氧化碳氣體下，然后將778g混合物添加回到具有一個大氣壓的二氧化碳的一升容器中，混合30分鐘。

混合之后，在室溫下，將40.14g的殼聚糖碳酸溶液涂到預(yù)冷卻(-40度)的鍍特氟龍鋁板(10”×20”×0.25”)表面，在醫(yī)生刮刀和特氟龍表面之間有均勻的3.5毫米間隔。凝固在鋁板上的殼聚糖溶液被放置在Virtis冷凍干燥器中，冷凍干燥超過48小時，直到殼聚糖基質(zhì)殘余水含量約≤5％w/w。干燥殼聚糖海綿重量是0.49g，表示殼聚糖溶液包含1.22％殼聚糖。

180g的1.22％w/w的碳酸殼聚糖溶液進一步冷凍到預(yù)冷卻的鍍特氟龍鋁板(10”×20”×0.25”)表面上，在醫(yī)生刮刀和特氟龍表面有均勻的3.5毫米間隔。在殼聚糖溶液涂層之前，預(yù)冷卻板(靜置于-40℃的Virtis冷凍干燥器中)已經(jīng)被放置于一層聚苯乙烯絕緣襯墊和涂有均勻的薄層冰(用于噴霧器噴射)之上。冰層被用于誘發(fā)均勻的瞬間的基礎(chǔ)冰成核，因此在相分離的凍干殼聚糖中產(chǎn)生均勻的殼聚糖結(jié)構(gòu)。板在virtis冷凍干燥器和冷凍干燥中替換，通過升華作用去除相分離和基礎(chǔ)冰。

實驗6：冷凍相分離、冷凍干燥的碳酸殼聚糖溶液的特性

從實驗5合成的冷凍干燥的殼聚糖海綿薄板一致的厚度是3.5毫米，密度接近0.012g/cm³。沒有明顯的收縮(小于5％的寬度和長度的收縮率)，接近長15"×寬 9"的鑄件薄板沒有開裂。薄板從其中間離開板有輕微的彎曲(每邊上升2")，但是這很容易通過在23±2℃和濕度 40±5％下使整個薄板表面和支持薄板的下層平面施加一個小的(1lb)平面荷載來輕易去除。所得的平面薄板可以容易地用尖剃刀切割成獨立的40mm×40mm的薄片。這些薄片在室溫下浸泡時不溶于水中。它們在水中潤濕有極小的收縮(寬度和長度<10％的)。這些薄片在濕潤條件下不會變形，可以在濕潤表面操作并被移動到不同的位置，不會有撕裂或破裂成碎片的風(fēng)險。該濕潤薄片適應(yīng)下墊面的密切接觸，但沒有附著于它們。

相比之下，3.5毫米厚的殼聚糖薄板更常規(guī)地直接從醋酸和1.8％w/w的殼聚糖溶液中，用板上冷凍相分離和冰凍干燥形成，在暴露于水時，立即開始溶解，附著于下墊面。同樣的源自醋酸溶液的1.8％w/w的殼聚糖溶液薄板當(dāng)在130℃下加熱20分鐘，可以基本除去醋酸，在暴露于水時，變得脆弱，使得它不能在一個濕潤的位置移動到下一個時保持一個穩(wěn)定的外殼薄片(4mm×mm)。

圖1展示了單獨的水(5ml)和冷凍相分離的冷凍干燥的碳酸薄板(0.075g)置于15ml離心管中的5ml水中的電導(dǎo)率測量。從圖1可以看出，單獨的水(E)和殼聚糖海綿薄片(D)起初分別具有0.68和1.28微西門子/厘米，隨時間系數(shù)的推移，在超過300小時浸潤后殼聚糖海綿薄片更大地增加了電導(dǎo)率(1.61微西門子/厘米)，而純水只有(0.94微西門子/厘米)。

室溫下，調(diào)查從殼聚糖碳酸溶液冷凍相分離的、冷凍干燥的薄板的吸水性。0.0097g薄板暴露在水中5分鐘后，吸收了0.13g水(1300％)。20分鐘吸收了0.14g(1446％)。這種吸收的水以薄板的最小溶脹方式實現(xiàn)(長度，寬度和高度尺寸的變化≤約10％)。如此高吸水性和小溶脹程度是傷口敷料的理想性能?？梢栽O(shè)想，根據(jù)本發(fā)明的敷料可以制備具有干重1000％到1600％的吸水能力，干重1200％到1500％的吸水能力，干重1300％到1450％的吸水能力的制品。

實驗7：天然最終形態(tài)完整凝膠海綿的形成或者殼聚糖碳酸溶液凝固/融化的水合殼聚糖

在嘗試實現(xiàn)從殼聚糖碳酸溶液中實現(xiàn)殼聚糖沉淀，在室溫下將實驗6中制備的殼聚糖碳酸溶液5ml置于加蓋的15ml離心管中，然后在-40℃的冷凍裝置中放置過夜。第二天，在融化殼聚糖溶液的嘗試中，發(fā)現(xiàn)溶液形成了一種具有離心管基底形狀的不可溶的殼聚糖“水凝膠”。該殼聚糖“水凝膠”成型接口與離心管的內(nèi)部尺寸匹配，從離心管移除后有約5％的收縮。發(fā)現(xiàn)其可以抵抗低的手壓(≤0.05psi)，包括抗變形和撕裂。它可以被中等的手壓(≥0.5psi)壓縮，去掉包含的水后如同海綿。浸入水中之后，吸水變回原來的形狀。驚喜的是，該殼聚糖“水凝膠”成型接口不會再溶液化，也就是說，暴露于水中或者溶解原先中和的凝膠的酸中也不會溶解。

放置180g殼聚糖碳酸溶液于4"x 4"x 0.8"特氟龍涂層腔的鋁模具中。之后模具和其內(nèi)容物都放置在-40℃冷凍裝置過夜。然后從冷凍裝置移除模具，凝固的內(nèi)容在室溫下融化。180克溶液相分離成一個令人驚訝的接近3.8"×3.8"×0.8"的不溶性水凝膠殼聚糖海綿，可以物理上從它的腔除去和處理且不撕裂或破裂形成的水凝膠制品。制品的尺寸接近實際模具的尺寸。該“水凝膠”海綿制品可以被容易地壓縮從其空隙脫水，失去它的形狀。浸入水中后重新恢復(fù)它的形狀。

實驗8：聚二烯丙基二甲基氯化銨受控釋放天然最終形態(tài)。

本實驗為了測評碳酸殼聚糖隨時間釋放可溶的混合材料的能力。

準備具有0.0,2.5％和10.0％w/w聚二烯丙基二甲基氯化銨的接近3.5mm厚度的冷凍干燥的、冷凍相分離碳酸殼聚糖薄板。聚二烯丙基二甲基氯化銨在5.0g水中從0.05克殼聚糖薄板切片(約1.5厘米x 3厘米)的洗脫是用在15毫升離心管超過72小時的電導(dǎo)率來確定的。

用到的材料包括：水-Omnipur WFI質(zhì)量水，醋酸(Aldrich)，氫氧化鈉(BDH(ACS Reagent))，二氧化碳(USP級Airgas)，聚二烯丙基二甲基氯化銨(Polysciences，Mw是8500da，在水溶液28％w/w)，通過Miya傅里葉變換紅外光譜計方法測定的，脫乙酰度(DDA)88％的中等分子量Marinard殼聚糖粉末；以及凝膠滲透色譜法測定的數(shù)均分子量139Kda，聚合分散性＝2.6(GPC標準，NIST的單分散聚環(huán)氧乙烷Mw標準)。1％乙酸和1％的殼聚糖在25℃下Brookfield LVT粘度計測量>400cps。

制備前述2.0±0.1％w/w的殼聚糖碳酸溶液，在目標末端重量分數(shù)10％w/w和2.5％w/w的天然的干燥殼聚糖薄板中，通過分別添加357±5和89±2微升的2.8％w/w的聚二烯丙基二甲基氯化銨水溶液，將聚二烯丙基二甲基氯化銨混入50±2g的2.0±0.1％w/w的殼聚糖溶液中。這些溶液隨后被倒入預(yù)冷卻到-40℃的10"x 20"x 0.25"的特氟龍涂層的鋁盤上，用醫(yī)生用刮刀調(diào)整到接近3.5mm厚度。裝有凝固的殼聚糖涂層的盤子隨后被放置于-40℃冷凍干燥設(shè)備的架子上，冷凍干燥是密閉的，繼續(xù)冷凍另外60分鐘，使冰和非水成分完成相分離。在凝固完成之后，在迅速將架子溫度從-40℃提升到-15℃，隨后到25℃用于最后干燥的Virtis冷凍干燥器中，在170mTorr條件下，冷凍干燥循環(huán)超過16小時。最終的冷凍干燥樣品質(zhì)譜分析顯示最終水分含量≤10％w/w。

將冷凍干燥薄板(0.05±0.005g)切薄片(約15mm x30mm x3.5mm)，加入到5.0g水中，聚二烯丙基二甲基氯化銨的洗脫在0、5和20分鐘以及1、3、8、24、32、48和72小時進行電導(dǎo)率測量(Thermo Orion 3星電導(dǎo)率Benchtop系統(tǒng))。樣品一式兩份進行試驗，用純水作為對照物。

如圖2所示，電導(dǎo)率與聚二烯丙基二甲基氯化銨濃度成正比。圖3證明聚二烯丙基二甲基氯化銨從潤濕的殼聚糖基質(zhì)在第一個120分鐘之內(nèi)快速釋放，隨后在緊接著72小時內(nèi)更多地、逐漸釋放。具有0％聚二烯丙基二甲基氯化銨的殼聚糖薄板在其電導(dǎo)率洗脫曲線中與水的電導(dǎo)率很難區(qū)分(圖3)，證明冷凍干燥殼聚糖中實質(zhì)上不存在殘留酸性鹽。

這些結(jié)果進一步證明由碳酸殼聚糖溶液形成的天然殼聚糖制成品，可用于輸送和釋放如聚二烯丙基二甲基氯化銨之類的物質(zhì)，以適合于活性物質(zhì)輸送的方式。

實驗9：殼聚糖精氨酸的天然最終形態(tài)的受控釋放。

完成的碳酸殼聚糖冷凍相分離和冷凍干燥材料用Marinard殼聚糖(實驗8所述)和0.0ppm(0.0w/w)、5,000ppm(0.5％w/w)、25,000ppm(2.5％w/w)、100,000ppm(10.0％w/w)的殼聚糖精氨酸制備。殼聚糖精氨酸，一種抗菌劑的合成方法已經(jīng)通過Lee等人的文獻描述。參見Lee,J.,Duncan,A.,Townsend,S.,和Baker,S.,殼聚糖衍生物的合成和表征(976.3),THE FASEB JOURNAL,2014年,28(1副刊)(下稱"Lee")。覆蓋薄板的制備：預(yù)先混合殼聚糖碳酸溶液和可調(diào)節(jié)％(w/w)的殼聚糖精氨酸溶液，在-45℃的預(yù)冷冰涂層板上形成溶液均勻的凝固的3.5mm厚度薄層片材(接近25cm x 18cm)，隨后通過冷凍干燥組合物到最終含水量約≤5％w/w來去除冰。0.0％、0.5％、2.5％和10.0％w/w的殼聚糖精氨酸餾分在完成的干燥薄板上分別具有100.0％、99.5％、97.5％和90％w/w實質(zhì)上無酸性鹽的純殼聚糖。圖7提供照片成像，右邊列圖片A,B,C具有4cm x 4cm切成100.0％的殼聚糖覆蓋層；左邊列的圖片提供類似的但不直接從稀釋乙酸溶液中獲得的預(yù)備的薄板照片成像。覆蓋薄板被切成4cm x 4cm覆蓋片，用于測試重量在0.072到0.085g之間的覆蓋物。覆蓋物的基準重量是接近45g/cm²。該覆蓋物顯示如試驗6所描述的類似的濕法處理和吸收性特性。

覆蓋物處的殼聚糖精氨酸洗脫圖通過用過量的去離子水潤濕覆蓋物容易地測定，電導(dǎo)率由殼聚糖精氨酸釋放覆蓋物進入到去離子水的濃度來測定。從覆蓋物中殼聚糖精氨酸洗脫分為相同的幾份，測量用于100,000、25,000、5,000、0ppm的殼聚糖精氨酸加載，在23±2℃儲存三個月，用于100,000、25,000ppm在23±2℃儲存12個月，用于100,000、25,000ppm在23±2℃儲存12個月，并在覆蓋物制備11個月后暴露于14-17.2kGyγ射線照射。所有覆蓋物的儲罐放置于密封的Kapak^TM聚乙烯包裝中。

圖4、圖5展示了在室溫下各個覆蓋物儲藏3到12月后在5.0g殼聚糖精氨酸去離子水(0.5微西門子/厘米)中的含水洗脫特性。圖5可以看出γ照射增加了電導(dǎo)率(即殼聚糖精氨酸的釋放量)

在非輻照25000ppm覆蓋物加載情況下，可以看出3個月和12個月洗脫圖(圖4、5)是非常相似的。有趣的是，對于非輻照100,000ppm覆蓋物加載洗脫圖在3個月和12個月具有非常類似的三個階段：i)初始的殼聚糖精氨酸快速釋放，6小時或更少時間內(nèi)電導(dǎo)率接近30微西門子/厘米；ii)第一個30微西門子/厘米釋放之后減慢釋放的速率，在50小時(3個月老化)和100小時(12個月老化)直至到達電導(dǎo)率接近50微西門子/厘米；iii)到達50微西門子/厘米之后，有非常明顯地較大降低，長期的殼聚糖精氨酸釋放速率漸進于約55微西門子/厘米。

令人驚訝的是，γ照射之后的25,000ppm和100,000ppm殼聚糖精氨酸加載覆蓋物中，100,000ppm加載樣品在階段ii)和iii)中存在實質(zhì)上的電導(dǎo)率和洗脫率的增加，在25,000ppm加載樣品也有同樣由γ輻射引起的增加的相同階段。這一原因的初步假設(shè)是γ輻射電導(dǎo)率增加量是因為γ輻射促進高分子分裂，因此釋放出較低分子量的殼聚糖精氨酸和具有較低的擴散系數(shù)的殼聚糖基質(zhì)。

設(shè)置在初始γ輻射時不含任何殼聚糖精氨酸的殼聚糖基質(zhì)作為對照組。摻雜這種對照物對任何未來的工作是期望的，消除可能混淆電導(dǎo)率變化解釋的、γ射線輻照產(chǎn)生帶電殼聚糖碎片的可能。

圖6展示了電導(dǎo)率和殼聚糖精氨酸水溶液濃度的線性關(guān)系(y＝1.92±0.83+0.0966±.0016x,R²＝0.999，其中y是電導(dǎo)率，單位μS/cm，x是殼聚糖精氨酸水溶液濃度，單位ppm)。在沒有混淆因素的情況下，通過電導(dǎo)率和殼聚糖精氨酸水溶液濃度線性關(guān)系可用電導(dǎo)率的測量，來測定殼聚糖精氨酸水溶液濃度。

初步的穩(wěn)定性分析結(jié)果確信了從天然的固體最終形態(tài)冷凍干燥殼聚糖基質(zhì)輸送殼聚糖精氨酸作為一種抗菌的藥物，是極有可能有效的、安全的和γ輻射滅菌后仍有活動力的，且儲存在穩(wěn)定地保護性包裝，用于短期輸送(1到7天)受控釋放設(shè)備，有儲存期限較長(25℃下兩到三年)的效果?？梢灶A(yù)料，進一步的儲存期限的研究將論證閉鎖原型的最終包裝的穩(wěn)定性。

總之，本發(fā)明包括一種可以提供抗菌劑、殼聚糖精氨酸的受控釋放的、有前途的殼聚糖材料覆蓋物，。殼聚糖精氨酸覆蓋物的三個加載濃度(5,000ppm，25,000ppm，100,000ppm)已被開發(fā)，25,000ppm，100,000ppm濃度在大型動物試驗中顯示了較高可能性的抗菌和傷口愈合功效。