根據(jù)美國法典第35篇第119條(e)款，本申請要求2014年3月11日提交的臨時美國序列號61/951,439的優(yōu)先權(quán)，所述申請以引用的方式并入本文。

序列表

本申請含有已以ASCII格式電子版形式提交且特此以引用的方式整體并入的序列表。2015年2月24日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝名為09531.389WO1_SL.txt并且大小為76,617字節(jié)。

發(fā)明背景

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是感染沿豬的小腸排列的細(xì)胞的冠狀病毒，從而引起豬流行性腹瀉(一種嚴(yán)重腹瀉和脫水的病狀)。它通常在老豬(older hog)中引起疾病，從而使得體重減輕，但是它在新生小豬中是嚴(yán)重疾病，通常在感染病毒的數(shù)天內(nèi)致死。PEDV首次在歐洲發(fā)現(xiàn)，但在亞洲國家，諸如韓國、中國、日本、菲律賓以及泰國變得越來越成問題。在2013年它還傳播到北美，并且。(Stevenson等人，Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,25(5)649-654,2013)。由于PEDV具有高度傳染性，從而在小豬中導(dǎo)致顯著的發(fā)病率和死亡率并且與增加的疫苗接種和消毒成本相關(guān)，因此是巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)(Song等人，Virus Genes,44(2):167–175,2012)。

尚未已知存在預(yù)防PEDV感染的疫苗。因此，對預(yù)防或改善PEDV感染的有效手段存在明顯持續(xù)的需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供一種疫苗和有效使易感豬對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)免疫的疫苗接種的方法。在某些實施方案中，疫苗含有與生理上可接受的無毒媒介物組合的免疫原性量的PEDV。在某些實施方案中，疫苗含有與生理上可接受的無毒媒介物組合的免疫原性量的PEDV S1蛋白(也稱為“突起”蛋白)或其變體。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含第一免疫原性組合物，所述第一免疫原性組合物包含豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和藥學(xué)上可接受的無毒媒介物，其中PEDV與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少90％的同一性(即，90％、91％、92％、93％、或94％、或95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)。在某些實施方案中，PEDV與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少99％、99.9％或99.99％的同一性。在某些實施方案中，PEDV由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2組成。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含第一免疫原性組合物，所述第一免疫原性組合物包含豬流行性腹瀉病毒(PEDV)S1蛋白和藥學(xué)上可接受的無毒媒介物，其中PEDV S1蛋白與由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4編碼的蛋白具有至少90％的同一性(即，90％、91％、92％、93％、或94％、或95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)。在某些實施方案中，PEDV與由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4編碼的蛋白具有至少99％、99.9％或99.99％的同一性。在某些實施方案中，PEDV S1蛋白由通過SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4編碼的蛋白組成。

在某些實施方案中，組合物還包含有效量的免疫學(xué)佐劑。

在某些實施方案中，組合物包含PEDV或綴合或連接至非PEDVS1肽的PEDVS1蛋白。

在某些實施方案中，組合物包含PEDV或綴合或連接至多糖的PEDVS1蛋白。

在某些實施方案中，組合物還包含第二免疫原性組合物。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種保護易感豬以防豬流行性腹瀉病毒(PEDV)感染的方法，其包括向豬施用有效量的上述組合物。在某些實施方案中，組合物通過肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下遞送或通過粘膜表面施用。在某些實施方案中，組合物通過口服攝取施用。在某些實施方案中，組合物通過鼻內(nèi)施用。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含表達盒，所述表達盒包含啟動子和編碼豬流行性腹瀉病毒(PEDV)S1蛋白的序列，其中PEDV S1蛋白與由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4編碼的蛋白具有至少90％的同一性(即，90％、91％、92％、93％、或94％、或95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％)。在某些實施方案中，PEDV與由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4編碼的蛋白具有至少99％、99.9％或99.99％的同一性。在某些實施方案中，PEDV S1蛋白由通過SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4編碼的蛋白組成。

附圖簡述

圖1提供了美國/印第安納州12.83/2013(SEQ ID NO:1)的序列。

圖2提供了美國/愛荷華州23.57/2013(SEQ ID NO:2)。

圖3提供了美國.印第安納州12.83.2013(SEQ ID NO:3)。

圖4提供了美國.愛荷華州23.57.2013(SEQ ID NO:4)。

發(fā)明詳述

核酸

本發(fā)明提供編碼部分或全部PEDV或PEDV S1蛋白的核酸。術(shù)語“核酸”指以單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物，其由包含糖、磷酸和可以是嘌呤或嘧啶的堿基的單體(核苷酸)構(gòu)成。除非具體限定，否則本術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有與參照核酸類似的結(jié)合性質(zhì)并且以與天然發(fā)生核苷酸類似的方式代謝。除非另外指示，否則一個特定核酸序列也涵蓋其經(jīng)過保守性修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)和互補序列，以及明確指示的序列。具體地，簡并密碼子取代可通過產(chǎn)生序列來實現(xiàn)，其中一個或多個選擇的(或所有)密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代。“核酸片段”是給定核酸分子的一部分。

術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”或“核酸片段”可在本文中互換使用。這些術(shù)語涵蓋由磷酸二酯鍵連接的核苷酸。“多核苷酸”可以是任選地含有合成、非天然或經(jīng)修飾的核苷酸堿基的單鏈或雙鏈的核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)聚合物。呈DNA的聚合物形式的多核苷酸可包含cDNA、基因組DNA、合成DNA中的一個或多個區(qū)段或其混合物。核苷酸堿基在本文中以單字母代碼示出：腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。除非具體限定，否則本術(shù)語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有與參照核酸類似的結(jié)合性質(zhì)并且以與天然發(fā)生核苷酸類似的方式代謝。除非另外指示，否則一個特定核酸序列也隱含地涵蓋其經(jīng)過保守性修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)和互補序列，以及明確指示的序列。具體地，簡并密碼子取代可通過產(chǎn)生序列來實現(xiàn)，其中一個或多個選擇的(或所有)密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代。

“核苷酸序列”是DNA或RNA的聚合物，其可以是單鏈或雙鏈的，任選地包含能夠摻入DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然的或經(jīng)修飾的核苷酸堿基。術(shù)語“核酸”、“核酸分子”、“核酸片段”、“核酸序列或區(qū)段”或“多核苷酸”可互換使用，并且可以同樣與基因、通過基因編碼的cDNA、DNA和RNA互換使用。

本發(fā)明涵蓋分離的或基本上純化的核酸組合物。在本發(fā)明的上下文中，“分離的”或“純化的”DNA分子或RNA分子是遠(yuǎn)離其天然環(huán)境存在的DNA分子或RNA分子并且因此不是天然產(chǎn)物。分離的DNA分子或RNA分子可以以純化的形式存在，或者可以在非天然環(huán)境，例如像在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中存在。例如，“分離的”或“純化的”核酸分子或其生物活性的部分，在通過重組技術(shù)生產(chǎn)時基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。在一個實施方案中，“分離的”核酸不含在所述核酸衍生自其的生物的基因組DNA中天然地側(cè)接所述核酸的序列(即位于所述核酸的5'和3'端的序列)。所公開的核苷酸序列的片段和變體也被本發(fā)明涵蓋?！捌巍被颉安糠帧币庵溉L的核苷酸序列或小于全長的核苷酸序列。

“天然存在的”、“天然的”或“野生型”用于描述可以在自然中發(fā)現(xiàn)而區(qū)別于人工生產(chǎn)的對象。例如，存在于生物(包括病毒)中的蛋白或核苷酸序列(其可以從自然中的來源分離并且沒有通過實驗室人員有意地修飾)是天然存在的。

“基因組”指生物的全部遺傳材料。

如在本領(lǐng)域中已知，“同一性”是通過比較序列確定的兩個或多個多肽序列或兩個或多個多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”還意指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，視情況而定，如通過此類序列串之間的匹配所確定的?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨梢酝ㄟ^已知方法方便地計算，包括但不限于以下文獻中描述方法：(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編，牛津大學(xué)出版社，New York，1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,編，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.編，M Stockton Press，New York，1991；以及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。設(shè)計確定同一性的優(yōu)選方法以得到所測試序列之間的最大匹配。在可公開獲得的計算機程序中編碼確定同一性和相似性的方法。確定兩個序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法包括但不限于，GCG程序包(Devereux,J.等，1984)、BLASTP、BLASTN以及FASTA(Altschul,S.F.等，1990。BLASTX程序可自NCBI和其他來源公開獲得(BLAST Manual,Altschul,S.等,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894；Altschul,S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于確定同一性。

通過本領(lǐng)域中已知的多種方法制備編碼PEDV S1蛋白的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但不限于從天然來源(在天然存在的氨基酸序列變體的情況中)分離或通過寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點)誘變、PCR誘變和盒誘變PEDV S1蛋白的早期制備的變體或非變體版的制備。

啟動子

“啟動子”是指通常在其編碼序列上游(5')的核苷酸序列，其通過提供關(guān)于RNA聚合酶和其他對于正確轉(zhuǎn)錄所需要的因子的識別來控制編碼序列的表達?！皢幼印卑ǘ藾NA序列的最小啟動子，其包括TATA框和作用是具體說明轉(zhuǎn)錄起始位點的其他序列，所述最小啟動子上可添加用于控制表達的調(diào)控元件?！皢幼印边€指包括最小啟動子和調(diào)控元件的核苷酸序列，其能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達。這種類型的啟動子序列包括近端和更遠(yuǎn)距離的上游元件，后一類元件通常被稱為增強子。因而，“增強子”是可刺激啟動子活性的DNA序列，并且可以是啟動子的內(nèi)在元件或插入的異源元件以增強啟動子的水平或組織特異性。它能夠在兩個方向(正常方向或翻轉(zhuǎn)方向)運行并且即使當(dāng)移動到啟動子上游或下游時，能夠發(fā)揮功能。增強子和其他上游啟動子元件都結(jié)合介導(dǎo)其效應(yīng)的序列特異性的DNA結(jié)合蛋白。啟動子可以整個衍生自天然基因，或包括衍生自天然可見的不同啟動子的不同元件，或者甚至包括合成的DNA區(qū)段。啟動子還可以含有蛋白質(zhì)因子結(jié)合所涉及的DNA序列，其響應(yīng)生理的或發(fā)育的條件，控制轉(zhuǎn)錄起始的效率。啟動子的綜述性討論提供于美國專利號7,501,129中，其以引用方式并入本文。

本發(fā)明涵蓋分離的或基本上純化的核酸組合物。在本發(fā)明的上下文中，“分離的”或“純化的”DNA分子或RNA分子是遠(yuǎn)離其天然環(huán)境存在的DNA分子或RNA分子并且因此不是天然產(chǎn)物。分離的DNA分子或RNA分子可以以純化的形式存在，或者可以在非天然環(huán)境，例如像在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中存在。例如，“分離的”或“純化的”核酸分子或其生物活性的部分，在通過重組技術(shù)生產(chǎn)時基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。在一個實施方案中，“分離的”核酸不含在所述核酸衍生自其的生物的基因組DNA中天然地側(cè)接所述核酸的序列(即位于所述核酸的5'和3'端的序列)。例如，在各種實施方案中，分離的核酸分子可含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在所述核酸衍生自其的細(xì)胞的基因組DNA中天然地側(cè)接所述核酸分子的核苷酸序列。所公開的核苷酸序列的片段和變體也被本發(fā)明涵蓋?！捌巍被颉安糠帧币庵溉L的核苷酸序列或小于全長的核苷酸序列。

“天然存在的”、“天然的”或“野生型”用于描述可以在自然中發(fā)現(xiàn)而區(qū)別于人工生產(chǎn)的對象。例如，存在于生物(包括病毒)中的蛋白或核苷酸序列(其可以從自然中的來源分離并且沒有通過實驗室人員有意地修飾)是天然存在的。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供運載體和含有上述啟動子的表達盒?！斑\載體”定義為包括，尤其是任何病毒運載體，以及任何質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或雙元運載體，其呈雙鏈或單鏈、線性或環(huán)狀形式，可以是或可以不是可自主轉(zhuǎn)移的或可移動的，并且其可以通過融入細(xì)胞基因組或在染色體外存在(例如，具有復(fù)制起點的自主復(fù)制質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化原核或真核宿主。

使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)，編碼治療組合物的核酸可被工程化到運載體中，諸如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor,NY(2001)中描述的那些技術(shù)。例如，連接可以在20mM Tris-Cl pH 7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10mM-50mM NaCl中與40μM ATP、0.01-0.02(Weiss)單位T4DNA連接酶在0℃(用于“粘性末端”連接)或1mM ATP、0.3-0.6(Weiss)單位T4DNA連接酶在14℃(用于“平末端”連接)完成。分子間的“粘性末端”連接通常在總DNA濃度30-100μg/ml(總終濃度5-100nM)下實施。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供了含有表達盒的運載體，所述表達盒包含可操作地連接至靶序列(例如PEDV S1蛋白)的啟動子以用于疫苗生產(chǎn)?！氨磉_盒”在本文中意指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在恰當(dāng)宿主細(xì)胞中表達的核酸序列，所述表達盒包括可操作地連接至目的核苷酸序列的啟動子，所述目的核苷酸序列可操作地連接至終止信號。編碼區(qū)通常編碼目的功能RNA，例如RNAi分子。包括目的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的。

“可操作地連接”指在單一分子片段上核酸或氨基酸序列的連接，從而使得序列之一的功能受另一個所影響。例如，將調(diào)節(jié)DNA序列稱為“可操作地連接至”編碼RNA或多肽的DNA序列或“與其連接”，如果這兩個序列處于這樣的位置，從而使得調(diào)節(jié)DNA序列影響編碼DNA序列的表達(即，編碼序列或功能RNA在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)。編碼序列可以以有義或反義方向可操作地連接至調(diào)節(jié)序列。當(dāng)核酸與另一個核酸序列呈功能關(guān)系安置時，所述核酸被“可操作地連接”。一般來說，“可操作地連接”意指所連接的DNA序列是鄰接的。然而，增強子不必是連續(xù)的。連接是通過連接于適宜的限制位點處來達成。如果所述位點不存在，那么根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸轉(zhuǎn)接頭或接頭。另外，編碼酶的核酸的多個拷貝可一起連接在表達運載體中。這種多個核酸可被接頭隔開。

“表達”是指內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，在反義構(gòu)建體的情況下，表達可僅指反義DNA的轉(zhuǎn)錄。此外，表達是指有義(mRNA)或功能RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積聚。表達還可以指蛋白的產(chǎn)生。

“表達盒”在本文中意指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在恰當(dāng)宿主細(xì)胞中表達的DNA序列，所述表達盒包括可操作地連接至目的核苷酸序列的啟動子，所述目的核苷酸序列可操作地連接至終止信號。它還典型地包括核苷酸序列的適當(dāng)翻譯所要求的序列。編碼區(qū)通常編碼目的蛋白，但是也可能編碼目的功能RNA(例如反義RNA或非翻譯的RNA，以有義或反義方向)。包含目標(biāo)核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，這指的是它的至少一種組分相對于它的至少一種其他組分是異源的。表達盒還可以是天然存在的但是已經(jīng)以用于異源表達的重組體形式來獲得的表達盒。這種表達盒將包含連接至目的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。這種表達盒可設(shè)置有多個限制性位點，所述限制性位點用于插入將處于調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控下的目的基因。表達盒可另外地含有選擇性標(biāo)記基因。

本發(fā)明還提供含有本文所述的運載體的哺乳動物細(xì)胞。

蛋白質(zhì)

PEDV S1蛋白可綴合或連接至另一個肽或至多糖。例如，可以利用本領(lǐng)域公知的又被稱為“載體”的免疫原性蛋白?？捎玫挠忻庖咴缘鞍装ㄨ€孔血藍(lán)素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、人血清白蛋白、人丙種球蛋白、雞免疫球蛋白G以及牛丙種球蛋白。可用的免疫原性多糖包括來自其他病原體的多糖，諸如作為疫苗有效的那些多糖。免疫原性多糖或其他病原體的蛋白可綴合至PEDV S1蛋白、連接至PEDV S1蛋白或與PEDV S1蛋白混合。

術(shù)語“蛋白”、“肽”和“多肽”在本文中可互換使用。

術(shù)語“氨基酸”包括呈右旋或左旋立體異構(gòu)體的形式的天然氨基酸(例如，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr以及Val)以及非天然氨基酸(例如，磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸、磷酸酪氨酸、羥脯氨酸以及γ-羧基谷氨酸；馬尿酸、八氫吲哚-2-羧酸、抑胃酶氨酸(statine)、1,2,3,4,-四氫異喹啉-3-羧酸、青霉胺、鳥氨酸、瓜氨酸、α--甲基-丙氨酸、對-苯甲酰基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、炔丙基甘氨酸、肌氨酸和叔-丁基甘氨酸)的殘基。術(shù)語還包括具有常規(guī)氨基保護基團(例如乙?；蚱S氧羰基)的天然和非天然的氨基酸(右旋和左旋立體異構(gòu)體)以及在羧基末端(例如，作為(C₁-C₆)烷基、苯基或芐基或酰胺；或作為α-甲基芐基酰胺)被保護的天然和非天然氨基酸。其他合適的氨基和羧基保護基團是本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的(參見例如，Greene,T.W.；Wutz,P.G.M.,Protecting Groups In Organic Synthesis；第二版，1991，New York，John Wiley&sons公司以及其中引用的文件)。氨基酸可通過羧基末端、氨基末端或通過任何其他方便的附接點例如像通過例如半胱氨酸的硫連接至化合物的其余部分。

本發(fā)明涵蓋分離的或基本上純化的蛋白組合物。在本發(fā)明的上下文中，“分離的”或“純化的”多肽是遠(yuǎn)離其天然環(huán)境存在的多肽并且因此不是天然產(chǎn)物。多肽可以以純化的形式存在，或者可以在非天然環(huán)境，例如像在轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中存在。例如，“分離的”或“純化的”蛋白或其生物活性的部分，在通過重組技術(shù)生產(chǎn)時基本上不含其他細(xì)胞材料或培養(yǎng)基，或者當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品?；旧喜缓?xì)胞材料的蛋白包括具有小于污染蛋白的約30％、20％、10％、5％(按干重計)的蛋白或多肽的制備物。當(dāng)本發(fā)明的蛋白或生物活性部分重組地產(chǎn)生時，優(yōu)選地培養(yǎng)基表示少于目的化學(xué)品的前體或非蛋白的約30％、20％、10％、或5％(按干重計)的。由此編碼的所公開的蛋白或部分長度蛋白的片段和變體也被本發(fā)明涵蓋?！捌巍被颉安糠帧币庵溉L的或小于全長的多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

分子的“變體”是基本上類似于天然分子的序列的序列。

“分離的”意思是從天然狀態(tài)發(fā)生改變或者去除。例如，在活動物體內(nèi)天然存在的核酸或肽不是“分離的”，但部分地或完全地從其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)分離出來的相同核酸或肽是“分離的”。分離的核酸或蛋白質(zhì)可以大致上純化的形式存在，或者可存在于非天然環(huán)境(例如，宿主細(xì)胞)中。除非此處另外具體說明，否則蛋白、病毒粒子復(fù)合體、抗體以及形成本發(fā)明的主題的其他生物分子被分離或可以被分離。

在肽的上下文中，術(shù)語“基本上同一性”是指包含在指定比較窗中與參考序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、或79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、或89％、至少90％、91％、92％、93％、或94％、或95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的序列的肽。使用Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比對算法進行最佳比對。兩個肽序列基本上同一的指標(biāo)是一條肽與針對第二肽產(chǎn)生的抗體有免疫學(xué)反應(yīng)。因此，例如當(dāng)兩條肽僅僅因保守取代而不同時，一條肽基本上與第二肽同一。

佐劑

如本文使用的術(shù)語“佐劑”是指免疫應(yīng)答的非特異性刺激物，或可以在宿主中產(chǎn)生儲庫(depot)的物質(zhì)，當(dāng)分別與本發(fā)明的疫苗和藥物組合物組合時可以產(chǎn)生甚至更強的免疫應(yīng)答。疫苗通常含有兩種組分：抗原(例如，PEDV S1蛋白或PEDV)和佐劑。抗原是病原體或免疫應(yīng)答所指向的腫瘤編碼的分子結(jié)構(gòu)。為了活化抗原特異性免疫應(yīng)答，抗原必須存在于適當(dāng)?shù)拿庖叽碳のh(huán)境中。在某些實施方案中，佐劑通過刺激免疫活化分子諸如促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來創(chuàng)建這種微環(huán)境。疫苗的功效取決于抗原和佐劑的類型以及它們被如何施用。在這些組分中實現(xiàn)正確的平衡對引出期望的免疫學(xué)結(jié)果是重要的。

在某些實施方案中，如本文所述的免疫原性組合物還包含一種或多種佐劑。佐劑是當(dāng)與免疫原或抗原一起施用時增強免疫應(yīng)答的物質(zhì)。細(xì)胞因子或淋巴因子的數(shù)目顯示具有免疫調(diào)節(jié)活性并且因此可用作佐劑，包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8以及10、12(參見例如美國專利號5,723,127)、13、14、15、16、17和18(及其突變形式)；干擾素-α、β和γ；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)(參見，例如美國專利號5,078,996和ATCC保藏號39900)；巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)；粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)；以及腫瘤壞死因子α和β?？膳c本文所述的免疫原性組合物一起使用的另外佐劑包括趨化因子，包括但不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β以及RANTES；粘附分子，諸如選擇蛋白，例如，L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和E-選擇蛋白；粘蛋白樣分子，例如，CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整合蛋白家族的成員，諸如LFA-1、VLA-1、Mac-1以及p150.95；免疫球蛋白超家族成員，諸如PECAM、ICAM，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3；共刺激分子諸如CD40和CD40L；生長因子，包括血管生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管內(nèi)皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2以及DR6；以及半胱天冬酶(ICE)。

其他佐劑還包括胞壁酰肽，諸如N-乙?；?胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙?；?去甲胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油型乳劑，諸如MF59(美國專利號6,299,884)(包含5％角鯊烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(可選地包含多種量的MTP-PE)，使用諸如型號110Y微射流機(microfluidizer)(Microfluidics,Newton,MA))和SAF(包含10％角鯊烯、0.4％Tween 80、5％普朗尼克(pluronic)嵌段聚合物L(fēng)121和thr-MDP，微射流為亞微米乳劑或渦旋來產(chǎn)生更大顆粒大小的乳劑)；鋁鹽(明礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸招；白槽石(Amphigen)；阿夫立定；L121/角鯊烯；D-交酯-聚交酯/配糖；普朗尼克多元醇；滅活的博德特桿菌屬(Bordetella)；皂素，諸如描述于美國專利號5,057,540的Stimulon^TMQS-21(Antigenics,Framingham,MA.)、描述于美國專利號5,254,339中的ISCOMATRIX(CSL公司，Parkville，澳大利亞)和免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)；結(jié)核分枝桿菌；細(xì)菌脂多糖；合成多核苷酸，諸如含有CpG基序的寡核苷酸(例如美國專利號6,207,646)；描述于歐洲專利號1,296,713和1,326,634中的IC-31(Intercell AG,Vienna，奧地利)；百日咳毒素(PT)或其突變體、霍亂毒素或其突變體(例如，美國專利號7,285,281、7,332,174、7,361,355以及7,384,640)；或大腸桿菌(E.coli)不耐熱毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72(例如，美國專利號6,149,919、7,115,730和7,291,588)。

用于增強免疫應(yīng)答的合適的佐劑還包括但不限于MPL^TM(3-O-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A，Corixa,Hamilton,MT)，其在美國專利號4,912,094中有所描述。還適用作佐劑的是合成脂質(zhì)A類似物或氨基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)或其衍生物或其類似物，其可得自Corixa(Hamilton,MT)并且在美國專利號6,113,918中有所描述。一種此類AGP是2-[(R)-3-十四?；趸孽；被鵠乙基2-脫氧-4-O-膦?；?3-O-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷?；鵠-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四?；?氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也被稱為529(先前被稱為RC529)。這種529佐劑被配制成水性形式(AF)或穩(wěn)定的乳劑(SE)。

合適的佐劑包括但不限于表面活性劑，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基雙十八烷基溴化銨，N，N-雙十八烷基-N'-N-雙(2-羥乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基甘油和普朗尼克多元醇；聚陰離子(polanions)，例如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC、聚丙烯酸、卡波姆(carbopol)；肽，例如胞壁酰二肽、MPL、對甲基甘氨酸、特夫素(tuftsin)、油乳劑、明礬及其混合物。其他可能的佐劑包括大腸桿菌(E.coli)熱不穩(wěn)定腸毒素和霍亂毒素的B肽亞單元。McGhee,J.R.等人，"On vaccine development,"Sem.Hematol.,30:3-15(1993)。最后，可將免疫原性產(chǎn)品并入到脂質(zhì)體中以用于疫苗制劑或可和綴合至蛋白諸如鑰孔血藍(lán)素(KLH)或人血清清蛋白(HSA)或其他聚合物。

本發(fā)明的疫苗

在某些實施方案中，本發(fā)明提供用于保護哺乳動物免受PEDV感染或治療PEDV感染的疫苗。

如本文所用，術(shù)語“治療劑”或“治療復(fù)合物”是指對哺乳動物接受者有有益效應(yīng)的任何藥劑或材料。因此，“治療劑”涵蓋具有核酸或蛋白質(zhì)組分的治療性和預(yù)防性分子。

為了制備疫苗，可分離、凍干和穩(wěn)定PEDV或PEDV S1蛋白。然后可將PEDV或PEDV S1蛋白調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)臐舛?，?yōu)選地與合適的疫苗佐劑組合并且封裝以用于使用。

在某些實施方案中，本發(fā)明包含兩種或更多種免疫原性多肽。在某些實施方案中，可將一種或多種多肽調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)臐舛炔⑶铱膳c任何合適的佐劑、稀釋劑、藥學(xué)上可接受的載體或其任何組合一起配制。本文中使用的短語“藥學(xué)上可接受的載體”旨在包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑、賦形劑等，這些都與藥物的施用相適應(yīng)。用于藥物活性物質(zhì)的此類介質(zhì)和藥劑的使用為本領(lǐng)域已熟知的。生理上可接受的媒介物可用作載體和/或稀釋劑。藥學(xué)可接受的媒介物應(yīng)理解是指進入藥物組合物或免疫原性組合物的化合物或化合物組合，其不導(dǎo)致副作用并且其使得可以例如促進活性化合物的施用、增加其在體內(nèi)的壽命和/或其功效、增加其在溶液中的溶解度或另選地增強其保存。這些藥學(xué)上可接受的媒介物是公知的并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所選活性化合物的性質(zhì)和施用模式而適應(yīng)。這些包括但不限于水、林格氏溶液、合適的等滲介質(zhì)、甘油、乙醇及其他常規(guī)溶劑、磷酸鹽緩沖鹽水等。

如本文所用的“治療”是指改善給定疾病或病狀的至少一種癥狀和/或預(yù)防其發(fā)展。

“抗原”是指能夠通過抗體結(jié)合的分子。抗原另外能夠被免疫系統(tǒng)識別和/或能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致B-和/或T-淋巴細(xì)胞活化?？乖删哂幸粋€或多個表位(B和/或T細(xì)胞表位)。如本文所用的抗原還可以是若干單個抗原的混合物?！翱乖瓫Q定簇”是指被B或T淋巴細(xì)胞特異性識別的抗原的部分。應(yīng)答抗原決定簇的B-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而T-淋巴細(xì)胞通過效應(yīng)物功能的增殖和建立應(yīng)答抗原決定簇，所述效應(yīng)物功能對于細(xì)胞和/或體液免疫性的介導(dǎo)是重要的。

“免疫應(yīng)答”是指導(dǎo)致B和/或T淋巴細(xì)胞和/或以及抗原遞呈細(xì)胞的活化或增殖的體液免疫應(yīng)答和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而，在一些情況中，免疫應(yīng)答可具有低強度并且僅當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的至少一種物質(zhì)時變得可檢測?！懊庖咴浴笔侵赣糜诖碳せ钌矬w的免疫系統(tǒng)的藥劑，從而免疫系統(tǒng)的一種或多種功能增加并且指向免疫原性劑。“免疫原性多肽”是引出細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答的多肽，所述多肽無論是單獨或連接至載體的。優(yōu)選地，可活化抗原遞呈細(xì)胞。

“增強”免疫應(yīng)答的物質(zhì)是指與沒有添加所述物質(zhì)情況下測量的相同免疫應(yīng)答相比較，添加所述物質(zhì)后觀察到免疫應(yīng)答更劇烈，或強化或以任何方式偏離。例如，使用⁵¹Cr釋放測定，可測定在免疫過程中使用和不使用所述物質(zhì)所獲得的樣品中細(xì)胞毒性T細(xì)胞的溶胞活性。與不使用所述物質(zhì)情況下的CTL溶胞活性相比，CTL溶胞活性增強下所述物質(zhì)的量，被稱為增強動物對抗原的免疫應(yīng)答的足夠量。在某些實施方案中，免疫應(yīng)答增強至少大約2倍，諸如大約3倍或以上。分泌的細(xì)胞因子的量或類型也可能改變。另選地，誘導(dǎo)的抗體的量或其亞類也可能改變。

術(shù)語“免疫”或“免疫作用”或相關(guān)術(shù)語，是指賦予對靶抗原或表位產(chǎn)生充分免疫應(yīng)答(包括抗體和/或細(xì)胞免疫，例如效應(yīng)物CTL)的能力。這些術(shù)語不要求產(chǎn)生完全免疫，但是產(chǎn)生的免疫應(yīng)答要比基線實質(zhì)上更高。例如，如果在應(yīng)用本發(fā)明方法之后發(fā)生針對靶抗原的細(xì)胞和/或體液免疫應(yīng)答，則就可認(rèn)為哺乳動物針對該靶抗原進行了免疫。

術(shù)語“免疫治療”是指用于治療疾病、病癥或病狀的組合物。更具體地講，術(shù)語用于指治療的方法，其中通過疫苗接種或通過免疫分子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生有益的免疫應(yīng)答?！懊庖哂行Я俊笔侵府?dāng)引入個體時足以在個體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物的量。在主動免疫的語境下，所述術(shù)語與“產(chǎn)生免疫的有效量”同義。成為免疫有效的所必需的組合物的量隨許多因素而變化，包括組合物、組合物中其他組分的存在、抗原、免疫途徑、個體、既往免疫或生理狀況等。

術(shù)語“表位”是指被單個抗體或T細(xì)胞受體識別的基本元件或最小單位，并且因此是指所述抗體或T細(xì)胞受體與之結(jié)合的特定結(jié)構(gòu)域、區(qū)域或分子結(jié)構(gòu)。抗原可由多個表位組成，而半抗原通常可具有少數(shù)表位。如本文所用的“基本上相當(dāng)于”是指將引出至少基本等同于由天然表位產(chǎn)生的應(yīng)答的免疫應(yīng)答的表位。對組合物或疫苗的免疫應(yīng)答是在細(xì)胞的宿主中的發(fā)展和/或?qū)δ繕?biāo)多肽或疫苗的抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通常，這種應(yīng)答包括特異性針對目標(biāo)組合物或疫苗中所包括的一種或多種抗原的受試者產(chǎn)生抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。本發(fā)明的疫苗還可包括已知增強免疫應(yīng)答的有效量的免疫佐劑?！坝行Я俊笔侵笇崿F(xiàn)所需生物作用必需或足夠的量。組合物的有效量可為實現(xiàn)這個選定結(jié)果的量，并且這種量可按慣例由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如，用于治療免疫系統(tǒng)缺陷的有效量可為引起免疫系統(tǒng)活化必需的量，從而導(dǎo)致在暴露于抗原時抗原特異性免疫應(yīng)答的發(fā)展。所述術(shù)語還與“足量”同義。任何具體應(yīng)用的有效量可隨例如待治療的疾病或病狀、要施用的具體組合物、受試者的大小和/或疾病或病狀的嚴(yán)重性等此類因素而變化。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需過度實驗，便可憑經(jīng)驗確定本發(fā)明的具體組合物的有效量。

為了使受試者免疫，腸胃外(通常通過肌內(nèi)或皮下注射)施用在合適媒介物中的組合物。然而，其他施用方式，諸如口服、鼻內(nèi)或皮內(nèi)遞送，也是可接受的。

疫苗制劑可含有在媒介物中的有效量的活性成分，有效量容易通過本領(lǐng)域技術(shù)人員確定?；钚猿煞滞ǔ？稍诮M合物的約1％至約95％(w/w)的范圍內(nèi)，或適當(dāng)時甚至更高或更低。待施用的量取決于諸如考慮疫苗接種的動物或人受試者的年齡、體重和身體狀況的因素。量還可取決于動物免疫系統(tǒng)合成抗體的能力和所需保護的程度。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可通過建立劑量反應(yīng)曲線的常規(guī)試驗容易地確立有效劑量。通過以一種或多種劑量施用生物膜肽或其片段，使受試者免疫?？砂葱枋┯枚鄤┝恳员３謱δ繕?biāo)細(xì)菌的免疫狀態(tài)。

鼻內(nèi)制劑可包括既不對鼻粘膜產(chǎn)生刺激也不顯著擾亂纖毛功能的媒介物。稀釋劑諸如水、鹽水或其他已知的物質(zhì)可與主題發(fā)明一起使用。鼻用制劑還可含有防腐劑，諸如但不限于氯代丁醇和苯扎氯銨。表面活性劑可存在以增強目標(biāo)蛋白質(zhì)被鼻粘膜吸收。

口服液體制備物可呈例如水性或油性懸浮劑、溶液、乳劑、糖漿或酏劑的形式，或可以片劑形式干燥提供，或以使用前用水或其他合適的媒介物復(fù)溶的產(chǎn)品干燥提供。這種液體制備物可以含有常規(guī)添加劑，諸如懸浮劑、乳化劑、非水性媒介物(可以包括食用油)或防腐劑。

為了制備疫苗，可分離、凍干和穩(wěn)定純化的組合物。然后可將組合物調(diào)節(jié)至適當(dāng)?shù)臐舛?，?yōu)選地與合適的疫苗佐劑組合并且封裝以用于使用。

制劑和施用方法

在某些實施方案中，將有效量的病毒、疫苗或治療組合物施用至受試者?！坝行Я俊被颉爸委熡行Я俊痹诒疚闹锌苫Q使用，并且是指有效實現(xiàn)特定生物學(xué)結(jié)果的化合物、制劑、材料或組合物的量，如本文中所描述。此類結(jié)果可以包括但不限于對病毒感染的抑制，如通過本領(lǐng)域中合適的任何手段所測定的。

在某些實施方案中，施用一定量的疫苗以使受試者免疫。如本文所用，“免疫”或“疫苗接種”在本文中可互換使用，并且旨在用于預(yù)防性或治療效免疫或疫苗接種。

在某些實施方案中，疫苗、治療組合物或病毒經(jīng)由肌內(nèi)、皮內(nèi)或皮下遞送施用。在某些實施方案中，疫苗、治療組合物或病毒經(jīng)由粘膜表面，諸如口或鼻內(nèi)表面施用。在某些實施方案中，疫苗、治療組合物或病毒經(jīng)由胸骨內(nèi)注射或通過使用注入技術(shù)施用。

在某些實施方案中，“醫(yī)藥學(xué)上可接受”是指就組合物、制劑、穩(wěn)定性、患者接受性和生物可用性來說，從藥理學(xué)/毒理學(xué)角度患者可接受且從物理/化學(xué)角度醫(yī)藥制造化學(xué)家可接受的那些性質(zhì)和/或物質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的載體”是指不干擾一種或多種活性成分的生物活性效果且對施用至的宿主無毒的介質(zhì)。

本發(fā)明的疫苗和組合物可被配制成藥物組合物并且以適合于所選施用途徑(即，經(jīng)口、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或胃腸外、通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、局部或皮下途徑)的多種形式向哺乳動物宿主(如人患者)施用。

因此，本發(fā)明化合物可與藥學(xué)上可接受的媒介物(如惰性稀釋劑或可吸收食用載體)組合來全身性施用，例如經(jīng)口施用。它們可封閉在硬殼或軟殼明膠膠囊中，可壓制成片劑，或可直接摻入患者膳食的食物。對于經(jīng)口治療性施藥，活性化合物可與一種或多種賦形劑組合并且以可攝取片劑、經(jīng)頰片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片等形式使用。所述組合物和制劑應(yīng)含有至少0.1％活性化合物。當(dāng)然組合物和制劑的百分比可變化并且可合宜地在給定單位劑型的約2重量％至約60重量％之間。活性化合物在所述治療適用組合物中的量是使得將獲得有效劑量水平的量。

片劑、錠劑、丸劑、膠囊等還可含有以下各物：粘合劑，如黃蓍樹膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸二鈣；崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；以及甜味劑，如蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜或可添加調(diào)味劑，如胡椒薄荷、冬青油或櫻桃香精。當(dāng)單位劑型是膠囊時，除以上類型的材料之外，它也可包含液體載體，如植物油或聚乙二醇。各種其他材料可作為包衣存在或以其他方式修改固體單位劑型的物質(zhì)形態(tài)。舉例來說，片劑、丸劑或膠囊可用明膠、蠟、蟲膠或糖等包覆。糖漿或酏劑可含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或果糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯、染料和調(diào)味劑，如櫻桃或甜橙香精。當(dāng)然，用于制備任何單位劑型的任何材料都應(yīng)為藥學(xué)上可接受的并且在所用量下大致上無毒。此外，活性化合物可并入持續(xù)釋放制劑和裝置中。

活性化合物還可通過輸注或注射來靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用?？捎谒兄苽浠钚曰衔锘蚱潲}的溶液，任選與無毒表面活性劑混合。還可于甘油、液體聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中以及于油中制備分散液。在普通的儲存和使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。

適用于注射或輸注的藥物劑型可包括無菌水溶液或分散液或任選地囊封于脂質(zhì)體中的包含活性成分的無菌粉末，所述活性成分適合于臨時制備無菌可注射或可輸注溶液或分散液。在所有情況下，最終劑型應(yīng)該在制造和存儲條件下處于無菌、流體和穩(wěn)定狀態(tài)。液態(tài)載體或媒介物可為溶劑或液態(tài)分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、植物油、無毒甘油酯及其適合的混合物。適當(dāng)?shù)牧鲃有钥衫缤ㄟ^形成脂質(zhì)體、在分散液的情況下維持所需粒度或使用表面活性劑加以維持。對微生物作用的防止可通過各種抗菌劑和抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)來實現(xiàn)。在許多情況下，將為優(yōu)選的是包括等滲劑，例如糖、緩沖劑或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長吸收可通過在組合物中使用延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)來實現(xiàn)。

無菌可注射溶液是通過將在適當(dāng)溶劑中的所需量的活性化合物與以上列舉的各種其他成分(根據(jù)需要)合并，隨后進行過濾滅菌來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，所述技術(shù)產(chǎn)生活性成分外加存在于先前無菌過濾溶液中的任何額外所需成分的粉末。對于局部施用，本發(fā)明的化合物可以純的形式(當(dāng)它們是液體時)施加。然而，將通常合乎需要的是將它們與皮膚病學(xué)上可接受的載體組合，以組合物或制劑形式施用至皮膚，所述載體可為固體或液體。

適用的固體載體包括微細(xì)分散的固體，如滑石、粘土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等。適用的液體載體包括水、醇或二醇或水-醇/二醇摻合物，其中本發(fā)明化合物可任選地借助于無毒表面活性劑在有效水平下溶解或分散于所述載體中?？商砑恿硗獾某煞种T如芳香劑或抗微生物劑以使給定用途的性質(zhì)最優(yōu)化。所得液體組合物可通過用于浸漬繃帶和其他敷料的吸收墊施用，或使用泵型噴霧器或氣霧劑噴霧器噴射于受影響的區(qū)域上。

如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽和酯類、脂肪醇、改性纖維素或改性礦物質(zhì)的增稠劑也可與液態(tài)載體一起使用，以便形成用于直接向使用者的皮膚施用的可涂敷糊劑、凝膠劑、軟膏劑、皂劑等。

所需劑量可方便地以單個劑量提供或以適當(dāng)時間間隔施用的分次劑量提供，例如以每天兩次、三次、四次或更多次亞劑量提供。亞劑量本身可進一步分成例如多個獨立的松散間隔的施用；如多次自吹入器吸入或通過多次滴入眼中。

為了使受試者免疫，腸胃外(通常通過肌內(nèi)或皮下注射)施用在合適媒介物中的PEDV S1蛋白或PEDV。然而，諸如口服遞送或鼻內(nèi)遞送的其他施用方式也是可接受的。疫苗制劑將含有在媒介物中的有效量的活性成分。

制劑可含有在媒介物中的有效量的活性成分，有效量容易通過本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。“有效量”意指指示實現(xiàn)所需生物作用必需或足夠的化合物的量。活性成分通?？稍诮M合物的約1％至約95％(w/w)的范圍內(nèi)，或適當(dāng)時甚至更高或更低。用于任何具體應(yīng)用的量可根據(jù)如病狀的嚴(yán)重性的此類因素而改變。待施用的量取決于諸如考慮疫苗接種的動物和同時治療的類型的因素，如果有的話。量還可取決于動物免疫系統(tǒng)合成抗體的能力和所需保護的程度。典型地，體外使用的劑量可以對用于原位施用藥物組合物的量提供有用的指導(dǎo)，并且動物模型可以用來確定治療具體病癥的有效劑量。多種考慮描述于例如Gilman等人編，Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press,1990；以及Reminpton's Pharmaceutical Sciences,第17版Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990，其中每個以引用的方式并入本文。另外，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可通過建立劑量反應(yīng)曲線的常規(guī)試驗容易地確立有效劑量。通過以一種或多種劑量施用組合物，使受試者免疫?？砂葱枋┯枚鄤┝恳员３謱Π械拿庖郀顟B(tài)。例如，在約四周的時間段后，初始劑量后面可跟著加強劑量以增強免疫原性應(yīng)答。還可施用進一步的加強劑量。可間隔例如，約1、2、3、4、5、6或7、14或21天多(例如，2、3、4或5)次施用組合物。

鼻內(nèi)制劑可包括既不對鼻粘膜產(chǎn)生刺激也不顯著擾亂纖毛功能的媒介物。稀釋劑諸如水、鹽水或其他已知的物質(zhì)可與主題發(fā)明一起使用。鼻用制劑還可含有防腐劑，諸如但不限于氯代丁醇和苯扎氯銨。表面活性劑可存在以增強目標(biāo)蛋白質(zhì)被鼻粘膜吸收。

口服液體制備物可呈例如水性或油性懸浮劑、溶液、乳劑、糖漿或酏劑的形式，或可以片劑形式干燥提供，或以使用前用水或其他合適的媒介物復(fù)溶的產(chǎn)品干燥提供。這種液體制備物可以含有常規(guī)添加劑，諸如懸浮劑、乳化劑、非水性媒介物(可以包括食用油)或防腐劑。

因此，本發(fā)明的組合物可與藥學(xué)上可接受的媒介物(如惰性稀釋劑或可吸收食用載體)組合來全身性施用，例如經(jīng)口施用。它們可封閉在硬殼或軟殼明膠膠囊中，可壓制成片劑，或可直接與患者膳食的食物合并。對于經(jīng)口治療性施藥，本發(fā)明的組合物可與一種或多種賦形劑組合并且以可攝取片劑、經(jīng)頰片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿、粉片等形式使用。這類制備物應(yīng)含有至少0.1％的本發(fā)明的組合物。當(dāng)然組合物的百分比可變化并且可合宜地在給定單位劑型的約2重量％至約60重量％之間。本發(fā)明的組合物在這種治療適用制備物中的量是使得將獲得有效劑量水平的量。

本發(fā)明的組合物的適用劑量可通過比較它們在動物模型中的體外活性與體內(nèi)活性來確定。治療中所需的本文描述的組合物的量可根據(jù)施用途徑和受試者的年齡和情況而變化，并且最終將由護理獸醫(yī)或臨床醫(yī)生確定。

所需劑量可方便地以單個劑量提供或以適當(dāng)時間間隔施用的分次劑量提供，例如以每天兩次、三次、四次或更多次亞劑量提供。亞劑量本身可進一步分成例如多個獨立的松散間隔的施用；如多次自吹入器吸入或通過多次滴入眼中。

本文所引用的所有公開案、專利和專利申請均以引用的方式并入本文中。盡管在前面的說明中，本發(fā)明按照其某些實施方案進行了描述，并且許多細(xì)節(jié)是為了舉例說明的目的而被闡述，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的是，本發(fā)明容許另外的實施方案，并且在此描述的某些細(xì)節(jié)可以進行相當(dāng)大的變化，而不脫離本發(fā)明的基本原理。

在描述本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“一個”和“一種”和“所述”以及“或”以及類似的指示的使用意圖解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者，除非在本文另外地指示或明顯地與上下文矛盾。因此，如提到“一種目標(biāo)多肽”包括多個此類多肽并且如提到“試劑”包括提到本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的一種或多種藥劑及其等效物等。

術(shù)語“包含”、“具有”、“包括”和“含有”應(yīng)解釋為開放式術(shù)語(即，意味著“包括但不限于”)，除非另外指明。除非本文另外指明，否則本文中值范圍的列舉僅僅意圖用作個別地表示屬于所述范圍的各單獨值的簡要方法，并且猶如本文個別描述地那樣將各單獨值并入到說明書中?？砂慈魏芜m合的順序來執(zhí)行本文所述的全部方法，除非本文另外指明或上下文明顯矛盾。本文所提供的任何以及全部實施例或示例性語言(例如，“如”)的使用僅意圖更好地說明本發(fā)明并且除非另外要求，否則不會對本發(fā)明的范圍施加限制。本說明書中的語言不應(yīng)解釋為將任何非要求的元素指示為實踐本發(fā)明所必需。

本文中描述了本發(fā)明的實施方案，其包括為發(fā)明人所知用來執(zhí)行本發(fā)明的最佳模式。在閱讀了上述描述后，這些所述實施方案的變化對本領(lǐng)域的技術(shù)人員將變得顯而易見。發(fā)明人希望技術(shù)人員視情況采用此類變體，并且發(fā)明人意圖以不同于如本文所特別描述的方式來實踐本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括在隨附的適用法律允許的權(quán)利要求中敘述的主題的所有修改和等效物。此外，除非本文另有指示或與上下文明顯矛盾，否則在所有可行變體中的上述元素的任何組合都涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。

關(guān)于值的范圍時，本發(fā)明涵蓋在范圍的上限與下限之間的每個中間值，除非上下文另有明確規(guī)定，否則精確到下限單位的十分之一。本發(fā)明還涵蓋任意其他指出的中間值。此外，本發(fā)明還涵蓋排除范圍的上限和下限中的一個或兩個的范圍，除非明確不包括在所述范圍內(nèi)。

除非另有說明，表達說明書和權(quán)利要求書中使用的成分、反應(yīng)條件、純度％、多肽和多核苷酸長度等的量的所有數(shù)被術(shù)語“約”修飾。因此，說明書和權(quán)利要求書中所陳述的數(shù)值參數(shù)都是近似值，所述近似值可以根據(jù)本發(fā)明的所需性質(zhì)而變化。在最低限度并且不試圖限制對權(quán)利要求書范圍的等價范圍的原則的應(yīng)用，每個數(shù)值參數(shù)均應(yīng)當(dāng)應(yīng)用普通四舍五入技術(shù)，至少根據(jù)報告的有效數(shù)字的數(shù)值來解讀。但是，盡可能精確地報告具體實例中陳述的數(shù)值。然而，任何數(shù)值固有地包含來自其實驗測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差的某些誤差。

除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語的含義是本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員一般理解的那些含義。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，與本文所描述的方法和材料類似或等同的任何方法和材料可用于實踐或測試本發(fā)明。此外，本文中提到的所有出版物均以引用的方式整體并入。

序列表

<110> 明尼蘇達大學(xué)董事會

<120> 豬流行性腹瀉病毒疫苗及其使用方法

<130> 09531.389WO1

<150> 61/951,439

<151> 2014-03-11

<160> 4

<170> 專利版本 3.5

<210> 1

<211> 27990

<212> DNA

<213> 豬流行性腹瀉病毒

<400> 1

ctttttctag actcttgtct actcaattca actaaacgaa attttgtcct tccggccgca 60

tgtccatgct gctggaagct gacgtggaat ttcattaggt ttgcttaagt agccatcgca 120

agtgctgtgc tgtcctctag ttcctggttg gcgttccgtc gccttctaca tactagacaa 180

acagccttcc tccggttccg tctgggggtt gtgtggataa ctagttccgt ctagtttgaa 240

accagtaact gtcggctatg gctagcaacc atgttacatt ggcttttgcc aatgatgcag 300

aaatttcagc ttttggcttt tgcactgcta gtgaagccgt ctcatactat tctgaggccg 360

ccgctagtgg atttatgcaa tgccgtttcg tgtccttcga tctcgctgac actgttgagg 420

gattgcttcc cgaagactat gtcatggtgg tggtcggcac taccaagctt agtgcgtatg 480

tggacacttt tggtagccgc cccaaaaaca tttgtggttg gctgttattt tctaactgta 540

attacttcct cgaagagtta gagcttactt ttggtcgtcg tggtggtaac atcgtgccag 600

ttgaccaata catgtgtggc gctgacggta aacctgttct tcaggaatcc gaatgggagt 660

atacagattt ctttgctgac tccgaagacg gtcaactcaa cattgctggt atcacttatg 720

tgaaggcctg gattgtagag cgatcggatg tctcttatgc gagtcagaat ttaacatcta 780

ttaagtctat tacttactgt tcaacctatg agcatacttt tcctgatggt actgccatga 840

aggttgcacg tactccaaag attaagaaga ctgttgtctt gtctgagcca cttgctacta 900

tctacaggga aattggttct ccttttgtgg ataatgggag cgatgctcgt tctatcatta 960

agagaccagt gttcctccac gcttttgtta agtgtaagtg tggtagttat cattggactg 1020

ttggtgattg gacttcctat gtctccactt gctgtggctt taagtgtaag ccagtccttg 1080

tggcttcatg ctctgctacg cctggttctg ttgtggttac gcgcgctggt gctggcactg 1140

gtgttaagta ttacaacaac atgttcctgc gccatgtggc agacattgat gggttggcat 1200

tctggcgaat tctcaaggtg cagtccaaag acgacctcgc ttgctctggt aaattccttg 1260

aacaccatga ggaaggtttc acagatcctt gctacttttt gaatgactcg agcattgcta 1320

ctaagctcaa gtttgacatc cttagtggca agttttctga tgaagtcaaa caagctatct 1380

ttgctggtca tgttgttgtt ggcagcgcgc tcgttgacat tgttgacgat gcactgggac 1440

agccttggtt tatacgtaag cttggtgacc ttgcaagtgc agcttgggag cagcttaagg 1500

ctgtcgttag aggccttaac ctcctgtctg atgaggtcgt gctctttggc aaaagactta 1560

gctgtgccac tcttagtatc gttaacggtg tttttgagtt catcgccgaa gtgcctgaga 1620

agttggctgc ggctgttaca gtttttgtca acttcttgaa tgagcttttt gagtctgcct 1680

gtgactgctt aaaggtcgga ggtaaaacct ttaacaaggt tggctcttat gttctttttg 1740

acaacgcatt ggttaagctt gtcaaggcaa aagttcgcgg cccacgacag gcaggtgttt 1800

gtgaagttcg ttacacaagc cttgttattg ggagtactac caaggtggtt tccaagcgcg 1860

ttgaaaatgc caatgtgaat ctcgtcgtcg ttgacgagga tgtgaccctc aacaccactg 1920

gtcgtacagt tgttgttgac ggacttgcat tcttcgagag tgacgggttt tacagacatc 1980

ttgctgatgc tgacgttgtc attgaacatc ctgtttataa gtctgcttgt gagctcaagc 2040

cagtttttga gtgtgaccca atacctgatt ttcctatgcc tgtggccgct agtgttgcag 2100

agctttgtgt gcaaactgat ctgttgctta aaaattacaa cactccttat aaaacttaca 2160

gctgcgttgt gagaggtgat aagtgttgta tcacttgcac cttacatttc acagcaccaa 2220

gttatatgga ggctgctgct aattttgtag acctctgtac caagaacatt ggtactgctg 2280

gttttcatga gttttacatt acggcccatg aacaacagga tctgcaaggg ttcgtaacca 2340

cttgttgcac gatgtcaggt tttgagtgtt ttatgcctat aatcccacag tgtccagcag 2400

tgcttgaaga gattgatggt ggtagcatct ggcggtcttt tatcactggt cttaatacaa 2460

tgtgggattt ttgcaagcat cttaaagtca gctttggact agatggcatt gttgtcactg 2520

tagcacgcaa atttaaacga cttggtgctc tcttggcaga aatgtataac acttaccttt 2580

caactgtggt ggaaaacttg gtactggccg gtgttagctt caagtattat gccaccagtg 2640

tcccaaaaat tgttttgggc tgttgttttc acagtgttaa aagtgttctt gcaagtgcct 2700

tccagattcc tgtccaggca ggcgttgaga agtttaaagt cttccttaac tgtgttcacc 2760

ctgttgtacc acgtgtcatt gaaacttctt ttgtggaatt agaagagacg acatttaaac 2820

caccagcact caatggtagt attgctattg ttgatggctt tgctttctat tatgatggaa 2880

cactatacta tcccaccgat ggtaatagcg ttgttcctat ctgctttaag aagaaaggtg 2940

gtggtgatgt caaattctct gatgaagtct ctgttaaaac cattgaccca gtttataagg 3000

tctcccttga atttgagttc gagtctgaga ctattatggc tgtgcttaat aaggctgttg 3060

gtaattgtat caaggttaca ggtggttggg acgatgttgt tgagtatatc aatgttgcca 3120

ttgaggttct taaagatcac atcgatgtgc ctaagtacta catctatgat gaggaaggtg 3180

gcaccgatcc taatctgccc gtaatggttt ctcagtggcc gttgaatgat gacacgatct 3240

cacaggatct gcttgatgtt gaagttgtta ctgatgcgcc agttgatttc gagggtgatg 3300

aagtagactc ctctgaccct gataaggtgg cagacgtggc taactctgag cctgaggatg 3360

acggtcttaa tgtagctcct gaaacaaatg tagagtctga agttgaggaa gttgccgcaa 3420

ccttgtcctt tattaaagat acaccttcca cagttactaa ggatcctttt gcttttgact 3480

ttgcaagcta tggaggactt aaggttttaa gacaatctca taacaactgc tgggttactt 3540

ctaccttggt gcagctacaa ttgcttggca tcgttgatga ccctgcaatg gagcttttta 3600

gtgctggtag agttggtcca atggttcgca aatgctatga gtcacaaaag gctatcttgg 3660

gatctttggg tgatgtgtcg gcttgcctag agtctctgac taaggaccta cacacactta 3720

agattacctg ttctgtagtc tgtggttgtg gtactggtga acgtatctat gatggttgtg 3780

cttttcgtat gacgccaact ttggaaccgt tcccatatgg tgcttgtgct cagtgtgctc 3840

aagttttgat gcacactttt aaaagtattg ttggcaccgg catcttttgt cgagatacta 3900

ctgctctctc cttggattct ttggttgtaa aacctctttg tgcggctgct tttataggca 3960

aggatagtgg tcattatgtc actaactttt atgatgctgc tatggctatt gatggttatg 4020

gtcgtcatca gataaagtat gacacactga acactatttg tgttaaagac gttaattgga 4080

cagcaccttt tgtcccagac gttgagcctg tattggagcc tgttgtcaaa cctttctatt 4140

cttataagaa tgttgatttt taccaaggag attttagtga ccttgttaaa cttccatgtg 4200

attttgttgt taatgctgca aatgagaatt tgtctcacgg tggcggcata gcaaaggcca 4260

ttgatgttta taccaagggc atgttgcaga agtgctcgaa tgattacatt aaagcacacg 4320

gtcccattaa agttggacgt ggtgtcatgt tggaggcatt aggtcttaag gtctttaatg 4380

ttgttggtcc acgtaagggt aagcatgcac ctgagcttct tgttaaggct tataagtccg 4440

tttttgctaa ttcaggtgtt gctcttacac ctttgattag tgttggaatt tttagtgttc 4500

ctttggaaga atctttatct gcttttcttg catgtgttgg tgatcgccac tgtaagtgct 4560

tttgttatag tgacaaagag cgcgaggcga tcattaatta catggatggc ttggtagatg 4620

ctattttcaa agatgcgctt gttgatacta ctcctgtcca ggaagatgtt caacaagttt 4680

cacaaaaacc agttttgcct aattttgaac ctttcaggat tgaaggtgct catgctttct 4740

atgagtgcaa ccctgaaggt ttgatgtcat taggtgctga taagctggtg ttgtttacaa 4800

attccaattt ggatttttgt agcgttggta agtgtcttaa caatgtgacc ggcggtgcat 4860

tgcttgaagc cataaatgta tttaaaaaga gtaacaaaac agtgcctgct ggcaactgtg 4920

ttacttttga gtgtgcagac atgatttcta ttactatggt agtattgcca tctgatggtg 4980

atgctaatta tgacaaaaat tatgcacgcg ccgtcgtcaa ggtatctaag cttaaaggca 5040

agttattgct tgctgttggt gatgccacgt tgtattccaa gttgtcccat ctcagcgtgg 5100

taggtttcgt atccacacct gatgatgtgg agcgtttcta cgcaaataag agtgtggtta 5160

ttaaagtcac tgaggataca cgtagtgtta aggctgttaa agtagaatcc actgttactt 5220

atggacaaca aattggacct tgtcttgtta atgacaccgt tgtcacagac aacaaacctg 5280

ttgttgctga tgttgtagct aaggttgtac caagtgctaa ttgggattca cattatggtt 5340

ttgataaggc tggtgagttc cacatgctag accatactgg gtttgtcttt cctagtgaag 5400

ttgttaacgg taggcgtgtg cttaaaacca cagataataa ctgttgggtt aatgttacat 5460

gtttacaatt acagtttgct agatttaggt tcaagtcagc aggtctacag gctatgtggg 5520

agtcctattg tactggtgat gttgctatgt ttgtgcattg gttgtactgg cttactggtg 5580

ttgacaaagg tcagcctagt gattcagaaa atgcacttaa catgttgtcc aagtacattg 5640

tttctgctgg ttctgtcact attgaacgtg tcacgcatga cggctgttgt tgtagtaagc 5700

gtgttgtcac tgcaccagtt gtgaatgcta gcgtattgaa gcttggcgtc gaggatggtc 5760

tttgtccaca tggtcttaac tacattgaca aagttgttgt agttaaaggt actacaattg 5820

ttgtcaatgt tggaaaacct gtagtggcac catcacacct ctttcttaag ggtgtttctt 5880

acacaacatt cctagataat ggtaacggtg ttgtcggcca ttatactgtt tttgatcatg 5940

acactggtat ggtgcatgat ggagatgctt ttgtaccggg tgatctcaat gtatctcctg 6000

ttacaaatgt tgtcgtctca gagcagacgg ctgttgtgat taaagaccct gtgaagaaag 6060

tagagttaga cgctacaaag ctgttagaca ctatgcatta tgcatcggaa agattctttt 6120

cctttggtga ttttatgtca cgtaatttaa ttacagtgtt tttgtacatc cttagcattt 6180

tgggtctctg ttttagggcc tttcgtaaga gggatgttaa agttctagct ggtgtacccc 6240

aacgtactgg tattatattg cgtaaaagtg tgcgctataa tgcaaaggcg ttgggtgtct 6300

tcttcaagct aaaactttat tggttcaaag ttcttggtaa gtttagtttg ggtatttatg 6360

cattgtatgc attactattc atgacaatac gctttacacc tataggtggc cctgtttgtg 6420

atgatgttgt tgctggttat gctaattcta gttttgacaa gaatgagtat tgcaacagtg 6480

ttatttgtaa ggtctgtctc tatgggtacc aggaactttc agacttctct cacacacagg 6540

tagtatggca acaccttaga gacccattaa ttggtaatgt gatgcctttc ttttatttgg 6600

catttctggc aatttttggg ggtgtttatg taaaggctat tactctctat tttattttcc 6660

agtaccttaa cattcttggt gtgtttttgg gcctacaaca gtccatttgg tttttgcagc 6720

ttgtgccttt tgatgtcttt ggtgacgaga tcgtcgtctt tttcatcgtt acacgcgtat 6780

tgatgttcct taagcatgtt ttccttggct gcgataaggc atcttgtgtg gcttgctcta 6840

agagtgctcg ccttaagcgc gttcctgtcc agactatttt tcagggtact agcaaatcct 6900

tctacgtaca tgccaatggt ggttctaagt tctgtaagaa gcacaatttc ttttgtttaa 6960

attgtgattc ttatggtcca ggctgcactt ttattaatga cgtcattgca actgaagttg 7020

gtaatgttgt caaacttaat gtgctaccga caggtcctgc cactattctt attgacaagg 7080

ttgaattcag taatggtttt tactatcttt atagtggtga cacattttgg aagtacaact 7140

ttgacataac agatagcaaa tacacttgca aagaatcact taaaaattgt agcataatca 7200

cagactttat tgtttttaac aataatggtt ccaatgtaaa tcaggttaag aatgcatgtg 7260

tttatttttc acagatgctt tgtaaacctg ttaagttagt ggactcagcg ttgttggcca 7320

gtttgtctgt tgattttggt gcaagcttac atagtgcttt tgttagtgtg ttgtcgaata 7380

gttttggcaa agatctgtca agttgtaatg acatgcagga ttgcaagagc acattgggtt 7440

ttgatgatgt accattggat acctttaatg ctgctgttgc tgaggctcat cgttacgatg 7500

tcctcttgac tgacatgtcg ttcaacaatt ttaccaccag ttatgcaaaa ccagaggaaa 7560

aatttcccgt ccatgacatt gccacgtgta tgcgtgtagg tgccaagatt gttaatcata 7620

acgttcttgt caaggatagt atacctgtgg tgtggcttgt acgtgatttc attgcccttt 7680

cggaagaaac taggaagtac attattcgta cgactaaagt taagggtata accttcatgt 7740

tgacctttaa tgattgtcgt atgcacacta ccatacctac tgtttgcatt gcaaataaga 7800

agggtgcagg tcttcctagt ttttcaaagg ttaagaaatt cttctggttt ttgtgtctgt 7860

tcatggttgc tgttttcttt gcactaagct ttcttgattt tagtactcag gttagcagtg 7920

atagcgatta tgacttcaag tatattgaga gtggccagtt gaagactttt gacaatccac 7980

ttagttgtgt gcataatgtc tttagtaact tcgaccagtg gcatgatgcc aagtttggtt 8040

tcacccccgt caacaatcct agttgtccta tagtcgttgg tgtatcagac gaagctcgca 8100

ctgttccagg tatyccagca ggtgtttatt tagctggtaa aacacttgtt tttgctatta 8160

acaccatttt tggtacatct ggtttgtgct ttgatgctag tggcgttgct gataagggcg 8220

cttgcatttt taattcggct tgcaccacat tatctggttt gggtggaact gctgtctact 8280

gttataagaa tggtctagtt gaaggtgcta aactttatag tgagttggca cctcatagct 8340

actataaaat ggtagatggt aatgctgtgt ctttacctga aattatttca cgcggctttg 8400

gcatccgtac tatccgtaca aaggctatga cctactgtcg cgttggccag tgtgtgcaat 8460

ctgcagaagg tgtttgtttt ggcgccgata gattctttgt ctataatgca gaatctggtt 8520

ctgactttgt ttgtggcaca gggctcttta cattgttgat gaacgttatt agtgtttttt 8580

ccaagacagt accagtaact gtgttgtctg gtcaaatact ttttaattgc attattgctt 8640

ttgctgctgt tgcggtgtgt ttcttattta caaagtttaa gcgcatgttc ggtgatatgt 8700

ctgttggcgt tttcactgtc ggtgcttgta ctttgttgaa caatgtttct tacattgtaa 8760

cacagaacac acttggcatg ttgggctatg caactttgta cttcttgtgc actaaaggtg 8820

ttagatatat gtggatttgg catttgggat ttttgatctc atatatactt attgcaccat 8880

ggtgggtttt gatggtttat gccttttcgg ccatttttga gtttatgcct aaccttttta 8940

agcttaaggt ttcaacacaa ctttttgagg gtgacaagtt cgtaggctct tttgaaaatg 9000

ctgcagcagg tacatttgtg cttgatatgc atgcctatga gagacttgcc aactctatct 9060

caactgaaaa actgcgtcag tatgctagta cttacaataa gtacaagtat tattcaggca 9120

gtgcttcaga ggctgattac aggcttgctt gttttgccca tttggccaag gctatgatgg 9180

attatgcttc taatcacaat gacacgttat acacaccacc cactgtgagt tacaattcaa 9240

ctctacaggc tggcttgcgt aagatggcac aaccatctgg tgttgttgag aagtgcatag 9300

ttcgtgtttg ctatggtaat atggctctta atggcctatg gcttggtgat actgttatgt 9360

gcccacgcca tgttatagcg tctagtacta ctagcactat agattatgac tatgcccttt 9420

ctgttttacg cctccacaac ttctccattt catctggtaa tgttttccta ggtgttgtgg 9480

gtgtaaccat gcgaggtgct ttgttgcaga taaaggttaa tcaaaacaat gtccacacgc 9540

ctaagtacac ctatcgcaca gttagaccag gtgaatcttt taatatcttg gcgtgctatg 9600

atggtgctgc agctggtgtt tatggcgtta acatgcgctc taattacact attagaggct 9660

cgttcattaa tggcgcttgt ggttcacctg gttataatat taacaatggt accgttgagt 9720

tttgctattt acatcagctt gaacttggtt caggctgtca tgttggtagc gacttagatg 9780

gtgttatgta tggtggttat gaggaccaac ctactttgca agttgaaggc gctagtagtc 9840

tgtttacaga gaatgtgttg gcatttcttt atgcagcact cattaatggt tctacctggt 9900

ggcttagttc ttctaggatt gctgtagaca ggtttaatga gtgggctgtt cataatggta 9960

tgacaacagt aggtaatact gattgctttt ctattcttgc tgctaagact ggtgttgatg 10020

tacaacgttt gttggcctca atccagtctc tgcataagaa ttttggtgga aagcaaattc 10080

ttggctatac ctcgttgaca gatgagttta ctacaggtga agttatacgt caaatgtatg 10140

gcgttaatct tcagagtggt tatgtttcac gcgcctgcag aaatgtcttg ctggttggtt 10200

cttttctgac tttcttttgg tcagaattag tttcctacac taagttcttt tgggtaaatc 10260

ctggttatgt cacacctatg tttgcgtgtt tgtcattgct gtcctcactt ttgatgttca 10320

cactcaagca taagacattg ttcttccagg tctttctaat acctgctctg attgttacat 10380

cttgcattaa tttggcattt gatgttgaag tctacaacta tttggcagag cattttgatt 10440

accatgtttc tctcatgggt tttaatgcac aaggtcttgt taacatcttt gtctgctttg 10500

ttgttaccat tttacacggc acatacacat ggcgcttttt taacacacct gtgagttctg 10560

tcacttatgt ggtagctttg atgactgcgg catataacta tttttacgct agtgacattc 10620

ttagttgtgc tatgacacta tttgctagtg tgactggcaa ctggttcgtt ggtgctgttt 10680

gttataaagc tgctgtttat attgccttga gatttcctac ttttgtggct atttttggtg 10740

atattaagag tgttatgttc tgttaccttg tgttgggtta ttttacctgt tgtttctacg 10800

gtattctcta ctggttcaac aggtttttta aggttagtgt aggtgtctat gactatactg 10860

ttagtgctgc tgagtttaag tatatggttg ctaacggcct acgtgcacca actggaacac 10920

ttgattcact acttctgtct gccaaattga ttggtattgg tggtgagcgg aatattaaga 10980

tttcttccgt tcagtctaaa ctgactgata ttaagtgtag taacgttgtg cttttaggct 11040

gtctctctag catgaatgtc tcagcaaatt caacagaatg ggcctattgt gttgacttgc 11100

ataacaagat caacttgtgt aatgacccag aaaaagcgca ggaaatgcta cttgctttgt 11160

tggcattttt ccttagtaag aatagtgctt ttggtttgga tgacttattg gaatcctatt 11220

ttaatgacaa tagtatgttg cagagtgttg catctactta tgtcggtttg ccttcttatg 11280

tcatttatga aaatgcacgc caacagtatg aagatgctgt taataatggt tctccacctc 11340

agttggttaa gcaattgcgc catgccatga atgtagcaaa gagcgaattt gaccgtgagg 11400

cttctactca gcgtaagctt gatagaatgg cggaacaggc tgcagcacag atgtacaaag 11460

aggcaagagc agttaatagg aagtccaaag ttgtaagtgc tatgcattca ctgctttttg 11520

gtatgttgag acgtttggac atgtcttctg tagacaccat tctcaacttg gcaaaggatg 11580

gggttgtacc tctgtctgtc ataccggcag tcagtgctac taagcttaac attgttactt 11640

ctgatatcga ttcttataat cgtatccagc gtgagggatg tgtccattac gctggtacca 11700

tttggaatat aattgatatc aaggacaatg atggcaaggt ggtacacgtt aaggaggtaa 11760

ccgcacagaa tgctgagtcc ctgtcatggc ccctggtcct tgggtgtgag cgtattgtca 11820

agctccagaa taatgaaatt attcctggta agctgaagca gcgctccatt aaggcagaag 11880

gagatggcat agttggagaa ggtaaggcac tttacaataa tgagggtgga cgtactttta 11940

tgtatgcttt catctcggac aaaccggacc tgcgtgtagt taagtgggag ttcgatggtg 12000

gttgtaacac tattgagcta gaaccaccac gtaagttctt ggtggattct cctaatggtg 12060

cacagatcaa gtatctctac tttgttcgta accttaacac gttacgtagg ggtgctgttc 12120

ttggctacat aggtgccact gtacgcttgc aggctggtaa acaaacagaa caggctatta 12180

actcttcatt gttgacactt tgcgctttcg ctgtggatcc tgctaagacc tacatcgatg 12240

ctgtcaaaag tggtcacaaa ccagtaggta actgcgttaa gatgttggcc aatggttctg 12300

gtaatggaca agctgttact aatggtgtgg aggctagtac taaccaggat tcatacggtg 12360

gtgcttccgt gtgtctatat tgtagagcac atgttgagca tccatctatg gatggttttt 12420

gcagactgaa aggcaagtac gtacaggtgc cactaggtac agtggatcct atacgttttg 12480

tacttgagaa tgacgtttgc aaggtctgtg gttgttggct ggctaatggc tgcacttgtg 12540

acagatccat tatgcaaagc actgatatgg cttatttaaa cgagtacggg gctctagtgc 12600

agctcgacta gagccctgta acggtactga tacacaacat gtgtatcgtg cttttgacat 12660

ctacaacaag gatgttgctt gtctaggtaa attcctcaag gtgaactgtg ttcgcctgaa 12720

gaatttggat aagcatgatg cattctatgt tgtcaaaaga tgtaccaagt ctgcgatgga 12780

acacgagcaa tccatctata gcagacttga aaagtgtgga gccgtagctg aacacgattt 12840

cttcacttgg aaggatggtc gtgcaatcta tggtaacgtt tgtagaaagg atcttaccga 12900

gtatactatg atggatttgt gttacgcttt acgtaacttt gatgaaaaca attgcgatgt 12960

tcttaagagc attttaatta aggtaggcgc ttgtgaggag tcctacttca ataataaagt 13020

ctggtttgac cctgttgaaa atgaagacat tcatcgtgtt tatgcattgt taggtaccat 13080

tgtttcacgt gctatgctta aatgcgttaa gttctgtgat gcaatggttg aacaaggtat 13140

agttggtgtt gtcacattag ataatcagga tcttaatggt gatttttatg attttggtga 13200

ttttacttgt agcatcaagg gaatgggtat acccatttgc acatcatatt actcttatat 13260

gatgcctgtt atgggtatga ctaattgcct tgctagtgag tgttttgtta agagtgatat 13320

atttggtgag gatttcaagt catatgacct gctggaatat gatttcacgg agcataagac 13380

agcactcttc aacaagtatt tcaagtattg gggactgcaa taccacccta actgtgtgga 13440

ctgcagtgat gagcagtgca tagttcactg tgccaacttc aatacgttgt tttccactac 13500

tatacctatt acggcatttg gacctttgtg tcgcaagtgt tggattgatg gtgttccact 13560

ggtaactaca gctggttatc attttaaaca gttaggtata gtttggaaca atgacctcaa 13620

cttacactct agcaggctct ctattaacga actactccag ttttgtagtg atcctgcatt 13680

gcttatagca tcatcaccag cccttgttga tcagcgtact gtttgctttt cagttgcagc 13740

gctaggtaca ggtatgacta accagactgt taaacctggc catttcaata aggagtttta 13800

tgacttctta cttgagcaag gtttcttttc tgagggctct gagcttactt taaagcactt 13860

cttctttgca cagaagggtg atgcagctgt taaggatttt gactactata ggtataatag 13920

acctactgtt ctggacattt gccaagctcg cgtcgtgtat caaatagtgc aacgctattt 13980

tgatatttac gaaggtggtt gtatcactgc taaagaagtg gttgttacaa accttaacaa 14040

gagcgcaggt tatcctttga acaagtttgg taaagctggt ctttactatg agtctttatc 14100

ctatgaggaa caggatgaac tttatgctta tactaagcgt aacatcctgc ccactatgac 14160

acagctcaac cttaaatatg ctataagtgg caaagaacgt gcacgcacag tgggtggtgt 14220

ttcgcttttg tcaaccatga ctactcggca gtatcaccag aaacacctta agtccatagt 14280

taatactagg ggcgcttcgg ttgttattgg tactactaag ttttatggtg gttgggacaa 14340

tatgcttaag aaccttattg atggtgtcga aaatccgtgt cttatgggtt gggattaccc 14400

aaagtgcgac agagcactgc ccaatatgat acgcatgatt tcagccatga ttttaggctc 14460

taagcacacc acatgctgca gttccactga ccgctttttc aggttgtgca atgaattggc 14520

tcaagtcctt actgaggttg tttattctaa tggaggtttt tatttgaagc caggtggtac 14580

tacctctggt gatgcaacca ccgcatatgc aaactcagtt ttcaatatct tccaagcagt 14640

aagtgccaat gttaacaaac ttcttagtgt tgacagcaat gtctgtcata atttagaagt 14700

taagcaattg cagcgtaagc tttatgagtg ctgttataga tcaactaccg tcgatgacca 14760

gttcgtcgtt gagtattatg gttacttgcg taaacatttt tcaatgatga ttctttctga 14820

tgatggcgtt gtttgttaca acaatgacta tgcatcactt ggttatgtcg ctgatcttaa 14880

cgcattcaag gctgttttgt attaccagaa caatgtcttc atgagcgcct ctaaatgttg 14940

gatcgagcct gacattaata aaggtcctca tgaattttgc tcgcagcata ctatgcagat 15000

tgtcgataaa gatggtactt actacctacc ttaccctgat ccttcaagaa tcctctctgc 15060

aggtgtgttt gttgacgacg ttgttaaaac tgatgcagtt gtattgcttg aacgttatgt 15120

gtcattggct atagatgcct acccgttatc taagcatgaa aaccctgaat ataagaaggt 15180

gttttatgtg cttttggatt gggttaagca cctgtataaa actttgaatg ctggtgtgtt 15240

agagtctttt tctgtcacac ttttggaaga ttctactgct aaattctggg atgagagctt 15300

ttatgccaac atgtatgaga aatctgcagt tttgcaatct gcagggcttt gtgttgtttg 15360

tggctctcaa actgttttac gttgtggtga ttgtctacgg cgtcctatgc tttgtactaa 15420

gtgtgcttat gatcatgtca ttggaacaac tcacaagttc attttggcta tcactccata 15480

tgtgtgttgt gcttcagatt gtggtgtcaa tgatgtaact aagctctact taggtggtct 15540

tagttattgg tgtcatgaac acaagccacg tcttgcattc ccgttgtgtt ctgctggtaa 15600

tgtttttggt ttgtacaaaa attctgctac cggctcaccc gatgttgagg actttaatcg 15660

cattgctaca tccgattgga ctgatgtttc tgactacagg ttggcaaatg atgtcaaaga 15720

ctcattgcgt ctatttgcag cggaaactat caaggccaag gaggagagcg ttaagtcatc 15780

ctacgcttgt gcaacactac atgaggttgt aggacctaaa gagttgttgc tcaaatggga 15840

agtcggcaga cccaaaccac ctcttaatag aaattcggtt ttcacttgtt atcatataac 15900

gaagaacacc aaatttcaaa tcggtgagtt tgtgtttgag aaggcagaat atgataatga 15960

tgctgtaaca tataaaacta ccgccacaac aaaacttgtt cctggcatgg tttttgtgct 16020

tacctcacat aatgttcagc cattgcgcgc accgaccatt gctaatcaag aacgttattc 16080

cactatacat aagttgcacc ctgcttttaa catacctgaa gcttattcta gcttagtgcc 16140

ctattaccaa ctgattggta agcagaagat tacaactatc cagggacctc caggtagtgg 16200

taaatctcac tgtgttatag ggctaggttt gtactatcca ggtgcacgta tagtgtttac 16260

agcttgttct catgcagcgg tcgattcact ttgtgtgaaa gcctccactg cttatagcaa 16320

tgacaaatgt tcacgcatca taccacagcg tgctcgtgtt gagtgttatg acggtttcaa 16380

gtctaataat actagtgctc agtacctttt ctccactgtc aatgctttgc cagagtgcaa 16440

tgcggacatt gttgtggtgg atgaggtttc tatgtgcact aattatgact tgtctgtcat 16500

aaatcagcgc atcagctata ggcatgtagt ctatgttggt gaccctcaac agctgcctgc 16560

accacgtgtt atgatttcac gtggtacttt ggaaccaaag gactacaacg ttgtcactca 16620

acgcatgtgt gcccttaagc ctgatgtttt cttgcacaag tgttatcgct gtcctgctga 16680

gatagtgcgc actgtgtctg agatggtcta tgaaaaccaa ttcattcctg tgcacccaga 16740

tagcaagcag tgttttaaaa tcttttgcaa gggtaatgtt caggttgaca atggttcaag 16800

catcaatcgc aggcaattgg atgttgtgcg tatgtttttg gctaaaaacc ctaggtggtc 16860

aaaggctgtt tttatttctc cttataacag ccagaattat gttgccagcc gcatgctagg 16920

tttacaaatt cagacagttg actcatccca gggtagtgag tatgactatg tcatttatac 16980

acaaacttca gatactgccc atgcctgtaa tgttaacagg tttaatgttg ccatcacaag 17040

ggctaagaaa ggcatattat gtataatgtg cgataggtcc ctttttgatg tgcttaaatt 17100

ttttgagctt aaattgtctg atttgcaggc taatgagggt tgtggtcttt ttaaagactg 17160

tagcagaggt gatgatctgt tgccaccatc tcacgctaac accttcatgt ctttagcgga 17220

caattttaag actgatcaag atcttgctgt tcaaataggt gttaatggac ccattaaata 17280

tgagcatgtt atctcgttta tgggcttccg ttttgatatc aacataccca accatcacac 17340

tctcttttgc acacgcgact ttgccatgcg caatgttaga ggttggttgg gttttgacgt 17400

tgaaggagca catgttgttg gctctaacgt cggtacaaat gtcccattgc aattagggtt 17460

ttctaacggt gttgattttg ttgtcagacc tgaaggttgc gttgtaactg agtctggtga 17520

ctacattaaa cccgtcagag ctcgtgctcc accaggggaa caatttgcac accttttgcc 17580

tctacttaaa cgcggccaac catgggatgt ggttcgtaag cgtatagtgc aaatgtgtag 17640

tgactacctg gctaacctat cagacatact aatttttgtg ttgtgggctg gtggtttgga 17700

gttgacaact atgcgttact ttgtcaagat tggaccaagc aagagttgtg attgtggtaa 17760

ggttgctact tgttacaata gtgcgctgca tacgtactgt tgtttcaaac atgcccttgg 17820

ttgtgattac ctgtacaatc catactgtat tgatatacag cagtggggat acaagggatc 17880

acttagcctt aaccaccatg agcattgtaa tgtacataga aacgagcatg tggcttctgg 17940

tgatgccata atgactcgct gtctagccat acatgattgc tttgtcaaga acgttgactg 18000

gtccatcaca tacccattta ttggtaatga ggctgttatt aataagagcg gccgaattgt 18060

gcaatcacac actatgcggt cagttcttaa gttatacaat ccaaaagcca tatatgatat 18120

tggcaaccct aagggcatta gatgtgccgt aacggatgct aagtggttct gctttgacaa 18180

gaatcctact aattctaatg tcaagacatt ggagtatgac tatataacac acggccaatt 18240

tgatgggttg tgcttgtttt ggaattgcaa tgtggacatg tatccagaat tctctgtggt 18300

ctgtcggttt gacactcgct gtaggtcacc actcaacttg gagggttgta atggtggttc 18360

actgtatgtt aataatcatg cattccatac accggctttt gacaagcgtg cttttgccaa 18420

gttgaagcca atgccatttt tcttctatga tgatactgag tgtgacaagt tacaggactc 18480

tataaactac gttcctctta gggctagtaa ttgcattact aaatgtaatg ttggtggagc 18540

tgtctgtagt aagcattgtg ctatgtacca tagctatgtt aatgcttaca acacctttac 18600

gtcggcgggc tttacgattt gggtgcccac ttcgtttgac acctacaatc tgtggcagac 18660

atttagtaac aacttgcaag gtcttgagaa cattgctttc aatgtcgtaa agaaaggatc 18720

ttttgttggt gctgaaggtg agcttcctgt agctgtggtt aatgacaaag tgctcgttag 18780

agatggtact gttgatactc ttgttttcac aaacaagaca tcactaccca ctaacgtagc 18840

ttttgagttg tatgccaagc gtaaggtagg actcacccca cccattacga tcctacgtaa 18900

cttgggtgtt gtttgcacat ctaagtgtgt catttgggac tatgaagccg aacgtccact 18960

tactactttt acaaaggatg tctgtaaata taccgacttt gagggtgacg tttgcacact 19020

ctttgataac agcattgttg gttcattaga gcgattctct atgacccaaa atgctgtgct 19080

tatgtcactt acagctgtta aaaagcttac tggcataaag ttaacttatg gttatcttaa 19140

tggtgtccca gttaacacac atgaagataa accttttact tggtacattt acactaggaa 19200

gaacggcaag ttcgaggact atcctgatgg ctattttacc caaggtagaa caaccgctga 19260

ttttagccct cgtagtgaca tggaaaagga cttcctaagt atggatatgg gtctgtttat 19320

taacaagtac ggactcgaag attacggctt tgagcacgtt gtgtatggtg atgtttctaa 19380

aaccaccctt ggtggtttac atctactaat ttcgcaggtg cgtctggcct gtatgggtgt 19440

gcttaaaata gacgagtttg tgtctagtaa tgatagcacg ttaaagtctt gtactgttac 19500

atatgctgat aaccctagta gtaagatggt ttgcacgtat atggatctcc ttcttgacga 19560

ttttgtcagc attcttaaat cgttggattt gagtgttgta tctaaagttc atgaagttat 19620

ggtcgattgt aaaatgtgga ggtggatgtt gtggtgtaag gatcataaac tccagacatt 19680

ttatccgcaa cttcaggcca gtgaatggaa atgtggttat tccatgcctt ctatttacaa 19740

gatacaacgt atgtgtttag aaccttgcaa tctctataac tatggtgctg gtattaagtt 19800

acctgatggc attatgttta acgtagttaa atatacacag ctttgtcaat atcttaatag 19860

caccacaatg tgtgtacccc atcacatgcg cgtgctacat cttggtgctg gctccgacaa 19920

gggtgttgca cctggcacgg ctgtcttacg acgttggttg ccactggatg ccattatagt 19980

tgacaatgat agtgtggatt acgttagcga tgctgattat agtgttacgg gagattgctc 20040

taccttatac ctgtcagata agtttgactt agttatatct gatatgtatg atggtaagat 20100

taaaagttgt gatggggaga acgtgtctaa agaaggcttc tttccctata ttaatggtgt 20160

catcactgaa aagttggcac ttggtggtac tgtagctatt aaggtgacgg agtttagttg 20220

gaataagaag ttgtatgaac tcattcagaa gtttgagtat tggacaatgt tctgtaccag 20280

tgttaacacg tcatcgtcag aggcattttt aattggtgtt cactatttag gtgattttgc 20340

aagtggcgct gtgattgacg gcaacactat gcatgccaat tatatcttct ggcgtaattc 20400

cacaattatg actatgtctt acaatagtgt acttgattta agcaagttca attgtaagca 20460

taaggctaca gttgttatta atttaaaaga ttcatccatt agtgatgttg tgttaggttt 20520

gttgaagaat ggtaagttgc tagtgcgtaa taatgacgcc atttgtggtt tttctaatca 20580

tttggtcaac gtaaacaaat gaagtcttta aattacttct ggttgttctt accagtactt 20640

tcaacactca gcctaccaca agatgtcact aggtgccagt ccactattaa cttcaggcgg 20700

ttcttttcaa aatttaatgt gcaggcacct gctgtcgttg tgttgggtgg ttatctacct 20760

agtatgaact cctctagctg gtactgtggc acaggtcttg aaactgctag tggcgtgcat 20820

ggtattttcc tcagttacat cgatgctggt cagggctttg agattggcat ttcacaggag 20880

ccgtttgatc ctagtggtta ccagctttat ttacataagg ccactaatgg taaccataat 20940

gctattgcac gactgcgcat ttgccagttt ccagataata aaacattggg ccctactgtt 21000

aatgatgtta caacaggtcg taactgccta ttcaacaaag ccattccagc ttatatgcag 21060

gatggaaaaa atatcgttgt cggcataaca tgggacaatg atcgtgtcac tgtttttgct 21120

gacaagatct atcattttta tcttaaaaat gattggtccc gtgttgcgac aagatgttac 21180

aataaaagaa gttgtgctat gcaatatgtt tatacaccta cctactacat gcttaatgtt 21240

actagtgcag gtgaggatgg catttattat gaaccatgta cagctaattg cagtggttac 21300

gctgccaatg tgtttgccac tgattctaat ggccacatac cagaaggttt tagttttaat 21360

aattggtttc ttttgtccaa tgattccact ttgttgcatg gtaaggtggt ttccaaccaa 21420

cctttgttgg tcaattgtct tttggccatt cctaagattt atggactagg ccaatttttc 21480

tcattcaatc aaacgatgga tggcgtttgt aatggagctg ctgcgcagcg tgcaccagag 21540

gctctgaggt ttaatattaa tgacacctct gtcattcttg ctgaaggctc aattgtactt 21600

catactgctt taggaacaaa tctttctttt gtttgcagta attcttcaga tcctcatcta 21660

gctaccttcg ccatacctct gggtgctacc caagtacctt attattgttt tcttaaagtg 21720

gatacttaca actccactgt ttataaattt ttggctgttt tacctcctac cgtcagggaa 21780

attgtcatca ccaagtatgg tgatgtttat gtcaatgggt ttggatactt gcatctcggt 21840

ttgttggatg ctgtcacaat taatttcact ggtcatggca ctgacgatga tgtttctggt 21900

ttttggacca tagcatcgac taattttgtt gatgcactca tcgaagttca aggaaccgcc 21960

attcagcgta ttctttattg tgatgatcct gttagccaac tcaagtgttc tcaggttgct 22020

tttgaccttg acgatggttt ttaccctatt tcttctagaa accttctgag tcatgaacag 22080

ccaatttctt ttgttactct gccatcattt aatgatcatt cttttgttaa cattactgta 22140

tctgcttcct ttggtggtca tagtggtgcc aaccttattg catctgacac tactatcaat 22200

gggtttagtt ctttctgtgt tgacactaga caatttacca tttcactgtt ttataacgtt 22260

acaaacagtt atggttatgt gtctaaatca caggacagta attgcccttt caccttgcaa 22320

tctgttaatg attacctgtc ttttagcaaa ttttgtgttt ccaccagcct tttggctagt 22380

gcctgtacca tagatctttt tggttaccct gagtttggta gtggtgttaa gtttacgtcc 22440

ctttactttc aattcacaaa gggtgagttg attactggca cgcctaaacc acttgaaggt 22500

gtcacggacg tttcttttat gactctggat gtgtgtacca agtatactat ctatggcttt 22560

aaaggtgagg gtatcattac ccttacaaat tctagctttt tggcaggtgt ttattacaca 22620

tctgattctg gacagttgtt agcctttaag aatgtcacta gtggtgctgt ttattctgtt 22680

acgccatgtt ctttttcaga gcaggctgca tatgttgatg atgatatagt gggtgttatt 22740

tctagtttgt ctagctccac ttttaacagt actagggagt tgcctggttt cttctaccat 22800

tctaatgatg gctctaattg tacagagcct gtgttggtgt atagtaacat aggtgtttgt 22860

aaatctggca gtattggcta cgtcccatct cagtctggcc aagtcaagat tgcacccacg 22920

gttactggga atattagtat tcccaccaac tttagtatga gtattaggac agaatattta 22980

cagctttaca acacgcctgt tagtgttgat tgtgccacat atgtttgtaa tggtaactct 23040

cgttgtaaac aattactcac ccagtacact gcagcatgta agaccataga gtcagcatta 23100

caactcagcg ctaggcttga gtctgttgaa gttaactcta tgcttactat ttctgaagag 23160

gctctacagt tagctaccat tagttcgttt aatggtgatg gatataattt tactaatgtg 23220

ctgggtgttt ctgtgtatga tcctgcaagt ggcagggtgg tacaaaaaag gtcttttatt 23280

gaagacctgc tttttaataa agtggttact aatggccttg gtactgttga tgaagactat 23340

aagcgctgtt ctaatggtcg ctctgtggca gatctagtct gtgcacagta ttactctggt 23400

gtcatggtac tacctggtgt tgttgacgct gagaagcttc acatgtatag tgcgtctctc 23460

atcggtggta tggtgctagg aggttttact tctgcagcgg cattgccttt tagctatgct 23520

gttcaagcta gactcaatta tcttgctcta cagacggatg ttctacagcg gaaccagcaa 23580

ttgcttgctg agtcttttaa ctctgctatt ggtaatataa cttcagcctt tgagagtgtt 23640

aaagaggcta ttagtcaaac ttccaagggt ttgaacactg tggctcatgc gcttactaag 23700

gttcaagagg ttgttaactc gcagggtgca gctttgactc aacttaccgt acagctgcaa 23760

cacaacttcc aagccatttc tagttctatt gatgacattt actctcgact ggacattctt 23820

tcagccgatg ttcaggttga ccgtctcatc accggcagat tatcagcact taatgctttt 23880

gttgctcaaa ccctcactaa gtatactgag gttcaggcta gcaggaagtt agcacagcaa 23940

aaggttaatg agtgcgttaa atcgcaatct cagcgttatg gtttttgtgg tggtgatggc 24000

gagcacattt tctctctggt acaggcagca cctcagggcc tgctgttttt acatacagta 24060

cttgtaccga gtgattttgt agatgttatt gccatcgctg gcttatgcgt taacgatgaa 24120

attgccttga ctctacgtga gcctggctta gtcttgttta cgcatgaact tcaaaatcat 24180

actgcgacgg aatattttgt ttcatcgcga cgtatgtttg aacctagaaa acctaccgtt 24240

agtgattttg ttcaaattga gagttgtgtg gtcacctatg tcaatttgac tagagaccaa 24300

ctaccagatg taatcccaga ttacatcgat gttaacaaaa cacttgatga gattttagct 24360

tctctgccca atagaactgg tccaagtctt cctttagatg tttttaatgc cacttatctt 24420

aatctcactg gtgaaattgc agatttagag cagcgttcag agtctctccg taatactaca 24480

gaggagctcc aaagtcttat atataatatc aacaacacac tagttgacct tgagtggctc 24540

aaccgagttg agacatatat caagtggccg tggtgggttt ggttgattat tttcattgtt 24600

ctcatctttg ttgtgtcatt actagtgttc tgctgcattt ccacgggttg ttgtggatgc 24660

tgcggctgct gctgtgcttg tttctcaggt tgttgtaggg gtcctagact tcaaccttac 24720

gaagtttttg aaaaggtcca cgtgcagtga tgtttcttgg actttttcaa tacacgattg 24780

acacagttgt caaagatgtc tcaaagtctg ctaacttgtc tttggatgct gtccaagagt 24840

tggagctcaa tgtagttcca attagacaag cttcaaatgt gacgggtttt cttttcacca 24900

gtgtttttat ctacttcttt gcactgttta aagcgtcttc tttgaggcgc aattatatta 24960

tgttggcagc gcgttttgct gtcattgttc tttattgccc acttttatat tattgtggtg 25020

catttttaga tgcaactatt atttgttgca cacttattgg caggctttgt ttagtctgct 25080

tttactcctg gcgctataaa aatgcgctct ttattatttt taatactacg acactttctt 25140

tcctcaatgg taaagcagct tattatgacg gcaaatccat tgtgatttta gaaggtggtg 25200

accattacat cacttttggc aactcttttg ttgcttttgt tagtagcatc gacttgtatc 25260

tagctatacg tgggcggcaa gaagctgacc tacagctgtt gcgaactgtt gagcttcttg 25320

atggcaagaa gctttatgtc ttttcgcaac atcaaattgt tggcattact aatgctgcat 25380

ttgactcaat tcaactagac gagtatgcta caattagtga atgataatgg tctagtagtt 25440

aatgttatac tttggctttt cgtactcttt ttcctgctta ttataagcat tactttcgtc 25500

caattggtta atctgtgctt cacttgtcac cggttgtgta atagcgcagt ttacacacct 25560

atagggcgtt tgtatagagt ttataagtct tacatgcaaa tagaccccct ccctagtact 25620

gttattgacg tataaacgaa atatgtctaa cggttctatt cccgttgatg aggtgattca 25680

acaccttaga aactggaatt tcacatggaa tatcatactg acgatactac ttgtagtgct 25740

tcagtatggc cattacaagt actctgcgtt cttgtatggt gtcaagatgg ctattctatg 25800

gatactttgg cctcttgtgt tagcactgtc actttttgat gcatgggcta gctttcaggt 25860

caattgggtc ttttttgctt tcagcatcct tatggcttgc atcactctta tgctgtggat 25920

aatgtacttt gtcaatagca ttcggttgtg gcgcaggaca cattcttggt ggtctttcaa 25980

tcctgaaaca gacgcgcttc tcactacttc tgtgatgggc cgacaggtct gcattccagt 26040

gcttggagca ccaactggtg taacgctaac actccttagt ggtacattgc ttgtagaggg 26100

ctataaggtt gctactggcg tacaggtaag tcaattacct aatttcgtca cagtcgccaa 26160

ggccactaca acaattgtct acggacgtgt tggtcgttca gtcaatgctt catctggcac 26220

tggttgggct ttctatgtcc ggtccaaaca cggcgactac tcagctgtga gtaatccgag 26280

ttcggttctc acagatagtg agaaagtgct tcatttagtc taaacagaaa ctttatggct 26340

tctgtcagtt ttcaggatcg tggccgcaaa cgggtgccat tatccctcta tgcccctctt 26400

agggttacta atgacaaacc cctttctaag gtacttgcaa ataatgctgt acccactaat 26460

aaaggaaata aggaccagca aattggatac tggaatgagc aaattcgctg gcgcatgcgc 26520

cgtggtgagc gaattgaaca accttccaat tggcatttct actacctcgg aacaggacct 26580

cacgccgacc tccgctatag gactcgtact gagggtgttt tctgggttgc taaagaaggc 26640

gcaaagactg aacccactaa cctgggtgtc agaaaggcgt ctgaaaagcc aattattcca 26700

aatttctctc aacagcttcc cagcgtagtt gagattgttg aacctaacac acctcctact 26760

tcacgtgcaa attcacgtag caggagtcgt ggtaatggca acaacaggtc cagatctcca 26820

agtaacaaca gaggcaataa ccagtcccgc ggtaattcac agaatcgtgg aaataaccag 26880

ggtcgtggag cttctcagaa cagaggaggc aataataata acaataacaa gtctcgtaac 26940

cagtccaaga acagaaacca gtcaaatgac cgtggtggtg taacatcacg cgatgatctg 27000

gtggctgctg tcaaggatgc ccttaaatct ttgggtattg gcgaaaaccc tgacaagctt 27060

aagcaacagc agaagcccaa acaggaaagg tctgacagca gcggcaaaaa tacacctaag 27120

aagaacaaat ccagagccac ttcgaaagaa cgtgacctca aagacatccc agagtggagg 27180

agaattccca agggcgaaaa tagcgtagca gcttgcttcg gacccagggg aggcttcaaa 27240

aattttggag atgcggaatt tgtcgaaaaa ggtgttgayg cctcaggcta tgctcagatc 27300

gccagtttag caccaaatgt tgcagcattg ctctttggtg gtaatgtggc tgttcgtgag 27360

ctagcggact cttacgagat tacatataat tataaaatga ctgtgccaaa gtctgatcca 27420

aatgtagagc ttcttgtttc acaggtggat gcatttaaaa ctgggaatgc aaaaccccag 27480

agaaagaagg aaaagaagaa caagcgtgaa accacgcagc agctgaatga agaggccatc 27540

tacgatgatg tgggtgtgcc atctgatgtg actcatgcca atttggaatg ggacacagct 27600

gttgatggtg gtgacacggc cgttgaaatt atcaacgaga tcttcgacac aggaaattaa 27660

acaatgtttg actggcttat cctggctatg tcccagggta gtgccattac actgttatta 27720

ctgagtgttt ttttagcgac ttggctgctg ggctatggct ttgccctcta actagcggtc 27780

ttggtcttgc acacaacggt aagccagtgg taatgtcagt gcaagaagga tattaccata 27840

gcactgtcat gaggggaacg cagtaccttt tcatctaaac ctttgcacga gtaatcaaag 27900

atccgcttga cgagcctata tggaagagcg tgccaggtat ttgactcaag gactgttagt 27960

aactgaagac ctgacggtgt tgatatggat 27990

<210> 2

<211> 28005

<212> DNA

<213> 豬流行性腹瀉病毒

<400> 2

ctacggatag ttagctcttt ttctagactc ttgtctactc aattcaacta aacgaaattt 60

tgtccttccg gccgcatgtc catgctgctg gaagctgacg tggaatttca ttaggtttgc 120

ttaagtagcc atcgcaagtg ctgtgctgtc ctctagttcc tggttggcgt tccgtcgcct 180

tctacatact agacaaacag ccttcctccg gttccgtctg ggggttgtgt ggataactag 240

ttccgtctag tttgaaacca gtaactgtcg gctatggcta gcaaccatgt tacattggct 300

tttgccaatg atgcagaaat ttcagctttt ggcttttgca ctgctagtga agccgtctca 360

tactattctg aggccgccgc tagtggattt atgcaatgcc gtttcgtgtc cttcgatctc 420

gctgacactg ttgagggatt gcttcccgaa gactatgtca tggtggtggt cggcactacc 480

aagcttagtg cgtatgtgga cacttttggt agccgcccca aaaacatttg tggttggctg 540

ttattttcta actgtaatta cttcctcgaa gagttagagc ttacttttgg tcgtcgtggt 600

ggtaacatcg tgccagttga ccaatacatg tgtggcgctg acggtaaacc tgttcttcag 660

gaatccgaat gggagtatac agatttcttt gctgactccg aagacggtca actcaacatt 720

gctggtatca cttatgtgaa ggcctggatt gtagagcgat cggatgtctc ttatgcgagt 780

cagaatttaa catctattaa gtctattact tactgttcaa cctatgagca tacttttcct 840

gatggtactg ccatgaaggt tgcacgtact ccaaagatta agaagactgt tgtcttgtct 900

gagccacttg ctactatcta cagggaaatt ggttctcctt ttgtggataa tgggagcgat 960

gctcgttcta tcattaagag accagtgttc ctccacgctt ttgttaagtg taagtgtggt 1020

agttatcatt ggactgttgg tgattggact tcctatgtct ccacttgctg tggctttaag 1080

tgtaagccag tccttgtggc ttcatgctct gctacgcctg gttctgttgt ggttacgcgc 1140

gctggtgctg gcactggtgt taagtattac aacaacatgt tcctgcgcca tgtggcagac 1200

attgatgggt tggcattctg gcgaattctc aaggtgcagt ccaaagacga cctcgcttgc 1260

tctggtaaat tccttgaaca ccatgaggaa ggtttcacag atccttgcta ctttttgaat 1320

gactcgagca ttgctactaa gctcaagttt gacatcctta gtggcaagtt ttctgatgaa 1380

gtcaaacaag ctatctttgc tggtcatgtt gttgttggca gcgcgctcgt tgacattgtt 1440

gacgatgcac tgggacagcc ttggtttata cgtaagcttg gtgaccttgc aagtgcagct 1500

tgggagcagc ttaaggctgt cgttagaggc cttaacctcc tgtctgatga ggtcgtgctc 1560

tttggcaaaa gacttagctg tgccactctt agtatcgtta acggtgtttt tgagttcatc 1620

gccgaagtgc ctgagaagtt ggctgcggct gttacagttt ttgtcaactt cttgaatgag 1680

ctttttgagt ctgcctgtga ctgcttaaag gtcggaggta aaacctttaa caaggttggc 1740

tcttatgttc tttttgacaa cgcattggtt aagcttgtca aggcaaaagt tcgcggccca 1800

cgacaggcag gtgtttgtga agttcgttac acaagccttg ttattgggag tactaccaag 1860

gtggtttcca agcgcgttga aaatgccaat gtgaatctcg tcgtcgttga cgaggatgtg 1920

accctcaaca ccactggtcg tacagttgtt gttgacggac ttgcattctt cgagagtgac 1980

gggttttaca gacatcttgc tgatgctgac gttgtcattg aacatcctgt ttataagtct 2040

gcttgtgagc tcaagccagt ttttgagtgt gacccaatac ctgattttcc tatgcctgtg 2100

gccgctagtg ttgcagagct ttgtgtgcaa actgatctgt tgcttaaaaa ttacaacact 2160

ccttataaaa cttacagctg cgttgtgaga ggtgataagt gttgcatcac ttgcacctta 2220

catatcacag caccaagtta tatggaggat gctgctaatt ttgtagacct ctgtaccaag 2280

aacattggta ctgctggttt tcatgagttt tacattacgg cccatgaaca acaggatctg 2340

caagggttcg taaccacttg ttgcacgatg tcaggttttg agtgttttat gcctataatc 2400

ccacagtgtc cagcagtgct tgaagagatt gatggtggta gcatctggcg gtcttttatc 2460

actggtctta atacaatgtg ggatttttgc aagcatctta aagtcagctt tggactagat 2520

ggcattgttg tcactgtagc acgcaaattt aaacgacttg gtgctctctt ggcagaaatg 2580

tataacactt acctttcaac tgtggtggaa aacttggtac tggccggtgt tagcttcaag 2640

tattatgcca ccagtgtccc aaaaattgtt ttgggctgtt gttttcacag tgttaaaagt 2700

gttcttgcaa gtgccttcca gattcctgtc caggcaggca ttgagaagtt taaagtcttc 2760

cttaactgtg ttcaccctgt tgtaccacgc gtcattgaaa cttcttttgt ggaattagaa 2820

gagacgacat ttaaaccacc agcactcaat ggtagtattg ctattgttga tggctttgct 2880

ttctattatg atggaacact atactatccc accgatggta atagtgttgt gcctatttgt 2940

tttaagaaga agggtggtgg tgatgtcaaa ttctctgatg aagtctctgt tagaaccatt 3000

gacccagttt ataaggtctc ccttgaattt gagttcgagt ctgagactat tatggctgtg 3060

cttaataagg ctgttggtaa tcgtatcaag gttacaggtg gttgggacga tgttgttgag 3120

tatatcaacg ttgccattga ggttcttaaa gatcatatcg atgtgcctaa gtactacatc 3180

tatgatgagg aaggtggcac cgatcctaat cttcccgtaa tggtttctca gtggccgttg 3240

aatgatgaca cgatctcaca ggatctgctt gatgtggaag ttgttactga tgcaccaatt 3300

gatttcgagg gtgatgaagt agactcctct gaccctgata aggtggcaga tgtggctaac 3360

tctgagcctg aggatgatgg tcctaatgta gctcctgaaa caaatgtaga gtctgaagtt 3420

gaggaagttg ccgcaacctt gtcttttatt aaagatacac cttccacagt tactaaggat 3480

ccttttgctt ttgactttgc aagctatgga ggacttaagg ttttaagaca atctcataac 3540

aactgctggg ttacttctac cttggtgcag ctacaattgc ttggcatcgt tgatgaccct 3600

gcaatggagc tttttagtgc tggtagagtt ggtccaatgg ttcgcaaatg ctatgagtca 3660

caaaaggcta tcttgggatc tttgggtgat gtgtcggctt gcctagagtc cctgactaag 3720

gacctacaca cacttaagat tacctgttct gtagtctgtg gttgtggtac tggtgaacgt 3780

atctatgagg gttgtgcttt tcgtatgacg ccaactttgg aaccgttccc atatggtgct 3840

tgtgctcagt gtgctcaagt tttgatgcac acttttaaaa gtattgttgg caccggcatc 3900

ttttgtcgag atactactgc tctctccttg gattctttgg ttgtaaaacc tctttgtgcg 3960

gctgctttta taggcaagga cagtggtcat tatgtcacta acttttatga tgctgctatg 4020

gctattgatg gttatggtcg tcatcagata aagtatgaca cactgaacac tatttgtgtt 4080

aaagacgtta attggacagc accttttgtc ccagacgttg agcctgtatt ggagcctgtt 4140

gtcaaaccgt tctattctta taagaatgtt gatttttacc aaggagattt tagtgacctt 4200

gttaaacttc catgtgactt tgttgttaat gctgcaaatg agaatttgtc tcacggtggc 4260

ggcatagcaa aggccattga tgtttatacc aagggcatgt tgcagaagtg ctcgaatgat 4320

tacattaaag cacacggtcc cattaaagtt ggacgtggtg tcatgttgga ggcattaggt 4380

cttaaggtct ttaatgttgt tggtccacgt aagggtaagc atgcacctga gcttcttgtt 4440

aaggcttata agtccgtttt tgctaattca ggtgttgctc ttacaccttt gattagtgtt 4500

ggaattttta gtgttccttt ggaagaatct ttatctgctt ttcttgcatg tgttggtgat 4560

cgccactgta agtgcttttg ttatagtgac aaagagcgcg aggcgatcat taattacatg 4620

gatggcttgg tagatgctat tttcaaagat gcacttgttg atactactcc tgtccaggaa 4680

gatgttcaac aagtttcaca aaaaccagtt ttgcctaatt ttgaaccttt caggattgaa 4740

ggtgctcatg ctttctatga gtgcaaccct gaaggtttga tgtcattagg tgctgacaag 4800

ctggtgttgt ttacaaattc caatttggat ttttgtagcg ttggtaagtg tcttaacaat 4860

gtgactggcg gtgcattgct tgaagccata aatgtattta aaaagagtaa caaaacagtg 4920

cctgctggca actgtgttac ttttgagtgt gcagatatga tttctattac tatggtagta 4980

ttgccatctg acggtgatgc taattatgac aaaaattatg cacgcgccgt cgtcaaggta 5040

tctaagctta aaggcaagtt attgcttgct gttggtgatg ctatgttgta ttccaagttg 5100

tcccacctca gcgtgttagg tttcgtatcc acacctgatg atgtggagcg tttctacgca 5160

aataagagtg tggttattaa agttactgag gatacacgta gtgttaagac tgttaaagta 5220

gaatccactg ttacttatgg acaacaaatt ggaccttgtc ttgttaatga caccgttgtc 5280

acagacaaca aacctgttgt tgctgatgtt gtagctaagg ttgtaccaag tgctaattgg 5340

gattcacatt atggttttga taaggctggt gagttccaca tgctagacca tactgggttt 5400

gcctttccta gtgaagttgt taacggtagg cgtgtgctta aaaccacaga taataactgt 5460

tgggttaatg ttacatgttt acaattacag tttgctagat ttaggttcaa gtcagcaggt 5520

ctacaggcta tgtgggagtc ctattgtact ggtgatgttg ctatgtttgt gcattggttg 5580

tactggctta ctggtgttga caaaggtcag cctagtgatt cagaaaatgc acttaacatg 5640

ttgtctaagt acattgttcc tgctggttct gtcactattg aacgtgtcac gcatgacggt 5700

tgttgttgta gtaagcgtgt tgtcactgca ccagttgtga atgctagcgt gttgaagctt 5760

ggcgtcgagg atggtctttg tccacatggt cttaactaca ttgacaaagt tgttgtagtt 5820

aaaggtacta caattgttgt caatgttgga aaacctgtag tggcaccatc gcacctcttt 5880

cttaagggtg tttcctacac aacattccta gataatggta acggtgttgc cggccattat 5940

actgtttttg atcatgacac tggtatggtg catgatggag atgtttttgt accaggtgat 6000

ctcaatgtgt ctcctgttac aaatgttgtc gtctcagagc agacggctgt tgtgattaaa 6060

gaccctgtga agaaagtaga gttagacgct acaaagctgt tagacactat gaattatgca 6120

tcggaaagat tcttttcctt tggtgatttt atgtcacgta atttaattac agtgtttttg 6180

tacatcctta gtattttggg tctctgtttt agggcctttc gtaagaggga tgttaaagtt 6240

ctagctggtg taccccaacg tactggtatt atattgcgta aaagtgtgcg ctataatgca 6300

aaggctttgg gtgtcttctt caagctaaaa ctttattggt tcaaagttct tggtaagttt 6360

agtttgggta tttatgcatt gtatgcatta ctattcatga caatacgctt tacacctata 6420

ggtggccctg tttgtgatga tgttgttgct ggttatgcta attctagttt tgacaagaat 6480

gagtattgca acagtgttat ttgtaaggtc tgtctctatg ggtaccagga actttcggac 6540

ttctctcaca cacaggtagt atggcaacac cttagagacc cattaattgg taatgtgatg 6600

cctttctttt atttggcatt tctggcaatt tttgggggtg tttatgtaaa ggctattact 6660

ctctatttta ttttccagta tcttaacata cttggtgtgt ttttgggcct acaacagtcc 6720

atttggtttt tgcagcttgt gccttttgat gtctttggtg acgagatcgt cgtctttttc 6780

atcgttacac gcgtattgat gttccttaag catgttttcc ttggctgcga taaggcatct 6840

tgtgtggctt gctctaagag tgctcgcctt aagcgcgttc ctgtccagac tatttttcag 6900

ggtactagca aatccttcta cgtacatgcc aatggtggtt ctaagttctg taagaagcac 6960

aatttctttt gtttaaattg tgattcttat ggtccaggct gcacttttat taatgacgtc 7020

attgcaactg aagttggtaa tgttgtcaaa cttaatgtgc aaccgacagg tcctgccact 7080

attcttattg acaaggttga attcagtaat ggtttttact atctttatag tggtgacaca 7140

ttttggaagt acaactttga cataacagat aacaaataca cttgcaaaga gtcacttaaa 7200

aattgtagca taatcacaga ctttattgtt tttaacaata atggttccaa tgtaaatcag 7260

gttaagaatg catgtgtgta tttttcacag atgctttgta aacctgttaa gttagtggac 7320

tcagcgttgt tggccagttt gtctgttgat tttggtgcaa gcttacatag tgcttttgtt 7380

agtgtgttgt cgaatagttt tggcaaagac ctgtcaagtt gtaatgacat gcaggattgc 7440

aagagcacat tgggttttga tgatgtacca ttggatacct ttaatgctgc tgttgctgag 7500

gctcatcgtt acgatgtcct cttgactgac atgtcgttca acaattttac caccagttat 7560

gcaaaaccag aggaaaaact tcccgtccat gacattgcca cgtgtatgcg tgtaggtgcc 7620

aagattgtta atcataacgt tcttgtcaag gatagtatac ctgtggtgtg gcttgtacgt 7680

gatttcattg ccctttctga agaaactagg aagtacatta ttcgtacgac taaagttaag 7740

ggtataacct tcatgttgac ctttaatgat tgtcgtatgc atactaccat acctactgtt 7800

tgcattgcaa ataagaaggg tgcaggtctt cctagttttt caaaggttaa gaaattcttc 7860

tggtttttgt gtctgttcat agttgctgtt ttctttgcac taagcttttt tgattttagt 7920

actcaggtta gcagtgatag tgattatgac ttcaagtata ttgagagtgg ccagttgaag 7980

acttttgaca atccacttag ttgtgtgcat aatgtcttta gtaacttcga ccagtggcat 8040

gatgccaagt ttggtttcac ccccgtcaac aatcctagtt gtcctatagt cgttggtgta 8100

tcagacgaag cgcgcactgt tccaggtatc ccagcaggtg tttatttagc tggtaaaaca 8160

cttgtttttg ctattaacac catttttggt acatctggtt tgtgctttga tgctagtggc 8220

gttgctgata agggcgcttg catttttaat tcggcttgca ccacattatc tggtttgggt 8280

ggaactgctg tctactgtta taagaatggt ctagttgaag gtgctaaact ttatagtgag 8340

ttggcacctc atagctacta taaaatggta gatggtaatg ctgtgtcttt acctgaaatt 8400

atctcgcgcg gctttggcat ccgtactatc cgtacaaagg ctatgaccta ctgtcgcgtt 8460

ggccagtgtg tgcaatctgc agaaggtgtt tgttttggcg ccgatagatt ctttgtctat 8520

aatgcagaat ctggttctga ctttgtttgt ggcacagggc tctttacatt gttgatgaac 8580

gttattagtg ttttttccaa gacagtacca gtaactgtgt tgtctggtca aatacttttt 8640

aattgcatta ttgcttttgc tgctgttgcg gtgtgtttct tatttacaaa gtttaagcgc 8700

atgttcggtg atatgtctgt tggcgttttc actgtcggtg cttgtacttt gttgaacaat 8760

gtttcctaca ttgtaacaca gaacacactt ggcatgttgg gctatgcaac tttgtacttt 8820

ttgtgcacta aaggtgttag atatatgtgg atttggcatt tgggattttt gatctcatat 8880

atacttattg caccatggtg ggttttgatg gtttatgcct tttcagccat ttttgagttt 8940

atgcctaacc tttttaagct taaggtttca acacaacttt ttgagggtga caagttcgta 9000

ggctcttttg aaaatgctgc agcaggtaca tttgtgcttg atatgcatgc ctatgagaga 9060

cttgccaact ctatctcaac tgaaaaactg cgtcagtatg ctagtactta caataagtac 9120

aagtattatt caggcagtgc ttcagaggct gattacaggc ttgcttgttt tgcccatttg 9180

gccaaggcta tgatggatta tgcttctaat cacaacgaca cgttatacac accacccact 9240

gtgagttaca attcaactct acaggctggc ttgcgtaaga tggcacaacc atctggtgtt 9300

gttgagaagt gcatagttcg tgtttgctat ggtaatatgg ctcttaatgg cctatggctt 9360

ggtgatactg ttatctgccc acgccatgtt atagcgtcta gtactactag cactatagat 9420

tatgactatg ccctttctgt tttacgcctc cacaacttct ccatttcatc tggtaatgtt 9480

ttcctaggtg ttgtgggtgt aaccatgcga ggtgctttgt tgcagataaa ggttaatcaa 9540

aacaatgtcc acacgcctaa gtacacctat cgcacagtta gaccgggtga atcttttaat 9600

atcttggcgt gctatgatgg ttctgcagct ggtgtttacg gcgttaacat gcgctctaat 9660

tacactatta gaggctcgtt cattaatggc gcttgtggtt cacctggtta taatattaac 9720

aatggtaccg ttgagttttg ctatttacac cagcttgaac ttggttcagg ctgtcatgtt 9780

ggtagcgact tagatggtgt tatgtatggt ggttatgagg accaacctac tttgcaagtt 9840

gaaggcgcta gtagtctgtt tacagagaat gtgttggcat ttctttatgc agcactcatt 9900

aatggttcta cctggtggct tagttcttct aggattgctg tagacaggtt taatgagtgg 9960

gctgttcata atggtatgac aacagtagtt aatactgatt gcttttctat tcttgctgct 10020

aagactggtg ttgatgtaca acgtttgttg gcctcaatcc agtctctgca taagaatttt 10080

ggtggaaagc aaattcttgg ctatacctcg ttgacagatg agtttactac aggtgaagtt 10140

atacgtcaaa tgtatggcgt taatcttcag agtggttatg tttcacgcgc ctgtagaaat 10200

gtcttgctgg ttggttcttt tctgactttc ttttggtcag aattagtttc ctacactaag 10260

ttcttttggg taaatcctgg ttatgtcaca cctatgtttg cgtgtttgtc attgctgtcc 10320

tcacttttga tgttcacact caagcataag acattgtttt tccaggtctt tctaatacct 10380

gctctgattg ttacatcttg cattaatttg gcatttgatg ttgaagtcta caactatttg 10440

gcagagcatt ttgattacca tgtttctctc atgggtttta atgcacaagg tcttgttaac 10500

atctttgtct gctttgttgt taccatttta cacggcacat acacatggcg cttttttaac 10560

acacctgtga gttctgtcac ttatgtggta gctttgctga ctgcggcata taactatttt 10620

tacgctagtg acattcttag ttgtgctatg acactatttg ctagtgtgac tggcaactgg 10680

ttcgttggtg ctgtttgtta taaagctgct gtttatatgg ccttgagatt tcctactttt 10740

gtggctattt ttggtgatat taagagtgtt atgttctgtt accttgtgtt gggttatttt 10800

acctgttgct tctacggtat tctctactgg ttcaacaggt tttttaaggt tagtgtaggt 10860

gtctatgact atactgttag tgctgctgag tttaagtata tggttgctaa cggcctacgt 10920

gcaccaactg gaacacttga ttcactactt ctgtctgcca aattgattgg tattggtggt 10980

gagcggaata ttaagatttc ttccgttcag tctaaactga ctgatattaa gtgtagtaac 11040

gttgtgcttt taggctgtct ctctagcatg aatgtctcag caaattcaac agaatgggcc 11100

tattgtgttg acttgcataa caagatcaac ttgtgtaatg acccagaaaa agcgcaggaa 11160

atgctacttg ctttgttggc atttttcctt agtaagaata gtgcttttgg tttagatgac 11220

ttattggaat cctattttaa tgacaatagt atgttgcaga gtgttgcatc tacttatgtc 11280

ggtttgcctt cttatgtcat ttatgaaaat gcacgccaac agtatgaaga tgctgttaat 11340

aatggttctc cacctcagtt ggttaagcaa ttgcgccatg ccatgaatgt agcaaagagc 11400

gaatttgacc gtgaggcttc tactcagcgt aagcttgata gaatggcgga acaggctgca 11460

gcacagatgt acaaagaggc acgagcagtt aataggaagt ccaaagttgt aagtgctatg 11520

cattcactgc tttttggtat gttgagacgt ttggacatgt cttctgtaga caccattctc 11580

aacttggcaa aggatggggt tgtacctctg tctgtcatac cggcagtcag tgctactaag 11640

cttaacattg ttacttctga tatcgattct tataatcgta tccagcgtga gggatgtgtc 11700

cactacgctg gtaccatttg gaatataatt gatatcaagg acaatgatgg caaggtggta 11760

cacgttaagg aggtaaccgc acagaatgct gagtccctgt catggcccct ggtccttggg 11820

tgtgagcgta ttgtcaagct ccagaataat gaaattattc ctggtaagct gaagcagcgc 11880

tccattaagg cagaaggaga tggcatagtt ggagaaggta aggcacttta caataatgag 11940

ggtggacgta cttttatgta tgctttcatc tcggacaaac cggacctgcg tgtagtcaag 12000

tgggagttcg atggtggttg taacactatt gagctagaac caccacgtaa gttcttggtg 12060

gattctccta atggtgcaca gatcaagtat ctctactttg ttcgtaacct taacacgtta 12120

cgtaggggtg ctgttctcgg ctacataggt gccactgtac gcttgcaggc tggtaaacaa 12180

acagaacagg ctattaactc ttcattgttg acactttgcg ctttcgctgt ggatcctgct 12240

aagacctaca tcgatgctgt caaaagtggt cacaaaccag taggtaactg tgttaagatg 12300

ttggccaatg gttctggtaa tggacaagct gttactaatg gtgtggaggc tagtactaac 12360

caggattcat acggtggtgc gtccgtgtgt ctatattgta gagcacatgt tgagcatcca 12420

tctatggatg gtttttgcag actgaaaggc aagtacgtac aggttccact aggtacagtg 12480

gatcctatac gttttgtact tgagaatgac gtttgcaagg tttgtggttg ttggctggct 12540

aatggctgca cttgtgacag atccattatg caaagcactg atatggctta tttaaacgag 12600

tacggggctc tagtgcagct cgactagagc cctgtaacgg tactgataca caacatgtgt 12660

atcgtgcttt tgacatctac aacaaggatg ttgcttgtct aggtaaattc ctcaaggtga 12720

actgtgttcg cctgaagaat ttggataagc atgatgcatt ctatgttgtc aaaagatgta 12780

ccaagtctgc gatggaacac gagcaatcca tctatagcag acttgaaaag tgtggagccg 12840

tagccgaaca cgatttcttc acttggaagg atggtcgtgc catctatggt aacgtttgta 12900

gaaaggatct taccgagtat actatgatgg atttgtgtta cgctttacgt aactttgatg 12960

aaaacaattg cgatgttctt aagagcattt taattaaggt aggcgcttgt gaggagtcct 13020

acttcaataa taaagtctgg tttgaccctg ttgaaaatga agacattcat cgtgtctatg 13080

cattgttagg taccattgtt tcacgtgcta tgcttaaatg cgttaagttc tgtgatgcaa 13140

tggttgaaca aggtatagtt ggtgttgtca cattagataa tcaggatctt aatggtgatt 13200

tttatgattt tggtgatttt acttgtagca tcaagggaat gggtataccc atttgcacat 13260

catattactc ttatatgatg cctgttatgg gtatgactaa ttgccttgct agtgagtgtt 13320

ttgttaagag tgatatattt ggtgaggatt tcaagtcata tgacctgctg gaatatgatt 13380

tcacggagca taagacagca ctcttcaaca agtatttcaa gtattgggga ctgcaatacc 13440

accctaactg tgtggactgc agtgatgagc agtgcatagt tcactgtgcc aacttcaata 13500

cgttgttttc cactactata cctattacgg catttggacc tttgtgtcgc aagtgttgga 13560

ttgatggtgt tccactggta actacagctg gttatcattt taaacagtta ggtatagttt 13620

ggaacaatga cctcaactta cactctagca ggctctctat taacgaatta ctccagtttt 13680

gtagtgatcc tgcattgctt atagcatcat caccagccct tgttgatcag cgtactgttt 13740

gcttttcagt tgcagcgcta ggtacaggta tgactaacca gactgttaaa cctggccatt 13800

tcaataagga gttttatgac ttcttacttg agcaaggttt cttttctgag ggctctgagc 13860

ttactttaaa gcacttcttc tttgcacaga agggtgatgc agctgttaag gattttgact 13920

actataggta taatagacct actgttctgg acatttgcca agctcgcgtc gtgtatcaaa 13980

tagtgcaacg ctattttgat atttacgaag gtggttgtat cactgctaaa gaggtggttg 14040

ttacaaacct taacaagagc gcaggttatc ctttgaacaa gtttggtaaa gctggtcttt 14100

actatgagtc tttatcctat gaggaacagg atgaacttta tgcttatact aagcgtaaca 14160

tcctgcccac tatgacacag ctcaacctta aatatgctat aagtggcaaa gaacgtgcac 14220

gcacagtggg tggtgtttcg cttttgtcaa ccatgactac tcggcagtat catcagaaac 14280

acctcaagtc catagttaat actaggggcg cttcggttgt tattggtact actaagtttt 14340

atggtggttg ggacaatatg cttaagaacc ttattgatgg tgttgaaaat ccgtgtctta 14400

tgggttggga ctacccaaag tgcgacagag cactgcccaa tatgatacgt atgatttcag 14460

ccatgatttt aggctctaag cacaccacat gctgcagttc cactgaccgc tttttcaggt 14520

tgtgcaatga attggctcaa gtccttactg aggttgttta ttctaatgga ggtttttatt 14580

tgaagccagg tggtactacc tctggtgatg caaccaccgc atatgcaaac tcagttttta 14640

atatcttcca agcagtaagt gccaatgtta acaaacttct tagtgttgac agcaatgtct 14700

gtcataattt agaagttaag caattgcagc gtaagcttta tgagtgctgt tatagatcaa 14760

ctaccgtcga tgaccagttc gtcgttgagt attatggtta cttgcgtaaa catttttcaa 14820

tgatgattct ttctgatgat ggcgttgttt gttataacaa tgactatgca tcacttggtt 14880

atgtcgctga tcttaacgca ttcaaggctg ttttgtatta ccagaacaat gtcttcatga 14940

gcgcctctaa atgttggatc gagcctgaca ttaataaagg tcctcatgaa ttttgctcgc 15000

agcatactat gcagattgtc gataaagatg gtacttatta ccttccttac cctgatcctt 15060

caagaattct ctctgcaggt gtgtttgttg atgacgttgt taaaactgat gcagttgtat 15120

tgcttgaacg ttatgtgtca ttggctatag atgcctaccc gttatctaag catgaaaatc 15180

ctgaatataa gaaggtgttt tatgtgcttt tggattgggt taagcatctg tacaaaactc 15240

ttaatgctgg tgtgttagag tctttttctg tcacactttt ggaagattct actgctaaat 15300

tctgggatga gagcttttat gccaacatgt atgagaaatc tgcagtttta caatctgcag 15360

ggctttgtgt tgtttgtggc tctcaaactg ttttacgttg tggtgattgt ctacggcgtc 15420

ctatgctttg tactaagtgt gcttatgatc atgtcattgg aacaactcac aagttcattt 15480

tggccatcac tccatatgtg tgttgtgctt cagattgtgg tgtcaatgat gtaactaagc 15540

tctacttagg tggtcttagt tattggtgtc atgaccacaa gccacgtctt gcattcccgt 15600

tgtgctctgc tggtaatgtt tttggcttgt acaaaaattc tgctaccggc tcacccgatg 15660

ttgaagactt taatcgcatt gctacatccg attggactga tgtttctgac tacaggttgg 15720

caaatgatgt caaggactca ttgcgtctgt ttgcagcgga aactatcaag gccaaggagg 15780

agagcgttaa gtcatcctat gcttgtgcaa cactacatga ggttgtagga cctaaagagt 15840

tgttgctcaa atgggaagtc ggcagaccca aaccacccct taatagaaat tcggttttca 15900

cttgttatca tataacgaag aacaccaaat ttcaaatcgg tgagtttgtg tttgagaagg 15960

cagaatatga taatgatgct gtaacatata aaactaccgc cacaacaaaa cttgttcctg 16020

gcatggtttt tgtgcttacc tcacataatg ttcagccatt gcgcgcaccg accattgcta 16080

atcaagaacg ttattccact atacataagt tgcatcctgc ttttaacata cctgaagctt 16140

attctagctt agtgccctat taccaattga ttggtaagca gaagattaca actattcagg 16200

gacctcccgg tagtggtaaa tctcactgtg ttatagggct aggtttgtac tatccaggtg 16260

cacgtatagt gtttacagct tgttctcatg cagcggtcga ttcactttgt gtgaaagctt 16320

ccactgctta tagcaatgac aaatgttcac gcatcatacc acagcgcgct cgtgttgagt 16380

gttatgatgg tttcaagtct aataatacta gtgctcagta ccttttctct actgtcaatg 16440

ctttgccaga gtgcaatgcg gacattgttg tggtggatga ggtctctatg tgcactaatt 16500

atgacttgtc tgtcataaat cagcgcatca gctataggca tgtagtctat gttggtgacc 16560

ctcaacagct gcctgcacca cgtgttatga tttcacgtgg tactttggaa ccaaaggact 16620

acaacgttgt cactcaacgc atgtgtgccc ttaagcctga tgttttcttg cacaagtgtt 16680

atcgctgtcc tgctgagata gtgcgtactg tgtctgagat ggtctatgaa aaccaattca 16740

ttcctgtgca cccagatagc aagcagtgtt ttaaaatctt ttgcaagggt aatgttcagg 16800

ttgataatgg ttcaagcatt aatcgcaggc aattggatgt tgtgcgtatg tttttggcta 16860

aaaatcctag gtggtcaaag gctgttttta tttctcctta taacagccag aattatgttg 16920

ccagccgcat gctaggtcta caaattcaga cagttgactc atcccagggt agtgagtatg 16980

actatgtcat ttacacacaa acttcagata ctgcccatgc ctgtaatgtt aacaggttta 17040

atgttgccat cacaagggcc aagaaaggca tattatgtat aatgtgcgat aggtcccttt 17100

ttgatgtgct taaattcttt gagcttaaat tgtctgattt gcaggctaat gagggttgtg 17160

gtctttttaa agactgtagc agaggtgatg atctgttgcc accatctcac gctaacacct 17220

tcatgtcttt agcggacaat tttaagactg atcaagatct tgctgttcaa ataggtgtta 17280

atggacccat taaatatgag catgttatct cgtttatggg cttccgtttt gatatcaaca 17340

tacccaacca tcacactctc ttttgcacac gcgactttgc catgcgcaat gttagaggtt 17400

ggttgggttt tgacgttgaa ggagcacatg ttgttggctc taacgtcggt acaaatgtcc 17460

cattgcaatt agggttttct aacggtgttg attttgttgt cagacctgaa ggttgcgttg 17520

taactgagtc tggtgactac attaaacccg tcagagctcg tgctccacca ggggaacaat 17580

ttgcacacct tttgcctcta cttaaacgcg gccaaccatg ggatgtggtt cgtaagcgta 17640

tagtgcaaat gtgtagtgac tacctggcta acctatcaga catactaatt tttgtgttgt 17700

gggctggtgg tttggagttg acaactatgc gttactttgt caagattgga ccaagcaaga 17760

gttgtgattg tggtaaggtt gctacttgtt acaatagtgc gctgcatacg tactgttgtt 17820

tcaaacatgc ccttggttgt gattacctgt acaatccata ctgtattgat atacagcagt 17880

ggggatacaa gggatcactt agccttaacc accatgagca ttgtaatgta catagaaacg 17940

agcatgtggc ttctggtgat gccataatga ctcgctgtct agccatacat gattgctttg 18000

tcaagaacgt tgactggtcc atcacatacc catttattgg taatgaggct gttattaata 18060

agagcggccg aattgtgcaa tcacacacta tgcggtcagt tcttaagtta tacaatccaa 18120

aagccatata tgatattggc aaccctaagg gcattagatg tgccgtaacg gatgctaagt 18180

ggttctgctt tgacaagaat cctactaatt ctaatgtcaa gacattggag tatgactata 18240

taacacacgg ccaatttgat gggttgtgct tgttttggaa ttgcaatgtg gacatgtatc 18300

cagaattctc tgtggtctgt cggtttgaca ctcgctgtag gtcaccactc aacttggagg 18360

gttgtaatgg tggttcactg tatgttaata atcatgcatt ccatacaccg gcttttgaca 18420

agcgtgcttt tgccaagttg aagccaatgc catttttctt ctatgatgat actgagtgtg 18480

acaagttaca ggactctata aactacgttc ctcttagggc tagtaattgc attactaaat 18540

gtaatgttgg tggagctgtc tgtagtaagc attgtgctat gtaccatagc tatgttaatg 18600

cttacaacac ctttacgtcg gcgggcttta cgatttgggt gcccacttcg tttgacacct 18660

acaatctgtg gcagacattt agtaacaact tgcaaggtct tgagaacatt gctttcaatg 18720

tcgtaaagaa aggatctttt gttggtgctg aaggtgagct tcctgtagct gtggttaatg 18780

acaaagtgct cgttagagat ggtactgttg atactcttgt tttcacaaac aagacatcac 18840

tacccactaa cgtagctttt gagttgtatg ccaagcgtaa ggtaggactc accccaccca 18900

ttacgatcct acgtaacttg ggtgttgttt gcacatctaa gtgtgtcatt tgggactatg 18960

aagccgaacg tccacttact acttttacaa aggatgtctg taaatatacc gactttgagg 19020

gtgacgtttg cacactcttt gataacagca ttgttggttc attagagcga ttctctatga 19080

cccaaaatgc tgtgcttatg tcacttacag ctgttaaaaa gcttactggc ataaagttaa 19140

cttatggtta tcttaatggt gtcccagtta acacacatga agataaacct tttacttggt 19200

acatttacac taggaagaac ggcaagttcg aggactatcc tgatggctat tttacccaag 19260

gtagaacaac cgctgatttt agccctcgta gtgacatgga aaaggacttc ctaagtatgg 19320

atatgggtct gtttattaac aagtacggac tcgaagatta cggctttgag cacgttgtgt 19380

atggtgatgt ttctaaaacc acccttggtg gtttacatct actaatttcg caggtgcgtc 19440

tggcctgtat gggtgtgctt aaaatagacg agtttgtgtc tagtaatgat agcacgttaa 19500

agtcttgtac tgttacatat gctgataacc ctagtagtaa gatggtttgc acgtatatgg 19560

atctccttct tgacgatttt gtcagcattc ttaaatcgtt ggatttgagt gttgtatcta 19620

aagttcatga agttatggtc gattgtaaaa tgtggaggtg gatgttgtgg tgtaaggatc 19680

ataaactcca gacattttat ccgcaacttc aggccagtga atggaaatgt ggttattcca 19740

tgccttctat ttacaagata caacgtatgt gtttagaacc ttgcaatctc tataactatg 19800

gtgctggtat taagttacct gatggcatta tgtttaacgt agttaaatat acacagcttt 19860

gtcaatatct taatagcacc acaatgtgtg taccccatca catgcgcgtg ctacatcttg 19920

gtgctggctc cgacaagggt gttgcacctg gcacggctgt cttacgacgt tggttgccac 19980

tggatgccat tatagttgac aatgatagtg tggattacgt tagcgatgct gattatagtg 20040

ttacgggaga ttgctctacc ttatacctgt cagataagtt tgacttagtt atatctgata 20100

tgtatgatgg taagattaaa agttgtgatg gggagaacgt gtctaaagaa ggcttctttc 20160

cctatattaa tggtgtcatc actgaaaagt tggcacttgg tggtactgta gctattaagg 20220

tgacggagtt tagttggaat aagaagttgt atgaactcat tcagaggttt gagtattgga 20280

caatgttctg taccagtgtt aacacgtcat cgtcagaggc attcttaatt ggtgttcact 20340

atttaggtga ttttgcaagt ggcgctgtga ttgacggcaa cactatgcat gccaattata 20400

tcttctggcg taattccaca attatgacta tgtcttacaa tagtgtactt gatttaagca 20460

agttcaattg taagcataag gctacagttg tcattaattt aaaagattca tccattagtg 20520

atgttgtgtt aggtttgttg aagaatggta agttgctagt gcgtaataat gacgccattt 20580

gtggtttttc taatcatttg gtcaacgtaa acaaatgaag tctttaacct acttctggtt 20640

gttcttacca gtactttcaa cactcagcct accacaagat gtcactaggt gccagtccac 20700

tattaacttc aggcggttct tttcaaaatt taatgtgcag gcacctgctg tcgttgtgtt 20760

gggtggttat ctacctagta tgaactcctc tagctggtac tgtggcacag gtcttgaaac 20820

tgctagtggc gtgcatggta ttttcctcag ttacatcgat tctggtcagg gctttgagat 20880

tggcatttca caggagccgt ttgatcctag tggttaccag ctttatttac ataaggccac 20940

taatggtaac cataatgcta ttgcacgact gcgcatttgc cagtttccag ataataaaac 21000

attgggccct actgttaatg atgttacaac aggtcgtaac tgcctattca acaaagccat 21060

tccagcttat atgcaggatg gaaaaaatat cgttgtcggc ataacatggg acaatgatcg 21120

tgtcactgtt tttgctgaca agatctatca tttttatctt aaaaatgatt ggtcccgtgt 21180

tgcgacaaga tgttacaata aaagaagttg tgctatgcaa tatgtttata cacctaccta 21240

ctacatgctt aatgttacta gtgcaggtga ggatggcatt tattatgaac catgtacagc 21300

taattgcagt ggttacgctg ccaatgtgtt tgccactgat tctaatggcc acataccaga 21360

aggttttagt tttaataatt ggtttctttt gtccaatgat tccactttgt tgcatggtaa 21420

ggtggtttcc aaccaacctt tgttggtcaa ttgtcttttg gccattccta agatttatgg 21480

actaggccaa tttttctcat tcaatcaaac gatggatggc gtttgtaatg gagctgctgc 21540

gcagcgtgca ccagaggctc tgaggtttaa tattaatgac acctctgtca ttcttgctga 21600

aggctcaatt gtacttcata ctgctttagg aacaaatctt tcttttgttt gcagtaattc 21660

ttcagatcct catctagcta ccttcgccat acctctgggt gctacccaag taccttatta 21720

ttgttttctt aaagtggata cttacaactc cactgtttat aaatttttgg ctgttttacc 21780

tcctactgtc agggaaattg tcatcaccaa gtatggtgat gtttatgtca atgggtttgg 21840

atacttgcat ctcggtttgt tggatgctgt cacaattaat ttcactggtc atggcactga 21900

cgatgatgtt tctggttttt ggaccatagc atcgactaat tttgttgatg cactcatcga 21960

agttcaagga accgccattc agcgtattct ttattgtgat gatcctgtta gccaactcaa 22020

gtgttctcag gttgcttttg accttgacga tggtttttac cctatttctt ctagaaacct 22080

tctgagtcat gaacagccaa tttcttttgt tactctgcca tcatttaatg atcattcttt 22140

tgttaacatt actgtatctg cttcctttgg tggtcatagt ggtgccaacc ttattgcatc 22200

tgacactact atcaatgggt ttagttcttt ctgtgttgac actagacaat ttaccatttc 22260

actgttttat aacgttacaa acagttatgg ttatgtgtct aaatcacagg acagtaattg 22320

ccctttcacc ttgcaatctg ttaatgatta cctgtctttt agcaaatttt gtgtttccac 22380

cagccttttg gctagtgmct gtaccataga tctttttggt taccctgagt ttggtagtgg 22440

tgttaagttt acgtcccttt actttcaatt cacaaagggt gagttgatta ctggcacgcc 22500

taaaccactt gaaggtgtca cggacgtttc ttttatgact ctggatgtgt gtaccaagta 22560

tactatctat ggctttaaag gtgagggtat cattaccctt acaaattcta gctttttggc 22620

aggtgtttat tacacatctg attctggaca gttgttagcc tttaagaatg tcactagtgg 22680

tgctgtttat tctgttacgc catgttcttt ttcagagcag gctgcatatg ttgatgatga 22740

tatagtgggt gttatttcta gtttgtctag ctccactttt aacagcacta gggagttgcc 22800

tggtttcttc taccattcta atgatggctc taattgtaca gagcctgtgt tggtgtatag 22860

taacataggt gtttgtaaat ctggcagtat tggctacgtc ccatctcagt ctggccaagt 22920

caagattgca cccacggtta ctgggaatat tagtattccc accaacttta gtatgagtat 22980

taggacagaa tatttacagc tttacaacac gcctgttagt gttgattgtg ccacatatgt 23040

ttgtaatggt aactctcgtt gtaaacaatt actcacccag tacactgcag catgtaagac 23100

catagagtca gcattacaac tcagcgctag gcttgagtct gttgaagtta actctatgct 23160

tactatttct gaagaggctc tacagttagc taccattagt tcgtttaatg gtgatggata 23220

taattttact aatgtgctgg gtgtttctgt gtatgatcct gcaagtggca gggtggtaca 23280

aaaaaggtct tttattgaag acctgctttt taataaagtg gttactaatg gccttggtac 23340

tgttgatgaa gactataagc gctgttctaa tggtcgctct gtggcagatc tagtctgtgc 23400

acagtattac tctggtgtca tggtactacc tggtgttgtt gacgctgaga agcttcacat 23460

gtatagtgcg tctctcatcg gtggtatggt gctaggaggt tttacttctg cagcggcatt 23520

gccttttagc tatgctgttc aagctagact caattatctt gctctacaga cggatgttct 23580

acagcggaac cagcaattgc ttgctgagtc ttttaactct gctattggta atataacttc 23640

agcctttgag agtgttaaag aggctattag tcaaacttcc aagggtttga acactgtggc 23700

tcatgcgctt actaaggttc aagaggttgt taactcgcag ggtgcagctt tgactcaact 23760

taccgtacag ctgcaacaca acttccaagc catttctagt tctattgatg acatttactc 23820

tcgactggac attctttcag ccgatgttca ggttgaccgt ctcatcaccg gcagattatc 23880

agcacttaat gcttttgttg ctcaaaccct cactaagtat actgaggttc aggctagcag 23940

gaagttagca cagcaaaagg ttaatgagtg cgttaaatcg caatctcagc gttatggttt 24000

ttgtggtggt gatggcgagc acattttctc tctggtacag gcagcacctc agggcctgct 24060

gtttttacat acagtacttg taccgagtga ttttgtagat gttattgcca tcgctggctt 24120

atgcgttaac gatgaaattg ccttgactct acgtgagcct ggcttagtct tgtttacgca 24180

tgaacttcaa aatcatactg cgacggaata ttttgtttca tcgcgacgta tgtttgaacc 24240

tagaaaacct accgttagtg attttgttca aattgagagt tgtgtggtca cctatgtcaa 24300

tttgactaga gaccaactac cagatgtaat cccagattac atcgatgtta acaaaacact 24360

tgatgagatt ttagcttctc tgcccaatag aactggtcca agtcttcctt tagatgtttt 24420

taatgccact tatcttaatc tcactggtga aattgcagat ttagagcagc gttcagagtc 24480

tctccgtaat actacagagg agctccaaag tcttatatat aatatcaaca acacactagt 24540

tgaccttgag tggctcaacc gagttgagac atatatcaag tggccgtggt gggtttggtt 24600

gattattttc attgttctca tctttgttgt gtcattacta gtgttctgct gcatttccac 24660

gggttgttgt ggatgctgcg gctgctgctg tgcttgtttc tcaggttgtt gtaggggtcc 24720

tagacttcaa ccttacgaag tttttgaaaa ggtccacgtg cagtgatgtt tcttggactt 24780

tttcaataca cgattgacac agttgtcaaa gatgtctcaa agtctgctaa cttgtctttg 24840

gatgctgtcc aagagttgga gctcaatgta gttccaatta gacaagcttc aaatgtgacg 24900

ggttttcttt tcaccagtgt ttttatctac ttctttgcac tgtttaaagc gtcttctttg 24960

aggcgcaatt atattatgtt ggcagcgcgt tttgctgtca ttgttcttta ttgcccactt 25020

ttatattatt gtggtgcatt tttagatgca actattattt gttgcacact tattggcagg 25080

ctttgtttag tctgctttta ctcctggcgc tataaaaatg cgctctttat tatttttaat 25140

actacgacac tttctttcct caatggtaaa gcagcttatt atgacggcaa atccattgtg 25200

attttagaag gtggtgacca ttacatcact tttggcaact cttttgttgc ttttgttagt 25260

agcatcgact tgtatctagc tatacgtggg cggcaagaag ctgacctaca gctgttgcga 25320

actgttgagc ttcttgatgg caagaagctt tatgtctttt cgcaacatca aattgttggc 25380

attactaatg ctgcatttga ctcaattcaa ctagacgagt atgctacaat tagtgaatga 25440

taatggtcta gtagttaatg ttatactttg gcttttcgta ctctttttcc tgcttattat 25500

aagcattact ttcgtccaat tggttaatct gtgcttcact tgtcaccggt tgtgtaatag 25560

cgcagtttac acacctatag ggcgtttgta tagagtttat aagtcttaca tgcaaataga 25620

ccccctacct agtactgtta ttgacgtata aacgaaatat gtctaacggt tctattcccg 25680

ttgatgaggt gattcaacac cttagaaact ggaatttcac atggaatatc atactgacga 25740

tactacttgt agtgcttcag tatggccatt acaagtactc tgcgttcttg tatggtgtca 25800

agatggctat tctatggata ctttggcctc ttgtgttagc actgtcactt tttgatgcat 25860

gggctagctt tcaggtcaat tgggtctttt ttgctttcag catccttatg gcttgcatca 25920

ctcttatgct gtggataatg tactttgtca atagcattcg gttgtggcgc aggacacatt 25980

cttggtggtc tttcaatcct gaaacagacg cgcttctcac tacttctgtg atgggccgac 26040

aggtctgcat tccagtgctt ggagcaccaa ctggtgtaac gctaacactc cttagtggta 26100

cattgcttgt agagggctat aaggttgcta ctggcgtaca ggtaagtcaa ttacctaatt 26160

tcgtcacagt cgccaaggcc actacaacaa ttgtctacgg acgtgttggt cgttcagtca 26220

atgcttcatc tggcactggt tgggctttct atgtccggtc caaacacggc gactactcag 26280

ctgtgagtaa tccgagttcg gttctcacag atagtgagaa agtgcttcat ttagtctaaa 26340

cagaaacttt atggcttctg tcagttttca ggatcgtggc cgcaaacggg tgccattatc 26400

cctctatgcc cctcttaggg ttactaatga caaacccctt tctaaggtac ttgcaaataa 26460

tgctgtaccc actaataaag gaaataagga ccagcaaatt ggatactgga atgagcaaat 26520

tcgctggcgc atgcgccgtg gtgagcgaat tgaacaacct tccaattggc atttctacta 26580

cctcggaaca ggacctcacg ccgacctccg ctataggact cgtactgagg gtgttttctg 26640

ggttgctaaa gaaggcgcaa agactgaacc cactaacctg ggtgtcagaa aggcgtctga 26700

aaagccaatt attccaaatt tctctcaaca gcttcccagc gtagttgaga ttgttgaacc 26760

taacacacct cctacttcac gtgcaaattc acgtagcagg agtcgtggta atggcaacta 26820

caggtccaga tctccaagta acaacagagg caataaccag tcccgcggta attcacagaa 26880

tcgtggaaat aaccagggtc gtggagcttc tcagaacaga ggaggcaata ataataacaa 26940

taacaagtct cgtaaccagt ccaagaacag aaaccagtca aatgaccgtg gtggtgtaac 27000

atcacgcgat gatctggtgg ctgctgtcaa ggatgccctt aaatctttgg gtattggcga 27060

aaaccctgac aagcttaagc aacagcagaa gcccaaacag gaaaggtctg acagcagcgg 27120

caaaaataca cctaagaaga acaaatccag agccacttcg aaagaacgtg acctcaaaga 27180

catcccagag tggaggagaa ttcccaaggg cgaaaatagc gtagcagctt gcttcggacc 27240

caggggaggc ttcaaaaatt ttggagatgc ggaatttgtc gaaaaaggtg ttgatgcctc 27300

aggctatgct cagatcgcca gtttagcacc aaatgttgca gcattgctct ttggtggtaa 27360

tgtggctgtt cgtgagctag cggactctta cgagattaca tataattata aaatgactgt 27420

gccaaagtct gatccaaatg tagagcttct tgtttcacag gtggatgcat ttaaaactgg 27480

gaatgcaaaa ccccagagaa agaaggaaaa gaagaacaag cgtgaaacca cgcagcagct 27540

gaatgaagag gccatctacg atgatgtggg tgtgccatct gatgtgactc atgccaattt 27600

ggaatgggac acagctgttg atggtggtga cacggccgtt gaaattatca acgagatctt 27660

cgacacagga aattaaacaa tgtttgactg gcttatcctg gctatgtccc agggtagtgc 27720

cattacactg ttattactga gtgtttttct agcgacttgg ctgctgggct atggctttgc 27780

cctctaacta gcggtcttgg tcttgcacac aacggtaagc cagtggtaat gtcagtgcaa 27840

gaaggatatt accatagcac tgtcatgagg ggaacgcagt accttttcat ctaaaccttt 27900

gcacgagtaa tcaaagatcc gcttgacgag cctatatgga agagcgtgcc aggtatttga 27960

ctcaaggact gttagtaact gaagacctga cggtgttgat atgga 28005

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213> 豬流行性腹瀉病毒

<400> 3

atgaagtctt taaattactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact cagcctacca 60

caagatgtca ctaggtgcca gtccactatt aacttcaggc ggttcttttc aaaatttaat 120

gtgcaggcac ctgctgtcgt tgtgttgggt ggttatctac ctagtatgaa ctcctctagc 180

tggtactgtg gcacaggtct tgaaactgct agtggcgtgc atggtatttt cctcagttac 240

atcgatgctg gtcagggctt tgagattggc atttcacagg agccgtttga tcctagtggt 300

taccagcttt atttacataa ggccactaat ggtaaccata atgctattgc acgactgcgc 360

atttgccagt ttccagataa taaaacattg ggccctactg ttaatgatgt tacaacaggt 420

cgtaactgcc tattcaacaa agccattcca gcttatatgc aggatggaaa aaatatcgtt 480

gtcggcataa catgggacaa tgatcgtgtc actgtttttg ctgacaagat ctatcatttt 540

tatcttaaaa atgattggtc ccgtgttgcg acaagatgtt acaataaaag aagttgtgct 600

atgcaatatg tttatacacc tacctactac atgcttaatg ttactagtgc aggtgaggat 660

ggcatttatt atgaaccatg tacagctaat tgcagtggtt acgctgccaa tgtgtttgcc 720

actgattcta atggccacat accagaaggt tttagtttta ataattggtt tcttttgtcc 780

aatgattcca ctttgttgca tggtaaggtg gtttccaacc aacctttgtt ggtcaattgt 840

cttttggcca ttcctaagat ttatggacta ggccaatttt tctcattcaa tcaaacgatg 900

gatggcgttt gtaatggagc tgctgcgcag cgtgcaccag aggctctgag gtttaatatt 960

aatgacacct ctgtcattct tgctgaaggc tcaattgtac ttcatactgc tttaggaaca 1020

aatctttctt ttgtttgcag taattcttca gatcctcatc tagctacctt cgccatacct 1080

ctgggtgcta cccaagtacc ttattattgt tttcttaaag tggatactta caactccact 1140

gtttataaat ttttggctgt tttacctcct 1170

<210> 4

<211> 1170

<212> DNA

<213> 豬流行性腹瀉病毒

<400> 4

atgaagtctt taacctactt ctggttgttc ttaccagtac tttcaacact cagcctacca 60

caagatgtca ctaggtgcca gtccactatt aacttcaggc ggttcttttc aaaatttaat 120

gtgcaggcac ctgctgtcgt tgtgttgggt ggttatctac ctagtatgaa ctcctctagc 180

tggtactgtg gcacaggtct tgaaactgct agtggcgtgc atggtatttt cctcagttac 240

atcgattctg gtcagggctt tgagattggc atttcacagg agccgtttga tcctagtggt 300

taccagcttt atttacataa ggccactaat ggtaaccata atgctattgc acgactgcgc 360

atttgccagt ttccagataa taaaacattg ggccctactg ttaatgatgt tacaacaggt 420

cgtaactgcc tattcaacaa agccattcca gcttatatgc aggatggaaa aaatatcgtt 480

gtcggcataa catgggacaa tgatcgtgtc actgtttttg ctgacaagat ctatcatttt 540

tatcttaaaa atgattggtc ccgtgttgcg acaagatgtt acaataaaag aagttgtgct 600

atgcaatatg tttatacacc tacctactac atgcttaatg ttactagtgc aggtgaggat 660

ggcatttatt atgaaccatg tacagctaat tgcagtggtt acgctgccaa tgtgtttgcc 720

actgattcta atggccacat accagaaggt tttagtttta ataattggtt tcttttgtcc 780

aatgattcca ctttgttgca tggtaaggtg gtttccaacc aacctttgtt ggtcaattgt 840

cttttggcca ttcctaagat ttatggacta ggccaatttt tctcattcaa tcaaacgatg 900

gatggcgttt gtaatggagc tgctgcgcag cgtgcaccag aggctctgag gtttaatatt 960

aatgacacct ctgtcattct tgctgaaggc tcaattgtac ttcatactgc tttaggaaca 1020

aatctttctt ttgtttgcag taattcttca gatcctcatc tagctacctt cgccatacct 1080

ctgggtgcta cccaagtacc ttattattgt tttcttaaag tggatactta caactccact 1140

gtttataaat ttttggctgt tttacctcct 1170