聯(lián)邦政府在本發(fā)明中享有一定權(quán)利，因為導致本發(fā)明的研究至少部分由國立神經(jīng)病和中風研究所(National Institute of Neurological Disorders and Strokes，NINDS)合約NS069375-01A1提供資金。

發(fā)明背景

神經(jīng)退行性病癥、病況和疾病，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是一種現(xiàn)代社會不斷增長的顧慮。僅AD便影響全球至少2400萬人，并且預期因人口老齡化和較高的診斷率所致，其流行程度呈指數(shù)增長。目前可獲得的經(jīng)FDA批準的AD藥物，例如膽堿酯酶抑制劑和美金剛，只提供癥狀緩解。AD目前仍無法治愈。無疑，缺少AD的有效療法可歸因于涉及該疾病的發(fā)生與發(fā)展的一系列復雜因素。例如，AD發(fā)生與發(fā)展的特征在于神經(jīng)元和突觸的丟失、不同神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的改變、淀粉狀蛋白斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)的蓄積，以及慢性炎癥，這通過在AD的不同階段觀察到的淀粉狀蛋白斑周圍存在活化小膠質(zhì)細胞和反應性星形細胞證實。這一系列的癥狀強調(diào)了涉及研發(fā)用于患有AD的人的有效療法的復雜難題，并且表明了同時調(diào)節(jié)AD病理學不同的關(guān)鍵靶點可能代表為此最全面的治療。

無法識別面部(社交識別)是幾種神經(jīng)障礙(包括阿爾茨海默病(AD))中的一種確定的內(nèi)在表型。然而，這種癥狀的基礎(chǔ)病因仍未找到。若干研究強調(diào)催產(chǎn)素和加壓素在社交識別中的作用，并且表明低水平的催產(chǎn)素可能對孤獨癥患者中面部識別的缺陷負有責任。然而，在AD患者中，死后研究無法表明中樞加壓素和催產(chǎn)素濃度的差異，海馬中的除外，其中似乎高于正?；颊叩乃?。這就表明催產(chǎn)素水平的變化不引起AD中社交識別的缺陷，并且表明我們不完全了解負責社交識別的神經(jīng)回路?；蛘撸擞么弋a(chǎn)素的長期作用未知，可能會被充分證實是有害的。

AD的一個已充分確認的病理學標志是藍斑(locus coeruleus) (腦中去甲腎上腺素(NA)的主要來源)中的神經(jīng)元變性。這種變性與NA的后續(xù)減少和腎上腺素能受體的活化降低有關(guān)。腎上腺素能受體通過不同的胞內(nèi)信號傳導途徑介導NA的獨特作用，并且在學習和記憶過程中起重要作用。最近，β-腎上腺素能系統(tǒng)明確地講β₁-腎上腺素能受體(β₁-ADR)在認知功能中的貢獻已引起關(guān)注。例如，β-ADR上的NA作用調(diào)節(jié)抑制性突觸功能。其它研究顯示，β₁選擇性拮抗劑倍他洛爾在野生型小鼠和大鼠中產(chǎn)生空間導航提取缺陷(spatial navigation retrieval deficit)，而可通過β₁部分激動劑扎莫特羅拯救在NA缺乏的小鼠中觀察到的提取缺陷。這些結(jié)果表明，由β₁-ADR介導的去甲腎上腺素能神經(jīng)傳遞可能關(guān)鍵性地參與特征在于去甲腎上腺素能變性的神經(jīng)障礙中所觀察到的認知缺陷。

遺憾的是，目前對成為阿爾茨海默病基礎(chǔ)的神經(jīng)原因且最終是分子原因的不完全了解，成為缺乏其有效療法的原因。用于改善認知和社交識別/社交記憶兩者的有效療法也可為用于孤獨癥的有用療法。同樣，因為本發(fā)明提供用于改善認知和社交行為兩者的方法，所以它也提供治療ADD和ADHD兩者的方法。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供改善患有阿爾茨海默病、唐氏綜合征、ADD、ADHD或孤獨癥的人的認知和社交識別的方法，所述方法需要以足以改善所述認知和社交識別的量給予至少一種化合物，所述化合物為β1-腎上腺素能受體激動劑或其前藥化合物或兩者或任一種或兩種的藥學上可接受的鹽。

本發(fā)明還提供多種在體內(nèi)水解時釋放β₁-腎上腺素能受體激動劑的前藥β₁-腎上腺素能受體激動劑化合物和包含所述前藥β₁-腎上腺素能受體激動劑化合物的組合物。與β₁-ADR激動劑化合物相比，β₁-ADR激動劑前藥具有改進的親脂性和CNS生物利用度。

本發(fā)明進一步提供具有手性中心的β₁-ADR激動劑化合物的R-和S-對映異構(gòu)體化合物，其可代替所述化合物的外消旋混合物單獨使用，以及用于制備這些對映異構(gòu)體化合物的方法。

本發(fā)明還提供用于改善顯示阿爾茨海默病、唐氏綜合征、ADD、ADHD和/或孤獨癥的人的社交記憶和其它認知特質(zhì)的方法。

附圖簡述

圖1：阿爾茨海默病APP小鼠模型的特征在于社交識別受損(impaired social recognition)和MeA中的β₁-ADR表達增量調(diào)節(jié)。在左邊，顯示了實驗的示意圖。(A)野生型(WT；n=11)和APP (n=9)小鼠兩者探索裝有陌生的C57B1/6入侵小鼠的杯超過空杯，顯示出正常的社交能力(通過配對t檢驗*** p<0.0001)：(B)然而，雖然WT對新的C56B1/6入侵者顯示超過對熟悉小鼠的偏愛(通過配對t檢驗** p<0.0067)，但是APP小鼠不顯示這種偏愛(通過配對t檢驗p=0.2780)，表明了社交識別缺陷。社交識別的這種缺陷與非社交氣味識別的缺陷無關(guān)。(C) WT (n=7)和APP (n=8)小鼠兩者更多地嗅聞裝有庚醇溶液的管超過空管(通過配對t檢驗** p<0.01)；(D)同樣，WT和APP小鼠兩者對裝有新的醇氣味(庚醇:辛醇溶液)的管顯示超過對熟悉管(僅庚醇)的偏愛(通過配對t檢驗** p=0.0062和*** p=0.0001)，表明了兩種基因型均可記住熟悉的非社交氣味。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。

圖2：β₁-ADR的活化是社交識別所必需的。在左邊，評價社交識別所遵循的實驗設(shè)計的代表性示圖。用范圍為0.01-1 mg/kg (n=8/組)的不同劑量的倍他洛爾阻斷β₁-ADR不影響社交學習但影響社交識別受損。(A)注射倍他洛爾或溶媒的所有小鼠更喜歡裝有陌生C57B1/6小鼠的杯子超過空杯(通過配對t檢驗*** p<0.0001)。(B)然而，注射0.1或1 mg/kg倍他洛爾的小鼠不顯示對新的C56B1/6入侵小鼠超過熟悉小鼠的偏愛(ns，通過配對t檢驗)，表明了社交識別受損，而注射溶媒或0.01 mg/kg倍他洛爾的小鼠顯示這種偏愛(通過配對t檢驗分別為** p=0.003和0.008)；倍他洛爾不損害非社交氣味識別；(C)在非社交氣味識別的試驗中，倍他洛爾不影響小鼠對裝有庚醇溶液的管的偏愛超過空管(通過配對t檢驗，溶媒n=7 *** p=0.0004；倍他洛爾n=7 ** p=0.0016)；(D)不影響小鼠區(qū)分熟悉的氣味(庚醇)與新但類似氣味(庚醇:辛醇的溶液)的能力(通過配對t檢驗，溶媒** p=0.019；倍他洛爾** p=0.0015)。(E)在社交識別測試之前全身注射扎莫特羅(3mg/kg)不影響WT (n=10)和APP (n=10)小鼠對陌生入侵者的偏愛超過空杯(通過配對t檢驗*** p<0.0001)；但是(F)拯救之前在APP小鼠中觀察到的社交識別缺陷(參見圖1B)；與其注射扎莫特羅的WT對照同胞仔鼠類似(n=10)，扎莫特羅注射APP小鼠(n=10)對新的入侵者顯示出偏愛超過熟悉的小鼠(通過配對t檢驗，WT；* p=0.0198；APP：***p=0.0001)。

圖3：β₁-ADR的活化是獲得社交暗示(social cue)所必需的。(A)在3室試驗中測試的β₁-ADR KO小鼠(n=17)對裝有陌生入侵者的杯顯示出偏愛超過空杯(*** p<0.0001)，與對照小鼠(FVB小鼠n=16)類似(*** p=0.0002)。然而，β₁-ADR KO小鼠無法識別新的入侵者與熟悉的小鼠，而其WT對照分得出這種區(qū)別(通過配對t檢驗** p=0.005)。(B) β₂-ADR KO小鼠(n=8)顯示對裝有陌生入侵者的杯的偏愛超過空杯(*** p=0.0002)，與對照FVB小鼠(n=8；*** p<0.0001)或用3mg/kg倍他洛爾治療的β₂-ADR KO小鼠(n=8；** p=0.001)類似。FVB對照和β₂-ADR KO小鼠兩者對新的入侵者顯示出偏愛超過熟悉的小鼠(通過配對t檢驗*** p=0.0004)，表明了甚至在小鼠缺乏β₂-ADR時的正常的社交識別能力；另外，倍他洛爾在β₂-ADR KO小鼠中有效地損害社交識別能力(ns，通過配對t檢驗)，表明倍他洛爾對社交識別的作用不受β₂-ADR調(diào)節(jié)。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。(C)在試驗的提取階段之前30分鐘全身注射倍他洛爾(1mg/kg)不損害社交識別；溶媒注射和倍他洛爾注射小鼠(n=8)兩者更喜歡新的入侵者超過熟悉的小鼠(通過配對t檢驗分別為** p=0.0023和* p=0.0136)。(D)在試驗的學習階段之前20分鐘全身注射倍他洛爾(1mg/kg)損害短期社交識別；相對于熟悉的小鼠，倍他洛爾注射小鼠(n=8)并不更喜歡新的入侵者(ns p=0.3889，通過配對t檢驗)，表明了社交識別缺陷，而溶媒注射小鼠(n=8)顯示這種偏愛(通過配對t檢驗*** p=0.0007)。(E)在試驗的學習階段之前20分鐘全身注射倍他洛爾(1mg/kg)損害長期社交記憶；在學習階段后24小時，倍他洛爾注射小鼠(n=8)顯示這種偏愛(* p=0.0119)。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。

圖4：內(nèi)側(cè)杏仁核(medial amygdala, MeA)中β₁-ADR的活化是社交識別所必需的。(A)在社交識別任務中的測試之前注射倍他洛爾(1 mg/kg)減少MeA中c-Fos陽性細胞的數(shù)目(溶媒注射小鼠n=4；倍他洛爾注射小鼠n=4；通過t檢驗** p=0.0076)。(B)冠狀面的圖示顯示MeA中的注射。(C)在MeA中給小鼠注射溶媒(n=5)或30納摩爾倍他洛爾(n=5)。倍他洛爾損害小鼠的社交識別而不影響社交學習。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。比例尺，50 μm。(D)在MeA中給小鼠注射溶媒(n=4)或PKA抑制劑(2.75納摩爾 – n=5)。PKA抑制不影響小鼠對陌生同種的偏愛超過空杯(通過配對t檢驗，溶媒治療小鼠：* p=0.047和PKA抑制劑治療小鼠：* p=0.02)但損害小鼠辨認新的和熟悉同種的能力(通過配對t檢驗，溶媒治療小鼠* p=0.031和PKA抑制劑治療小鼠：ns)。

圖5：CREB磷酸化是社交識別所必需的。(A)在社交習得(SA)之前(基線) (n=6)、在社交習得3 (n=6)或5分鐘(N=5)后立即和在5分鐘社交習得后10分鐘(n=6)對C57B1/6小鼠的MeA提取物進行的pCREB的蛋白質(zhì)印跡分析。當與基線值相比時，在社交學習5分鐘后pCREB表達顯著增加*(在單因素ANOVA后的事后檢驗(**，p=0.0333))，且在社交學習完成后10分鐘降低(**，在單因素ANOVA后的事后檢驗((** p=0.0333))。使相對光密度歸一化至CREB。(B)對在社交學習前60分鐘全身注射倍他洛爾(1 mg/kg)或溶媒(n=5/組)并在社交互動5分鐘后處安樂死的C57B1/6小鼠的MeA提取物進行的pCREB的蛋白質(zhì)印跡分析。pCREB表達在倍他洛爾注射中顯著增加(通過t檢驗* p=0.0113)。(C)對在安樂死前5分鐘(N=6)、15分鐘(n=6)和30分鐘(n=5)全身注射β₁-ADR部分激動劑扎莫特羅(3 mg/kg)的C57B1/6小鼠的MeA提取物進行的pCREB的蛋白質(zhì)印跡分析。當與基線相比時，在注射后5分鐘pCREB表達增加(n=5) (*，在單因素ANOVA后的事后檢驗(* p=0.0415))。使相對光密度歸一化至CREB。(D)在社交學習前注射扎莫特羅(n=4 APP，n=5 WT)或溶媒(n=4 APP，n=4 WT)的APP小鼠和WT對照的內(nèi)側(cè)杏仁核的核流分的蛋白質(zhì)印跡分析顯示核pCREB的水平在APP小鼠中較低(*，在單因素ANOVA后的事后檢驗)，且在扎莫特羅注射組中顯著較高(**，在單因素ANOVA后的事后檢驗(**，p=0.011))。使相對光密度歸一化至組蛋白H3。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。

圖6：用倍他洛爾(1mg/kg)阻斷β₁-ADR獨立于非社交氣味識別和物體識別地損害社交識別。(A)在3室社交識別試驗中，在實驗的學習階段前全身注射倍他洛爾不改變小鼠對杯中的陌生入侵者的偏愛超過空杯(溶媒-τττβ注射小鼠n=10，通過配對t檢驗*** p=0.0005；倍他洛爾注射小鼠n=10，通過配對t檢驗** p=0.0015)。然而，倍他洛爾損害社交識別：倍他洛爾注射小鼠不顯示對新的入侵者的偏愛超過熟悉的小鼠(通過配對t檢驗p=0.7127)，而溶媒注射小鼠顯示出這種偏愛(通過配對t檢驗** p=0.0082)。(B)倍他洛爾不損害非社交氣味識別：在非社交氣味習慣、習慣解除和識別的試驗中，溶媒注射(n=10)和倍他洛爾注射(n=10)小鼠兩者在連續(xù)3次暴露的過程中習慣于非社交氣味(水和香子蘭)，并在提供新的氣味時解除習慣(水習慣：溶媒*** p<0.0001；倍他洛爾^τττ p<0.001；水習慣：溶媒** p=0.0011；倍他洛爾^τττ p<0.001；香子蘭習慣：溶媒*** p=0.0001；倍他洛爾^τττ p=0.0029)。所有小鼠還能夠區(qū)分之前提供的氣味(香子蘭)和新的氣味(薄荷)，如相對于當3次提供香子蘭氣味時的嗅聞時間，當提供薄荷氣味時較長的嗅聞時間所表明的(溶媒** p=0.0025；倍他洛爾^ττ p=0.0017)。(C和D)小鼠面對新的氣味或物體時分別認出熟悉的氣味或物體的能力不受倍他洛爾影響。在物體識別試驗中，溶媒注射(n=10，通過配對t檢驗*** p<0.0001)和倍他洛爾注射(n=10，通過配對t檢驗** p=0.0015)小鼠兩者更喜歡新的氣味或物體超過熟悉的氣味或物體。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。

圖7：(A)在社交識別后90分鐘在MeA中誘導c-Fos表達。在對照小鼠(n=4)和暴露于社交識別任務的小鼠(n=$)中采用無偏體視學方法(non-biased stereological method)進行了c-Fos陽性細胞的定量測定(通過t檢驗* p-0.0303)。(B)在社交識別后，在基底外側(cè)杏仁核(BLA)中不誘導c-Fos表達。在對照小鼠(n=4)和暴露于社交識別任務的小鼠(n=4)中采用無偏體視學方法進行了c-Fos陽性細胞的定量測定(通過Mann-Whitney檢驗p=0.4857)。(C)在社交識別任務的測試之前注射倍他洛爾不影響丘腦(PV) (不參與社交記憶和β₁-ADR低下的腦區(qū))中的c-Fos陽性細胞的數(shù)目(溶媒注射小鼠n=4；倍他洛爾注射小鼠n=4；通過Mann-Whitney檢驗p=0.8571)。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。比例尺，100μm (放大框)和200 μm。

圖8：對來自對照小鼠和APP小鼠(n=4/組)的內(nèi)側(cè)杏仁核的完整組織勻漿物進行的pCREB的蛋白質(zhì)印跡分析，pCREB水平在APP小鼠中顯著較高(通過Mann-Whitney檢驗*，p=0.0286)。使相對光密度歸一化至CREB。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。

圖9：說明作為例如AD治療劑的β₁-ADR激動劑化合物(或其前藥或衍生物)的工作模型。除恢復認知功能以外，β₁-ADR的活化可提供獨特的疾病緩和作用。

圖10：說明用于測定各化合物及其前藥作為治療AD、DS、ADD、ADHD和孤獨癥的治療性化合物的療效的方法的示意圖。

圖11：說明(A)扎莫特羅的藥理學，籍此作為β₁-ADR激動劑的扎莫特羅的確刺激cAMP信號傳導(A)，同時對β-抑制蛋白途徑?jīng)]有作用(B)。相比之下，異丙腎上腺素激活cAMP和β-抑制蛋白途徑兩者。

圖12：C57BI/6小鼠用單劑量(1 mg/kg)的β₁-ADR拮抗劑倍他洛爾治療，這導致背景記憶的損害。

圖13：說明通過急性皮下給予扎莫特羅拯救在Thy1-APP ^Lond/Swe+小鼠中觀察到的社交記憶(A)和工作記憶(B)缺陷。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。Non-tg：非轉(zhuǎn)基因)。

圖14：說明通過DAB染色檢測Thy1-APP ^Lond/Swe+ (Tg)小鼠中內(nèi)側(cè)杏仁核的β₁-ADR表達的增量調(diào)節(jié)。(*p<0.05;Non-Tg = 非轉(zhuǎn)基因)。

圖15：說明5XFAD小鼠中慢性給予扎莫特羅的作用：(A)通過扎莫特羅治療拯救陳述性記憶的缺陷(判別比不顯著高于機會水平)。(B和C)以治療改善Morris水迷宮中的行為(逃避潛伏期–B和趨觸性時間– C)。Ns：不顯著高于機會水平；*p=0.05；**p<0.001；***p<0.001。慢性給予扎莫特羅增加活化小膠質(zhì)細胞和Aβ斑清除。(D)用以下染色的50μm冠狀面的DAB染色：上排，抗Iba1抗體(針對活化小膠質(zhì)細胞)；下排，6E10抗淀粉狀蛋白AB抗體。

圖16：說明用扎莫特羅慢性治療(3 mg/kg，s. c.，3個月)不產(chǎn)生心肌結(jié)構(gòu)的變化，如通過解剖心臟的Masson三色染色測量的(A)。用扎莫特羅/溶媒治療3個月的野生型小鼠顯示在心肌纖維化(B)和左心室與右心室(LV/RV)比(C)上無顯著差異。用扎莫特羅/溶媒治療3個月的野生型小鼠顯示在心血管功能中無顯著差異(D)。全身血壓：sys BP；舒張壓：diast BP；心率；射血分數(shù)：EF；縮短分數(shù)：FS；心臟重量/體重：HW/BW (n = 3)。

圖17：說明扎莫特羅的結(jié)構(gòu)和加入名為R₁和R₂的基團的結(jié)構(gòu)修飾的某些位置。R₁和R₂的實例為酰基、氨基甲酰基和噁唑烷基。或者，在扎莫特羅分子中，可通過使–NH-基團衍生化形成可水解的前藥。例如，可按U.S. 8,865,920 (其以整體結(jié)合到本文中)所述使-NH-基團?；?。在本發(fā)明中，使用用于形成結(jié)構(gòu)修飾的基團來形成扎莫特羅和其它β₁-ADR激動劑的前藥，這賦予前藥比所述β₁-ADR激動劑大的親脂性和大的CNS生物利用度。

圖18：說明扎莫特羅的親脂性前藥的實例(1-4)及其ClogP值。在該圖中，使用R₁和R₂兩者，但考慮了單獨的R₁或R₂任一個的前藥。

圖19：說明其中只使用R₁的本發(fā)明的扎莫特羅的具體示例性前藥。在這兩個實例中不使用R₂。

圖20：說明在臨床前AD動物模型中測試前藥的流程。

圖21：說明阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因小鼠模型Thyl-hAPP ^Lond/Swe+系轉(zhuǎn)基因小鼠中扎莫特羅的行為作用。(A)顯示用扎莫特羅慢性治療在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生活動過度表型的劑量依賴性逆轉(zhuǎn)。(B)顯示用扎莫特羅慢性治療產(chǎn)生認知功能的劑量依賴性改善，如通過恐懼條件反射試驗測定。這表明前藥在ADD和ADHD治療中的潛在有用性。

圖22：說明扎莫特羅的前藥不激活cAMP信號傳導途徑，并且前藥體內(nèi)轉(zhuǎn)化成扎莫特羅。(A)顯示扎莫特羅和2種前藥(AT-001)和(AT-002)的分子結(jié)構(gòu)，及其對cAMP信號傳導途徑的藥理作用。(B)顯示在口腔注入2種前藥后，扎莫特羅和AT-001 (上排)和AT-002 (下排)的血漿濃度與時間概況。扎莫特羅血漿水平反映了前藥在體內(nèi)水解產(chǎn)生扎莫特羅所需要的時間和程度。對于2種前藥，進行口服給藥。

圖23：說明扎莫特羅的R-和S-對映異構(gòu)體具有明確不同的藥理活性，因為在β₁-ADR激動作用中S-對映異構(gòu)體的效力約為R-對映異構(gòu)體的500倍。扎莫特羅(R,S)、扎莫特羅(S)和扎莫特羅(R)的EC₅₀ (nM)值分別為11.6、21.2和11900。這些是扎莫特羅(外消旋體)和扎莫特羅的R-和S-對映異構(gòu)體的濃度反應曲線。

圖24：說明皮下(subQ)給予AT-002提供來自體內(nèi)水解的高血漿水平的扎莫特羅的速度。SubQ注射也許是給予扎莫特羅的親脂性前藥以達到高血漿水平的扎莫特羅的最快和最有效的手段。

實施方案詳述

本發(fā)明基于幾個基本發(fā)現(xiàn)。第一，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)β₁-去甲腎上腺素能信號傳導調(diào)節(jié)社交識別的認知功能，并且可用作治療例如AD、DS、ADD、ADHD和/或孤獨癥等神經(jīng)變性疾病的治療靶標。

第二，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)Thy1-hAPP ^Lond/Swe+小鼠顯示社交識別缺陷。他們還發(fā)現(xiàn)用倍他洛爾(一種選擇性β₁-ADR拮抗劑)治療的WT小鼠顯示與β₁-ADR表達細胞中c-Fos活化降低和MeA中pCREB水平降低有關(guān)的社交識別缺陷。另外觀察到，在MeA中直接注射PKA抑制劑導致類似的社交識別缺陷。

第三，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)β₁-腎上腺素能受體激動劑(例如扎莫特羅)通過提高核pCREB的水平拯救Thyl-hAPP ^{Lond Swe+}小鼠的社交識別缺陷。

第四，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)通過激動劑激活β₁-ADR降低或抑制活動過度，因此，提供治療注意缺陷障礙(ADD)和/或注意缺陷障礙伴多動(ADHD)的方法。

第五，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)β₁-ADR的激動性刺激提供提高社交記憶的機制，其是用于治療可觀察到的隨DS和/或孤獨癥發(fā)生的社交記憶下降的有利方法。實際上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)β₁-ADR的活化是社交識別所必需的。

第六，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)親脂性增強的扎莫特羅的各種前藥為本文公開的用途提供提高的生物利用度。

第七，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)扎莫特羅的不同前藥的R-和S-對映異構(gòu)體之間的活性差異可有利地用于提供具有高β₁-ADR激動劑活性的對映異構(gòu)體以產(chǎn)生增強的認知的改善和活動過度的逆轉(zhuǎn)。

第八，本發(fā)明人進一步發(fā)現(xiàn)用于制備扎莫特羅的R-或S-對映異構(gòu)體前藥的對映有擇合成以及用于制備外消旋扎莫特羅或其前藥的合成程序。

本發(fā)明部分涉及任何β₁-ADR激動劑的親脂性前藥。然而，特別有利的是扎莫特羅的親脂性前藥。扎莫特羅具有下式：

HO-Phe-O-CH₂-C*HOH-CH₂-NH-CH₂CH₂-NH-C(=O)-嗎啉

其中Phe為苯基，其末端OH和OCH₂彼此相對，嗎啉為嗎啉環(huán)，*表示手性碳。-C(=O)-表示羰基。有關(guān)扎莫特羅的結(jié)構(gòu)圖參見圖17的上式。

一般而言，扎莫特羅的親脂性化合物如下制備：通過使可水解基團同與苯環(huán)鍵合的末端–OH基團或與手性碳鍵合的羥基或兩者共價結(jié)合，條件是可水解基團既是親脂的，又增強整個分子的親脂性，并且可水解基團是體內(nèi)可水解的。所述可水解基團的非限制性實例為酰基、氨基甲酸酯和噁唑烷基(oxoazolidine group)?？偟膩碚f，所有這些基團基本上都可用于末端苯基羥基或與手性碳鍵合的羥基或兩者的親脂性封閉基團，其是體內(nèi)可水解的基團，釋放出作為外消旋體或作為(R)-或(S)-對映異構(gòu)體的游離扎莫特羅。這些同類基團還可用來在任何β₁-ADR激動劑化合物(例如去甲腎上腺素、異丙腎上腺素或酯多巴酚丁胺)的末端羥基上形成酯，以改進例如親脂性，并因此改進生物利用度和CNS可用性。去甲腎上腺素和異丙腎上腺素兩者均具有2個末端苯基羥基和1個第二羥基。多巴酚丁胺具有3個末端苯基羥基，但無第二羥基。因此，特別考慮了用于任何其它β₁-ADR激動劑化合物(例如去甲腎上腺素、異丙腎上腺素和多巴酚丁胺)的下述對于扎莫特羅的方法。

NA系統(tǒng)代表了AD中最估計不足但卻重要的神經(jīng)藥理學靶標。來自AD患者的死后腦顯示藍斑(LC) (腦中NA的主要來源)的進行性和廣泛性變性。在人AD患者和AD小鼠模型中還描述了生物化學變化，例如NA的皮質(zhì)水平降低和腎上腺素能受體(ADR)和NA轉(zhuǎn)運蛋白的表達的改變。重要的是，發(fā)現(xiàn)NA病理學與AD的幾個關(guān)鍵方面相關(guān)。此外，因為NA對與學習和記憶有關(guān)的皮質(zhì)回路和突觸功能具有十分確定的作用。

已表明NA神經(jīng)元的減少與癡呆的嚴重程度正相關(guān)，并且表明使用神經(jīng)毒素N-[2-氯乙基]-N-乙基-2-溴芐胺化學切除LC加重AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型的認知缺陷。此外，NA系統(tǒng)功能障礙涉及特征在于包括拳擊員癡呆、輕度認知損害、Wernicke-Korsakov綜合征和唐氏綜合征在內(nèi)的記憶損害的其它疾病。還表明LC神經(jīng)元變性和NA缺乏與AD的幾個病理學特征(包括淀粉狀蛋白斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的組織負荷)強相關(guān)。實際上，可通過NA缺乏在炎癥反應中的重要作用，來解釋NA缺乏和AD的神經(jīng)病理學標志之間的相關(guān)性。例如，已顯示NA可激活小膠質(zhì)細胞，其通過分泌降解β-淀粉狀蛋白肽(Aβ)的蛋白水解酶和通過介導Aβ的胞吞兩者而具有神經(jīng)保護功能。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)β₁-ADR在社交識別和記憶中起重要作用，因此可用于療法，以期改善因神經(jīng)變性病癥(例如阿爾茨海默病)所致而在這些特質(zhì)有缺陷的人的認知和社交識別/社交記憶。我們利用藥理學和分子工具研究了AD Thy1-APP^Lond/Swe (APP)小鼠模型中的社交識別/記憶，并且表明APP小鼠中所觀察到的社交識別缺陷與MeA中的β₁-ADR信號傳導異常有關(guān)。β₁-ADR的藥理活化作用和恢復APP小鼠中的pCREB水平拯救該AD模型中以別的方式檢出的社交記憶缺陷。我們的結(jié)果首次證實了MeA中的β₁-ADR和CREB磷酸化是在正常腦功能下社交學習的必需的信號傳導級聯(lián)。

許多不同的化合物和這些化合物及其藥理學上可接受的鹽的組合被明確考慮用作所要求保護的發(fā)明的β₁-ADR激動劑。

例如扎莫特羅、異丙腎上腺素、多巴酚丁胺和多巴胺或其鹽等化合物可用作β₁-ADR激動劑。另外，也可使用通過分子羥基的官能化所得的前藥衍生物或前藥化合物(例如?；苌锘蝓０费苌?以及其鹽。然而，特別引人關(guān)注的是具有酰化末端苯基羥基的扎莫特羅的前藥化合物和扎莫特羅的這些前藥化合物的R-和S-對映異構(gòu)體。下面更詳細地進一步描述這些化合物。

術(shù)語定義：

在本說明書中使用下文所示術(shù)語，所述術(shù)語具有如下定義的含義。

神經(jīng)變性病癥：意指相對于如通過慣常學識和學問對于該類別的哺乳動物(包括人)可預期的顯示正?；虻湫偷恼J知或社交記憶或社交記憶的正常或?qū)φ詹溉閯游?包括人)，引起顯示病況、病癥或疾病的哺乳動物(包括人)出現(xiàn)認知或社交識別或社交記憶減退的任何神經(jīng)變性病況、病癥或疾病。這類病況、病癥或疾病的非限制性實例是阿爾茨海默病(AD)和/或孤獨癥。

社交識別：意指哺乳動物(包括人)識別其它哺乳動物(包括人)的能力，在非人哺乳動物的情況下通過已建立的實驗測量，就人而言如通過行為或言語表明的根據(jù)面部識別。

MeA：意指內(nèi)側(cè)杏仁核。

PKA：意指蛋白質(zhì)激酶A，一種酶的家族。

CREB：意指cAMP反應元件結(jié)合蛋白，其是與某種DNA序列(稱為cAMP反應元件(CRE))結(jié)合的細胞轉(zhuǎn)錄因子。其轉(zhuǎn)錄被CREB調(diào)節(jié)的基因包括例如c-fos、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白BDNF和許多神經(jīng)肽，例如促生長素抑制素。

cAMP：意指環(huán)腺苷-3’,5’-一磷酸。cAMP依賴性途徑意指腺苷酸環(huán)化酶途徑。

Beta-1 ADR或β₁-ADR：意指β₁-腎上腺素能受體。

Beta-1 ADR激動劑或β₁-ADR激動劑：意指對β₁-ADR顯示完全或部分激動作用的任何化合物或其藥學上可接受的鹽。這類化合物的實例包括扎莫特羅、異丙腎上腺素(亦稱為isoproterenol)、多巴酚丁胺、去甲腎上腺素或多巴胺。

前藥-化合物：意指藥理學活性化合物的化學修飾形式，其在體內(nèi)進行化學或酶促轉(zhuǎn)化以釋放出活性化合物或母體藥物。更準確地說，使適于化學或酶促轉(zhuǎn)化的功能部分與藥理學活性化合物連接以改進藥物打靶。例如，自β₁-ADR母體(即未衍化)化合物的羥基官能化的?；苌锘蝓０费苌锟捎涗洖榍八幯苌锘蚧衔锏膶嵗Ｍㄟ^將酰基部分或酰胺部分加至母體化合物中，可提高母體化合物相對于未衍化母體化合物的生物利用度。在本說明書中，術(shù)語“衍生物”與“前藥化合物”互換使用。本發(fā)明的特別優(yōu)勢為具有?；┒吮交u基或第二羥基或兩者的扎莫特羅的前藥化合物，其中酰基的R₁或R₂基團對于兩者可共總為5-30、優(yōu)選9或10-30個碳。下文更詳細地進一步定義R₁和R₂兩者。本文所用術(shù)語“衍生化”意指從相應的β₁-ADR激動劑化合物形成含有R₁或R₂基團的前藥β₁-ADR化合物。

鹽：意指藥學上可接受的鹽，包括有機酸和無機酸加成鹽兩者。有機酸鹽的實例包括例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、草酸鹽、富馬酸鹽、半富馬酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、苯甲酸鹽和己二酸鹽。無機酸鹽的實例包括例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽。

clogP：意指計算logP，差異溶解度更確切地說作為辛醇/水分配系數(shù)的疏水性的度量?？偟膩碚f，logP的負值，例如-0.50，表明生物吸收差和生物利用度差。logP的正值，例如1.00，表明生物吸收更好和生物利用度更好。本發(fā)明具體公開了相對于先導或母體β₁-ADR激動劑化合物親脂性提高、通常其衍生物或前藥的clogP值大于先導或母體化合物的至少+ 0.50、優(yōu)選至少+ 1.00 logP值的β₁-ADR激動劑化合物衍生物或前藥的制備和用途。更優(yōu)選，clogP差異為至少+ 1.50 logP值。clogP值越高越好。

本發(fā)明提供β₁-ADR激動劑化合物及其前藥或衍生物。β₁-ADR激動劑化合物的具體實例包括例如異丙腎上腺素、多巴酚丁胺、去甲腎上腺素、多巴胺和扎莫特羅。這些β₁-ADR激動劑化合物的各種前藥包括以下的化合物，例如其中這些激動劑分子的末端苯基羥基或第二羥基被衍生化以分別形成R₁或R₂基團，所述基團可為例如-O-(C=O)-低級烷基、-O-(C=O)-氨基烷基或-O-(C=O)-苯基或–O-(C=O)-取代的苯基。在這些激動劑分子還具有第二羥基的情況下，這些基團可衍生化以形成R₂基團，其中R₂可如R₁定義。對于R₁和R₂兩者，低級烷基意指可以是線性或支鏈烷基的C₁-C₆烷基。氨基烷基意指–NH-烷基，其中烷基意指C₁-C₆線性或支鏈烷基。苯基是自定義的，而取代的苯基意指一個或多個低級烷基、鹵素或羥基取代的苯基。在此，低級烷基意指可以是線性或支鏈的C₁-C₆烷基。再次注意，在本說明書中術(shù)語“衍生物”與“前藥”互換使用，因為衍生化是用于提高母體β₁-ADR激動劑化合物的親脂性的目的。術(shù)語“母體”僅意指衍生化前的β₁-ADR激動劑化合物或“先導化合物”。特別的優(yōu)勢是具有通式R-(C=O)-O-的?；┒吮交u基的扎莫特羅的前藥化合物，其中R是親脂性基團，提高整個前藥分子相對于扎莫特羅的親脂性，且其中R具有為線性、支鏈或環(huán)狀或其組合的5-30個碳原子，其是未取代的或被1-4個低級烷基、低級烷氧基、羥基或鹵素任選取代，且其中環(huán)狀基團為含有0、1或2個雜原子的5-或6-元環(huán)，所述雜原子為-O-或-N-或兩者，所述環(huán)狀基團是飽和的或不飽和的。5-或6-元環(huán)可以是例如吡咯、呋喃、咪唑烷(imidizoline)、咪唑、吡唑烷、吡唑、吡啶或吡喃，其如所述可以是未取代的或被1-4個低級烷基、低級烷氧基、羥基或鹵素任選取代。鹵素可以是氯或氟，但是優(yōu)選為氟。在本文的所有結(jié)構(gòu)定義和式中，術(shù)語“低級”意指C₁-C₆，例如低級烷基或低級烷氧基。在前藥化合物內(nèi)的鍵合的環(huán)，吡咯、呋喃、咪唑烷、咪唑、吡唑烷、吡唑、吡啶和吡喃當然是吡咯基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、吡唑烷基、吡唑基、吡啶基和吡喃基。

為了方便，用于形成β₁-ADR激動劑化合物的前藥的R₁和R₂基團在本申請中一致性地命名，使得R₁是指與末端苯基羥基連接的可水解基團，R₂是指與第二羥基連接的可水解基團，如圖17下排結(jié)構(gòu)所示。

KO：意指敲除(小鼠)。

短期記憶：意指來自短期儲存的初級記憶或主動記憶，有時亦稱為工作記憶。

長期記憶：意指持續(xù)存儲信息，其當需要時可被調(diào)出成為工作記憶。在人中，長期記憶被分為陳述性記憶和程序性記憶，所述陳述性記憶包括意識中可獲得的所有記憶，而所述程序性記憶包括身體運動和如何在環(huán)境中使用物體的記憶。陳述性記憶可被進一步分成對具體事件的事件記憶和對于有關(guān)世界知識的語義記憶。

社交記憶：意指從不論來源于短期還是長期記憶的工作記憶中提取對名稱、面容或物理位置的識別的能力。

生物可逆性：意指藥理活性劑的前藥或衍生物可通過體內(nèi)轉(zhuǎn)化(例如通過水解)容易地轉(zhuǎn)化為原有的活性化合物，所述轉(zhuǎn)化可以是通過酶或通過pH/氧化還原。本文所用術(shù)語生物可逆的和/或可水解的沒有一種機制超過另一種的含義。

孤獨癥(Autism或Autistic)譜系障礙(ASD)：意指一類可引起明顯的社交、交流和行為挑戰(zhàn)的發(fā)育失能。ASD以不同的方式(例如癥狀的性質(zhì)、癥狀何時開始和癥狀的嚴重程度)影響不同的人。例如，ASD癥狀可包括不同測量的智力(IQ)，僅僅社交和口頭交流能力差以及重復行為的表現(xiàn)。還可有不同程度的感官敏感性。

ANOVA：意指方差分析。

ADD：意指注意缺陷障礙。

ADHD：意指注意缺陷障礙伴多動。

ADME：意指吸收、分布、代謝和分泌。

去甲腎上腺素(NA)系統(tǒng)和β₁-ADR化合物及其親脂性衍生物

本發(fā)明至少部分基于以下認識：NA缺乏與AD的多個病理學特征(例如突觸功能障礙)以及認知癥狀有關(guān)。本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)：可增加NA傳遞的藥理學調(diào)節(jié)可提供例如比現(xiàn)行方法更全面的治療AD的方法。圖9說明本文公開的方法，其中β₁-ADR的活化提供AD疾病改善作用以及恢復認知功能兩者。

具體地說，在圖9中，經(jīng)由β₁-ADR恢復NA信號傳導，通過提高在中間神經(jīng)元中調(diào)節(jié)去極化和認知功能所需神經(jīng)傳遞的下游調(diào)節(jié)所必需的cAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化和腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的水平，來拯救與AD有關(guān)的認知減退。β₁-ADR的活化通過經(jīng)由其對小膠質(zhì)細胞活性的作用賦予針對Aβ病理學的神經(jīng)保護潛力，來提供額外益處。此外，cAMP經(jīng)由β₁-ADR活化的增加通過抑制細胞因子腫瘤壞死因子-α (TNFα)的釋放，來改善細胞和突觸丟失以及可能的神經(jīng)炎癥。

另外，除使用β₁-ADR作為治療AD的治療靶標以外，本發(fā)明還明確公開了靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)中β₁-ADR的信號傳導級聯(lián)下游同時保持對心臟功能的最小有害外周作用。圖10顯示用于評價按照本發(fā)明制備的前藥的詳細示意圖。示意圖中所示程序允許同時鑒定并進一步開發(fā)因親脂性改進引起的腦分布改善和具有最小外周作用的β₁-ADR激動劑衍生物。這還供制備β₁-ADR化合物的合成的生物可逆的(即可水解的)衍生物的文庫或目錄。本文所用術(shù)語“生物可逆的”意指體內(nèi)可水解以從該β₁-ADR激動劑化合物的前藥釋放出母體β₁-ADR化合物。

對合成的前藥進行一系列試驗，例如體外吸收、分布、代謝和分泌(統(tǒng)稱ADME試驗)，并根據(jù)ADME性質(zhì)開發(fā)結(jié)構(gòu)性能關(guān)系(SPR)。這些研究或評價以重復方式進行，所得SPR用來指導設(shè)計其它前藥化合物和甚至在其前藥的結(jié)合和形成中的新的合成β₁-ADR激動劑化合物。對顯示有前景的ADME性質(zhì)的衍生化β₁-ADR化合物繼續(xù)進行體內(nèi)生物分布和藥代動力學研究。在AD臨床前模型中測試了具有最有力的ADME和藥代動力學(PK)性質(zhì)的兩種化合物。針對進行這些試驗的各衍生β₁-ADR激動劑化合物，制作含有有關(guān)獲自臨床前動物模型研究的體外和體內(nèi)PK性質(zhì)兩者以及體內(nèi)功效的數(shù)據(jù)的目標產(chǎn)品概況(Target product profile, TPP)。

另外，已知的β₁-ADR激動劑化合物或?qū)Ζ?sub>1-ADR顯示激動作用的其它配體可獲自文獻和進行上述試驗的衍生化。還針對這些衍生物制作TPP以形成全面的目錄或文庫。

扎莫特羅

雖然任何β₁-ADR激動劑化合物或?qū)Ζ?sub>1-ADR顯示激動作用的配體可用于衍生化，但是發(fā)現(xiàn)扎莫特羅顯示幾種用于治療AD的特別的藥理學性質(zhì)。第一，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)扎莫特羅選擇性地激活cAMP級聯(lián)，同時只顯示對β-抑制蛋白信號傳導途徑的最小活性。圖8說明扎莫特羅的這種藥理學。值得注意地，扎莫特羅，作為β₁-ADR的激動劑，刺激cAMP信號傳導以誘導激動劑異丙腎上腺素的最大反應的約60% (A)。另一方面，與無區(qū)別的異丙腎上腺素(其激活cAMP和β-抑制蛋白途徑兩者)相反，扎莫特羅對β-抑制蛋白途徑?jīng)]有作用(B)。β-抑制蛋白是調(diào)節(jié)β2-ADR的信號傳導的蛋白質(zhì)家族，其在調(diào)節(jié)心臟功能中具有作用。

扎莫特羅的功能選擇性(例如缺乏β-抑制蛋白信號傳導活性)具有第2個重要意義，即連續(xù)和持久的功效。更準確地說，激動劑療法的治療應用常常受限于耐受性和快速耐受的發(fā)生，這由β-抑制蛋白信號傳導依賴性受體脫敏介導。實際上，使用大鼠腦室的動物研究表明長期給予扎莫特羅不誘導β₁-ADR密度或腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)效率的降低。

扎莫特羅的第3個重要性質(zhì)是相對于密切相關(guān)的受體β₂-ADR對β₁-ADR的亞型選擇性。β₁-ADR與腺苷酸環(huán)化酶普通偶聯(lián)，并且其活化導致CREB磷酸化水平提高。因此，可預期β₁-ADR的活化拯救CREB依賴性記憶缺陷。因此，尤其可預期扎莫特羅的亞型選擇性通過β₁-ADR提高認知功能，同時避免與β₂-ADR相互作用。

扎莫特羅的第4個重要性質(zhì)是它越過BBB并達到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，如本發(fā)明人所表明的，其中它誘導CREB磷酸化的增加，并介導促認知作用。參見下表1和圖9。

表1. 小鼠中在s. c.注射3 mg/kg扎莫特羅后血漿和腦樣品中扎莫特羅濃度的分析

圖8說明小鼠腦中扎莫特羅對pCREB表達的作用。小鼠中s.c.注射3 mg/kg扎莫特羅在15分鐘后在腦中誘導pCREB的顯著增加。*** p < 0.001。

以上所有數(shù)據(jù)表明，扎莫特羅例如對于AD的治療具有重大的治療價值。因此，例如提高其藥代動力學性質(zhì)和CNS可用性的扎莫特羅的衍生化得到甚至更有效的化合物用于AD的治療。

最后，扎莫特羅的額外優(yōu)勢是人對其特別耐受而又無任何重大的副作用。

用扎莫特羅的實驗：

本發(fā)明人之前表明，注射選擇性β₁-ADR拮抗劑倍他洛爾損害野生型(WT)動物的社交和背景記憶。值得注意地，在用單劑量的1 mg/kg倍他洛爾治療的C57Bl/6小鼠中，社交識別和背景記憶變得受損。通過實驗觀察到，β₁-ADR KO小鼠的社交識別受損，而其對照同胞鼠仔或β₂-ADR KO小鼠的行為正常** p < 0.01；*** p < 0.0001，相對于機會水平(零)。

除社交和背景記憶之外，Y型迷宮試驗中用倍他洛爾的研究也表明β₁-ADR在空間記憶中的重要作用。另外，β₁-ADR KO小鼠顯示社交和背景記憶受損，而β₂-ADR KO小鼠具有正常的記憶功能。

總的來說，這些結(jié)果表明β₁-ADR在不同形式的認知功能中的重要作用，并且β₁-ADR信號傳導的恢復提供治療策略以改善AD中的認知功能。

此外，本發(fā)明人表明，急性皮下(s. c.)注射3 mg/kg扎莫特羅拯救AD的Thy1-APP ^{Lond/Swe +}小鼠模型的工作記憶和社交識別缺陷。重要的是，在Thy1-APP ^{Lond/Swe +}小鼠的特定腦區(qū)(例如內(nèi)側(cè)杏仁核)觀察到增量調(diào)節(jié)的β₁-ADR表達。β₁-ADR表達的增加表明NA的突觸后表達保持功能性，盡管LC變性和NA信號傳導受損可用β₁-ADR激動劑及其ADME和生物利用度改進的親脂性衍生物來恢復。在AD的5xFAD小鼠模型中，還觀察到慢性口服給予扎莫特羅對認知損害的作用。值得注意地，在3個月內(nèi)6 mg/kg扎莫特羅的每日口服劑量拯救在5xFAD小鼠觀察到的陳述性記憶和空間記憶缺陷。

無產(chǎn)生于β₁-ADR活化的副作用：

在初步研究中，心臟組織的組織學檢查顯示用扎莫特羅慢性治療(3 mg/kg s. c.持續(xù)3個月)不誘導心臟纖維化。同樣，用扎莫特羅治療的野生型小鼠(3 mg/kg s. c.持續(xù)3個月)在通過血壓(BP)、心率(HR)、射血分數(shù)(EF)、縮短分數(shù)(FS)和心臟重量:體重比測量的心臟功能方面沒發(fā)生病理學變化。此外，患有心血衰竭的人的臨床研究表明用扎莫特羅慢性治療(200 mg一日兩次持續(xù)2-12個月)的功效而無任何明顯的副作用。這表明了用扎莫特羅慢性治療例如AD將不與對人心臟功能的不當副作用有關(guān)。

將通過某些非限制性實施例對本發(fā)明作進一步說明：

實施例：

材料與方法

動物。使用成年C57Bl/6小鼠(Jackson Laboratory，#000664)、β₂-ADR (敲除) KO小鼠(由RG Giffard博士提供)、β₁-ADR KO小鼠(由D. Bernstein博士提供)及其年齡匹配的對照(FVB/NJ小鼠，來自Jackson Laboratory，#001800)和AD的Thy1-hAPP^Lond/Swe+模型小鼠(APP)。實驗遵循斯坦福大學機構(gòu)動物管理與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of Stanford University)批準的方案，并且根據(jù)國立研究院實驗室動物管理與使用健康指導(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)進行。

行為測試。在2個不同的試驗中測試了社交識別：由Nadler等人研發(fā)的3室社交試驗和由Macbeth等人研發(fā)的養(yǎng)育籠內(nèi)社交辨別任務(in-home cage social discrimination task)。為了區(qū)分社交識別和非社交氣味/物體的識別，采用非社交氣味辨別試驗(嗅覺習慣/習慣解除和嗅覺識別試驗)和物體識別試驗。

藥物治療。使用β₁-ADR部分激動劑扎莫特羅、β₁-ADR拮抗劑倍他洛爾和蛋白質(zhì)激酶A (PKA)抑制劑肉豆蔻?；疨KI 14-22酰胺(Tocris bioscience，Minneapolis，MN，USA)。皮下注射扎莫特羅(3mg/kg)。皮下(1mg/kg)或在MeA中(30納摩爾/側(cè))注射倍他洛爾。將PKI 14-22酰胺溶于30%乙腈中，并在MeA (2.75納摩爾/側(cè))中注射。

分子分析。采用免疫組織化學以評價c-Fos、酪氨酸羥化酶(TH)和β₁-ADR。按照小鼠腦圖集(Mouse Brain Atlas)在不同腦區(qū)進行染色細胞的定量分析。采用無偏體視學方法，實現(xiàn)細胞計數(shù)。應用StereoInvestigator軟件(MBF Bioscience,Williston，VT，USA)，用光學篩分儀方法確定陽性細胞的總數(shù)。確定計數(shù)標準以得到平均誤差系數(shù)≤ 0.10。通過蛋白質(zhì)印跡進行pCREB的分析。

統(tǒng)計學。應用軟件Prism 5.01 (GraphPad Software Inc.，CA，USA)分析數(shù)據(jù)。對于行為和藥理學測試，使用最少5只動物/組，對于免疫組織化學和蛋白質(zhì)印跡，使用3-4只動物/組。

結(jié)果

阿爾茨海默病小鼠模型中社交識別和β₁-去甲腎上腺素能神經(jīng)傳遞受損

在嚙齒動物中，可通過與之前相遇的同種相比較多時間量探查未曾相遇的同種來測量社交識別。我們首先研究了APP小鼠識別之前相遇的同種的能力。雖然它們顯示對陌生入侵者的偏愛超過空杯(圖1A)，但它們無法顯示對新的入侵者的偏愛超過熟悉的入侵者，表明有社交識別缺陷(圖1B)。這種缺陷與在嗅覺能力或分辨非社交氣味中的缺陷無關(guān)(圖1C和1D)。

我們?nèi)缓鬁y試了β₁-ADR表達的異常是否存在于APP小鼠中，并表明與其對照同胞鼠仔相比，在APP小鼠的MeA中顯著較大數(shù)目的β₁-ADR表達細胞。我們首次表明，該AD的APP小鼠模型再現(xiàn)了AD特有的一個重要癥狀，無法識別之前相遇的個體以及MeA (已知對社交記憶是重要的區(qū)域)中的β₁-去甲腎上腺素能回路異常。

β₁-ADR及其下游信號傳導對社交暗示的學習是必需的

我們?nèi)缓笳{(diào)查了β₁-ADR在社交識別中的潛在貢獻以確定APP小鼠中β₁-去甲腎上腺素能神經(jīng)傳遞異常是否可能是造成其社交記憶缺陷的原因。我們評價了在急性皮下注射不同劑量的選擇性β₁-ADR拮抗劑倍他洛爾(0.01、0.1和1mg/kg)后C57Bl/6小鼠識別之前相遇的同種的能力。雖然倍他洛爾不影響對陌生入侵者的偏愛超過空杯，但是0.1和1mg/kg倍他洛爾導致小鼠無法辨別新的和熟悉的同種而不影響探查兩個同種所花費的總時間(單因素ANOVA p=0.153) (圖2A和2B)。這個研究結(jié)果在同樣評價社交識別的不同行為范例(即3室試驗)中再現(xiàn)。我們之后證實了阻斷β₁-ADR影響社交暗示的識別，而不影響通常的嗅覺能力和分辨力(圖2C和2D)。在氣味習慣/習慣解除范例中證實了這些結(jié)果。最后，我們觀察到記憶熟悉物體能力在注射倍他洛爾或溶媒的小鼠中無不同。

這些結(jié)果表明，β₁-ADR活化對小鼠的社交學習和識別是必需的。因此我們提出在APP小鼠中觀察到的β₁-ADR表達水平的異常是造成其社交識別的缺陷的原因，并且恢復APP小鼠中β₁-ADR的功能可拯救社交識別缺陷。在社交學習前給APP小鼠注射β₁-ADR部分激動劑扎莫特羅拯救之前觀察到的缺陷(圖2E和2F)。

我們的藥理學數(shù)據(jù)表明，β₁-ADR是社交識別所必需的。然而，對特異性受體的藥物選擇性常常是有爭議的。為了證實倍他洛爾特異性靶向β₁-ADR和社交識別中的β₁-ADR (相對于β₂-ADR)，我們測試了在β₁-ADR KO和β₂-ADR KO小鼠兩者及其FVB對照中的社交識別能力。所有小鼠顯示對有陌生入侵者的杯的偏愛超過空杯。還有，雖然β₁-ADR KO小鼠的社交識別受損(圖3A)，但β₂-ADR KO小鼠正常地執(zhí)行任務(圖3B)。另外，在社交學習之前在β₂-ADR KO小鼠中注射倍他洛爾導致社交識別受損(圖3B)。這表明了由倍他洛爾誘導的社交識別缺陷依賴于β₁-ADR而非β₂-ADR，且β₁-ADR是社交識別所必需的。

我們接下來評價了β₁-ADR的活化是否在社交暗示習得(社交學習)期間或在該信息提取期間是重要的。我們在試驗的學習階段前20分鐘或在試驗的提取階段前30分鐘注射倍他洛爾。學習階段期間β₁-ADR的抑制導致社交識別缺陷(圖3C)，而試驗的提取階段β₁-ADR的抑制不損害社交識別(圖3D)。我們之后通過在長期社交識別試驗的學習階段之前注射倍他洛爾，證實了β₁-ADR對社交暗示的學習的重要性。在學習前注射倍他洛爾且24小時后測試的小鼠顯示社交識別受損，而溶媒注射小鼠具有不受影響的社交識別(圖3E)?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)突出了β₁-ADR對社交暗示的學習的重要性，所述社交暗示的學習是社交識別所必需的。

內(nèi)側(cè)杏仁核中的β₁-ADR是社交識別所必需的

已鑒定出參與社交識別的腦區(qū)。它們中有側(cè)間隔、額葉前皮質(zhì)和MeA。我們首先證實了MeA對社交識別的重要性。我們使用c-Fos作為神經(jīng)元活性的標志物，并將其在社交學習后在C57Bl/6小鼠組中的表達與在社交學習和社交識別兩者后的小鼠組進行了比較。無偏體視學計數(shù)顯示在社交識別后在MeA中較高的c-Fos表達水平但在基底外側(cè)杏仁核中無，這證實了MeA對于社交暗示的加工的重要性。我們之后觀察到在注射倍他洛爾后，MeA中的c-Fos表達在社交識別后顯著降低(相對于溶媒注射) (圖4A)。這種降低對在社交識別期間激活的區(qū)域(例如MeA)是特異性的，因為我們在丘腦室旁核中未觀察到這種作用，所述丘腦室旁核中β₁-ADR表達差，且不被社交識別優(yōu)先激活。我們還觀察到被倍他洛爾誘導的MeA中較低的c-Fos表達與β₁-ADR表達細胞中較低的c-Fos表達有關(guān)：雙重免疫染色顯示與溶媒注射小鼠相比，表達c-Fos的β₁-ADR細胞的百分比在倍他洛爾注射小鼠中顯著降低(圖4B)。

為了進一步證實MeA中β₁-ADR對社交識別的作用，在社交學習之前將倍他洛爾直接注射到C57Bl/6小鼠的MeA中(圖4C)。在MeA中用倍他洛爾治療的小鼠不能夠識別熟悉的同種(圖4D)。我們的結(jié)果表明MeA是對社交識別的重要結(jié)構(gòu)，MeA中β₁-ADR的活化是小鼠社交學習和識別中所必需的。

β₁-ADR是與Gs異三聚體G蛋白締合的G蛋白偶聯(lián)受體。因此，β₁-ADR下游的信號傳導途徑之一包括導致cAMP反應元件結(jié)合(CREB)磷酸化的cAMP/PKA級聯(lián)的活化。我們因此分析了通過倍他洛爾阻斷β₁-ADR下游的途徑是否損害社交學習和識別。我們首先在社交學習之前在C57Bl/6小鼠的MeA中注射PKA抑制劑以確定PKA/CREB/pCREB級聯(lián)的阻斷是否影響社交識別。我們觀察到在社交學習期間阻斷PKA損害小鼠識別熟悉的同種的能力(圖4E)，而不影響對陌生入侵者的偏愛超過空杯。這些結(jié)果表明，PKA活性是社交學習和識別必需的?？傊覀兊慕Y(jié)果表明，通過倍他洛爾或PKA抑制劑抑制MeA中的β₁-ADR信號傳導途徑導致社交識別缺陷。

β₁-ADR調(diào)節(jié)CREB磷酸化

因為PKA的一個眾所周知的下游靶標是CREB磷酸化，我們旨在評價pCREB在社交學習中的可能作用；我們進行了一系列實驗：我們首先觀察到在C57Bl/6小鼠中社交暗示的學習誘導MeA中pCREB的強增加，這在社交學習開始后5分鐘達到峰值，在10分鐘之后返回基線(圖5A)。我們?nèi)缓笳{(diào)查了在社交學習的情況下β₁-ADR的藥理學調(diào)節(jié)是否影響MeA中的CREB磷酸化。我們表明，在社交學習之前通過急性全身注射1mg/kg倍他洛爾阻斷β₁-ADR抑制在社交學習后pCREB的誘導(圖5B)，而用3mg/kg部分激動劑扎莫特羅對β₁-ADR的活化增加pCREB (圖5C)。我們用本發(fā)明的數(shù)據(jù)表明β₁-ADR下游的PKA/pCREB級聯(lián)的活化介導社交學習和識別。

為了評價APP小鼠中扎莫特羅對社交記憶的拯救作用是否與pCREB的水平改進有關(guān)，我們測量了在注射扎莫特羅和社交學習后在APP小鼠及其WT同胞仔鼠的MeA中的pCREB水平。如之前在C57Bl/6小鼠所觀察到一樣(圖5C)，在WT動物中，扎莫特羅在社交學習后誘導pCREB的增加。然而，在APP小鼠中沒有明顯增加。據(jù)報告在阿爾茨海默病中，幾種磷酸化蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)先位于胞質(zhì)(相對于核)，因此不足于誘導對學習和記憶是重要的基因表達。我們因此測定了APP小鼠核中的pCREB (有效pCREB)的水平是否受扎莫特羅影響。我們觀察到扎莫特羅增加APP小鼠中MeA核流分中的pCREB水平(圖5D)。這表明了在AD小鼠模型中使用部分激動劑扎莫特羅的β₁-ADR的活化導致社交識別改善，這與MeA中核pCREB的水平提高有關(guān)。

許多神經(jīng)障礙(例如AD)的特征在于社交記憶和識別的缺陷。這種具體癥狀的起因尚未充分確定，因此，目前不存在拯救這種致殘缺陷的治療。我們現(xiàn)已鑒定出參與社交學習和識別的分子途徑，并且表明AD模型中該級聯(lián)的病理學變化。我們發(fā)現(xiàn)Thy1-hAPP^Lond/Swe+小鼠MeA中β₁-去甲腎上腺素能系統(tǒng)的若干異常。具體地說，我們鑒定出β₁-ADR及其下游PKA/pCREB信號傳導級聯(lián)為社交學習和識別的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。此外，我們表明β₁-ADR的選擇性部分激動劑可恢復這種選擇性缺陷，突出顯示了用于改善或恢復AD中的社交功能的可能方法。

我們報告了Thy1-hAPP^Lond/Swe+小鼠顯示社交識別缺陷，盡管表明對非社交嗅覺暗示的正常識別。即使在嗅球的水平下，去甲腎上腺素表明通過提高對嗅覺刺激物的選擇性注意而對中立和社交嗅覺信息的處理是重要的，我們的結(jié)果表明嗅球下游的2個獨立的途徑調(diào)節(jié)用于社交和非社交暗示的記憶。我們首次顯示在學習社交或中立嗅覺暗示之前阻斷β₁-ADR導致社交識別受損而不影響非社交嗅覺識別。另外，我們的結(jié)果表明，β₁-ADR途徑是社交暗示的學習必需的，但對于其回憶則不是。

已知MeA參與對在人和非人哺乳動物兩者中調(diào)節(jié)社交和性行為是必需的感覺信息處理。雖然許多嚙齒動物研究表明MeA對社交識別的重要作用，但我們的結(jié)果證實MeA中β₁-ADR去甲腎上腺素能神經(jīng)傳遞對社交識別的重要性，并且表明在Thy1-hAPP^Lond/Swe+小鼠的該腦區(qū)中這種受體/信號傳導級聯(lián)的異常表達可能是造成其社交識別缺陷的原因。

我們的數(shù)據(jù)表明，MeA中的β₁-ADR通過激活PKA/CREB磷酸化-信號傳導級聯(lián)而調(diào)節(jié)社交學習。實際上，在社交學習之前MeA中PKA的藥理學抑制損害社交識別。我們還證實用誘導社交識別缺陷的選擇性拮抗劑阻斷β₁-ADR導致MeA中CREB磷酸化的嚴重降低。這些結(jié)果表明小鼠中PKA/pCREB級聯(lián)與社交學習的直接關(guān)系。一般認為pCREB對長期記憶而非短期記憶是必需的，因為其對長期記憶所需要的基因表達和蛋白質(zhì)合成的已知作用。最近，Suzuki等人證實了導致較高BDNF表達的CREB活性的增量調(diào)節(jié)提高小鼠的社交和非社交短期記憶。在此，我們提出作為β₁-ADR活化的結(jié)果而發(fā)生類似現(xiàn)象。社交學習誘導激活MeA中的β₁-ADR的去甲腎上腺素的釋放，導致了cAMP/PKA/pCREB信號傳導級聯(lián)的活化。我們表明β₁-ADR及其下游信號傳導的活化是社交暗示學習必需的。

雖然用β₁-ADR部分激動劑扎莫特羅治療拯救APP小鼠的社交識別缺陷，但它不影響其總的pCREB水平，但核pCREB的水平顯著提高。因此我們提出，更合適通過沒有不當?shù)暮藀CREB水平來解釋APP小鼠中所觀察到的社交識別缺陷。在細胞系統(tǒng)中已表明，Aβ引起高水平的pCREB和缺乏核易位。因此我們提出用扎莫特羅激活β₁-ADR影響APP小鼠MeA中pCREB的核水平，并且激活允許處理進一步社交識別所必需的社交暗示的機制。

我們的研究結(jié)果表明，β₁-ADR可用作改善AD的社交記憶和其它認知缺陷的治療靶標。然而，由于去甲腎上腺素能系統(tǒng)明顯參與心血管功能，因此當鑒定用于本文所公開的療法的其它化合物時，可采用安全和轉(zhuǎn)化研究以確保該方法的安全和功效。其它化合物的目標是開發(fā)具有最小全身活性和高CNS穿透力的分子以提高腎上腺素能系統(tǒng)積極的CNS作用同時使心血管作用降到最低。

用于AD、DS、ADD、ADHD和孤獨癥的療法的β₁-ADR前藥和衍生物的鑒定和評價：

鑒于在給予本發(fā)明的化合物和組合物時社交記憶以及其它認知缺陷的改善，明確考慮了可使用這些化合物和組合物以增強顯示AD、DS、ADD、ADHD和孤獨癥的人的社交記憶和其它認知特質(zhì)。鑒于已知NA病理學在人類患者和小鼠模型兩者中與AD的多個病理學特征有關(guān)，本發(fā)明的一個重要基礎(chǔ)是認識到增加NA傳遞可提供比使用靶向單一信號傳導途徑的化合物的常規(guī)方法更廣泛和更有效的治療方法。具體地說，本發(fā)明需要通過提高在中間神經(jīng)元中調(diào)節(jié)去極化和認知功能所需神經(jīng)傳遞的下游調(diào)節(jié)所必需的cAMP反應元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化和腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的水平，恢復經(jīng)由β₁-ADR的激動性刺激恢復NA信號傳導以拯救與AD有關(guān)的認知減退。

因此，本發(fā)明人在此提供用于治療AD、DS、ADD、ADHD和孤獨癥的化合物和組合物兩者，以及治療這些疾病和改善其癥狀的方法。

選擇本文公開的示例性化合物以外的用于治療AD、DS、ADD和ADHD和孤獨癥的其它化合物的準則

本發(fā)明還提供用于鑒定對心臟功能顯示最小或不存在外周作用的β₁-ADR激動劑(部分或完全)及其前藥的過程和準則。整體過程描述于圖10。該過程的另一個總體目標是鑒定具有改進的腦分布和最小外周作用的β₁-ADR激動劑(部分或完全)及其前藥，更具體地講扎莫特羅前藥。該程序的一個結(jié)果是產(chǎn)生是生物可逆的β₁-ADR激動劑前藥(具體地講為扎莫特羅前藥)的擴大文庫。采用下列程序以生產(chǎn)是生物可逆的(即體內(nèi)可水解的)和甚至新的合成β₁-ADR激動劑化合物的β₁-ADR激動劑前藥的擴大文庫。

1). 步驟1：根據(jù)估算的有利的clogP值選擇候選β₁-ADR激動劑前藥化合物，并對化合物進行一系列體外吸收、分布、代謝和分泌(ADME)試驗。針對該最初測試選出的化合物可獨創(chuàng)地設(shè)計或可產(chǎn)生于相關(guān)文獻的檢索。例如，使用已知的?；磻苽渫ǔＨ鐖D17-19所示的扎莫特羅前藥，例如?；亓_化合物?？赏ㄟ^對映有擇合成制備作為外消旋體(外消旋混合物)或作為(R)-和(S)-對映異構(gòu)體的扎莫特羅前藥。

2) 步驟2：根據(jù)其具有通過已知方法測定的吸收、分布、代謝和分泌每一個的ADME性質(zhì)，研發(fā)受測化合物的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)關(guān)系(SPR)。

3) 步驟3：使來自步驟2的顯示有利的ADME性質(zhì)的化合物進一步進行體內(nèi)生物分布和藥代動力學(PK)研究。選出具有最有力的ADME、生物分布和PK性質(zhì)的兩種化合物用于在臨床前動物模型研究中的測試。

4) 步驟4：針對進行了步驟1-3的各化合物產(chǎn)生目標產(chǎn)品概況(TPP)，其含有來自動物模型研究的所有體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)。

5) 步驟5：然后將TPP用作策略計劃工具以指導進一步的藥物開發(fā)。

如上所述，圖10還顯示了上述5個步驟。

扎莫特羅

扎莫特羅是一種有利的和優(yōu)選的β₁-ADR先導化合物，從其中產(chǎn)生不同的前藥。為此有幾個原因。第一，本發(fā)明人獲得的結(jié)果表明扎莫特羅選擇性地激活cAMP級聯(lián)同時保持對β-抑制蛋白信號傳導途徑的最小活性。參見圖9。在β₁-ADR活化下游的信號傳導途徑中，cAMP信號傳導級聯(lián)已顯示在突觸功能、神經(jīng)傳遞和認知功能中起關(guān)鍵作用。

第二，由于經(jīng)由β₁-ADR活化的β-抑制蛋白介導的信號傳導參與各種心臟過程，因此十分有利的是，扎莫特羅可僅以對心臟功能的最小作用或影響特異性地靶向參與認知功能的信號傳導途徑。

第三，通過扎莫特羅功能性回避β-抑制蛋白信號傳導活性具有以下額外優(yōu)勢：避免了因耐受性和快速耐受的發(fā)生而對激動劑療法的局限性。具體地說，β-抑制蛋白參與受體脫敏和減量調(diào)節(jié)。激動劑療法中發(fā)生的耐受性增加由β-抑制蛋白信號傳導依賴性受體脫敏介導。這個問題通過使用扎莫特羅作為β₁-ADR先導化合物而被大大減弱。

第四，扎莫特羅鑒于其對β₁-ADR的亞型選擇性超過密切相關(guān)的受體β₂-ADR是有利的，因為β₁-ADR普遍與腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)并提高CREB磷酸化的水平。因此，β₁-ADR的活化具有拯救CREB依賴性記憶缺陷的能力。另一方面，β₂-ADR可與AC抑制性G蛋白G_i/o偶聯(lián)并對抗β₁-ADR的信號傳導和認知作用。因此，扎莫特羅作為先導化合物的亞型選擇性是重要的。扎莫特羅還穿過血腦屏障，并達到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其中誘導CREB磷酸化增加并介導促認知作用。參見上表1和圖9。因此，扎莫特羅作為用于制備具有性能提高(例如生物利用度)的多種扎莫特羅前藥的先導激動劑化合物是有利的。

化合物選擇的實例：

上述選擇程序步驟的總體目標是提供具有最大化治療有用性但具有最小全身或外周副作用的β₁-ADR前藥，具體地說為扎莫特羅前藥。下面將更詳細地描述上述一般步驟(1-5)：

步驟1：作為前藥的β₁-ADR激動劑化合物(例如扎莫特羅)的結(jié)構(gòu)類似物的設(shè)計和合成

產(chǎn)生可酶促或非酶促轉(zhuǎn)化為先導或激動劑化合物(例如扎莫特羅)的β₁-ADR激動劑化合物(例如扎莫特羅)的生物可逆衍生物的集中文庫。為了改進CNS生物利用度并提高BBB穿透能力，可采用不同的策略，并分解成單獨的研究。此外，明確認識到許多β₁-ADR化合物(像扎莫特羅)是外消旋混合物，且可如下所述解析成其對映異構(gòu)體組分并作為先導化合物單獨評價?？刹捎酶鞣N已知方法，例如氣相色譜法和逆流萃取，拆分β₁-ADR外消旋混合物。例如參見EP 0 663 897 (1997)。在備選方法中，可對映有擇地合成扎莫特羅和扎莫特羅前藥的(R)-和(S)-對映異構(gòu)體化合物兩者。另參見在下文的流程1的實施例中由本發(fā)明提供的對映有擇合成。在流程2的實施例中，本發(fā)明還提供用于合成外消旋扎莫特羅和扎莫特羅前藥的程序。這些程序可用于制備本文公開的任何前藥，不僅包括扎莫特羅的前藥，還包括其它β₁-ADR激動劑(例如去甲腎上腺素、異丙腎上腺素或多巴酚丁胺等)的前藥。

此外，在結(jié)構(gòu)類似物的制備中，通過LCMS分析反應進程，并通過HPLC純化純度小于90%的化合物。所有的產(chǎn)物化合物通過¹H和¹³C NMR表征。將經(jīng)證實的化合物溶于DMSO中，并作為50 mM DMSO溶液保存在-25℃下。

例如，研究1中，先導或激動劑化合物親脂性的改進是目標，這通過修飾先導化合物的結(jié)構(gòu)而獲得。由于扎莫特羅的吸收差、生物利用度低(高親水性，其計算的logP (clogP)值為-0.62)，因此制備親脂性改進的結(jié)構(gòu)類似物。為此，使例如酯、氨基甲酸酯和噁唑烷等酶不穩(wěn)定基團與扎莫特羅的羥基和/或氨基共價連接。圖17-19顯示扎莫特羅的具體親脂性前藥的實例。通過末端苯基羥基酰化形成的扎莫特羅的前藥是特別有利的。下面是幾個方案，說明扎莫特羅前藥的制備，而且值得注意地是扎莫特羅前藥的R-和S-對映異構(gòu)體的對映有擇合成。還描述了用于cAMP測定法的生物傳感器和方案。

扎莫特羅對映異構(gòu)體的方法和合成

cAMP測定法

對于cAMP測定法，采用GloSensor cAMP生物傳感器(Promega)，其利用含有cAMP結(jié)合基序的修飾形式的螢火蟲螢光素酶。在cAMP結(jié)合時，改良型的GloSensor cAMP生物傳感器進行構(gòu)象變化，這導致酶補充，并在螢光素酶底物反應后提供發(fā)光讀出。為了定量測定β₁-腎上腺素能受體(β-ADR)介導的反應，使用穩(wěn)定表達β₁-ADR的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。簡單地說，以2.0 x 10⁴個細胞/孔的密度將細胞接種透明的94孔培養(yǎng)板上，在補充10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中在37℃、5% CO₂下孵育。在接種后24小時，使用lipofectamine? 2000 (Invitrogen)，將細胞用pGloSensor?-20F cAMP (Promega)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的細胞保持在37℃、5% CO₂中。在48小時后，將細胞在平衡培養(yǎng)基(CO₂非依賴性培養(yǎng)基，3% GloSensor? cAMP試劑)中在37℃下孵育小時。在2小時孵育后，加入在CO₂非依賴性培養(yǎng)基中制備的試驗化合物，并使用讀板儀(FlexStation；Molecular Devices)，從板底部測量發(fā)光信號的變化20分鐘。通過計算在化合物添加前的基礎(chǔ)發(fā)光值與在化合物添加后的發(fā)光峰值之間的差異，定量功能反應。結(jié)果表示為30 uM異丙腎上腺素的百分比。

下面是幾個反應流程和相關(guān)實驗程序作為外消旋扎莫特羅及(R)-和(S)-扎莫特羅制備程序的非限制性實例。

實施例

流程1. (R)和(S)-扎莫特羅的合成

2-(嗎啉-4-甲酰氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯(10)：

在0℃下向2-氨基乙基氨基甲酸叔丁酯8 (50 g，312.09 mmol)的300 mL CH₂Cl₂溶液中加入三乙胺(94.74 g，936.3 mmol)，并滴加200 mL CH₂Cl₂中的嗎啉-4-碳酰氯9 (46.7 g，312.09 mmol)。將反應混合物加熱至室溫，并在環(huán)境溫度下攪拌過夜。反應混合物通過TLC監(jiān)測。反應混合物然后經(jīng)減壓濃縮和常規(guī)后處理。殘余物用硅膠柱(CH₂Cl₂：MeOH = 10:1)純化，得到2-(嗎啉-4-甲酰氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯10 (75g，87.9 %)，為白色固體。1H NMR與結(jié)構(gòu)一致。

N-(2-氨基乙基)嗎啉-4-甲酰胺(4)：

在0℃下，將2-(嗎啉-4-甲酰氨基)乙基氨基甲酸叔丁酯3 (75 g，274.39 mmol)的500 mL CH₂Cl₂溶液用TFA (156.0 g，1.37 mol)逐滴處理。攪拌反應混合物1.5小時。反應混合物然后經(jīng)減壓濃縮，將所得殘余物溶于CH₂Cl₂中，加入6M NaOH調(diào)節(jié)至pH 8。將這種混合物用CH₂Cl₂萃取，接著常規(guī)后處理，得到N-(2-氨基乙基)嗎啉-4-甲酰胺4 (43 g，91 %)，為黃色油狀物。1H NMR與結(jié)構(gòu)一致。將一些游離堿轉(zhuǎn)化成4-(N-β-氨基乙基氨甲酰基)嗎啉硫酸氫鹽(溶點168-169℃)。

(S)-2-((4-(芐氧基)苯氧基)甲基)氧雜環(huán)丙烷(13a)：

向4-(芐氧基)苯酚11 (50 g，249.71 mmol)和(R)-2-(氯甲基)氧雜環(huán)丙烷12a (69.31 g，749.14 mmol)在500 mL DMF中的混合物中加入CsF (113.79 g，749.14 mmol)。將反應混合物在50℃下攪拌3天。然后使所得反應混合物在水(1 L)和EtOAc (2 L)之間分配。有機層用水(每次900 mL)洗滌3次，用鹽水洗滌，然后經(jīng)Na₂SO₄干燥。有機萃取物經(jīng)減壓濃縮，并用硅膠柱(石油醚:EtOAc，4:1)純化，得到(S)-2-((4-(芐氧基)苯氧基)甲基)氧雜環(huán)丙烷13a (47 g，73.4 %)，為白色固體。1H NMR與結(jié)構(gòu)一致。

(S)-N-(2-(3-(4-(芐氧基)苯氧基)-2-羥基丙基氨基)乙基)嗎啉-4-甲酰胺(14a)：

在50℃以下在5小時內(nèi)將N-(2-氨基乙基)嗎啉-4-甲酰胺4 (30 g，104.11 mmol)在120 mL丙-2-醇中的混合物慢慢加入(S)-2-((4-(芐氧基)苯氧基)甲基)氧雜環(huán)丙烷13a (19.72 g，156.66 mmol)的230 mL丙-2-醇溶液中。然后使反應混合物冷卻至室溫，并用EtOAc充分萃取。有機層用水(300 mL)、鹽水洗滌，然后經(jīng)Na₂SO₄干燥。EtOc萃取物經(jīng)減壓濃縮，用硅膠柱(CH₂Cl₂：MeOH，10:1)純化，得到(S)-N-(2-(3-(4-(芐氧基)苯氧基)-2-羥基丙基氨基)乙基)嗎啉-4-甲酰胺14a (20.8 g，63%)，為白色固體。1H NMR與結(jié)構(gòu)一致。

(S)-扎莫特羅(7a)：

向在含有2mL乙酸的200mL EtOH中的(S)-N-(2-(3-(4-(芐氧基)苯氧基)-2-羥基丙基氨基)乙基)嗎啉-4-甲酰胺14a (20 g，46.56 mmol)的混合物中加入Pd(OH)₂/C (5g)。以55 psi對所得反應混合物進行氫化過夜。通過過濾除去催化劑，濾液經(jīng)減壓濃縮。將殘余物溶于EtOH中，并用富馬酸轉(zhuǎn)化成半富馬酸鹽。半富馬酸鹽用EtOH重結(jié)晶，得到(S)-扎莫特羅7a (12.3 g，91.7%)，為灰白色固體。1H NMR與結(jié)構(gòu)一致。

(R)-2-((4-(芐氧基)苯氧基)甲基)氧雜環(huán)丙烷(13b)：

這種化合物按照13a所述程序由11 (8 g，41.9 5mmol)制備，得到(R)-2-((4-(芐氧基)苯氧基)甲基)氧雜環(huán)丙烷13b (6.3 g，24.6 mmol，61%)，為白色固體。

(R)-N-(2-(3-(4-(芐氧基)苯氧基)-2-羥基丙基氨基)乙基)嗎啉-4-甲酰胺(14b)：

化合物14b按照制備14a所述程序由6.3 g (24.6 mmol)的7a和12.77 g (73.80 mmol)的4制備，得到3 g (6.98 mmol，30%)的14b。

(R)-扎莫特羅(7b)：

按照上述程序，將3 g (6.98 mmol)的14b轉(zhuǎn)化成作為半富馬酸鹽的(R)-扎莫特羅(7b)，得到2.5 g (6.8 mmol，91%)的7b，為灰白色固體。

流程2. 外消旋扎莫特羅的合成：

外消旋扎莫特羅的制備：

N-苯氧基羰基嗎啉(3)：

在20分鐘內(nèi)，將嗎啉2 (4.35 g)和氯甲酸苯酯1 (6.35 g)分別同時滴加到保持在0℃下的甲苯(10 ml)、水(5 ml)和氫氧化鈉(2 g)的攪拌混合物中。再攪拌混合物2小時，使溫度升到20℃。分離甲苯溶液，含水溶液用甲苯萃取兩次，將合并的甲苯溶液用水洗滌，干燥并減壓蒸發(fā)至干。使殘余物從石油醚(沸點60-80℃)中結(jié)晶出來，因此得到N-苯氧基羰基嗎啉(3)，熔點46.5-47.5℃。

4-(N-β氨基乙基氨甲?；?嗎啉硫酸氫鹽(4)：

將上述化合物3 (11 g)和乙二胺(27.8 g)的混合物在實驗室溫度下攪拌3天，通過減壓蒸發(fā)除去過量的乙二胺。將殘余物溶于甲醇中，使溶液冷卻至5℃，加入濃硫酸直到溶液的pH為2。加入助濾劑(硅藻土，10 g)，攪拌混合物1小時，然后過濾。濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)至干，將殘余物用乙酸乙酯攪拌。混合物經(jīng)過濾，由此得到作為固體的殘余物4-(N-β-氨基乙基氨甲?；?嗎啉硫酸氫鹽(4)，熔點168-169℃。

1-對芐氧基苯氧基-3-(β-嗎啉代甲酰胺基乙基)氨基-2-丙醇鹽酸鹽(6)：

將1-對芐氧基苯氧基-2,3-環(huán)氧丙烷5 (11.5 g)在異丙醇(6 ml)中的懸浮液加入4-(N-β氨基乙基氨甲?；?嗎啉硫酸氫鹽4 (12.7 g)、氫氧化鉀(7.0 g)和異丙醇(10 ml)的攪拌混合物中，將混合物在45℃下攪拌1小時，然后減壓蒸發(fā)至干。將殘余油狀物用水攪拌，將混合物過濾，將固體殘余物溶于丙酮中。加入丙醇中的30%氯化氫溶液，直到混合物的pH小于2，將混合物過濾。

固體殘余物從水中結(jié)晶出來，由此得到1-對芐氧基苯氧基-3-(β-嗎啉代甲酰胺基乙基)氨基-2-丙醇鹽酸鹽6 (4.9 g)。

扎莫特羅(7c)：(1-對羥基苯氧基-3-β-(嗎啉代甲酰胺基)乙基-氨基-2-丙醇富馬酸氫鹽)：

在實驗室溫度和壓力下，將上述化合物6在乙醇(20 ml)和乙酸(20 ml)混合物中的溶液與30%炭載鈀催化劑(0.1 g)在氫氣氛中振蕩直到250 ml的氫吸收。將混合物過濾，濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)至干，向殘余物中加入乙醇(15 ml)中的富馬酸(1.25 g)熱溶液。將混合物保持在5℃下12小時，然后過濾，將固體殘余物用熱乙醇洗滌，然后干燥。因此得到1-對羥基苯氧基-3-β-(嗎啉代甲酰胺基)乙基-氨基-2-丙醇富馬酸氫鹽(7c)，熔點168-169℃ (具有分解)。參見美國專利4,143,140，其通過引用以其整體結(jié)合到本文。

在研究2中，靶向腦微血管中的具體載體以提高先導化合物的CNS生物利用度。這種策略具有增加藥物遞送至腦同時降低其它外周器官的暴露和毒性的目標。具體地說，使用BBB上表達的內(nèi)源載體或轉(zhuǎn)運蛋白(例如GLUT-1、LAT-1和膽堿轉(zhuǎn)運蛋白)以使扎莫特羅與例如載體或轉(zhuǎn)運蛋白的基質(zhì)綴合以將藥物特異性地遞送至腦。圖17顯示靶中的扎莫特羅的前藥的實例。

在研究3中，實施外消旋前藥化合物的對映異構(gòu)體的拆分以評價對映異構(gòu)體前藥的性質(zhì)。如上所述，可通過任何已知程序，例如氣相色譜法、逆流萃取以及手性拆分(采用使用α-甲氧基-α-三氟甲基-苯基乙酸的Mosher酯化)，實現(xiàn)將β₁-ADR外消旋先導或前藥化合物混合物拆分成對映異構(gòu)體。參見Mosher等，Journal of Organic Chemistry 34(9)：2543-2549 (1969)。

實際上，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)扎莫特羅的R-和S-對映異構(gòu)體顯示顯著不同的藥理學活性。例如，圖23證實扎莫特羅外消旋體(R,S)和(S)-對映異構(gòu)體以具有納摩爾范圍的EC50值的相似效能刺激cAMP蓄積，即(R,S)-扎莫特羅EC₅₀ = 11.6nM；而(S-)-扎莫特羅EC₅₀ = 21.2 nM。相比之下，(R)-扎莫特羅以11900 nM的EC₅₀刺激cAMP蓄積。這表明了在通過β₁-ADR刺激cAMP蓄積時，(S)-扎莫特羅的效力是(R)-扎莫特羅的約500倍。然而，本發(fā)明提供產(chǎn)生扎莫特羅前藥的(R)-和(S)-對映異構(gòu)體以及β₁-ADR激動劑(一般例如去甲腎上腺素、異丙腎上腺素和多巴酚丁胺)的這類對映異構(gòu)體的對映有擇方法。

步驟2：選擇具有有利的藥代動力學性質(zhì)和改進的CNS生物利用度的前藥化合物

在該步驟選出的化合物前藥一般必須在達到腦之前在生物介質(zhì)或組織中顯示穩(wěn)定性、顯示用于穿過BBB的跨細胞滲透的有利的物理化學性質(zhì)或具有被在BBB中表達的受體或轉(zhuǎn)運蛋白識別的用于主動轉(zhuǎn)運的結(jié)構(gòu)并且容易轉(zhuǎn)回成母體或先導化合物。C57B1/6小鼠因扎莫特羅代謝在人和小鼠之間的相似性而用于體內(nèi)PK研究。

在研究1中，評價了β₁-ADR前藥化合物(例如扎莫特羅類似物)的生物穩(wěn)定性及其體外向母體藥物的轉(zhuǎn)化。例如，將扎莫特羅類似物在37℃的振蕩器水浴中與小鼠血液、肝S9流分、腦勻漿物和等滲磷酸鹽緩沖液一起孵育。在時間零時和藥物添加后每30分鐘直到3小時取出100 μl的等分樣品。將收集的樣品立即離心，仔細地取出上清液，并保存在-80℃下直到分析。進行LC-MS/MS分析以測定例如上清液中完整前藥和扎莫特羅的量。還測定了代謝半衰期和生物轉(zhuǎn)化。

在研究2中，使用非接觸共培養(yǎng)模型評價了β₁-ADR激動劑前藥(例如扎莫特羅類似物)的CNS穿透能力，所述模型顯示BBB的許多特征，包括低的旁細胞滲透、發(fā)育良好的緊密連接和流出轉(zhuǎn)運蛋白(efflux transporter)的表達。使用具有微孔半透膜的跨孔板，將人腦微血管內(nèi)皮細胞(HBMEC)和人星形細胞(HA)共培養(yǎng)。將HBMEC接種在纖連蛋白包被的半透明膜插入物上，允許建立極化單層3-4天。所形成的內(nèi)皮細胞層把系統(tǒng)分隔成頂部區(qū)室和底外側(cè)區(qū)室，允許在模型的任一側(cè)上給予試驗化合物并采樣。將HA接種在承板的底部。在實際實驗的當天，除去全部培養(yǎng)基，將插入物重置于含有磷酸鹽緩沖鹽水的新的24孔板中。將試驗化合物溶于DMSO中，以1 μM的濃度加入供體區(qū)室。為了測定在受體側(cè)的化合物出現(xiàn)速率，在藥物添加后5、15、30、60、90和120分鐘從受體側(cè)收集樣品。為了保持室間的恒定體積，在每次取樣后，將等量的磷酸鹽緩沖鹽水加入受體室中。通過LC/MS/MS分析收集的樣品。測定了表觀頂部至基底滲透性(P_app AB)、表觀基底至頂部滲透性(P_app BA)和流出比(P_app BA/P_app AB)。測試了每種膜在多個時間點上受測的各個藥物或藥物前藥跨過最少4種不同的膜。

在研究3中，對在體外研究中顯示有前景的物理化學性質(zhì)的前藥(例如扎莫特羅類似物)繼續(xù)進行體內(nèi)PK研究。例如，將3 mg/kg單劑量的扎莫特羅靜脈內(nèi)或皮下給予C57B1/6小鼠。對于前藥，給予相當于3 mg/kg扎莫特羅的劑量。在給予藥物后3、15、30、60、120、240和360分鐘使小鼠安樂死。通過心臟穿刺抽取血液，并收集在肝素化管中。通過離心立即分離血漿，保存在-80℃下直到測定。對于組織分布研究，在給予藥物后60和120分鐘收集來自腦、心臟、腎、肝和脾的組織樣品。使用0.9%鹽水以1:2比率將組織樣品勻漿。將勻漿物保存在-80℃下直到分析。采用已知方法，通過LC-MS/MS分析血漿和組織樣品中扎莫特羅的濃度。參見Faizi等，Brain Behavior, 2012. 2(2): 第142-154頁。通過非區(qū)室方法分析血漿腦中扎莫特羅及其類似物的濃度以測定藥代動力學參數(shù)。測定前藥的PK參數(shù)，包括最大血漿濃度(C_max)、至最大濃度的時間(T_max)和曲線下面積(AUC)，并與扎莫特羅的進行比較。這些結(jié)果提供扎莫特羅類似物的BBB滲透性指標。

統(tǒng)計分析

采用體外生物穩(wěn)定性、生物轉(zhuǎn)化和BBB滲透試驗，篩選所有化合物(先導和前藥/類似物化合物)。只有顯示CNS生物利用度改進潛力的化合物進行了體內(nèi)PK研究。應用WinNonlin軟件進行PK數(shù)據(jù)分析。利用Prism 3.0程序(Graph Pad軟件)，應用Student t檢驗檢測前藥和母體或先導藥物參數(shù)間的統(tǒng)計顯著性。在p<0.05的水平下，差異被視為顯著。

步驟3：評價前藥對認知癥狀的作用

在該步驟中，使用AD的Thy1-APP^Lond/Swe+小鼠模型，所述小鼠模型表現(xiàn)為認知缺陷、成熟的β-淀粉狀蛋白斑以及突觸變性。Thy1-App^Lond/Swe+小鼠用慢性給予的扎莫特羅和至少2種前藥治療，自6月齡起使用植入皮膚下的滲透泵4個月。圖20說明下文所述研究1和2的流程。

在研究1中，測試了用扎莫特羅及其前藥的慢性治療對小鼠的認知作用的作用。該研究需要研究β₁-ADR激動劑(例如扎莫特羅)及其前藥對工作記憶(采用Y型迷宮試驗)、社交記憶(采用社交新奇性試驗)和背景記憶(采用恐懼條件反射試驗)的作用。Thy1-APP^Lond/Swe+小鼠在6月齡時顯示工作記憶(Y型迷宮試驗)、社交識別和背景記憶(恐懼條件反射試驗)受損，且是AD小鼠模型。具體地說，測試了用β₁-ADR激動劑(例如扎莫特羅)及其前藥的慢性治療以評價每種在拯救AD小鼠模型中觀察到的認知缺陷中的作用。使這些特定的小鼠和非-Tg (非轉(zhuǎn)基因)小鼠長到6個月，然后在上文和圖20兩者表明的3種行為試驗中測試。在行為測試后，處死小鼠，收獲腦組織用于研究。所得值用作基線。其它隊列的小鼠接受使用皮下滲透泵的β₁-ADR激動劑前藥，包括扎莫特羅前藥。在開始給藥后2個月(小鼠8月齡)和4個月(小鼠10月齡)，在規(guī)定的3個認知任務中測試了這些隊列。每種治療和每個時間點每基因型使用12只小鼠(n=12)。在行為測試后，處死小鼠用于下面研究2中的腦組織分析。以矢狀面切割腦，將半個腦在-80℃中冷凍備用，另一半置于4%低聚甲醛(PFA)中過夜，在蔗糖中保持在4℃下直到處理。

在研究2中，測試了用β₁-ADR激動劑(包括扎莫特羅)及其前藥慢性治療的結(jié)果以確定哪種化合物減少與AD有關(guān)的病理學變化。(AD的Thy1-App^Lond/Swe+小鼠模型表現(xiàn)出突觸結(jié)構(gòu)異常和高水平的Aβ42和斑塊數(shù))。這個研究評價了受測前藥改善AD小鼠模型中所示突觸結(jié)構(gòu)的病理學變化的程度。此外，針對突觸前囊泡蛋白、突觸小泡蛋白、突觸前膜蛋白SNPA-25 (25 kDa突觸體相關(guān)蛋白)和突觸后支架蛋白PSD-95 (突觸后密度95)進行了夾心ELISA。還評價斑塊水平的降低，并通過ELISA進行了Aβ40和Aβ42的量化。還使用抗Aβ抗體對矢狀腦切片進行了免疫組織化學試驗，并且還應用ImageJ軟件對不同腦區(qū)中的斑塊大小、數(shù)目和負荷進行了分析。

同樣，根據(jù)NA參與小膠質(zhì)細胞的遷移和吞噬活性，還測定了用不同β₁-ADR激動劑前藥(包括扎莫特羅前藥)慢性治療是否影響神經(jīng)炎性過程。

還采用免疫組織化學，用lbal-抗體和無偏體視學計數(shù)定量測定小膠質(zhì)細胞活化。通過ELISA評價了神經(jīng)炎性介質(zhì)例如TNF-α和白介素-1(IL-1)和-6(IL-6)。分析了6-8只動物/組治療。

體內(nèi)統(tǒng)計分析

由對基因型和治療兩者不知情的實驗者進行了全部體內(nèi)功效研究以確保結(jié)果的可靠性。用Shapiro-Wilk檢驗測試了所有數(shù)據(jù)的正態(tài)性，并且將合適的參數(shù)或非參數(shù)檢驗用于組間比較。應用ANOVA (參數(shù))或Kruskal-Wallis檢驗(非參數(shù))接著事后分析對所有數(shù)據(jù)進行了分析。全部分析應用Prism軟件進行。

本發(fā)明因此提供幾個發(fā)明方面，其是同一發(fā)明所有的重要組成部分。

第一，本發(fā)明提供生物可逆性β₁-ADR激動劑前藥，其在生物轉(zhuǎn)化成母體藥物后激動性地刺激β₁-ADR，并且與相應的β₁-ADR激動劑相比其具有改進的親脂性和CNS生物利用度。優(yōu)選生物可逆性β₁-ADR激動劑前藥在生物轉(zhuǎn)化成相應的β₁-ADR激動劑后，還刺激cAMP途徑超過它們刺激β-抑制蛋白途徑。具體地說，如果在生物轉(zhuǎn)化后β₁-ADR激動劑前藥化合物以范圍為10^-4-10^-10 M的相同濃度刺激β-抑制蛋白途徑不超過它們刺激cAMP途徑的50%，則是最優(yōu)選的。甚至更優(yōu)選的是β-抑制蛋白途徑是不超過20%的刺激，并且如果完全不刺激β-抑制蛋白途徑則是最優(yōu)選的。

生物可逆性β₁-ADR激動劑前藥在生物轉(zhuǎn)化后刺激下游CREB途徑也是優(yōu)選的。

可將這些化合物作為組合物配制成注射形式。例如，可將化合物溶于無菌鹽水溶液或葡萄糖鹽水溶液中。因此，可靜脈內(nèi)(i.v.)或皮下(s. c.)注射該溶液。然而，可通過任何給藥方法，例如通過吸入或通過滴鼻劑、鼻拭子或干粉吸入器或普通鼻內(nèi)遞送或甚至經(jīng)口，來給予本發(fā)明的β₁-ADR前藥。

第二，本發(fā)明提供治療人的DS的方法，所述方法需要以有效改善認知(包括社交記憶)的量給予上述一種或多種β₁-ADR激動劑前藥。

第三，本發(fā)明提供治療人的AD的方法，所述方法需要以有效改善認知(包括社交記憶)的量給予上述一種或多種β₁-ADR激動劑前藥。

第四，本發(fā)明提供治療人的孤獨癥的方法，所述方法需要以有效改善認知(包括社交記憶)的量給予上述一種或多種β₁-ADR激動劑前藥。

本發(fā)明的化合物和組合物可有利地用于治療AD、DS、ADD、ADHD和孤獨癥。所有這些疾病或病況獲益于認知(包括社交記憶)的改善。

第五，本發(fā)明還提供選擇β₁-ADR激動劑前藥用于治療應用的方法，所述方法需要：

a) 選擇相對于相應的β₁-ADR激動劑化合物clogP值提高的一種或多種前藥化合物；

b) 對從步驟a)選出的前藥化合物進行一系列ADME試驗，并測定前藥化合物的SPR；

c) 從步驟b)選擇一種或多種前藥化合物，并對所述前藥化合物進行體內(nèi)生物分布和藥代動力學(PK)評價；

d) 從步驟c)選擇一種或多種前藥化合物用于臨床前動物模型研究；和

e) 獲得從步驟a)-d)的全部中選出的各前藥化合物的TPP，用于治療應用的進一步研發(fā)。

β₁-ADR前藥的合成

總的來說，選擇clogP值至少為0、優(yōu)選>1.0的本發(fā)明的β₁-ADR前藥。然而，clogP值>2.0和更高、例如3.0-5.0的前藥是更優(yōu)選的。

通過使來自相應的β₁-ADR母體或先導化合物的取代基羥基形成酯化合物和/或由取代基胺基形成酰胺基，來制備本發(fā)明的β₁-ADR前藥。例如，扎莫特羅的酯和/或酰胺通過使扎莫特羅的羥基酯化而形成，而扎莫特羅的酰胺通過使扎莫特羅的胺基酰胺化而形成?？刹捎帽娝苤幕瘜W反應制備β₁-ADR化合物的酯和酰胺兩者以形成相應的β₁-ADR前藥。此外，β₁-ADR化合物的一個或多個羥基可被酯化，和/或β₁-ADR化合物的一個或多個胺基可被酰胺化。例如，扎莫特羅具有2個游離羥基和2個內(nèi)部游離氨基(-NH-)?？偟膩碚f，使扎莫特羅的末端苯基羥基或第二羥基或兩者酯化是有利的。酯化的更優(yōu)選的方法是?；?。

也就是說，對于任何β₁-ADR激動劑化合物，通過形成通式的酯：-O-(C=O)-R，使其上的一個或多個游離羥基衍生化。

下面顯示用于制備前藥的示例性合成流程：

流程3. (S)-扎莫特羅的苯氧基酯前藥的合成

注意：上述流程的化合物7是(S)-對映異構(gòu)體，即3-硝基苯磺酸(S)-氧雜環(huán)丙烷-2-基甲酯。

2,2-二甲基辛酸(2a)：

在氮氣氛下，在0℃下將異丁酸(2.0 g，22.7 mmol)滴加到LDA (7.6 mL)溶液中。將溶液攪拌15分鐘。在此溫度下，將1-碘己烷(4.8 g，22.7 mmol)滴加到溶液中，將所得混合物在室溫下攪拌2小時。然后將反應混合物用50 mL水處理，并用3 N HCl調(diào)節(jié)至P_H ~ 3。所得混合物用乙酸乙酯萃取幾次。有機層經(jīng)分離，干燥，減壓蒸發(fā)，得到2,2-二甲基辛酸(2.48 g，63.4%)，為無色油狀物，其無需進一步純化便可使用。

2,2-二甲基己酸(2b)：

2,2-二甲基己酸(2a)采用上述程序制備，得到(2 g，13.87 mmol，61%)，為無色油狀物。

2,2-二甲基辛酸4-(芐氧基)苯酯(5a)：

在0℃下，向2,2-二甲基辛酸2a (2.48 g，14.4 mmol)的二氯甲烷(15 mL)溶液中滴加草酰氯(3.66 g，28.8 mmol)。在氮氣氛下攪拌所得溶液2小時。所得混合物經(jīng)減壓蒸發(fā)，得到2,2-二甲基辛酰氯(3a)，為不穩(wěn)定的中間體，無需進一步純化便可使用。將三乙胺(2.91 g，28.76 mmol)滴加到上文得到的2,2-二甲基辛酰氯(3a)的溶液中，然后在0℃下用4-(芐氧基)苯酚4 (3.2 g，15.98 mmol)的15 mL二氯甲烷溶液處理。將幾滴二甲基甲酰胺加入溶液中。在加入后，將所得溶液在室溫下攪拌15小時。反應混合物經(jīng)減壓濃縮，將殘余物用二氯甲烷充分萃取。有機層用水(150 mL)、鹽水洗滌，干燥并減壓濃縮。殘余物采用快速色譜法(石油醚:乙酸乙酯 = 10:1)純化，得到2,2-二甲基辛酸4-(芐氧基)苯酯5a (2.49 g，49%)，為無色油狀物。

2,2-二甲基己酸-4-(芐氧基)苯酯(5b)：

2.25 g的2,2-二甲基己酸-4-(芐氧基)苯酯(5b)采用用于5a的上述程序制備。

2,2-二甲基辛酸-4-羥基苯酯(6a)：

將2,2-二甲基辛酸-4-(芐氧基)苯酯5a (2.49 g，7.02 mmol)和Pd/C (500 mg)在氫氣下在THF (100 mL)中攪拌15小時。使混合物通過硅藻土墊過濾。濾液經(jīng)減壓濃縮。殘余物采用快速色譜法(石油醚:乙酸乙酯 = 10:1)純化，得到2,2-二甲基辛酸-4-羥基苯基酯6a (1.86 g，100%)，為白色固體。

2,2-二甲基己酸-4-羥基苯酯(6b)：

采用上述程序從4 g的5b制備2,2-二甲基己酸-4-羥基苯酯(6b)，3 g (12.7 mmol，99%)，并照原樣用于下一步。

2,2-二甲基辛酸-(S)-4-(氧雜環(huán)丙烷-2-基甲氧基)苯酯(8a)：

在氮氣氛下，向2,2-二甲基辛酸-4-羥基苯酯6a (3.2 g，12.1 mmol)的二甲基甲酰胺(30 mL)溶液中分批加入NaH (0.32 g，13.3 mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時，然后將3-硝基苯磺酸-(S)-氧雜環(huán)丙烷-2-基甲酯7 (3.45 g，13.3 mmol)加入溶液中。將所得混合物在室溫下攪拌15小時，然后用100mL水稀釋，并用二氯甲烷充分萃取。有機層用水、鹽水洗滌，然后干燥并減壓濃縮。殘余物采用快速色譜法(石油醚:乙酸乙酯 = 5:1)純化，得到2,2-二甲基辛酸-(S)-4-(氧雜環(huán)丙烷-2-基甲氧基)苯酯8a (3.04 g，78%)，為無色油狀物。

2,2-二甲基己酸-(S)-4-(氧雜環(huán)丙烷-2-基甲氧基)苯酯(8b)：

采用上述程序從3 g的6b制備2,2-二甲基己酸-(S)-4-(氧雜環(huán)丙烷-2-基甲氧基)苯酯(8b) 2 g (6.84 mmol，54%)，為白色固體。

(S)-扎莫特羅的2,2-二甲基辛酸酯(10a)：

將2,2-二甲基辛酸-(S)-4-(氧雜環(huán)丙烷-2-基甲氧基)苯酯8a (3.07 g，9.6 mmol)和N-(2-氨基乙基)嗎啉-4-甲酰胺9 (4.98 g，28.8 mmol)在50℃下在異丙醇(100 mL)中攪拌15小時?；旌衔锝?jīng)減壓濃縮。殘余物用二氯甲烷(100 mL)稀釋，并用水(100 mL)洗滌。有機層減壓蒸發(fā)。殘余物采用快速色譜法(石油醚:乙酸乙酯 = 10:1)純化，得到(S)-扎莫特羅的2,2-二甲基辛酸酯10a (2.1 g，44%)，為無色油狀物。1H NMR與結(jié)構(gòu)一致。

將乙醇(15 mL)中的富馬酸(0.18 g，1.52 mmol)滴加到乙醇(15 mL)中的10a (1.5 g，3.04 mmol)的攪拌溶液中。將所得溶液在室溫下攪拌5小時?；旌衔锝?jīng)減壓過濾。沉淀用乙醇(10 mL)洗滌，并減壓干燥。將殘余物溶于蒸餾水(10 mL)中，在-78℃下真空干燥除去乙醇殘留物。得到10a的半富馬酸鹽(1.08 g，64%)，為白色固體。

(S)-扎莫特羅的2,2-二甲基己酸酯(10b)：

此化合物10b按照針對10a的上述程序制備，并轉(zhuǎn)化成半富馬酸鹽，得到0.995 g (1.90 mmol，28%)的所需產(chǎn)物。

另外，可按照美國專利5,466,811和7,988,956 (其兩者以其整體結(jié)合到本文中)所述使用胺的水解性可降解的氨基甲酸酯衍生物。具體地說，U.S. 5,466,811公開了使用氧代二氧雜環(huán)戊烯基甲基氨基甲酸酯以從伯胺和仲胺兩者得到生物可逆性中性前藥。

總的來說，β₁-ADR激動劑化合物的羥基和/或胺基的任一個或兩個的任何衍生化是可接受的，條件是所得到的前藥的clogP值大于0、優(yōu)選大于1.0、最優(yōu)選大于2.0。然而，如上所述，使用具有?；┒吮交u基的扎莫特羅前藥是特別有利的。這類化合物具有圖17下排結(jié)構(gòu)式所示的通式。

此外，R₁-(C=O)-O-基團的R₁部分和/或R2-(C=O)-O-基團的R₂部分(如圖17中在位置上注釋的)各自為5-30個碳原子的親脂性基團，其可為線性、支鏈或環(huán)狀基團，且其可以是未取代的或被低級烷基、低級烷氧基或鹵素(優(yōu)選氟)任選取代。本申請書所用術(shù)語“低級”意指C₁-C₆。然而，環(huán)狀化合物也可包括在5-30個碳原子的親脂性基團中，例如如圖19 (上圖)所示可被任選取代的苯環(huán)或另例如圖19 (下圖)所示的雜環(huán)。?；囊患夋溁蛑麈湹腞₁和/或R₂部分來自8、9或10-30個碳原子是優(yōu)選的。一級碳原子或主碳原子的數(shù)目的范圍不包括任何側(cè)鏈的碳原子。術(shù)語“一級鏈或主鏈”與“側(cè)鏈”在本文通過標準IUPAC命名法確定。因此，例如，在2-甲基戊烷中，一級鏈或主鏈為戊烷(C₅)，側(cè)鏈為甲基(C₁)。

R₁和/或R₂部分的環(huán)狀化合物一般可為不含雜原子或具有1或2個雜原子(例如-O-或-N-)的5-或6-元環(huán)。此外，不含雜原子的環(huán)可以是飽和或不飽和的和甚至是芳族的。雜原子也可以是-O-或-N-。示例性的環(huán)系統(tǒng)包括例如吡咯、呋喃、咪唑烷、咪唑、吡唑烷、吡唑、吡啶或吡喃，其是未取代的或被1-4個低級烷基、低級烷氧基、羥基或鹵素基團(特別是氟)任選取代。所有這類化合物可通過眾所周知的程序合成，包括參照上述流程1和2的末端苯基羥基的?；?，使用合適?；衔镆灾苽渌璧南鄳孽；亓_前藥。

參照上述流程3，可觀察到可采用化合物2 >化合物3 >化合物5 >化合物6 >化合物8和最后化合物10的類似反應，使任何親脂性?；c扎莫特羅連接。也就是說一般可采用流程3轉(zhuǎn)化：

X-OH > R-(C=O)-O-X，其中X為扎莫特羅，R為親脂基團。

注意：在上述簡化反應中，使用通用R而不是具體的R₁和/或R₂，但是所示機制明確代表了兩者。

例如，可采用一般地說使扎莫特羅的第二羥基酯化而具體地說使扎莫特羅的第二羥基?；囊阎セ磻孕纬蓤D17所示基團R2-(C=O)-O-。例如參見美國專利3,278,585和8,669,311，其兩者以其整體結(jié)合到本文中。

類似地，可采用流程1、2和3中的上述反應以制備其它β₁-ADR激動劑的前藥。

對應于于流程3中式10 (其中代之以R基團與扎莫特羅分子直接連接為R-(C=O)-O-X))的親脂性R基團的具體實例如下：

R可以是未取代的或任選取代的線性或支鏈烷基，所述烷基可為C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀、C₁₁、C₁₂、C₁₃、C₁₄、C₁₅、C₁₆、C₁₇、C₁₈、C₁₉、C₂₀、C₂₁、C₂₂、C₂₃、C₂₄、C₂₅、C₂₆、C₂₇、C₂₈、C₂₉或C₃₀，或這些相同的C₅-C₃₀烷基的任一個可以是未取代的或任選取代的支鏈或環(huán)狀基團(例如環(huán)戊基或環(huán)己基)或具有線性、支鏈或環(huán)狀基團的組合。此外，這些線性、支鏈或環(huán)狀基團可具有例如連接扎莫特羅分子與環(huán)系統(tǒng)(例如苯基或吡喃基)的一級鏈或主鏈中的一個或多個間插的-O-或-N-基團。

此外，明確考慮了圖17和18所示具有R1和R2基團兩者的化合物，包括R₁和R₂兩者的任一的含有環(huán)的取代基，例如苯甲酸酯或吡喃基酯，所述環(huán)可以是未取代的或被1-5個低級烷基、低級烷氧基、羥基或鹵素基團取代。

另外，基團R₁和/或R₂可在雜原子和環(huán)之間含有間斷性的連接序列。例如R₁和/或R₂各自可以是例如，

苯基丙氨酰基-氧代-(CH₂)m-(C=O)-O-，

吡喃基-(CH₂)m-(C=O)-O-，

其中m為1-20個碳原子，優(yōu)選1-10個碳原子。在這種情況下，基團–(CH₂)-為“連接基”。

此外，明確包括了在基團R₁和/或R₂中含有氨基酸的化合物。例如，圖19上排的化合物含有通過氧基乙基羰基與扎莫特羅的末端苯基羥基橋接的苯基丙氨?；??？墒褂萌魏伟被?優(yōu)選L-氨基酸)替換這類化合物中的苯基-丙氨酸?？商峒鞍被?，例如丙氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和纈氨酸等。

本發(fā)明的所有前藥化合物可參照上述流程1、2或3附帶類似于這些流程所必需的任何修改來制備。此外，所需的任何修改可采用眾所周知的反應實現(xiàn)。

所用的β₁-ADR前藥化合物的量的范圍

總的來說，對于治療AD、DS或孤獨癥，對于臨床應用的人或?qū)τ谂R床前測試或藥物篩選的動物，以約1-20 mg/kg體重的量給予一種或多種β₁-ADR前藥化合物。更優(yōu)選對于人和動物兩者給予約2-10 mg/kg體重。此外，給藥可為多次，由治療醫(yī)生(對于人)和實驗室科學家或獸醫(yī)(對于動物)斟酌決定。本文所用“約”意指± 25%。因此，“約1”意指0.75-1.25。

如上所述，以在無菌鹽水或葡萄糖-5%-鹽水(D5S)的藥學上可接受的溶液中的溶液劑形式通過i.v.或s. c.給予β₁-ADR前藥。然而，對于親脂性極大提高(即水溶性差)的β₁-ADR前藥，可使用各種已知的混懸劑。參見美國專利5,679,138，其以整體結(jié)合到本文中?？墒褂闷渌o藥方式，例如口服或鼻內(nèi)?？诜o藥可用混懸劑、片劑或膠囊劑實現(xiàn)。鼻內(nèi)給藥可使用干粉吸入器、薄霧吸入器或通過使用已知方法的滴劑或拭子實現(xiàn)。

認知和社交記憶改善的測試

患有AD、DS、ADD、ADHD和孤獨癥的人的認知和社交記憶改善的測試采用已知的診斷方法(包括觀察)實現(xiàn)。例如小鼠的測試可采用本文上述已知試驗進行。

對于患有AD的人，測試可通過Folstein試驗(亦稱為簡易精神狀態(tài)檢查)進行。該試驗利用問卷以篩查精神損害，并且由Psychological Assessment Resources出版。所測類別包括例如時間與位置定位、注意與計算、回憶、語言識別、重復和服從復雜命令的能力。通過各類別的最大可能點數(shù)中各類別中給出的點數(shù)，來評估受測個體。

對于患有DS的人，測試通常用Arizona Cognitive Test Battery進行。參見J. Neurodev. Disorder 2010 Sept. 1; 2 (3): 149-164。

對于患有孤獨癥譜系障礙的人，測試一般用Social Cognitive Skills Test進行。參見J. Intell. Disability 2008 Mar.; 12(1):49-57。本文明確認知到本發(fā)明的化合物和組合物可有利地用于治療表現(xiàn)各種孤獨癥譜系障礙的個體。

合成實施例：

扎莫特羅富馬酸鹽的制備出自美國專利4,143,140，其以整體結(jié)合到本文中。

將1-對芐氧基苯氧基-2,3-環(huán)氧丙烷(11.5 g)的異丙醇(6 ml)懸浮液加入4-(N-β-氨基乙基氨甲?；?嗎啉硫酸氫鹽(12.7 g)、氫氧化鉀(7.0 g)和異丙醇(10 ml)的攪拌混合物中，將混合物在45℃下攪拌1小時，然后減壓蒸發(fā)至干。將殘余油狀物用水攪拌，將混合物過濾，將固體殘余物溶于丙酮中。加入丙醇中的30%氯化氫溶液，直到混合物的pH小于2，將混合物過濾。固體殘余物從水中結(jié)晶出來，由此得到1-對芐氧基苯氧基-3-(β-嗎啉代甲酰胺基乙基)氧基-2-丙醇鹽酸鹽(4.9 g)。

在實驗室溫度和壓力下，將上述化合物在乙醇(20 ml)和乙酸(20 ml)的混合物的溶液中在氫氣氛下用30%炭載鈀催化劑(0.1 g)振蕩直到250 ml的氫吸收。將混合物過濾，濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)至干，向殘余物中加入乙醇(15 ml)中富馬酸(1.25 g)的熱溶液。將混合物保持在5℃下12小時，然后過濾，將固體殘余物用熱乙醇洗滌，然后干燥。因此得到1-對羥基苯氧基-3-β-(嗎啉代甲酰胺基)乙基-氨基-2-丙醇富馬酸氫鹽，熔點168-169℃ (具有分解)。

可如下得到用作起始原料的4-(N-β-氨基乙基氨甲?；?嗎啉硫酸氫鹽：

在20分鐘內(nèi)，將嗎啉(4.35 g)和氯甲酸苯酯(6.35 g)分別同時滴加到保持在0℃下的甲苯(10 ml)、水(5 ml)和氫氧化鈉(2 g)的攪拌混合物中。再攪拌混合物2小時，同時使溫度升到20℃。分離甲苯溶液，含水溶液用甲苯萃取兩次，將合并的甲苯溶液用水洗滌，干燥并減壓蒸發(fā)至干。殘余物從石油醚(沸點60-80℃)中結(jié)晶出來，得到N-苯氧基羰基嗎啉，熔點46.5-47.5℃。將該化合物(11 g)和乙二胺(27.8 g)的混合物在實驗室溫度下攪拌3天，通過減壓蒸發(fā)除去過量的乙二胺。將殘余物溶于甲醇中，使溶液冷卻至5℃，加入濃硫酸直到溶液的pH為2。加入助濾劑(硅藻土，10 g)，并攪拌混合物1小時，然后過濾。濾液經(jīng)減壓蒸發(fā)至干，將殘余物用乙酸乙酯攪拌?；旌衔锝?jīng)過濾，由此得到作為固體殘余物的4-(N-β-氨基乙基氨甲?；?嗎啉硫酸氫鹽，熔點168-169℃。

在上述制備中，可以化學計量方式使用任何有機酸或無機酸代替富馬酸以制備相應的扎莫特羅鹽。

已對本發(fā)明進行了描述，要了解可對上述實施方案進行許多常規(guī)改變和修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。