本公開處在肌肉抑制素拮抗劑(例如肌肉抑制素結合分子或活化素受體IIB(ActRIIB)結合分子，例如針對ActRIIB的拮抗劑抗體，例如比麥單抗(bimagrumab))的領域。具體地，其是關于髖部骨折的手術治療(或髖部骨折手術)后恢復的改善或加速和用于此適應癥的新型給藥方案，其采用治療有效量的ActRII拮抗劑，例如活化素受體II(ActRII)結合分子，例如抗活化素受體II(ActRII)抗體，例如比麥單抗。

背景技術：

肌肉抑制素(轉化生長因子β(TGF-β)超家族的成員)是一種在動物和人類整個生命周期中負調(diào)控骨骼肌質(zhì)量的分泌蛋白。肌肉抑制素通過II型活化素受體(主要通過ActRIIB)起作用，提出信號傳導是通過SMAD 2/3路徑，其參與抑制蛋白質(zhì)合成，和肌細胞分化與增殖。肌肉抑制素的抑制或遺傳消融增加肌肉量和強度(Lee等，2005，Lee和McPherron 2001，Whittemore等，2003)。

比麥單抗(BYM338)是經(jīng)研發(fā)以競爭性結合II型活化素受體(ActRII)的單克隆抗體，其結合親和力大于肌肉抑制素或活化素(ActRII的天然配體)。比麥單抗是全人類抗體(經(jīng)修飾IgG1、234-235-Ala-Ala、λ₂)，其結合ActRII的配體結合結構域，從而阻止其配體(包括擔當骨骼肌生長天然抑制劑的肌肉抑制素和活化素)的結合和后續(xù)信號傳導。肌肉抑制素(轉化生長因子β(TGF-β)超家族的成員)是一種負調(diào)控動物和人類的骨骼肌質(zhì)量的分泌蛋白。肌肉抑制素信號傳導發(fā)生在ActRII處，且所提出的其作用機制是通過Smad 2/3路徑來抑制蛋白質(zhì)合成和肌細胞分化與增殖。肌肉抑制素抑制或遺傳消融增加肌肉質(zhì)量和強度(Lee等，2005；Lee和McPherron 2001；Whittemore等，2003)。

比麥單抗與人類和小鼠ActRIIB交叉反應，且對人類、食蟹猴、小鼠和大鼠骨骼肌細胞有效。比麥單抗經(jīng)調(diào)配用于靜脈內(nèi)(i.v.)施用。

肌肉抑制素、ActRIIB受體和ActRIIB受體抗體

比麥單抗(也稱為BYM338)是一種經(jīng)研發(fā)競爭性結合II B型活化素受體(ActRIIB)的人類單克隆抗體，其結合親和力大于肌肉抑制素(ActRIIB的主要天然配體)。比麥單抗公開于WO2010/125003中，該專利的全文以引用方式并入本文中。肌肉抑制素(轉化生長因子β(TGF-β)超家族的成員)是一種在動物和人類整個生命周期中負調(diào)控骨骼肌質(zhì)量的分泌蛋白。肌肉抑制素信號傳導發(fā)生在ActRIIB處，且所提出的其作用機制是通過Smad 2/3路徑來抑制蛋白質(zhì)合成以及肌細胞分化與增殖。在發(fā)育期動物和人類中缺失肌肉抑制素會產(chǎn)生肌肉纖維數(shù)目和尺寸增加的超級肌肉表型。產(chǎn)后肌肉抑制素的含量降低造成現(xiàn)有肌纖維的尺寸增加導致的骨骼肌肥大。在成人中，肌肉抑制素是在骨骼肌中產(chǎn)生，且在血液中循環(huán)，部分作為潛在無活性復合物。

與肌肉抑制素作為骨骼肌質(zhì)量內(nèi)源抑制劑的作用一致，在失用且類固醇誘導萎縮的臨床前鼠類模型和在健康食蟹猴的毒物學研究中，比麥單抗顯著增加骨骼肌質(zhì)量。此外，小鼠和大鼠中的質(zhì)量增加導致肌肉強度(力量生成)相應增加。i.v.和s.c.施用于小鼠和食蟹猴后，比麥單抗顯示一致的IgG1藥物代謝動力學(PK)曲線與靶點介導藥物處置(TMDD)，且耐受良好。

首次人類單次劑量遞增研究的六個劑量水平的分析表明，比麥單抗的0.1、0.3、1、3、10和30mg/kg的單次i.v.劑量是安全且耐受良好的，且產(chǎn)生可根據(jù)模型化臨床前數(shù)據(jù)預測的PK曲線。與安慰劑相比，在四周時3-30mg/kg的劑量產(chǎn)生大腿肌肉體積自基線2.7％-5.2％的可測量增加。

身體組成在移動性和髖部骨折風險的測定中的作用

已確定即使在健康老年人中，肌肉強度下降也不能完全由骨骼肌質(zhì)量損失來解釋(Frontera等，2000,Vandervoort 2002)。此外，肌肉質(zhì)量的維持或甚至增加不必定能阻止肌肉強度損失(Goodpaster等，2006)；且由每單位肌肉質(zhì)量骨骼肌產(chǎn)生的力隨著年齡增長而減少(Goodpaster等，2006；Brooks和Faulkner 1994)。盡管這些事實并未降低在老化期間維持肌肉質(zhì)量的重要性，但其強調(diào)為解決年齡相關的移動性下降，不止需要了解和治療肌肉組織的損失。

除肌肉質(zhì)量損失外，也存在肌肉組織由脂質(zhì)和其他非收縮性組分浸潤。新出現(xiàn)的證據(jù)表明，骨骼肌脂質(zhì)含量直接影響肌肉強度和移動性功能(Goodpaster等，2001；Visser等，2002)以及老年男性和女性中將來移動性損失增加的風險(Visser等，2005)。Beavers等(2013)顯示，大腿中高/增加的肌間脂肪組織(IMAT)面積以及總大腿肌肉面積減少是步行速度下降的重要預測因子?；€大腿IMAT預測男性和女性中的每年步行速度下降。在縱向分析中，大腿IMAT和總大腿肌肉的變化是預測男性和女性中步行速度下降的唯一身體組成量度(圖1)。

肌肉組織的年齡相關性脂肪浸潤以及與下肢性能降低結合的肌肉強度降低使得多種結果例如移動性損失、跌倒和骨骼骨折(包括髖部骨折)的風險升高(Lang等，2010)。

肌間脂肪質(zhì)量影響骨骼肌的機制

IMAT增加與步行速度下降之間聯(lián)系的基本機制可能包括脂肪組織的內(nèi)分泌性質(zhì)。肌肉中的過量脂肪累積可能與促炎細胞因子的過量分泌相關(Fantuzzi等，2005)。慢性發(fā)炎與較低的肌肉強度相關(Visser等，2002)，且能預測老年人中的失能(Verghese等，2011)，這可能是肌肉-纖維收縮性受損的結果(Pahor和Kritchevsky 1998)。過度肥胖也可下調(diào)胰島素、睪酮和生長激素的合成代謝作用(Chevalier等，2006，Schaap等，2005，Waters等，2008)，這些因子都可促使肌肉損失和功能下降。

髖部骨折后身體組成變化

臨床觀察指示，由于手術后的移動性限制加劇，經(jīng)受髖部骨折且隨后經(jīng)歷骨折修復大手術的老年個體經(jīng)受身體組成的額外快速變化的惡性循環(huán)(Wehren等，2005；D’Adamo等，2014)。直接或快速推進的變化包括神經(jīng)性肌無力、骨骼肌損傷(失用性萎縮)、脂肪質(zhì)量增加和加速的骨損失(D’Adamo等，2014，F(xiàn)ox等，2000，Daguet等，2011)。重要的是，這些變化的顯現(xiàn)可早在手術后第10天且可在術后約2個月達到最大值。

總之，脆弱性和易碎性的急性并發(fā)癥(髖部骨折)進一步惡化身體組成，這促使首先出現(xiàn)并發(fā)癥。另外，其減少手術后功能恢復的速度和幅度，這進而增加移動性相關并發(fā)癥(傷害性跌倒、骨折和相關再度住院)的風險。該惡性循環(huán)的凈結果是髖部骨折后患者的驚人死亡率：在第一年期間介于8.4％-36％的范圍(Abrahamsen等，2009)。

預防手術后并發(fā)癥的早期需要

重要的是，大部分并發(fā)癥往往在手術后前6個月內(nèi)發(fā)生，提高對以下措施的需求：可加速和增加全身移動性的幅度以預防移動性相關并發(fā)癥、再度住院并最終降低此群體中相當高的死亡率。

未滿足的醫(yī)學需要

涵蓋飲食措施(蛋白質(zhì)、維生素D和Ca補充)的當前護理標準、早期手術后動員和阻力訓練結合抗吸回療法離最優(yōu)選化仍有相當大的空間。對復健的依從性是有限的且當前藥理學治療(雙膦酸酯、狄諾塞麥(denosumab)、維生素D)的效應相對較小且起效緩慢。

對理想藥劑的需求

鑒于這些需求，存在下述明確未滿足的需求：需要一種藥劑，它在具有合并癥共存的這一脆弱群體中能加速并加強當前護理標準的功效而不會出現(xiàn)顯著安全性問題。因此，理想藥物候選者可滿足以下要求：

A.就逆轉身體組成的不良改變而言可快速達成最大益處

B.可誘導臨床上有意義的肌肉質(zhì)量變化，其可轉化成肌肉強度和身體性能增加

C.可實質(zhì)上降低骨骼肌的脂肪浸潤，從而改善肌肉品質(zhì)和改善肌肉強度和移動性

D.沒有顯著安全性或耐受性問題來限制預期進行的6個月治療

比麥單抗對實現(xiàn)前述3個要求有機會的證據(jù)

申請人有證據(jù)：用以防止肌肉抑制素信號傳導(抗肌肉抑制素抗體、可溶性IIB型活化素受體和針對細胞結合的II型活化素受體的抗體)的當前方法中，活化素受體拮抗作用提供功效與安全性之間的最佳平衡(最高效益/風險比)，因此能夠誘導快速且實質(zhì)的肌肉生長并伴以肌間脂肪組織減少(即肌肉品質(zhì)改善)，這二者直接促使肌肉收縮和最終移動性的改善。

臨床前證據(jù)

ActRII阻斷誘導肌肉質(zhì)量的最大增加

通過比較抗體與僅中和循環(huán)中肌肉抑制素的抑制劑，申請人研究了通過ActRII傳導的其他配體的抑制是否在由比麥單抗誘導的肥大中起顯著作用(Lach-Trifilieff 2014)。出于此目的，使用穩(wěn)定化肌肉抑制素前肽(D76A)，其經(jīng)驗證是肌肉抑制素特異性抑制劑。向年輕SCID小鼠每周施用比麥單抗和肌肉抑制素前肽達5周；比麥單抗是以10mg/kg施用，肌肉抑制素前肽是以30mg/kg施用。

體重在整個治療期間增加，僅在用比麥單抗治療中達到顯著(36％相比肌肉抑制素前肽的15％)。由肌肉抑制素前肽誘導的15％增加與先前出版物中所述一致(Trendelenburg等，2009)；ActRII抗體的功效是其2倍以上(圖2，左圖)。肌肉重量在檢查的大部分肌肉中顯著增加，其中用比麥單抗顯示出更顯著的增加(圖2，中間圖)。通過分析纖維橫截面積分布進一步證實此較大的總肌肉質(zhì)量增加，證明這些因子是通過增加纖維直徑而非纖維數(shù)量起作用(圖2，右圖)。

相比循環(huán)肌肉抑制素庫的中和，II型活化素受體阻斷顯著更高的功效明確展示：除肌肉抑制素外還存在能夠通過IIB型活化素受體促使肌肉損失的配體。

阻斷肌肉抑制素信號傳導的第三種方法是通過能捕獲循環(huán)中此受體的所有可能配體(包括肌肉抑制素)的可溶性IIB型活化素受體陷阱/誘餌(ActRIIB-Fc)。就誘導肌肉生長而言，此方法的功效很可能與比麥單抗的功效相當。對迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy)的男孩用ActRIIB-Fc(ACE-031)所作2期研究的結果顯示：LBM增加和TMV和六分鐘步行距離的下降減弱(Campbell等，2012)。然而，在健康志愿者MAD研究以及2期肌營養(yǎng)不良研究中觀察到的可逆鼻出血和皮膚毛細管擴張已導致這些試驗和此藥理學方法的臨床研發(fā)的終止(Smith和Lin 2013)。比麥單抗有別于后一方法的基本差異在于其僅阻斷靶組織(例如肌肉)上通過受體的配體運輸，且不消除循環(huán)配體到達其自身替代配體以發(fā)揮效應的機會，這可對安全性至關重要(例如，通過骨骼肌上ActRIIB的BMP的信號傳導將受阻，但BMP可到達其自身BMP受體并通過這些受體傳導信號，這不是以誘捕來阻止作用的選擇)。

盡管活化素受體IIB陷阱可誘發(fā)的肌肉體積增加與通過膜結合ActRIIB來阻斷所誘發(fā)的肌肉體積增加相當，且迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良男孩中利用ActRIIB-Fc(ACE-031)的2期研究結果顯示瘦體重質(zhì)量增加和大腿肌肉體積和六分鐘步行距離的下降減弱(Campbell等，2012)，在健康志愿者MAD研究以及2期肌營養(yǎng)不良研究中觀察到的可逆鼻出血和皮膚毛細管擴張已導致這些試驗的終止(Smith和Lin 2013)。兩種方法之間的基本差異在于ActRIIB-Fc捕獲并中和循環(huán)中受體的所有可能配體阻止這些配體結合其他可能的靶受體，但比麥單抗僅阻斷靶組織(例如肌肉)上通過ActRIIB的配體運輸。例如結合ActRIIB的BMP可繼續(xù)通過其BMP受體傳導信號。

年輕和年老動物中對ActRII抑制的響應性

動物研究展示，在6月齡和21月齡大鼠中，單次施用20mg/kg I.V.比麥單抗在2至3周顯著增加體重，表明促進合成代謝肌肉的作用。這實際上通過基于MRI的后腿肌肉體積的評估得以確認，證明施用單劑比麥單抗在6月齡和21月齡大鼠中都促使肌肉肥大(圖3)。

比麥單抗的肥大性作用在其單次施用2周后明顯，其相對于對照組達到13％至15％的增加。重要的是，對比麥單抗的最大響應在6月齡和21月齡大鼠中類似，證明在平行設定中比較時年老動物仍與年輕動物對ActRII抑制有同等響應且能夠生成相同的骨骼肌體積增加。

臨床證據(jù)

健康年輕志愿者中失用性萎縮的逆轉：全長上石膏腿模型

申請人有證據(jù)表明，比麥單抗能夠在一只腿全長上石膏2周的年輕健康志愿者(平均年齡24歲)中引發(fā)失用性相關肌肉損失的快速逆轉。此固定(即肌肉的失活)在2周過程中誘導約5％的快速肌肉損失。比麥單抗的單次i.v.劑量(30mg/kg)在石膏移除后2周內(nèi)產(chǎn)生大腿肌肉體積的幾乎完全恢復(至澆鑄前的-0.8％)，而僅通過恢復至正常每日活動(沒有針對性復健項目)恢復肌肉質(zhì)量的群組看來需要耗費12周以恢復至基線。該觀察明確證實了通過比麥單抗的ActRII阻斷作用的快速起效，如由重新活動早期的骨骼肌質(zhì)量增加所反映。

正?；M一步地，大腿肌肉質(zhì)量在石膏移除后第2周至第12周繼續(xù)增加，最后比沒有接受比麥單抗的群組大約增加5％體積(圖4)。因此，可在12周觀察時段內(nèi)可見所述藥物的單次靜脈內(nèi)劑量導致大腿肌肉體積增加全部總計為約10％。

肌減少性患者中恢復肌肉質(zhì)量

在最近完成的對患有肌肉減少癥和身體脆弱的老年患者的研究中，單劑30mg/kg靜脈內(nèi)比麥單抗可引發(fā)大腿肌肉體積增加，與失用性萎縮的實驗模型中觀察到的肌肉生長幅度相當，即在8周內(nèi)自基線增加>8％(圖5)。在大部分移動性受限的患者(以6MWD<300m開始的那些)中，此質(zhì)量增加先于6分鐘步行距離(6MWD)的顯著增加(+76米，p＝0.02)。

因此，不管其是施用于失用性萎縮的年輕個體或是由于老齡患有實質(zhì)肌肉萎縮的年老個體，比麥單抗都能夠誘導相當?shù)姆磻?/p>

肌間脂肪組織(IMAT)顯著減少

在49名最高65歲的健康女性和男性的隨機化、六種處理、雙盲、安慰劑對照的單一劑量遞增設計試驗中，以交錯方式施用0.1、0.3、1、3、10和30mg/kg的單一i.v.劑量。在此試驗中，除安全性、耐受性和藥物動力學外，也評價通過磁共振成像測量的比麥單抗對大腿肌肉體積以及肌間脂肪組織的效應。如圖6中所示，比麥單抗誘導劑量依賴性肌間脂肪組織減少。10和30mg/kg的效應在藥物注射后第10周相當，都自基線減少超過10％。

比麥單抗治療與功能性能的顯著改善相關

如通過來自散發(fā)性包涵體肌炎(一種進行性肌肉退化疾病)患者的數(shù)據(jù)所說明，由單次注射比麥單抗(30mg/kg)誘導的瘦體質(zhì)量的快速增加(自基線>5％)能夠引發(fā)身體性能的顯著增加(圖7)。重要的是，肌肉質(zhì)量增加后功能的改善需要一段滯后時間，這可能反映骨骼肌在完全成熟且準備好用于增強態(tài)收縮活動前的結構/功能重塑。

總之，比麥單抗看來具有能夠逆轉年齡相關的身體組成變化以及髖部骨折手術后的反應變化(失用性萎縮)的能勝任的藥理試劑特性。申請人也有越來越多的證據(jù)證明，該藥物候選者可引發(fā)肌肉消瘦疾病的功能改善。因此，利用對肌肉和IMAT的相對快速且顯著的效應，比麥單抗提供髖部骨折后加速恢復的創(chuàng)新方法。

技術實現(xiàn)要素：

經(jīng)歷過髖部骨折手術的患者群體中的干預是高度創(chuàng)新的且能滿足高度未滿足的醫(yī)學需要。實際上，目前沒有改善和/或加速自髖部骨折手術恢復的治療選擇。該目的是通過本公開提供的方法和給藥方案來實現(xiàn)的。

因此，本公開的第一主題是關于包含肌肉抑制素拮抗劑的組合物改善和/或加速自髖部骨折手術恢復的方法或用途，所述肌肉抑制素拮抗劑可以是肌肉抑制素結合分子或ActRII結合分子。肌肉抑制素結合分子可以是(例如)針對肌肉抑制素的拮抗劑抗體。ActRII結合分子可以是(例如)針對ActRII的拮抗劑抗體，例如比麥單抗(也稱為BYM338)。

如本文所使用的“肌肉抑制素拮抗劑”是指能夠拮抗(例如降低、抑制、減小、延遲)肌肉抑制素功能、表達和/或信號傳導(例如通過阻斷肌肉抑制素與肌肉抑制素受體(即ActRII)結合)的分子。拮抗劑的非限制性實例包括肌肉抑制素結合分子和ActRII受體結合分子。在所公開方法、方案、套件、過程、用途和組合物的一些實施方式中，采用肌肉抑制素拮抗劑。

“肌肉抑制素結合分子”意指能夠單獨或與其他分子締合來結合人類肌肉抑制素抗原的任意分子?？赏ㄟ^標準方法(定性分析)顯示結合反應，包括(例如)結合分析、競爭分析或用于測定肌肉抑制素與其受體結合的抑制的生物分析或任意種類的結合分析，以使用具有不相關特異性但理想地屬于相同同種型的抗體(例如抗CD25抗體)的陰性對照測試為參照。肌肉抑制素結合分子的非限制性實例包括如小分子、肌肉抑制素受體誘餌和由B細胞或雜交瘤所產(chǎn)生結合肌肉抑制素的抗體以及嵌合抗體、CDR移植抗體或人類抗體或其任意片段(例如F(ab’)₂和Fab片段)以及單鏈或單一結構域抗體。優(yōu)選地，肌肉抑制素結合分子拮抗(例如降低、抑制、減小、延遲)肌肉抑制素的功能、表達和/或信號傳導。在所公開方法、方案、套件、過程、用途和組合物的一些實施方式中，采用肌肉抑制素結合分子。

“ActRII結合分子”意指能夠單獨或與其他分子締合來結合人類ActRII受體(ActRIIA和/或ActRIIB)的任意分子?？赏ㄟ^標準方法(定性分析)顯示結合反應，包括(例如)結合分析、競爭分析或用于測定ActRII受體與肌肉抑制素結合的抑制的生物分析或任意種類的結合分析，以使用具有不相關特異性但理想地屬于相同同種型的抗體(例如抗CD25抗體)的陰性對照測試為參照。ActRII受體結合分子的非限制性實例包括小分子、肌肉抑制素誘餌和如由B細胞或雜交瘤所產(chǎn)生針對ActRII受體的抗體以及嵌合抗體、CDR移植抗體或人類抗體或其任意片段(例如F(ab’)₂和Fab片段)以及單鏈或單一結構域抗體。優(yōu)選地，ActRII受體結合分子拮抗(例如降低、抑制、減小、延遲)肌肉抑制素的功能、表達和/或信號傳導。在所公開方法、方案、套件、過程、用途和組合物的一些實施方式中，采用ActRIIB受體結合分子。

在另一個實施方式中，組合物包含抗ActRII抗體，其結合由SEQ ID NO:181(SEQ ID NO:182)的氨基酸19-134組成的結合結構域，或結合包含以下序列或由以下序列組成的表位：(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)。

在另一個替代性實施方式中，上文所提及的組合物包含抗ActRII抗體，其結合ActRIIB的親和力是其結合ActRIIA結合的親和力的10倍或更高。

另外地，本公開關于組合物，其中抗ActRIIB抗體包含重鏈可變區(qū)CDR1，其包含選自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID NO:29-42的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)CDR1，其包含選自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NO:57-70的氨基酸序列；和輕鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列。

在某些實施方式中，本公開提供組合物，其中抗ActRII抗體包含：(a)SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:15的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:29的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:43的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:57的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:71的輕鏈可變區(qū)CDR3，(b)SEQ ID NO:2的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:16的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:30的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:44的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:58的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:72的輕鏈可變區(qū)CDR3，(c)SEQ ID NO:3的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:17的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:31的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:45的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:59的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:73的輕鏈可變區(qū)CDR3，(d)SEQ ID NO:4的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:18的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:32的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:46的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:60的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:74的輕鏈可變區(qū)CDR3，(e)SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:19的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:33的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:47的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:61的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:75的輕鏈可變區(qū)CDR3，(f)SEQ ID NO:6的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:20的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:34的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:48的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:62的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:76的輕鏈可變區(qū)CDR3，(g)SEQ ID NO:7的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:35的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:49的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:63的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:77的輕鏈可變區(qū)CDR3，(h)SEQ ID NO:8的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:22的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:36的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:50的輕鏈可變區(qū)CDR1，SEQ ID NO:64的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:78的輕鏈可變區(qū)CDR3，(i)SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:37的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:51的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:65的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:79的輕鏈可變區(qū)CDR3，(j)SEQ ID NO:10的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:24的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:38的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:52的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:66的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:80的輕鏈可變區(qū)CDR3，(k)SEQ ID NO:11的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:25的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:39的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:53的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:67的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:81的輕鏈可變區(qū)CDR3，(l)SEQ ID NO:12的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:26的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:40的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:54的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:68的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:82的輕鏈可變區(qū)CDR3，(m)SEQ ID NO:13的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:27的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:41的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:55的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:69的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:83的輕鏈可變區(qū)CDR3，或(n)SEQ ID NO:14的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:28的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:42的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:56的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:70的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:84的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在另一個實施方式中，上文所提及的抗ActRII抗體包含(i)全長重鏈氨基酸序列，其與選自SEQ ID NO:146-150和156-160的至少一個序列具有至少95％的序列一致性，(ii)全長輕鏈氨基酸序列，其與選自SEQ ID NO:141-145和151-155的至少一個序列具有至少95％的序列一致性，或(iii)(a)SEQ ID NO:99的可變重鏈序列和SEQ ID NO:85的可變輕鏈序列；(b)SEQ ID NO:100的可變重鏈序列和SEQ ID NO:86的可變輕鏈序列；(c)SEQ ID NO:101的可變重鏈序列和SEQ ID NO:87的可變輕鏈序列；(d)SEQ ID NO:102的可變重鏈序列和SEQ ID NO:88的可變輕鏈序列；(e)SEQ ID NO:103的可變重鏈序列和SEQ ID NO:89的可變輕鏈序列；(f)SEQ ID NO:104的可變重鏈序列和SEQ ID NO:90的可變輕鏈序列；(g)SEQ ID NO:105的可變重鏈序列和SEQ ID NO:91的可變輕鏈序列；(h)SEQ ID NO:106的可變重鏈序列和SEQ ID NO:92的可變輕鏈序列；(i)SEQ ID NO:107的可變重鏈序列和SEQ ID NO:93的可變輕鏈序列；(j)SEQ ID NO:108的可變重鏈序列和SEQ ID NO:94的可變輕鏈序列；(k)SEQ ID NO:109的可變重鏈序列和SEQ ID NO:95的可變輕鏈序列；(l)SEQ ID NO:110的可變重鏈序列和SEQ ID NO:96的可變輕鏈序列；(m)SEQ ID NO:111的可變重鏈序列和SEQ ID NO:97的可變輕鏈序列；或(n)SEQ ID NO:112的可變重鏈序列和SEQ ID NO:98的可變輕鏈序列。

在某些方面中，本公開關于上述組合物，其中所包含抗ActRII抗體包含(a)SEQ ID NO:146的重鏈序列和SEQ ID NO:141的輕鏈序列；(b)SEQ ID NO:147的重鏈序列和SEQ ID NO:142的輕鏈序列；(c)SEQ ID NO:148的重鏈序列和SEQ ID NO:143的輕鏈序列；(d)SEQ ID NO:149的重鏈序列和SEQ ID NO:144的輕鏈序列；(e)SEQ ID NO:150的重鏈序列和SEQ ID NO:145的輕鏈序列；(f)SEQ ID NO:156的重鏈序列和SEQ ID NO:151的輕鏈序列；(g)SEQ ID NO:157的重鏈序列和SEQ ID NO:152的輕鏈序列；(h)SEQ ID NO:158的重鏈序列和SEQ ID NO:153的輕鏈序列；(i)SEQ ID NO:159的重鏈序列和SEQ ID NO:154的輕鏈序列；或(j)SEQ ID NO:160的重鏈序列和SEQ ID NO:155的輕鏈序列。

本公開的另一主題關于組合物，其中(i)抗ActRII抗體交叉阻斷或被上述抗體中之一交叉阻斷，(ii)具有通過Fc區(qū)突變而改變的效應子功能，和/或(iii)結合由上述抗體之一識別的表位。

在另一個實施方式中，所公開組合物包含由pBW522(DSM22873)或pBW524(DSM22874)編碼的抗ActRII抗體。

附圖說明

圖1.步行速度變化與大腿肌間脂肪組織面積和大腿肌肉面積變化之間的相關性。

如圖所示，具有肌肉質(zhì)量最小增加和脂肪質(zhì)量最大增加的患者顯示步行/步行速度最大下降(采用自Beavers等，2013)。

圖2.抗ActRII抗體治療相對于藥理學肌肉抑制素抑制的功效的比較。治療是比麥單抗(10mg/kg；條紋塊)、肌肉抑制素前肽D76A(30mg/kg；灰色塊)或磷酸緩沖鹽水(白色塊)。結果以平均值±SEM(n＝9或10)表示。*，相對經(jīng)PBS處理的組P<0.05；**，相對經(jīng)PBS處理的組P0.01。

圖3.經(jīng)單劑20mg/kg IV IgG1或比麥單抗治療3周的大鼠的通過MRI測量的后腿肌肉體積。

圖4.全腿上石膏2周期間和后續(xù)在有或沒有單劑比麥單抗(30mg/kg)的情況下自行恢復期間大腿肌肉體積變化。

圖5.具有功能性移動障礙(步行速度低于1.0m/s)的肌減少性個體中對于一個或兩個劑量的比麥單抗(30mg/kg iv.)的大腿肌肉體積變化。

圖6.接受單劑比麥單抗(0.1、0.3、1、10、30mg/kg)的健康志愿者中肌間脂肪組織自基線的變化，結果以平均值(SEM)顯示。

圖7.在散發(fā)性包涵體肌炎患者中，比麥單抗誘導的瘦體質(zhì)量(LBM)、四頭肌強度(QMT)和6分鐘步行距離(6MWD)自基線的變化。應注意LBM增加(在第8周至第16周)與第16周開始肌肉強度和身體性能顯著增加之間的時間間隔。

圖8.BYM338D2201研究設計。

具體實施方式

定義

為更容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術語。其他定義在整個詳細說明書中進行闡釋。

術語“包含”意指“包括”，例如“包含”X的組合物可排他地由X組成或可包括額外某物，例如X+Y。

與數(shù)值x相關的術語“約”意指(例如)x±10％。

術語“失用性萎縮”是肌肉萎縮或肌肉消瘦的另一術語。其發(fā)生在肌肉不再如平常一樣活躍之時。當肌肉不再使用時，其緩慢變?nèi)?。最終，其開始收縮。在一些情況下，如果肌肉再次變活躍，則失用性萎縮可被逆轉。

失用性萎縮可由不活動引起，例如手臂長時間上石膏。如果人停止進行其常見活動(例如步行)，則也可在一定程度上發(fā)生失用性萎縮。

術語“大手術”是任何涉及麻醉和呼吸輔助的手術。在本發(fā)明上下文中，其意指手術中或手術后并發(fā)癥(心臟或呼吸道并發(fā)癥、大出血、嚴重感染)風險的顯著切除(關節(jié)的移除和置換)。所述手術包含內(nèi)固定或關節(jié)成形術。

下文例示評估使用肌肉抑制素拮抗劑(例如肌肉抑制素結合分子或ActRII結合分子，優(yōu)選ActRII結合分子，更優(yōu)選針對ActRII的拮抗劑抗體，例如比麥單抗)治療的可能效應的可能臨床前治療方案。

該治療是通過使用食蟹猴來例示，但所述實驗并不限于猴，且本領域技術人員知悉如何針對其他物種、特別是人設定合適的實驗或給藥方案：可通過靜脈內(nèi)注射向雄性和雌性食蟹猴每周一次持續(xù)3個月施用抗ActRII抗體(例如比麥單抗)?？蓪?2只食蟹猴(16只/性別)分配給四個治療組中的一個(3-5只動物/性別/組)，且可以10、30或100mg/kg每周一次持續(xù)13周靜脈內(nèi)注射載劑或ActRIIB抗體(例如BYM338)(總共14個劑量；劑量應基于猴的肌肉肥大活動來選擇)來施用。

術語“ActRIIA”和“ActRIIB”是指活化素受體。活化素通過受體絲氨酸激酶的異二聚體復合物傳導信號，所述復合物包括至少兩種I型(I和IB)和兩種II型(IIA和IIB、也稱ACVR2A和ACVR2B)受體。這些受體都是跨膜蛋白，由具有半胱氨酸富集區(qū)的配體結合細胞外結構域、跨膜結構域和具有所預測絲氨酸/蘇氨酸特異性的細胞質(zhì)結構域構成。I型受體為信號傳導所必需，而II型受體為結合配體和表達/募集I型受體所必需。I型和II型受體在配體結合后形成穩(wěn)定復合物，引起II型受體對I型受體的磷酸化?；罨厥荏wII B(ActRIIB)是肌肉抑制素的受體。活化素受體II A(Act RIIA)也是肌肉抑制素的受體。術語ActRIIB或Act IIB受體是指如SEQ ID NO:181(AAC64515.1，GI:3769443)所定義的人類ActRIIB。本領域內(nèi)已知研究級多克隆和單克隆抗ActRIIB抗體，例如由R&DMN,USA制造的那些。當然，抗體可針對其他物種的ActRIIB，且被用于治療那些物種的病理學病況。

術語“免疫響應”是指例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和上述細胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(例如抗體、細胞因子和補體)的作用，所述作用導致選擇性損害、破壞或自人體消除入侵病原體、感染病原體的細胞或組織、癌性細胞或(在自體免疫或病理性發(fā)炎的情形下的)正常人類細胞或組織。

“信號傳導活動”是指通常由蛋白-蛋白相互作用(例如生長因子與受體的結合)引發(fā)的使信號自細胞的一部分傳遞至細胞另一部分的生化因果關系。通常傳遞涉及在引起信號轉導的反應系列中一或多種蛋白質(zhì)的一或多個酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基的特異性磷酸化。倒數(shù)第二個過程通常包括核事件，引起基因表達發(fā)生變化。

術語“抗體”在本文中提及時包括全抗體和其任意抗原結合片段(即“抗原結合部分”)或單鏈。天然存在的“抗體”是糖蛋白，包含由二硫鍵互聯(lián)的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每一重鏈包括重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為V_H)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包括三個結構域：CH1、CH2和CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為V_L)和輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個結構域C_L。V_H和V_L區(qū)可進一步細分成多個超變區(qū)(稱為互補決定區(qū)(CDR))，間雜著更為保守的區(qū)(稱為框架區(qū)(FR))。每一V_H和V_L是由三個CDR和四個FR構成，其自氨基末端至羧基末端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結合結構域?？贵w的恒定區(qū)可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如效應子細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一組分(C1q))的結合。

如本文所使用，術語抗體的“抗原結合部分”(或簡單稱為“抗原部分”)是指全長或抗體的保留了特異性結合到抗原(例如ActRIIB的部分)能力的一或多個片段。已顯示抗體的抗原結合功能可由全長抗體的片段來實施。涵蓋于術語抗體的“抗原結合部分”內(nèi)的結合片段的實例包括Fab片段，即由V_L、V_H、C_L和CH1結構域組成的單價片段；F(ab)₂片段，即包含各自結合相同抗原、在鉸鏈區(qū)由二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；由V_H和CH1結構域組成的Fd片段；由抗體單臂的V_L和V_H結構域組成的Fv片段；由V_H結構域組成的dAb片段(Ward等，1989，Nature 341:544-546)；和經(jīng)分離的互補決定區(qū)(CDR)。

此外，盡管Fv片段的兩個結構域(V_L和V_H)由單獨基因編碼，但可使用重組方法通過合成接頭使該兩個結構域連接在一起，該合成接頭使該兩個結構域能夠被制備成其中V_L與V_H區(qū)配對形成單價分子的單一蛋白鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；例如參見Bird等，1988Science 242:423-426；和Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。這些單鏈抗體也被涵蓋于術語抗體的“抗原結合區(qū)”內(nèi)。這些抗體片段使用本領域技術人員已知的常用技術來獲得，且這些片段經(jīng)篩選以與完整抗體相同的方式使用。

如本文所使用，“經(jīng)分離抗體”是指抗體實質(zhì)上不含具有不同抗原特異性的其它抗體(例如特異性結合ActRIIB的經(jīng)分離抗體實質(zhì)上不含特異性結合ActRIIB以外抗原的抗體)。然而，特異性結合ActRIIB的經(jīng)分離抗體可能與其他抗原(例如來自其他物種的ActRIIB分子)具有交叉反應性。此外，經(jīng)分離抗體可以實質(zhì)上不含其他細胞材料和/或化學品。

術語“交叉阻斷(cross-block、cross-blocked和cross-blocking)”在本文中可互換使用，意指在標準競爭性結合分析中抗體或其他結合劑干擾其他抗體或結合劑結合ActRIIB、特別是配體結合結構域的能力。

如本文所使用的術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指具有單一分子組成的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物展示針對特定表位的單一結合特異性和親和力。

如本文所使用，術語“人類抗體”包括具有可變區(qū)的抗體，其中框架區(qū)和CDR區(qū)二者都源自人類來源的序列。另外，如果抗體含有恒定區(qū)，則該恒定區(qū)也源自這些人類序列，例如人類種系序列或人類種系序列的突變形式或含有源自人類框架序列分析的一致性框架序列的抗體(例如，如Knappik等(2000.J Mol Biol 296,57-86所述)。本公開的人類抗體可包括并非由人類序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外的隨機誘變或定點誘變或通過體內(nèi)體細胞突變而引入的突變)。然而，如本文所使用的術語“人類抗體”并不包括有源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)種系的CDR序列被移植至人類框架序列上的抗體。

術語“人類單克隆抗體”是指展示單一結合特異性的抗體，其可變區(qū)中框架區(qū)和CDR區(qū)都源自人類序列。在一個實施方式中，人類單克隆抗體是由雜交瘤產(chǎn)生，該雜交瘤所含與永生細胞融合的B細胞獲自轉基因非人類動物(例如轉基因小鼠)，該轉基因非人類動物的基因組具有包含人類重鏈轉基因和輕鏈轉基因。

如本文所使用的術語“重組人類抗體”包括通過重組方式制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有人類抗體，例如分離自就人類免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或自其制備的雜交瘤的抗體，分離自經(jīng)轉化以表達人類抗體的宿主細胞(例如自轉染瘤)的抗體，分離自重組、組合人類抗體文庫的抗體，以及通過涉及將人類免疫球蛋白基因、序列的全部或部分剪接至其他DNA序列的任何其他方式來制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人類抗體具有的可變區(qū)中框架區(qū)和CDR區(qū)源自人類種系免疫球蛋白序列。然而，在某些實施方式中，可使這些重組人類抗體經(jīng)歷體外誘變(或當使用就人類Ig序列的轉基因動物時經(jīng)歷體內(nèi)體細胞誘變)，因此盡管源自人類種系V_H和V_L序列及與其相關，重組抗體V_H和V_L區(qū)的氨基酸序列是可以不天然存在于體內(nèi)人類抗體種系譜內(nèi)的序列。

如本文所使用的“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因提供的抗體類別(例如IgM、IgE、IgG(例如IgG1或IgG2))。

片語“識別抗原的抗體”和“對抗原具有特異性的抗體”在本文中可與術語“特異性結合抗原的抗體”互換使用。

如本文所使用，“特異性結合ActRIIB多肽”的抗體指以約100nM或更小、約10nM或更小、約1nM或更小的K_D結合人類ActRIIB多肽的抗體。“與ActRIIB外的抗原交叉反應”的抗體指以約10×10^-9M或更小、約5×10^-9M或更小或約2×10^-9M或更小的K_D結合該抗原的抗體?！安慌c具體抗原交叉反應”的抗體指以約1.5×10^-8M或更大的K_D或約5-10×10^-8M或約1×10^-7M或更大的K_D結合該抗原的抗體。在某些實施方式中，在標準結合分析中，不與抗原交叉反應的這些抗體展現(xiàn)出針對這些蛋白質(zhì)本質(zhì)上不可檢測的結合。K_D可使用生物傳感器系統(tǒng)(例如系統(tǒng))或溶液平衡滴定來測定。

如本文所使用，術語“拮抗劑抗體”指在肌肉抑制素或其他ActRIIB配體(例如活化素或GDF-11)存在下能抑制由ActRIIB誘導的信號傳導活動的抗體和/或在肌肉抑制素或其他ActRIIA配體(例如活化素或GDF-11)存在下能抑制由ActRIIA誘導的信號傳導活動的抗體。用于檢測此的分析的實例包括抑制肌肉抑制素誘導的信號傳導(例如通過Smad依賴性報告基因分析)、抑制肌肉抑制素誘導的Smad磷酸化(P-Smad ELISA)和抑制肌肉抑制素誘導的骨骼肌細胞分化抑制(例如通過肌酸激酶分析)。

在一些實施方式中，如Smad依賴性報告基因分析中所測量，這些抗體以約10nM或更小、約1nM或更小或約100pM或更小的IC₅₀抑制了肌肉抑制素誘導的信號傳導。

如本文所使用，“無激動活性”的抗體指在基于細胞的分析中，在肌肉抑制素不存在時不顯著增加ActRIIB介導的信號傳導活性的抗體，例如抑制肌肉抑制素誘導的信號傳導(例如通過Smad依賴性報告基因分析)、抑制肌肉抑制素誘導的Smad磷酸化(P-Smad ELISA)和抑制肌肉抑制素誘導的骨骼肌細胞分化的抑制(例如通過肌酸激酶分析)。這些分析更詳細地闡述于下文實例中。

如本文所使用，術語“K_締合”或“K_a”指特定抗體-抗原相互作用的締合速率，而如本文所使用的術語“K_解離”或“K_d”指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所使用，術語“K_D”指解離常數(shù)，其從K_d對K_a的比率(即K_d/K_a)獲得且以摩爾濃度(M)表示?？贵w的K_D值可使用本領域內(nèi)已確定的方法測定。用于測定抗體K_D的一種方法是使用表面等離子共振，例如的生物傳感器系統(tǒng)，或者溶液平衡滴定(SET)(參見Friguet B等(1985)J.Immunol Methods；77(2):305-319，和Hanel C等(2005)Anal Biochem；339(1):182-184)。

如本文所使用，術語“親和力”是指單一抗原位點處抗體與抗原之間相互作用的強度。在每一抗原位點內(nèi)，抗體“臂”的可變區(qū)通過弱非共價力在多個位點處與抗原相互作用；相互作用愈大，則親和力愈強。

如本文所使用，術語“親合力”是指抗體-抗原復合物的總體穩(wěn)定性或強度的有用量度。其受控于三個主要因素：抗體表位親和力；抗原和抗體二者的化合價；以及相互作用部分的結構排列。最終，這些因素定義抗體的特異性，即特定抗體結合精確抗原表位的可能性。

如本文所使用，術語“ADCC”或“抗體依賴性細胞毒性”活性是指人類B細胞耗減活動。ADCC活性可通過本領域內(nèi)已知的人類B細胞耗減分析來測量。

為獲得較高親合力探針，可構建二聚偶聯(lián)物(兩分子抗體蛋白偶合至FACS標記物)，因此更容易通過FACS檢測到低親和力相互作用(例如與種系抗體)。此外，增加抗原結合親合力的另一方式涉及產(chǎn)生本文所述抗ActRIIB抗體的任意構建體的二聚體、三聚體或多聚體。這些多聚體可通過個體模塊之間的共價結合(例如通過模仿天然C至N末端結合或通過模仿通過其恒定區(qū)連接在一起的抗體二聚體)來產(chǎn)生。在Fc/Fc界面改造的鍵可為共價或非共價的。另外，除Fc外的二聚或多聚配偶體可用于ActRIIB雜合體中以產(chǎn)生這些高階結構。例如可使用多聚結構域，例如WO2004/039841中所闡述的三聚結構域或WO98/18943中所闡述的五聚結構域。

如本文所使用，術語抗體的“選擇性”是指結合某些靶多肽但不結合密切相關多肽的抗體。

如本文所使用，術語抗體的“高親和力”是指對靶抗原的K_D為1nM或更小的抗體。如本文所使用，術語“個體”包括任何人類或非人類動物。

術語“非人類動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。

如本文所使用，術語“優(yōu)化的”意指核苷酸序列經(jīng)改變以編碼氨基酸序列，其所用密碼子在生產(chǎn)用細胞或有機體中是優(yōu)選，生產(chǎn)用有機體通常為真核細胞(例如畢赤酵母屬細胞、木霉屬細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人類細胞)。優(yōu)化的核苷酸序列經(jīng)改造以完全或盡可能多地保留由起始核苷酸序列原始編碼的氨基酸序列，也稱為“親代”序列。本文的優(yōu)化序列已經(jīng)改造以具有在CHO哺乳動物細胞中優(yōu)選的密碼子，然而本文也設想這些序列在其他真核細胞中的優(yōu)化表達。由優(yōu)化核苷酸序列編碼的氨基酸序列也稱為被優(yōu)化的。

詳細內(nèi)容

已發(fā)現(xiàn)針對ActRII受體的抗體(例如比麥單抗)可阻止肌肉抑制素結合受體，由此改善或加速髖部骨折術患者的恢復。

因此，在一方面，本公開提供組合物，其包含肌肉抑制素拮抗劑，例如肌肉抑制素結合分子或ActRII結合分子，優(yōu)選ActRII結合分子，更優(yōu)選抗ActRII抗體，例如比麥單抗或包含該抗體的抗原結合部分的功能蛋白供應用。在一個實施方式中，ActRIIB是人類ActRIIB。人類ActRIIB的多肽序列記錄于SEQ ID NO:181(AAC64515.1,GI:3769443)中。在一個實施方式中，抗體或功能蛋白是來自哺乳動物，具有例如人類或駱駝科動物起源。因此，所公開組合物中包含的抗體可為嵌合、人類或人源化抗體。在一個特定的實施方式中，所公開組合物中包含的抗ActRIIB抗體表征為含有對靶蛋白ActRIIB具有特異性且結合ActRIIB或ActRIIB片段的抗原結合區(qū)。

在一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體是不具有或具有低激動活性的ActRII拮抗劑。在另一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體或功能片段結合靶蛋白ActRII，且將肌肉抑制素與ActRII的結合減少至基底水平。在此實施方式的另一方面，所公開組合物中包含的抗體或功能片段完全阻止肌肉抑制素結合ActRII。在另一個實施方式中，所公開組合物中所包含的抗體或功能片段抑制Smad活化。在另一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體或功能片段通過Smad依賴性路徑抑制IIB型活化素受體介導的肌肉抑制素誘導性骨骼分化抑制。

所述結合可通過一或多種可用于測量抗體的拮抗作用或激動作用活性的分析來測定。優(yōu)選地，這些分析測量抗體對ActRIIB的至少一種效應，包括：抑制肌肉抑制素與ActRIIB的結合(通過ELISA測量)、抑制肌肉抑制素誘導的信號傳導(例如通過Smad依賴性報告基因分析)、抑制肌肉抑制素誘導的Smad磷酸化(P-Smad ELISA)和抑制肌肉抑制素誘導的骨骼肌細胞分化抑制(例如通過肌酸激酶分析)。

在一個實施方式中，本公開提供包含特異性結合ActRIIB肌肉抑制素結合區(qū)(即配體結合結構域)的抗體的組合物。此配體結合結構域是由SEQ ID NO:181的氨基酸19-134組成，且在本文中已編為SEQ ID NO:182。配體結合結構域包括若干下文所闡述的表位。

在一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體以約100nM或更小、約10nM或更小、約1nM或更小的K_D結合ActRIIB。優(yōu)選地，所公開組合物中包含的抗體以100pM或更小(即約100pM、約50pM、約10pM、約2pM、約1pM或更小)的親和力結合ActRIIB。在一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體以介于約1pM與約10pM之間的親和力結合ActRIIB。

在一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體不與ActRIIB相關蛋白交叉反應，尤其不與人類ActRIIA(NP_001607.1,GI:4501897)交叉反應。在另一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體與ActRIIA交叉反應，且結合ActRIIB的親和力與結合ActRIIA的親和力相當或是后者的約1、2、3、4或5倍、更優(yōu)選約10倍、仍更優(yōu)選約20倍、30倍、40倍或50倍、仍更優(yōu)選約100倍。

在一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體以100pM或更大(即約250pM、約500pM、約1nM、約5nM或更大)的親和力結合ActRIIA。

在一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體具有IgG₂同種型。

在另一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體具有IgG₁同種型。在另一個實施方式中，所公開組合物中包含的抗體具有IgG1同種型，且具有通過Fc區(qū)突變而改變的效應子功能。所述經(jīng)改變的效應子功能可以是降低的ADCC和CDC活性。在一個實施方式中，所述經(jīng)改變的效應子功能是沉默的ADCC和CDC活性。

在另一個相關實施方式中，所公開組合物中含的抗體是不具抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性或CDC活性的完整人類或人源化IgG1抗體，且結合由SEQ ID NO:181的氨基酸19-134組成的ActRIIB區(qū)。

在另一個相關實施方式中，所公開組合物中所包含的抗體是抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性或CDC活性降低的完整人類或人源化IgG1抗體，且結合由SEQ ID NO:181的氨基酸19-134組成的ActRIIB區(qū)。

本發(fā)明也關于包含人類或人源化抗ActRIIB抗體的組合物，其用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)。

在某些實施方式中，所公開組合物中包含的抗體源自特定重鏈和輕鏈序列和/或包含特定結構特征，例如含特定氨基酸序列的CDR區(qū)。本公開提供經(jīng)分離的ActRIIB抗體，制備此類抗體的方法，含此類抗體的免疫偶聯(lián)物和多價或多特異性分子以及含有所述抗體、免疫偶聯(lián)物或雙特異性分子的藥用組合物。

在替代的實施方式中，本公開關于以下方面：

1.一種肌肉抑制素拮抗劑，供應用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)的。

2.如方面1供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑在確認髖部修復手術成功和傷口愈合后施用。

3.如方面1或2中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中在有或沒有助步器情況下能進行負重步行且能開始身體復健的患者中施用所述肌肉抑制素拮抗劑。

4.如方面1-3供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑在手術后7-42天或約1-6周、優(yōu)選14-42天、或約2-6周、最多8周開始施用。

5.如方面1-4中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑以約3-10mg/kg的劑量施用于有需要的患者。

6.如方面5供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑以約3mg/kg體重或約10mg/kg體重的劑量施用。

或者，所述肌肉抑制素拮抗劑以約3、4、5、6、7、8、9或約10mg/kg體重的劑量施用。

7.如方面1-3中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑以約70-700mg的劑量施用于有需要的患者。

8.如方面5供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑以約210mg或約700mg的劑量施用。

或者，所述肌肉抑制素拮抗劑以約210mg、280mg、300mg、350mg、400mg、420mg、450mg、490mg、500mg、550mg、560mg、600mg、630mg或約700mg的劑量施用。

9.如方面1-8供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑經(jīng)靜脈內(nèi)施用。

10.如方面1-9中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑每四周施用。

或者，所述肌肉抑制素拮抗劑可每8周施用。

11.如方面1-10中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑施用至少3個月。

12.如方面1-11中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑施用約6個月。

13.如方面1-11中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述肌肉抑制素拮抗劑施用最長達12個月。

優(yōu)選地，所述肌肉抑制素拮抗劑施用至少或最長達3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月。

14.如前述方面中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中施用所述肌肉抑制素以加速/改善失用性萎縮患者身體恢復(所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā))意味著增強肌肉生長、增加肌肉強度和身體性能、改善自我感知移動性、加速恢復至獨立以及降低跌倒和傷害性跌倒的風險。

15.一種加速/改善失用性萎縮患者身體恢復的方法，所述失用性萎縮由髖部骨折和用于骨折修復的后續(xù)大手術而造成移動性降低所引發(fā)，包含施用肌肉抑制素拮抗劑。

16.如方面15的方法，包含在確認髖部修復手術成功和傷口愈合后施用肌肉抑制素拮抗劑。

17.如方面16的方法，包含在手術后約7-42天或約1-6周、優(yōu)選14-42天或約2-6周、最多8周開始施用所述肌肉抑制素拮抗劑。

18.如方面15-17中任意一項的方法，包含對能在有或沒有助步器情況下進行負重步行且開始身體復健的患者開始施用所述肌肉抑制素拮抗劑。

19.如方面15-18中任意一項的方法，包含以約3-10mg/kg的劑量向有需要的患者施用所述肌肉抑制素拮抗劑。

20.如方面15-19中任意一項的方法，包含以約3mg/kg體重或約10mg/kg體重的劑量向有需要的患者施用所述肌肉抑制素拮抗劑。

21.如方面15-20中任意一項的方法，包含經(jīng)靜脈內(nèi)施用所述肌肉抑制素拮抗劑。

22.如方面15-21中任意一項的方法，包含每4周施用所述肌肉抑制素拮抗劑。

23.如方面15-22中任意一項的方法，包含施用所述肌肉抑制素拮抗劑至少3個月。

24.如方面15-23中任意一項的方法，包含施用所述肌肉抑制素拮抗劑至少6個月。

25.如方面23的方法，包含施用所述肌肉抑制素拮抗劑長達12個月。

26.如方面15-25中任意一項的方法，其中加速/改善失用性萎縮患者身體恢復(所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā))意味著增強的肌肉生長、增加的肌肉強度和身體性能、改善的自我感知移動性、加速的恢復至獨立和降低的跌倒和傷害性跌倒風險。

27.如方面1-26中任意一項使用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述肌肉抑制素拮抗劑是肌肉抑制素受體結合分子。

28.如方面1-27中任意一項使用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述肌肉抑制素拮抗劑是ActRII受體拮抗劑。

29.如方面1-28中任意一項使用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述肌肉抑制素拮抗劑是抗ActRII受體抗體。

30.如方面1-29中任意一項的供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗ActRII受體抗體是比麥單抗。

31.如方面29的供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述肌肉抑制素拮抗劑是結合由SEQ ID NO:181的氨基酸19-134(SEQ ID NO:182)組成的ActRIIB表位的抗ActRII抗體。

32.如方面29-31中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗ActRII抗體結合的ActRIIB包含以下序列或由以下序列組成：

(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；

(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；

(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；

(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；

(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；

(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；

(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或

(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)。

33.如方面29-32中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述抗ActRIIB抗體選自下組：

a)抗ActRIIB抗體，其結合的ActRIIB表位包含以下序列：

(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；

(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；

(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；

(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；

(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；

(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；

(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或

(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)

；和b)針對ActRIIB的拮抗劑抗體，其結合的ActRIIB表位包含以下序列：

(a)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；

(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；

(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；

(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；

(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；

(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT–SEQ ID NO:191)；

(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN–SEQ ID NO:192)；或

(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)，

其中所述抗體具有約2pM的K_D。

34.如方面29-33中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗體結合ActRIIB的親和力是其與ActRIIA結合親和力的10倍或更大。

35.如方面29-34中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)CDR1，其包含選自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID NO:29-42的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)CDR1，其包含選自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NO:57-70的氨基酸序列；和輕鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列。

36.如方面29-35中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗體包含：

(a)SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:15的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:29的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:43的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:57的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:71的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(b)SEQ ID NO:2的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:16的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:30的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:44的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:58的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:72的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(c)SEQ ID NO:3的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:17的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:31的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:45的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:59的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:73的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(d)SEQ ID NO:4的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:18的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:32的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:46的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:60的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:74的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(e)SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:19的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:33的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:47的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:61的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:75的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(f)SEQ ID NO:6的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:20的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:34的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:48的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:62的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:76的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(g)SEQ ID NO:7的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:35的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:49的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:63的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:77的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(h)SEQ ID NO:8的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:22的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:36的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:50的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:64的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:78的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(i)SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:37的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:51的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:65的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:79的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(j)SEQ ID NO:10的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:24的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:38的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:52的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:66的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:80的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(k)SEQ ID NO:11的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:25的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:39的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:53的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:67的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:81的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(l)SEQ ID NO:12的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:26的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:40的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:54的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:68的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:82的輕鏈可變區(qū)CDR3，

(m)SEQ ID NO:13的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:27的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:41的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:55的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:69的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:83的輕鏈可變區(qū)CDR3，或

(n)SEQ ID NO:14的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:28的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:42的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:56的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:70的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:84的輕鏈可變區(qū)CDR3。

37.如方面29-36中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗體包含的全長重鏈氨基酸序列與選自SEQ ID NO:146-150和156-160的至少一個序列具有至少95％序列一致性。

38.如方面29-37中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗體包含的全長輕鏈氨基酸序列與選自SEQ ID NO:141-145和151-155的至少一個序列具有至少95％序列一致性。

39.如方面29-38中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗體包含：

(a)SEQ ID NO:99的可變重鏈序列和SEQ ID NO:85的可變輕鏈序列；

(b)SEQ ID NO:100的可變重鏈序列和SEQ ID NO:86的可變輕鏈序列；

(c)SEQ ID NO:101的可變重鏈序列和SEQ ID NO:87的可變輕鏈序列；

(d)SEQ ID NO:102的可變重鏈序列和SEQ ID NO:88的可變輕鏈序列；

(e)SEQ ID NO:103的可變重鏈序列和SEQ ID NO:89的可變輕鏈序列；

(f)SEQ ID NO:104的可變重鏈序列和SEQ ID NO:90的可變輕鏈序列；

(g)SEQ ID NO:105的可變重鏈序列和SEQ ID NO:91的可變輕鏈序列；

(h)SEQ ID NO:106的可變重鏈序列和SEQ ID NO:92的可變輕鏈序列；

(i)SEQ ID NO:107的可變重鏈序列和SEQ ID NO:93的可變輕鏈序列；

(j)SEQ ID NO:108的可變重鏈序列和SEQ ID NO:94的可變輕鏈序列；

(k)SEQ ID NO:109的可變重鏈序列和SEQ ID NO:95的可變輕鏈序列；

(l)SEQ ID NO:110的可變重鏈序列和SEQ ID NO:96的可變輕鏈序列；

(m)SEQ ID NO:111的可變重鏈序列和SEQ ID NO:97的可變輕鏈序列；或

(n)SEQ ID NO:112的可變重鏈序列和SEQ ID NO:98的可變輕鏈序列。

40.如方面29-39中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑或方法，其中所述抗體包含：

(a)SEQ ID NO:146的重鏈序列和SEQ ID NO:141的輕鏈序列；

(b)SEQ ID NO:147的重鏈序列和SEQ ID NO:142的輕鏈序列；

(c)SEQ ID NO:148的重鏈序列和SEQ ID NO:143的輕鏈序列；

(d)SEQ ID NO:149的重鏈序列和SEQ ID NO:144的輕鏈序列；

(e)SEQ ID NO:150的重鏈序列和SEQ ID NO:145的輕鏈序列；

(f)SEQ ID NO:156的重鏈序列和SEQ ID NO:151的輕鏈序列；

(g)SEQ ID NO:157的重鏈序列和SEQ ID NO:152的輕鏈序列；

(h)SEQ ID NO:158的重鏈序列和SEQ ID NO:153的輕鏈序列；

(i)SEQ ID NO:159的重鏈序列和SEQ ID NO:154的輕鏈序列；或

(j)SEQ ID NO:160的重鏈序列和SEQ ID NO:155的輕鏈序列。

41.如方面29-40中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述組合物中包含的抗體交叉阻斷至少一種如方面36的抗體與ActRIIB的結合或被至少一種如方面36的抗體交叉阻斷與ActRIIB的結合。

42.如方面29-41中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述組合物中包含的抗體具有通過Fc區(qū)突變改變的效應子功能。

43.如方面29-42中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述組合物中包含的抗體結合由方面39-40中所列抗體識別的表位。

44.如方面29-43中任意一項供應用的肌肉抑制素拮抗劑，其中所述抗體是由pBW522(DSM22873)或pBW524(DSM22874)編碼。

45.比麥單抗，供應用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)，其中比麥單抗以約3-10mg/kg體重的劑量每四周經(jīng)靜脈內(nèi)施用。

46.比麥單抗，其供應用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)，其中比麥單抗以約3mg/kg體重的劑量每四周經(jīng)靜脈內(nèi)施用。

47.比麥單抗，其供應用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)，其中比麥單抗以約10mg/kg體重的劑量每四周經(jīng)靜脈內(nèi)施用。

48.一種組合物，其包含150mg/ml的比麥單抗，供應用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復的方法中，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)。

49.一種單一劑型，其包含150mg/ml的比麥單抗。

在其他實施方式中，所述單一劑型(即小瓶)包含100-200mg/ml的比麥單抗，優(yōu)選100mg/ml、105mg/ml、110mg/ml、115mg/ml、120mg/ml、125mg/ml、130mg/ml、135mg/ml、140mg/ml、145mg/ml、150mg/ml、155mg/ml、160mg/ml、165mg/ml、170mg/ml、175mg/ml、180mg/ml、185mg/ml、190mg/ml、195mg/ml、200mg/ml的比麥單抗。

50.一種輸液袋，其包含來自一或多瓶經(jīng)溶液稀釋的適量比麥單抗。

該溶液優(yōu)選是右旋糖溶液。

在一些其他的實施方式中，肌肉抑制素拮抗劑、優(yōu)選AcRII拮抗劑或抗ActRII抗體(例如比麥單抗)以約1mg/kg體重、2mg/kg體重、3mg/kg體重、4mg/kg體重、5mg/kg體重、6mg/kg體重、7mg/kg體重、8mg/kg體重、9mg/kg體重、10mg/kg體重的劑量施用。

本文公開的是用于制造藥物的肌肉抑制素拮抗劑，該藥物用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)。

在其他實施方式中，本文公開的所有方面都可以組合其一與任意其它來使用。

本公開的多個方面進一步詳細闡述于以下子部分中。本領域已知用于評估抗體對不同物種ActRII的結合能力的標準分析，包括(例如)ELISA、蛋白質(zhì)印跡和RIA。合適的分析詳細闡述于實施例中。抗體的結合親和力也可通過本領域內(nèi)已知的標準分析、例如通過Biacore分析或溶液平衡滴定來評價?；诒砻娴入x子共振的技術(例如Biacore)可測定能計算結合親和力的結合動力學。用于評估抗體對ActRIIB功能特性的效應(例如受體結合、阻止或誘導人類B細胞增殖或IgG產(chǎn)生)的分析進一步詳細闡述于實施例中。

因此，如根據(jù)本領域內(nèi)已知的方法測定并在本文中闡述的“抑制”這些ActRII功能特性(例如生物化學、免疫化學、細胞、生理學或其他生物活性等)中的一或多個的抗體與特定活性應理解為關聯(lián)有相對于在抗體不存在(例如，或存在不相關特異性的對照抗體時)所觀察到活性的統(tǒng)計學上顯著的降低。抑制ActRII活性的抗體影響所測量參數(shù)統(tǒng)計學上顯著減小至少10％、至少50％、80％或90％，且在某些實施方式中，本公開的抗體可抑制超過95％、98％或99％的ActRII功能活性。

可以使用標準競爭性結合分析來測定抗體或其他結合劑能夠干擾另一抗體或結合分子與ActRII結合的能力或程度，并由此測定其根據(jù)本公開是否可稱為交叉阻斷。一種合適的分析涉及使用Biacore技術(例如通過使用BIAcore儀器(Biacore,Uppsala,Sweden))，其可使用表面等離子共振技術來測量相互作用程度。用于測量交叉阻斷的另一分析使用基于ELISA的方法。另一分析使用FACS分析，其中測試不同抗體競爭結合ActRIIB表達型細胞(例如闡述于實施例中)。

根據(jù)本公開，在所闡述的BIAcore交叉阻斷分析中本公開的交叉阻斷抗體或其他結合劑結合ActRII，以使得抗體或結合劑的組合(混合物)的所記錄的結合介于組合中兩種抗體或結合劑的最大理論結合的80％與0.1％(例如80％-4％)之間，特定地介于最大理論結合的75％與0.1％(例如75％-4％)之間，且更特定地介于最大理論結合的70％與0.1％(例如70％-4％)之間，且更特定地介于65％與0.1％(例如65％-4％)之間(如上文所定義)。

在ELISA分析中，如果與陽性對照孔(即相同的抗ActRIIB抗體和ActRIIB，但無“測試”的交叉阻斷抗體)相比，測試抗體能夠引起抗ActRII抗體與ActRIIB的結合減少介于60％與100％之間、特定地介于70％與100％之間、且更特定地介于80％與100％之間，則將該測試抗體定義為交叉阻斷本公開的抗ActRIIB抗體。如本文所引用的交叉阻斷抗體的實例是MOR08159和MOR08213(公開于WO2010/125003中)。因此，本公開提供如下組合物，其包含交叉阻斷MOR08159或MOR08213與ActRIIB結合的抗體。

重組抗體

用于本公開的組合物中所含抗體(例如針對ActRII的拮抗劑抗體，例如比麥單抗)包括人類重組抗體，其如實施例中所闡述進行分離和結構表征。本發(fā)明組合物中所包含抗體的V_H氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:99-112中。本發(fā)明組合物中所包含抗體的V_L氨基酸序列分別顯示于SEQ ID NO:85-98中。本發(fā)明組合物中所包含抗體的優(yōu)選全長重鏈氨基酸序列的實施例顯示于SEQ ID NO:146-150和156-160中。本發(fā)明組合物中所包含抗體的優(yōu)選全長輕鏈氨基酸序列的實施例分別顯示于SEQ ID NO:141-145和151-155中。本發(fā)明組合物中所包含的其他抗體包括已通過氨基酸缺失、插入或替代而突變、但在CDR區(qū)中與上述序列中所示CDR區(qū)具有至少60％、70％、80％、90％、95％、97％或99％一致性的氨基酸。在一些實施方式中包括突變體氨基酸序列，其中當與上述序列中所示CDR區(qū)相比時，不超過1個、2個、3個、4個或5個氨基酸已通過CDR區(qū)中的氨基酸缺失、插入或替代而突變。

此外，可變重鏈親代核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:127-140中?？勺冚p鏈親代核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:113-126中。經(jīng)優(yōu)化以在哺乳動物細胞中表達的全長輕鏈核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:161-165和171-175中。經(jīng)優(yōu)化以在哺乳動物細胞中表達的全長重鏈核苷酸序列顯示于SEQ ID NO:166-170和176-180中。本發(fā)明組合物中所包含的其他抗體包括由已經(jīng)突變、但仍與上述序列具有至少60％或更高(即80％、90％、95％、97％、99％或更高)一致性的核酸編碼的氨基酸。在一些實施方式中包括突變體氨基酸序列，其中當與上述序列中所示可變區(qū)相比時，不超過1個、2個、3個、4個或5個氨基酸已通過可變區(qū)中的氨基酸缺失、插入或替代而突變。

由于這些抗體中的每一個都結合相同表位且是來自相同親代抗體的子代，所以可“混合搭配”V_H、V_L、全長輕鏈和全長重鏈序列(核苷酸序列和氨基酸序列)以產(chǎn)生本公開的其他抗ActRIIB結合分子。可使用上文和實例中所闡述的結合分析法(例如ELISA)來測試這些“混合搭配”抗體的ActRIIB結合性。當混合搭配這些鏈時，來自特定V_H/V_L配對的V_H序列應更換為結構類似的V_H序列。同樣地，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對的全長重鏈序列應更換為結構類似的全長重鏈序列。同樣地，來自特定V_H/V_L配對的V_L序列應更換為結構類似的V_L序列。同樣地，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對的全長輕鏈序列應更換為結構類似的全長輕鏈序列。因此，在一個方面，本公開提供的組合物包含具有以下要素的重組抗ActRII抗體或其抗原結合區(qū)：重鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NO:99-112的氨基酸序列；和輕鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NO:85-98的氨基酸序列。

在另一方面，本公開提供組合物，其包含：

(i)經(jīng)分離重組抗ActRII抗體，其具有包含選自SEQ ID NO:99-112的氨基酸序列的全長重鏈；和包含選自SEQ ID NO:85-98的氨基酸序列的全長輕鏈，或

(ii)包含其抗原結合部分的功能蛋白。

在另一方面，本公開提供組合物，其包含：

(i)經(jīng)分離重組抗ActRII抗體，其具有由已經(jīng)優(yōu)化以在哺乳動物細胞中表達且選自SEQ ID NO:127-140的核苷酸序列編碼的全長重鏈和由已經(jīng)優(yōu)化以在哺乳動物細胞中表達且選自SEQ ID NO:113-126的核苷酸序列編碼的全長輕鏈，或

(ii)包含其抗原結合部分的功能蛋白。

本發(fā)明組合物中所包含的抗體的V_H CDR1的氨基酸序列的示例顯示于SEQ ID NO:1-14中?？贵w的V_H CDR2的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:15-28中?？贵w的V_H CDR3的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:29-42中?？贵w的V_L CDR1的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:43-56中?？贵w的V_L CDR2的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:57-70中?？贵w的V_L CDR3的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO:71-84中。使用Kabat系統(tǒng)描繪CDR區(qū)(Kabat,E.A.等，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美國衛(wèi)生和公共服務部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版物第91-3242號)。測定CDR區(qū)的替代方法使用由Chothia設計的方法(Chothia等1989,Nature,342:877-883)。Chothia定義是基于結構環(huán)區(qū)的位置。然而，由于Chothia所使用的編號系統(tǒng)發(fā)生變化(參見例如http://www.biochem.ucl.ac.uk/～martin/abs/GeneralInfo.html和http://www.bioinf.org.uk/abs/)，該系統(tǒng)現(xiàn)在較不常用。存在用于定義CDR的其他系統(tǒng)，且也在該兩個網(wǎng)站上有所提及。

鑒于這些抗體中的每一個都可以結合ActRII且抗原結合特異性主要是由CDR1區(qū)、2區(qū)和3區(qū)提供，可“混合搭配”V_H CDR1、2和3序列以及V_L CDR1、2和3序列(即可混合搭配來自不同抗體的CDR)，含有V_H CDR1、2和3和V_L CDR1、2和3的每一抗體產(chǎn)生本公開的其他抗ActRII結合分子?？墒褂蒙衔暮蛯嵤├兴U述的結合分析(例如ELISA)來測試這些“混合搭配”抗體的ActRIIB結合。當混合搭配V_H CDR序列時，來自特定V_H序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列應更換為結構類似的CDR序列。同樣地，當混合搭配V_L CDR序列時，來自特定V_L序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列應更換為結構類似的CDR序列。本領域技術人員將容易了解可通過使一或多個V_H和/或V_L CDR區(qū)序列用來自本文所示單克隆抗體CDR序列的結構類似序列替代來產(chǎn)生新型的V_H和V_L序列。

所公開組合物中包含的抗ActRII抗體或其抗原結合區(qū)具有：重鏈可變區(qū)CDR1，其包含選自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID NO:29-42的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)CDR1，其包含選自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)CDR2，其包含選自SEQ ID NO:57-70的氨基酸序列；和輕鏈可變區(qū)CDR3，其包含選自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:1的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:15的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:29的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:43的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:57的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:71的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:2的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:16的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:30的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:44的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:58的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:72的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:3的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:17的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:31的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:45的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:59的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:73的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:4的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:18的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:32的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:46的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:60的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:74的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:5的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:19的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:33的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:47的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:61的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:75的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:6的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:20的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:34的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:48的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:62的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:76的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:7的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:21的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:35的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:49的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:63的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:77的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:8的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:22的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:36的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:50的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:64的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:78的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:9的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:23的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:37的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:51的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:65的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:79的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:10的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:24的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:38的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:52的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:66的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:80的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:11的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:25的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:39的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:53的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:67的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:81的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:12的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:26的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:40的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:54的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:68的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:82的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:13的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:27的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:41的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:55的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:69的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:83的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體包含：SEQ ID NO:14的重鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:28的重鏈可變區(qū)CDR2；SEQ ID NO:42的重鏈可變區(qū)CDR3；SEQ ID NO:56的輕鏈可變區(qū)CDR1；SEQ ID NO:70的輕鏈可變區(qū)CDR2；和SEQ ID NO:84的輕鏈可變區(qū)CDR3。

在一個實施方式中，本公開提供包含包含以下序列的抗體的組合物：(a)SEQ ID NO:85的可變重鏈序列和SEQ ID NO:99的可變輕鏈序列；(b)SEQ ID NO:86的可變重鏈序列和SEQ ID NO:100的可變輕鏈序列；(c)SEQ ID NO:87的可變重鏈序列和SEQ ID NO:101的可變輕鏈序列；(d)SEQ ID NO:88的可變重鏈序列和SEQ ID NO:102的可變輕鏈序列；(e)SEQ ID NO:89的可變重鏈序列和SEQ ID NO:103的可變輕鏈序列；(f)SEQ ID NO:90的可變重鏈序列和SEQ ID NO:104的可變輕鏈序列；(g)SEQ ID NO:91的可變重鏈序列和SEQ ID NO:105的可變輕鏈序列；(h)SEQ ID NO:92的可變重鏈序列和SEQ ID NO:106的可變輕鏈序列；(i)SEQ ID NO:93的可變重鏈序列和SEQ ID NO:107的可變輕鏈序列；(j)SEQ ID NO:94的可變重鏈序列和SEQ ID NO:108的可變輕鏈序列；(k)SEQ ID NO:95的可變重鏈序列和SEQ ID NO:109的可變輕鏈序列；(l)SEQ ID NO:96的可變重鏈序列和SEQ ID NO:110的可變輕鏈序列；(m)SEQ ID NO:97的可變重鏈序列和SEQ ID NO:111的可變輕鏈序列；或(n)SEQ ID NO:98的可變重鏈序列和SEQ ID NO:112的可變輕鏈序列。

在一個實施方式中，本公開提供包含包含以下序列的抗體的組合物：(a)SEQ ID NO:146的重鏈序列和SEQ ID NO:141的輕鏈序列；(b)SEQ ID NO:147的重鏈序列和SEQ ID NO:142的輕鏈序列；(c)SEQ ID NO:148的重鏈序列和SEQ ID NO:143的輕鏈序列；(d)SEQ ID NO:149的重鏈序列和SEQ ID NO:144的輕鏈序列；(e)SEQ ID NO:150的重鏈序列和SEQ ID NO:145的輕鏈序列；(f)SEQ ID NO:156的重鏈序列和SEQ ID NO:151的輕鏈序列；(g)SEQ ID NO:157的重鏈序列和SEQ ID NO:152的輕鏈序列；(h)SEQ ID NO:158的重鏈序列和SEQ ID NO:153的輕鏈序列；(i)SEQ ID NO:159的重鏈序列和SEQ ID NO:154的輕鏈序列；或(j)SEQ ID NO:160的重鏈序列和SEQ ID NO:155的輕鏈序列。

如本文所使用，如果抗體的可變區(qū)或全長鏈是獲自使用人類種系免疫球蛋白基因的系統(tǒng)，則人類抗體包含的重鏈或輕鏈可變區(qū)或全長重鏈或輕鏈是“源自”特定種系序列或是其“產(chǎn)物”。這些系統(tǒng)包括使用感興趣抗原對攜帶人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠實施免疫或使用感興趣抗原篩選噬菌體上展示的人類免疫球蛋白基因文庫。作為“源自”人類種系免疫球蛋白序列或是其“產(chǎn)物”的人類抗體可通過以下方式來鑒定：比較人類抗體的氨基酸序列與人類種系免疫球蛋白的氨基酸序列，并選擇序列最接近于人類抗體序列(即最大一致性％)的人類種系免疫球蛋白序列。作為“源自”特定人類種系免疫球蛋白序列或是其“產(chǎn)物”的人類抗體與種系序列相比可具有氨基酸差異，這是因為(例如)存在天然產(chǎn)生的體細胞突變或有意引入的定點突變。然而，所選人類抗體的氨基酸序列通常與由人類種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少90％一致，且含有當與其他物種的種系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠類種系序列)相比時將該人類抗體鑒定為確屬人類的氨基酸殘基。在某些情形下，人類抗體的氨基酸序列可與由種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列至少80％、90％或至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％一致。通常，源自特定人類種系序列的人類抗體將顯示與由人類種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列相比不超過10個的氨基酸差異。在某些情形下，人類抗體可顯示與由種系免疫球蛋白基因編碼的氨基酸序列相比不超過5個或甚至不超過4個、3個、2個或1個的氨基酸差異。

在一個實施方式中，本公開組合物中所包含的抗體是由pBW522或pBW524編碼的抗體(分別以保藏號DSM22873和DSM22874保藏于DSMZ，Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig，德國，2009年8月18日)。

同源抗體

在另一個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體具有與本文所闡述抗體的氨基酸和核苷酸序列同源的全長重鏈和輕鏈氨基酸序列；全長重鏈和輕鏈核苷酸序列、可變區(qū)重鏈和輕鏈核苷酸序列或可變區(qū)重鏈和輕鏈氨基酸序列，且其中所述抗體保留本公開的抗ActRIIB抗體所需的功能特性。

例如，本公開提供組合物，其包含含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的經(jīng)分離重組抗ActRIIB抗體(或包含其抗原結合部分的功能蛋白)，其中：重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:99-112的氨基酸序列至少80％或至少90％(優(yōu)選至少95％、97％或99％)一致的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:85-98的氨基酸序列至少80％或至少90％(優(yōu)選至少95％、97％或99％)一致的氨基酸序列；或者，這些組合物包含含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的重組抗ActRIIB抗體(或包含其抗原結合部分的功能蛋白)，其中：重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:99-112的氨基酸序列相比不超過5個氨基酸、或不超過4個氨基酸、或不超過3個氨基酸、或不超過2個或不超過1個氨基酸變化；輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:85-98的氨基酸序列相比不超過5個氨基酸、或不超過4個氨基酸、或不超過3個氨基酸、或不超過2個或不超過1個氨基酸變化，且所述抗體展現(xiàn)至少一個以下的功能特性：(i)其抑制體外或體內(nèi)肌肉抑制素結合，(ii)降低通過Smad依賴性路徑的肌肉分化抑制和/或(iii)不誘導血液學變化，具體地說沒有RBC變化。在此背景下，術語“變化”是指插入、缺失和/或替代。

在另一個實施例中，本公開提供組合物，其包含含有全長重鏈和全長輕鏈的經(jīng)分離重組抗ActRII抗體(或包含其抗原結合部分的功能蛋白)，其中：全長重鏈包含與選自SEQ ID NO:146-150和156-160的氨基酸序列至少80％或至少90％(優(yōu)選至少95％、97％或99％)一致的氨基酸序列；全長輕鏈包含與選自SEQ ID NO:141-145和151-155的氨基酸序列至少80％或至少90％(優(yōu)選至少95％、97％或99％)一致的氨基酸序列；或者，這些組合物包含含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的重組抗ActRII抗體(或包含其抗原結合部分的功能蛋白)，其中：重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:146-150和156-160的氨基酸序列相比不超過5個氨基酸、或不超過4個氨基酸、或不超過3個氨基酸、或不超過2個或不超過1個氨基酸的變化；輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:141-145和151-155的氨基酸序列相比不超過5個氨基酸、或不超過4個氨基酸、或不超過3個氨基酸、或不超過2個或不超過1個氨基酸的變化，且所述抗體表現(xiàn)至少一個以下功能特性：(i)其抑制體外或體內(nèi)肌肉抑制素結合，(ii)降低通過Smad依賴性路徑的肌肉分化抑制和/或(iii)不誘導血液學變化，具體地說沒有RBC變化。優(yōu)選地，該抗體結合ActRIIB和/或ActRIIA的配體結合結構域。在此背景下，術語“變化”是指插入、缺失和/或替代。

在另一個實施例中，本公開提供組合物，其包含含有全長重鏈和全長輕鏈的經(jīng)分離重組抗ActRII抗體(或包含其抗原結合部分的功能蛋白)，其中：全長重鏈的編碼核苷酸序列與選自SEQ ID NO:166-170和176-180的核苷酸序列至少80％或至少90％(優(yōu)選至少95％、97％或99％)一致；全長輕鏈的編碼核苷酸序列與選自SEQ ID NO:161-165和171-175的核苷酸序列至少80％或至少90％(優(yōu)選至少95％、97％或99％)一致；或者，這些組合物包含含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的重組抗ActRIIB抗體(或包含其抗原結合部分的功能蛋白)，其中：重鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:166-170和176-180的氨基酸序列相比不超過5個氨基酸、或不超過4個氨基酸、或不超過3個氨基酸、或不超過2個或不超過1個氨基酸的變化；輕鏈可變區(qū)包含與選自SEQ ID NO:161-165和171-175的氨基酸序列相比不超過5個氨基酸、或不超過4個氨基酸、或不超過3個氨基酸、或不超過2個或不超過1個氨基酸的變化，且所述抗體表現(xiàn)至少一個以下功能特性：(i)其抑制體外或體內(nèi)肌肉抑制素結合，(ii)降低通過Smad依賴性路徑的肌肉分化抑制和/或(iii)不誘導血液學變化，具體地說沒有RBC變化。優(yōu)選地，該抗體結合ActRIIB的配體結合結構域。在此背景下，術語“變化”是指插入、缺失和/或替代。

在多個實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體可展現(xiàn)一種或更多種、兩種或更多種或三種上文所討論的功能特性。所述抗體可是例如人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。優(yōu)選地，所述抗體是完全人類IgG1抗體。

在其他實施方式中，V_H和/或V_L氨基酸序列可與上文所闡釋的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。在其他實施方式中，除不超過1個、2個、3個、4個或5個氨基酸位置的氨基酸替代外，V_H和/或V_L氨基酸序列可一致。所含V_H和V_L區(qū)分別與SEQ ID NO 99-112和SEQ ID NO:85-98的V_H和V_L區(qū)具有高(即80％或更高)一致性的抗體可通過以下方式來獲得：分別誘變(例如定點誘變或PCR介導誘變)核酸分子SEQ ID NO:127-140和113-126，然后使用本文所闡述的功能分析測試所編碼的經(jīng)改變抗體的保留功能(即上文所闡釋的功能)。

在其他實施方式中，全長重鏈和/或全長輕鏈氨基酸序列可與上文所闡釋的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或除不超過1個、2個、3個、4個或5個氨基酸位置的氨基酸變化外可一致。所含全長重鏈和全長輕鏈分別與SEQ ID NO:146-150和156-160中任何的全長重鏈以及SEQ ID NO:141-145和151-155中任何的全長輕鏈具有高(即至少80％或更大)一致性的抗體可通過以下方式來獲得：分別誘變(例如定點誘變或PCR介導誘變)核酸分子SEQ ID NO:166-170和176-180以及SEQ ID NO:161-165和171-175，然后使用本文所闡述的功能分析測試所編碼的經(jīng)改變抗體的保留功能(即上文所闡釋的功能)。

在其他實施方式中，全長重鏈和/或全長輕鏈核苷酸序列可與上文所闡釋的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。

在其他實施方式中，重鏈和/或輕鏈核苷酸序列的可變區(qū)可與上文所闡釋的序列至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致，或除不超過1個、2個、3個、4個或5個氨基酸位置的氨基酸變化外可一致。

如本文所使用，考慮到為達成兩條序列最優(yōu)比對而需要引入的缺口數(shù)和各缺口的長度，兩個序列之間的一致性百分比是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即一致性％＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)×100)。如下文所闡述，兩條序列之間的序列比較與一致性百分比測定可使用數(shù)學算法來完成。

兩個氨基酸序列之間的一致性百分比可使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)的算法來測定，該算法已納入ALIGN程序(2.0版)中，使用PAM120權重殘基表，缺口長度罰分為12且缺口罰分為4。另外，兩個氨基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48:444-453,1970)算法來測定，該算法已納入GCG軟件包裝的GAP程序(于http://www.gcg.com處獲得)中，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，且缺口權重為16、14、12、10、8、6或4，且長度權重為1、2、3、4、5或6。

具有保守修飾的抗體

在某些實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的抗體具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中這些CDR序列中的一或多個具有基于本文所闡述抗體的指定氨基酸序列或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化或其保守修飾的變體序列，且其中這些抗體保留本公開抗ActRIIB抗體的所需功能特性。因此，本公開提供組合物，其包含經(jīng)分離重組抗ActRIIB抗體或包含其抗原結合部分的功能蛋白，具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重鏈可變區(qū)以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的輕鏈可變區(qū)，其中：重鏈可變區(qū)CDR1氨基酸序列是選自SEQ ID NO:1-14或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化和其保守修飾的變體序列；重鏈可變區(qū)CDR2氨基酸序列是選自SEQ ID NO:15-28或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化和其保守修飾的變體序列；CDR3氨基酸序列的重鏈可變區(qū)是選自SEQ ID NO:29-42或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化和其保守修飾的變體序列；輕鏈可變區(qū)CDR1氨基酸序列是選自SEQ ID NO:43-56或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化和其保守修飾的變體序列；輕鏈可變區(qū)CDR2氨基酸序列是選自SEQ ID NO:57-70或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化和其保守修飾的變體序列；CDR3氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)是選自SEQ ID NO:71-84或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化和其保守修飾的變體序列。優(yōu)選地，所述抗體顯示至少一個以下功能特性中：(i)其抑制體外或體內(nèi)肌肉抑制素結合，(ii)降低通過Smad依賴性路徑的肌肉分化抑制和/或(iii)不誘導血液學變化，具體地說沒有RBC變化。

在多個實施方式中，所述抗體可表現(xiàn)一或兩個上文所列示的功能特性。這些抗體可是(例如)人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。

在其他實施方式中，本發(fā)明組合物中所包含的經(jīng)優(yōu)化以在哺乳動物細胞中表達的抗體具有全長重鏈序列和全長輕鏈序列，其中這些序列中的一或多個具有基于本文所闡述的抗體或其保守修飾的指定氨基酸序列，且其中這些抗體保留本公開抗ActRIIB抗體的所需功能特性。因此，本公開提供組合物，其包含經(jīng)優(yōu)化以在哺乳動物細胞中表達、由全長重鏈和全長輕鏈組成的經(jīng)分離單抗抗ActRII抗體，其中：全長重鏈具有的氨基酸序列選自SEQ ID NO:146-150和156-160或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化和其保守修飾的變體序列；且全長輕鏈具有的氨基酸序列選自SEQ ID NO:141-145和151-155或其包含1個、2個、3個、4個或5個氨基酸變化和其保守修飾的變體序列；且所述抗體表現(xiàn)至少一個以下功能特性：(i)其抑制體外或體內(nèi)肌肉抑制素結合，(ii)降低通過Smad依賴性路徑的肌肉分化抑制和/或(iii)不誘導血液學變化，具體地說沒有RBC變化。

在多個實施方式中，所述抗體可表現(xiàn)一或兩個上文所列示的功能特性。這些抗體可是(例如)人類抗體、人源化抗體或嵌合抗體。

如本文所使用，術語“保守序列修飾”指氨基酸修飾不顯著影響或改變含有該氨基酸序列的抗體的結合特征。這些保守修飾包括氨基酸替代、添加和缺失?？赏ㄟ^本領域內(nèi)已知的標準技術(例如定點誘變和PCR介導誘變)將修飾引入本公開的抗體中。

保守氨基酸替代是其中氨基酸殘基被具有類似側鏈的氨基酸殘基替代的那些。本領域內(nèi)已定義具有類似側鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有無電荷極性側鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β支鏈側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，本公開的抗體的CDR區(qū)內(nèi)的一或多個氨基酸殘基可被來自同一側鏈家族的其他氨基酸殘基替代，且可使用本文所闡述的功能分析來測試經(jīng)改變抗體的保留功能。

與所公開組合物中包含的抗ActRII抗體結合相同表位的抗體

在另一個實施方式中，本發(fā)明提供組合物，其包括與本文所闡述的多個特異性抗ActRII抗體結合相同表位的抗體。實施例中所闡述能夠阻斷肌肉抑制素與ActRIIA和ActRIIB結合的所有抗體以高親和力結合ActRIIA和ActRIIB中的一個表位，所述表位包括在SEQ ID NO:181的氨基酸19-134之間。

因此，基于其與本公開的其他抗體交叉競爭(例如以統(tǒng)計學上顯著的方式競爭性抑制結合)的能力，可在標準ActRIIB結合分析中鑒定額外的抗體。測試抗體抑制本發(fā)明組合物中所含抗體與人類ActRIIB結合的能力顯示，測試抗體可與所述抗體競爭結合人類ActRIIB；根據(jù)非限制性理論，這樣的抗體可與其所競爭的抗體結合至人類ActRIIB上的相同或相關(例如結構類似或空間近端)表位。在某一個實施方式中，與本發(fā)明組合物中所含抗體結合人類ActRIIA和ActRIIA上相同表位的抗體是人類重組抗體。這些人類重組抗體可如實施例中所闡述來制備和分離。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:85所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:99所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位和/或與其競爭結合。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:86所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:100所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:87所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:101所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:88所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:102所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:89所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:103所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:90所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:104所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:91所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:105所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:92所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:106所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:93所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:107所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:94所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:108所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:95所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:109所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:96所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:110所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:97所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:111所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由具有SEQ ID NO:98所示可變重鏈序列和SEQ ID NO:112所示可變輕鏈序列的抗體識別的表位。

根據(jù)更詳細的表位定位實驗，已更明確地定義了本發(fā)明組合物的優(yōu)選抗體的結合區(qū)。

因此，本公開提供包含抗體的組合物，所述抗體結合包含SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)的表位。

本公開也提供包含抗體的組合物，所述抗體結合包含SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)的表位。

本公開也提供包含抗體的組合物，所述抗體結合包含SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)的表位。

本公開也提供包含抗體的組合物，所述抗體結合包含SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)的表位。

本公開也提供包含抗體的組合物，所述抗體結合包含SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)的表位。

本公開也提供包含抗體的組合物，所述抗體結合包含SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)或由其組成的表位。

本公開也提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)組成的表位；和(b)由SEQ ID NO:181的氨基酸49-63()組成的表位。

本公開也提供包含抗體的組合物，所述抗體結合由這些序列組成的表位或包含這些表位區(qū)的組合的表位。

因此，本公開也提供包含抗體的組合物，所述抗體結合包含SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)或由其組成的表位。

經(jīng)改造和經(jīng)修飾抗體

本發(fā)明組合物中所包含的抗體可進一步使用具有本文所顯示V_H和/或V_L序列中一或多個的抗體作為起始材料來改造出經(jīng)修飾抗體而制得，該經(jīng)修飾抗體可具有與起始抗體相比改變的特性?？贵w可通過修飾一或兩個可變區(qū)(即V_H和/或V_L)內(nèi)、例如一或多個CDR區(qū)內(nèi)和/或一或多個框架區(qū)內(nèi)的一或多個殘基來改造。補充或替代地，抗體可通過修飾恒定區(qū)內(nèi)的殘基來改造，例如改變抗體的效應子功能。

可實施的一種可變區(qū)改造類型是CDR移植?？贵w與靶抗原主要通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(CDR)中的氨基酸殘基相互作用。出于此原因，在個體抗體之間CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列差異更大。由于CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，故可通過構建表達載體來表達模擬特異性天然抗體特性的重組抗體，這些表達載體包括移植至具有不同特性的不同抗體的框架序列上的來自特異性天然抗體的CDR序列(例如，參見Riechmann,L.等，1998Nature 332:323-327；Jones,P.等，1986Nature 321:522-525；Queen,C.等，1989Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033；頒予Winter的美國專利第5,225,539號以及頒予Queen等的美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號和第6,180,370號)。

因此，本公開的另一個實施方式是關于包含單克隆抗ActRII抗體或包含其抗原結合部分的功能蛋白的組合物，其包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)包含具有選自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列的CDR1序列、具有選自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列的CDR2序列和具有選自SEQ ID NO:29-42組成的群的氨基酸序列CDR3序列；輕鏈可變區(qū)具有選自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列的CDR1序列、具有選自SEQ ID NO:57-70的氨基酸序列的CDR2序列和由選自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列組成的CDR3序列。因此，這些抗體含有單克隆抗體的V_H和V_L CDR序列，但可含有不同于這些抗體的框架序列。

這些框架序列可獲自包括種系抗體基因序列的公開DNA數(shù)據(jù)庫或公開參考文獻。例如，人類重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列可參見“VBase”人類種系序列數(shù)據(jù)庫(在互聯(lián)網(wǎng)www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)以及Kabat,E.A.等[參見上文]；Tomlinson,I.M.等，1992J.fol.Biol.227:776-798；和Cox,J.P.L.等，1994Eur.J Immunol.24:827-836。用于本公開抗體中的框架序列的實例是那些與由本公開特選抗體使用的框架序列(例如共有序列)和/或由本公開的單克隆抗體使用的框架序列結構類似的那些。可將V_H CDR1、2和3序列和V_L CDR1、2和3序列移植到具有序列與衍生出框架序列的種系免疫球蛋白基因中所見一致的框架區(qū)上，或可將CDR序列移植到與種系序列相比含有一或多個突變的框架區(qū)上。例如，已發(fā)現(xiàn)在某些情況下，突變框架區(qū)內(nèi)的殘基對維持或增強抗體的抗原結合能力是有益的(例如參見頒予Queen等的美國專利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一類型的可變區(qū)修飾是突變V_H和/或V_L CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)內(nèi)的氨基酸殘基，從而改善感興趣抗體的一或多種結合特性(例如親和力)，這稱為“親和力成熟”。可實施定點誘變或PCR介導誘變以引入突變，且可在如本文所闡述和在實施例中提供的體外或體內(nèi)分析中評估抗體結合效應或其他感興趣的功能特性?？梢?如上文所討論的)保守修飾。突變可為氨基酸替代、添加或缺失。此外，通常改變CDR區(qū)內(nèi)不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。

因此，在另一個實施方式中，本公開提供經(jīng)分離抗ActRII單克隆抗體或包含其抗原結合部分的功能蛋白，所述抗體或功能蛋白具有重鏈可變區(qū)組成，該重鏈可變區(qū)具有：V_HCDR1區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:1-14的氨基酸序列或與SEQ ID NO:1-14相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列組成；V_H CDR2區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:15-28的氨基酸序列或與SEQ ID NO:15-28相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列；V_H CDR3區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:29-42的氨基酸序列或與SEQ ID NO:29-42相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列；V_L CDR1區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:43-56的氨基酸序列或與SEQ ID NO:43-56相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列；V_LCDR2區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:52-70的氨基酸序列或與SEQ ID NO:52-70相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列；和V_L CDR3區(qū)，其具有選自SEQ ID NO:71-84的氨基酸序列或與SEQ ID NO:71-84相比具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸替代、缺失或添加的氨基酸序列。

駱駝科抗體

已對自駱駝和單峰駱駝家族成員(雙峰駱駝(Camelus bactrianus)和單峰駱駝(Camelus dromaderius)，包括新世界成員，例如美洲駝(llama)種(羊駝(Lama paccos)、大羊駝(Lama glama)和小羊駝(Lama vicugna)))獲得的抗體蛋白尺寸、結構復雜度和對人類個體的抗原性進行了表征。發(fā)現(xiàn)某些來自此哺乳動物家族的IgG抗體天然缺少輕鏈，且因此在結構上與來自其他動物抗體的具有兩條重鏈和兩條輕鏈的典型四鏈四級結構不同(參見WO94/04678)。

可通過遺傳改造來獲得被鑒別為V_HH的小型單一可變結構域的駱駝科抗體區(qū)以產(chǎn)生對靶標具有高親和力的小蛋白，從而產(chǎn)生稱為“駱駝科納米抗體”的低分子量抗體衍生蛋白(參見US5,759,808；Stijlemans,B.等，2004J Biol Chem 279:1256-1261；Dumoulin,M.等，2003Nature 424:783-788；Pleschberger,M.等2003Bioconjugate Chem 14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等2002Int J Cancer 89:456-62；和Lauwereys,M.等1998EMBO J 17:3512-3520)。駱駝科抗體和抗體片段的經(jīng)改造文庫可自(例如)Ablynx(比利時根特)購得。與非人類來源的其他抗體一樣，可重組改變駱駝科抗體的氨基酸序列，以獲得更密切類似于人類序列的序列，即可“人源化”納米抗體。因此，可進一步降低駱駝科抗體對人類的天然低抗原性。

駱駝科納米抗體的分子量約為人類IgG分子的十分之一，且該蛋白質(zhì)具有僅幾納米的物理直徑。小尺寸的一個結果是駱駝科納米抗體有能力結合在功能上對于較大抗體蛋白不可見的抗原位點，即駱駝科納米抗體可用作試劑來檢測原本使用經(jīng)典免疫學技術時隱秘的抗原，也可用作可能的治療劑。因此，小尺寸的另一結果在于，駱駝科納米抗體可由于與靶蛋白的溝或窄縫中特異性位點的結合而抑制，并因此可提供較經(jīng)典抗體更近似于經(jīng)典低分子量藥物功能的能力。

低分子量和緊湊尺寸進一步使得駱駝科納米抗體極其熱穩(wěn)定、對極端pH和蛋白水解消化穩(wěn)定以及抗原性不足。另一結果在于，駱駝科納米抗體容易自循環(huán)系統(tǒng)移動至組織中，甚至穿過血腦屏障，且可治療影響神經(jīng)組織的病癥。納米抗體可進一步促進藥物運輸穿過血腦屏障(參見US2004/0161738)。這些特征與對人類的低抗原性相結合指示了較大的治療潛能。此外，這些分子可在原核細胞(例如大腸桿菌)中完整表達，且表達為細菌噬菌體的融合蛋白并具有功能。

因此，在一個實施方式中，本發(fā)明是關于組合物，其包含對ActRIIB具有高親和力的駱駝科抗體或納米抗體。在本文的某些實施方式中，駱駝科抗體或納米抗體在駱駝科動物中以天然方式產(chǎn)生，即用本文闡述用于其他抗體的技術，由駱駝科在用ActRIIB或其肽片段實施免疫后產(chǎn)生?；蛘?，抗ActRIIB駱駝科納米抗體是工程改造的，即如本文實施例中所闡述，使用以ActRIIB為靶的淘選程序，通過(例如)自展示駱駝科納米抗體蛋白適當誘變的噬菌體文庫選擇得到。經(jīng)改造納米抗體可進一步通過遺傳改造來定制使其在接受個體中具有45分鐘到兩周的半衰期。在一個具體實施方式中，駱駝科抗體或納米抗體是通過將本公開人類抗體的重鏈或輕鏈CDR序列移植至納米抗體或單一結構域抗體框架序列中來獲得，如(例如)WO94/04678中所闡述。

非抗體支架

已知非免疫球蛋白框架或支架包括但不限于阿德奈汀(Adnectin)(纖連蛋白)(Compound Therapeutics公司，Waltham,MA)、錨蛋白(Molecular Partners AG,Zurich,Switzerland)、結構域抗體(Domantis有限公司(Cambridge,MA)和Ablynx nv(Zwijnaarde,Belgium))、脂質(zhì)運載蛋白(抗運載蛋白(Anticalin))(Pieris Proteolab AG,Freising,Germany)、小模塊免疫醫(yī)藥(Trubion Pharmaceuticals公司，Seattle,WA)、馬克西抗體(maxybody)(Avidia公司(Mountain View,CA))、蛋白質(zhì)A(Affibody AG,Sweden)和親和素(γ-晶體蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH,Halle,Germany)、蛋白質(zhì)表位模擬物(Polyphor有限公司，Allschwil,Switzerland)。

(i)纖連蛋白支架

纖連蛋白支架優(yōu)選是基于III型纖連蛋白結構域(例如III型纖連蛋白的第十模塊(10Fn3結構域))。III型纖連蛋白結構域具有7或8條分布于兩個β片之間的β鏈，這些鏈本身彼此堆砌形成蛋白質(zhì)的核心，并進一步含有將β鏈彼此連接且暴露于溶劑中的環(huán)(類似于CDR)。在β片夾心的每一邊緣處存在至少三個這種環(huán)，其中該邊緣是垂直于β鏈方向的蛋白質(zhì)的邊界(US 6,818,418)。

雖然這些基于纖連蛋白的支架的總體折迭與包含駱駝和美洲駝IgG中的整個抗原識別單元的最小功能抗體片段重鏈可變區(qū)的折迭密切相關，但是這些基于纖連蛋白的支架并非免疫球蛋白。由于此結構，非免疫球蛋白抗體能模擬在性質(zhì)和親和力方面與抗體類似的抗原結合特性。這些支架可用于與體內(nèi)抗體親和力成熟過程類似的體外環(huán)隨機化和改組策略。這些基于纖連蛋白的分子可用作支架，其中該分子的環(huán)區(qū)可使用標準克隆技術使用本公開的CDR來替代。

(ii)錨蛋白-分子配偶體

該技術是基于使用具有錨蛋白衍生重復模塊的蛋白質(zhì)作為支架來支撐可用于與不同靶向結合的可變區(qū)。錨蛋白重復模塊是由兩個反向平行的α-螺旋與β轉角組成的33氨基酸多肽?？勺儏^(qū)的結合大多通過使用核糖體展示來優(yōu)化。

(iii)馬克西抗體/厄維體(Avimer)-Avidia

厄維體是源自含有A-結構域的天然蛋白質(zhì)，例如LRP-1。這些結構域天然用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，且在人類中超過250種蛋白質(zhì)的結構是基于A-結構域。厄維體是由多個不同的“A-結構域”單體(2-10)通過氨基酸接頭連接組成。可結合靶抗原的厄維體可使用(例如)US2004/0175756、US2005/0053973、US2005/0048512和US2006/0008844中所闡述的方法來產(chǎn)生。

(vi)蛋白質(zhì)A-親和體

親和力配體是由基于蛋白質(zhì)A的一個IgG結合結構域的支架的三螺旋束構成的簡單小蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)A是來自細菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白。此支架結構域是由58個氨基酸組成，將其中的13個隨機化以產(chǎn)生具有大量配體變體的文庫(例如參見US 5,831,012)。分子模擬抗體，其與抗體的150kDa分子量相比具有6kDa的分子量。盡管其尺寸較小，分子的結合位點與抗體的結合位點類似。

(v)抗運載蛋白(Anticalin)-粉蝶屬(Pieris)

是由Pieris ProteoLab AG公司研發(fā)的產(chǎn)品。其是源自脂質(zhì)運載蛋白，這些脂質(zhì)運載蛋白是一類廣泛的小且穩(wěn)健的蛋白質(zhì)，其通常參與化學敏感或不可溶化合物的生理運輸或儲存。若干天然脂質(zhì)運載蛋白出現(xiàn)在人類組織或體液中。

蛋白質(zhì)架構像免疫球蛋白，具有剛性框架上的超變環(huán)。然而，與抗體或其重組片段不同，脂質(zhì)運載蛋白是由具有160至180個氨基酸殘基的單一多肽鏈構成，僅略大于單一免疫球蛋白結構域。

組成結合口袋的四環(huán)集合顯示顯著的結構可塑性并耐受多條側鏈。因此，可在專有過程中對結合位點進行重塑以高親和力和特異性識別所指定的不同形狀的靶分子。

已使用脂質(zhì)運載蛋白家族的一種蛋白質(zhì)(歐洲粉蝶(Pieris brassicae)的膽素(bilin)結合蛋白(BBP))通過誘變四環(huán)集合來研發(fā)抗運載蛋白。闡述“抗運載蛋白”的專利申請的一個實例是WO1999/16873。

AFFILIN^TM分子是經(jīng)設計對蛋白質(zhì)和小分子有特定親和力的小的非免疫球蛋白。新型AFFILIN^TM分子可極快速地選自兩個文庫，文庫各自都基于源自人類的不同支架蛋白。

AFFILIN^TM分子并不顯示任何與免疫球蛋白的結構同源性。Scil蛋白采用兩種AFFILIN^TM支架，其中一種是γ晶體蛋白(人類結構晶狀體蛋白)，另一種是“泛素”超家族蛋白。兩種人類支架都極小，顯示出高溫穩(wěn)定性病幾乎耐受pH變化和變性劑。此高穩(wěn)定性主要歸因于這些蛋白質(zhì)的擴展β片結構。γ晶體蛋白衍生蛋白質(zhì)的實例闡述于WO2001/004144中，“泛素樣”蛋白的實例闡述于WO2004/106368中。

(vii)蛋白質(zhì)表位模擬物(PEM)

PEM是模擬蛋白質(zhì)的二級β-發(fā)夾結構(參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的主要二級結構)的中等尺寸環(huán)狀肽樣分子(MW 1-2kDa)。

將抗原結合結構域移植到替代框架或支架中

可采用多種抗體/免疫球蛋白框架或支架，只要所得多肽包括至少一個特異性結合ActRIIB的結合區(qū)。這些框架或支架包括人類免疫球蛋白或其片段的5個主要的個體基因型(例如本文其他處所公開的那些)，且包括其他動物物種的免疫球蛋白，優(yōu)選具有人源化的方面。單一重鏈抗體(例如于駱駝科中所鑒定的那些)在此方面尤其受關注。本領域技術人員持續(xù)發(fā)現(xiàn)并研發(fā)新型框架、支架和片段。

在一個方面中，本公開組合物可包含基于非免疫球蛋白的抗體，其使用其上可移植有所公開抗體CDR的非免疫球蛋白支架。可采用已知或未來的非免疫球蛋白框架和支架，只要其包含特異性針對靶蛋白SEQ ID NO:181的結合區(qū)(優(yōu)選其配體結合結構域如SEQ ID NO:182中所顯示)。這些化合物在本文中稱為“包含靶特異性結合區(qū)的多肽”。非免疫球蛋白框架的實例進一步闡述于以下部分中(駱駝科抗體和非抗體支架)。

框架或Fc改造

本公開組合物中所包含的經(jīng)改造抗體包括其中已對V_H和/或V_L內(nèi)的框架殘基進行修飾以(例如)改善抗體特性的那些。通常，這些框架修飾經(jīng)制備以降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一或多個框架殘基“回復突變”成相應的種系序列。更特定地，已經(jīng)歷體細胞突變的抗體可含有與衍生出所述抗體的種系序列不同的框架殘基。這些殘基可通過比較抗體框架序列與衍生出所述抗體的種系序列來鑒定。為使框架區(qū)序列返回至其種系構型，可通過(例如)定點誘變或PCR介導誘變將體細胞突變“回復突變”成種系序列。這些“回復突變”抗體也可包含在本發(fā)明組合物中。

另一類型的框架修飾涉及突變框架區(qū)或甚至一或多個CDR區(qū)內(nèi)的一或多個殘基，以移除T細胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。此方法也稱為“去免疫化”且進一步詳細闡述于US2003/0153043中。

補充或替代在框架或CDR區(qū)內(nèi)進行的修飾，本公開的抗體可經(jīng)改造以包括Fc區(qū)內(nèi)的修飾，通常改變抗體的一或多種功能特性，例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外，本公開組合物中所包含的抗體可經(jīng)化學修飾(例如可將一或多個化學部分附接至所述抗體)或經(jīng)修飾以改變其糖基化，以同樣改變抗體的一或多種功能特性。這些實施方式中的每一個都進一步詳細闡述于下文中。Fc區(qū)中殘基的編號是Kabat的EU指數(shù)。

在一個實施方式中，CH1的鉸鏈區(qū)經(jīng)修飾以改變(例如增加或減少)鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基數(shù)。此方法進一步闡述于US5,677,425中。改變CH1鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基數(shù)以(例如)促進輕鏈和重鏈組裝或增加或降低抗體的穩(wěn)定性。

在另一個實施方式中，抗體的Fc鉸鏈區(qū)經(jīng)突變以縮短抗體的生物半衰期。更特定地，將一或多個氨基酸突變引入Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區(qū)中，以使得所述抗體相對于天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合具有受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。此方法進一步詳細闡述于US 6,165,745中。

在另一個實施方式中，抗體經(jīng)修飾以延長其生物半衰期。多種方法是可行的。例如可如US6,277,375中所闡述引入以下突變中的一或多個：T252L、T254S、T256F?；蛘?，為延長生物半衰期，可改變抗體的CH1或CL區(qū)以含有取自IgG的Fc區(qū)的CH2結構域的兩環(huán)的補救受體結合表位，如US5,869,046和US6,121,022中所闡述。

在其他實施方式中，通過使用不同氨基酸殘基替代至少一個氨基酸殘基來改變Fc區(qū)以改變抗體的效應子功能。例如可使用不同的氨基酸殘基來替代一或多個氨基酸，以使得抗體具有對效應子配體經(jīng)改變的親和力但保留親代抗體的抗原結合能力。對其親和力改變的效應子配體可是(例如)Fc受體或補體的C1組分。此方法進一步詳細闡述于Winter等的US5,624,821和US5,648,260中。具體地，可突變殘基234和235。具體地，這些突變可變成丙氨酸。因此，在一個實施方式中，本公開組合物中所包含的抗體在氨基酸234和235中的一或兩個具有Fc區(qū)的突變。在另一個實施方式中，可用丙氨酸替代氨基酸234和235中的一或兩個。用丙氨酸替代氨基酸234和235二者可降低ADCC活性。

在另一個實施方式中，選自所闡述抗體的氨基酸殘基的一或多個氨基酸可被不同氨基酸殘基替代，以使得抗體具有經(jīng)改變的C1q結合和/或降低或消除的補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法進一步詳細闡述于US6,194,551中。

在另一個實施方式中，改變所闡述抗體的一或多個氨基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力。此方法進一步闡述于WO94/29351中。

在另一個實施方式中，通過修飾一或多個氨基酸對所闡述抗體的Fc區(qū)進行修飾，以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗體對Fcγ受體的親和力。此方法進一步闡述于WO00/42072中。此外，已定位了人類IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的結合位點，并闡述了結合有所改善的變體(參見Shields,R.L.等，2001J.Biol.Chen.276:6591-6604)。

在另一個實施方式中，對本公開組合物中所包含的抗體的糖基化進行修飾。例如，可制備未糖基化的抗體(即抗體缺少糖基化)?？筛淖兲腔?例如)增加抗體對抗原的親和力。這些碳水化合物修飾可通過(例如)改變抗體序列內(nèi)的一或多個糖基化位點來完成。例如，一或多個氨基酸替代可引起消除一或多個可變區(qū)框架糖基化位點，從而消除該位點處的糖基化。該無糖基化可增加抗體對抗原的親和力。此方法進一步詳細闡述于Co等的美國專利第5,714,350號和第6,350,861號中。

補充或替代地，可使用具有經(jīng)改變類型的糖基化的抗體，例如具有減少量的巖藻糖基殘基的低巖藻糖基化抗體或具有增加的二分型GlcNac結構的抗體。已顯示這些經(jīng)改變糖基化模式增加了抗體的ADCC能力。這些碳水化合物修飾可通過(例如)在具有經(jīng)改變的糖基化機制的宿主細胞中表達抗體來完成。本領域內(nèi)已經(jīng)闡述了具有經(jīng)改變糖基化機制的細胞，且其可用作其中表達所公開重組抗體的宿主細胞，從而產(chǎn)生具有經(jīng)改變糖基化的抗體。例如，Hang等的EP 1,176,195描述了編碼巖藻糖基轉移酶的FUT8基因功能被破壞的細胞系，使得在這一細胞系中表達的抗體呈現(xiàn)低巖藻糖基化。因此，在一個實施方式中，本公開組合物中所包含的抗體是通過在展現(xiàn)低巖藻糖基化模式的細胞系(例如編碼巖藻糖基轉移酶的FUT8基因表達缺陷的哺乳動物細胞系)中重組表達來產(chǎn)生。WO03/035835描述了變體CHO細胞系Lecl3細胞，其將巖藻糖附接至Asn(297)連接的碳水化合物的能力降低，也導致在該宿主細胞中表達的抗體低巖藻糖基化(也參見Shields,R.L.等，2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。WO99/54342闡述經(jīng)改造以表達糖蛋白修飾的糖基轉移酶(例如β(1,4)-N乙酰葡糖氨基轉移酶III(GnTIII))的細胞系，以使得在經(jīng)改造細胞系中表達的抗體展現(xiàn)出增加的二分型GlcNac結構，導致增加抗體的ADCC活性(也參見Umana等，1999Nat.Biotech.17:176-180)?；蛘?，本公開組合物中所包含的抗體可在經(jīng)改造用于哺乳動物樣糖基化模式的酵母菌或絲狀真菌中產(chǎn)生，且能夠產(chǎn)生缺少巖藻糖作為糖基化模式的抗體(例如參見EP1297172B1)。

本公開考慮的本文抗體的另一種修飾是聚乙二醇化?？贵w可經(jīng)聚乙二醇化以(例如)延長抗體的生物(例如血清)半衰期。為對抗體實施聚乙二醇化，通常在一或多個PEG基團會附接至抗體或抗體片段的條件下將抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)(例如PEG的活性酯或醛衍生物)反應。聚乙二醇化可通過與活性PEG分子(或類似活性水溶性聚合物)的?；磻蛲榛磻獊韺嵤Ｈ绫疚乃褂?，術語“聚乙二醇”涵蓋已用于衍生化其他蛋白質(zhì)的任意形式PEG，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方式中，所用聚乙二醇化的抗體是無糖基化抗體。用于聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法為本領域內(nèi)已知且可應用于所公開抗體(例如參見EP0154316和EP0401384)。

本公開所涵蓋的抗體的另一種修飾是本公開組合物中所包含抗體的至少抗原結合區(qū)與血清蛋白(例如人類血清白蛋白或其片段)的偶聯(lián)或蛋白融合，以延長所得分子的半衰期(例如參見EP0322094)。

另一可能性是融合本公開組合物中所包含抗體的至少抗原結合區(qū)與能夠結合血清蛋白(例如人類血清白蛋白)的蛋白質(zhì)，以延長所得分子的半衰期(例如參見EP0486525)。

改造經(jīng)改變抗體的方法

如上文所論述，通過修飾CDR序列全長重鏈和/或輕鏈序列、V_H和/或V_L序列或附接的恒定區(qū)，具有本文所示的CDR序列、V_H和V_L序列或全長重鏈和輕鏈序列的抗ActRIIB抗體可被用來產(chǎn)生新型抗ActRIIB抗體。因此，在本公開的另一方面，使用本公開組合物中所包含的抗ActRIIB抗體的結構要素來產(chǎn)生結構相關的抗ActRIIB抗體，其保留本公開組合物中所包含抗體的至少一種功能特性，例如結合人類ActRIIB，也抑制ActRIIB的一或多種功能特性(例如抑制Smad活化)。

例如，本公開組合物中所包含抗體的一或多個CDR區(qū)或其突變可以與已知框架區(qū)和/或其他CDR重組組合，以產(chǎn)生如上文所論述的本公開組合物中所包含的額外的經(jīng)重組改造抗ActRIIB抗體。其他類型的修飾包括先前部分中所闡述的那些。用于改造方法的起始材料是本文所提供V_H和/或V_L序列中的一或多個，或其一或多個CDR區(qū)。為產(chǎn)生經(jīng)改造抗體，實際上無需制備(即表達為蛋白質(zhì))具有本文所提供V_H和/或V_L序列中的一或多者或其一或多個CDR區(qū)的抗體。相反地，使用序列中所含有的信息作為起始材料以產(chǎn)生源自初始序列的“第二代”序列，然后制備“第二代”序列并表達為蛋白質(zhì)。

經(jīng)改變抗體序列也可通過篩選抗體文庫來制備，這些抗體文庫具有選自SEQ ID NO:29-42和SEQ ID NO:71-84的固定CDR3序列或如US2005/0255552中所闡述的最小必需結合決定簇和多樣的CDR1和CDR2序列。篩選可根據(jù)適用于自抗體文庫篩選抗體的任何篩選技術(例如噬菌體展示技術)來實施。

可使用標準分子生物學技術來制備并表達經(jīng)改變抗體序列。由經(jīng)改變抗體序列編碼的抗體保留本文所闡述抗ActRIIB抗體的一個、一些或所有功能特性，包括但不限于與人類ActRIIB特異性結合和抑制Smad活化。

經(jīng)改變抗體可展現(xiàn)上文所論述功能特性中的一或多個、兩個或更多個或三個或更多個。

經(jīng)改變抗體的功能特性可使用本領域內(nèi)可獲得和/或本文所闡述的標準分析(例如實例中所闡釋的那些(例如ELISA))來評價。

可沿抗ActRIIB抗體編碼序列的全部或部分隨機或選擇性引入突變，且可針對結合活性和/或如本文所闡述的其他功能特性來篩選所得的經(jīng)修飾抗ActRIIB抗體。本領域已闡述了突變方法。例如WO02/092780闡述使用飽和誘變、合成性連接組裝或其組合來產(chǎn)生并篩選抗體突變的方法?；蛘?，WO03/074679闡述使用計算篩選方法優(yōu)化抗體的物理化學特性的方法。

編碼本公開組合物中所包含抗體的核酸分子

優(yōu)化用于哺乳動物細胞中表達的全長輕鏈核苷酸序列的實例示于SEQ ID NO:161-165和171-175中。優(yōu)化用于哺乳動物細胞中表達的全長重鏈核苷酸序列的實例示于SEQ ID NO:166-170和176-180中。

這些核酸可存在于全細胞、細胞裂解物中，或可以是呈部分純化或?qū)嵸|(zhì)上純凈形式的核酸。當通過標準技術自其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質(zhì))純化出時，核酸是“經(jīng)分離”或“實質(zhì)上純凈”的，這些標準技術包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領域內(nèi)熟知的其他方法。參見F.Ausubel等編輯，1987Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。核酸可使用標準分子生物學技術來獲得。對于由雜交瘤(例如如下文進一步闡述的自攜載人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠制備的雜交瘤)表達的抗體，編碼雜交瘤所制抗體的輕鏈和重鏈的cDNA可通過標準PCR擴增或cDNA選殖技術來獲得。對于(例如使用噬菌體展示技術)獲自免疫球蛋白基因文庫的抗體，可從多個是文庫成員的噬菌體克隆回收編碼抗體的核酸。

一旦獲得編碼V_H和V_L區(qū)段的DNA片段，即可通過標準重組DNA技術進一步操縱這些DNA片段，以(例如)將可變區(qū)基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操縱中，編碼V_L或V_H的DNA片段可操作地連接至另一DNA分子或編碼另一蛋白質(zhì)的片段(例如抗體恒定區(qū)或撓性接頭)。如在此背景下所使用，術語“可操作地連接”指以功能方式連接兩個DNA片段，例如使由該兩個DNA片段編碼的氨基酸序列保留在框內(nèi)，或使蛋白質(zhì)在所需啟動子的控制下表達。

通過將編碼V_H的DNA可操作地連接至編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子，可將編碼V_H區(qū)的經(jīng)分離DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恒定區(qū)基因的序列為本領域內(nèi)已知(例如參見Kabat,E.A.等[參見上文])且涵蓋這些區(qū)的DNA片段可通過標準PCR擴增來獲得。重鏈恒定區(qū)可是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)可選自IgG1同種型。對于Fab片段重鏈基因，編碼V_H的DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恒定區(qū)的另一DNA分子。

通過將編碼V_L的DNA可操作地連接至編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一DNA分子，可將編碼V_L區(qū)的經(jīng)分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恒定區(qū)基因的序列為本領域內(nèi)已知(例如參見Kabat,E.A.等[參見上文])且涵蓋這些區(qū)的DNA片段可通過標準PCR擴增來獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)。

為產(chǎn)生scFv基因，編碼V_H和V_L的DNA片段可操作地連接至編碼撓性接頭、例如編碼氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃的另一片段，以使得V_H和V_L序列可表達為連續(xù)單鏈蛋白，且V_L和V_H區(qū)通過撓性接頭連接(例如參見Bird等，1988Science 242:423-426；Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等，1990Nature 348:552-554)。

單克隆抗體的生成

單克隆抗體(mAb)可通過多種技術(包括傳統(tǒng)單克隆抗體方法，例如Kohler和Milstein的標準體細胞細胞雜交技術)來產(chǎn)生(1975Nature 256:495)?？刹捎枚喾N技術來產(chǎn)生單克隆抗體，例如B淋巴細胞的病毒或癌性轉化。

用于制備雜交瘤的一種動物系統(tǒng)是鼠類系統(tǒng)。小鼠中的雜交瘤產(chǎn)生是已確立的程序。分離融合用免疫脾細胞的免疫方案和技術為本領域內(nèi)已知。融合配偶體(例如鼠類骨髓瘤細胞)和融合程序也已知。

本發(fā)明組合物中所包含的嵌合或人源化抗體可基于前述制備的鼠類單克隆抗體的序列來制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可獲自感興趣鼠類雜交瘤并使用標準分子生物學技術加以改造以含有非鼠類(例如人類)免疫球蛋白序列。例如，為產(chǎn)生嵌合抗體，可使用本領域內(nèi)已知的方法將鼠類可變區(qū)連接至人類恒定區(qū)(例如，參見US4,816,567)。為產(chǎn)生人源化抗體，可使用本領域內(nèi)已知的方法將鼠類CDR區(qū)插入人類框架中(例如參見美國專利第5225539號、第5530101號、第5585089號、第5693762號和第6180370號)。

在某一個實施方式中，本公開組合物中所包含的抗體是人類單克隆抗體?？墒褂脭y載部分人類免疫系統(tǒng)而非小鼠系統(tǒng)的轉基因或轉染色體小鼠來產(chǎn)生針對ActRIIB的這些人類單克隆抗體。這些轉基因和轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，且在本文中統(tǒng)稱為“人類Ig小鼠”。

HuMAb(Medarex公司)含有編碼非重排人類重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列以及使內(nèi)源性μ和κ鏈基因座失活的定向突變的人類免疫球蛋白基因微小基因座(例如參見Lonberg等，1994Nature 368(6474):856-859)。因此，小鼠展現(xiàn)降低的小鼠IgM或κ表達，且在對免疫接種的反應中，所引入人類重鏈和輕鏈轉基因進行類別轉換和體細胞突變，以產(chǎn)生高親和力人類IgGκ單克隆抗體(Lonberg,N.等，1994[參見上文]；綜述于Lonberg,N.,1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg,N.和Huszar,D.,1995 Intern.Rev.Immunol.13:65-93，以及Harding,F.和Lonberg,N.,1995Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMAb小鼠和這些小鼠所攜載基因組修飾的制備和用途進一步闡述于Taylor,L.等，1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等，1993 International Immunology 5:647-656；Tuaillon等，1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3720-3724；Choi等，1993Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等，1993 EMBO J.12:821-830；Tuaillon等，1994 J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等，1994 International Immunology 579-591；和Fishwild,D.等，1996Nature Biotechnology 14:845-851，這些文獻中所有的全文都以引用方式并入本文中。進一步參見美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號、第5,770,429號和第5,545,807號；以及WO92/103918、WO93/12227、WO94/25585、WO97/113852、WO98/24884；WO99/45962和WO01/14424。

在另一個實施方式中，本公開組合物中所包含的人類抗體可使用轉基因和轉染色體上攜載人類免疫球蛋白序列的小鼠(例如攜載人類重鏈轉基因和人類輕鏈轉染色體的小鼠)來產(chǎn)生。這些小鼠(在本文中稱為“KM小鼠”)詳細闡述于WO02/43478中。

此外，本領域內(nèi)可獲得表達人類免疫球蛋白基因的替代性轉基因動物系統(tǒng)且可用其來產(chǎn)生本公開的抗ActRIIB抗體。例如，可使用稱為Xenomouse(Abgenix公司)的替代性轉基因系統(tǒng)。這些小鼠闡述于例如美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號和第6,162,963號中。

此外，本領域內(nèi)可獲得另一種表達人類免疫球蛋白基因的轉染色體動物系統(tǒng)且可用其來產(chǎn)生本公開的抗ActRIIB抗體。例如，可使用攜載人類重鏈轉染色體和人類輕鏈轉染色體的小鼠(稱為“TC小鼠”)；這些小鼠闡述于Tomizuka等，2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727中。此外，本領域內(nèi)已闡述攜載人類重鏈和輕鏈轉染色體的牛(Kuroiwa等，2002 Nature Biotechnology 20:889-894)，且可用其來產(chǎn)生抗ActRIIB抗體。

本公開組合物中所包含的人類重組抗體也可使用用于篩選人類免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示方法來制備。用于分離人類抗體的這些噬菌體展示方法在本領域內(nèi)已確立或闡述于以下實施例中。參見(例如)美國專利第5,223,409號、第5,403,484號、第5,571,698號、第5,427,908號、第5,580,717號、第5,969,108號、第6,172,197號、第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號和第6,593,081號。

本公開組合物中所包含的人類單克隆抗體也可使用SCID小鼠來制備，人類免疫細胞已經(jīng)重構入此類小鼠以使得免疫后可產(chǎn)生人類抗體反應。這些小鼠闡述于(例如)美國專利第5,476,996號和第5,698,767號中。

產(chǎn)生人類單克隆抗體的雜交瘤的生成

為生成產(chǎn)生本公開組合物中所包含的人類單克隆抗體的雜交瘤，可自經(jīng)免疫小鼠分離脾細胞和/或淋巴結細胞并融合至合適的永生細胞系，例如小鼠骨髓瘤細胞系。所得雜交瘤可就抗原特異性抗體的生產(chǎn)作篩選。例如，可使用50％PEG將來自經(jīng)免疫小鼠的脾淋巴細胞的單細胞懸浮液融合至六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC,CRL 1580)。將細胞以約2×145平鋪于平底微量滴定板中，然后在含有20％胎?？寺⊙?、18％"653"條件化培養(yǎng)基、5％奧瑞金(origen)(IGEN)、4mM L-谷酰氨酸、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0:055mM 2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小時加入HAT)的選擇培養(yǎng)基中培育兩周。約兩周后，可在HAT更換為HT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。然后個體孔可通過ELISA篩選人類單抗IgM和IgG抗體。一旦出現(xiàn)雜交瘤過度生長，通常即可在10-14天后觀察培養(yǎng)基?？蓪⒎置陔s交瘤的抗體再鋪板，再篩選，且如果對人類IgG仍呈陽性，則可通過限制性稀釋將單克隆抗體亞克隆至少兩次。然后可在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體用于表征。

為純化人類單克隆抗體，可使所選雜交瘤在兩升轉瓶中生長用于純化單克隆抗體?？蓪⑸锨逡哼^濾并濃縮，然后使用瓊脂糖凝膠蛋白質(zhì)A(Pharmacia)進行親和層析?？赏ㄟ^凝膠電泳和高效液相層析檢查所洗脫的IgG以確保純度?？蓪⒕彌_溶液更換為PBS，且可使用1.43消光系數(shù)通過OD₂₈₀來測定濃度?？蓪慰寺】贵w等分并儲存在-80℃下。

產(chǎn)生單克隆抗體的轉染瘤的生成

本公開組合物中所包含的抗體也可使用(例如)如本領域內(nèi)所熟知的重組DNA技術和基因轉染方法的組合來在宿主細胞轉染瘤中產(chǎn)生(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。

例如，為表達抗體或其抗體片段，可通過標準分子生物學技術(例如PCR擴增或使用表達感興趣抗體的雜交瘤的cDNA選殖)獲得編碼部分或全長輕鏈和重鏈的DNA，且DNA可插入表達載體中，以使得這些基因可操作地連接至轉錄和翻譯控制序列。在此背景下，術語“可操作地連接”指使抗體基因接合至載體中，以使得該載體內(nèi)的轉錄和翻譯控制序列發(fā)揮其調(diào)控抗體基因轉錄和翻譯的預期功能。表達載體和表達控制序列經(jīng)選擇與所用表達宿主細胞相容?？蓪⒖贵w輕鏈基因和抗體重鏈基因插入單獨載體中，或更典型地，將兩種基因插入同一表達載體中。通過標準方法將抗體基因插入表達載體中(例如，將抗體基因片段上的互補限制位點與載體接合，或如果不存在限制位點則使用鈍端接合)。通過將其插入已編碼所需同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達載體，可使用本文所闡述抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)來產(chǎn)生任何抗體同種型的全長抗體基因，以使V_H區(qū)段可操作地連接至載體內(nèi)的CH區(qū)段，且使V_L區(qū)段可操作地連接至載體內(nèi)的CL區(qū)段。補充或替代地，重組表達載體可編碼促進自宿主細胞分泌抗體鏈的信號肽。可將抗體鏈基因克隆至載體中，以使得信號肽在框內(nèi)連接至抗體鏈基因的氨基末端。信號肽可是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的信號肽)。

除抗體鏈基因外，本公開的重組表達載體可攜載控制抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調(diào)控序列。術語“調(diào)控序列”包括控制抗體鏈基因轉錄或翻譯的啟動子、增強子和其他表達控制元件(例如多腺苷酸化信號)。這些調(diào)控序列闡述于(例如)Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA 1990)中。那些本領域技術人員應了解，表達載體的設計(包括調(diào)控序列的選擇)可取決于例如轉化宿主細胞的選擇、所需蛋白質(zhì)的表達水平等因素。用于哺乳動物宿主細胞表達的調(diào)控序列包括在哺乳動物細胞中引導高水平蛋白質(zhì)表達的病毒元件，例如源自以下各項的啟動子和/或增強子：巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒?；蛘撸墒褂梅遣《菊{(diào)控序列，例如泛素啟動子或P-球蛋白啟動子。此外，調(diào)控元件是由來自不同來源的序列構成，例如含有來自SV40早期啟動子的序列和人類T細胞1型白血病病毒的長末端重復的SRa啟動子系統(tǒng)(Takebe,Y.等，1988Mol.Cell.Biol.8:466-472)。

除抗體鏈基因和調(diào)控序列外，重組表達載體可攜載額外序列，例如調(diào)控載體在宿主細胞中復制的序列(例如復制起點)和選擇標記基因。選擇標記基因促進選擇其中已引入載體的宿主細胞(例如參見美國專利第4,399,216號、第4,634,665號和第5,179,017號)。例如，通常選擇標記基因賦予已引入載體的宿主細胞對藥物(例如G418、潮霉素或氨甲喋呤)的耐受性。選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于經(jīng)氨甲喋呤選擇/擴增的dhfr-宿主細胞)和neo基因(用于G418選擇)。

為表達輕鏈和重鏈，通過標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染至宿主細胞中。術語“轉染”的各種形式涵蓋眾多常用的將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中的技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖轉染等。理論上可在原核或真核宿主細胞中表達本公開的抗體。討論了抗體在真核細胞尤其是哺乳動物宿主細胞中的表達，因為這些真核細胞且尤其是哺乳動物細胞比原核細胞更可能組裝并分泌經(jīng)正確折疊的具免疫學活性的抗體。已報導抗體基因的原核表達無法有效地產(chǎn)生高產(chǎn)量的活性抗體(Boss,M.A.和Wood,C.R.,1985Immunology Today 6:12-13)。

用于表達本公開組合物中所包含的重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(包括闡述于Urlaub和Chasing,1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216-4220中的dhfr-CHO細胞，其與DH FR選擇標記一起使用(例如如R.J.Kaufman和P.A.Sharp,1982Mol.Biol.159:601-621中所闡述))、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。在一個實施方式中，宿主細胞是CHO K1PD細胞。具體地，為與NSO骨髓瘤細胞一起使用，另一表達系統(tǒng)是WO87/04462、WO89/01036和EP 338,841中所顯示的GS基因表達系統(tǒng)。用于表達本公開組合物中所包含的重組抗體的哺乳動物宿主細胞包括FUT8基因表達缺陷的哺乳動物細胞系，例如如US6,946,292B2中所闡述。當編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞中時，通過將宿主細胞培養(yǎng)一段時間來產(chǎn)生抗體，該段時間足以在宿主細胞中表達抗體或分泌抗體至生長宿主細胞的培養(yǎng)基中。可使用標準蛋白質(zhì)純化方法自培養(yǎng)基回收抗體。

免疫交聯(lián)物

在另一方面，本發(fā)明的特征在于包含偶聯(lián)至治療部分(例如細胞毒素、藥物(例如免疫阻抑劑)或放射性毒素)的抗ActRIIB抗體或其片段的組合物。這些偶聯(lián)物在本文中稱為“免疫交聯(lián)物”。包括一或多種細胞毒素的免疫交聯(lián)物稱為“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒性劑包括對細胞有害(例如殺死)的任何藥劑。

使用本領域內(nèi)可獲得的接頭技術將細胞毒素偶聯(lián)至本公開的抗體。已用于將細胞毒素偶聯(lián)至抗體的接頭類型的實例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接頭。可選擇(例如)易受溶酶體隔室內(nèi)的低pH影響而裂解或易受蛋白酶(例如在腫瘤組織中優(yōu)先表達的蛋白酶，如組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、C、D))影響而裂解的接頭。

關于細胞毒素的類型、將治療劑偶聯(lián)至抗體的接頭和方法的進一步論述，也參見Saito,G.等，2003 Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等，2003 Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.2003Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.,2002 Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.,2002 Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.,2001 Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。

也可將本發(fā)明組合物中所包含的抗體偶聯(lián)至放射性同位素以產(chǎn)生細胞毒性放射性藥劑，也稱為放射性免疫交聯(lián)物?？膳悸?lián)至抗體用于診斷或治療的放射性同位素的實例包括但不限于碘¹³¹、銦¹¹¹、釔⁹⁰和镥¹⁷⁷。用于制備放射性免疫交聯(lián)物的方法在本領域內(nèi)已確立。放射性免疫交聯(lián)物的實例市售可得，包括Zevalin^TM(DEC Pharmaceuticals)和Bexxar^TM(Corixa Pharmaceuticals)，且可使用類似方法用本公開的抗體來制備放射性免疫交聯(lián)物。

可使用本公開組合物中所包含的抗體偶聯(lián)物來調(diào)整給定生物反應，且藥物部分不應理解為局限于經(jīng)典化學治療劑。例如，藥物部分可是具有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這些蛋白質(zhì)可包括(例如)酶促活性毒素或其活性片段，例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，例如腫瘤壞死因子或干擾素-γ；或生物反應修飾劑，例如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生長因子。

用于偶聯(lián)該治療部分與抗體的技術已眾所周知(例如，參見Amon等,Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(編輯)，第243至56頁(Alan R.Liss公司，1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”，Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson(編輯)，第623-53頁(Marcel Dekker公司，1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications，Pinchera等(編輯)，第475-506頁(1985)；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(編輯)，第303-16頁(Academic Press 1985)和Thorpe等，“The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”,Inmunol.Rev.,62:119-58(1982)。

雙特異性分子

在另一方面，本發(fā)明的特征在于本公開組合物，其包含含有抗ActRIIB抗體或其片段的雙特異性或多特異性分子。本公開組合物中所包含的抗體或其抗原結合區(qū)可衍生化或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(zhì)(例如受體的另一抗體或配體)，以產(chǎn)生結合至少兩個不同結合位點或靶分子的雙特異性分子。本公開的抗體事實上可衍生化或連接至超過一個其他功能分子，以產(chǎn)生結合超過兩個不同結合位點和/或靶分子的多特異性分子；這些多特異性分子也涵蓋于如本文所使用的術語“雙特異性分子”中。為產(chǎn)生本公開的雙特異性分子，本公開的抗體可在功能上連接(例如通過化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子，例如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，以產(chǎn)生雙特異性分子。

因此，本發(fā)明包括包含雙特異性分子的組合物，這些雙特異性分子包含至少一種對ActRIIB的第一結合特異性和對第二靶表位的第二結合特異性。例如，第二靶表位可以是ActRIIB的與第一靶表位不同的另一表位。

此外，對于其中雙特異性分子具有多特異性的組合物，該分子可進一步包括除第一和第二靶表位外的第三結合特異性。

在一個實施方式中，所公開組合物的雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段(包含例如Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv或單鏈Fv)作為結合特異性。所述抗體也可為輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，例如Fv或單鏈構建體，如Ladner等US4,946,778中所述，其公開以引用方式并入本文中。

可用于雙特異性分子中的其他抗體是鼠類、嵌合和人源化單克隆抗體。

本發(fā)明組合物中所包含的雙特異性分子可使用本領域內(nèi)已知方法通過偶聯(lián)多個成分結合特異性來制備。例如，可分別產(chǎn)生雙特異性分子的各結合特異性，然后再彼此偶聯(lián)。當結合特異性是蛋白質(zhì)或肽時，可使用多種偶合或交聯(lián)劑進行共價偶聯(lián)。交聯(lián)劑的實例包括蛋白質(zhì)A、碳化二亞胺、N-琥珀酰亞胺基-S-乙?；?硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰苯基二馬來酰亞胺(oPDM)、N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)和4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-l-甲酸磺基琥珀酰亞胺基酯(磺基-SMCC)(例如，參見Karpovsky等，1984J.Exp.Med.160:1686；Liu,MA等，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其他方法包括闡述于以下文獻中的：Paulus,1985Behring Ins.Mitt.第78期，118-132；Brennan等，1985Science 229:81-83)和Glennie等，1987J.Immunol.139:2367-2375)。偶聯(lián)劑是SATA和磺基-SMCC，其都可自Pierce Chemical公司(Rockford,IL)購得。

當結合特異性是抗體時，其可通過兩條重鏈的C末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵來偶聯(lián)。在特定實施方式中，在偶聯(lián)前鉸鏈區(qū)經(jīng)修飾而含有奇數(shù)個巰基殘基，例如1個。

或者，兩種結合特異性可在同一載體中編碼且在同一宿主細胞中表達并組裝。此方法在雙特異性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')₂或配體×Fab融合蛋白時尤其有用。本公開組合物中所包含的雙特異性分子可是包含一個單鏈抗體和結合決定簇的單鏈分子或包含兩個結合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用于制備雙特異性分子的方法闡述于(例如)美國專利第5,260,203號、第5,455,030號、第4,881,175號、第5,132,405號、第5,091,513號、第5,476,786號、第5,013,653號、第5,258,498和第5,482,858號中。

雙特異性分子與其特異性靶的結合可通過(例如)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或蛋白印跡分析來確認。這些分析中的每一個對尤為感興趣的蛋白質(zhì)-抗體復合物的檢測通常都通過采用對該感興趣復合物具有特異性的經(jīng)標記試劑(例如抗體)來進行。

多價抗體

在另一方面，本發(fā)明是關于包含多價抗體的組合物，這些抗體包含所公開ActRIIB結合抗體的至少兩個相同或不同的抗原結合部分。在一個實施方式中，多價抗體提供至少兩個、三個或四個抗體的抗原結合部分?？乖Y合部分可通過蛋白融合或共價或非共價連接連接在一起?；蛘撸丫碗p特異性分子闡述連接方法。在多個實施方式中，組合物可具有單價、二價或多價(例如能夠結合一個、兩個或若干個抗原)和/或單特異性、雙特異性或多特異性(例如具有能夠結合一種、兩種或若干種不同抗原的結合區(qū))。組合物可以是這些任意組合，例如單價和單特異性(具有一個結合一種抗原或表位的結合區(qū))；或二價和雙特異性(具有兩個結合區(qū)，其各自結合不同表位或抗原)；或二價和單特異性(具有兩個結合區(qū)，其各自結合相同表位或抗原)；或多價和單特異性(具有若干結合區(qū)，其都結合相同抗原或表位)；或多價和多特異性(具有若干結合區(qū)，其結合若干個不同的抗原或表位)。

醫(yī)藥組合物

在另一方面，本發(fā)明提供組合物，例如醫(yī)藥組合物，其含有上文所闡述抗體/單克隆抗體或其抗原結合部分其中之一或其組合，與藥學上可接受載劑調(diào)配在一起。這些組合物可包括所闡述抗體或免疫交聯(lián)物或雙特異性分子其中一個或其組合(例如兩個或更多個不同的)。例如，本公開的醫(yī)藥組合物可包含結合靶抗原上不同表位或具有互補活性的多個抗體的組合。

本公開的醫(yī)藥組合物也可在組合療法中施用，即與其他藥劑組合施用。例如，組合療法可包括本發(fā)明抗ActRII抗體與至少一種其他肌肉質(zhì)量/強度增加劑的組合，該增加劑是(例如)IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的變體、抗肌肉抑制素抗體、肌肉抑制素前肽、結合ActRIIB但不使其活化的肌肉抑制素誘餌蛋白、β2激動劑、胃饑餓素(Ghrelin)激動劑、SARM、GH激動劑/模擬物或卵泡抑素?？捎糜诮M合療法中的治療劑的實例更詳細闡述于下文關于本公開的抗體的用途部分中。

如本文所使用，“藥學上可接受的載劑”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑和類似試劑。載劑應適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、非經(jīng)腸、脊髓或表皮施用(例如通過注射或輸注)，優(yōu)選適于靜脈內(nèi)注射或輸注。根據(jù)施用路徑，可在材料中對活性化合物(即抗體、免疫交聯(lián)物或雙特異性分子)進行包衣以保護化合物免受可使化合物失活的酸和其他天然條件影響。

本公開的醫(yī)藥組合物可包括一或多種藥學上可接受的鹽?！八帉W上可接受的鹽”是指保留母體化合物所需生物活性而不造成任何不想要的毒理學效應的鹽(例如參見Berge,S.M.等，1977J.Pharm.Sci.66:1-19)。這些鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括衍生自無毒無機酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等)以及衍生自無毒有機酸(例如脂肪族單羧酸和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等)的那些。堿加成鹽包括那些衍生自堿土金屬(例如鈉、鉀、鎂、鈣等)以及衍生自無毒有機胺(例如N,N'-二芐基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等)的那些。

本公開的醫(yī)藥組合物也可包括藥學上可接受的抗氧化劑。藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括：水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉等；油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；以及金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本公開的醫(yī)藥組合物中合適的水性和非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其合適混合物、植物油(例如橄欖油)和可注射有機酯(例如油酸乙酯)。適當?shù)牧鲃有钥傻靡跃S持，例如通過使用例如卵磷脂等包衣材料、在分散系的情況中通過維持所需粒徑以及通過使用表面活性劑。

這些組合物也可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。通過滅菌程序(同前)和通過納入各種抗細菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)可確保阻止微生物的存在。這些組合物中也可包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等。此外，可通過納入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)可注射醫(yī)藥形式的延長吸收。

藥學上可接受的載劑包括無菌水溶液或分散液和用于當場制備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。本領域內(nèi)已知用于醫(yī)藥活性物質(zhì)的這些介質(zhì)和試劑的使用。任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑除與活性化合物不相容的以外，本公開涵蓋其在醫(yī)藥組合物中的用途。這些組合物中也可納入增補的活性化合物。

通常，治療組合物必須無菌且在制造和儲存條件下穩(wěn)定。組合物可調(diào)配成溶液、微乳液、脂質(zhì)體或其他適于高藥物濃度的有序結構。載劑可為溶劑或分散介質(zhì)，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物?？?例如)通過使用包衣(例如卵磷脂)、在分散液情形中通過維持所需粒徑以及通過使用表面活性劑來維持適當流動性。在許多情形下，可向組合物中納入等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉?？赏ㄟ^向組合物中納入延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)實現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。

無菌可注射溶液可通過將所需量的活性化合物根據(jù)需要和上文所列舉試劑其中一個或其組合一同納入合適溶劑中然后進行無菌微濾來制備。通常，可通過將活性化合物納入含有基本分散介質(zhì)和來自上文所列舉所需其他試劑的無菌載劑中來制備分散液。在使用無菌粉末制備無菌可注射溶液的情形下，制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，其可自其預先經(jīng)無菌過濾的溶液產(chǎn)生由活性劑加上任意所需額外試劑構成的粉末。

可與載劑材料組合產(chǎn)生單一劑型的活性劑的量將根據(jù)所治療個體和特定施用模式而變化。可與載劑材料組合產(chǎn)生單一劑型的活性劑的量通常是產(chǎn)生治療效應的組合物的量。通常在100％中，此量為活性劑在約0.01％至約99％范圍內(nèi)，約0.1％-約70％或約1％-約30％范圍內(nèi)，組合以藥學上可接受載劑。

可對劑量方案進行調(diào)整以提供最優(yōu)選的所需反應(例如治療反應)。例如可施用單次推注，可隨時間施用若干個分次劑量或可根據(jù)治療狀況緊急程度所示按比例減少或增加劑量。尤其有利的是將非經(jīng)腸組合物調(diào)配成劑量單位形式以便于施用和劑量均勻性。如本文所使用的劑量單位形式是指適于作為單位劑量供待治療個體使用的物理離散單元；各單元含有經(jīng)計算與所需醫(yī)藥載劑一起產(chǎn)生所需治療效應的預定量的活性化合物。本公開的劑量單位形式的規(guī)格取決于且直接依賴于活性化合物的獨特特征和待實現(xiàn)的特定治療效果，以及復合這一活性化合物以治療個體敏感性的現(xiàn)有技術中的固有限制。

對于含抗體組合物的施用，抗體劑量介于約0.0001mg/kg-約100mg/kg、且更通常介于約0.01mg/kg-約30mg/kg宿主體重范圍內(nèi)。例如，劑量為約1mg/kg體重、約3mg/kg體重、約5mg/kg體重或約10mg/kg體重，介于約1-10mg/kg范圍內(nèi)，例如約1mg/kg體重、2mg/kg體重、3mg/kg體重、4mg/kg體重、5mg/kg體重、6mg/kg體重、7mg/kg體重、8mg/kg體重、9mg/kg體重、10mg/kg體重，優(yōu)選每4周一次。優(yōu)選在靜脈內(nèi)施用。用于本公開的抗ActRII抗體(例如比麥單抗)的劑量方案包括每四周一次靜脈內(nèi)施用約1mg/kg體重或約3mg/kg體重或約10mg/kg體重。

同樣，可基于70kg成人個體平均重量以相應的固定劑量施用上述劑量范圍。

例如，劑量是約70mg、約210mg、約350mg或約500mg或約700mg，介于約70-700mg/kg范圍內(nèi)，例如約70mg/kg體重、140mg/kg體重、210mg/kg體重、280mg/kg體重、350mg/kg體重、420mg/kg體重、490mg/kg體重、560mg/kg體重、630mg/kg體重、700mg/kg體重，優(yōu)選每4周一次。

優(yōu)選地，本公開組合物用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)。

在一些方法中，本公開組合物包含兩個或更多個具有不同結合特異性的單克隆抗體并因而同時施用，在該情形下所施用每一抗體的劑量在所指示范圍內(nèi)。抗體通常是在多個時機施用。單個劑量之間的間隔可是(例如)每周、每月、每三個月、每六個月或每年。間隔也可如通過測量患者的針對靶抗原的抗體血液水平所指示而不規(guī)則。在一些方法中，對劑量進行調(diào)整以實現(xiàn)約1μg/ml-約1000μg/ml、且在一些方法中為約25μg/ml-約300μg/ml的血漿抗體濃度。例如，本公開的ActRII抗體可與抗肌肉抑制素抗體共施用。

劑量和頻率根據(jù)抗體在患者中的半衰期而變化。通常，人類抗體顯示出最長半衰期，其次為人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。施用劑量和頻率可根據(jù)治療是否為預防性還是治療性而變化。在預防性應用中，以相對較不頻繁的間隔經(jīng)較長時間段施用相對較低的劑量。一些患者在其余生中持續(xù)接受治療。在治療性應用中，有時需要相對較短間隔的相對較高劑量直至減輕或終止疾病進展或直至患者顯示出疾病癥狀的部分或完全改善。此后，可向患者施用預防性方案。

“治療有效劑量”的本公開組合物中所含抗ActRII抗體的施用可減輕疾病癥狀的嚴重程度、增加無疾病癥狀時段的頻率和持續(xù)時間或預防感病性所致?lián)p害或失能，即增加肌肉質(zhì)量和/或強度。

活性化合物可用保護化合物免于快速釋放的載劑制備，例如控釋劑型，包括植入物、經(jīng)皮貼劑和微囊封遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾纳锵嗳菥酆衔?，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制備這些劑型的許多方法已申請專利或通常為本領域技術人員已知。例如，參見Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker公司，New York,1978。

治療性組合物可與本領域已知的醫(yī)學裝置一起施用。

本發(fā)明的用途和方法

本發(fā)明的組合物和所公開抗體具有治療效用，這是因為其對散發(fā)性包涵體肌炎的治療或受散發(fā)性包涵體肌炎影響患者病況的改善或與散發(fā)性包涵體肌炎相關癥狀的減輕有影響。

如本文所使用，術語“對象”或“個體”包括人類和非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類、綿羊、狗、貓、牛、馬、雞、兩棲動物和爬行動物。

因此，本公開也關于治療方法，其中本公開組合物或所公開肌肉抑制素拮抗劑(例如肌肉抑制素結合分子或ActRII結合分子，優(yōu)選ActRII結合分子，更優(yōu)選針對ActRII的抗體，例如比麥單抗或BYM338)抑制(即拮抗)ActRII的功能，并從而引起髖部骨折手術恢復的改善。本公開提供加速/改善失用性萎縮患者身體恢復的方法，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)，包含向患者施用治療有效量的肌肉抑制素拮抗劑(例如肌肉抑制素結合分子或ActRIIB結合分子，優(yōu)選ActRIIB結合分子，更優(yōu)選針對ActRIIB的拮抗劑抗體，例如比麥單抗或BYM338)或所公開組合物。

可用于所公開治療方法中的肌肉抑制素拮抗劑(例如肌肉抑制素結合分子或ActRII結合分子，優(yōu)選ActRIIB結合分子，更優(yōu)選針對ActRIIB的拮抗劑抗體，例如比麥單抗或BYM338)的實例已公開或詳細闡述于上文中。在某些實施方式中，本文所公開的本發(fā)明組合物包含ActRII抗體(例如比麥單抗或BYM338)。

本公開也關于肌肉抑制素拮抗劑(例如肌肉抑制素結合分子或ActRIIB結合分子，優(yōu)選ActRIIB結合分子，更優(yōu)選針對ActRII的拮抗劑抗體，例如BYM338)在制備藥物中的用途，所述藥物用于加速/改善失用性萎縮患者身體恢復，所述失用性萎縮由髖部骨折和后續(xù)大手術造成移動性降低所引發(fā)。

在另一個實施方式中，患者可以未響應先前治療。例如，患者可能未響應使用以下物質(zhì)的治療：IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的變體、抗肌肉抑制素抗體、肌肉抑制素前肽、結合ActRIIB但不使其活化的肌肉抑制素誘餌蛋白、β2激動劑、胃饑餓素激動劑、SARM、GH激動劑/模擬物或卵泡抑素。測量患者對治療響應的簡單方式可以是對患者爬上已知高度的樓梯所花費時間進行計時并比較治療前和治療后的結果。

肌肉抑制素拮抗劑(例如肌肉抑制素結合分子或ActRII結合分子，優(yōu)選ActRII結合分子，更優(yōu)選針對ActRII的拮抗劑抗體，例如比麥單抗或BYM338)可作為唯一活性劑施用，或結合(例如作為佐藥或組合)例如以下的其他藥物施用：IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的變體、抗肌肉抑制素抗體、肌肉抑制素前肽、結合ActRIIB但不使其活化的肌肉抑制素誘餌蛋白、β2激動劑、胃饑餓素激動劑、SARM、GH激動劑/模擬物或卵泡抑素。例如，本公開的拮抗劑可與如WO2007/146689中所公開的IGF-1模擬物組合使用。

根據(jù)上文，本發(fā)明在另一方面提供：

一種如上文所定義的方法或用途，其包含共施用(例如同時或依序)治療有效量的肌肉抑制素拮抗劑(例如肌肉抑制素結合分子或ActRII結合分子，優(yōu)選ActRII或結合分子，更優(yōu)選針對ActRII的拮抗劑抗體，例如比麥單抗或BYM338)與至少一種第二藥品，該第二藥品是IGF-1、IGF-2或IGF-1或IGF-2的變體、抗肌肉抑制素抗體、肌肉抑制素前肽、結合ActRII但不使其活化的肌肉抑制素誘餌蛋白、β2激動劑、胃饑餓素激動劑、SARM、GH激動劑/模擬物或卵泡抑素。

套件

本發(fā)明也涵蓋套件，其可包含肌肉抑制素拮抗劑，例如肌肉抑制素結合分子(例如肌肉抑制素抗體或其抗原結合片段，例如比麥單抗或BYM338)或肌肉抑制素受體(即ActRIIB受體)結合分子(例如抗ActRIIB抗體或其抗原結合片段)(例如呈液體或凍干形式)或包含所述肌肉抑制素拮抗劑(如上所述)的醫(yī)藥組合物。此外，這些套件可包含用于施用肌肉抑制素拮抗劑的構件(例如注射器和小瓶、預填充注射器、預填充筆)和使用說明書。這些套件可含有其他治療劑(如上所述)，例如用于與所裝肌肉抑制素拮抗劑(例如BYM338)聯(lián)合遞送。

片語“用于施用……的構件”用來指用于向患者全身性施用藥物的任意可用器具，包括但不限于預填充注射器、小瓶和注射器、注射筆、自動注射器、靜脈滴注器和靜脈輸液袋、泵等。使用這些物項，患者可自施用藥物(即自己施用藥物)或醫(yī)師可施用藥物。

套件的每一部件通常裝在個別容器內(nèi)，且所有不同容器都與使用說明書一起在單個包裝內(nèi)。

序列

表1：序列表

所公開方法、治療、方案、用途和套件的一些實施方式采用肌肉抑制素拮抗劑，例如肌肉抑制素結合分子或ActRIIB結合分子。在其他實施方式中，ActRIIB結合分子是針對ActRIIB的拮抗劑抗體。

在所公開方法、治療、方案、用途和套件的一些實施方式中，該抗ActRIIB抗體是選自下組：a)抗ActRIIB抗體，其結合的ActRIIB表位包含以下序列：SEQ ID NO:SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；

(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；

(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；

(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；

(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；

(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；

(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或

(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)；

和b)針對ActRIIB的拮抗劑抗體，其結合的ActRIIB表位包含以下序列：SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN-SEQ ID NO:188)；

(b)SEQ ID NO:181的氨基酸76-84(GCWLDDFNC-SEQ ID NO:186)；

(c)SEQ ID NO:181的氨基酸75-85(KGCWLDDFNCY-SEQ ID NO:190)；

(d)SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR-SEQ ID NO:189)；

(e)SEQ ID NO:181的氨基酸49-63(CEGEQDKRLHCYASW-SEQ ID NO:187)；

(f)SEQ ID NO:181的氨基酸29-41(CIYYNANWELERT-SEQ ID NO:191)；

(g)SEQ ID NO:181的氨基酸100-110(YFCCCEGNFCN-SEQ ID NO:192)；或

(h)SEQ ID NO:181的氨基酸78-83(WLDDFN)和SEQ ID NO:181的氨基酸52-56(EQDKR)，

其中所述抗體具有約2pM的K_D。

在所公開方法、治療、方案、用途和套件的一些實施方式中，針對ActRIIB的拮抗劑抗體是人類抗體。

在所公開方法、治療、方案、用途和套件的一些實施方式中，抗體是比麥單抗或BYM338。

本公開的一或多個實施方式詳細闡釋于以上隨附說明中。任意類似于或等效于本文所述方法和材料的那些方法和材料都可用于本發(fā)明實踐或測試中，而現(xiàn)在闡述優(yōu)選方法和材料。根據(jù)說明書和權利要求書可顯見本發(fā)明的其他特征、目標和優(yōu)點。在說明書和隨附權利要求書中，除非上下文另外明確指明，否則單數(shù)形式包括復數(shù)個所指物。除非另外定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語都具有與本領域技術人員通常所理解相同的含義。本說明書中所引用的所有專利和出版物都以引用方式并入。呈現(xiàn)下列實施例以更全面地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。這些實施例決不應理解為限制所公開專利內(nèi)容的范圍，該范圍由隨附權利要求書限定。

實施例

一般方法

ActRIIB抗體，其表征和其相關方法，如(i)功能分析，(ii)報告基因分析(RGA)，(iii)HEK293T/17細胞系的培養(yǎng)，(iv)肌肉抑制素誘導的螢光素酶報告基因分析，(v)特異性ELISA，(vi)ActRIIB/Fc-肌肉抑制素結合相互作用ELISA，(vii)對表達hActRIIB和hActRIIA的細胞的FACS滴定，(viii)結合原代人類骨骼肌細胞，(ix)使用表面等離子共振(Biacore)的所選抗人類ActRIIB Fab的親和力測定，(x)CK分析，(xi)動物模型，(xii)治療方案，(xiii)統(tǒng)計分析，(xiiii)淘選，(xv)抗體鑒定和表征，(xvi)源自第一次親和力成熟的抗體的優(yōu)化，(xvii)親和力成熟Fab(第1次成熟)的IgG2轉化，(xviiii)第二次親和力成熟，(xx)IgG2轉化和IgG2的表征(第2次成熟)，(xxi)體內(nèi)鼠類研究中抗ActRIIB抗體的表征，(xxii)通過SET的親和力確認，(xxiii)交叉阻斷研究和(xxiv)表位定位詳情和技術都已公開于WO 2010/125003中。

研究設計

這是IIa/IIb期、56周、4治療組、平行組、隨機化、雙盲、安慰劑對照的多中心臨床研究(圖8)。用術后至多5周的篩選期評價適格性。在基線拜訪時，將245名適格患者以2:1:2:2隨機化至安慰劑、70mg比麥單抗、210mg比麥單抗或700mg比麥單抗。隨機化患者將被治療12個月且每4周接受研究治療持續(xù)總共13個劑量。在所有患者都完成24周治療后，將進行終點分析以評價主要和次要終點以及關鍵安全性量度。在完成治療期后，患者將進入4周的治療后隨訪。研究結束(EOS)拜訪將在接受研究治療的最后劑量之后8周。

存在3個研究期：

篩選期：在實施任何研究特定程序前必須獲得知情同意。一旦患者開始步行(定義為完成4米步行速度測試的個體)且能夠進入復健程序(根據(jù)個體患者的功能恢復而定，預計在手術后約7天開始)，立刻開始篩選期。篩選期可持續(xù)其后最多4周(手術后最多35天)；然而，應盡可能快地完成以確?；颊咴谄涔δ芑謴烷_始時進入試驗。

必須在患者隨機化前確認骨折修復手術成功介入，其由研究者評估為：1)通過X-射線所確認的按照制造商說明書的手術固定或關節(jié)成形術，和2)完成手術傷口愈合。

在確認滿足所有納入準則和無一排除準則后，將患者隨機化。

隨機化必須在篩選起始后盡快發(fā)生，以使研究藥劑的治療可在患者的個體“功能基線”后不久開始。

隨機化日期是“第1天”研究拜訪(基線/隨機化)且用作整個研究時段訪問日程的參照。

治療期：

在隨機化當天(第1天)施用研究治療的第一個劑量。在每次拜訪時，所有評估將在研究治療施用前實施，給藥后PK取樣除外?；颊邔⒔邮?3個劑量，每4周一個劑量。最終劑量將在第48周拜訪時施用且治療期將在4周后即在第52周拜訪時結束(治療結束)。

在用于髖部骨折的局部標準護理以外施用研究治療并聯(lián)合需要遵守方案規(guī)定最小需求的局部復健程序(包括阻力訓練)。

治療后追蹤期：在完成治療結束拜訪后，患者將進入治療后隨訪時且在4周后即在第56周(或在接受研究治療的最終劑量后8周)完成研究。

研究設計的原理

沒有公開的醫(yī)療管理機構指南提供關于此研究群體或手術后失用性萎縮的治療的考慮因素。所用的假說是：與僅接受標準護理的患者相比，藥物誘導的肌肉質(zhì)量增加與標準復健結合將引起肌肉強度和耐力的恢復增強以及隨后的功能性能改善。由于身體性能改善，可預計跌倒和相關損傷/骨折的發(fā)生率將減小。

劑量/方案、施用路徑和治療持續(xù)時間的原理

施用劑量、頻率、路徑和治療持續(xù)時間的選擇是基于三個I期研究的結果：首次人體(FIH)研究(CBYM338X2101 A部分)、健康男性志愿者中的上石膏研究(CBYM338X2101 B部分)和健康志愿者中的多劑量研究(CBYM338X2102)。劑量和頻率

在所述I期試驗中，3mg/kg和10mg/kg劑量可有效增加健康志愿者中的TMV，因此預計這些劑量在髖部骨折后的患者中有效。健康志愿者(CBYM338X2101和CBYM338X2102)中的結果指示，對于10mg/kg和30mg/kg的單一劑量，通過MRI所評價的大腿肌肉體積的增加相當，但30mg/kg的效果持續(xù)時間更長。即使認為3mg/kg在給藥間隔內(nèi)所引起完全受體占有的持續(xù)時間是10mg/kg的約一半，比麥單抗的3個重復每月劑量在3mg/kg和10mg/kg下使得健康成人的TMV增加相當。在健康志愿者(CBYM338X2101)中，在輸注單一劑量的1mg/kg比麥單抗后觀察到對TMV的效應有限且短暫。因此，預計在此研究中，1mg/kg劑量是無效或最小有效劑量。

此研究將評估每4周施用的70mg、210mg或700mg比麥單抗的固定i.v.劑量。相當于前述研究中所用的mg/kg劑量的該固定劑量是基于平均患者重量計算的，且當前研究用類似計算基于文獻中報導的髖部骨折患者(66±12kg)的四舍五入成70kg的平均患者重量(Mak等，2014)算出。因此，此研究將評估70mg(最初1mg/kg)、210mg(最初3mg/kg)或700mg(最初10mg/kg)的比麥單抗的固定i.v.劑量。

最初選擇基于重量給藥以確保在各治療組中覆蓋所有患者體重的一致暴露。然而無論是固定給藥或基于重量的給藥，并不預計隨機化患者將以超過那些在前述研究中經(jīng)歷最高測試劑量(即30mg/kg)的Cmax值暴露于比麥單抗。

每4周的給藥頻率是基于自PK/PD研究，觀察到10mg/kg每4周給藥和30mg每8周i.v.給藥的功效達到相同平臺。

施用路徑

研究藥劑通過靜脈內(nèi)輸注30分鐘來施用，其在研究BYM338X2107中經(jīng)過測試并記載為耐受良好。

治療持續(xù)時間

在用合成代謝劑(甲磺酸伊布莫侖)治療髖部骨折患者的新近研究顯示，按簡短身體功能量表其步行速度評分部分所測量，6個月(而非3個月)治療可有效改善身體功能(Adunsky等，2011)。由于預計LBM增加在2至3個月治療后達到最大值且預計觀察到的功能益處具有延遲，假定療法的6個月持續(xù)時間足以增加髖部骨折患者的功能恢復看來是合理的。

然而，由于髖部骨折恢復需要約1年，因此至多12個月的較長治療可能有增加益處(次要目標)，特別是如果可減少在12月時段內(nèi)跌倒次數(shù)。繼發(fā)性髖部骨折的主要風險因素是跌倒，且所有骨折的90％以上發(fā)生在跌倒后。使用65歲和更大年紀的髖部骨折患者的醫(yī)療保險(Medicare)和醫(yī)療援助(Medicaid)數(shù)據(jù)，Bischoff-Ferrari等(2010)報導了10.3％在3年內(nèi)遭受第二次髖部骨折-51％的二次髖部骨折發(fā)生在首次骨折的6個月內(nèi)且75％發(fā)生在一年內(nèi)。

第一劑量的時間安排

比麥單抗的功效預計在伴有身體活動時最優(yōu)，因此協(xié)調(diào)第一劑量的時間安排在臨近物理療法的開始(即手術后7天-4周且最多6周)。由Chudyk等，2009和English and Paddon-Jones D 2010綜述的多個研究表明，髖部骨折手術固定后的早期離床活動可改善患者結果，例如早期身體功能、出院回家的速度、并發(fā)癥和再入院。最近的綜述也主張物理治療的及早(且優(yōu)選更加強的)開始對于克服髖部骨折手術后肌肉強度的早期損失是至關重要的(Bandholm and Kehlet 2012)，這是恢復過程的重要預測因子。

選擇比較劑的原理

需要選擇安慰劑作為對照試劑以獲得關于積極治療的特異性效果相對非特異性效果的信息，且其提供評估比麥單抗功效和評價安全性及耐受性的最好方法。

在失用性萎縮中不存在任何批準的藥理學比較劑(即“黃金標準”或“護理標準”)下，在維生素D(最少800IU/天)和身體復健外，也使用安慰劑。

預期益處

預計如在健康志愿者和sIBM患者中所見，髖部骨折患者肌肉質(zhì)量將增加，其可轉變成更好的功能且較快恢復至移動。在研究持續(xù)時間內(nèi)，跌倒次數(shù)可能減少，從而引起繼發(fā)性髖部骨折的減少。

群體

納入準則

適于納入此研究中的患者必須滿足所有以下標準：

1.隨機化時≥65歲的男性和絕經(jīng)后女性；

2.患者必須已進行髖部骨折的手術治療(內(nèi)側、外側和股骨轉子近端股骨骨折，AO分類31A-C(AO Foundation 2013)；

3.患者在隨機化時必須心智健全，F(xiàn)olstein簡易精神狀態(tài)檢查(MMSE)評分至少≥21；

4.患者必須能夠完成4m步行速度測試。在手術后初始7天期間重新獲得移動性(即負重步行能力)的患者不合格。

5.患者必須能夠理解并遵循研究的需求和程序，承諾參與復健訓練且愿意參與約56周；

6.患者在篩選時必須至少35kg且必須具有介于15-35kg/m²范圍內(nèi)的身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)；

排除標準

滿足以下任意標準的患者不適于納入此研究中。研究者不可施加其他排除，以確保研究群體能代表所有適格患者：

矯正外科病史、與肌肉損失相關的醫(yī)學病況、干擾身體評價(SPPB和步行速度)的醫(yī)學病況、臨床上顯著的心血管共病、肝相關病況或提出問題的其他醫(yī)學病況。

治療

1.研究治療

諾華將供應以下研究藥物：

·比麥單抗：BYM338 150mg/1ml液體，在小瓶(具有橡膠塞和鋁鉗口瓶蓋的無色玻璃小瓶)中。

·安慰劑：BYM338安慰劑/1ml液體，在小瓶(具有橡膠塞和鋁鉗口瓶蓋的無色玻璃小瓶)中。

2.其他研究治療

髖部骨折后護理療法的局部標準

用于圍手術期或手術后管理患者的護理療法的局部標準(例如用于血栓形成預防、疼痛管理、鈣補充、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥預防)是可接受的且可根據(jù)國際或當?shù)刂改鲜褂谩?/p>

方案要求的額外研究治療

此方案需要遵守：

·復健(最低需求在下文定義)

·維生素D補充(每日最少800國際單位(IU))

最低復健要求

假定髖部骨折后的復健是使比麥單抗在該適應癥中效果最大化的先決條件。尤其是復健過程中的阻力和強度訓練可與誘導肌肉肥大的合成代謝化合物協(xié)同工作。理想地，對所有患者實施標準復健程序，以避免評價不同的比麥單抗給藥方案功效中的變化。

然而，在此研究中，出于兩個原因未定義詳細單一復健方案：

·化合物應在不同情況(包括不同復健程序)下起效，和

·包括多個場所與不同復健方法的統(tǒng)一似乎不可行。醫(yī)學界中存在關于復健主要階段的總體共識，包括阻力練習程序的有益影響。此方案將確保入選的每一患者都接受最少的所需復健要素，作為比麥單抗與練習訓練協(xié)同作用的基礎(表1)。通過使用由患者以及研究組完成的電子練習遵守日記監(jiān)測對程序的遵守。

表1最少所需復健訓練，3課時/周，持續(xù)10周

場所應愿意且能夠遵守最少復健措施以參與此研究。如果在特定場所需要，患者可實施額外練習。

關鍵功效評價

通過DXA評價總LBM和aLBM

監(jiān)測LBM(瘦體質(zhì)量)變化的臨床相關性在于以下事實：藥物誘導的肌肉質(zhì)量增加是后續(xù)功能改善的先決條件。關于睪酮補充的先前工作已通過記錄突出此情況：為增強肌肉強度和身體功能閾值，必須改善LBM和四肢骨骼肌質(zhì)量(Sattler等，2011)。與此先前觀察一致，接受單一劑量比麥單抗(30mg/kg)的sIBM患者的初步數(shù)據(jù)顯示，藥物誘導的LBM增加(在8-12周時為平臺期)之后，按第24周時的6分鐘步行距離(6MWD)所定量(圖6-1)，身體性能顯著增加。此外，隨著藥物退出LBM下降并恢復至基線時，功能益處也消失。因此，LBM增加是預計功能益處的臨床相關反映。

雙能量X射線吸收測定法提供用于估計骨骼肌質(zhì)量的推薦替代方法，與黃金標準方法(例如電腦化斷層攝影(CT)和MRI)相比，其具有以下優(yōu)點：不太昂貴、掃描時間短、對患者的輻射暴露大幅降低以及在臨床和研究設定中更廣泛可用。

研究文獻記載DXA方法給出平均總身體骨骼肌估計值，其與通過CT或MRI所測量的肌肉緊密一致，盡管DXA往往系統(tǒng)地高估總身體骨骼肌約5％(Wang等，1996，Chen等，2007)。這是由于以下事實：當測量總LBM時，DXA也考慮軀干、皮膚和脂肪組織中非脂肪組分的器官瘦肉質(zhì)量(Wang等，1976)。

關注于aLBM(腿加上肢)或腿LBM的瘦肉質(zhì)量測量僅可稍微改善骨骼肌質(zhì)量的估計(Chen等，2007)。然而，當在監(jiān)測設定中使用時，消除軀干對更高準確度的優(yōu)點可由于在使用解剖學標志以定義四肢中被不同掃描之間差異產(chǎn)生的變化壓倒(Covey等，2010，Wang等，1996)。在旨在確立藥物與誘導的骨骼肌質(zhì)量變化之間劑量-反應關系的多中心2期臨床試驗背景中，后一變化尤其相關。

此外，在監(jiān)測設定中較少顧慮用以估計總骨骼肌質(zhì)量的總LBM的相對不準確度，這是因為藥物對器官瘦肉質(zhì)量、皮膚或脂肪質(zhì)量的非脂肪組分不具有已知的效應。作為支持，BYM338X2102研究中的觀察指示總LBM(DXA)的變化％與大腿肌肉體積(MRI)變化％之間的高度相關性(r＝0.94)。

盡管總LBM是定量藥物的主要藥效學效果并確立劑量-反應關系的優(yōu)選選擇，但對aLBM變化(其也是手術后復健(體育鍛煉)的目標)的測量和監(jiān)測的興趣也在增加，以探究藥物誘導的骨骼肌質(zhì)量變化如何預測/反映治療的預期功能益處。

簡短身體功能量表(SPPB)

流行病學研究和門診診所已顯示簡短身體功能量表(SPPB)可高度預測社區(qū)老年人的后續(xù)失能、住院、機構收治和死亡(Guralnik等，2000；Studenski等，2003)。即使在調(diào)節(jié)共病和自陳功能狀態(tài)的水平和嚴重性后，仍保持失能。

最近，已證明SPPB可行且能安全地被用于評估因嚴重醫(yī)學病況被收入醫(yī)院的急性疾病老年患者的功能狀態(tài)，且SPPB評分可提供重要短期預后信息(Volpato等，2008)。SPPB評分低于10的患者相較評分為10或更高的那些患者更可能出現(xiàn)若干其他疾病。在多個回歸分析中，作者發(fā)現(xiàn)較下肢功能差的顯著獨立預測因子是年齡、糖尿病、中風和骨質(zhì)疏松癥。

此外，在住院期間和在出院后頭幾周中通過SPPB對身體性能的序貫評估可提供關于老年急性疾病患者中未來健康風險的額外信息?？傊蓪PPB視為非特異性但反映若干潛在生理損害的整體健康狀態(tài)的高度敏感性指示因子。

步行速度

步行速度將作為SPPB的一部分來測得以評價功能改善。常見步行速度代表應用于老年人的標準臨床評估中的最合適身體性能量度之一。步行速度與身體活動水平、下肢肌肉的等長收縮力變化、脆弱性和跌倒相關(Newman等，2005，Chandler等，1998，Cesari等，2005)。

步行速度不僅是充分確立的身體功能量度，其也可在不同的社區(qū)老年群體中預測未來失能，且靈敏反映身體狀態(tài)對身體活動(包括短期復健)的響應(Barthuly等，2012)。按步行速度緩慢或下降測量的較差功能性能與失能、住院和死亡風險相關(Studenski等，2011)，而步行速度改善與死亡風險降低有關(Hardy等，2007)。出于這些原因，步行速度經(jīng)常被引用為老年群體健康的整體指示因子。

跌倒和骨折

髖部骨折患者在骨折后經(jīng)歷實質(zhì)移動性降低，其中大部分患者從未恢復至骨折前的移動性程度。許多這些患者也在骨折后時段中經(jīng)歷移動性有關的事件，尤其是跌倒(Bischoff-Ferrari等，2010)。在這些脆性個體中，跌倒經(jīng)常引起損傷，包括復發(fā)性骨折。骨折后時段中的比麥單抗治療可能加速肌肉體積增加，且可改善強度和移動性，可能引起改善的身體功能和潛在地引起移動性相關不良事件減少。

關鍵安全性評價

此研究中的安全性評價包括：

·所有AE和SAE(包括輸注位點和過敏反應)的評估

·身體檢查

·生命體征、身高和重量

·實驗室評估

·心電圖(ECG)

·心維、壁厚度和收縮性的二維超聲心動圖監(jiān)測

·手術并發(fā)癥(如果有)和髖部骨折愈合的X射線評價

·免疫原性

·營養(yǎng)狀態(tài)

·監(jiān)測對側(未影響)髖部BMD的DEXA

參考文獻列表：

Abrahamsen B,van Staa T,Ariely R,Olson M,Cooper C(2009).Excess mortality following hip fracture:a systematic epidemiological review.Osteoporos Int；20(10):1633-50。

Adunsky A,Chandler J,Heyden N等，(2011)MK-0677(ibutamoren mesylate)for the treatment of patients recovering from hip fracture:a multicenter,randomized,placebo-controlled phase IIb study.Arch Gerontol Geriatr；53:183-9。

Auais MA,Eilayyan O,Mayo NE(2012)Extended exercise rehabilitation after hip fracture improves patients’physical function:a systematic review and meta-analysis.Phys Ther；92:1437-1451。

Bandholm T和Kehlet H(2012)Physiotherapy exercise after fast-track total hip and knee arthroplasty:time for reconsideration？Arch Phys Med Rehabil；93:1292-4。Barthuly AM,Bohannon RW,Gorack W(2012)Gait speed is a responsive measure of physical performance for patients undergoing short-term rehabilitation.Gait Posture；36(1):61-4。

Bischoff-Ferrari HA,Dawson-Hughes B,Platz A等，(2010)Effect of high-dosage cholecalciferol and extended physiotherapy on complications after hip fracture:a randomized controlled trial.Arch Intern Med；170:813-20。

Beavers KM,Beavers DP,Houston DK,Harris TB,Hue TF,Koster A,Newman AB,Simonsick EM,Studenski SA,Nicklas BJ,Kritchevsky SB.Associations between body composition and gait-speed decline:results from the Health,Aging,and Body Composition study.Am J Clin Nutr.2013；97(3):552-60。

Brooks SV,Faulkner JA.Skeletal muscle weakness in old age:underlying mechanisms.Med Sci Sports Exerc.1994；26(4):432-9。

Campbell C,Escolar D,Mah J等A Phase 2,randomized,placebo-controlled,multiple ascending-dose study of ACE-031,a soluble activin receptor Type IIB,in boys with Duchenne muscular dystrophy(DMD).Neurology 2012；78:P04.088。

Cesari M,Kritchevsky SB,Penninx BW等，(2005)Prognostic value of usual gait speed in well-functioning older people--results from the Health,Aging and Body Composition Study.J Am Geriatr Soc；53:1675-80。

Chandler JM,Duncan PW,Kochersberger G,Studenski S(1998)Is lower extremity strength gain associated with improvement in physical performance and disability in frail,community-dwelling elders？Arch Phys Med Rehabil；79(1):24-30。

Chen Z,Wang Z,Lohman T等(2007)Dual-energy X-ray absorptiometry is a valid tool for assessing skeletal muscle mass in older women.J Nutr；137(12):2775-80。

Chevalier S,Gougeon R,Choong N,Lamarche M,Morais JA.Influence of adiposity in the blunted whole-body protein anabolic response to insulin with aging.J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2006；61:156-64。

Chudyk AM,Jutai JW,Petrella RJ,Speechley M(2009)Systematic review of hip fracture rehabilitation practices in the elderly.Arch Phys Med Rehabil；90:246-62。

Covey MK,Berry JK,Hacker ED(2010)Regional body composition:cross-calibration of DXA scanners--QDR4500W and Discovery Wi.Obesity(Silver Spring)；18(3):632-7。

D'Adamo CR,Hawkes WG,Miller RR,Jones M,Hochberg M,Yu-Yahiro J,Hebel JR,Magaziner J.Short-term changes in body composition after surgical repair of hip fracture.Age Ageing.2014；43(2):275-80。

Daguet E1,Jolivet E,Bousson V,Boutron C,Dahmen N,Bergot C,Vicaut E,Laredo JD.Fat content of hip muscles:an anteroposterior gradient.J Bone Joint Surg Am.2011；93(20):1897-905。

English KL,Paddon-Jones D(2010)Protecting muscle mass and function in older adults during bed rest.Curr Opin Clin Nutr Metab Care；13(1):34-39。

Frontera WR,Hughes VA,Fielding RA,Fiatarone MA,Evans WJ,Roubenoff R.Aging of skeletal muscle:a 12-yr longitudinal study.J Appl Physiol.2000；88(4):1321-6。

Fox KM1,Magaziner J,Hawkes WG,Yu-Yahiro J,Hebel JR,Zimmerman SI,Holder L,Michael R.Loss of bone density and lean body mass after hip fracture.Osteoporos Int.2000；11(1):31-5。

Goodpaster BH,Park SW,Harris TB等.The loss of skeletal muscle strength,mass,and quality in older adults:the health,aging and body composition study.J Gerontol A Biol Sci Med Sci.2006；61(10):1059-64。

Goodpaster BH,Carlson CL,Visser M等.Attenuation of skeletal muscle and strength in the elderly:The Health ABC Study.J Appl Physiol.2001；90(6):2157-65。

Guralnik JM,Ferrucci L,Pieper CF等(2000)Lower extremity function and subsequent disability:consistency across studies,predictive models,and value of gait speed alone compared with the short physical performance battery.J Gerontol A Biol Sci Med Sci；55(4):M221-31。

Hardy SE,Perera S,Roumani YF等(2007)Improvement in usual gait speed predicts better survival in older adults.J Am Geriatr Soc；55(11):1727-34。

Lach-Trifilieff E1,Minetti GC,Sheppard K,Ibebunjo C,Feige JN,Hartmann S,Brachat S,Rivet H,Koelbing C,Morvan F,Hatakeyama S,Glass DJ.An antibody blocking activin type II receptors induces strong skeletal muscle hypertrophy and protects from atrophy.Mol Cell Biol.2014；34(4):606-18。

Lang T,Cauley JA,Tylavsky F,Bauer D,Cummings S,Harris TB；Health ABC Study.Computed tomographic measurements of thigh muscle cross-sectional area and attenuation coefficient predict hip fracture:the health,aging,and body composition study.J Bone Miner Res.2010；25(3):513-9。

Lee SJ,McPherron AC.Regulation of myostatin activity and muscle growth.Proc Natl Acad Sci U S A.2001年7月31日；98(16):9306-11。

Lee SJ,Reed LA,Davies MV,Girgenrath S,Goad ME,Tomkinson KN,Wright JF,Barker C,Ehrmantraut G,Holmstrom J,Trowell B,Gertz B,Jiang MS,Sebald SM,Matzuk M,Li E,Liang LF,Quattlebaum E,Stotish RL,WolfmannM.Regulation of muscle growth by multiple ligands signaling through activin type II receptors.Proc Natl Acad Sci U S A.2005 Dec 13；102(50):18117-22。

Newman AB,Haggerty CL,Kritchevsky SB,Nevitt MC,Simonsick EM；Health ABC Collaborative Research Group(2003)Walking performance and cardiovascular response:associations with age and morbidity--the Health,Aging and Body Composition Study.J Gerontol A Biol Sci Med Sci；58(8):715-20。

Pahor M,Kritchevsky S.Research hypotheses on muscle wasting,aging,loss of function and disability.J Nutr Health Aging 1998；2:97-100。

Sattler F,Bhasin S,He J等(2011)Testosterone threshold levels and lean tissue mass targets needed to enhance skeletal muscle strength and function:the HORMA trial.J Gerontol A Biol Sci Med Sci；66:122-9。

Schaap LA,Pluijm SM,Smit JH,van SchoornM,Visser M,Gooren LJ,Lips P.The association of sex hormone levels with poor mobility,low muscle strength and incidence of falls among older men and women.Clin Endocrinol(Oxf)2005；63:152-60。

Smith RC,Lin BK.Myostatin inhibitors as therapies for muscle wasting associated with cancer and other disorders.Curr Opin Support Palliat Care.2013；7(4):352-360。

Studenski S,Perera S,Wallace D等(2003)Physical performance measures in the clinical setting.J Am Geriatr Soc；51(3):314-22。

Studenski S,Perera S,Patel K等(2011)Gait speed and survival in older adults.JAMA；305(1):50-8。

Trendelenburg AU,Meyer A,Rohner D,Boyle J,Hatakeyama S,Glass DJ.Myostatin reduces Akt/TORC1/p70S6K signaling,inhibiting myoblast differentiation and myotube size.Am.J.Physiol.Cell Physiol.2009；296:C1258-C1270。

Vandervoort AA.Aging of the human neuromuscular system.Muscle Nerve.2002；25(1):17-25。

Verghese J,Holtzer R,Oh-Park M,Derby CA,Lipton RB,Wang C.Inflammatory markers and gait speed decline in older adults.J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2011；66:1083-9.31。

Visser M,Kritchevsky SB,Goodpaster BH等.Leg muscle mass and composition in relation to lower extremity performance in men and women aged 70 to 79:the health,aging and body composition study.J Am Geriatr Soc.2002；50(5):897-904。

Visser M,Goodpaster BH,Kritchevsky SB等.Muscle mass,muscle strength,and muscle fat infiltration as predictors of incident mobility limitations in well-functioning older persons.J Gerontol A Biol Sci Med Sci.2005；60(3):324-33。

Visser M,Pahor M,Taaffe DR,Goodpaster BH,Simonsick EM,Newman AB,Nevitt M,Harris TB.Relationship of interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha with muscle mass and muscle strength in elderly men and women:the Health ABC Study.J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2002；57:M326-32。

Volpato S,Cavalieri M,Guerra G等(2008)Performance-based functional assessment in older hospitalized patients:feasibility and clinical correlates.J Gerontol A Biol Sci Med Sci；63(12):1393-8。

Wang J,Pierson RN Jr(1976)Disparate hydration of adipose and lean tissue require a new model for body water distribution in man.J Nutr；106:1687-93。

Wang ZM,Visser M,Ma R等(1996)Skeletal muscle mass:evaluation of neutron activation and dual-energy X-ray absorptiometry methods.J Appl Physiol；80:824-31。

Waters DL,Qualls CR,Dorin RI,Veldhuis JD,Baumgartner RN.Altered growth hormone,cortisol,and leptin secretion in healthy elderly persons with sarcopenia and mixed body composition phenotypes.J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2008；63:536-41。

Wehren LE1,Hawkes WG,Hebel JR,Orwig DL,Magaziner J.Bone mineral density,soft tissue body composition,strength,and functioning after hip fracture.J Gerontol A Biol Sci Med Sci.2005；60(1):80-4。

Whittemore LA,Song K,Li X,Aghajanian J,Davies M,Girgenrath S,Hill JJ,Jalenak M,Kelley P,Knight A,Maylor R,O'Hara D,Pearson A,Quazi A,Ryerson S,Tan XY,Tomkinson KN,Veldman GM,Widom A,Wright JF,Wudyka S,Zhao L,WolfmannM.Inhibition of myostatin in adult mice increases skeletal muscle mass and strength.Biochem Biophys Res Commun.2003年1月24日；300(4):965-71。