本申請(qǐng)要求2014年4月17日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/980,844和2014年9月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?2/046,627的權(quán)益，兩個(gè)專利申請(qǐng)據(jù)此通過(guò)引用整體并入。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明部分涉及β-內(nèi)酰胺酶的組合物和在例如胃腸道(GI道)病癥諸如艱難梭狀芽孢桿菌(C.difficile)感染(CDI)中使用這些酶的方法。背景人可被視為“超級(jí)生物體”，其為哺乳動(dòng)物和微生物細(xì)胞的聚集體，估計(jì)后者的數(shù)量超出前者，為十比一。這種微生物成分及其微生物遺傳庫(kù)(微生物組)是人宿主的大約100倍。引人注目的是，盡管外來(lái)生物體的這種極大多樣性，但人免疫系統(tǒng)通常保持協(xié)同作用狀態(tài)。在遠(yuǎn)端GI道尤其如此，遠(yuǎn)端胃腸道容納高達(dá)1000種不同細(xì)菌種類和估計(jì)超過(guò)1×1014個(gè)微生物，并且在定義人宿主健康狀態(tài)方面似乎是重要的。在微生物組尤其在GI道中的謹(jǐn)慎平衡的喪失可導(dǎo)致各種疾病。然而，抗生素藥物治療(其為治療疾病的某些方面所需的)可引起包括在GI道中的微生物組的破壞，并導(dǎo)致其它疾病。例如，某些胃腸外施用的β-內(nèi)酰胺，如氨芐青霉素、頭孢曲松、頭孢哌酮和哌拉西林經(jīng)由膽汁排泄到小腸(十二指腸)的近端部分而部分消除。在腸道中殘余未吸收的β-內(nèi)酰胺可導(dǎo)致對(duì)正常腸微生物群的生態(tài)平衡的不期望作用，這引起在例如CDI抗生素相關(guān)性腹瀉，致病細(xì)菌諸如萬(wàn)古霉素抗性腸球菌的過(guò)度生長(zhǎng)(VRE)，產(chǎn)生革蘭陰性桿菌(ESBL)和真菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，和在正常腸微生物群和潛在病原體細(xì)菌中選擇抗生素抗性菌株。一種用于避免或重新平衡正常腸微生物群的生態(tài)平衡的方法是β-內(nèi)酰胺酶的治療用途，例如通過(guò)使GI道中排泄的或未吸收的抗生素失活，從而維持正常腸微生物群且用潛在的致病微生物體防止其過(guò)度生長(zhǎng)。仍然需要用于治療胃腸道(GI道)病癥諸如艱難梭狀芽孢桿菌感染(CDI)的藥劑和藥物，其具有最適合這些用途的酶性質(zhì)。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供β-內(nèi)酰胺酶，所述β-內(nèi)酰胺酶包含基于P1Aβ-內(nèi)酰胺酶的氨基酸序列，但含有有利突變，所述突變例如改變底物特異性和/或活性且提供治療優(yōu)點(diǎn)。例如，此類突變體可與SEQIDNO:1具有至少70％序列同一性且在以下Ambler分類位置F33、Q135、G156、A232、A237、A238、S240、T243、R244、S266和D276處具有一個(gè)或多個(gè)突變。這種β-內(nèi)酰胺酶具有水解青霉素和頭孢菌素的能力且用期望酶特征實(shí)現(xiàn)所述能力，所述期望酶特征諸如對(duì)所選抗生素底物的低KM和/或高Vmax。這些改進(jìn)的β-內(nèi)酰胺酶用于許多療法，包括預(yù)防或治療GI道中CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病或其它抗生素引起的副作用。例如，β-內(nèi)酰胺酶用于使患者經(jīng)受抗生素療法而被保護(hù)免受可由于負(fù)面地影響微生物組的過(guò)量抗生素產(chǎn)生的疾病。這種使用不干擾抗生素的系統(tǒng)利用。相反地，β-內(nèi)酰胺酶清除可在GI道的部分駐留的過(guò)量抗生素，且這樣做，防止與本文所述的各種疾病狀態(tài)相關(guān)的微生物群的破壞。附圖簡(jiǎn)述圖1示出具有來(lái)自10g/l葡萄糖枯草芽孢桿菌(B.subtilis)生長(zhǎng)的濃縮樣本(參見(jiàn)凝膠右側(cè)的樣本標(biāo)簽)的12％Bis-TrisCriterionXTSDS-PAGE(BioRad)凝膠。MWM＝分子量標(biāo)記PrecisionPlus(BioRad)，RS310＝P1A枯草芽孢桿菌菌株且P1AA18K31＝P1A參考材料?！癙1A→”表示P1A的正確尺寸和突變蛋白質(zhì)。圖2示出具有來(lái)自5g/l葡萄糖枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的上清液樣本(參見(jiàn)凝膠右側(cè)的樣本標(biāo)簽)的12％Bis-TrisCriterionXTSDS-PAGE(BioRad)凝膠。將14μl每種上清液施加到凝膠上。MWM＝分子量標(biāo)記PrecisionPlus(BioRad)，RS310＝P1A枯草芽孢桿菌菌株且“P1A→”表示P1A的正確尺寸和突變蛋白質(zhì)。圖3示出來(lái)自HIC運(yùn)行的洗脫圖。收集洗脫級(jí)分的地方均用箭頭和黑色虛線(虛線最遠(yuǎn)至右側(cè))標(biāo)記，兩者都垂直于X軸。流過(guò)級(jí)分A7-B8可容易地在圖上看到。A280曲線圖用實(shí)線表示(頂側(cè)線)，稀釋溶液的導(dǎo)電性由實(shí)線表示(從頂側(cè)起的第二條線)。樣本注射用虛線(虛線最遠(yuǎn)至左側(cè))標(biāo)記且級(jí)分用多條實(shí)線表示，兩者都垂直于X軸。圖4示出來(lái)自HIC運(yùn)行的洗脫圖。收集洗脫級(jí)分的地方均用箭頭和黑色虛線(虛線最遠(yuǎn)至右側(cè))標(biāo)記，兩者都垂直于X軸。流過(guò)級(jí)分A1-A8可容易地在圖上看到。A280曲線圖用實(shí)線表示(從頂側(cè)起的第二條線)，洗脫溶液的導(dǎo)電性由實(shí)線表示(頂側(cè)線)。樣本注射用虛線(虛線最遠(yuǎn)至左側(cè))標(biāo)記且級(jí)分用多條實(shí)線表示，兩者都垂直于X軸。圖5示出來(lái)自HIC運(yùn)行的洗脫圖。收集洗脫級(jí)分的地方均用箭頭和黑色虛線(虛線最遠(yuǎn)至右側(cè))標(biāo)記，兩者都垂直于X軸。流過(guò)級(jí)分A1-B1可容易地在圖上看到。A280曲線圖用由實(shí)線表示(從頂側(cè)起的第二條線)，洗脫溶液的導(dǎo)電性由實(shí)線表示(頂側(cè)線)。樣本注射用虛線(虛線最遠(yuǎn)至左側(cè))標(biāo)記且級(jí)分用多條實(shí)線表示，兩者都垂直于X軸。在X軸上零之前的部分表示用緩沖液A的柱平衡。圖6示出圖3-5所示出的三個(gè)HIC純化的級(jí)分的SDS-PAGE凝膠。AS-sup＝在特定純化中使用的硫酸銨濾液，即，用于純化的起始材料。B1161008、B7161008、B8161008、A2041108、A7041108和B1121108：每個(gè)純化的流過(guò)級(jí)分。C3-C8161008、C9-D1161008、D2-D8161008、B2-B10041108和B8-C3121108：洗脫的蛋白質(zhì)峰，匯集的級(jí)分。A18K31P1A：參考材料，0.64μg/泳道。圖7顯示SOE(剪接重疊延伸)技術(shù)。P1A的B3β-鏈的靶氨基酸如此緊密地相互定位，使得所有四個(gè)氨基酸可使用SOE技術(shù)交換。涵蓋交換的區(qū)域含有24個(gè)核苷酸(8個(gè)氨基酸密碼子)，且包括于兩個(gè)PCR引物的重疊延伸部分中。突變的penP基因首先在兩個(gè)部分中通過(guò)PCR擴(kuò)增，使用引物A+B和C+D。然后將兩個(gè)PCR產(chǎn)物合并，并使用與penP基因的5'和3'部分互補(bǔ)的引物A和D擴(kuò)增?？寺∥稽c(diǎn)被包括于引物A和D中。一旦準(zhǔn)備好構(gòu)建，使用Multi試劑盒添加其它突變。示出由重疊引物(B和C)所編碼的氨基酸序列。圖8顯示P1A(左側(cè)柱)和P4A(右側(cè)柱)的抗生素降解活性。將10或100ng/ml的酶濃度針對(duì)所指示的抗生素使用。將數(shù)據(jù)繪制為由指示的β-內(nèi)酰胺酶降解的最高抗生素濃度(所使用的抗生素濃度為10、100或1000μg/ml)。詳述本發(fā)明部分基于某些突變?chǔ)?內(nèi)酰胺酶具有用于治療的期望特征的發(fā)現(xiàn)，所述期望特征包括例如水解青霉素和頭孢菌素中一種或多種的能力。在一些方面，本發(fā)明提供β-內(nèi)酰胺酶和這些β-內(nèi)酰胺酶的藥物組合物。在各個(gè)方面，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物通過(guò)SEQIDNO:1(地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)PenP，即P1A)的突變產(chǎn)生。因此，在各個(gè)方面，本發(fā)明提供β-內(nèi)酰胺酶和/或?yàn)镻1A衍生物的藥物組合物。P1A經(jīng)設(shè)計(jì)以使腸胃外施用的具有或不具有經(jīng)由膽道系統(tǒng)分泌的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(例如，三唑巴坦、舒巴坦、克拉維酸)的青霉素群組β-內(nèi)酰胺(例如，青霉素、阿莫西林氨芐青霉素和哌拉西林)失活(參見(jiàn)國(guó)際專利公布WO1993/013795和WO2008/065247；Tarkkanen,A.M.等人,AntimicrobAgentsChemother.53:2455，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用整體并入)。P1A酶是地衣芽孢桿菌749/C小的外切β-內(nèi)酰胺酶的重組體形式(WO2008/065247)，其屬于分類A且在功能分類中被分組為亞組2a。地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶及其P1A衍生物被視為具有降解例如青霉素、氨芐青霉素、阿莫西林或哌拉西林的高水解能力的青霉素酶并且它們通常被活性定點(diǎn)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑諸如克拉維酸、舒巴坦或三唑巴坦抑制。然而，P1A酶具有使屬于頭孢菌素或碳青霉烯群組的β-內(nèi)酰胺抗生素失活的有限能力。因?yàn)樗玫摩?內(nèi)酰胺酶具有對(duì)頭孢菌素的差的活性，所以它們不能與腸胃外頭孢菌素治療聯(lián)合應(yīng)用來(lái)用于使小腸道中的未吸收β-內(nèi)酰胺失活。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物改善P1A的性質(zhì)，如本文所述。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶具有期望特征，所述期望特征包括例如具有有效靶向廣譜抗生素的能力。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶具有期望的酶動(dòng)力學(xué)特征。例如，在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種頭孢菌素具有低KM，包括例如小于約500μM、或約100μM、或約10μM、或約1μM、或約0.1μM(100nM)、或約0.01μM(10nM)、或約1nM的KM。例如，在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種青霉素具有低KM，包括例如小于約500μM、或約100μM、或約10μM、或約1μM、或約0.1μM(100nM)、或約0.01μM(10nM)、或約1nM的KM。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種頭孢菌素具有高Vmax，包括例如大于約100s-1、或約1000s-1、或約10000s-1、或約100000s-1、或約1000000s-1的Vmax。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種青霉素具有高Vmax，包括例如大于約100s-1、或約1000s-1、或約10000s-1、或約100000s-1、或約1000000s-1的Vmax。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種頭孢菌素具有大于約106M-1s-1的催化效率。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種青霉素具有大于約106M-1s-1的催化效率。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)頭孢菌素和青霉素的至少一個(gè)或兩者具有期望的酶動(dòng)力學(xué)特征。在各個(gè)實(shí)施方案中，特定抗生素(例如頭孢菌素和青霉素描述于本文中)。本文提供P1A酶的263個(gè)氨基酸的序列(去除N端處的31個(gè)氨基酸的信號(hào)序列和QASKT(Gln-Ala-Ser-Lys-Thr)五肽后，參見(jiàn)SEQIDNO:3)。如本文所述，可以對(duì)這個(gè)序列進(jìn)行突變以產(chǎn)生本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶。SEQIDNO:1GluMetLysAspAspPheAlaLysLeuGluGluGlnPheAspAlaLysLeuGlyIlePheAlaLeuAspThrGlyThrAsnArgThrValAlaTyrArgProAspGluArgPheAlaPheAlaSerThrIleLysAlaLeuThrValGlyValLeuLeuGlnGlnLysSerIleGluAspLeuAsnGlnArgIleThrTyrThrArgAspAspLeuValAsnTyrAsnProIleThrGluLysHisValAspThrGlyMetThrLeuLysGluLeuAlaAspAlaSerLeuArgTyrSerAspAsnAlaAlaGlnAsnLeuIleLeuLysGlnIleGlyGlyProGluSerLeuLysLysGluLeuArgLysIleGlyAspGluValThrAsnProGluArgPheGluProGluLeuAsnGluValAsnProGlyGluThrGlnAspThrSerThrAlaArgAlaLeuValThrSerLeuArgAlaPheAlaLeuGluAspLysLeuProSerGluLysArgGluLeuLeuIleAspTrpMetLysArgAsnThrThrGlyAspAlaLeuIleArgAlaGlyValProAspGlyTrpGluValAlaAspLysThrGlyAlaAlaSerTyrGlyThrArgAsnAspIleAlaIleIleTrpProProLysGlyAspProValValLeuAlaValLeuSerSerArgAspLysLysAspAlaLysTyrAspAspLysLeuIleAlaGluAlaThrLysValValMetLysAlaLeuAsnMetAsnGlyLys.在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO:1可以在序列的第一殘基前具有Met和/或Thr。在各個(gè)實(shí)施方案中，可以裂解Met。如本文所述，可以對(duì)在第一殘基前包含Met和/或Thr的序列進(jìn)行突變以產(chǎn)生本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶。本文還提供去除N端處的31個(gè)氨基酸的信號(hào)序列和QASKT(Gln-Ala-Ser-Lys-Thr)五肽前P1A酶的299個(gè)氨基酸的序列，如SEQIDNO:3：SEQIDNO:3MetIleGlnLysArgLysArgThrValSerPheArgLeuValLeuMetCysThrLeuLeuPheValSerLeuProIleThrLysThrSerAlaGlnAlaSerLysThrGluMetLysAspAspPheAlaLysLeuGluGluGlnPheAspAlaLysLeuGlyIlePheAlaLeuAspThrGlyThrAsnArgThrValAlaTyrArgProAspGluArgPheAlaPheAlaSerThrIleLysAlaLeuThrValGlyValLeuLeuGlnGlnLysSerIleGluAspLeuAsnGlnArgIleThrTyrThrArgAspAspLeuValAsnTyrAsnProIleThrGluLysHisValAspThrGlyMetThrLeuLysGluLeuAlaAspAlaSerLeuArgTyrSerAspAsnAlaAlaGlnAsnLeuIleLeuLysGlnIleGlyGlyProGluSerLeuLysLysGluLeuArgLysIleGlyAspGluValThrAsnProGluArgPheGluProGluLeuAsnGluValAsnProGlyGluThrGlnAspThrSerThrAlaArgAlaLeuValThrSerLeuArgAlaPheAlaLeuGluAspLysLeuProSerGluLysArgGluLeuLeuIleAspTrpMetLysArgAsnThrThrGlyAspAlaLeuIleArgAlaGlyValProAspGlyTrpGluValAlaAspLysThrGlyAlaAlaSerTyrGlyThrArgAsnAspIleAlaIleIleTrpProProLysGlyAspProValValLeuAlaValLeuSerSerArgAspLysLysAspAlaLysTyrAspAspLysLeuIleAlaGluAlaThrLysValValMetLysAlaLeuAsnMetAsnGlyLys此外，本發(fā)明還提供從SEQIDNO:1的第一殘基開(kāi)始的另外的上游殘基(參見(jiàn)，例如，JBC258(18):11211,1983，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入-包括penP和penP1的外大和外小形式)。此外，本發(fā)明還提供從SEQIDNO:1的最后一個(gè)殘基開(kāi)始的另外的下游殘基。P1A的多核苷酸序列(去除N端處的31個(gè)氨基酸的信號(hào)序列和QAKST五肽后)還如SEQIDNO:2所提供。如本文所述，可以對(duì)這個(gè)序列進(jìn)行突變以產(chǎn)生本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶(包括，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性考慮在內(nèi))。SEQIDNO:2gagatgaaagatgattttgcaaaacttgaggaacaatttgatgcaaaactcgggatctttgcattggatacaggtacaaaccggacggtagcgtatcggccggatgagcgttttgcttttgcttcgacgattaaggctttaactgtaggcgtgcttttgcaacagaaatcaatagaagatctgaaccagagaataacatatacacgtgatgatcttgtaaactacaacccgattacggaaaagcacgttgatacgggaatgacgctcaaagagcttgcggatgcttcgcttcgatatagtgacaatgcggcacagaatctcattcttaaacaaattggcggacctgaaagtttgaaaaaggaactgaggaagattggtgatgaggttacaaatcccgaacgattcgaaccagagttaaatgaagtgaatccgggtgaaactcaggataccagtacagcaagagcacttgtcacaagccttcgagcctttgctcttgaagataaacttccaagtgaaaaacgcgagcttttaatcgattggatgaaacgaaataccactggagacgccttaatccgtgccggtgtgccggacggttgggaagtggctgataaaactggagcggcatcatatggaacccggaatgacattgccatcatttggccgccaaaaggagatcctgtcgttcttgcagtattatccagcagggataaaaaggacgccaagtatgatgataaacttattgcagaggcaacaaaggtggtaatgaaagccttaaacatgaacggcaaataa還提供去除的N端處的31個(gè)氨基酸的信號(hào)序列和QASKT五肽前P1A的多核苷酸序列，如SEQIDNO:4。如本文所述，可以對(duì)這個(gè)序列進(jìn)行突變以產(chǎn)生本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶(包括，遺傳密碼的簡(jiǎn)并性考慮在內(nèi))。SEQIDNO:4atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcgcaagcttccaagacggagatgaaagatgattttgcaaaacttgaggaacaatttgatgcaaaactcgggatctttgcattggatacaggtacaaaccggacggtagcgtatcggccggatgagcgttttgcttttgcttcgacgattaaggctttaactgtaggcgtgcttttgcaacagaaatcaatagaagatctgaaccagagaataacatatacacgtgatgatcttgtaaactacaacccgattacggaaaagcacgttgatacgggaatgacgctcaaagagcttgcggatgcttcgcttcgatatagtgacaatgcggcacagaatctcattcttaaacaaattggcggacctgaaagtttgaaaaaggaactgaggaagattggtgatgaggttacaaatcccgaacgattcgaaccagagttaaatgaagtgaatccgggtgaaactcaggataccagtacagcaagagcacttgtcacaagccttcgagcctttgctcttgaagataaacttccaagtgaaaaacgcgagcttttaatcgattggatgaaacgaaataccactggagacgccttaatccgtgccggtgtgccggacggttgggaagtggctgataaaactggagcggcatcatatggaacccggaatgacattgccatcatttggccgccaaaaggagatcctgtcgttcttgcagtattatccagcagggataaaaaggacgccaagtatgatgataaacttattgcagaggcaacaaaggtggtaatgaaagccttaaacatgaacggcaaataa在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及β-內(nèi)酰胺酶(例如分類Aβ-內(nèi)酰胺酶)的誘變以產(chǎn)生有利的酶(例如可靶向超廣譜抗生素的酶)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括定點(diǎn)誘變、隨機(jī)誘變和/或直接進(jìn)化途徑。在一些實(shí)施方案中，突變?cè)O(shè)計(jì)尤其基于以下的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(例如晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)、同系物模型等)：P1A晶體結(jié)構(gòu)(Knox和Moews,J.MolBiol.,220,435–455(1991))、CTX-M-44(1BZA(Ibuka等人JournalofMolecularBiology第285卷,第5期2079–2087(1999)、1IYS(Ibuka等人Biochemistry,2003,42(36):10634-43)、1IYO、1IYP和1IYQ(Shimamura等人2002J.Biol.Chem.277:46601-08)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)K1(1HZO,Nugaka等人JMolBiol.2002年3月15；317(1):109-17)和羽狀變形菌(Proteuspenneri)HugA(Liassine等人AntimicrobAgentsChemother.2002年1月；46(1):216-9.2002)，并且綜述于Bonnet,Antimicrob.AgentsChemother48(1):1-14(2004)(對(duì)于CTM-X)，所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用整體并入)。在一些實(shí)施方案中，本突變通過(guò)分析以下β-內(nèi)酰胺酶的任一個(gè)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的分析(例如晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)、同系物模型等)來(lái)報(bào)告：P1A(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,607,671，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)、P2A(參見(jiàn)，例如，WO2007/147945，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)、P3A(參見(jiàn)，例如，WO2011/148041，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)、CTX-M-3、CTX-M-4、CTX-M-5、CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14、CTX-M-15、CTX-M-16、CTX-M-18、CTX-M-19、CTX-M-25、CTX-M-26、CTX-M-27、CTX-M-32、CTX-M-44、CTX-M-45和CTX-M-54。此類信息對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員在已知數(shù)據(jù)庫(kù)是可用的，例如，Swiss-ProtProteinSequenceDataBank、NCBI和PDB。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一個(gè)或多個(gè)(例如約1、或約2、或約3、或約4、或約5、或約6、或約7、或約8、或約9、或約10、或約15、或約20、或約30、或約40、或約50、或約60、或約70、或約80、或約90、或約100、或約110、或約120、或約130、或約140、或約150個(gè))對(duì)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的突變或與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3具有至少30、35、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.8、99.9％同一性(或與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3具有約70％、或約75％、或約80％、或約85％、或約90、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％同一性)的序列。在各個(gè)實(shí)施方案中，SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的一個(gè)或多個(gè)氨基酸被天然存在的氨基酸取代，諸如親水性氨基酸(例如極性和帶正電荷的親水性氨基酸，諸如精氨酸(R)或賴氨酸(K)；極性和電中性的親水性氨基酸，諸如天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)，極性和帶負(fù)電荷的親水性氨基酸，諸如天冬氨酸鹽(D)或谷氨酸鹽(E)，或者芳族、極性和帶正電荷的親水性氨基酸，諸如組氨酸(H))或疏水性氨基酸(例如疏水性、脂肪族氨基酸諸如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)或纈氨酸(V)，疏水性、芳族氨基酸，諸如苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)或者非經(jīng)典氨基酸(例如硒代半胱氨酸、吡咯賴氨酸、N-甲?；琢虬彼幡?丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸。4-氨基苯甲酸(PABA)、常見(jiàn)氨基酸的D-異構(gòu)體、2,4-二氨基丁酸、α-氨基異丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基異丁酸、3-氨基丙酸、鳥(niǎo)氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸(sarcosme)、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、環(huán)己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、設(shè)計(jì)產(chǎn)生氨基酸諸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸以及一般氨基酸類似物)。在說(shuō)明性實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變包括但不限于一個(gè)或多個(gè)(例如約1、或約2、或約3、或約4、或約5、或約6、或約7、或約8、或約9、或約10、或約15、或約20、或約30、或約40、或約50、或約60、或約70、或約80、或約90、或約100、或約110、或約120、或約130、或約140、或約150個(gè))對(duì)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的以下突變或與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3具有至少30、35、40、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5、99.8、99.9％同一性(或與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3具有約70％、或約75％、或約80％、或約85％、或約90、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％同一性)的序列：Glu1Ala；Glu1Cys；Glu1Asp；Glu1Phe；Glu1Gly；Glu1His；Glu1Ile；Met1Lys；Glu1Leu；Glu1Met；Glu1Asn；Glu1Pro；Glu1Gln；Glu1Arg；Glu1Ser；Glu1Thr；Glu1Val；Glu1Trp；Glu1Tyr；Met2Ala；Met2Cys；Met2Asp；Met2Glu；Met2Phe；Met2Gly；Met2His；Met2Ile；Met1Lys；Met2Leu；Met2Asn；Met2Pro；Met2Gln；Met2Arg；Met2Ser；Met2Thr；Met2Val；Met2Trp；Met2Tyr；Lys3Ala；Lys3Cys；Lys3Asp；Lys3Glu；Lys3Phe；Lys3Gly；Lys3His；Lys3Ile；Lys3Leu；Lys3Met；Lys3Asn；Lys3Pro；Lys3Gln；Lys3Arg；Lys3Ser；Lys3Thr；Lys3Val；Lys3Trp；Lys3Tyr；Asp4Ala；Asp4Cys；Asp4Glu；Asp4Phe；Asp4Gly；Asp4His；Asp4Ile；Asp4Lys；Asp4Leu；Asp4Met；Asp4Asn；Asp4Pro；Asp4Gln；Asp4Arg；Asp4Ser；Asp4Thr；Asp4Val；Asp4Trp；Asp4Tyr；Asp5Ala；Asp5Cys；Asp5Glu；Asp5Phe；Asp5Gly；Asp5His；Asp5Ile；Asp5Lys；Asp5Leu；Asp5Met；Asp5Asn；Asp5Pro；Asp5Gln；Asp5Arg；Asp5Ser；Asp5Thr；Asp5Val；Asp5Trp；Asp5Tyr；Phe6Ala；Phe6Cys；Phe6Asp；Phe6Glu；Phe6Gly；Phe6His；Phe6Ile；Phe6Lys；Phe6Leu；Phe6Met；Phe6Asn；Phe6Pro；Phe6Gln；Phe6Arg；Phe6Ser；Phe6Thr；Phe6Val；Phe6Trp；Phe6Tyr；Ala7Cys；Ala7Asp；Ala7Glu；Ala7Phe；Ala7Gly；Ala7His；Ala7Ile；Ala7Lys；Ala7Leu；Ala7Met；Ala7Asn；Ala7Pro；Ala7Gln；Ala7Arg；Ala7Ser；Ala7Thr；Ala7Val；Ala7Trp；Ala7Tyr；Lys8Ala；Lys8Cys；Lys8Asp；Lys8Glu；Lys8Phe；Lys8Gly；Lys8His；Lys8Ile；Lys8Leu；Lys8Met；Lys8Asn；Lys8Pro；Lys8Gln；Lys8Arg；Lys8Ser；Lys8Thr；Lys8Val；Lys8Trp；Lys8Tyr；Leu9Ala；Leu9Cys；Leu9Asp；Leu9Glu；Leu9Phe；Leu9Gly；Leu9His；Leu9Ile；Leu9Lys；Leu9Met；Leu9Asn；Leu9Pro；Leu9Gln；Leu9Arg；Leu9Ser；Leu9Thr；Leu9Val；Leu9Trp；Leu9Tyr；Glu10Ala；Glu10Cys；Glu10Asp；Glu10Phe；Glu10Gly；Glu10His；Glu10Ile；Glu10Lys；Glu10Leu；Glu10Met；Glu10Asn；Glu10Pro；Glu10Gln；Glu10Arg；Glu10Ser；Glu10Thr；Glu10Val；Glu10Trp；Glu10Tyr；Glu11Ala；Glu11Cys；Glu11Asp；Glu11Phe；Glu11Gly；Glu11His；Glu11Ile；Glu11Lys；Glu11Leu；Glu11Met；Glu11Asn；Glu11Pro；Glu11Gln；Glu11Arg；Glu11Ser；Glu11Thr；Glu11Val；Glu11Trp；Glu11Tyr；Gln12Ala；Gln12Cys；Gln12Asp；Gln12Glu；Gln12Phe；Gln12Gly；Gln12His；Gln12Ile；Gln12Lys；Gln12Leu；Gln12Met；Gln12Asn；Gln12Pro；Gln12Arg；Gln12Ser；Gln12Thr；Gln12Val；Gln12Trp；Gln12Tyr；Phe13Ala；Phe13Cys；Phe13Asp；Phe13Glu；Phe13Gly；Phe13His；Phe13Ile；Phe13Lys；Phe13Leu；Phe13Met；Phe13Asn；Phe13Pro；Phe13Gln；Phe13Arg；Phe13Ser；Phe13Thr；Phe13Val；Phe13Trp；Phe13Tyr；Asp14Ala；Asp14Cys；Asp14Glu；Asp14Phe；Asp14Gly；Asp14His；Asp14Ile；Asp14Lys；Asp14Leu；Asp14Met；Asp14Asn；Asp14Pro；Asp14Gln；Asp14Arg；Asp14Ser；Asp14Thr；Asp14Val；Asp14Trp；Asp14Tyr；Ala15Cys；Ala15Asp；Ala15Glu；Ala15Phe；Ala15Gly；Ala15His；Ala15Ile；Ala15Lys；Ala15Leu；Ala15Met；Al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r；Met260Thr；Met260Val；Met260Trp；Met260Tyr；Asn261Ala；Asn261Cys；Asn261Asp；Asn261Glu；Asn261Phe；Asn261Gly；Asn261His；Asn261Ile；Asn261Lys；Asn261Leu；Asn261Met；Asn261Pro；Asn261Gln；Asn261Arg；Asn261Ser；Asn261Thr；Asn261Val；Asn261Trp；Asn261Tyr；Gly262Ala；Gly262Cys；Gly262Asp；Gly262Glu；Gly262Phe；Gly262His；Gly262Ile；Gly262Lys；Gly262Leu；Gly262Met；Gly262Asn；Gly262Pro；Gly262Gln；Gly262Arg；Gly262Ser；Gly262Thr；Gly262Val；Gly262Trp；Gly262Tyr；Lys263Ala；Lys263Cys；Lys263Asp；Lys263Glu；Lys263Phe；Lys263Gly；Lys263His；Lys263Ile；Lys263Leu；Lys263Met；Lys263Asn；Lys263Pro；Lys263Gln；Lys263Arg；Lys263Ser；Lys263Thr；Lys263Val；Lys263Trp；Lys263Tyr；Met264Ala；Met264Cys；Met264Asp；Met264Glu；Met264Phe；Met264Gly；Met264His；Met264Ile；Met264Lys；Met264Leu；Met264Asn；Met264Pro；Met264Gln；Met264Arg；Met264Ser；Met264Thr；Met264Val；Met264Trp；Met264Tyr；Asn265Ala；Asn265Cys；Asn265Asp；Asn265Glu；Asn265Phe；Asn265Gly；Asn265His；Asn265Ile；Asn265Lys；Asn265Leu；Asn265Met；；Asn265Pro；Asn265Gln；Asn265Arg；Asn265Ser；Asn265Thr；Asn265Val；Asn265Trp；Asn265Tyr；Gly266Ala；Gly266Cys；Gly266Asp；Gly266Glu；Gly266Phe；；Gly266His；Gly266Ile；Gly266Lys；Gly266Leu；Gly266Met；Gly266Asn；Gly266Pro；Gly266Gln；Gly266Arg；Gly266Ser；Gly266Thr；Gly266Val；Gly266Trp；Gly266Tyr；Lys267Ala；Lys267Cys；Lys267Asp；Lys267Glu；Lys267Phe；Lys267Gly；Lys267His；Lys267Ile；Lys267Leu；Lys267Met；Lys267Asn；Lys267Pro；Lys267Gln；Lys267Arg；Lys267Ser；Lys267Thr；Lys267Val；Lys267Trp和Lys267Tyr。在一些實(shí)施方案中，SEQIDNO:1可以在序列的第一個(gè)殘基前具有Met和/或Thr。這些殘基可以與如上突變類似。在所有這些突變體中，殘基的編號(hào)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1。這些殘基編號(hào)可以通過(guò)使用任何常規(guī)的生物信息學(xué)方法，例如通過(guò)使用BLAST(基本局部比對(duì)搜索工具)或FASTA(FAST-AII)轉(zhuǎn)換成Ambler編號(hào)(Ambler等人,1991,AstandardnumberingschemefortheClassAβ-lactamases,Biochem.J.276:269-272，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)。例如，殘基244對(duì)應(yīng)于Ambler276。例如，可以使用以下轉(zhuǎn)換：Ambler分類編號(hào)SEQIDNO:1殘基F33F6I72I44Q135Q105G156G126T160T130A232A202A237A207A238A208S240S209T243T212R244R213S266S234D276D244而且，百分比同一性還可以用這些常規(guī)的生物信息學(xué)方法進(jìn)行評(píng)估。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物，所述藥物組合物包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3具有至少70％(例如約70％、或約71％、或約72％、或約73％、或約74％、或約75％、或約76％、或約77％、或約78％、或約79％、或約80％、或約81％、或約82％、或約83％、或約84％、或約85％、或約86％、或約87％、或約88％、或約89％、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％)序列同一性的氨基酸序列以及Ambler分類的一個(gè)或多個(gè)以下突變：F33X、Q135X、G156X、A232X、A237X、A238X、S240X、T243X、R244X、S266X和D276X，其中X是任何天然存在的氨基酸且條件是D276X不存在于單突變體的情形中。在一些實(shí)施方案中，X是天然存在的親水性或疏水性氨基酸殘基或非經(jīng)典氨基酸。在另一方面，本發(fā)明涉及β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物，所述藥物組合物包含與SEQIDNO:1或SEQIDNO:3具有至少70％序列同一性的氨基酸序列以及Ambler分類的一個(gè)或多個(gè)以下突變：位置33處除苯丙氨酸(F)外的疏水性殘基；位置135處除谷氨酰胺(Q)外的疏水性殘基；位置156處除甘氨酸(G)外的親水性殘基；位置232處除丙氨酸(A)外的疏水性殘基；位置237處除丙氨酸(A)外的親水性殘基；位置238處除丙氨酸(A)外的疏水性或親水性殘基；位置240處不同于絲氨酸(S)的親水性殘基；位置243處不同于蘇氨酸(T)的疏水性殘基；位置244處除精氨酸(R)外的疏水性殘基；位置266處不同于絲氨酸(S)的親水性殘基；以及位置276處除天冬氨酸(D)外的親水性殘基，條件是在對(duì)應(yīng)于位置276的位置處除天冬氨酸(D)外的親水性氨基酸殘基不存在于單突變體的情形中。如通篇中所用，親水性氨基酸殘基可包括選自精氨酸(R)和賴氨酸(K)的極性和帶正電荷的親水性殘基；選自天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)的極性和電中性的親水性殘基；選自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的極性和帶負(fù)電荷的親水性殘基；或者芳族、極性和帶正電荷的親水性氨基酸，其包括組氨酸(H)。如通篇中所用，疏水性氨基酸殘基可包括選自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)或纈氨酸(V)的疏水性、脂肪族氨基酸；或者選自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)的疏水性、芳族氨基酸。可以通過(guò)參考遺傳密碼(包括考慮密碼子簡(jiǎn)并性在內(nèi))對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的基因序列(例如SEQIDNO:3和4)進(jìn)行突變。在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含Ambler分類的位置處的一個(gè)或多個(gè)以下突變：F33Y、Q135M、G156R、A232G、A237S、A238G或T、S240P或D、T243I、R244T、S266N、D276N或R或K，條件是D276N或R或K不在單突變體的情形中。在一個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含Q135M。在另一實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含G156R和A238T。在另一實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含F(xiàn)33Y和D276N。在又另一實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含F(xiàn)33Y、S240P和D276N。在一個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含F(xiàn)33Y、A238T和D276N。在另一實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A232G、A237S、A238G和S240D。在其它實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A232G、A237S、A238G、S240D和R244T。在另一實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276R。在一個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276K。在一個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A232G、A237S、A238G、S240D和Q135M。在一個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A238T。在一個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含T243I、S266N和D276N。在一個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276N.在其它實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含與SEQIDNO:2具有至少70％序列同一性的氨基酸序列和以下Ambler分類：位置232處除丙氨酸(A)外的疏水性殘基；位置237處除丙氨酸(A)外的親水性殘基；位置238處除丙氨酸(A)外的疏水性殘基；位置240處除絲氨酸(S)外的親水性殘基；以及位置276處除天冬氨酸(D)外的親水性殘基。在一些實(shí)施方案中，位置232處除丙氨酸(A)外的疏水性殘基是甘氨酸(G)。在一些實(shí)施方案中，位置237處除丙氨酸(A)外的親水性殘基是絲氨酸(S)。在一些實(shí)施方案中，位置238處除丙氨酸(A)外的疏水性殘基是甘氨酸(G)。在一些實(shí)施方案中，位置240處除絲氨酸(S)外的親水性殘基是天冬氨酸(D)。在一些實(shí)施方案中，位置276處除天冬氨酸(D)外的是天冬酰胺(N)。在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276N的一個(gè)或多個(gè)。在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276N的全部，其序列可以是SEQIDNO：5：SEQIDNO：5EMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK或SEQIDNO：6：SEQIDNO：5，包括信號(hào)和另外的QASKT氨基酸(編碼區(qū)加下劃線)：MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAQASKTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶的任一種的多核苷酸，包括，例如包含此類多核苷酸的載體。此類多核苷酸除編碼本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶的序列外還可包含一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制元件。例如，多核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和多腺苷酸化信號(hào)作為表達(dá)控制元件。多核苷酸可被插入到任何合適的載體中，其可被包含于任何合適的宿主細(xì)胞中用于表達(dá)。本發(fā)明的說(shuō)明性的多核苷酸(polyucleotide)是SEQIDNO：7：SEQIDNO：7A232G、A237S、A238G、S240D和D276N突變體的全長(zhǎng)核苷酸序列，HindIII位點(diǎn)(AAGCTT-粗體)及另外的K和T氨基酸。前導(dǎo)序列和另外的核苷酸(HindIII位點(diǎn)及K和T氨基酸-對(duì)于另外的氨基酸序列QASKT)加下劃線。atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcgcaagcttccaagacggagatgaaagatgattttgcaaaacttgaggaacaatttgatgcaaaactcgggatctttgcattggatacaggtacaaaccggacggtagcgtatcggccggatgagcgttttgcttttgcttcgacgattaaggctttaactgtaggcgtgcttttgcaacagaaatcaatagaagatctgaaccagagaataacatatacacgtgatgatcttgtaaactacaacccgattacggaaaagcacgttgatacgggaatgacgctcaaagagcttgcggatgcttcgcttcgatatagtgacaatgcggcacagaatctcattcttaaacaaattggcggacctgaaagtttgaaaaaggaactgaggaagattggtgatgaggttacaaatcccgaacgattcgaaccagagttaaatgaagtgaatccgggtgaaactcaggataccagtacagcaagagcacttgtcacaagccttcgagcctttgctcttgaagataaacttccaagtgaaaaacgcgagcttttaatcgattggatgaaacgaaataccactggagacgccttaatccgtgccggtgtgccggacggttgggaagtgggtgataaaactggaagcggagattatggaacccggaatgacattgccatcatttggccgccaaaaggagatcctgtcgttcttgcagtattatccagcagggataaaaaggacgccaagtatgataataaacttattgcagaggcaacaaaggtggtaatgaaagccttaaacatgaacggcaaataa在一些實(shí)施方案中，載體可以保持游離型或變?yōu)槿旧w整合的，只要編碼治療劑的插入物可被轉(zhuǎn)錄即可。載體可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)構(gòu)建。載體可以是例如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、噬菌粒、病毒或本領(lǐng)域已知的任何其它類型，其可用于原核或真核細(xì)胞(例如腺病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒；慢病毒；scAAV；pGEX載體；pET載體；和pHT載體)中的復(fù)制和表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到多種本領(lǐng)域已知的組分(諸如表達(dá)控制元件)可包含于此類載體中，包括多種轉(zhuǎn)錄信號(hào)，諸如啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)RNA聚合酶結(jié)合到啟動(dòng)子上的其它序列。已知在其中載體將表達(dá)的細(xì)胞中有效的任何啟動(dòng)子可用于啟動(dòng)治療劑的表達(dá)。合適的啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。合適的啟動(dòng)子的實(shí)例包括pET系統(tǒng)(INVITROGEN)、lac啟動(dòng)子、tac、trc、T7、T7A3啟動(dòng)子、PhoA、plux和噬菌體λpR、λpL啟動(dòng)子(參見(jiàn)，例如JIndMicrobiolBiotechnol(2012)39:383–399；CurrOpinBiotech2001,12:195，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的(例如經(jīng)由IPTG、代謝物、溫度)。合適的啟動(dòng)子的實(shí)例包括SV40早期啟動(dòng)子區(qū)、勞氏肉瘤病毒的3'長(zhǎng)末端重復(fù)中包含的啟動(dòng)子、HSV-1胸苷激酶啟動(dòng)子、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列等，以及以下動(dòng)物轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，其展現(xiàn)組織特異性并且已經(jīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：在胰腺腺泡細(xì)胞中具有活性的彈性酶I基因控制區(qū)；在胰腺β細(xì)胞中具有活性的胰島素基因控制區(qū)；在淋巴樣細(xì)胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)；在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中具有活性的小鼠乳房腫瘤病毒控制區(qū)；在肝臟中具有活性的白蛋白基因控制區(qū)；在肝臟中具有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)；在肝臟中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制區(qū)；在類紅細(xì)胞中具有活性的β-珠蛋白基因控制區(qū)；在腦中的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中具有活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)；以及在下丘腦中具有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)。本發(fā)明提供多核苷酸，此類多核苷酸包含編碼本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列。例如，編碼本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶的核苷酸序列。此類多核苷酸還可包含與核苷酸序列可操作地連接的另外的控制元件，諸如啟動(dòng)子元件和/或其它轉(zhuǎn)錄或表達(dá)相關(guān)的信號(hào)。多核苷酸可以插入到各種載體中，其可用于產(chǎn)生宿主細(xì)胞中的治療劑，所述宿主細(xì)胞包括例如細(xì)菌和真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶可以通過(guò)已知的重組表達(dá)技術(shù)制備。例如，為了重組產(chǎn)生本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶，編碼各個(gè)基因的核酸序列可操作地連接于合適的啟動(dòng)子序列，使得編碼本發(fā)明的此β-內(nèi)酰胺酶的核酸序列將在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。說(shuō)明性的啟動(dòng)子是用于在各種系統(tǒng)中表達(dá)的那些啟動(dòng)子，諸如T7啟動(dòng)子、Pspac、PgroES、Pgsi和Plux和amyQ啟動(dòng)子和/或來(lái)自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的amyQ信號(hào)肽(通過(guò)非限制性實(shí)例GenBankIDNo.J01542.1，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)。可使用任何通常使用的表達(dá)系統(tǒng)，包括真核或原核系統(tǒng)。具體的實(shí)例包括酵母(例如，酵母屬種、畢赤酵母屬種)、桿狀病毒、哺乳動(dòng)物和細(xì)菌系統(tǒng)，諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和柄桿菌屬。本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括例如原核、真核、細(xì)菌、酵母、藻類、植物、昆蟲(chóng)和/或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括重組表達(dá)與本發(fā)明相關(guān)的基因的任何類型的細(xì)胞，包括原核和真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，諸如，例如，埃希氏菌屬種、鏈霉菌屬種、發(fā)酵單胞菌屬種(Zymonasspp.)、醋酸桿菌屬種、檸檬酸桿菌屬種、集胞藻屬種、根瘤菌屬種、梭狀芽孢桿菌屬種、棒狀桿菌屬種、鏈球菌屬種、黃單孢菌屬種、乳桿菌屬種、乳球菌屬種、芽孢桿菌屬種、產(chǎn)堿桿菌屬種、假單胞菌屬種、氣單胞菌屬種、固氮菌屬種、叢毛單胞菌屬種、分枝桿菌屬種、紅球菌屬種、葡萄糖桿菌屬種、青枯菌屬種、嗜酸硫桿菌屬種、小月菌屬種(Microlunatusspp.)、地桿菌屬種、地芽孢桿菌屬種、節(jié)桿菌屬種、黃桿菌屬種、沙雷氏菌屬種、糖多孢菌屬種、棲熱菌屬種、寡養(yǎng)單胞菌屬種、色素桿菌屬種、中華根瘤菌屬種、糖多孢菌屬種、土壤桿菌屬種和泛菌屬種。細(xì)菌細(xì)胞可以是革蘭氏陰性細(xì)胞諸如大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞，或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞諸如芽孢桿菌屬的種。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真菌細(xì)胞，諸如，例如，酵母細(xì)胞，例如，酵母屬種、裂殖酵母屬種、畢赤酵母屬種、紅發(fā)夫酵母屬種(Paffiaspp.)、克魯維酵母屬種、假絲酵母屬種、籃狀菌屬種、酒香酵母屬種、管囊酵母屬種、德巴利酵母屬種、耶氏酵母屬種和工業(yè)多倍體酵母菌株。酵母菌株可以是釀酒酵母菌株或耶氏酵母屬種菌株。真菌的其它實(shí)例包括例如曲霉屬種、青霉菌屬種、鐮孢菌屬種、根霉菌屬種、支頂孢屬種、鏈孢霉屬種、糞殼菌屬種、稻痕菌屬種、異水霉屬種、黑粉菌屬種、葡萄孢屬種和木霉菌屬種。在其它實(shí)施方案中，細(xì)胞是藻類細(xì)胞或植物細(xì)胞(例如，擬南芥、萊茵衣藻、節(jié)旋藻、三角褐指藻、扁藻(T.suecica)、顆石藻(P.carterae)、三角褐指藻、小球藻屬種，諸如普通小球藻)。靶細(xì)胞可包括轉(zhuǎn)基因和重組細(xì)胞系。另外，可使用異源細(xì)胞系，諸如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)。宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞宿主細(xì)胞或多細(xì)胞宿主細(xì)胞。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶具有使它們期望用于各種用途的功能特征，所述用途包括治療用途。表征β-內(nèi)酰胺酶的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，O'Callaghan,等人Antimicrob.AgentsChemother,1:283-288所描述的頭孢硝噻測(cè)定；Viswanatha等人MethodsMolMed.2008；142:239-60的各種方法)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺水解一種或多種青霉素和頭孢菌素。如通篇中所用，青霉素包括例如阿莫西林(例如阿莫西林(NOVAMOX，AMOXIL))；氨芐青霉素(例如氨芐青霉素(PRINCIPEN))；阿洛西林；羧芐青霉素(例如GEOCILLIN)；鄰氯青霉素(例如鄰氯青霉素(TEGOPEN))；雙氯青霉素(例如雙氯青霉素(DYNAPEN))；氟氯青霉素(例如氟氯西林(FLOXAPEN))；美洛西林(例如MEZLIN)；甲氧西林(例如甲氧西林(STAPHCILLIN))；萘夫西林(例如萘夫西林(UNIPEN))；苯唑西林(例如苯唑西林(PROSTAPHLIN))；芐青霉素(PenicillinG)(例如PENTIDS或PFIZERPEN)；苯氧甲基青霉素(PenicillinV)(例如VEETIDS(PEN-VEE-K))；哌拉西林(例如，哌拉西林(PIPRACIL))；替莫西林(例如替莫西林(NEGABAN))；和替卡西林(例如羧噻吩青霉素(TICAR))。如通篇中所用，頭孢菌素類包括例如第一代頭孢菌素(例如頭孢羥氨芐(例如羥氨芐頭孢菌素(DURICEF))；頭孢唑啉(例如唑啉頭孢菌素(ANCEF))；頭孢菌素(Ceftolozane)，頭孢噻吩(Cefalotin)/頭孢噻吩(Cefalothin)(例如開(kāi)弗林(KEFLIN))；頭孢氨芐(例如頭孢力新(KEFLEX))；第二代頭孢菌素(例如頭孢克洛(例如頭孢克洛(DISTACLOR))；頭孢孟多(例如頭孢羥唑鈉甲酸酯(MANDOL))；頭孢西丁(例如美福仙(MEFOXIN))；頭孢丙烯(例如頭孢齊爾(CEFZIL))；頭孢呋辛(例如新菌靈(CEFTIN)，頭孢呋新(ZINNAT)))；第三代頭孢菌素(例如頭孢克肟(例如世伏素(SUPRAX))；頭孢地尼(例如頭孢地尼(OMNICEF，CEFDIEL))；頭孢托侖(例如頭孢托侖(SPECTRACEF))；頭孢哌酮(例如先鋒必(CEFOBID))；頭孢噻肟(例如頭孢噻肟(CLAFORAN))；頭孢泊肟(例如頭孢泊肟(VANTIN))；頭孢他啶(例如頭孢他啶(FORTAZ))；頭孢布烯(例如先力騰(CEDAX))頭孢唑肟(例如施福澤(CEFIZOX))；和頭孢曲松(例如頭孢曲松(ROCEPHIN)))；第四代頭孢菌素(例如頭孢吡肟(例如馬斯平(MAXIPIME)))；或者第五代頭孢菌素(例如頭孢洛林酯(例如頭孢洛林酯(TEFLARO))；頭孢吡普(例如頭孢吡普(ZEFTERA)))。在具體實(shí)施方案中，頭孢菌素包括例如頭孢哌酮、頭孢曲松或頭孢唑啉。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶相較于SEQIDNO:1對(duì)頭孢菌素具有改善的催化效率。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶具有期望的酶動(dòng)力學(xué)特征。例如，在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種頭孢菌素具有低KM，包括例如小于約500μM、或約100μM、或約10μM、或約1μM、或約0.1μM(100nM)、或約0.01μM(10nM)、或約1nM的KM。例如，在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種青霉素具有低KM，包括例如小于約500μM、或約100μM、或約10μM、或約1μM、或約0.1μM(100nM)、或約0.01μM(10nM)、或約1nM的KM。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種頭孢菌素具有高Vmax，包括例如大于約100s-1、或約1000s-1、或約10000s-1、或約100000s-1、或約1000000s-1的Vmax。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種青霉素具有高Vmax，包括例如大于約100s-1、或約1000s-1、或約10000s-1、或約100000s-1、或約1000000s-1的Vmax。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種頭孢菌素具有大于約106M-1s-1的催化效率。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)至少一種青霉素具有大于約106M-1s-1的催化效率。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)頭孢菌素和青霉素的任一個(gè)或兩者的至少一個(gè)具有期望的酶動(dòng)力學(xué)特征。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶在GI道中，例如在口腔、食道、胃、十二指腸、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、升結(jié)腸、乙狀結(jié)腸(colonsigmoidenum)、盲腸和直腸的一個(gè)或多個(gè)中是穩(wěn)定的和/或具有活性。在具體實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶在大腸，任選地選自橫結(jié)腸、降結(jié)腸、升結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和盲腸的一個(gè)或多個(gè)中是穩(wěn)定的。在具體實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶在小腸，任選地選自十二指腸、空腸和回腸的一個(gè)或多個(gè)中是穩(wěn)定的。在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶在GI道，包括例如小腸中是蛋白酶抗性的。在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶在pH約6.0至約7.5，例如約6.0、或約6.1、或約6.2、或約6.3、或約6.4、或約6.5、或約6.6、或約6.7、或約6.8、或約6.9、或約7.0、或約7.1、或約7.2、或約7.3、或約7.4、或約7.5(包括例如，經(jīng)由本文所述的制劑)為基本上活性的。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)一種或多種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，任選地選自阿維巴坦(avibactam)、三唑巴坦、舒巴坦和克拉維酸為抗性的。在一些實(shí)施方案中，穩(wěn)定的是指具有足夠長(zhǎng)的半衰期且保持對(duì)治療有效性的足夠活性的酶。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和一種或多種和如本文所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。在具體實(shí)施方案中，藥物組合物經(jīng)配制用于口服施用，例如作為片劑或多顆粒噴灑劑或多顆粒膠囊。然而，如本文所述，還提供了其它施用途徑和制劑。在一些實(shí)施方案中，藥物組合物可以與另外的藥劑結(jié)合使用或可以為共同制劑。在一些實(shí)施方案中，另外的藥劑是另外的抗生素降解酶，諸如，例如，EC3.5.2.6類的β-內(nèi)酰胺酶。在一些實(shí)施方案中，抗生素降解酶選自功能組1、組2、組3或組4β-內(nèi)酰胺酶(參見(jiàn)，例如，Bush等人，Antimicrob.AgentsChemother,39:1211，其公開(kāi)內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)：不希望受理論束縛，組1由未被克拉維酸很好地抑制的頭孢菌素組成；組2由青霉素酶、頭孢菌素酶和通常由活性定點(diǎn)的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制的廣譜β-內(nèi)酰胺酶組成；組3由水解青霉素、頭孢菌素和碳青霉烯的金屬-β-內(nèi)酰胺酶組成，且被幾乎所有的含β-內(nèi)酰胺的分子不良抑制；并且組4由那些不能很好地被克拉維酸)和/或分子/Ambler分類A、或分類B、或分類C、或分類Dβ-內(nèi)酰胺酶抑制的青霉素酶組成(參見(jiàn)，例如，Ambler1980,PhilosTransRSocLondBBiolSci.289:321，其內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)，不希望受理論束縛：分類A、C和D聚集絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶的進(jìn)化上不同的群體，和分類B鋅依賴性(“EDTA抑制的”)β-內(nèi)酰胺酶(參見(jiàn)AmblerR.P.等人,1991,BiochemJ.276:269-270，其內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入)。在一些實(shí)施方案中，抗生素降解酶是絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶或鋅依賴性(EDTA抑制的)β-內(nèi)酰胺酶。例如，在一些實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶是P1A、P2A或P3A的一個(gè)或多個(gè)。此外，β-內(nèi)酰胺酶可以是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBL)，任選地選自TEM、SHV、CTX-M、OXA、PER、VEB、GES和IBCβ-內(nèi)酰胺酶。此外，β-內(nèi)酰胺酶可以是抑制劑抗性的β-內(nèi)酰胺酶，任選地選自AmpC型β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶、IMP型碳青霉烯酶(金屬-β-內(nèi)酰胺酶)、VIM(Verona整合子編碼的金屬-β-內(nèi)酰胺酶)、β-內(nèi)酰胺酶的OXA(苯唑西林酶(oxacillinase))組、KPC(肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶)、CMY(分類C)、SME、IMI、NMC和CerA和NDM(新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶，例如NDM-1)β-內(nèi)酰胺酶。在一些實(shí)施方案中，另外的藥劑是用于，例如，如本文所述的CDI治療中的輔助治療劑。在一些實(shí)施方案中，另外的藥劑是甲硝唑(例如FLAGYL)、非達(dá)霉素(例如DIFICID)或萬(wàn)古霉素(例如萬(wàn)古霉素)、利福昔明，糞細(xì)菌療法、炭基粘合劑(例如DAV132)、益生菌療法(參見(jiàn)，Intnat’lJInfDis,16(11):e786，其內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用并入，說(shuō)明性益生菌包括布拉酵母菌；鼠李糖乳桿菌GG；植物乳桿菌299v；酪酸梭狀芽孢桿菌M588；艱難梭狀芽孢桿菌VP20621(非產(chǎn)毒艱難梭狀芽孢桿菌菌株)；干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌(Bio-K+CL1285)的組合；干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌(Actimel)的組合；嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌(Florajen3)的組合；嗜酸乳桿菌、德氏保加利亞乳桿菌保加利亞亞種、保加利亞干酪乳桿菌，保加利亞植物乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、唾液鏈球菌嗜熱亞種(VSL#3))的組合，以及抗體或其它生物治療(例如NEnglJMed.2010；362(3):197中所述的針對(duì)艱難梭狀芽孢桿菌毒素A和B的單克隆抗體，其內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用整體并入；中和結(jié)合蛋白，例如，排列成多聚體，其被定向至美國(guó)專利公開(kāi)號(hào)2013/0058962中敘述的一個(gè)或多個(gè)SEQIDNo.(例如，SEQIDNo.:59、60、95、67、68和87中的一個(gè)或多個(gè))，其內(nèi)容通過(guò)引用并入本文)；或針對(duì)艱難梭狀芽孢桿菌二元毒素的任何中和結(jié)合蛋白。在一些實(shí)施方案中，本文所述的任何青霉素和頭孢菌素可以是另外的藥劑。對(duì)于所有的其它藥劑的組合物和方法，靶向GI道的不同部分可以如本文所述使用。在一些實(shí)施方案中，本文所述的本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)包括經(jīng)修飾的衍生物，即通過(guò)使任何類型的分子共價(jià)連接到該組合物，使得共價(jià)連接不阻止組合物的活性。例如，但不通過(guò)限制的方式，衍生物包括通過(guò)以下方式修飾的組合物，尤其是糖基化、脂化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過(guò)已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)衍生化，蛋白水解裂解，與細(xì)胞配體或其它蛋白質(zhì)連接等。許多化學(xué)修飾的任一種可以通過(guò)已知技術(shù)來(lái)進(jìn)行，所述已知技術(shù)包括但不限于特定化學(xué)裂解、乙酰化、甲酰化，衣霉素(turicamycin)的代謝合成等。另外，衍生物可含有一種或多種非經(jīng)典氨基酸。在又其它實(shí)施方案中，本文所述的本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物可被修飾以添加效應(yīng)子部分諸如化學(xué)連接子，可檢測(cè)部分諸如例如熒光染料、酶、底物、生物發(fā)光材料、放射性材料，和化學(xué)發(fā)光部分，或官能部分，諸如例如鏈霉親和素、抗生物素蛋白、生物素、細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒性劑和放射性材料。本文所述的本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可具有足夠堿性的官能團(tuán)，其可與無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸、或羧基反應(yīng)，其可與無(wú)機(jī)堿或有機(jī)堿反應(yīng)，以形成藥學(xué)上可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的酸加成鹽由藥學(xué)上可接受的酸形成，如在本領(lǐng)域所熟知的。這樣的鹽包括，以下列出的藥學(xué)上可接受的鹽，例如，JournalofPharmaceuticalScience,66,2-19(1977)以及TheHandbookofPharmaceuticalSalts；Properties,Selection,andUse.P.H.Stahl和C.G.Wermuth(編輯),Verlag,Zurich(Switzerland)2002，其據(jù)此通過(guò)引用整體并入。藥學(xué)上可接受的鹽包括，通過(guò)非限制性實(shí)例，硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽，酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來(lái)酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽(glucaronate)、蔗糖酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、樟腦磺酸鹽、雙羥萘酸鹽、苯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙烯酸鹽、氯苯甲酸鹽、二硝基苯甲酸鹽、羥基苯甲酸鹽、甲氧基苯甲酸鹽、甲基苯甲酸鹽、鄰-乙酰氧基苯甲酸鹽、萘-2-苯甲酸鹽、異丁酸鹽、苯基丁酸鹽，α-羥基丁酸鹽、丁炔-1,4-二羧酸鹽、己炔-1,4-二羧酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、肉桂酸鹽、乙醇酸鹽、庚酸鹽、馬尿酸鹽、蘋(píng)果酸鹽、羥基馬來(lái)酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、對(duì)苯二酸鹽、丙炔酸鹽、丙酸鹽、苯基丙酸鹽、癸二酸鹽、辛二酸鹽、對(duì)-溴苯磺酸鹽、氯苯磺酸鹽、乙基磺酸鹽、2-羥基乙基磺酸鹽、甲基磺酸鹽、萘-1-磺酸鹽、萘-2-磺酸鹽、萘-1,5-磺酸鹽、二甲苯磺酸鹽和酒石酸鹽。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”還指具有酸性官能團(tuán)諸如羧酸官能團(tuán)和堿基的本發(fā)明的組合物的鹽。合適的堿包括但不限于，堿金屬諸如鈉、鉀和鋰的氫氧化物；堿土金屬諸如鈣和鎂的氫氧化物；其它金屬諸如鋁和鋅的氫氧化物；氨和有機(jī)胺，諸如未取代的或羥基取代的單、二或三-烷基胺，二環(huán)己胺；三丁胺；吡啶；N-甲基、N-乙胺；二乙胺；三乙胺；單-、雙-或三-(2-OH-低級(jí)烷基胺)，諸如單-、二-或三-(2-羥乙基)胺，2-羥基-叔丁胺或三-(羥甲基)甲胺，N,N-二-低級(jí)烷基-N-(羥基-低級(jí)烷基)-胺，諸如N,N-二甲基-N-(2-羥乙基)胺或三-(2-羥乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；和氨基酸諸如精氨酸、賴氨酸等。在一些實(shí)施方案中，本文所述的組合物為藥學(xué)上可接受的鹽的形式。此外，本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可以作為包含藥學(xué)上可接受的載體或媒介物的組合物的組分向受試者施用。此類組合物可任選地包含合適量的藥學(xué)上可接受的賦形劑以便提供適當(dāng)施用的形式。藥物賦形劑可以是液體，諸如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。藥物賦形劑可以是例如鹽水、阿拉伯樹(shù)膠、明膠、淀粉糊、滑石、角蛋白、膠體二氧化硅、尿素等。另外，可使用輔助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑和著色劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)向受試者施用時(shí)藥學(xué)上可接受的賦形劑是無(wú)菌的。當(dāng)本文所述的任何藥劑靜脈內(nèi)施用時(shí)水是有用的賦形劑。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液體賦形劑，尤其對(duì)于可注射溶液。合適的藥物賦形劑還包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。必要時(shí)，本文所述的藥劑還可包含少量濕潤(rùn)劑或乳化劑或pH緩沖劑。本發(fā)明包括在各種制劑中的所述本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可以采用溶液、懸浮液、乳劑、滴劑、片劑、丸劑、小丸、膠囊、含液體的膠囊、粉末、持續(xù)釋放制劑、栓劑、乳劑、氣霧劑、噴霧劑、懸浮液或適合使用的任何其它形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物為膠囊形式(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5,698,155)。合適的藥物賦形劑的其它實(shí)例描述于Remington’sPharmaceuticalSciences1447-1676(AlfonsoR.Gennaro編輯，第19版，1995)，通過(guò)引用并入本文。必要時(shí)，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)也可包括增溶劑。而且，藥劑可以用本領(lǐng)域已知的合適媒介物或遞送裝置來(lái)遞送。施用的組合物可任選地包括局部麻醉劑，諸如例如利多卡因，以減輕注射部位的疼痛。本文所述的組合治療劑可以在單個(gè)的遞送媒介物或遞送裝置中共同遞送。包含本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或本發(fā)明的藥物組合物(和/或另外的藥劑)的制劑可以方便地以單位劑型存在并且可以通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域熟知的任何方法來(lái)制備。此類方法包括使治療劑與構(gòu)成一種或多種輔助成分的載體締合的步驟。典型地，制劑通過(guò)均勻地和緊密地使治療劑與液體載體、細(xì)碎的固體載體或兩者締合，然后，如果需要的話，使產(chǎn)物成形為期望制劑的劑型(例如，濕法或干法造粒、粉末共混等，隨后使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法壓片)來(lái)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)根據(jù)常規(guī)程序配制為適于本文所述的施用模式的組合物。在一些實(shí)施方案中，任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的施用是口服、靜脈內(nèi)和腸胃外的任一種。在一些實(shí)施方案中，任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的施用不是靜脈內(nèi)，以便例如防止抗生素系統(tǒng)施用的干擾。在其它實(shí)施方案中，施用途徑包括，例如：口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、舌下、鼻內(nèi)、腦內(nèi)、陰道內(nèi)、經(jīng)皮、直腸、通過(guò)吸入，或局部，特別是施用到耳、鼻、眼或皮膚。在一些實(shí)施方案中，施用通過(guò)口服或腸胃外注射實(shí)現(xiàn)。施用模式可以留給醫(yī)生判斷，并且部分取決于醫(yī)學(xué)病癥的部位。在大多數(shù)情況下，施用導(dǎo)致本文所述的任何藥劑釋放到血流中。本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可以口服施用。這種本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)也可通過(guò)任何其它方便的途徑施用，例如通過(guò)靜脈內(nèi)輸注或推注注射、通過(guò)經(jīng)上皮或粘膜皮膚襯層(例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收并且可與另外的藥劑一起施用。施用可為全身性的或局部的。在一些實(shí)施方案中，不在感染部位施用以避免例如抗生素在感染部位水解。各種遞送系統(tǒng)是已知的，例如，包封在脂質(zhì)體、微粒、微膠囊、膠囊等中，并且可以用于施用。在具體實(shí)施方案中，可能需要局部施用至需要治療的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)根據(jù)常規(guī)程序配制為適于向人口服施用的組合物。用于口服遞送的組合物可以為例如片劑、錠劑、水性或油性懸浮液、顆粒、粉末、噴灑劑、乳劑、膠囊、糖漿和酏劑的形式?？诜┯玫慕M合物可包含一種或多種藥劑，例如，甜味劑諸如果糖、阿司帕坦或糖精；調(diào)味劑諸如薄荷、冬青油或櫻桃；著色劑；和防腐劑，以提供藥學(xué)上可口的制劑。此外，在片劑或丸劑形式中，可將組合物包衣以延遲崩解從而在延長(zhǎng)的時(shí)間周期內(nèi)提供持續(xù)作用。包圍驅(qū)動(dòng)本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的滲透活性劑的選擇性滲透膜也適于口服施用的組合物。在這些后者的平臺(tái)上，來(lái)自圍繞膠囊的環(huán)境的流體被驅(qū)動(dòng)化合物吸收，所述驅(qū)動(dòng)化合物溶脹以通過(guò)孔置換藥劑或藥劑組合物。這些遞送平臺(tái)可以提供基本上零級(jí)遞送分布，而不是即刻釋放制劑的峰狀分布。延時(shí)材料諸如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯也可以是有用的。口服組合物可包括標(biāo)準(zhǔn)賦形劑諸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、乙基丙烯酸和它們的衍生物聚合物，以及碳酸鎂。在一個(gè)實(shí)施方案中，賦形劑是藥用級(jí)的。除活性化合物外，懸浮液還可含有助懸劑，諸如例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤(rùn)土、瓊脂-瓊脂、黃芪膠等，及其混合物。適于腸胃外施用的劑型(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注)包括例如溶液、懸浮液、分散體、乳劑等。它們也可以以無(wú)菌固體組合物(例如凍干的組合物)形式制造，所述無(wú)菌固體組合物可以在使用前立即溶解或懸浮于無(wú)菌可注射介質(zhì)。它們可以含有，例如，本領(lǐng)域已知的懸浮劑或分散劑。本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可通過(guò)例如直接或間接地接觸胃腸道的粘膜組織施用給受試者。胃腸道包括消化系統(tǒng)的器官，諸如口腔、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸和直腸，并包括其所有的分段(例如，小腸可包括十二指腸、空腸和回腸；大腸可包括橫結(jié)腸、降結(jié)腸、升結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和盲腸)。各種方法可用于配制和/或遞送本文所述的藥劑至所關(guān)注的部位。例如，本文所述的本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可被配制成用于遞送至胃、小腸、大腸和直腸的一者或多者，并且包括其所有的分段(例如，十二指腸、空腸和回腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、升結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和盲腸)。在一些實(shí)施方案中，本文所述的組合物可經(jīng)配制以遞送至上或下GI道。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物經(jīng)配制用于腸遞送。例如，組合物可被配制成用于口服遞送的膠囊或片劑，并且可以包含含有一種或多種腸溶藥劑的延遲釋放包衣。延遲釋放包衣在胃液中基本上穩(wěn)定且在腸液中基本上不穩(wěn)定(例如，快速溶解或?yàn)槲锢砩喜环€(wěn)定的)，從而提供在小腸的受影響區(qū)域中從組合物中的大量釋放的活性劑，所述受影響區(qū)域例如十二指腸、空腸和/或回腸或大腸，例如橫結(jié)腸、降結(jié)腸、升結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和盲腸。本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或附另外的藥劑)在胃液或模擬腸液中通常是穩(wěn)定，即，組合物在酸性環(huán)境中是穩(wěn)定的。因此，組合物在大約120分鐘內(nèi)在pH5或更低的胃液或pH5或更低的模擬胃液中釋放少于30重量％的活性劑。本發(fā)明的組合物可在大約120分鐘在pH5或更低的胃液或pH5或更低的模擬胃液中釋放約0重量％至約25重量％、或約0重量％至約10重量％的活性劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在大約120分鐘在胃液或pH5或更低的模擬胃液中釋放不超過(guò)約1重量％、約2重量％、約3重量％、約4重量％、約5重量％、約6重量％、約7重量％、約8重量％、約9重量％或約10重量％的活性劑。藥物組合物通常釋放活性劑以在小腸或大腸的區(qū)域局部地起作用。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物在約120分鐘內(nèi)在小腸或大腸中釋放約70重量％或更多的活性劑。在某些實(shí)施方案中，組合物在約九十分鐘內(nèi)或約120分鐘內(nèi)在小腸或大腸中釋放80％或更多、或90％或更多的活性劑。在某些實(shí)施方案中，這種在小腸或大腸中的釋放受胃液或模擬胃液的pH值調(diào)節(jié)-例如，當(dāng)pH為約5或更高時(shí)釋放(例如，pH約5.5-6.5在十二指腸中釋放，pH約6-7在升結(jié)腸或空腸中釋放，pH約6.5-7在回腸中釋放，pH約7-7.5在降結(jié)腸中釋放)。藥物組合物可以通過(guò)一個(gè)或多個(gè)延遲釋放包衣控制活性劑的腸釋放，所述延遲釋放包衣在胃液中保持基本上完整和/或可以是基本上不溶的。延遲釋放包衣的穩(wěn)定性可以是pH依賴性的。pH依賴性的延遲釋放包衣將在酸性環(huán)境(pH為5或更低)中基本上穩(wěn)定，并且在近中性至堿性環(huán)境(pH值大于5)中基本上不穩(wěn)定。例如，延遲釋放包衣可在近中性至堿性環(huán)境(諸如見(jiàn)于小腸或大腸)中基本上崩解或溶解，從而局部地釋放活性劑至患病或受影響的組織。模擬胃液和模擬腸液的實(shí)例包括但不限于，2005Pharmacopeia23NF/28USPTestSolutions中第2858頁(yè)公開(kāi)的那些和/或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它模擬胃液和模擬腸液，例如，不含酶的制備的模擬胃液和/或腸液?；蛘撸舆t釋放包衣的穩(wěn)定性可以是酶依賴性的。酶依賴性的延遲釋放包衣將在不含有特定酶的流體中基本上穩(wěn)定，并且在含有酶的流體中基本不穩(wěn)定。延遲釋放包衣將在含有合適酶的流體中基本上崩解或溶解?？衫缤ㄟ^(guò)使用僅在暴露于腸中的酶時(shí)釋放活性成分的物質(zhì)(諸如半乳甘露聚糖)而引起酶依賴性控制。在一些實(shí)施方案中，用于從本發(fā)明的組合物(其包括胃抗性膠囊或片劑)釋放活性劑的靶器官是小腸，諸如十二指腸和空腸或大腸，例如橫結(jié)腸、降結(jié)腸、升結(jié)腸、乙狀結(jié)腸和盲腸。對(duì)于此類片劑或膠囊的制備的實(shí)例，參見(jiàn)Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版，Osol編輯,MackPublishingCo.,第89章(1980)；Digenis等人，J.Pharm.Sci.,83:915-921(1994)；Vantini等人,ClinicaTerapeutica,145:445-451(1993)；Yoshitomi等人,Chem.Pharm.Bull.,40:1902-1905(1992)；Thoma等人,Pharmazie,46:331-336(1991)；Morishita等人,DrugDesignandDelivery,7:309-319(1991)；以及Lin等人,PharmaceuticalRes.,8:919-924(1991)(在以上的內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用整體并入)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以使用EUDRAGIT系統(tǒng)來(lái)配制，如本領(lǐng)域已知的且描述于PharmaPolymerNo.7，2000年10月，其內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用整體并入。本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的劑量以及給藥方案的可取決于各種參數(shù)，包括但不限于待治療的疾病、受試者的一般健康和施用醫(yī)生的判斷。本文所述的任何藥劑可以在向有需要的受試者施用另外的治療劑之前(例如，之前5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同時(shí)或之后(例如，之后5分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。在各個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的任何藥劑施用間隔1分鐘、間隔10分鐘、間隔30分鐘、間隔小于1小時(shí)、間隔1小時(shí)、間隔1小時(shí)至2小時(shí)、間隔2小時(shí)至3小時(shí)、間隔3小時(shí)至4小時(shí)、間隔4小時(shí)至5小時(shí)、間隔5小時(shí)至6小時(shí)、間隔6小時(shí)至7小時(shí)、間隔7小時(shí)至8小時(shí)、間隔8小時(shí)至9小時(shí)、間隔9小時(shí)至10小時(shí)、間隔10小時(shí)至11小時(shí)、間隔11小時(shí)至12小時(shí)、間隔不超過(guò)24小時(shí)或間隔不超過(guò)48小時(shí)。與載體物質(zhì)混合以產(chǎn)生單一劑量的本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的量，可根據(jù)被治療的受試者和特定的施用模式而變化?？刹捎皿w外或體內(nèi)測(cè)定以幫助鑒別最佳劑量范圍。通常，有用的劑量是本技術(shù)人員已知的。例如，劑量可參照Physicians’DeskReference，第66版，PDRNetwork；2012版本(2011年12月27日)確定，其內(nèi)容通過(guò)引用整體并入。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明允許患者接受超過(guò)參照Physicians’DeskReference確定的劑量的劑量。本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的劑量可取決于若干因素，包括病狀的嚴(yán)重程度、病狀是否被治療或預(yù)防，及待治療的受試者的年齡、體重和健康。此外，關(guān)于特定受試者的藥物基因組學(xué)(基因型對(duì)治療劑的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)或效力分布的影響)信息可以影響使用的劑量。此外，確切的個(gè)體劑量可以在某種程度上根據(jù)多種因素來(lái)調(diào)節(jié)，所述因素包括被施用的藥劑的具體組合、施用時(shí)間、施用途徑、制劑性質(zhì)、排泄速率、被治療的特定疾病、病癥的嚴(yán)重程度以及病癥的解剖位置?？梢灶A(yù)期劑量的一些變化。在具體實(shí)施方案中，當(dāng)口服施用時(shí)，任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的濃度為約0.2至約20g/L，或者當(dāng)靜脈內(nèi)施用時(shí)，所述濃度為約4g/mL。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)口服施用給哺乳動(dòng)物時(shí)，本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的劑量可為約0.001mg/kg/天至約100mg/kg/天、約0.01mg/kg/天至約50mg/kg/天或約0.1mg/kg/天至約10mg/kg/天。當(dāng)口服施用給人時(shí)，本文所述的任何藥劑的劑量通常為每天約0.001mg至1000mg、每天約1mg至約600mg或每天約5mg至約30mg。在一個(gè)實(shí)施方案中，將100mg/天的本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物口服施用給人。對(duì)于通過(guò)腸胃外注射施用本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)，劑量通常為每天約0.1mg至約250mg、每天約1mg至約20mg或每天約3mg至約5mg。注射可以每天給予多達(dá)四次。通常，當(dāng)口服或腸胃外施用時(shí)，本文所述的任何藥劑的劑量通常為每天約0.1mg至約1500mg，或每天約0.5mg至約10mg，或每天約0.5mg至約5mg。可以每天施用多達(dá)約3000mg的劑量。在一些實(shí)施方案中，劑量可以是每天約1000mg。在一些實(shí)施方案中，可以使用以下劑量方案：100mg，一天四次。在各個(gè)實(shí)施方案中，施用本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的劑量以達(dá)到約1ng/ml至約10,000ng/ml、約1ng/ml至約5,000ng/ml、約1ng/ml至約2,500ng/ml、約1ng/ml至約1,000ng/ml、約1ng/ml至約500ng/ml、約1ng/ml至約250ng/ml、約1ng/ml至約100ng/ml、約1ng/ml至約50ng/ml、約1ng/ml至約25ng/ml、約1ng/ml至約10ng/ml、約10ng/ml至約10,000ng/ml、約10ng/ml至約5,000ng/ml、約10ng/ml至約2,500ng/ml、約10ng/ml至約1,000ng/ml、約10ng/ml至約500ng/ml、約10ng/ml至約250ng/ml、約10ng/ml至約100ng/ml、約10ng/ml至約50ng/ml、約10ng/ml至約25ng/ml、約100ng/ml至約10,000ng/ml、約100ng/ml至約5,000ng/ml、約100ng/ml至約2,500ng/ml、約100ng/ml至約1,000ng/ml、約100ng/ml至約500ng/ml或約100ng/ml至約250ng/ml的腸濃度。在各個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的腸濃度為10ng/ml、100ng/ml或1,000ng/ml。在另一實(shí)施方案中，可以以囊泡，特別是脂質(zhì)體遞送(參見(jiàn)Langer,1990,Science249:1527-1533；Treat等人,于LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-Berestein和Fidler(編輯),Liss,NewYork,第353-365頁(yè)(1989)。本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可通過(guò)控制釋放或持續(xù)釋放工具或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的遞送裝置來(lái)施用。實(shí)例包括但不限于，在美國(guó)專利號(hào)3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556和5,733,556中描述的那些，所述美國(guó)專利的每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文。此類劑型可用于使用例如羥丙基纖維素(hydropropylcellulose)、羥丙基甲基纖維素(hydropropylmethylcellulose)、聚乙烯吡咯烷酮、其它聚合物基質(zhì)、凝膠、可滲透膜、滲透系統(tǒng)、多層包衣、微粒、脂質(zhì)體、微球體或其組合以不同的比例提供期望的釋放曲線來(lái)提供一種或多種活性成分的控釋或緩釋?？梢匀菀椎剡x擇本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適控制釋放或持續(xù)釋放制劑(包括本文所述的制劑)與本文所述的藥劑的活性成分一起使用。因此，本發(fā)明提供適于口服施用的單一單位劑型，諸如但不限于適于控制釋放或持續(xù)釋放的片劑、膠囊、軟膠囊和小膠囊?；钚猿煞值目刂漆尫呕虺掷m(xù)釋放可通過(guò)各種條件來(lái)刺激，包括但不限于pH的變化、溫度的變化、通過(guò)合適光波長(zhǎng)的刺激、酶的濃度或可用性、水的濃度或可用性或者其它生理?xiàng)l件或化合物。在另一實(shí)施方案中，可以使用聚合物材料(參見(jiàn)MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise(編輯),CRCPres.,BocaRaton,Florida(1974)；ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(編輯),Wiley,NewYork(1984)；Ranger和Peppas,1983,J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；還參見(jiàn)Levy等人,1985,Science228:190；During等人,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard等人,1989,J.Neurosurg.71:105)。在另一實(shí)施方案中，可將控制釋放系統(tǒng)放置在待治療的靶標(biāo)區(qū)域附近，因此僅需要系統(tǒng)劑量的一部分(參見(jiàn)，例如Goodson,于MedicalApplicationsofControlledRelease,同上,第2卷,第115-138頁(yè)(1984))。可以使用Langer,1990,Science249:1527-1533)的綜述中討論的其它控制釋放系統(tǒng)。本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的施用可獨(dú)立地為每天一至六次(例如，每天1、或2、或3、或4、或5、或6次)或每月一至四次或每年一至六次或每隔二、三、四或五年一次。施用可以為一天或一個(gè)月、兩個(gè)月、三個(gè)月、六個(gè)月、一年、兩年、三年的持續(xù)時(shí)間，并且甚至可以是受試者的終生。將在許多情況下指示慢性、長(zhǎng)期施用。劑量可以作為單次劑量施用或分成多次劑量。一般來(lái)說(shuō)，雖然可能需要數(shù)月或數(shù)年或更長(zhǎng)時(shí)間的施用時(shí)期，但期望的劑量應(yīng)以設(shè)定的間隔持續(xù)長(zhǎng)時(shí)期，通常至少數(shù)周或數(shù)月內(nèi)施用。利用本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)的劑量方案可以根據(jù)多種因素選擇，所述因素包括受試者的類型、種類、年齡、體重、性別和醫(yī)療狀況；待治療的病況的嚴(yán)重程度；施用途徑；受試者的腎功能或肝功能；個(gè)體的藥物基因組學(xué)組成；和所使用的本發(fā)明的具體化合物。本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可以按單次每日劑量施用，或者總每日劑量可以按每日二、三或四次的分開(kāi)劑量施用。此外，本文所述的任何本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可以連續(xù)地而不是間歇地在整個(gè)劑量方案中施用。在各個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防GI道中抗生素引起的副作用的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防GI道中抗生素引起的副作用的方法，包括向有需要的患者(通過(guò)非限制性實(shí)例，被施用或?qū)⒈皇┯每股氐幕颊撸ū疚乃龅幕颊?施用有效量的本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。在各個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療或預(yù)防艱難梭狀芽孢桿菌感染(CDI)和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病的方法，包括向有需要的患者施用有效量的本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防艱難梭狀芽孢桿菌感染(CDI)和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病的方法，包括向有需要的患者(通過(guò)非限制性實(shí)例，被施用或?qū)⒈皇┯玫目股氐幕颊?，包括本文所述的患?施用有效量的本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。在各個(gè)實(shí)施方案中，抗生素引起的副作用和/或CDI或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病是以下的一種或多種：抗生素相關(guān)性腹瀉、艱難梭狀芽孢桿菌腹瀉(CDD)、艱難梭狀芽孢桿菌腸炎性疾病、結(jié)腸炎、假膜性結(jié)腸炎、發(fā)熱、腹痛、脫水和電解質(zhì)紊亂、巨結(jié)腸、腹膜炎以及穿孔和/或結(jié)腸破裂。在各個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于保護(hù)受試者的胃腸微生物組的方法，包括施用有效量的本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。在各個(gè)實(shí)施方案中，受試者正在經(jīng)受抗生素治療或最近已經(jīng)經(jīng)受抗生素治療。在各個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)是能夠使抗生素降解或失活。在各個(gè)實(shí)施方案中，受試者包括但不限于，處于微生物組介導(dǎo)的病癥的特定風(fēng)險(xiǎn)下的受試者，諸如，通過(guò)非限制性實(shí)例，經(jīng)受抗生素治療或與最近已經(jīng)經(jīng)受抗生素治療的受試者。例如，受試者可以已經(jīng)在過(guò)去的約30天左右期間攝取抗生素和/或具有弱的免疫系統(tǒng)(例如，由于慢性疾病)和/或?yàn)閶D女和/或?yàn)槔夏耆?例如，在約65歲以上)和/或?yàn)槔夏陭D女和/或正在經(jīng)受(或已經(jīng)經(jīng)受)對(duì)于胃灼熱或胃酸病癥(例如，用諸如蘭索拉唑(PREVACID)、泰胃美(TAGAMET)、奧美拉唑(PRILOSEC)或埃索美拉唑(NEXIUM)和相關(guān)藥物的藥劑)的治療和/或最近已經(jīng)住院，包括在重癥監(jiān)護(hù)病房或住在療養(yǎng)院院。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途治療或預(yù)防醫(yī)院感染和/或繼發(fā)性突發(fā)感染和/或醫(yī)院獲得性感染(HAI)。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括治療或預(yù)防微生物組介導(dǎo)的病癥。說(shuō)明性微生物組介導(dǎo)的病癥包括但不限于，例如，在WO2014/121298的表3中發(fā)現(xiàn)的病癥，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。例如，微生物組介導(dǎo)的病癥可以選自由抗生素引起的副作用，艱難梭狀芽孢桿菌感染(CDI)、艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病和腸易激綜合征。在各個(gè)實(shí)施方案中，微生物組介導(dǎo)的病癥是抗生素引起的副作用、艱難梭狀芽孢桿菌感染(CDI)或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療GI道中抗生素引起的副作用的方法，包括向受試者施用有效量的本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)，所述受試者正在經(jīng)受抗生素治療或最近已經(jīng)經(jīng)受抗生素治療。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)防GI道中抗生素引起的副作用的方法，包括向受試者施用有效量的本文所述的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)，所述受試者正在經(jīng)受抗生素治療或最近已經(jīng)經(jīng)受抗生素治療。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的用途和方法涉及用本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物和本文所述的任何另外的藥劑和/或任何初始和/或輔助治療共同治療(同時(shí)或依序)，或者用本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物和本文所述的任何另外的藥劑和/或用于本文所述的各種疾病的任何初始和/或輔助治療的共同制劑治療，或者通過(guò)施用本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物至患者用于在患者中治療本文所述的各種疾病的方法，所述患者經(jīng)受本文所述的任何另外的藥劑和/或本文所述的任何初始和/或輔助治療的治療。在各個(gè)實(shí)施方案中，在初始發(fā)作或復(fù)發(fā)(relapse)/再發(fā)(recurrence)的背景下(例如，由于持續(xù)或重新開(kāi)始抗生素治療)治療或預(yù)防CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病。例如，先前已罹患CDI的在患者中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)可以在再發(fā)的最初癥狀時(shí)施用。通過(guò)非限制性實(shí)例，再發(fā)的癥狀包括，在輕度的情況下，每天排水樣便約5至約10次，無(wú)顯著發(fā)熱，且僅有輕度腹部痙攣，而血液測(cè)試可顯示白血細(xì)胞計(jì)數(shù)緩和上升，多達(dá)約15,000個(gè)(正常水平是多達(dá)約10,000個(gè))，在嚴(yán)重的情況下，每天排水樣便多于約10次、惡心、嘔吐、高燒(例如，約102-104°F)、直腸出血、劇烈腹痛(例如具有壓痛)、腹脹以及高白細(xì)胞計(jì)數(shù)(例如，約15,000個(gè)至約40,000個(gè))。無(wú)論初始發(fā)作或復(fù)發(fā)/再發(fā)，CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病可經(jīng)由本文所述的任何癥狀(例如，一天約3次或更多次水樣便，持續(xù)約2天或更多天，輕度至嚴(yán)重痙攣和腹部疼痛，發(fā)燒，便中有血或膿，惡心，脫水，食欲不振，體重減輕等)進(jìn)行診斷。無(wú)論初始發(fā)作或復(fù)發(fā)/再發(fā)，CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病也可經(jīng)由酶免疫測(cè)定診斷，例如以檢測(cè)艱難梭狀芽孢桿菌毒素A或B抗原和/或由艱難梭狀芽孢桿菌生物體產(chǎn)生的谷氨酰胺脫氫酶(GDH)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如，以檢測(cè)艱難梭狀芽孢桿菌毒素A或B基因或其部分(例如，tcdA或tcdB)，包括ILLUMIGENELAMP測(cè)定)；細(xì)胞毒性測(cè)定。例如，可使用可使用以下測(cè)試中的任何一種：MeridianImmunoCardToxinsA/B；WampoleToxinA/BQuikChek；WampoleC.diffQuikChekComplete；RemelXpectClostridiumdifficileToxinA/B；MeridianPremierToxinsA/B；WampoleC.difficileToxA/BII；RemelProspectToxinA/BEIA；BiomerieuxVidasC.difficileToxinA&B；BDGeneohmC.diff；ProdesseProgastroCD；和CepheldXpertC.diff。在各個(gè)實(shí)施方案中，臨床樣本是患者糞便樣本。另外，可屈性乙狀結(jié)腸鏡檢查“范圍”試驗(yàn)和/或腹部X射線和/或計(jì)算機(jī)化斷層(CT)掃描(提供結(jié)腸圖像)可用于評(píng)估患者(例如，尋找粘附于結(jié)腸壁的特征性乳白色或黃色斑)。另外，活檢(例如GI道的任何區(qū)域)可用于評(píng)估潛在的CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病患者。此外，本發(fā)明的患者包括但不限于，處于CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病的特定風(fēng)險(xiǎn)下的患者，諸如在過(guò)去的30天左右期間已經(jīng)攝取抗生素和/或具有弱的免疫系統(tǒng)(例如，由于慢性疾病)和/或?yàn)閶D女和/或?yàn)槔夏耆?例如，在約65歲以上)和/或?yàn)槔夏陭D女和/或經(jīng)受對(duì)于胃灼熱或胃酸病癥(例如，用諸如蘭索拉唑、泰胃美、奧美拉唑或埃索美拉唑和相關(guān)藥物的藥劑)的治療和/或最近已經(jīng)住院，包括在重癥監(jiān)護(hù)病房或住在療養(yǎng)院的患者。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途治療或預(yù)防醫(yī)院感染和/或繼發(fā)性突發(fā)感染和/或醫(yī)院獲得性感染(HAI)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法治療或預(yù)防頭孢曲松相關(guān)的副作用(例如，腹瀉、惡心、嘔吐、味覺(jué)障礙和偽膜性結(jié)腸炎疾病和/或癥狀)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途涉及正在經(jīng)受一種或多種主要抗生素治療或最近已經(jīng)經(jīng)受一種或多種主要抗生素治療的患者?！爸饕股亍笔侵赶蚧颊呤┯貌⑶铱蓪?dǎo)致CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病的抗生素。這些包括最經(jīng)常導(dǎo)致CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病的抗生素：氟喹諾酮、頭孢菌素、克林霉素和青霉素。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途涉及在主要抗生素進(jìn)入大腸之前水解所述抗生素的本發(fā)明β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途涉及水解GI道中過(guò)量的抗生素殘留物的本發(fā)明β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途涉及維持患者GI道中正常的腸微生物群和/或防止一種或多種致病微生物過(guò)度生長(zhǎng)的本發(fā)明β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)。在各個(gè)實(shí)施方案中，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)基本上不干擾主要抗生素的血漿水平。例如，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)允許患者接收對(duì)于感染可能需要的主要抗生素且不干擾抗生素的系統(tǒng)利用。相反地，β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)使可在GI道的部分繁殖的過(guò)量抗生素失活，且這樣做，防止與本文所述的各種疾病狀態(tài)相關(guān)的微生物群的破壞。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)沒(méi)有被系統(tǒng)吸收。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)基本上不干擾系統(tǒng)施用的抗生素的活性。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)起到消除抗生素干擾微生物組的微生物群(例如腸道，包括大腸)的作用。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)不干擾抗生素自腸的吸收和/或腸肝上(enterohepatically)充足地以改變抗生素循環(huán)的半衰期。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物(和/或另外的藥劑)不干擾來(lái)自腸的抗生素吸收和/或腸肝上足夠的是臨床上重要的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途包括其中向患者施用初始和/或輔助治療的那些。初始和/或輔助治療指示在檢測(cè)到這樣的疾病時(shí)用于治療CDI和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病的治療。在一些實(shí)施方案中，初始和/或輔助治療是甲硝唑、萬(wàn)古霉素、非達(dá)霉素、利福昔明、糞細(xì)菌療法、益生菌療法和抗體療法中的一種或多種，如本文所述。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途包括將本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶作為用于任何這些初始和/或輔助治療(包括共同施用或依序施用)的佐劑。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和用途包括在進(jìn)行初始和/或輔助治療的患者中使用本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶。在其它方面，本發(fā)明提供了β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物，用于在GI道中治療的抗生素引起的副作用和/或預(yù)防或治療艱難梭狀芽孢桿菌感染(CDI)和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病。在其它方面，本發(fā)明提供了β-內(nèi)酰胺酶和/或藥物組合物的用途，用于治療GI道中抗生素引起的副作用和/或預(yù)防或治療艱難梭狀芽孢桿菌感染(CDI)和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病。此外，一些方面提供了所公開(kāi)的β-內(nèi)酰胺酶在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療GI道中抗生素引起的副作用和/或預(yù)防或治療艱難梭狀芽孢桿菌感染(CDI)和/或艱難梭狀芽孢桿菌相關(guān)疾病。在各個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了減輕或防止患者的腸道中各種大腸菌群(包括毒性和/或抗生素抗性的大腸菌群)過(guò)度生長(zhǎng)的組合物和方法。在各個(gè)方面，本文所述的方法和組合物預(yù)防或減輕抗性生物體的繼發(fā)性感染，并且可以，在一些實(shí)施方案中，減少β-內(nèi)酰胺抗性的發(fā)展。此外，本文所述的方法和組合物可以允許使用由于抗性問(wèn)題而目前避免的β-內(nèi)酰胺酶抗生素和/或減少與一種或多種β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(例如，奧格門(mén)汀(AUGMENTIN)是阿莫西林和克拉維酸的混合物)共同施用或共同配制的需要。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“患者”和“受試者”可互換使用。在一些實(shí)施方案中，受試者和/或動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、馬、牛、豬、兔、羊或非人靈長(zhǎng)動(dòng)物，諸如猴子、黑猩猩或狒狒。在其它實(shí)施方案中，受試者和/或動(dòng)物是非哺乳動(dòng)物，例如，斑馬魚(yú)。在一些實(shí)施方案中，受試者和/或動(dòng)物可包含熒光標(biāo)記的細(xì)胞(用例如GFP)。在一些實(shí)施方案中，受試者和/或動(dòng)物是包含熒光細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，受試者和/或動(dòng)物是人。在一些實(shí)施方案中，人是兒童。在其它實(shí)施方案中，人是成年人。在其它實(shí)施方案中，人是老年人。在其它實(shí)施方案中，人可以稱為患者。在某些實(shí)施方案中，人的年齡范圍為約6至約18個(gè)月大、約18至約36個(gè)月大、約1至約5歲大、約5至約10歲大、約10至約15歲大、約15至約20歲大、約20至約25歲大、約25至約30歲大、約30至約35歲大、約35至約40歲大、約40至約45歲大、約45至約50歲大、約50至約55歲大、約55至約60歲大、約60至約65歲大、約65至約70歲大、約70至約75歲大、約75至約80歲大、約80至約85歲大、約85至約90歲大、約90至約95歲大或約95至約100歲大。在其它實(shí)施方案中，受試者是非人動(dòng)物，因此，本發(fā)明涉及獸醫(yī)用途。在特定實(shí)施方案中，非人動(dòng)物是家庭寵物。在另一特定實(shí)施方案中，非人動(dòng)物是家畜動(dòng)物。本發(fā)明提供了可簡(jiǎn)化本文所述的任何藥劑的施用的試劑盒。本發(fā)明的示例性試劑盒包括單位劑型的本文所述的任何組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，單位劑型為容器，諸如預(yù)填充注射器，其可以是無(wú)菌的，含有本文所述的任何藥劑和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或媒介物。試劑盒還可包括指導(dǎo)本文所述的任何藥劑的使用的標(biāo)簽或印刷說(shuō)明書(shū)。試劑盒還可包括眼瞼擴(kuò)張器、局部麻醉劑和用于施用部位的清洗劑。試劑盒還可進(jìn)一步包括本文所述的一種或多種另外的藥劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括容納有效量的本發(fā)明的組合物和有效量的另一種組合物的容器，例如本文所述的那些。本發(fā)明進(jìn)一步通過(guò)以下非限制實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例通篇使用以下縮寫(xiě)：實(shí)施例1：材料和方法不同P1A突變體使用SOE或QUIKCHANGE多定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，CA，USA)定點(diǎn)誘變或者使用隨機(jī)誘變?cè)噭┖?Stratagene，CA，USA)隨機(jī)誘變來(lái)生成。將突變的DNA轉(zhuǎn)化到細(xì)菌(大腸桿菌或枯草芽孢桿菌)中，所述細(xì)菌在頭孢噻肟(定點(diǎn)突變體)或頭孢曲松(隨機(jī)突變體)上篩選。β-內(nèi)酰胺酶在菌落中的存在用頭孢硝噻測(cè)試進(jìn)一步證實(shí)并且選擇陽(yáng)性菌落用于進(jìn)一步分析。突變?chǔ)?內(nèi)酰胺酶的DNA序列通過(guò)測(cè)序證實(shí)。突變體的β-內(nèi)酰胺酶活性進(jìn)一步由大腸桿菌細(xì)胞裂解物和具有氨芐青霉素、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢呋辛、頭孢他啶、美羅培南和亞胺培南的枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)上清液表征。僅使用所測(cè)試的每種抗生素的底物濃度測(cè)定活性。抗生素濃度的選擇與抗生素濃度一起完成濃度高是可行的，[S]>>Km?；谶@些初步實(shí)驗(yàn)，對(duì)幾個(gè)突變體從定點(diǎn)和隨機(jī)誘變研究線測(cè)定更精確的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。所有選擇用于更詳細(xì)研究的突變體酶在枯草芽孢桿菌宿主菌RS303中表達(dá)。攜帶突變的蛋白質(zhì)的細(xì)胞在基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)過(guò)夜，之后收獲細(xì)胞且將上清液在AmiconUltra-4離心設(shè)備，MWCO10000(Amicon)中以1:10濃縮。各培養(yǎng)物上清液中的蛋白質(zhì)濃度使用P1A參考材料A18K31作為標(biāo)準(zhǔn)物由12％SDS-PAGE(CriterionXTBis-Tris,BioRad,CA,USA)估計(jì)。對(duì)于每個(gè)所選的突變菌株，測(cè)量頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢呋辛的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。將定點(diǎn)突變體設(shè)計(jì)成水解頭孢噻肟且用頭孢曲松篩選隨機(jī)突變體，使得這些抗生素自然選擇用于確定動(dòng)力學(xué)參數(shù)。P1A修飾在P1A中進(jìn)行一系列突變，包括：表1：來(lái)自基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)的P1A上的突變和頭孢噻肟降解的P1A衍生物的構(gòu)建區(qū)段1I72S,Q135M,T160F區(qū)段2A232,A237S,A238G,S240DR244TD276R/K及這些的不同組合平行于定點(diǎn)誘變，對(duì)P1A和P3A用頭孢曲松作為篩選抗生素進(jìn)行隨機(jī)誘變。還存在對(duì)于質(zhì)量控制研究所制備的P1A的兩個(gè)修飾突變體：P1A-N293D(IS205，“脫酰胺突變體”)和P1A-ΔMNGK(IS206，“缺失突變體”)。這兩種菌株的生長(zhǎng)如P1A菌株RS310同樣好并且蛋白產(chǎn)量也大約相同。這些突變也不影響蛋白質(zhì)的結(jié)晶性。所選的CTX-M酶的序列源自Swiss-Prot蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)并且三維結(jié)構(gòu)源自ProteinDataBank(PDB)。個(gè)別序列和結(jié)構(gòu)的登錄代碼如下表示。在一些情況下，這種數(shù)據(jù)用于預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)功能活性。研究中使用的酶的說(shuō)明性Swiss-Prot或TrEMBL、GenBank和ProteinDataBank(PDB)登錄代碼。Linux工作站和FedoraCore5操作系統(tǒng)用作研究平臺(tái)。用Bodil分子建模環(huán)境進(jìn)行序列比對(duì)和分析以及建模和三維結(jié)構(gòu)分析。此外，設(shè)計(jì)和制備若干其它P1A突變體。這些突變體中的一個(gè)是IS288，其具有以下突變：A232G、A237S、A238G、A240S和D276N。四個(gè)突變A232G、A237S、A238G和A240S是所謂的“區(qū)段2”-突變。第五個(gè)突變體，D276N，是“P3A”-突變，其僅給予蛋白質(zhì)降解頭孢曲松的能力。在P1A變體IS288是對(duì)P1A基因兩輪誘變和分泌的P1A變體的初步活性測(cè)定的結(jié)果。將通過(guò)定點(diǎn)誘變制備的若干P1A變體克隆到枯草芽孢桿菌生產(chǎn)宿主中并且在搖瓶培養(yǎng)中生產(chǎn)。將這些突變菌株的生長(zhǎng)上清液濃縮，并且用于測(cè)量每個(gè)菌株降解所選頭孢菌素的能力。以較大規(guī)模生產(chǎn)IS288，且使用硫酸銨沉淀、疏水相互作用色譜和超濾來(lái)純化。設(shè)置研究以更詳細(xì)地表征所選的P1A變體IS288。除用HIC純化之外，還開(kāi)發(fā)進(jìn)一步脫鹽和表征洗脫的蛋白質(zhì)峰中蛋白質(zhì)的量和純度方法。疏水相互作用色譜，即HIC，是其中生物分子的分離是基于介質(zhì)的疏水性、樣本的性質(zhì)和組成、表面暴露的疏水性氨基酸殘基的普遍性和分布以及在結(jié)合緩沖液中鹽的類型和濃度的方法。蛋白質(zhì)吸附至凝膠基質(zhì)內(nèi)取決于抗離液鹽諸如(NH4)2SO4和Na2SO4的濃度；鹽濃度越高HIC介質(zhì)的吸附能力越強(qiáng)。HIC基質(zhì)可具有不同類型的疏水性取代基，如丁基、辛基或苯基。將丁基瓊脂糖選為HIC基質(zhì)如P1A緊密地結(jié)合未適當(dāng)洗脫的辛基瓊脂糖。IS288純化程序：第一天，將少量的冰凍IS288枯草芽孢桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物劃線于含有10μg/ml卡那霉素的LB-瓊脂板上。第二天早晨，將單一培養(yǎng)物從這個(gè)板上取下并接種到10X3ml的搖瓶培養(yǎng)的最小生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在同一天下午，從3ml預(yù)培養(yǎng)物中取出導(dǎo)致100ml過(guò)夜(o/n)培養(yǎng)物中0.01起始OD600的體積。將100ml培養(yǎng)物在振蕩器中在+37℃下過(guò)夜孵育。從幾種3ml預(yù)培養(yǎng)物制備OD600＝1甘油原液(10％甘油)。甘油原液儲(chǔ)存在-70℃。在第三天培養(yǎng)約16小時(shí)后，測(cè)量搖瓶培養(yǎng)的最終OD600測(cè)定且使細(xì)胞用(SorvallRC6)SLA-3000旋轉(zhuǎn)器以7000rpm在+4℃下離心10分鐘。將培養(yǎng)物上清液收集和合并，然后用0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾。濾液的體積被測(cè)量為約745ml。稱量導(dǎo)致70％(NH4)2SO4飽和的326.86g固體(NH4)2SO4，且作為約33g的等分試樣加入到上清液中，同時(shí)持續(xù)混合。一旦所有的鹽已經(jīng)溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到+4℃冰箱中。第二天早晨，將硫酸銨溶液(SorvallRC6)SLA-3000旋轉(zhuǎn)器以10500rpm在+4℃離心90分鐘，加速度9和減速4。離心后，將上清液合并，并通過(guò)0.2μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾。取72.5ml濾液用于疏水相互作用色譜(HIC)。將濾液的其余部分分成17×50ml等份試樣且首先儲(chǔ)存在+4℃和隨后轉(zhuǎn)移至-20℃。此外，取兩個(gè)1ml濾液的樣本且首先儲(chǔ)存在+4℃和隨后轉(zhuǎn)移至-20℃。硫酸銨濾液的(NH4)2SO4濃度估計(jì)為約2.7M且將其稀釋，使得(NH4)2SO4的濃度用190mMNa-H-磷酸鹽緩沖液(pH6.8)降低到約2M。將濾液在用50mMNa-H-磷酸鹽(pH6.9)、2M(NH4)2SO4平衡的5mlHiTrapButylFF柱中經(jīng)受HIC。將總共50ml樣本泵送通過(guò)柱且收集流過(guò)液作為5ml級(jí)分。將未結(jié)合的樣本用50mM的Na-H-磷酸鹽(pH6.9)、2M(NH4)2SO4洗出。將結(jié)合的IS288用不連續(xù)梯度和50mMNa-H-磷酸鹽(pH6.8)用減小的(NH4)2SO4濃度洗脫。在第一次運(yùn)行中，洗脫級(jí)分為1ml。將含有洗脫的蛋白質(zhì)的級(jí)分合并在三個(gè)不同的組中；C3-C8、C9-D1和D2-D8。將流過(guò)級(jí)分和洗脫級(jí)分的剩余部分儲(chǔ)存在+4℃。樣本取自流過(guò)級(jí)分B1和B8以及匯集的蛋白質(zhì)級(jí)分并儲(chǔ)存在+4℃。對(duì)于不同的樣本體積，即65ml和125ml平衡的硫酸銨濾液，重復(fù)HIC步驟兩次。這些后來(lái)的HIC運(yùn)行從第一次運(yùn)行開(kāi)始有一定程度修改。未結(jié)合的樣本的洗滌體積為3和4CV，流過(guò)級(jí)分的體積增加至10ml，并且洗脫級(jí)分的體積增加至1.5ml。沒(méi)有對(duì)運(yùn)行條件做出其它修改。將匯集的蛋白質(zhì)級(jí)分以及第一次運(yùn)行的B1和B8的流過(guò)級(jí)分超濾且使用具有10000NMWL的AmiconUltra-4濃縮器濃縮。將樣本離心六次且每次離心后，除最后一次外，將樣本或緩沖液的其余部分加入到殘余物，以便獲得4ml體積。在第六濃縮步驟后，收集殘余物，測(cè)量且存儲(chǔ)在+4℃。將來(lái)自后續(xù)HIC運(yùn)行的樣本以及來(lái)自第一運(yùn)行的多于一個(gè)流過(guò)級(jí)分超濾且用AmiconUltra-15用10000NMWL濃縮，并且僅需要4輪離心。將這些樣本也存儲(chǔ)在+4℃。將硫酸銨濾液超濾和濃縮，且將流過(guò)級(jí)分用Ultracell-10膜，10000NMWL用MultiScreen過(guò)濾板再次濃縮。在這個(gè)最后濃縮步驟之前測(cè)量流過(guò)樣本的蛋白質(zhì)濃度，而沒(méi)有測(cè)量硫酸銨濾液的蛋白質(zhì)濃度。樣本的蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)量?；讷@自的洗脫峰，洗脫的蛋白級(jí)分稀釋約1：20和約1：40，而流過(guò)級(jí)分用作這種(1：1稀釋)或?qū)Π胂♂?1：2稀釋)。最后，來(lái)自所有三次純化的樣本在CriterionXT12％Bis-TrisSDS-PAGE上用MOPS運(yùn)行緩沖液運(yùn)行到最佳分離6–66kDa尺寸的蛋白質(zhì)。對(duì)于硫酸銨濾液加入樣本的最大量并且所有流過(guò)級(jí)分除B1121108之外，對(duì)于其蛋白質(zhì)含量在33X濃縮樣本中測(cè)定為0.21μg/μl。計(jì)算吸蛋白質(zhì)峰級(jí)分的量，使得0.5μg蛋白質(zhì)將被加載到凝膠上。將IS288的純化的蛋白質(zhì)溶液用于確定每單位質(zhì)量的IS288活性。檢查在儲(chǔ)存條件下IS288的穩(wěn)定性，以找出是否該蛋白被降解或在儲(chǔ)存期間通過(guò)一些其它方式修飾。還確定在靶位點(diǎn)基質(zhì)處蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。將靶位點(diǎn)基質(zhì)中穩(wěn)定性測(cè)定的結(jié)果與來(lái)自活性測(cè)定的結(jié)果組合以估計(jì)對(duì)于IS288在小腸中消除抗生素殘留物花費(fèi)的時(shí)間。除了獲得關(guān)于P1A變體IS288的更詳細(xì)信息，在研究過(guò)程中所創(chuàng)建的表征方案用于其它后續(xù)P1A變體的表征中。研究P1A變體IS288產(chǎn)生水平的方法在枯草芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)期間，在不同時(shí)間點(diǎn)取出樣本以評(píng)價(jià)IS288的產(chǎn)生水平。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量OD600值，以及觀察細(xì)胞如何生長(zhǎng)。在SDS-PAGE上估計(jì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量。在不同pH水平下研究酶效力和抗生素譜的方法在此研究中使用的抗生素是例如靜脈內(nèi)施用的頭孢菌素的選擇。所選抗生素的濃度，不希望受理論束縛，設(shè)置為盡可能靠近膽汁或十二指腸中文獻(xiàn)報(bào)道的濃度。還在不同的pH下進(jìn)行這個(gè)實(shí)驗(yàn)。在人回腸食糜中研究酶穩(wěn)定性的方法不同量的純化的酶在合適的溫度下在人體回腸食糜中孵育設(shè)定的時(shí)間段。在不同時(shí)間點(diǎn)獲取樣本。用SDS-PAGE分析IS288的降解模式且使用頭孢硝噻作為底物分析IS288的活性?；衔锖图?xì)菌菌株：氨芐青霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢唑啉、Amp/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢噻肟和頭孢呋辛購(gòu)自商業(yè)來(lái)源，并且分別存儲(chǔ)為15mg/mL和10mg/mL冷凍原液。P1A由SyntheticBiologics以32mg/mL的原液濃度提供且存儲(chǔ)在-80℃。大腸桿菌ATCC25922獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)。在不存在和存在P1A(RS310)、P3A(IS118)和P4A(IS288)時(shí)有效抑制濃度的測(cè)定：根據(jù)CLSI指南(M07-A9:MethodsforDilutionAntimicrobialSusceptibilityTestsforBacteriaThatGrowAerobically；ApprovedStandard–第九版)通過(guò)微量肉湯稀釋分析測(cè)定氨芐青霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢唑啉、amp/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢噻肟和頭孢呋辛的有效抑制濃度(EC50,90)。大腸桿菌菌株25922從甘油原液培養(yǎng)至在大氣環(huán)境中在37℃下在陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，并且在陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯中稀釋，以實(shí)現(xiàn)5x105CFU/mL的孔濃度下的起始。在陽(yáng)離子調(diào)節(jié)的Mueller-Hinton肉湯中制備連續(xù)2倍稀釋的抗微生物化合物以實(shí)現(xiàn)對(duì)于氨芐青霉素為128μg/mL至0.13μg/mL的最終孔濃度，和在不存在或存在P1A、P3A或P4Aβ-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)物的連續(xù)10倍稀釋下為4μg/mL4ng/mL，對(duì)于氨芐青霉素為5pg/mL至50ng/mL且對(duì)于頭孢曲松、頭孢他啶、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢唑啉、amp/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢噻肟和頭孢呋辛為50pg/mL至500ng/mL。將抗生素加入P1A且在加入細(xì)菌前在37℃下孵育30min(預(yù)孵育)，或者在加入P1A、P3A、P4A和細(xì)菌(同時(shí))后加到板上。所有濃度和組合以僅含有介質(zhì)、化合物加僅介質(zhì)(比色對(duì)照)以及未經(jīng)處理的細(xì)菌對(duì)照的96孔板形式以一式三份評(píng)估。在孵育過(guò)夜后，在Spectramax384板讀數(shù)器中測(cè)量板的OD625，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到定制的Excel電子表格，用于通過(guò)線性回歸分析確定抑制細(xì)菌生長(zhǎng)50％、90％和99％(EC50,90,99)的有效濃度。實(shí)施例2：誘變的結(jié)果突變?cè)O(shè)計(jì)尤其基于以下的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)(例如晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)、同系物模型等)：P1A晶體結(jié)構(gòu)(Knox和Moews,J.MolBiol.,220,435–455(1991))、CTX-M-44(1BZA(Ibuka等人JournalofMolecularBiology第285卷,第5期2079–2087(1999)、1IYS(Ibuka等人Biochemistry,2003,42(36):10634-43)、1IYO、1IYP和1IYQ(Shimamura等人2002J.Biol.Chem.277:46601-08)、普通變形桿菌K1(1HZO,Nugaka等人JMolBiol.2002年3月15日；317(1):109-17)和羽狀變形菌HugA(Liassine等人AntimicrobAgentsChemother.2002年1月；46(1):216-9.2002),以及綜述于Bonnet,Antimicrob.AgentsChemother48(1):1-14(2004)(對(duì)于CTM-X)，所有這些文獻(xiàn)的內(nèi)容據(jù)此通過(guò)引用整體并入)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變通過(guò)以下β-內(nèi)酰胺酶中的任何一個(gè)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析(例如晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)、同系物模型等)報(bào)告：P1A、P2A、P3A、CTX-M-3、CTX-M-4、CTX-M-5、CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14、CTX-M-15、CTX-M-16、CTX-M-18、CTX-M-19、CTX-M-25、CTX-M-26、CTX-M-27、CTX-M-32、CTX-M-44、CTX-M-45和CTX-M-54。此類信息對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員在已知數(shù)據(jù)庫(kù)是可用的，例如，Swiss-ProtProteinSequenceDataBank、NCBI和PDB。定點(diǎn)和隨機(jī)誘變的結(jié)果分別匯總在表2和3中。所選突變體的酶活性示于表4中和動(dòng)力學(xué)參數(shù)示于表5中。先前的酶P1A、P3A和P2A的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也包括在那個(gè)表中。突變區(qū)段1.I72S、Q135M和T160F使用QUIKCHANGEMulti定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?此后簡(jiǎn)稱為Multi試劑盒)Stratagene，在一個(gè)反應(yīng)中將包括I72S、Q135M和T160F的突變的第一區(qū)段引入誘變引物。攜帶penP基因的質(zhì)粒在誘變反應(yīng)中用作模板。將突變單鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL10Gold中且用卡那霉素/氯霉素選擇。提供感受態(tài)XL10Gold細(xì)胞和Multi試劑盒。挑取菌落(10-30個(gè))，且用頭孢硝噻測(cè)試以驗(yàn)證β-內(nèi)酰胺酶活性。將菌落的一部分用作PCR中的模板，將所得的片段，如果干凈的話，送至DNA測(cè)序。將菌落的其余部分在補(bǔ)充有合適的抗生素的Luria中在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜，并且培養(yǎng)物的一部分存儲(chǔ)在甘油(≤10％，最終)中，另一部分用于質(zhì)粒分離。用DNA測(cè)序證實(shí)期望的突變后，更詳細(xì)地表征突變體克隆。制備周質(zhì)裂解液，且在SDS-PAGE中分析，且用分光光度法測(cè)量頭孢噻肟水解的動(dòng)力學(xué)。突變區(qū)段2.A232G、A237S、A238G和S240DP1A的B3β-鏈的靶標(biāo)氨基酸如此緊密地相互定位，使得在至少一輪中，Multi-Site方案是不合適的。相反，所有四個(gè)氨基酸使用SOE技術(shù)交換。涵蓋交換的區(qū)域含有24個(gè)核苷酸(8個(gè)氨基酸密碼子)，且包括于兩個(gè)PCR引物的重疊延伸部分。突變的penP基因在兩個(gè)部分中使用引物A+B和C+D進(jìn)行第一輪PCR(圖7)。然后將兩個(gè)PCR產(chǎn)物合并，并使用與penP基因的5'和3'部分互補(bǔ)的引物A和D擴(kuò)增?？寺∥稽c(diǎn)被包括于引物A和D中。一旦準(zhǔn)備好構(gòu)建體，進(jìn)一步使用Multi試劑盒加入其它突變。進(jìn)一步突變，R244T和D276R(K)使用Multi-Site試劑盒技術(shù)和先前制備的突變質(zhì)粒作為模板，加入這些突變。構(gòu)建的突變的列表如表1所示。突變組合的數(shù)目容易增加，且因此，與測(cè)量單獨(dú)克隆的頭孢噻肟降解動(dòng)力學(xué)相比，用更穩(wěn)健的方法完成表征。初步表征是頭孢噻肟MIC的確定。表1.構(gòu)建的突變和其它可能的組合表2：使用定點(diǎn)誘變制備的P1A突變體。標(biāo)記枯草芽孢桿菌和大腸桿菌菌株編號(hào)、突變和質(zhì)粒名稱。表3：隨機(jī)誘變產(chǎn)生的P1A突變。標(biāo)記枯草芽孢桿菌和大腸桿菌菌株編號(hào)、突變和質(zhì)粒名稱。表4：由枯草芽孢桿菌上清液測(cè)量的P1A突變體的初始酶活性。值表示為P1A的倍數(shù)。AMP＝氨芐青霉素，CTX＝頭孢噻肟，CRO＝頭孢曲松，CXM＝頭孢呋辛和CAZ＝頭孢他啶。用于計(jì)算的P1A值是兩種不同的實(shí)驗(yàn)手段。表5：對(duì)P1A突變菌株測(cè)量的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。由于原始曲線不遵循米氏動(dòng)力學(xué)，IS230降解頭孢呋辛的動(dòng)力學(xué)參數(shù)是不可靠的。此外，應(yīng)注意，IS219和IS221的動(dòng)力學(xué)參數(shù)互相接近，除當(dāng)頭孢噻肟被降解之外；當(dāng)IS219的Vmax增加時(shí)，IS221的Vmax降低。另一方面，IS219對(duì)頭孢噻肟的親和力未與相同量的IS221對(duì)頭孢噻肟的親和力一起增加。低＝?jīng)]有對(duì)于測(cè)量的足夠活性；ND或空單元＝未進(jìn)行。表6：所選突變體的Vmax和Km值表示為P1A活性的相對(duì)值。如果Km<1.0，則突變體對(duì)其配體的親和性增加。如果Km>1.0，則親和減小。對(duì)于kcat和Vmax正好相反。低＝低活性；-＝未進(jìn)行。酶活性與動(dòng)力學(xué)參數(shù)根據(jù)P1A針對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢呋辛測(cè)量的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，不希望受理論束縛，可以推斷出P1A具有低的固有頭孢菌素酶活性。一般來(lái)說(shuō)，突變體對(duì)配體的親和力增加(即Km降低)。IS229(區(qū)段2+R244T)突變體中Vmax增加和親和力降低(Km增加)(表5)。對(duì)于IS229，kcat增加最多。用頭孢曲松的隨機(jī)誘變篩選優(yōu)選對(duì)抗生素具有低Km(高親和力)的突變體。在突變系列P3A→IS158→IS232中觀察到隨后幾輪突變的Km降低；IS232對(duì)頭孢曲松具有極高親和力。頭孢曲松的Vmax未依序減少，IS158的最高，然而kcat經(jīng)過(guò)幾輪突變下降。這輪的前兩個(gè)突變體不具有頭孢噻肟活性，但A238T和另外的IS232具有頭孢噻肟活性。僅定點(diǎn)區(qū)段2(IS191)突變并不明顯地增加P1A-衍生物對(duì)頭孢菌素的活性但對(duì)氨芐青霉素的活性降低20倍(表4)。區(qū)段2+D276R/K(IS219/IS221)的頭孢菌素酶活性顯著好于IS191的頭孢菌素酶活性。IS219和IS221定點(diǎn)突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示，定點(diǎn)誘變優(yōu)選增加酶對(duì)靶標(biāo)抗生素的親和力。穩(wěn)定性測(cè)定/葡萄糖壓力測(cè)試為了測(cè)試突變體在枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)條件中的穩(wěn)定性，用RS310、IS219和IS232進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。以5g/l和10g/l的兩個(gè)不同的葡萄糖濃度進(jìn)行培養(yǎng)。P1A(RS310)和兩個(gè)突變體IS219和IS232在搖瓶中(100ml)中用具有5或10g/l葡萄糖的基本培養(yǎng)基培養(yǎng)。用顯微鏡監(jiān)測(cè)細(xì)胞的狀態(tài)，由5g/l生長(zhǎng)測(cè)量的葡萄糖消耗和來(lái)自培養(yǎng)物上清液(濃縮和非濃縮)的樣本在12％Bis-TrisSDS-PAGE(Criterion,BioRad)上運(yùn)行(圖1和2)。還監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物的OD。在10g/l葡萄糖培養(yǎng)物中，P1A和IS232以可比較的量生產(chǎn)，但I(xiàn)S219的產(chǎn)量較低(泳道2-4，圖1)。濃縮期間，IS219產(chǎn)率進(jìn)一步降低(泳道6、9和16，圖1)。在圖1中的泳道16上觀察到約29kDa模糊條帶?？蓪1A和IS232再次濃縮(泳道5、7、8、10、15和16，圖1)。在5g/l葡萄糖的存在下，P1A菌株RS310開(kāi)始生長(zhǎng)得比其它兩種菌株慢。然而，在培養(yǎng)末期，P1A的量已經(jīng)取代其它蛋白質(zhì)的量(圖2)。突變體菌株IS219開(kāi)始以如菌株IS232大致相同的速度產(chǎn)生，而經(jīng)10小時(shí)培養(yǎng)，其產(chǎn)量已開(kāi)始落后于IS232且其量隨時(shí)間減少。IS219和IS232培養(yǎng)中9.5小時(shí)培養(yǎng)消耗所有葡萄糖并且從該點(diǎn)開(kāi)始，假定蛋白酶的量開(kāi)始增加。由于RS310增長(zhǎng)較慢，所以在培養(yǎng)11小時(shí)時(shí)仍剩余一些葡萄糖，并且第二天早晨RS310已經(jīng)消耗了所有葡萄糖。因?yàn)樵谝雇砥陂g沒(méi)有從RS310取樣，所以無(wú)法說(shuō)明RS310已經(jīng)使用所有其葡萄糖且開(kāi)始生產(chǎn)蛋白酶的確切時(shí)間點(diǎn)。通過(guò)27.5小時(shí)培養(yǎng)，P1A的量已經(jīng)增加，但I(xiàn)S219和IS232的量已經(jīng)從前日有所減少。從研究中，不希望受理論束縛，可以推斷出IS232比IS219更好地耐受蛋白酶，所述IS219完全不耐受蛋白酶?；?0g/l葡萄糖和5g/l葡萄糖培養(yǎng)，不希望受理論束縛，可以說(shuō)對(duì)P1A的修飾降低蛋白質(zhì)的蛋白酶耐受性。葡萄糖耗竭導(dǎo)致在IS219和IS232的情況下降解產(chǎn)物的外觀且消耗所有葡萄糖后降解產(chǎn)物的量增加。IS219蛋白質(zhì)對(duì)降解更敏感，因?yàn)镮S219蛋白質(zhì)的量比IS232的量下降更多。不希望受理論束縛，這可能表明對(duì)芽孢桿菌蛋白酶的較低可分泌性或較高靈敏性，或兩者?？傊?，使用如對(duì)RS310和IS232相同的生長(zhǎng)條件，IS219的產(chǎn)量是不可能的。葡萄糖應(yīng)激測(cè)試還證明這種試驗(yàn)可以用于估計(jì)所產(chǎn)生的突變體的蛋白酶耐受性。葡萄糖應(yīng)激測(cè)試已證明區(qū)段2+D276R＝IS219(和最有可能的區(qū)段2+D276K＝IS221)突變降低了酶的蛋白酶耐受性。最可能的是，不希望受理論束縛，不穩(wěn)定性是由于D276R突變，它在蛋白質(zhì)表面上產(chǎn)生蛋白酶裂解位點(diǎn)。在IS191上生成D276N突變，將產(chǎn)生區(qū)段2+D276N-突變體。不希望受理論束縛，天冬氨酸至天冬酰胺突變預(yù)期增加IS191的頭孢曲松(且可以是頭孢噻肟)活性，但同時(shí)保持酶比IS219(和IS221)對(duì)蛋白酶更耐受。R244T突變可以與區(qū)段2和D276N組合以觀察我們是否可以用這種突變?cè)黾覸max(和kcat)。R244T突變也可以與IS219和IS221組合。活性測(cè)定(表4)R244T(IS217)突變消除P1A的幾乎所有的酶活性。一些活性用雙突變體R244T+D276K(IS215)獲得，但不是至野生型酶的水平。因此，僅R244T突變不能提供具有頭孢菌素酶活性的P1A?；趧?dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)(表5)，區(qū)段1突變(I72S/Q135M/T160F、IS227)沒(méi)有改善P1A水解頭孢菌素的能力。在其它活性測(cè)定中，僅Q135M或T160F不增加P1A水解頭孢菌素的能力，相反，兩種單突變消除幾乎所有P1A的酶活性，甚至對(duì)氨芐青霉素的活性。然而，存在區(qū)段2+Q135M-突變體(IS224)，所述突變體具有對(duì)區(qū)段2(IS191)和區(qū)段2+D276R/K(IS219/IS221)突變體之間的頭孢噻肟和頭孢曲松的活性。不希望受理論束縛，區(qū)段1可“松開(kāi)”Ω環(huán)，催化性Glu166位于其中。T160F突變是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的核心中相當(dāng)大的修飾。它可完全破壞結(jié)構(gòu)或至少使蛋白質(zhì)失去適當(dāng)起作用的能力。為了避免這種可能性，加入了兩個(gè)代償性突變以伴隨P1A中的T160F突變，即I72S和Q135M且突變的這個(gè)組合稱為“區(qū)段1”。實(shí)施例3：P1A突變體IS288的生產(chǎn)和純化的結(jié)果純化的結(jié)果報(bào)道為洗脫峰圖(圖3、4和5)和峰值表，報(bào)道為蛋白濃度和SDS-PAGE照片(圖6)。疏水相互作用色譜的色譜圖疏水相互作用色譜(HIC)使用不同的參數(shù)在三個(gè)不同的場(chǎng)合中運(yùn)行。在第一次運(yùn)行中(16.10.08，圖3)，樣本體積為約50ml，流過(guò)級(jí)分的體積為5ml，未結(jié)合樣本的洗滌體積為2CV，并且洗脫級(jí)分的體積為1.0ml。在以下的HIC運(yùn)行中(4.11.08，圖4)，樣本體積增加至65ml，流過(guò)級(jí)分的體積增加至10ml，且未結(jié)合的樣本的洗滌體積增加至3CV和級(jí)分尺寸增加至1.5ml。在最后一次運(yùn)行中(12.11.08，圖5)，僅樣本體積和未結(jié)合的樣本的洗滌體積與前次運(yùn)行不同，分別為125ml和4CVHIC運(yùn)行的所有曲線(圖3、4和5)表示相同的整體形式。在整個(gè)樣本施加中流過(guò)級(jí)分在280nm處得到約700mAU恒定吸光度，而在洗滌未結(jié)合的樣本期間，在280nm處吸光度下降到零，當(dāng)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)時(shí)再次上升。圖3和圖4中施加的樣本中的樣本電導(dǎo)率比含有2M(NH4)2SO4的運(yùn)行緩沖液A的略低，而在12.11.2008上運(yùn)行時(shí)，它與緩沖液A保持相同。在兩個(gè)第一運(yùn)行中，硫酸銨濾液的(NH4)2SO4濃度估計(jì)為2.7M且在最后一次運(yùn)行中為2.6M。似乎2.6M估計(jì)值更接近硫酸銨濾液的實(shí)際(NH4)2SO4濃度，因?yàn)樵跇颖臼┘悠陂g流出溶液的電導(dǎo)率沒(méi)有下降(圖5)。在緩沖液(緩沖液B)施加到柱上后立即開(kāi)始洗脫。這表明，樣本中的蛋白質(zhì)幾乎沒(méi)有結(jié)合到柱上，因?yàn)樗谔荻戎腥绱嗽绲叵疵?。因此，至關(guān)重要的是，樣本的電導(dǎo)率從未變得小于約240mS/cm。洗脫的結(jié)合蛋白質(zhì)作為典型的洗脫峰，具有陡峭的上坡和緩和的下坡，得到略不對(duì)稱的峰。在第一次運(yùn)行中峰的尺寸為最大，約18ml(18×1ml級(jí)分)(圖3)。此峰被收集在三個(gè)組中：第一組6ml(級(jí)分C3-C8)，第二組5ml(級(jí)分C9-D1)和第三組7ml(級(jí)分D2-D8)，因?yàn)樵诩?jí)分C8和C9之間的洗脫峰中存在一個(gè)“肩”，且認(rèn)為最后的7個(gè)級(jí)分對(duì)于濃縮可能過(guò)于稀釋。在隨后的兩個(gè)HIC運(yùn)行(分別4.11.2008和12.11.2008，圖4和5)中，洗脫峰為13.5ml(9x1.5ml級(jí)分，4.11.2008)和12ml(8x1.5ml級(jí)分，12.11.2008)，且將全部峰匯集成一個(gè)級(jí)分。在表7中，給出三個(gè)HIC運(yùn)行的A280曲線圖的統(tǒng)計(jì)值。峰的面積用于估計(jì)該樣本的蛋白質(zhì)含量，并且它用于估計(jì)在BCA測(cè)定中不同樣本的稀釋倍數(shù)。計(jì)算需要蛋白質(zhì)的理論消光系數(shù)，所述理論消光系數(shù)在ExPASy網(wǎng)絡(luò)服務(wù)使用ProtParam工具計(jì)算。對(duì)于IS288，此系數(shù)為25440M-1cm-1，且對(duì)于0.1％(＝1g/l)溶液，得到A2800.869。使用上述比例，計(jì)算洗脫蛋白樣本中蛋白質(zhì)的量和這些樣本的已知體積、從柱中洗脫的蛋白質(zhì)的量。使用的式為：((mAU*ml)*10^-3/V級(jí)分)/0.869*V級(jí)分→(mAU*ml)*10^-3/0.869，得到：3.36mg蛋白質(zhì)161008、2.95mg041108和3.60mg121108。表7：來(lái)自三次單獨(dú)的HIC運(yùn)行的峰值表給出運(yùn)行日期、峰名稱、保留時(shí)間(即在峰達(dá)到其頂部時(shí)的體積)、峰的面積和峰的最大高度。使用的峰的面積來(lái)估計(jì)洗脫級(jí)分中洗脫的蛋白質(zhì)的量。超濾和流過(guò)液的濃度和洗脫的蛋白質(zhì)級(jí)分根據(jù)純化的每一個(gè)，選擇流過(guò)級(jí)分的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)用于濃縮以及含有洗脫的蛋白質(zhì)峰的所有級(jí)分。所選樣本示于表8中。另外，還在表中呈現(xiàn)樣本的起始體積以及最終體積和濃縮倍數(shù)。表8：所選的用于超濾的樣本和用AmiconUltra-4,10000NMWL濃縮呈現(xiàn)樣本的原始體積和濃縮后樣本的最終體積以及濃縮倍數(shù)。濃縮倍數(shù)通過(guò)原始體積除以濃縮后的樣本的最終體積來(lái)計(jì)算。所選用于超濾的流過(guò)級(jí)分來(lái)自樣本施加的開(kāi)始(B1161008和A2041108)和結(jié)束時(shí)(B7161008、B8161008、A7041108和B1121108)。分析這些樣本以便觀察柱的容積是否超過(guò)特定樣本量。此外，將每個(gè)純化的硫酸銨濾液超濾和濃縮，并且曾經(jīng)濃縮的流過(guò)級(jí)分還進(jìn)一步用具有Ultracell-10膜，10000NMWL的MultiScreen板濃縮。濃縮結(jié)果呈現(xiàn)于表9中。表9：所選用于超濾的樣本和用具有Ultracell-10膜，10000NMWL的MultiScreen過(guò)濾板濃縮指示原始體積和濃縮后樣本的體積。濃縮倍數(shù)通過(guò)原始樣本體積除以最終樣本體積來(lái)計(jì)算。因此，將HIC運(yùn)行的流過(guò)級(jí)分濃縮16倍或更多倍。流過(guò)級(jí)分的最終濃縮倍數(shù)在表10中列出。表10：流過(guò)樣本的最終濃縮倍數(shù)最終濃縮倍數(shù)通過(guò)第一濃度的濃縮倍數(shù)與第二濃度的濃縮倍數(shù)相乘來(lái)計(jì)算。BCA測(cè)定結(jié)果BCA測(cè)定的結(jié)果呈現(xiàn)于表11中。在用具有Ultracell-10膜的MultiScreen板進(jìn)行最后濃縮步驟之前測(cè)量流過(guò)級(jí)分的蛋白質(zhì)濃度。表11：HIC流過(guò)級(jí)分和峰級(jí)分的蛋白質(zhì)濃度蛋白質(zhì)濃度由給定樣本的兩種不同稀釋度的兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定。濃縮后測(cè)量樣本的最終體積。來(lái)自HIC運(yùn)行的色譜圖得到相當(dāng)高，約700MAU，對(duì)排出溶液的A280值流過(guò)樣本施加。洗脫的蛋白質(zhì)峰含有足夠量的蛋白質(zhì)。它們接近柱的假定結(jié)合能力，10mg。來(lái)自的峰面積給出比BCA測(cè)定低三倍的對(duì)蛋白質(zhì)量的估計(jì)。SDS-PAGE對(duì)硫酸銨濾液和流過(guò)級(jí)分，將樣本的最大體積(17.5μl)加載到SDS-PAGE上(圖6)，除B1121108外，所述B1121108加載6.5μl。計(jì)算來(lái)自蛋白質(zhì)峰的樣本的體積，使得每泳道將存在約0.5μg蛋白質(zhì)，且假定樣本中的所有蛋白質(zhì)將是P1A衍生物IS288。SDS-PAGE呈現(xiàn)于圖6中。硫酸銨濾液樣本都含有接近30kDa的雙條帶(IS288的MW為29288Da，且P1A的MW為29273Da)?？稍诹鬟^(guò)級(jí)分B1121108中清楚地觀察到伴隨著略小的額外條帶的相同雙條帶且在流過(guò)級(jí)分A7041108中略較模糊。在另一方面，這些額外條帶的兩個(gè)已經(jīng)從洗脫的蛋白質(zhì)峰去除。當(dāng)加載約10倍蛋白質(zhì)預(yù)期量時(shí)，在純化D2-D8161008的最后匯集級(jí)分上可以看到一些少量雜質(zhì)。可以得出結(jié)論，純化的蛋白質(zhì)是主要的蛋白質(zhì)形式，且通過(guò)分子量分析，它是P1A變體IS288。實(shí)施例4：微生物篩選測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶活性的測(cè)試在不存在和存在P1Aβ-內(nèi)酰胺酶下測(cè)定氨芐青霉素和頭孢曲松針對(duì)大腸桿菌的50％有效抑制濃度(EC50)。對(duì)于這些研究的目的，所述有效濃度為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)加入的氨芐青霉素或頭孢曲松的初始濃度，而不是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中或在孵育期結(jié)束時(shí)測(cè)量的濃度。分析結(jié)果呈現(xiàn)于表12-14中。初始評(píng)估利用濃度為0.5ng/mL至5μg/mL的P1A和濃度為0.13μg/mL至128μg/mL的氨芐青霉素或頭孢曲松。當(dāng)同時(shí)加入時(shí)，P1A的最低濃度(0.5ng/mL)的加入將氨芐青霉素的EC50從16μg/mL轉(zhuǎn)變至大于128μg/mL的最高試驗(yàn)濃度，且當(dāng)加入細(xì)菌之前P1A與氨芐青霉素預(yù)孵育時(shí)，至64μg/mL(表12)。使用具有0.13μg/mL至128μg/mL頭孢曲松的相同濃度的P1A，觀察到頭孢曲松在最低濃度(EC99<0.13μg/mL)被完全抑制，且當(dāng)同時(shí)加入時(shí)，在5ng/mLP1A存在下頭孢曲松的EC50轉(zhuǎn)變至0.25μg/mL，且當(dāng)50ng/mLP1A與抗生素預(yù)孵育時(shí)至128μg/mL。基于這種分析，P1A和頭孢曲松的濃度調(diào)節(jié)至包括兩者的抑制濃度。使用5pg/mL至50ng/mL的P1A濃度和0.13μg/mL至128μg/mL氨芐青霉素，當(dāng)預(yù)孵育或同時(shí)加入時(shí)，氨芐青霉素的EC50從P1A不存在下的16μg/mL轉(zhuǎn)變至50pg/mLP1A存在下的128μg/mL。P1A的較低濃度(5pg/mL)對(duì)氨芐青霉素EC50沒(méi)有影響。當(dāng)預(yù)孵育或同時(shí)加入時(shí)，頭孢曲松的EC50從P1A不存在下的0.03μg/mL轉(zhuǎn)變至50ng/mL或更高P1A存在下的大于4μg/mL(表13)。P1A(50pg/mL至5ng/mL)的較低濃度對(duì)頭孢曲松EC50沒(méi)有影響。同時(shí)加入P1A和氨芐青霉素或頭孢曲松的結(jié)果通過(guò)重復(fù)分析得以證實(shí)(表14)。表12.在不存在和存在通過(guò)微肉湯稀釋分析測(cè)定的P1A時(shí)，氨芐青霉素和頭孢曲松的有效抑制濃度(EC50)。將抗生素加入P1A且在加入細(xì)菌前在37℃下孵育30min(預(yù)孵育)，或者在加入P1A和細(xì)菌(同時(shí))后加到板上。以一式三份以96孔板形式評(píng)價(jià)所有濃度和組合。在孵育過(guò)夜后，在Spectramax384板讀數(shù)器中測(cè)量板的OD625，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到定制的Excel電子表格，用于通過(guò)線性回歸分析確定50％有效抑制濃度(EC50)。對(duì)于這些研究的目的，所述有效濃度為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)加入的氨芐青霉素或頭孢曲松的初始濃度，而不是在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中或在孵育期結(jié)束時(shí)測(cè)量的濃度。表13.在不存在和存在通過(guò)微肉湯稀釋分析測(cè)定的P1A時(shí)，氨芐青霉素和頭孢曲松的有效抑制濃度(EC50)。將抗生素加入P1A且在加入細(xì)菌之前在37℃下孵育30min(預(yù)孵育)，或者在加入P1A和細(xì)菌(同時(shí))后加到板上。以一式三份以96孔板形式評(píng)價(jià)所有濃度和組合。在孵育過(guò)夜后，在Spectramax384板讀數(shù)器中測(cè)量板的OD625，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到定制的Excel電子表格，用于確定50％有效抑制濃度(EC50)。表14.在不存在和存在通過(guò)微肉湯稀釋分析測(cè)定的P1A時(shí)，氨芐青霉素和頭孢曲松的有效抑制濃度(EC50)。將抗生素加入P1A細(xì)菌(同時(shí))。以一式三份以96孔板形式評(píng)價(jià)所有濃度和組合。在孵育過(guò)夜后，在Spectramax384板讀數(shù)器中測(cè)量板的OD625，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到定制的Excel電子表格，用于通過(guò)線性回歸分析確定50％有效抑制濃度(EC50)。這些結(jié)果表明，P1A在體外微生物測(cè)定中有效抑制氨芐青霉素和頭孢曲松的活性，并表明P1A在微生物測(cè)定中針對(duì)氨芐青霉素比頭孢曲松大1000倍的活性。接著，在不存在和存在P1A、P3A或P4Aβ-內(nèi)酰胺酶時(shí)測(cè)定氨芐青霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢唑啉、amp/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢噻肟和頭孢呋辛針對(duì)大腸桿菌90％有效抑制濃度(EC90)。對(duì)于這些研究的目的，所述有效濃度為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)加入的氨芐青霉素、頭孢曲松、頭孢他啶、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢唑啉、amp/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢噻肟和頭孢呋辛的初始濃度，而不是在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中或在孵育期結(jié)束時(shí)測(cè)量的濃度。分析結(jié)果呈現(xiàn)于表15-17中。下表(表15-17)中的每個(gè)框具有由斜杠分隔的兩個(gè)數(shù)字，所述兩個(gè)數(shù)字是重復(fù)測(cè)定，所有測(cè)定都顯示出緊密的一致。具體地講，通過(guò)稀釋(2倍步驟)跨96孔皿的行的所選抗生素進(jìn)行測(cè)定。將MIC確定為稀釋的抗生素從殺滅細(xì)菌轉(zhuǎn)變至不殺滅細(xì)菌(在這種情況下，對(duì)所有抗生素敏感的大腸桿菌菌株)的點(diǎn)。將P1A、P3A和P4A沿柱向下稀釋(10倍步驟)(β-內(nèi)酰胺酶濃度沿柱向下增加)。當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶的濃度增加時(shí)，它達(dá)到一定水平，在所述水平它降解的抗生素足以改變表觀MIC讀數(shù)(MIC沒(méi)有實(shí)際上改變，但它似乎改變，因?yàn)榭字袣埩舻目股氐牧可儆诳字屑虞d的量)。在大多數(shù)情況下，出現(xiàn)了兩個(gè)折點(diǎn)，第一折點(diǎn)，其中MIC似乎有一點(diǎn)增加了，然后在MIC超過(guò)測(cè)試的抗生素的最大量的地方高十倍濃度。后一折點(diǎn)用作截止點(diǎn)。重要的是注意在此大腸桿菌的情況下，對(duì)每種抗生素MIC為不同的。然而，對(duì)于這個(gè)測(cè)定，絕對(duì)MIC不是最重要的參數(shù)。最相關(guān)的讀數(shù)是β-內(nèi)酰胺酶濃度，在所述濃度處表觀MIC增加至測(cè)試的抗生素的最大量。當(dāng)截止點(diǎn)出現(xiàn)在低β-內(nèi)酰胺酶濃度時(shí)，這暗示β-內(nèi)酰胺酶在降解抗生素方面是強(qiáng)效的。當(dāng)它攜帶很多β-內(nèi)酰胺酶移動(dòng)MIC時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶對(duì)那種抗生素相對(duì)較弱。不希望受理論束縛，此測(cè)定經(jīng)設(shè)計(jì)為每個(gè)β-內(nèi)酰胺酶提供對(duì)給定抗生素的體內(nèi)功效的預(yù)測(cè)。這些數(shù)據(jù)可與體外動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)組合。表15.在存在來(lái)自表達(dá)可溶性β-內(nèi)酰胺酶蛋白P1A(RS310)、P3A(IS118)或P4A(IS288)的芽孢桿菌屬菌株的細(xì)菌培養(yǎng)上清液時(shí)，氨芐青霉素和頭孢曲松的抗生素活性。在存在連續(xù)稀釋的抗生素和所示量的來(lái)自96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的β-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)時(shí)，將大腸桿菌29522孵育過(guò)夜。測(cè)量培養(yǎng)物的細(xì)菌密度(OD625)，且測(cè)定相對(duì)于未處理的細(xì)菌對(duì)照密度減少90％(EC90)時(shí)的濃度。在單獨(dú)的兩天進(jìn)行測(cè)定且數(shù)據(jù)報(bào)道為Rep1和Rep2。NA＝未測(cè)定。表16.在存在來(lái)自表達(dá)可溶性β-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)P1A(RS310)、P3A(IS118)或P4A(IS288)的芽孢桿菌屬菌株的細(xì)菌培養(yǎng)上清液時(shí)，頭孢他啶、美羅培南、頭孢吡肟和頭孢三嗪(ceftriazone)的抗生素活性。在存在連續(xù)稀釋的抗生素和所示量的來(lái)自96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的β-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)時(shí)，將大腸桿菌29522孵育過(guò)夜。測(cè)量培養(yǎng)物的細(xì)菌密度(OD625)，且測(cè)定相對(duì)于未處理的細(xì)菌對(duì)照密度減少90％(EC90)時(shí)的濃度。在單獨(dú)的個(gè)天進(jìn)行測(cè)定且數(shù)據(jù)報(bào)道為由斜線分隔的兩個(gè)數(shù)值。NA＝未測(cè)定。表17.在存在來(lái)自表達(dá)可溶性β-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)P1A(RS310)、P3A(IS118)或P4A(IS288)的芽孢桿菌屬菌株的細(xì)菌培養(yǎng)上清液時(shí)，頭孢唑啉、amp/舒巴坦、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢呋辛和頭孢曲松的抗生素活性。在存在連續(xù)稀釋的抗生素和所示量的來(lái)自96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的β-內(nèi)酰胺酶蛋白質(zhì)時(shí)，將大腸桿菌29522孵育過(guò)夜。測(cè)量培養(yǎng)物的細(xì)菌密度(OD625)，且測(cè)定相對(duì)于未處理的細(xì)菌對(duì)照密度減少90％(EC90)時(shí)的濃度。在單獨(dú)的兩天進(jìn)行測(cè)定且數(shù)據(jù)報(bào)道為由斜線分隔的兩個(gè)數(shù)值。NA＝未測(cè)定。不希望受理論束縛，這些數(shù)據(jù)表明比由相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的更多的體外活性。例如，頭孢他啶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)缺乏治療效果，但這些數(shù)據(jù)顯示P4A在500ng/ml處10倍改善的活性。接著，觀察到P1A和P3A對(duì)氨芐青霉素相當(dāng)有效，而P4A喪失對(duì)氨芐青霉素的一些活性。amp/舒巴坦數(shù)據(jù)證實(shí)舒巴坦有效抑制P1A、P3A和P4A。然而amp/舒巴坦數(shù)據(jù)證實(shí)舒巴坦是有效的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，這不應(yīng)解釋為意味著這些β-內(nèi)酰胺酶將不會(huì)在體內(nèi)有效。具體地，如果膽汁排泄的藥代動(dòng)力學(xué)對(duì)抗生素和抑制劑是不同，那么抗生素可在不存在它的抑制劑下見(jiàn)于小腸中。例如，用哌拉西林/三唑巴坦已顯示P1A在人中是有效的。美羅培南數(shù)據(jù)證實(shí)所預(yù)期的是，P1A、P3A和P4Aβ-內(nèi)酰胺酶是青霉素酶和頭孢菌素酶。最后，觀察到P4A明顯有效地降解頭孢曲松，比P3A更好。P4A對(duì)頭孢曲松如它對(duì)氨芐青霉素一樣良好。P4對(duì)若干重要的頭孢菌素也有改善的活性，除頭孢吡肟外。與P1A相比，P4A展現(xiàn)出對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢唑啉、頭孢哌酮和頭孢呋辛約10倍或更大的β-內(nèi)酰胺酶活性。實(shí)施例5：P1A、P3A和P4A的抗生素降解性能的分析篩選P1A和P4A在微量滴定板活性測(cè)定中氨芐青霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟、cefozolin、頭孢呋辛、頭孢哌酮、頭孢吡肟和頭孢他啶的降解，設(shè)計(jì)所述測(cè)定以模仿在高抗生素濃度的存在下腸中β-內(nèi)酰胺酶的活性。通過(guò)在10或100ng/ml濃度下混合10、100或1000μg/ml的指示的抗生素與P1A或P4A進(jìn)行測(cè)定。將板在37℃孵育一小時(shí)，此后加入大腸桿菌(ATCC25922)，或在加入β-內(nèi)酰胺酶后立即加入大腸桿菌。將板孵育過(guò)夜，且通過(guò)在Spectramax384Plus板讀數(shù)器中在625nm(OD625)處測(cè)量吸光度來(lái)定量細(xì)菌生長(zhǎng)。對(duì)每個(gè)β-內(nèi)酰胺酶和抗生素進(jìn)行兩次分析。基于單個(gè)孔中的細(xì)菌生長(zhǎng)的外觀，將培養(yǎng)上清液的β-內(nèi)酰胺酶活性測(cè)定為陽(yáng)性或陰性。1.0或更大的OD625指示最大細(xì)菌生長(zhǎng)，因此完成抗生素降解和高β-內(nèi)酰胺酶活性。小于1.0的OD625指示低細(xì)菌生長(zhǎng)，因此完成抗生素降解和低β-內(nèi)酰胺酶活性。分析的結(jié)果示出于圖8。與β-內(nèi)酰胺酶和抗生素預(yù)培育的板與未進(jìn)行預(yù)孵育的板相比，獲得的讀數(shù)不存在差異。對(duì)于所有抗生素，除氨芐青霉素外，P4A顯示相對(duì)于P1A改善的活性。P1A對(duì)頭孢曲松、頭孢噻肟和頭孢他啶沒(méi)有顯示出活性。P4A顯示對(duì)頭孢噻肟、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢吡肟和頭孢他啶的更大功效。因此，P1A中的五個(gè)(P4A)氨基酸修飾增強(qiáng)頭孢菌素酶活性10-1000倍。因此P4A的口服施用可保護(hù)腸菌群免受常用頭孢菌素并且擴(kuò)大此預(yù)防性策略的臨床應(yīng)用，以預(yù)防例如CDI。具體地，本文提供的測(cè)定顯示在小腸中容易達(dá)到的濃度下，P4A可降解頭孢菌素和其它抗生素且具有相對(duì)于P1A改善的底物分布。定義以下定義與本文所公開(kāi)的發(fā)明結(jié)合使用。除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。如本文所用，“一個(gè)”，“一種”或“所述/該”可以意指一個(gè)或多于一個(gè)。此外，術(shù)語(yǔ)“約”當(dāng)與一個(gè)參考數(shù)字指示結(jié)合使用時(shí)意指所引用的數(shù)字指示加或減高達(dá)該參考數(shù)字指示的10％。例如，語(yǔ)言“約50”包括45至55的范圍。當(dāng)與醫(yī)學(xué)用途聯(lián)合使用時(shí)“有效量”是有效提供目標(biāo)疾病的可測(cè)量的治療、預(yù)防或降低目標(biāo)疾病的發(fā)病率的量。如本文所提及，除非另外規(guī)定，則所有的組合物百分比是按組合物總重量。如本文所用，單詞“包括”和它的變化形式意圖為非限制性的，使得列表中條目的敘述不是對(duì)其它類似物品的排除，其它類似物品也可用于在此技術(shù)的組合物和方法中。類似地，術(shù)語(yǔ)“可以”和“可”及它們的變化形式意圖為非限制性的，使得實(shí)施方案可以或可包括某些要素或特征的敘述并不排除不包含那些要素或特征的本技術(shù)的其它實(shí)施方案。盡管開(kāi)放式術(shù)語(yǔ)“包含”，作為術(shù)語(yǔ)諸如包括、含有或具有的同義詞，在本文中用于描述或要求保護(hù)本發(fā)明，本發(fā)明或其實(shí)施方案可替代地使用替代術(shù)語(yǔ)諸如“由...組成”或“基本上由...組成”來(lái)描述。如本文所用，詞語(yǔ)“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”是指在某些情況下提供某些益處的技術(shù)的實(shí)施方案。然而，在相同或其它情況下，也可優(yōu)選其它實(shí)施方案。此外，一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的敘述并不意味著其它實(shí)施方案是沒(méi)有用的，并且不意圖從技術(shù)范圍排除其它實(shí)施方案。實(shí)現(xiàn)治療效果所需的本文所述的組合物的量可根據(jù)用于特定目的的常規(guī)程序經(jīng)驗(yàn)性地確定。一般地，對(duì)于施用治療劑(例如，本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺酶和/或用于治療目的的藥物組合物(和/或另外的藥劑)，治療劑是按藥理學(xué)有效劑量給予。“藥學(xué)上有效的量”、“藥學(xué)上有效的劑量”、“治療有效量”或“有效量”是指足以產(chǎn)生期望的生理效應(yīng)的量或能夠?qū)崿F(xiàn)期望結(jié)果的量，所述期望結(jié)果特別是對(duì)于治療病癥或疾病。如本文所用，有效量將包括足以例如延緩病癥或疾病的癥狀的發(fā)展、改變病癥或疾病的癥狀的過(guò)程(例如，減慢疾病的癥狀的進(jìn)展)、減少或消除病癥或疾病的一種或多種癥狀或表現(xiàn)以及逆轉(zhuǎn)病癥或疾病的癥狀的量。例如，不僅當(dāng)潛在病狀被根除或改善時(shí)，而且當(dāng)患者報(bào)道疾病相關(guān)的癥狀的嚴(yán)重程度降低或持續(xù)時(shí)間減少時(shí)，向患有GI道病癥(例如，CDI)的患者施用治療劑提供治療益處。治療益處還包括停止或減慢潛在疾病或病癥的進(jìn)展，無(wú)論是否實(shí)現(xiàn)改善。有效量、毒性和治療功效可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定，例如，確定LD50(約50％群體致死劑量)和ED50(約50％群體中治療上有效的劑量)。劑量可視所使用的劑型和所使用的施用途徑而變化。毒性與治療作用之間的劑量比為治療指數(shù)并且可表示為L(zhǎng)D50/ED50比。在一些實(shí)施方案中，展現(xiàn)出大的治療指數(shù)的組合物和方法是優(yōu)選的?？捎审w外測(cè)定(包括例如細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定)來(lái)初始地評(píng)估治療有效劑量。而且，接著可在動(dòng)物模型中配制劑量以實(shí)現(xiàn)循環(huán)血漿濃度范圍，所述范圍包括如在細(xì)胞培養(yǎng)物中或在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型中測(cè)定的IC50?？衫缤ㄟ^(guò)高效液相色譜法測(cè)量血漿中所述組合物的水平。任何特定劑量的效果可以通過(guò)合適的生物測(cè)定來(lái)監(jiān)測(cè)。可由醫(yī)生確定劑量，且在必要時(shí)調(diào)整以適合治療的觀察到的效果。在某些實(shí)施方案中，效果將導(dǎo)致至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約50％、至少約70％或至少約90％的可量化改變。在一些實(shí)施方案中，效果將導(dǎo)致約10％、約20％、約30％、約50％、約70％或甚至約90％或更多的可量化改變。在某些實(shí)施方案中，效果將導(dǎo)致兩倍、或三倍、或四倍、或五倍或十倍的可量化改變。治療益處還包括停止或減慢潛在疾病或病癥的進(jìn)展或降低毒性，無(wú)論是否實(shí)現(xiàn)改善。等效方案雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合其具體實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解能夠進(jìn)一步地修改，并且本申請(qǐng)意圖涵蓋一般按照本發(fā)明的原理和包括自本發(fā)明出發(fā)的變化、用途或改變，所述變化、用途或改變?cè)诒景l(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)的已知或常規(guī)實(shí)踐，并可以應(yīng)用于本文提出的和以下所附權(quán)利要書(shū)的范圍內(nèi)的必要特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)將認(rèn)識(shí)到或能夠確定本文確切描述的具體實(shí)施方案的許多等效方案。此類等效方案意圖涵蓋在以下權(quán)利要求書(shū)的范圍中。通過(guò)引入并入本文引用的所有專利和出版物據(jù)此通過(guò)引用整體并入。本文所討論的公布僅因其公開(kāi)內(nèi)容在本申請(qǐng)的提交日期之前而提供。本文中的任何內(nèi)容不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明由于先前的發(fā)明而無(wú)權(quán)早于所述公布。如本文所用，所有標(biāo)題是簡(jiǎn)單地用于組織和不意圖以任何方式限制本公開(kāi)。任何個(gè)別部分的內(nèi)容可同樣適用于所有部分。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3