抑制壞死性凋亡的方法與流程
本發(fā)明涉及抑制壞死性凋亡的方法，用于鑒定抑制壞死性凋亡的化合物的篩選方法以及用于抑制壞死性凋亡的化合物。
背景技術(shù)：
在許多疾病中，細胞死亡通過凋亡和/或壞死途徑介導。雖然已知很多關(guān)于控制凋亡的作用機制，但對控制壞死還不太清楚。了解調(diào)節(jié)細胞壞死和細胞凋亡兩者的機制對于能夠治療如神經(jīng)變性疾病、中風、冠心病、腎病、肝病、AIDS以及與AIDS相關(guān)病癥的疾病是必要的。
根據(jù)形態(tài)特征，細胞死亡傳統(tǒng)上被歸類為凋亡或壞死(Wyllie等人，Int.Rev.Cytol.68：251(1980))。這兩種模式的細胞死亡最初也被認為分別通過調(diào)節(jié)過程(半胱天冬酶依賴)和非調(diào)節(jié)過程發(fā)生。然而，更多最近的研究表明，導致這兩種表型的潛在細胞死亡機制要復(fù)雜得多，并且在某些情況下是相互關(guān)聯(lián)的。此外，導致壞死的條件可以通過調(diào)節(jié)的半胱天冬酶非依賴性的或非調(diào)節(jié)過程發(fā)生。
已經(jīng)描述了一種伴有類似壞死的形態(tài)學特征，稱為壞死性凋亡的調(diào)節(jié)的半胱天冬酶非依賴的細胞死亡途徑(Degterev等人，Nat.Chem.Biol.1：112,2005)。這種細胞死亡方式可在大量細胞類型(例如單核細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、上皮細胞和神經(jīng)元)中由各種刺激(例如TNF-[α]和Fas配體)啟動。在涉及過度細胞應(yīng)激、快速能量損失和大量氧化物質(zhì)產(chǎn)生的病理條件下，壞死性凋亡可能代表細胞死亡的主要原因并且在一些情況下是主要模式，此時高度能量依賴性細胞凋亡過程不起作用。
能夠抑制壞死性凋亡的低分子量分子的鑒定和優(yōu)化將有助于闡明其在疾病病理生理學中的作用，并且可以提供用于治療抗壞死性凋亡的化合物。防止半胱天冬酶依賴性細胞死亡(例如壞死或壞死性凋亡)的化合物的發(fā)現(xiàn)也將為治療或預(yù)防發(fā)生壞死的病癥提供有用的治療劑。這些化合物和方法將對治療神經(jīng)變性疾病、缺血性腦和心臟損傷、頭部創(chuàng)傷和炎性病癥特別有用。
已經(jīng)包括在本說明書中的文檔、療法、材料、裝置、制品等的任何討論不應(yīng)因為它存在于本申請的每個權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前而被視為承認這些中的任何一個或全部形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或者是與本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域公知常識。
發(fā)明簡述
在一方面，提供了用于在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的化合物，所述化合物結(jié)合混合系列激酶域樣(MLKL)蛋白的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點。
在另一方面，提供了一種用于鑒定抑制壞死性凋亡的化合物的篩選方法，所述方法包括：
a)在允許MLKL和候選化合物相互作用的條件下，將含有MLKL的蛋白質(zhì)溶液與候選化合物接觸；和
b)將存在候選化合物時獲得的解折疊轉(zhuǎn)變溫度(Tm)與不存在候選化合物時獲得的解折疊轉(zhuǎn)變溫度(Tm)進行比較，以確定解折疊轉(zhuǎn)變溫度的變化(ΔTm)；
其中MLKL和候選化合物通過候選化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合相互作用；和
其中正ΔTm值表示候選化合物穩(wěn)定蛋白質(zhì)防止其變性并抑制其在壞死性凋亡中的作用。
在另一方面，提供了一種用于鑒定抑制壞死性凋亡的化合物的篩選方法，所述方法包括：
a)在允許MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域和候選化合物相互作用的條件下，將MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域與濃度漸增的候選化合物接觸；和
b)測定結(jié)合親和力(Kd)；
其中MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域和候選化合物通過候選化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合相互作用，和
其中與候選化合物的結(jié)合表明候選化合物能夠抑制壞死性凋亡。
在另一方面，提供了用于鑒定抑制壞死性凋亡的化合物的篩選方法，所述方法包括：
a)將含有MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)溶液與核苷酸和候選化合物接觸，并進行STD-NMR；和
b)將候選化合物存在時獲得的STD-NMR譜圖和不存在候選化合物時獲得的STD-NMR譜圖進行比較；
其中MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域和候選化合物通過候選化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合相互作用；和
其中STD-NMR譜圖中信號強度的消失或減少表明候選化合物能夠抑制壞死性凋亡。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)US2005/0085637中描述的具體化合物適合于抑制壞死性凋亡。
因此，一方面，提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(I)的化合物，或其鹽、溶劑合物，或生理功能性衍生物：
其中：
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D是-N(H)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)RR”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、S(O)2R”’，或-S(O)2NR’R’，其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1或C(O)R1；以及
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、烷基、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；和
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基。
另一方面，提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(II)的化合物，或其鹽、溶劑合物，或生理功能性衍生物：
其中：
D是-N(H)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)RR”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、S(O)2R”’，或-S(O)2NR’R’，其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1或C(O)R1；以及
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；和
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基。
另一方面，提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(I)的化合物，或其鹽、溶劑合物，或生理功能性衍生物：
其中，
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D為
q為1、2或3；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是O且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；
R5是C1-C6烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R6為由-(X4)z-(X5)定義的基團，
其中，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、CN、-NR7R7、-N(H)C(O)R7、-N(H)C(O)ORR7R7N(H)S(O)2R7、N(H)S(O)2NR7R7、-OC(O)R7、OC(O)NR7R7、-C(O)R7、-C(O)NR7R7、-SR7、-S(O)R7、-S(O)2R7R7、或-S(O)2NR7R7；和
R7為氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基氨基。
另一方面，提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(II)的化合物，或其鹽、溶劑合物，或生理功能性衍生物：
其中：
D為
q為1、2或3；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是O且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2RS和-C(O)R5；
R5是C1-C6烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R6為由-(X4)z-(X5)定義的基團，其中，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、CN、-NR7R7、-N(H)C(O)R7、-N(H)C(O)OR7、-N(H)C(O)NR7R7、N(H)S(O)2R7、N(H)S(O)2NR7R7、-OC(O)R7、OC(O)NR7R7、-C(O)R7、-O)NR7R7、-SR7、-S(O)R7、-S(O)2R7R7、或-S(O)2NR7R7；和
R7為氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基氨基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳基或雜芳基。
另一方面，提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(I)的化合物，或其鹽、溶劑合物，或生理功能性衍生物：
其中：
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D為-N(R8)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，
其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)R”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、-S(O)2R”’、或-S(O)2NR’R’，
其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；和
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、烷基、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R8為氫或C1-C3烷基。
另一方面，進一步提供了式(I)、(II)和/或(III)的新化合物。
另一方面，提供了式(I)、(II)和/或(III)的化合物在制備用于抑制受試者中壞死性凋亡的藥物的用途。
另一方面，提供了式(I)、(II)和/或(III)的化合物用于抑制壞死性凋亡的用途。
另一方面，提供了用于抑制壞死性凋亡的式(I)、(II)和/或(III)的化合物。
另一方面，提供了當用于抑制壞死性凋亡時的式(I)、(II)和/或(III)的化合物。
除非另有明確說明，本文的任何實施例應(yīng)被作必要修改以適用于任何其它實施例。
本發(fā)明不限于本文所描述的具體實施例的范圍，這些實施例僅用于示例的目的。如本文所述，功能等同的產(chǎn)品、組合物和方法顯然在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在整個說明書中，除非另有特別說明或上下文另有要求，提及單個步驟、物質(zhì)組成、步驟組或物質(zhì)組合物組應(yīng)被認為包括一個和多個(即一個或多個)那些步驟、物質(zhì)組合物、步驟組或物質(zhì)組合物組。
下文通過以下非限制性實施例并參考附圖描述本發(fā)明。
附圖說明
圖1：化合物1抑制MLKL-誘導的壞死性凋亡的機理研究。(A)：使用熱穩(wěn)定性位移測定法化合物1被鑒定為小鼠MLKL相互作用物。(B)：通過表面等離子體共振(SPR)驗證與小鼠MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的化合物1。(C)：化合物1以劑量依賴性方式抑制用TSQ刺激的野生型MDF的壞死性死亡。所示數(shù)據(jù)是3次獨立實驗的平均值±SEM。(D)：化合物1阻滯藍色非變性PAGE的抗MLKL印跡中的膜部分的易位。通過對于GADPH和VDAC1的對照印跡說明細胞質(zhì)和膜部分純度和蛋白質(zhì)豐度。
圖2：(A)：顯示與小鼠MLKL結(jié)合的核苷酸的飽和度轉(zhuǎn)移差異(STD)NMR光譜。數(shù)據(jù)顯示，化合物1可以與(i)ATP和(ii)ADP競爭結(jié)合小鼠MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域。偏離共振光譜的低場區(qū)域顯示檢測到在不存在蛋白質(zhì)時200μM ATP(i)或ADP(ii)的峰。在2μM小鼠MLKL(179-464)存在下，在ATP(i)或ADP(ii)上進行的STD-NMR實驗中觀察到用星號標記的峰，確認核苷酸結(jié)合。這些峰在200μM化合物1的存在下減少，證實通過加入化合物1從小鼠MLKL(179-464)中置換出ATP和ADP和化合物1。(B)：濃度≥5μM的化合物1的毒性誘導野生型MDF死亡。顯示三次重復(fù)實驗的平均值±SEM。(C)：體外激酶測試，證明化合物1相對于DMSO對照(“0”泳道)對重組RIPK3激酶活性沒有影響?；衔?濃度≥10μM可重復(fù)地導致小鼠MLKL(179-464)的磷酸化增加。所示的實驗是三種獨立測試的代表。左圖，干燥考馬斯染色4-12％Bis-Tris凝膠；右圖，相同凝膠的放射自顯影。
圖3：(A)：顯示與人MLKL結(jié)合的核苷酸的STD NMR光譜。數(shù)據(jù)顯示化合物1可以與(i)ATP和(ii)ADP競爭結(jié)合人MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域。偏離共振光譜的低場區(qū)顯示檢測到在不存在蛋白質(zhì)時200μM ATP(i)或ADP(ii)的峰。在2μM人MLKL(190-471)存在時，在ATP(i)或ADP(ii)上進行的STD-NMR實驗中觀察到用星號標記的峰，確認核苷酸結(jié)合。這些峰在200μM化合物1存在時減少，證實通過加入化合物1從人MLKL(190-471)中置換出ATP和ADP和化合物1。(B)：通過SPR驗證化合物1結(jié)合人MLKL(190-471)。(C)：化合物1以劑量依賴性方式抑制用TSQ刺激的野生型U937細胞系的壞死性死亡。所示數(shù)據(jù)是5次獨立實驗的平均值±SD。(D)：化合物1在基因編輯以刪除MLKL的U937細胞中的毒性。在不存在MLKL時，TSQ刺激的細胞與未受刺激的細胞表現(xiàn)等同。TS處理說明細胞保留了經(jīng)歷凋亡死亡的能力，并且這不受化合物1處理的影響。所示數(shù)據(jù)是2次獨立實驗的平均值±SD。
圖4：(A)：索拉非尼，具有與化合物1類似的蛋白激酶靶標譜的蛋白激酶抑制劑，在相同于或小于1μM濃度，不抑制野生型MDF中TSQ-誘導的細胞死亡。顯示三次重復(fù)實驗的平均值±SEM。(B)：索拉非尼，具有與化合物1相似的蛋白激酶靶標譜的蛋白激酶抑制劑，在野生型U937細胞中不抑制TSQ-誘導的壞死性凋亡。顯示兩次重復(fù)實驗的平均值±SEM。
圖5：(A)和(B)：化合物3和人MLKL的復(fù)合物，證明化合物3在人MLKL的ATP結(jié)合位點內(nèi)結(jié)合。
圖6：顯示化合物1抑制聚肌胞(Poly(I：C))-誘導的RIP1非依賴性壞死性凋亡的圖。
圖7：SEQ ID NO:1是MLKL蛋白的人全長同種型(isoform)的氨基酸序列。
圖8：SEQ ID NO:2是MLKL蛋白的人短同種型的氨基酸序列。
圖9：SEQ ID NO:3是MLKL蛋白的小鼠全長同種型的氨基酸序列。
圖10：SEQ ID NO:4是464-氨基酸MLKL蛋白的小鼠短同種型的氨基酸序列。
序列表要點
SEQ ID NO:1是MLKL蛋白的人全長同種型的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是MLKL蛋白的人短同種型的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是MLKL蛋白的小鼠全長同種型的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是464-氨基酸MLKL蛋白的小鼠短同種型的氨基酸序列。
具體實施方式
應(yīng)當理解，在本說明書中公開和定義的本發(fā)明延伸到文本或附圖提及的或從中顯而易見獲得的兩個或更多個單獨特征的所有替代組合。所有這些不同的組合構(gòu)成本發(fā)明的各種替代方面。
在過去5年中，已經(jīng)出現(xiàn)程序性壞死或“壞死性凋亡”作為細胞死亡機制，補充了多細胞生物體中凋亡這一常規(guī)細胞死亡途徑。與凋亡相反，壞死性凋亡看起來不在多細胞生物體發(fā)育中起重要作用，但在對抗病原體的防御中起作用，并且在許多破壞性炎癥狀況中是可能的罪魁禍首。2009年，受體相互作用蛋白激酶-3(RIPK3)被確定為壞死性凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)子，2012年確定其底物，假激酶混合系列激酶域樣(MLKL)，但誘導細胞死亡所需的RIPK3-介導的MLKL磷酸化后的分子事件尚不清楚。已經(jīng)聲稱RIPK1/RIPK3/MLKL壞死(necrosome)激活PGAM5和Drp1以引起線粒體片段化和細胞死亡，但是對于用于壞死的PGAM5、Drp1和線粒體的需求已被質(zhì)疑。MLKL是在壞死性凋亡細胞死亡途徑中必需的效應(yīng)子蛋白(Sun等人，Cell，148(1-2)，213-227,2012；Zhao等人，PNAS，109(14)，5322-5327；Murphy等人，Immunity，39(3)，443-453，2013)。
MLKL含有通過兩個螺旋接頭(“支架(brace)”螺旋)連接的C-末端假激酶結(jié)構(gòu)域和N-末端四螺旋束(4HB)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明是基于我們的突變和生物化學分析，其證明MLKL 4HB結(jié)構(gòu)域足以誘導壞死性凋亡，其中幾個帶電殘基聚集在4HB結(jié)構(gòu)域的兩個面上，是該功能所需的。令人驚奇的是，這些帶電荷殘基中的幾個的極性在小鼠和人MLKL之間不守恒，并且在4HB結(jié)構(gòu)域的α4螺旋上的帶負電殘基的丙氨酸取代破壞功能。這一發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了結(jié)合至殺傷活性4HB結(jié)構(gòu)域的磷脂的重要性，并且說明膜結(jié)合不能僅僅歸因于MLKL 4HB結(jié)構(gòu)域內(nèi)較差保守堿性殘基之間的相互作用。有趣的是，4HB結(jié)構(gòu)域上第二個殘基簇的突變不妨礙寡聚和膜定位，說明盡管膜易位可能是4HB結(jié)構(gòu)域的殺傷功能的基礎(chǔ)，但其不足以誘導細胞死亡。
不希望受理論束縛，這些數(shù)據(jù)支持MLKL功能的模型，其中MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域抑制4HB結(jié)構(gòu)域，直到被RIPK3磷酸化，其引起假激酶結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象變化以釋放4HB結(jié)構(gòu)域以進行寡聚并與膜結(jié)合。MLKL活化中的這個步驟可以被靶向MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的ATP結(jié)合位點的小分子阻礙，從而阻礙MLKL易位到膜并防止壞死性凋亡。靶向假激酶的ATP結(jié)合位點或“假活性”位點是迄今未開發(fā)的一類治療靶標。因此，通過靶向MLKL防止壞死性凋亡的化合物的鑒定將有利于治療與失調(diào)的壞死性凋亡相關(guān)的病癥。
本發(fā)明證明MLKL寡聚和膜易位可以被化合物抑制，所述化合物基于其對MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的親和力來鑒定。此外，本發(fā)明證明了通過小分子抑制MLKL寡聚和膜易位實現(xiàn)了抑制壞死作用。
本發(fā)明的一方面，提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的結(jié)合混合系列激酶域樣(MLKL)蛋白的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的化合物。
如上所述，認為MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域抑制4HB結(jié)構(gòu)域直到被RIPK3磷酸化，其引起假激酶結(jié)構(gòu)域中的構(gòu)象變化以釋放4HB結(jié)構(gòu)域，從而寡聚并與膜結(jié)合，從而導致壞死性凋亡。因此，在本發(fā)明的一實施例中，給予所述化合物抑制MLKL的構(gòu)象變化。在另一個實施例中，所述MLKL的構(gòu)象變化涉及MLKL的四螺旋束(4HB)結(jié)構(gòu)域的釋放。在另一實施例中，給予所述化合物抑制MLKL寡聚。在另一實施例中，給予所述化合物抑制MLKL易位至細胞膜。在另一實施例中，給予所述化合物抑制MLKL的構(gòu)象變化，抑制MLKL寡聚并抑制MLKL易位至細胞膜。
人和小鼠MLKL都具有通過選擇性剪接產(chǎn)生的兩種轉(zhuǎn)錄同種型。人MLKL同種型1是較長的人轉(zhuǎn)錄物并編碼471-氨基酸蛋白(SEQ ID NO:1)的全長同種型。人同種型2缺少外顯子4-8并且編碼263-氨基酸蛋白(SEQ ID NO:2)的短同種型。雖然人MLKL的兩種同種型具有相同的N和C末端(如WO2010/122135中所述)，但全長人MLKL而不是該基因的短同種型，具有一個蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(如在WO2010/122135中所述；人MLKL的190-471(SEQ ID NO:1)；Murphy等人，Biochem J，457(3)：369-77,2004)。小鼠MLKL的兩種同種型都含有一個蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(氨基酸179-472(SEQ ID NO:3)，179-464(SEQ ID NO:4))。因此，本發(fā)明涵蓋的化合物結(jié)合人MLKL同種型1(SEQ ID NO:1)，小鼠MLKL同種型1(SEQ ID NO:3)和2(SEQ ID NO:4)及其各種已知的天然變體。在人MLKL的蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在ATP結(jié)合位點(SEQ ID NO:1的氨基酸209-217)，其結(jié)合ATP和其它核苷酸(包括但不限于AMP，ADP和AMPPNP)。在人MLKL中，ATP(和其他核苷酸)結(jié)合不連續(xù)殘基的袋(狀結(jié)構(gòu))，該不連續(xù)殘基的袋(狀結(jié)構(gòu))包括來自N端半段結(jié)構(gòu)(N-lobe)的β3鏈的K230和來自常規(guī)蛋白激酶的“催化”環(huán)的對應(yīng)物的K331(Murphy等人，Biochem J，457(3)：369-77，2014)。MLKL還具有N末端四螺旋束(4HB)結(jié)構(gòu)域(在SEQ ID NO:1、2、3、4的氨基酸1-125內(nèi)；Murphy等人，免疫(Immunity)，39(3)，443-453，2013)。4HB是MLKL中的死亡效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，其具有依賴于4HB的寡聚化以及質(zhì)膜結(jié)合的MLKL的細胞殺傷功能。
設(shè)想本發(fā)明的化合物可以結(jié)合各物種的MLKL并抑制壞死性凋亡。例如，本發(fā)明的化合物可以結(jié)合人MLKL(SEQ ID NO:1、或其變體、或類似物；Murphy等人，The Biochemical Journal，457(3)，369-377，2014)并抑制壞死性凋亡。在另一個實施例中，本發(fā)明的化合物可以結(jié)合小鼠MLKL(SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，或其變體，或類似物；Murphy等人，Immunity，39(3)，443-453，2013)和抑制壞死性凋亡。
如本文所用，術(shù)語“假激酶結(jié)構(gòu)域”，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，是指含有催化惰性或催化缺陷的激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)?！凹偌っ附Y(jié)構(gòu)域”通常被稱為“蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域”，因為這些結(jié)構(gòu)域缺乏已知催化磷?；D(zhuǎn)移的保守殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，盡管預(yù)測假激酶結(jié)構(gòu)域主要作為催化獨立的蛋白相互作用模塊起作用，但幾個假激酶結(jié)構(gòu)域被歸因于意想不到的催化功能。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“假激酶結(jié)構(gòu)域”包括缺乏激酶活性的“假激酶結(jié)構(gòu)域”和具有弱激酶活性的“假激酶結(jié)構(gòu)域”。
如本文所用，術(shù)語“ATP結(jié)合位點”，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，是指促進ATP與靶蛋白附著的蛋白質(zhì)亞基的特定序列。ATP結(jié)合位點是一種蛋白質(zhì)微環(huán)境，其中ATP被捕獲并水解為ADP，從而釋放通過改變蛋白質(zhì)形狀和/或使酶具有催化活性而被蛋白質(zhì)利用的能量。在假激酶結(jié)構(gòu)域中，“ATP結(jié)合位點”通常稱為“假活性位點”。術(shù)語“ATP結(jié)合位點”也可以稱為“核苷酸結(jié)合位點”，因為在該位點的結(jié)合包括除ATP以外的核苷酸的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，術(shù)語“核苷酸”包括任何核苷酸。示例性核苷酸包括但不限于AMP、ADP、ATP、AMPPNP、GTP、CTP和UTP。
如本文所述，抑制壞死性凋亡包括完全和部分抑制壞死性凋亡。在一實施例中，抑制壞死性凋亡是完全抑制。在另一個實施例中，抑制壞死性凋亡是部分抑制。
化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員認為適合這種用途的任何方法來確定。在本發(fā)明的一實施例中，化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合通過一種或多種選自下組的測試來確定，所述測試包括但不限于熱位移測試，表面等離子體共振(SPR)和飽和度轉(zhuǎn)移差異NMR(STD-NMR)。在另一實施例中，化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合通過熱位移測試確定。在另一實施例中，化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合通過SPR確定。在另一實施例中，化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合通過STD-NMR確定。在另一個實施例中，化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合通過熱位移測試和一個或多個另外的測試來確定。在另一個實施例中，另外的測試選自下組，包括但不限于，SPR和STD-NMR。
熱位移測試(也稱為差示掃描熒光法(DSF))是熱變性測試，其測量靶蛋白的熱穩(wěn)定性和配體與蛋白結(jié)合后蛋白熔融溫度的后續(xù)升高。低分子量配體的結(jié)合可以增加蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，并且通過在熒光染料的存在下進行熱變性曲線來測量熱穩(wěn)定性變化。所用的熒光染料通常是非特異性染料(例如SYPRO橙)，并非特異性地結(jié)合到疏水表面，并且水強烈地淬滅熒光染料的熒光。當?shù)鞍踪|(zhì)解折疊時，暴露的疏水性表面結(jié)合染料，導致熒光增加。通過逐漸升高溫度以展開蛋白質(zhì)并測量每個點的熒光，獲得蛋白質(zhì)解折疊轉(zhuǎn)變(熔解溫度，Tm)的穩(wěn)定性曲線及其中點值。僅測量蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)加配體的曲線，并計算ΔTm。正ΔTm值表明配體穩(wěn)定蛋白質(zhì)免于變性，并因此結(jié)合蛋白質(zhì)?；跓晒獾臒嵛灰茰y試可以在結(jié)合樣品溫度控制和染料熒光檢測的儀器上進行，例如容易獲得的實時聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)機器。
表面等離子體共振(SPR)技術(shù)是用于測量結(jié)合到表面的分子和定量在不使用標簽的溶液中表面固定化蛋白和如其他蛋白質(zhì)，肽，核酸，脂質(zhì)或小分子的分析物之間的結(jié)合常數(shù)的公認方法。SPR效應(yīng)依賴于與固定化表面相鄰的溶液的折射率的變化，并且極其敏感。結(jié)合反應(yīng)以共振單位(RU)測量，并與傳感器芯片表面上的分子質(zhì)量成比例，因此與表面上的分子數(shù)量成比例。相互作用的親和力可以從速率常數(shù)的比率(Kd＝kdiss/kass)或通過不同濃度的分析物在平衡時響應(yīng)的線性或非線性擬合來計算。
飽和度轉(zhuǎn)移差異NMR(STD-NMR)可以檢測小分子配體與大分子受體如蛋白質(zhì)的瞬時結(jié)合。在STD-NMR中，通過直接觀察來自配體本身的NMR信號來測量從受體轉(zhuǎn)移到其結(jié)合的配體的磁化。低功率照射應(yīng)用于包含蛋白質(zhì)信號但不包含配體信號的(1)H NMR光譜區(qū)。這種輻射通過自旋擴散過程迅速擴散遍及膜蛋白，并飽和所有蛋白質(zhì)(1)H NMR信號。來自與膜蛋白瞬時結(jié)合的配體的(1)H NMR信號變得飽和，并且在解離時用于降低測量自游離配體池的(1)H NMR信號的強度。用放置在蛋白質(zhì)和配體的光譜區(qū)域外的照射脈沖重復(fù)實驗，該條件不導致對配體的飽和轉(zhuǎn)移。減去所得的兩個譜產(chǎn)生差譜。所得到的差譜僅產(chǎn)生那些經(jīng)歷飽和的共振，即受體的那些和與受體結(jié)合的化合物的那些。因此，STD-NMR可用于測定化合物的結(jié)合表位。競爭STD-NMR方法將STD-NMR與競爭結(jié)合實驗組合，以檢測在NMR時標上經(jīng)歷緩慢化學交換的高親和力配體。使用該技術(shù)，化合物混合物中競爭的高親和力配體的存在可以通過低親和性指示劑配體的STD信號的消失或減少來檢測。因此，該方法可用于基于STD指示劑的信號強度的降低得到化合物的結(jié)合親和力(Kd)。
如本文所述，結(jié)合MLKL蛋白的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的化合物可以是發(fā)揮所述功能從而實現(xiàn)抑制壞死性凋亡的任何化合物。要強調(diào)的是，該化合物不限于任何特定的化學類型、形式、大小、形狀或構(gòu)象。因此，該化合物可以選自合成化合物、有機合成藥物、小分子有機藥物、天然小分子化合物、其它小分子化合物和肽。
這樣的化合物可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知適合的任何方式鑒定。可以通過靶向藥物開發(fā)或通過商業(yè)庫的篩選來鑒定化合物。這種商業(yè)庫的篩選將包括中或高通量篩選。在一實施例中，通過篩選一個或多個商業(yè)庫來鑒定化合物。
化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合可以通過效應(yīng)子激酶抑制MLKL的磷酸化，或者化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合可以不通過效應(yīng)子激酶抑制MLKL的磷酸化。本發(fā)明證明，如本文所述，結(jié)合MLKL蛋白的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的化合物可以抑制壞死性凋亡，而不通過效應(yīng)子激酶抑制MLKL的磷酸化。在一實施例中，化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合不通過效應(yīng)子激酶抑制MLKL的磷酸化。在另一實施例中，化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合通過效應(yīng)子激酶抑制MLKL的磷酸化。
本文所述的化合物可以是任何合適的化學類型、形式、大小、形狀和構(gòu)象。在一實施例中，所述化合物具有高達且包含約的體積。在一實施例中，所述化合物具有高達且包含約的體積。在一實施例中，所述化合物具有高達且包含約的體積。在一實施例中，所述化合物具有高達且包含約的體積。在一實施例中，所述化合物具有高達且包含約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。在另一實施例中，所述化合物具有從約至約的體積。
在本發(fā)明的一實施例中，所述化合物具有下式
其中，R1選自下組：3-MeSO2CH2-、4-MeSO2CH2-、3-H2NSO2-和4-H2NSO2-；和
R2是0-2個取代基，所述取代基獨立地選自下組：OCF3、CF3、氟、氯、溴、碘和COMe，
或其藥學上可接受的衍生物、多晶型物、鹽或前藥。在一實施例中，R1為3-H2NSO2-。在另一實施例中，R1為4-H2NSO2-。
在一實施例中，R2為0個取代基。在另一實施例中，R2為4-OCF3。在另一實施例中，R2為2個取代基，且其中所述2個取代基為3-CF3和6-氟。
在另一實施例中，式III化合物選自化合物1-4的組，
在另一實施例中，式III化合物為化合物1，
在一方面，用于抑制壞死性凋亡的化合物具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)式，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中：
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D為-N(H)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)RR”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、S(O)2R”’或S(O)2NR’R’，其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、–SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1或C(O)R1；和
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，其中
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、烷基、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；和
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基。
另一方面，用于抑制壞死性凋亡的化合物具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)式，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中：
D為-N(H)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)R”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、S(O)2R”’、或S(O)2NR’R’，其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；和
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；和
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基。
另一方面，用于抑制壞死性凋亡的化合物具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)式，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中，
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D為
q為1、2或3；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是O且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；
R5是C1-C6烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R6為由-(X4)z-(X5)定義的基團，
其中，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、CN、-NR7R7、-N(H)C(O)R7、-N(H)C(O)OR R7R7N(H)S(O)2R7、N(H)S(O)2NR7R7、-OC(O)R7、OC(O)NR7R7、-C(O)R7、-C(O)NR7R7、-SR7,-S(O)R7、S(O)2R7R7、或-S(O)2NR7R7；和
R7為氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基氨基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳基或雜芳基。
另一方面，用于抑制壞死性凋亡的化合物具有式(II)所示的結(jié)構(gòu)式，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中：
D為
q為1、2或3；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A，當Q2是A1時Q3是A2；其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是O且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2RS和-C(O)R5；
R5是C1-C6烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R6為由-(X4)z-(X5)定義的基團，其中，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、CN、-NR7R7、-N(H)C(O)R7、-N(H)C(O)OR7、-N(H)C(O)NR7R7、N(H)S(O)2R7、N(H)S(O)2NR7R7、-OC(O)R7、OC(O)NR7R7、-C(O)R7、-O)NR7R7、-SR7、-S(O)R7、-S(O)2R7R7、或-S(O)2NR7R7；和
R7為氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基氨基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳基或雜芳基。
另一方面，用于抑制壞死性凋亡的化合物具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)式，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中：
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D為-N(R8)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，
其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)R”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、-S(O)2R”’、或-S(O)2NR’R’，其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；和
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、烷基、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R8為氫或C1-C3烷基。
另一方面，本發(fā)明提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(I)的化合物，或其鹽、溶劑合物，或生理功能性衍生物：
其中：
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D為-N(H)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)RR”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、S(O)2R”’、或S(O)2NR’R’，其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、–SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1或C(O)R1；和
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、烷基、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；和
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基。
另一方面，本發(fā)明提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(II)的化合物，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中：
D為-N(H)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)R”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、-S(O)2R”’、或-S(O)2NR’R’，其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；和
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；和
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基。
另一方面，本發(fā)明提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(I)的化合物，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中，
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D為
q為1、2或3；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是O且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；
R5是C1-C6烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R6為由-(X4)z-(X5)定義的基團，
其中，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、CN、-NR7R7、-N(H)C(O)R7、-N(H)C(O)OR R7R7N(H)S(O)2R7、N(H)S(O)2NR7R7、-OC(O)R7、OC(O)NR7R7、-C(O)R7、-C(O)NR7R7、-SR7,-S(O)R7、-S(O)2R7R7、或-S(O)2NR7R7；和
R7為氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基氨基。
另一方面，本發(fā)明提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(II)的化合物，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中：
D為
q為1、2或3；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A，當Q2是A1時Q3是A2；其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是O且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2RS和-C(O)R5；
R5是C1-C6烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R6為由-(X4)z-(X5)定義的基團，其中，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、CN、-NR7R7、-N(H)C(O)R7、-N(H)C(O)OR7、-N(H)C(O)NR7R7、N(H)S(O)2R7、N(H)S(O)2NR7R7、-OC(O)R7、OC(O)NR7R7、-C(O)R7、-O)NR7R7、-SR7、-S(O)R7、-S(O)2R7R7、或-S(O)2NR7R7；和
R7為氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷基氨基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基氨基、芳烷基氨基、芳基或雜芳基。
另一方面，本發(fā)明提供了在有需要的受試者中抑制壞死性凋亡的方法，所述方法包括給予治療有效量的式(I)的化合物，或其鹽、溶劑合物、或生理功能性衍生物：
其中：
W是N或C-R，其中R是氫、鹵素或氰基；
J是氫、C1-C4烷基、C1-C4鹵代烷基、芳烷基、氰基烷基、-(CH2)pC＝CH(CH2)tH、-(CH2)pC≡CH(CH2)tH，或C3-C7環(huán)烷基；
p為1、2或3；
t為0或1；
D為-N(R8)(X)；
X是由-(X1)-(X2)q-(X3)定義的基團，
其中，
X1是C(O)或C(S)并且q是1，或
X1是-C(O)或-S(O)2并且q是0，
X2是N(H)或O，以及
X3是烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基，或雜芳基，或
被至少一個由-(X4)z-(X5)定義的基團所取代的烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、芳基、芳烷基或雜芳基，
X4是C(H)2，其中z是0、1、2、3或4，和
X5是氫、C1-C6烷基、C1-C6鹵代烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、烷氧基、鹵代烷氧基、羥基、芳氧基、芳烷氧基、鹵素、-CN、-NR’R’、N(H)C(O)R”、N(H)C(O)OR”、N(H)C(O)NR’R’、N(H)S(O)2R”、OR”、OC(O)R”、C(O)R”、SR”、-S(O)R”’、-S(O)2R”’、或-S(O)2NR’R’，其中，
R’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-SR1、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；
R”是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1、-NR3R4、-S(O)2R1、-S(O)R1、或C(O)R1；和
R”’是氫、烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、-OR1或-NR3R4；
Q1是氫、鹵素、C1-C2鹵代烷基、C1-C2烷基、C1-C2烷氧基或C1-C2鹵代烷氧基；
Q2是A1或A2；
當Q2是A2時Q3是A1，當Q2是A1時Q3是A2；
其中，
A1是氫、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3鹵代烷基，-OR1，和
A2是由-(Z)m-(Z1)-(Z2)定義的基團，
其中，
Z是CH2且m是0、1、2或3，或
Z是NR2且m是0或1，或
Z是氧且m是0或1，或
Z是CH2NR2且m是0或1；
Z1是S(O)2、S(O)或C(O)；和
Z2是C1-C4烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、NR3R4、芳基、芳基氨基、芳烷基、芳烷氧基或雜芳基；
R1是氫、烷基、雜環(huán)基和-NR3R4；
R2、R3和R4各自獨立地選自氫、羥基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、C1-C4烷基、C3-C7環(huán)烷基、雜環(huán)基、-S(O)2R5和-C(O)R5；
R5是C1-C4烷基或C3-C7環(huán)烷基；和
R8為氫或C1-C3烷基。
另一方面，另外提供了新的式(I)、(II)和/或(III)的化合物。
另一方面，提供了式(I)、(II)和/或(III)的化合物在制備用于在受試者中抑制壞死性凋亡的藥物的用途。
另一方面，提供了式(I)、(II)和/或(III)的化合物用于抑制壞死性凋亡的用途。
另一方面，提供了用于抑制壞死性凋亡的式(I)、(II)和/或(III)的化合物。
另一方面，提供了當用于抑制壞死性凋亡時的式(I)、(II)和/或(III)的化合物。
式I、II和III的化合物的鹽優(yōu)選是藥學上可接受的，但是應(yīng)當理解，非藥學上可接受的鹽也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)，因為它們可用作制備藥學上可接受的鹽的中間體。
術(shù)語“藥學上可接受的”可用于描述任何藥學上可接受的鹽、水合物或前藥，或任何其它化合物，其在給予受試者后能夠提供(直接或間接)式I、II和/或III的化合物或其活性代謝物或殘余物。
合適的藥學上可接受的鹽包括但不限于藥學上可接受的無機酸(如鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氫溴酸)的鹽，或藥學上可接受的有機酸(例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、馬來酸、羥基馬來酸、富馬酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水楊酸、磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸、硬脂酸、棕櫚酸、油酸、月桂酸、泛酸、丹寧酸、抗壞血酸和戊酸)的鹽。
堿鹽包括但不限于與藥學上可接受的陽離子形成的鹽，如鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、鈣鹽、鎂鹽、鋅鹽、銨鹽、烷基銨鹽(例如由三乙胺形成的鹽)、烷氧基銨鹽(例如與乙醇胺形成的鹽和由乙二胺形成的鹽)、膽堿鹽或或氨基酸(如精氨酸、賴氨酸或組氨酸)鹽。關(guān)于藥學上可接受的鹽的類型及其形成的一般信息是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且通常如文獻例如“藥用鹽手冊(Handbook of Pharmaceutical salts)”P.H.斯特爾，C.G.韋穆特，第1版，2002，Wiley-VCH中所述。
堿性含氮基團可用諸如低級烷基(如甲基，乙基，丙基和丁基)鹵化物(如氯化物，溴化物和碘化物)，二烷基硫酸鹽(如二甲基硫酸鹽和二乙基硫酸鹽)等的試劑季銨化。
前藥包括化合物，其中氨基酸殘基或兩個或多個(例如兩個，三個或四個)氨基酸殘基的多肽鏈與式I、II和/或III化合物的游離氨基和酰胺基共價連接。所述氨基酸殘基包括通常由三字母符號表示的20種天然存在的氨基酸，并且還包括4-羥基脯氨酸、羥基賴氨酸、鎖鏈賴氨酸(demosine)、異鎖鏈賴氨酸、3-甲基組氨酸、正纈氨酸(norvlin)、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸和甲硫氨酸砜。前藥還包括化合物，其中碳酸酯、氨基甲酸酯、酰胺和烷基酯通過羰基碳前藥側(cè)鏈與式I、II和/或III的上述取代基共價鍵合。前藥可以包括共價不可逆和可逆抑制劑。
在化合物為固體的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本發(fā)明的化合物、試劑和鹽可以以不同的結(jié)晶或多晶型形式存在，所有這些形式都在本發(fā)明的范圍和指定的化學式內(nèi)。
術(shù)語“多晶型物”包括式I、II和/或III的化合物的任何結(jié)晶形式，例如無水形式、含水形式、溶劑合物形式和混合溶劑合物形式。
式(I)、式(II)和/或式(III)旨在適用時涵蓋化合物的溶劑化以及非溶劑化形式。因此，式(I)、式(II)和/或式(III)包括具有所示結(jié)構(gòu)的化合物，包括水合或溶劑化形式，以及非水合和非溶劑化形式。
藥物組合物可以由式(I)、式(II)和/或式(III)化合物配制用于任何合適的給藥途徑，包括例如局部(例如透皮或眼部)，口服，口腔，鼻，陰道，直腸或腸胃外給藥。本文所用的術(shù)語腸胃外包括皮下，皮內(nèi)，血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))，肌內(nèi)，脊髓，顱內(nèi)，鞘內(nèi)，眼內(nèi)，眼周，眶內(nèi)，滑膜內(nèi)和腹膜內(nèi)注射以及任何類似的注射或輸注技術(shù)。在某些實施方案中，優(yōu)選適合于口服使用或腸胃外使用的形式的組合物。合適的口服形式包括例如片劑，糖劑(troche)，錠劑(lozenge)，水性或油性混懸劑，可分散粉劑或顆粒劑，乳劑，硬或軟膠囊劑或糖漿劑或酏劑。對于靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下或腹膜內(nèi)給予，一種或多種化合物可以與無菌水性溶液組合，該溶液優(yōu)選與接受者的血液等滲。這樣的制劑可以通過將固體活性成分溶解在含有生理上相容的物質(zhì)(例如氯化鈉或甘氨酸)并且具有與生理條件相容的緩沖pH的水中以產(chǎn)生水溶液并使所述溶液無菌來制備。制劑可以存在于單位或多劑量容器(例如密封的安瓿或小瓶)中。組分的實例描述于馬西德爾外藥典(Martindale-The Extra Pharmacopoeia)(醫(yī)藥出版社Pharmaceutical Press，倫敦1993)和馬丁(編輯)，雷明頓藥學大全(Remington's Pharmaceutical Sciences)中。
在本說明書的上下文中，術(shù)語“給予”和該術(shù)語的變化包括“給予”和“給藥”包括通過任何適當?shù)姆绞綄⒈景l(fā)明的化合物或組合物接觸、施用、遞送或提供至生物體或表面。
關(guān)于抑制壞死性凋亡，本發(fā)明的生物活性化合物的劑量可以在寬范圍內(nèi)變化，并且可以根據(jù)個體需要進行調(diào)整。本發(fā)明的活性化合物通常以治療有效量給予。優(yōu)選的劑量范圍5為每天每千克體重約0.1mg至約140mg(例如每個患者每天約0.5mg至約7g)。日劑量可以作為單一劑量或多劑量給予。可與載體材料組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將根據(jù)所治療的受試者和具體的給藥方式而變化。劑量單位形式通常含有約1mg至約500mg的活性成分。
然而，應(yīng)當理解，任何特定受試者的具體劑量水平將取決于多種因素，包括所用具體化合物的活性，年齡，體重，一般健康狀況，性別，飲食，給藥時間，給藥途徑和排泄速率，藥物組合(即用于治療受試者的其它藥物)，以及正在進行治療的特定病癥的嚴重程度。如果化合物局部給予而不是全身給予，并且為了預(yù)防而不是治療，則劑量通常較低。這樣的治療可以根據(jù)需要經(jīng)常施用，以及施用一段由治療醫(yī)師判斷的必需時間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，待給予的式(I)化合物的劑量方案或治療有效量可能需要針對每個個體進行優(yōu)化。藥物組合物可以含有約0.1至2000mg，優(yōu)選約0.5至500mg，最優(yōu)選約1至200mg范圍內(nèi)的活性成分。約0.01至100mg/kg體重，優(yōu)選約0.1至約50mg/kg體重的日劑量可能是合適的。日劑量可以每天一至四個劑量給予。
還將理解，可能需要不同的劑量來治療不同的疾病。藥劑的有效量是引起壞死性凋亡的統(tǒng)計學上顯著減少的量。
對于體外分析，可以通過用于測量TSQ-誘導的壞死性凋亡的測試來測定壞死性凋亡的抑制作用，如本文定義的生物學測試中所述。
術(shù)語“治療有效量”或“有效量”是指導致改善或修復(fù)壞死性凋亡癥狀和/或相關(guān)疾病或它們的癥狀的式(I)化合物的量。
如本文所用，術(shù)語“治療的”、“治療”和“療法”是指治愈性治療、預(yù)防性治療(prophylactic therapy)和防止性治療(preventative therapy)。因此，在本公開的上下文中，術(shù)語“治療”包括治愈、改善或緩和壞死性凋亡和/或相關(guān)疾病或它們的癥狀的嚴重性。
“預(yù)防”或“防止”是指如果在給予本發(fā)明的化合物或藥物組合物后有所發(fā)展，則防止壞死性凋亡的發(fā)生或緩和壞死性凋亡的嚴重程度。
“受試者”包括任何人或非人動物。因此，除了可用于人類治療之外，本發(fā)明的化合物還可用于獸醫(yī)治療哺乳動物，包括伴侶動物和農(nóng)場動物，例如但不限于狗、貓、馬、牛、羊、和豬。
術(shù)語“抑制”用于描述導致預(yù)防、減少或其他改善壞死性凋亡的任何形式的抑制，包括完全和部分抑制。
本發(fā)明的方法可以用于預(yù)防或治療受試者的以下疾?。?/p>
·骨、關(guān)節(jié)、結(jié)締組織和軟骨疾病，例如骨質(zhì)疏松，骨髓炎，關(guān)節(jié)炎，包括例如骨關(guān)節(jié)炎，類風濕性關(guān)節(jié)炎和銀屑病關(guān)節(jié)炎，無血管壞死，進行性骨化性纖維發(fā)育不良(fibrodysplasia ossificans)，佝僂病，庫興氏綜合征；
·肌肉疾病，例如肌營養(yǎng)不良，例如杜興氏肌營養(yǎng)不良，肌強直性營養(yǎng)不良，肌病和肌無力；
·皮膚疾病，例如皮炎，濕疹，牛皮癬，衰老或甚至瘢痕形成的改變；
·心血管疾病，如心臟和/或血管缺血，心肌梗死，缺血性心臟病，慢性或急性充血性心力衰竭，心臟失常，心房纖維性顫動，心室纖維性顫動，陣發(fā)性心動過速，充血性心力衰竭，肥厚性心臟病，缺氧(anoxia)，低氧(hypoxia)，由于用抗癌劑的治療的次生效應(yīng)；
·循環(huán)系統(tǒng)疾病，如動脈粥樣硬化(Lin等人，Cell Rep，2013)，動脈硬化和外周血管疾病，腦血管性中風，動脈瘤；
·血液病和血管疾病，例如：貧血，血管淀粉樣變性，出血，鐮狀細胞病，紅細胞碎裂綜合征，中性粒細胞減少，白細胞減少，髓質(zhì)發(fā)育不全，全血細胞減少，血小板減少，血友??；
·肺疾病，包括肺炎，哮喘；肺部阻塞性慢性疾病，例如慢性支氣管炎和肺氣腫；
·胃腸道疾病，如潰瘍；
·肝臟疾病，例如肝炎，特別是病毒來源或具有病原體其它感染因子的肝炎，自身免疫性肝炎，暴發(fā)性肝炎，某些遺傳性代謝性疾病，威爾遜氏病，肝硬化，非酒精性肝脂肪變性，由于毒素和藥物的肝臟疾病，如藥物誘導的肝損傷(Wang等人，Mol Cell，2014)；
·胰腺疾病，例如急性或慢性胰腺炎(He等人，Cell，2009；Zhang等人，Science，2009；Wu等人，Cell Res，2013)；
·代謝疾病，如糖尿病和單純性糖尿病，甲狀腺炎；
·腎臟疾病，例如急性腎臟疾病或腎小球腎炎；
·病毒和細菌感染，如敗血癥；
·化學品，毒素或藥物引起的嚴重中毒；
·與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)相關(guān)的變性疾??；
·與衰老相關(guān)的疾病，如加速衰老綜合征；
·炎性疾病，例如末梢回腸炎(Gunther等，Nature，2011；Welz等，Nature，2011)，包括克羅恩病，類風濕性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，TNF-誘導的全身炎癥綜合征(Duprez等，免疫(Immunity),2011)；
·自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡；
·牙科疾病，例如導致組織降解的疾病，例如牙周炎；
·眼科疾病或癥狀，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變，青光眼，黃斑變性，視網(wǎng)膜變性，色素性視網(wǎng)膜炎，視網(wǎng)膜孔或眼淚(retinal holes or tears)，視網(wǎng)膜脫離(Trichonas等人，PNAS，2010)，視網(wǎng)膜缺血，與創(chuàng)傷相關(guān)的急性視網(wǎng)膜病變，炎性變性，手術(shù)后并發(fā)癥，藥物性視網(wǎng)膜病，白內(nèi)障，視錐細胞變性(Murakami等人，PNAS，2012)；
·聽覺(audition tracts)疾病，例如耳硬化和抗生素引起的耳聾；
·缺血性再灌注損傷(Linkermann等人，Kydney Int，2012；Oerlemans等人，in vivo Bas Res Cardiol，2012)；
·神經(jīng)元丟失(Vitner等人，Nat Med，2014)；
·與線粒體(線粒體病理)相關(guān)的疾病，如弗里德里希共濟失調(diào)，結(jié)構(gòu)性線粒體異常的先天性肌營養(yǎng)不良，某些肌病(MELAS綜合征，MERFF綜合征，皮爾遜綜合征)，MIDD(線粒體糖尿病和耳聾)綜合征，沃爾弗拉姆綜合征(Wolfram's syndrome)，肌張力障礙；和
·癌癥和轉(zhuǎn)移，包括但不限于肺和支氣管癌，包括非小細胞肺癌(NSCLC)，鱗狀肺癌，細支氣管肺泡癌(BAC)，肺腺癌和小細胞肺癌(SCLC)；前列腺癌，包括雄激素依賴性和雄激素非依賴性前列腺癌；乳腺癌，包括轉(zhuǎn)移性乳腺癌；胰腺癌；結(jié)腸和直腸癌；甲狀腺癌；肝和肝內(nèi)膽管癌；肝細胞癌；胃癌；子宮內(nèi)膜癌；黑素瘤；腎、腎盂、膀胱、子宮體和子宮頸的癌癥；卵巢癌，包括進行性上皮或原發(fā)性腹膜癌；多發(fā)性骨髓瘤；食道癌，包括食管的鱗狀細胞癌和腺癌；急性骨髓性白血病(AML)；慢性髓性白血病(CML)，包括加速的CML和CML急變期(CML-BP)；淋巴細胞性白血?。还撬栊园籽?；急性淋巴細胞性白血病(ALL)；慢性淋巴細胞性白血病(CLL)；霍奇金病(HD)；非霍奇金淋巴瘤(NHL)，包括濾泡淋巴瘤和套細胞淋巴瘤；B細胞淋巴瘤，包括彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)；T細胞淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤(MM)；淀粉樣變性；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；骨髓增生異常綜合征(MDS)，包括難治性貧血(RA)，難治性貧血伴環(huán)狀鐵幼粒細胞增多(RARS)，(難治性貧血伴有母細胞增多(RAEB)和在轉(zhuǎn)化中的RAEB(RAEB-T))；和骨髓增生性綜合征；腦癌，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤/膠質(zhì)母細胞瘤，間變性少突膠質(zhì)細胞瘤和成熟間變性星形細胞瘤；神經(jīng)內(nèi)分泌癌，包括轉(zhuǎn)移性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤；頭頸癌，包括例如頭頸部鱗狀細胞癌，和鼻咽癌；口腔癌、咽癌和小腸癌；骨癌；軟組織肉瘤；和絨毛結(jié)腸腺瘤。
所述方法還可用于在移植之前、期間(移除、運輸和/或再植入)或之后保護細胞、組織和/或移植器官。
在一實施例中，本發(fā)明的方法中，所述受試者不患有與過度血管生成相關(guān)的增殖性病癥。在另一實施例中，所述增生性疾病為癌癥。
本發(fā)明也提供了用于鑒定通過與MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點結(jié)合抑制壞死性凋亡的化合物的篩選方法。因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒定抑制壞死性凋亡的化合物的篩選方法，所述方法包括：
a)在允許MLKL和候選化合物相互作用的條件下，將含有MLKL的蛋白質(zhì)溶液與候選化合物接觸；和
b)將存在候選化合物時獲得的解折疊轉(zhuǎn)變溫度(Tm)與不存在候選化合物時獲得的解折疊轉(zhuǎn)變溫度(Tm)進行比較，以確定解折疊轉(zhuǎn)變溫度的變化(ΔTm)；
其中MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域和候選化合物通過候選化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合相互作用；和
其中正ΔTm值表示候選化合物穩(wěn)定蛋白質(zhì)防止其變性并抑制其在壞死性凋亡中的作用。
在一實施例中，所述篩選方法包括包含熒光染料的蛋白質(zhì)溶液。所述熒光染料可以是適于本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的用途的任何染料。在一實施例中，所述熒光染料為SYPRO橙。
所述篩選方法可以在已知的適于本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的這種用途的任何儀器上進行。在一實施例中，所述儀器組合了樣品溫度對照和染料熒光檢測。在另一實施例中，所述儀器是實時聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)機。
另一方面，提供了一種用于鑒定抑制壞死性凋亡的化合物的篩選方法，所述方法包括：
a)在允許MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域和候選化合物相互作用的條件下，將MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域與濃度漸增的候選化合物接觸；和
b)測定結(jié)合親和力(Kd)；
其中MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域和所述候選化合物通過候選化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合相互作用，和
其中與候選化合物的結(jié)合表明候選化合物能夠抑制壞死性凋亡。
所述篩選方法可以以已知的適于本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的這種用途的任何方式進行。此外，所述篩選方法可以在已知的適于本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的這種用途的任何儀器上進行。在一實施例中，所述篩選方法包括SPR并在SPR機上進行。在另一實施例中，所述篩選方法包括使用固定在傳感器芯片上的MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域。在另一實施例中，所述固定的MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域為雙His標記的。在另一實施例中，所述篩選方法包括SPR并在SPR機器上進行，并涉及使用固定在傳感器芯片上的MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域。
在本發(fā)明中，術(shù)語“在允許MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域和候選化合物相互作用的條件下”包括這樣的相互作用是可能的所有條件。這樣的條件將是已知的或由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
另一方面，提供了一種用于鑒定抑制壞死性凋亡的化合物的篩選方法，所述方法包括：
a)將含有MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)溶液與核苷酸和候選化合物接觸，并進行STD-NMR；和
b)將候選化合物存在時獲得的STD-NMR譜圖和不存在候選化合物時獲得的STD-NMR譜圖進行比較；
其中MLKL和候選化合物通過候選化合物與MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點的結(jié)合相互作用；和
其中STD-NMR譜圖中信號強度的消失或減少表明候選化合物能夠抑制壞死性凋亡。
所述篩選方法可以以已知的適于本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的這種用途的任何方式進行。
在一實施例中，所述篩選方法包括采用選自下組的核苷酸：AMP、AMPPNP、ADP和ATP。在另一實施例中，所述篩選方法包括采用選自下組的核苷酸：ATP和ADP。在另一實施例中，所述核苷酸為ATP。在另一實施例中，所述核苷酸為ADP。
在本發(fā)明中，術(shù)語“蛋白質(zhì)溶液”包括含有MLKL蛋白或其部分的任何溶液，以合適的方式以進行篩選方法。合適的“蛋白質(zhì)溶液”是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或容易確定的。在一實施例中，所述“蛋白質(zhì)溶液”可以包括另外的組分。另外的組分包括所采用的篩選方法所需的任何組分。
本發(fā)明的篩選方法可以用來自任何物種的MLKL進行。在一實施例中，MLKL是如上文所定義的小鼠MLKL。在另一實施例中，MLKL為上文定義的人MLKL。
本發(fā)明的篩選方法還可以包括細胞死亡測試以確定候選化合物抑制細胞中壞死性凋亡的能力。所述細胞死亡測試可以在細胞或組織培養(yǎng)物上進行。在該篩選方法中使用的細胞可以是能夠表達MLKL的任何細胞，而不管天然基因和重組基因之間的差異。此外，MLKL的衍生沒有特別限制。此外，也可以使用含有包含編碼MLKL的核酸序列的表達載體的轉(zhuǎn)化細胞。
所述細胞可以是人細胞的或非人細胞。在一實施例中，所述細胞為人細胞。在另一實施例中，所述細胞為非人細胞。在另一實施例中，所述細胞為非人哺乳動物細胞。
合適的人細胞的實例包括癌癥和非癌細胞。在一實施例中，人細胞是非癌細胞系。在另一實施例中，人細胞是癌細胞系。在一實施例中，人細胞是白血病細胞系。白血病細胞系可以選自但不限于包括急性骨髓性白血病(AML)、骨髓單核細胞性白血病和T細胞白血病的組。白血病細胞系可以選自但不限于包含Jurkat T細胞、Jurkat細胞的FADD缺陷型變體、Mv4；11細胞、OCI-AML-3細胞和U937細胞的組。在一實施例中，人細胞是U937細胞。在另一實施例中，人細胞是人結(jié)腸腺癌細胞系。在一實施例中，人結(jié)腸腺癌細胞系是HT29。
合適的非人哺乳動物細胞包括但不限于來自嚙齒動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠)，兔，馬類動物(例如馬)，犬類動物(例如狗)，貓科動物(例如貓)，?？苿游?例如牛)，綿羊類動物(例如綿羊和山羊)，靈長類動物(例如猴)，禽類動物(例如雞)等的細胞。非人哺乳動物細胞和禽類細胞的實例包括諸如CHO細胞、NIH3T3細胞、COS細胞、DT40細胞、BHK細胞、MDCK細胞、CRFK細胞、CV-1細胞、LMTK細胞和Vero細胞的培養(yǎng)細胞；原代培養(yǎng)細胞；造血干細胞；造血細胞和血細胞(如B細胞、T細胞、胸腺細胞、白細胞、單核細胞和巨噬細胞，紅細胞和血小板)；受精卵母細胞；和ES細胞。此外，也可以使用其它細胞，例如各種組織細胞、腎細胞、成纖維細胞和骨髓瘤細胞。在一實施例中，細胞是嚙齒動物細胞。在另一實施例中，細胞是小鼠細胞。在另一實施例中，細胞是小鼠真皮成纖維細胞(MDF)。
因此，本發(fā)明一實施例中提供了如本文所述的篩選方法，其還包括測試所述候選化合物拯救因壞死性凋亡的細胞死亡的能力。在一實施例中，所述測試在體外基于細胞的測試中進行。在另一實施例中，細胞是小鼠真皮成纖維細胞(MDF)。
所述細胞死亡測試可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的任何已知適合的方式進行。在一實施例中，所述細胞死亡測試包括使用流式細胞術(shù)在缺乏或存在壞死性刺激物時測定碘化丙啶(PI)攝取。
在本發(fā)明的細胞死亡測試中，可以以已知的本領(lǐng)域技術(shù)人員確定合適的任何方式在細胞中誘導壞死性凋亡。在一實施例中，由選自以下任一種或多種的因子刺激壞死性凋亡：TNF(T)；Smac模擬物(S)；和泛胱天蛋白酶抑制劑Q-VD-OPh(Q)。在另一實施例中，所述細胞死亡測試包括TNF(T)，Smac模擬物(S)和泛胱天蛋白酶抑制劑Q-VD-OPh(Q)的壞死刺激物，這種壞死性凋亡刺激物的組合被稱為“TSQ”。
通過以下說明性和非限制性實施例描述本發(fā)明所述的方法和化合物。
實施例
1.1材料與方法
化合物
在商業(yè)庫篩選中鑒定化合物1。
所有涉及的溫度單位為℃。
如下化合物的名稱獲自ChemDraw Ultra 12.0。
縮寫
AcOH 醋酸
(Boc)2O 二-叔-丁基二碳酸酯
CDCl3 氘代氯仿
CDI 1,1’-羰基二咪唑
Cs2CO3 碳酸銫
DMSO-d6 氘代二甲基亞砜
DCC 二環(huán)己基碳二亞胺
DCM 二氯甲烷
DIPEA 二異丙基乙胺
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亞砜
TEA 三乙胺
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
hr 小時
HATU 1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸鹽
HCl 鹽酸/氯化氫
HPLC 高效液相色譜
K2CO3 碳酸鉀
LCMS 液相色譜-質(zhì)譜
M 摩爾(濃度)
MeOH 甲醇
min 分鐘
M/Z 質(zhì)/荷比(質(zhì)譜)
Na2CO3 碳酸鈉
NaH 氫化鈉
NaHCO3 碳酸氫鈉
NaOH 氫氧化鈉
Na2SO4 硫酸鈉
NH4Cl 氯化銨
NMP N-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振
Pd/C 活性炭上的鈀
Rt 保留時間
rt 室溫
SOCl2 氯化亞砜
TFA 三氟醋酸
THF 四氫呋喃
TsOH 對甲基苯磺酰氯
LCMS方法
使用以下方法進行電噴霧質(zhì)譜(MS)：
方法A(10分鐘方法)：使用反相高效液相色譜(HPLC)分析的菲尼根(Finnigan)LCQ Advantage Max(柱：Gemini 3μC18 20×4.0mm 110A)；溶劑A：水，0.1％甲酸；溶劑B：乙腈，0.1％甲酸；梯度：10-100％B，歷時10分鐘；檢測：100-600nm，使用電噴霧電離(ESI)正模式，源溫度：300℃。
方法B(5分鐘方法)：LC型號：安捷倫(Agilent)1200(泵型：二元泵，檢測器類型：DAD)，MS型號：安捷倫G6110A四極桿。柱：Xbridge-C18，2.5μm，2.1×30mm。柱溫：30℃。波長的獲得：214nm，254nm。流動相：A：0.07％HCOOH水溶液，B：MeOH。運行時間：5分鐘。MS：離子源：ES+(或ES-)。MS范圍：碰撞誘導解離(電壓)：60。干燥氣體流量：10L/min。霧化器壓力：35psi。干燥氣體溫度：350℃。毛細管電壓：3.5kV。
制備型質(zhì)量-導向LC
方法A：
儀器：
沃特斯(Waters)ZQ 3100質(zhì)量檢測器(Mass Detector)，沃特斯2545-泵；沃特斯SFO系統(tǒng)應(yīng)用流體組織器(System Fluidics Organizer)，沃特斯2996二極管陣列檢測器，沃特斯2767樣品管理器(Sample Manager)
LC條件：
反相HPLC分析
柱：XBridge TM C18 5μm 19x50mm。注射體積：500μL
溶劑A:水，0.1％甲酸。溶劑B：MeCN，0.1％甲酸
梯度：5％B，歷時4min，然后5-100％B歷時8min，然后100％B歷時4min
流速：19mL/min。檢測：100-600nm
MS條件：
離子源：單四極桿。離子模式：ES正極。源溫：150℃
去溶劑溫度：350℃。檢測：離子計數(shù)。毛細管(KV)-3.00。錐孔(V):30
提取器(V):3RF鏡頭(V):0.1掃描范圍：100-1000Amu掃描時間：0.5秒
獲取時間：10min
氣流：
去溶劑化L/小時-650
錐孔L/小時-100
制備型HPLC
儀器類型：
瓦里安(VARIAN)940LC。泵類型:二元泵。檢測器類型:PDA
LC條件：
柱：沃特斯SunFire prep C18OBD,5μm,19×100mm。波長獲得：214nm,254nm。流動相：A:0.07％TFA水溶液，B:MeOH,0.07％TFA。
NMR
除非另有說明，否則核磁共振(1H NMR,600MHz或400MHz)譜圖在300K以CDCl3作為溶劑獲得?；瘜W位移在δ標度上以ppm報道并參考合適的溶劑峰。
中間體A的合成
步驟1：N-甲基-4-硝基苯胺
向1-氟-4-硝基苯(50.0g,354mmol)的DMSO(200mL)溶液中加入甲胺鹽酸鹽(47.1g,709mmol)和碳酸鉀(98.0g,709mmol)。所得混合物在氮氣氣氛中在70℃下攪拌過夜。TLC分析顯示反應(yīng)完成?；旌衔锏谷胨械玫匠恋?，將沉淀過濾，然后用另外的水洗滌和干燥得到為黃色固體的所需產(chǎn)物(50g,93％)。LCMS(方法B):1.63min[MH]+＝153.1,[MNa]+＝175.1。
步驟2：2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺
向N-甲基-4-硝基苯胺(30.0g,197mmol)的DMF(150mL)溶液中加入2,4-二氯嘧啶(29.4g,197mmol)和碳酸鉀(40.88g,296mmol)。所得混合物在80℃下攪拌過夜。混合物用乙酸乙酯(300mL)和水(200mL)稀釋，合并的有機相用水、鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮得到殘留物，殘留物用硅膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯,10:1至3:1)得到為黃色固體的所需產(chǎn)物(20g,38％)。LCMS(方法B):2.34min[MH]+＝265.0,267.0,[MNa]+＝287.0,289.0。
步驟3：3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
向2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1.0g,3.8mmol)的1.4-二氧六環(huán)(10mL)溶液中加入3-氨基苯磺酰胺(651mg,3.8mmol)和濃HCl(0.5mL)。所得混合物在微波條件下在160℃下攪拌2小時。LCMS和TLC分析顯示反應(yīng)完成。減壓除去溶劑得到殘留物。殘留物溶解于NaOH水溶液(4M)和DCM。有機層用水、鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮得到殘留物，殘留物用硅膠柱層析純化(DCM/MeOH,30:1至10:1)得到為黃色固體的所需產(chǎn)物(1g,67％)。LCMS(方法B):0.96min[MH]+＝401.1。
步驟4：(中間體A)3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
向3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(800mg,2.0mmol)的EtOH(20mL)溶液中加入鋅(1.3g,20mmol)和NH4Cl(水性，30ml)。反應(yīng)混合物在90℃下攪拌2小時。LCMS和TLC分析顯示反應(yīng)完成。過濾混合物，濾液真空濃縮除去EtOH，然后過濾混合物得到為白色固體的所需產(chǎn)物(320mg,43％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 3.34(s,3H)5.22(s,2H)5.68(d,J＝6.0Hz,1H)6.65(d,J＝8.4Hz,2H)6.95(d,J＝8.4Hz,2H)7.23(s,2H)7.41(m,2H)7.81(m,2H)8.57(s,1H)8.42(s,1H)。LCMS(方法B):0.37min[MH]+＝370.1
中間體B的合成
步驟1：(中間體B)3-(4-(甲基(4-(3-苯基脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯磺酰胺
在(圓)底燒瓶中，將3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(中間體A(1.5g,4.1mmol)溶于THF(20mL)。然后加入吡啶(320mg,12.2mmol)。將氯甲酸苯酯(698mg,4.5mmol)緩慢加入混合物中。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。除去溶劑。粗品用水(2x 50mL)、乙醚(2x 50mL)洗滌，并干燥得到為黃色固體的苯基(4-(甲基(2-((3-氨基磺酰基苯基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)氨基甲酸酯(1.5g,76％)。1H NMR(400MHz,MeOD-d4):δppm 3.54(s,3H),5.87(d,J＝6.4Hz,1H),7.28(m,5H),7.45(m,5H),7.68(m,4H),7.82(d,J＝6.4Hz,1H),8.62(br s,1H)。LCMS(方法B):2.17[M+H]+＝491.2。
中間體C的合成
步驟1：N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-甲基苯-1,4-二胺
2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(來自中間體A制備的步驟2,100mg,0.38mmol)溶于甲醇(10mL)和水性NH4Cl(10mL)。加入鋅(粉末,245mg,3.0mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜?；旌衔餃p壓濃縮。殘留物用EtOAc萃取(3x 20mL)。合并的有機層用鹽水(20mL)洗滌、用Na2SO4干燥。減壓除去溶劑得到為黃色固體的N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-甲基苯-1,4-二胺(80mg,90％)，直接用于下一步驟。LCMS(方法B):1.10[M+H]+＝235.1
步驟2：(中間體C)1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
在(圓)底燒瓶中，N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-甲基苯-1,4-二胺(776mg,3.31mmol)溶于DCM(4mL)。向混合物中加入1-異氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(672mg,3.31mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌過夜。過濾白色固體并用DCM(20mL)洗滌，并干燥得到為白色固體的1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(1.06g,73％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 3.40(s,3H)6.27(d,J＝6.0Hz,1H)7.31(m,4H)7.60(m,4H)7.98(d,J＝6.0Hz,1H)8.90(s,1H)8.93(s,1H)。LCMS(方法B):3.09[M+H]+＝438.2。
合成脲的通用方法A：
在N2下，向中間體A(1mmol)在干燥的DMF(0.2mL)中的溶液中滴加異氰酸酯(1mmol)。反應(yīng)混合物室溫下攪拌16小時，減壓濃縮，殘留物用制備型質(zhì)量導向的LC純化得到相應(yīng)的化合物。
合成脲的通用方法B：
在N2下，向中間體B(1mmol)在干燥的THF中的溶液中加入芳胺(2mmol)，隨后加入DIEA(2mmol)。反應(yīng)混合物60℃加熱16小時，減壓濃縮，殘留物通過制備型HPLC純化得到相應(yīng)的化合物。
向2-氯嘧啶中添加苯胺的通用方法C：
向苯胺(1mmol)和中間體C(1mmol)在2-丙醇(10mL)的溶液中加入濃HCl的溶液(2滴)。反應(yīng)混合物80℃加熱16小時。除去溶劑，粗產(chǎn)品通過柱層析純化得到相應(yīng)的化合物。
化合物1
3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
按照通用方法A采用中間體A(100mg,0.27mmol)和(4-三氟甲氧基苯基)異氰酸酯(55mg,0.27mmol),得到3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(17mg,12％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm3.50(s,3H),5.96(br s,1H),7.21(m,1H),7.32(m,3H),7.40(s,2H),7.63(m,7H),7.90(d,J＝7.20Hz,1H),8.37(br s,1H),9.33(m,2H),10.66(br s,1H)。LCMS(方法B):2.42min[MH]+＝574.1。
化合物2
3-(3-(甲基(4-(3-苯基脲基)苯基)胺基)苯基胺基)苯-磺酰胺。
按照通用方法A采用中間體A(50mg,0.135mmol)和苯基異氰酸酯，得到3-(3-(甲基(4-(3-苯基脲基)苯基)胺基)苯基胺基)苯磺酰胺(2.5mg,2％)為白色固體。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm 3.51(s,3H),5.92(s,1H),7.02(m,1H),7.23(d,J＝8.7Hz,2H),7.25-7.30(m,2H),7.41-7.44(m,3H),7.52(m,1H),7.56(d,J＝8.7Hz,2H),7.67(d,J＝8.5Hz,1H),7.96(s,1H),8.58(s,1H)。LCMS(方法A):4.10min[MH]+＝490.4。
化合物3
3-(3-((4-(3-(2-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)胺基)苯基胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法A采用中間體A(50mg,0.135mmol)和2-氟-5-三氟甲基苯基異氰酸酯(10.9mg,0.135mmol)，得到3-(3-((4-(3-(2-氟-5-(三氟甲基)苯基)脲基)苯基)(甲基)胺基)苯基胺基)苯磺酰胺(9mg,7％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm3.52(s,3H),5.88(m,1H),7.26(d,J＝9.0Hz,2H),7.33(d,J＝9.0Hz,1H),7.42(m,1H),7.51(m,1H),7.60(d,J＝9.0Hz,1H),7.68(m,1H),7.76(br d,J＝7.8Hz,1H),8.17(m,1H),8.57(s,1H),8.60(m,1H)。LCMS(方法A):4.60min[MH]+＝576.3。
化合物4
步驟1：N-(4-硝基苯基)乙酰胺。
0℃下，向4-硝基苯胺(5.0g,36.2mmol)在EtOAc(70mL)的溶液中滴加乙酸酐(3.77mL,39.8mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16小時并減壓濃縮得到標題化合物，為白色固體(6.36g,97％)。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm 2.15(s,3H),7.80(d,2H),8.19(d,2H)。
步驟2：N-(4-氨基苯基)乙酰胺。
硼氫化鈉(2.87g,75.9mmol)溶于甲醇/H2O(180mL/90mL)混合物，并冷至0℃。在N2氣流下，小量添加Pd/C(0.443mg,10mol％)，然后添加MeOH(3mL)中的N-(4-硝基苯基)乙酰胺(4.55g,25.3mmol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌72小時，通過硅藻土過濾并用MeOH沖洗3次.合并的濾液真空濃縮并在EtOAc/H2O之間分層。分離有機層，水層用EtOAc萃取兩次。合并的有機層用鹽水洗滌，用MgSO4干燥并減壓濃縮得到標題化合物(4.39g,80％)，為淡黃色固體。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δppm 1.95(s,3H),4.80(br s,2H),6.48(d,2H),7.18(d,2H),9.46(s,1H)。LCMS(方法A):0.82min[MH]+＝151.3。
步驟3：N-(4-(2-氯嘧啶-4-基胺基)苯基)乙酰胺
將N-(4-氨基苯基)乙酰胺(3.91g,26.0mmol)溶于EtOH/THF(345mL/115mL)混合物中和溶液在冰浴中冷卻至0℃。分批添加2,4-二氯嘧啶(4.65g,31.2mmol)，然后添加NaHCO3(4.37g,52.0mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌16小時,并減壓濃縮.加入EtOAc，分離有機層，水層用EtOAc萃取兩次。合并的有機層用鹽水洗滌，用MgSO4干燥，并真空濃縮得到標題化合物(6.83g)，為粗固體。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δppm2.01(s,3H),6.66(d,J＝8.7Hz,1H),7.42-7.54(m,4H),8.08(d,J＝9.0Hz 1H),9.92(s,2H)。LCMS(方法A):4.88min[MH]+＝263.2。
步驟4：N-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酰胺
在N2下，將N-(4-(2-氯嘧啶-4-基胺基)苯基)乙酰胺(6.83g,26.0mmol)溶于DMF(150mL)并加入K2CO3(5.39g,39.0mmol)，然后滴加MeI(1.78mL,28.6mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌72小時并在EtOAc和水(350mL/350mL)之間分層。有機層用鹽水洗滌，用MgSO4干燥，并真空濃縮。殘留物用快速柱層析純化(洗脫:DCM/MeOH 98/2)得到標題化合物(2.49g,34％兩步)，為淡黃色固體。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δppm2.03(s,3H)3.32(s,3H)6.21(m,1H)7.24(d,2H)7.66(d,2H)7.93(m,1H)10.08(s,1H)。LCMS(酸性，10min):4.70min[MH]+＝413.3
步驟5：N-(4-(甲基(2-(4-氨基磺酰基苯基胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)乙酰胺。
將N-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酰胺(1.34g,4.84mmol)和對氨基苯磺酰胺(sulfanilamide,0.84g,4.84mmol)溶于i-PrOH(45mL)。滴加濃HCl(10滴)至攪拌的溶液中。反應(yīng)混合物在80℃下攪拌40小時并冷至室溫。過濾收集形成的灰白色沉淀，用EtOAc洗滌并真空干燥得到標題化合物(1.54g,77％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δppm 2.06(s,3H),3.48(s,3H),6.65(s,1H),7.27-7.35(m,6H),7.46(m,2H),7.73(d,J＝8.7Hz,2H),10.26(br s,1H)。LCMS(方法A):2.97min[MH]+＝413.3。
步驟6：4-(4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯-磺酰胺
將N-(4-(甲基(2-(4-氨基磺酰基苯基胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)乙酰胺(1.54g,3.73mmol)溶于MeOH(40mL)。滴加乙酰氯(2.65mL,37.3mmol)，反應(yīng)混合物室溫攪拌48小時并真空濃縮得到標題化合物(1.40g,100％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δppm 3.48(s,3H),6.72(d,J＝8.7Hz,2H),7.32(m,2H),7.39(m,2H),7.77(m,2H)。LCMS(方法A):0.72min[MH]+＝371.2。
步驟7:4-(4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法A采用4-(4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯磺酰胺(100mg,0.27mmol)和(4-三氟甲氧基苯基)異氰酸酯(0.27mmol),得到標題化合物(18mg,14％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm 3.47(s,3H),5.96(br d,J＝5.4Hz,1H),7.20(d,J＝9.0Hz,1H),7.24(d,J＝9.0Hz,1H),7.53(d,J＝9.0Hz,2H),7.57(d,J＝9.0Hz,2H),7.73-7.77(m,4H),7.84(m,1H)。LCMS(方法A):4.64min[MH]+＝574.4。
化合物5
步驟1：N-(4-(甲基(2-(2-氨基磺?；交坊?嘧啶-4-基)胺基)苯基)-乙酰胺
將N-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酰胺(1.15g,4.16mmol)和2-氨基苯磺酰胺(716mg,4.16mmol)溶于i-PrOH(40mL)。滴加濃HCl(10滴)至攪拌的溶液中。反應(yīng)混合物80℃下攪拌16小時并冷至室溫。過濾收集形成的淡粉色沉淀，用EtOAc洗滌并真空干燥得到標題化合物(1.48g,86％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δppm 2.05(s,3H),3.35(s,3H),7.28(d,J＝8.7Hz,2H),7.30-7.45(m,3H),7.50-7.65(m,2H),7.70(d,J＝8.7Hz,2H),7.92(m,1H),10.28(br s,1H)。LCMS(方法A):3.80min[MH]+＝413.4。
步驟2：2-(4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯-磺酰胺
將N-(4-(甲基(2-(2-氨基磺?；交坊?嘧啶-4-基)胺基)苯基)乙酰胺(1.47g,3.56mmol)溶于MeOH(40mL)。滴加乙酰氯(5.07mL,71.3mmol)，反應(yīng)混合物室溫攪拌48小時并真空濃縮得到標題化合物(1.21g,92％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm 3.51(s,3H),6.00(br s,1H),7.48-8.06(m,14H)。LCMS(方法A):1.08min[MH]+＝371.1。
步驟3：2-(4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法A采用2-(4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯磺酰胺(100mg,0.27mmol)和(4-三氟甲氧基苯基)異氰酸酯(0.27mmol)，得到標題化合物(28mg,21％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm 3.46(s,3H),6.01(br s,1H),6.77(d,J＝9.0Hz,1H),7.00(d,J＝9.0Hz,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,2H),7.25(d,J＝9.0Hz,2H),7.27(m,1H),7.53(d,J＝9.0Hz,2H),7.59(d,J＝8.4Hz,2H),7.79(m,1H),7.92-7.97(m,2H)。LCMS(方法A):4.71min[MH]+＝574.4。
化合物6
3-(3-((4-(3-(2-氟-5-甲基苯基)脲基)苯基)(甲基)胺基)苯基胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法A采用中間體A(100mg,0.27mmol)和2-氟-5-甲基苯基異氰酸酯(41mg,0.27mmol)，得到3-(3-((4-(3-(2-氟-5-甲基苯基)脲基)苯基)(甲基)胺基)苯基胺基)苯磺酰胺(9.8mg,7％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm 3.52(s,3H),5.88(d,J＝5.4Hz,1H),6.82(m,1H),6.99(m,1H),7.24(d,J＝9.0Hz,2H),7.42(m,1H),7.52(d,J＝7.8Hz,1H),7.60(d,J＝9.0Hz,2H),7.66(d,J＝10.2Hz,1H),7.76(d,J＝7.8Hz,1H),7.90(8.17(m,1H),8.17(s,1H),8.57(br s,1H)。LCMS(方法A):4.37min[MH]+＝522.2。
化合物7
2-(4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法A采用2-(4-((4-氨基苯基)(甲基)-胺基)嘧啶-2-基胺基)苯磺酰胺(100mg,0.27mmol)和苯基異氰酸酯(32mg,0.27mmol)，得到標題化合物(3.5mg,3％)，為白色固體。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm 3.46(s,3H),6.01(br s,1H),6.77(d,J＝9.0Hz,1H),7.00(d,J＝9.0Hz,1H),7.20(d,J＝8.4Hz,2H),7.25(d,J＝9.0Hz,2H),7.27(m,1H),7.53(d,J＝9.0Hz,2H),7.59(d,J＝8.4Hz,2H),7.79(m,1H),7.92-7.97(m,2H)。LCMS(酸性，10min):4.71min[MH]+＝574.4。
化合物8
步驟1：3-(4-(N-甲基-N-(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯甲酰胺
將2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(來自中間體A的制備的步驟2,200mg,0.77mmol)和3-氨基苯甲酰胺(110mg,0.80mmol)溶于t-BuOH(5mL)，添加濃HCl(2滴)。反應(yīng)混合物于160℃加熱2小時。除去溶劑，粗品用石油醚:乙酸乙酯(2:1)沖洗從而得到3-(4-(N-甲基-N-(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯甲酰胺(180mg,64％)，為黃色固體，不純化直接用于下一步驟。LCMS(方法B):0.67min[MH]+＝365.2。
步驟2：3-(4-(N-甲基-N-(4-酰胺苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯甲酰胺
將3-(4-(N-甲基-N-(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯甲酰胺(180mg,0.5mmol)溶于乙醇(20mL)并將10％濕Pd/C(20mg)添加至溶液中。反應(yīng)混合物在氫氣氛中攪拌過夜。過濾除去催化劑并減壓除去溶劑得到3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯甲酰胺(150mg,88％)，為黃色固體，不純化直接用于下一步驟。LCMS(方法B):0.36min[MH]+＝335.1。
步驟3：3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯甲酰胺
向3-(4-(N-甲基-N-(4-酰胺苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯甲酰胺(150mg,0.45mmol)的THF(20mL)的溶液中加入1-異氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(95mg,0.47mmol)和DIEA(116mg,0.9mmol)。反應(yīng)室溫攪拌過夜?；旌衔镎婵諠饪s，粗品用洗脫劑(DCM:甲醇,100至100:2)柱層析純化得到3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯甲酰胺(152mg,63％)，為黃色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 3.43(s,3H),5.79(d,J＝6.0Hz,1H),7.38(m,7H),7.59(m,4H),7.88(m,3H),8.33(s,1H),8.99(m,2H),9.28(s,1H),9.47(s,1H)。LCMS(方法B):2.47min[MH]+＝538.3。
化合物9
步驟1：N-甲基-3-硝基苯磺酰胺
向3-硝基苯-1-磺酰氯(1.0g,4.52mmol)的THF(15mL)的溶液中加入甲胺鹽酸鹽(366mg,5.42mmol)和N,N-二異丙基乙胺(1.75g,13.6mmol)?；旌衔锸覝財嚢柽^夜。將反應(yīng)混合物倒入水(20mL)中。過濾收集形成的沉淀。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥固體得到N-甲基-3-硝基苯磺酰胺(800mg,82％)，為白色固體。LCMS(方法B):0.75min[MH]+＝217.1。
步驟2：3-氨基-N-甲基苯磺酰胺
向N-甲基-3-硝基苯磺酰胺(800mg,3.70mmol)的甲醇(20mL)的溶液中加入鈀碳(10％,80mg)?；旌衔镌跉錃鈿夥罩惺覝財嚢柽^夜。過濾反應(yīng)混合物除去固體并減壓濃縮濾液至干得到3-氨基-N-甲基苯磺酰胺(630mg,92％)，為淡棕色固體。LCMS(方法B):0.33min[MH]+＝187.2。
步驟3：N-甲基-3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
向3-氨基-N-甲基苯磺酰胺(180mg,0.97mmol)的叔丁醇(5mL)的溶液中加入2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(來自化合物1的制備的步驟2,244mg,0.92mmol)和濃縮HCl水溶液(2滴)。于160℃攪拌所得混合物5小時。TLC和LCMS分析顯示反應(yīng)完成。混合物冷至室溫。過濾收集固體并減壓干燥得到N-甲基-3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(300mg,79％)，為淡黃色固體。LCMS(方法B):2.15min[MH]+＝415.1。
步驟4：N-甲基-3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)-苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
向N-甲基-3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(300mg,0.72mmol)的甲醇(25mL)的溶液中加入鋅粉(1.0g)和飽和氯化銨水溶液(25mL)。所得混合物室溫攪拌過夜。過濾固體并減壓除去溶劑得到殘留物，將殘留物在水和乙酸乙酯之間分層。分離有機相并用水、鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮至干得到3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-N-甲基苯-磺酰胺(250mg,90％)，為深棕色固體。LCMS(方法B):1.27min[MH]+＝385.2。
步驟5：N-甲基-3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)-苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
N-甲基-3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)-嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。向3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-N-甲基苯磺酰胺(250mg,0.65mmol)的四氫呋喃(25mL)的溶液中加入4-(三氟甲氧基)苯基異氰酸酯(158mg,0.78mmol)和N,N-二異丙基乙胺(168mg,1.30mmol)?；旌衔锸覝財嚢柽^夜。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干得到殘留物，該殘留物用硅膠層析純化(二氯甲烷/甲醇,30:1)得到N-甲基-3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(210mg,55％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 2.45(d,J＝5.0Hz,3H),3.50(s,3H),5.95(br s,1H),7.32(t,J＝8.5Hz,4H),7.49-7.45(m,2H),7.68-7.54(m,5H),7.77(dd,J＝8.0and 1.2Hz,1H),7.89(d,J＝6.8Hz,1H),8.39(s,1H),9.19(s,2H),10.49(s,1H)。LCMS(方法B):2.57min[MH]+＝588.2。
化合物10
步驟1：N,N-二甲基-3-硝基苯磺酰胺
在(圓)底燒瓶中，將Me2NH2.HCl(442mg,5.42mmol)和DIEA(1.75g,13.6mmol)加入THF(15mL)并溶液冷卻至0℃。緩慢加入3-硝基苯-1-磺酰氯(1g,4.52mmol)并室溫攪拌反應(yīng)混合物?；旌衔锏谷胨?50mL)，用EtOAc(3x 30mL)萃取。合并的有機層用水(3x 30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。減壓除去溶劑得到N,N-二甲基-3-硝基苯磺酰胺(850mg,83％)，為黃色固體，直接用于下一步驟。LCMS(方法B):1.31[M+H]+＝231.1
步驟2：3-氨基-N,N-二甲基苯磺酰胺
將N,N-二甲基-3-硝基苯磺酰胺(850mg,3.7mmol)溶于甲醇(20mL)。將濕Pd/C(85mg)加至混合物中。反應(yīng)混合物在氫氣氣氛中攪拌過夜。過濾除去催化劑并減壓除去溶劑得到3-氨基-N,N-二甲基苯磺酰胺(600mg,80％)，為白色固體。LCMS(方法B):0.48[M+H]+＝201.1
步驟3：N,N-二甲基-3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
將2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(來自化合物1的制備的步驟2,200mg,0.77mmol)和3-氨基-N,N-二甲基苯磺酰胺(158mg,0.79mmol)溶于t-BuOH(5mL)，然后加入濃HCl(2滴)。反應(yīng)混合物160℃加熱2小時。除去溶劑，粗品用石油醚/乙酸乙酯，1:1重結(jié)晶純化，得到所需化合物(220mg,68％)，為黃色固體。LCMS(方法B):2.16min[MH]+＝429.2。
步驟4：3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-N,N-二甲基苯磺酰胺
將N,N-二甲基-3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(220mg,0.51mmol)溶于乙醇(30mL)，然后添加濕Pd/C(10％,22mg)。反應(yīng)混合物在氫氣氣氛中攪拌過夜。過濾除去催化劑，濾液減壓濃縮得到3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-N,N-二甲基苯磺酰胺(150mg,75％)，為黃色固體，直接用于下一步驟。LCMS(方法B):1.87min[MH]+＝399.2。
步驟5：N,N-二甲基-3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)-苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
N,N-二甲基-3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)-胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。向3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-N,N-二甲基苯磺酰胺(150mg,0.38mmol)的THF(20mL)的溶液中加入1-異氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(80mg,0.4mmol)和DIEA(98mg,0.76mmol)。反應(yīng)室溫攪拌過夜?；旌衔镎婵諠饪s，粗品用洗脫劑(DCM/甲醇,100至100/2)柱層析純化得到不純產(chǎn)品，用石油醚/乙醇,1:1重結(jié)晶得到N,N-二甲基-3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(42.6mg,19％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 2.63(s,6H)3.45(s,3H),5.81(d,J＝6.0Hz,1H),7.32(m,5H),7.50(t,J＝8.0Hz,1H),7.59(m,4H),7.93(m,2H),8.53(s,1H),8.89(s,1H),8.94(s,1H),9.60(s,1H)。LCMS(方法B):2.66min[MH]+＝602.3。
化合物11
步驟1：(4-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯
將苯-1,4-二胺(3.24g,30mmol)溶于THF(30mL)、DMF(10mL)和水(5mL)，然后添加碳酸鉀(1.52g,11mmol)和Boc2O(2.18g,10mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜?；旌衔锏谷胨?50mL)，所得混合物用乙酸乙酯(50mL)萃取三次。合并的有機層用水(50mL)洗滌三次，用Na2SO4干燥，得到(4-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.6g,77％)，為黃色固體。LCMS(方法B):0.51min[MH]+＝209.1。
步驟2：(4-((2-氯嘧啶-4-基)胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯
4-氨基苯基氨基甲酸叔丁酯(800mg,3.84mmol)、2,4-二氯嘧啶(744mg,5.00mmol)和NaHCO3(967mg,11.5mmol)溶于2-丙醇(20mL)。反應(yīng)混合物90℃加熱過夜。過濾熱的反應(yīng)混合物除去固體。濃縮濾液得到殘留物。向殘留物中加入DCM(80mL)，攪拌懸浮液30min。過濾收集析出的固體得到(4-((2-氯嘧啶-4-基)胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1g,63％)，為白色固體。LCMS(方法B):2.63min[MH]+＝321.1。
步驟3：(4-((2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯
將4-(2-氯嘧啶-4-基胺基)苯基氨基甲酸叔丁酯(200mg,0.62mmol)和3-氨基-苯磺酰胺(107mg,0.62mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(4mL)，然后添加TsOH(95mg,0.5mmol)。反應(yīng)混合物微波120℃加熱2小時。TLC分析顯示反應(yīng)結(jié)束。除去溶劑，粗品用石油醚:EtOAc(2:1)洗滌和干燥得到(4-((2-((3-氨基磺酰基苯基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-氨基甲酸叔丁酯(120mg,42.3％)，為黃色固體。
步驟4：3-((4-((4-氨基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
(4-((2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(120mg,0.26mmol)溶于DCM(10mL)，然后添加TFA(1mL)。反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜。除去溶劑得到粗品，將粗品用NaHCO3水溶液洗滌，干燥得到3-((4-((4-氨基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(80mg,86.3％)，為黃色固體。LCMS(方法B):0.29min[MH]+＝357.1。
步驟5：3-((4-((4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
3-((4-((4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。向3-((4-((4-氨基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(80mg,0.22mmol)的THF(20mL)的溶液中加入1-異氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(48mg,0.24mmol)和DIEA(57mg,0.44mmol)。反應(yīng)室溫攪拌過夜。真空濃縮混合物，粗品經(jīng)柱層析純化(DCM:甲醇,100:0至100:5)得到3-((4-((4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(17.8mg,14.5％)，為黃色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 6.38(d,J＝6.8Hz,1H),7.58(m,13H),7.98(m,3H),8.84(s,1H),8.98(s,1H),10.24(s,1H)。LCMS(方法B):2.46min[MH]+＝560.1[MNa]+＝582.1
化合物12
步驟1：N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1,N4-二甲基苯-1,4-二胺
將N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-甲基苯-1,4-二胺(來自中間體C的制備的步驟2,700mg,2.98mmol)，多聚甲醛(98.4mg,3.28mmol)溶于1,2-二氯乙烷(16mL)和甲醇(8mL)，然后添加醋酸(3滴)。反應(yīng)混合物40℃加熱過夜，然后加入NaBH3CN(281mg,4.47mmol)。除去溶劑，粗品通過柱層析(石油醚:乙酸乙酯,3:1)純化得到N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1,N4-二甲基苯-1,4-二胺(250mg,30％)為白色固體。LCMS(方法B):2.22min[MH]+＝249.1。
步驟2：3-((4-(甲基(4-(甲基胺基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
將N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1,N4-二甲基苯-1,4-二胺(50mg,0.20mmol)，3-氨基-苯磺酰胺(35mg,0.20mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(3mL)，然后添加TsOH(30mg,0.16mmol)。反應(yīng)混合物微波120℃加熱2小時。除去溶劑，粗品柱層析純化(DCM/甲醇,100:0至100:2)，然后用制備型HPLC純化，得到3-((4-(甲基(4-(甲基胺基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(16mg,21％)，為黃色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 2.72(s,3H),3.48(s,3H),5.89(s,1H),6.67(d,J＝8.0Hz,2H),7.13(m,2H),7.73(m,6H),7.85(d,J＝6.8Hz,1H),8.37(s,1H),10.73(s,1H)。LCMS(方法B):0.86min[MH]+＝385.1
步驟3：3-((4-(甲基(4-(1-甲基-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
3-((4-(甲基(4-(1-甲基-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。向3-((4-(甲基(4-(甲基胺基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(來自上述步驟2,150mg,0.39mmol)的THF(10mL)的溶液中加入1-異氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(87mg,0.43mmol)和DIEA(101mg,0.78mmol)。反應(yīng)室溫攪拌過夜?；旌衔镎婵諠饪s，粗品通過柱層析純化(DCM:甲醇,100至100:5)，得到黃色固體，用制備型HPLC純化得到3-((4-(甲基(4-(1-甲基-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯-磺酰胺(40mg,17％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 3.34(s,3H),3.53(s,3H),6.09(d,J＝6.4Hz,1H),7.28(d,J＝8.8Hz,2H),7.45(m,4H),7.59(m,6H),7.75(m,1H),7.96(d,J＝7.2Hz,1H),8.39(s,1H),8.58(s,1H),10.51(s,1H)。LCMS(方法B):2.40min[MH]+＝588.2[MNa]+＝610.1。
化合物13
步驟1：(3-硝基苯基)甲磺酰胺
向(3-硝基苯基)甲磺酰氯(700mg,2.97mmol)在乙腈(3mL)中的混合物中加入經(jīng)碳酸銨飽和的濃縮氨水。所得混合物室溫攪拌2小時。濃縮混合物，殘留物用冷水稀釋形成沉淀，經(jīng)過濾并用水洗滌得到(3-硝基苯基)甲磺酰胺(642mg,100％)，為白色固體。LCMS(方法B):0.47min[MNa]+＝239.0。
步驟2：(3-氨基苯基)甲磺酰胺
向(3-硝基苯基)甲磺酰胺(150mg,0.69mmol)在甲醇(4mL)和NH4Cl溶液(4mL)中的混合物中加入鋅(453mg,6.9mmol)?；旌衔?5℃攪拌3小時。用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)混合物至pH＝7。過濾固體。濾液用乙酸乙酯(3x)萃取。合并的有機層用硫酸鈉干燥并濃縮得到(3-氨基苯基)甲磺酰胺(100mg,78％)，為黃色油。LCMS(方法B):0.28min[MH]+＝187.0。
步驟3：(3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯基)甲磺酰胺
按照通用方法C采用中間體C(117mg,0.27mmol)和3-氨基苯基甲磺酰胺(50mg,0.27mmol)，得到(3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯基)甲磺酰胺(100mg,45％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,MeOD-d4):δppm3.59(s,3H),4.41(s,2H),5.97(d,J＝7.4Hz,1H),7.36-7.15(m,6H),7.47(d,J＝7.9Hz,1H),7.57(m,2H),7.72-7.61(m,3H),7.84(s,1H)。LCMS(方法B):2.48min[MH]+＝588.2。
化合物14
步驟1：N-甲基-3-硝基苯胺
向3-硝基苯胺(5g,36.2mmol)的丙酮(30mL)的溶液中加入碘甲烷(5.65g,39.8mmol)和碳酸鉀(10g,72.4mmol)?；旌衔?0℃攪拌過夜。混合物減壓濃縮至干。殘留物通過柱層析純化(石油醚:乙酸乙酯,10:1)得到N-甲基-3-硝基苯胺(1.6g,29％)，為紅色固體。LCMS(方法B):3.01min[MH]+＝153.1。
步驟2：2-氯-N-甲基-N-(3-硝基苯基)嘧啶-4-胺
向N-甲基-3-硝基苯胺(1.6g,10.5mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)的溶液中加入2,4-二氯吡啶(1.72g,11.6mmol)和碳酸鉀(2.18g,15.8mmol)。于130℃攪拌混合物3小時。反應(yīng)混合物在乙酸乙酯和水之間分層，分離有機層并用水、鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮得到殘留物，其用柱層析純化(石油醚:乙酸乙酯,5:1)得到2-氯-N-甲基-N-(3-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1.0g,36％)，為淡黃色固體。LCMS(方法B):3.01min[MH]+＝265.1。
步驟3：3-((4-(甲基(3-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯-磺酰胺
向2-氯-N-甲基-N-(3-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1g,3.78mmol)的1,4-二氧六環(huán)(20mL)的溶液中加入3-氨基苯磺酰胺(683mg,3.97mmol)和一水合對甲基苯磺酸(575mg,3.02mmol)?；旌衔?20℃攪拌3小時。減壓除去溶劑，加入氨水溶液(30mL)形成沉淀。過濾收集固體并減壓干燥得到3-((4-(甲基(3-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(1.4g,93％產(chǎn)率)，為棕色固體。LCMS(方法B):1.24min[MH]+＝401.1。
步驟4：3-((4-((3-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
向3-((4-(甲基(3-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(700mg,1.75mmol)的甲醇(30mL)的溶液中加入鋅粉(3.0g)和飽和氯化銨水溶液(30mL)?；旌衔锸覝財嚢柽^夜。過濾固體并減壓除去溶劑得到殘留物，殘留物在水和乙酸乙酯之間分層。分離有機相并用水、鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并減壓濃縮得到3-((4-((3-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(600mg,92％)，為淡黃色固體。LCMS(方法B):0.49min[MH]+＝371.1。
步驟5：3-((4-(甲基(3-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
3-((4-(甲基(3-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。向3-((4-((3-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(200mg,0.54mmol)的四氫呋喃(20mL)的溶液中加入4-(三氟甲氧基)苯基異氰酸酯(121mg,0.54mmol)和N,N-二異丙基乙胺(140mg,1.08mmol)?；旌衔锸覝財嚢?小時。反應(yīng)混合物減壓濃縮得到殘留物，其用硅膠層析純化(二氯甲烷/甲醇,35:1)得到3-((4-(甲基(3-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(190mg,65％)，為淡棕色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 3.47(s,3H),5.89(d,J＝6.0Hz,1H),6.97(d,J＝8.0Hz,1H),7.32-7.24(m,4H),7.44-7.33(m,4H),7.55(s,1H),7.55(d,J＝8.8Hz,2H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),7.91(d,J＝6.0Hz,1H),8.56(s,1H),9.07(s,1H),9.10(s,1H),9.57(s,1H)。LCMS(方法B):2.50min[MH]+＝574.2,[MNa]+＝596.2。
化合物15
步驟1：2-氯-N-甲基吡啶-4-胺
向密封管中加入2,4-二氯吡啶(2g,13.5mmol)和2M甲胺的甲醇溶液?；旌衔?5℃加熱過夜。除去溶劑，粗品通過柱層析(石油醚/乙酸乙酯,3:1)純化得到2-氯-N-甲基吡啶-4-胺(1.58g,82％)，為白色固體。LCMS(方法B):1.54min[MH]+＝143.0。
步驟2：2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)吡啶-4-胺
將2-氯-N-甲基吡啶-4-胺(200mg,1.4mmol),4-氟-硝基苯(217mg,1.54mmol)和K2CO3(368mg,2.8mmol)加至DMSO(5mL)中。反應(yīng)混合物120℃加熱至起始原料消失。將反應(yīng)混合物倒入水(20mL)。過濾收集固體，并干燥得到2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)吡啶-4-胺(280mg,75.9％)，為黃色固體。LCMS(方法B):2.37min[MH]+＝264.0。
步驟3：3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯-磺酰胺
將2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)吡啶-4-胺(400mg,1.52mmol)、3-氨基苯甲酰胺(261mg,1.52mmol)、Cs2CO3(991mg,3.04mmol)和4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽(xantphos)(174mg,0.3mmol)加至1,4-二氧六環(huán)(15mL)中，然后添加Pd2(dba)3(139mg,0.152mmol)。反應(yīng)混合物在氮氣氣氛中120℃加熱過夜。混合物真空濃縮，粗品通過柱層析純化(DCM/甲醇,100:0至98:2)得到3-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(303mg,50％)，為黃色固體。LCMS(方法B):0.75min[MH]+＝400.1。
步驟4：3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
將3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(300mg,0.75mmol)溶于DMF(30mL)和飽和NH4Cl(30mL)的混合溶劑中，然后添加鋅粉(487mg,7.5mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜。過濾除去固體，并用甲醇(30mL)洗滌3次。收集濾液并濃縮得到殘留物。粗品用水(30mL)洗滌三次。收集黃色固體并干燥得到3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(200mg,72％)。LCMS(方法B):0.35min[MH]+＝370.1。
步驟5：3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。向3-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(200mg,0.54mmol)的THF(10mL)的溶液中加入1-異氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(115mg,0.57mmol)和DIEA(140mg,1.08mmol)。反應(yīng)室溫攪拌過夜?；旌衔镎婵諠饪s，粗品經(jīng)柱層析(DCM/甲醇,100:0至97.5:2.5)純化得到3-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)吡啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(120mg,39％)，為黃色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 3.24(s,3H),6.03(d,J＝2.0Hz,1H),6.20(dd,J＝6.0and 2.1Hz,1H),7.39-7.18(m,8H),7.57(t,J＝9.5Hz,4H),7.86-7.77(m,2H),8.21(s,1H),9.04(br s,2H),9.12(s,1H)。LCMS(方法B):2.43min[MH]+＝573.2,[MNa]+＝595.2。
化合物16
步驟1：N-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-2-(4-(三氟-甲氧基)苯基)乙酰胺
將2-(4-(三氟甲氧基)苯基)醋酸(63mg,0.28mmol)、中間體A(100mg,0.27mmol)和DIEA(70mg,0.54mmol)加至DMF(3mL)中。然后加入HATU(123mg,0.324mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜。粗品用洗脫劑(DCM/甲醇,100:0至97:3)柱層析純化得到白色固體，其用制備型HPLC純化得到N-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-2-(4-(三氟-甲氧基)苯基)乙酰胺(15mg,10％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.55(s,3H),3.70(s,2H),5.82(s,1H),6.18(s,1H),7.17(m,4H),7.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.50(br s,2H),7.68(m,3H),7.84(br s,1H),8.41(s,1H)。LCMS(方法B):2.42min[MH]+＝573.2。
化合物17
步驟1：2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)胺基)苯基)乙酸甲酯
10℃下，緩慢地將DIEA(2.2g,16.8mmol)加至2,4-二氯嘧啶(500mg,3.36mmol)和2-(4-氨基苯基)乙酸甲酯(664mg,4mmol)的乙醇(20mL)的溶液中。然后，混合物回流加熱48小時。濃縮混合物并用柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯,3:1)得到2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)胺基)苯基)乙酸甲酯(740mg,79％)，為紅色油。LCMS(方法B):2.37min[MH]+＝278.0。
步驟2：2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酸甲酯
將2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)胺基)苯基)乙酸甲酯(490mg,1.76mmol)溶于DMF(6mL)和碳酸銫(1.7g,5.3mmol)。15min之后，加入碘甲烷(376mg,2.65mmol)，混合物室溫攪拌16小時。加入水淬滅反應(yīng)，所得混合物用乙酸乙酯萃取。合并的有機相用硫酸鈉干燥，濃縮并用柱層析(石油醚/乙酸乙酯,7:1)純化得到2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酸甲酯(260mg,61％)，為黃色油。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm3.38(s,3H),3.65(s,3H),3.77(s,2H),6.30(d,J＝6.0Hz,1H),7.35(m,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,2H),8.00(d,J＝6.0Hz,1H)。LCMS(方法B):2.48min[MH]+＝292.1。
步驟3：2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)醋酸
向2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酸甲酯(320mg,1.1mmol)的THF(16mL)和甲醇(8mL)的溶液中加入1M氫氧化鈉(4.8mL)。反應(yīng)混合物室溫攪拌2小時。用1M HCl溶液調(diào)節(jié)混合物至pH＝2并用乙酸乙酯萃取多次。合并的有機層用硫酸鈉干燥，濃縮得到2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)醋酸(304mg,定量)，為白色固體。LCMS(方法B):2.32min[MH]+＝278.2。
步驟4：2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰胺
室溫攪拌二氯甲烷(8mL)中2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)醋酸(304mg,1.1mmol)的混合物。加入4-(三氟甲氧基)苯胺(195mg,1.1mmol)和TEA(222mg,2.2mmol)，然后添加EDC.HCl(211mg,1.1mmol)和HOBt(148mg,1.1mmol)?；旌衔锸覝財嚢?6小時。濃縮混合物并用柱層析(石油醚/乙酸乙酯,3:1至1:1)純化得到2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)-N-(4-(三氟-甲氧基)苯基)乙酰胺(380mg,79％)，為白色固體。LCMS(方法B):2.97min[MH]+＝437.1。
步驟5：2-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰胺
將2-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-N-(4-(三氟-甲氧基)苯基)乙酰胺。將2-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰胺(100mg,0.23mmol)和3-氨基苯基磺酰胺(39mg,0.23mmol)溶于DMF(3mL)。向該混合物中加入p-TsOH.H2O(85mg,0.23mmol)。反應(yīng)混合物60℃攪拌16小時。然后用碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)混合物至pH＝9。所得混合物用乙酸乙酯萃取多次。合并的萃取液用硫酸鈉干燥，濃縮并用柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯,30:1)得到2-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酰胺(100mg,76％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d4):δppm 3.45(s,3H),3.72(s,2H),5.83(d,J＝6.0Hz,1H),7.27(s,2H),7.33(m,5H),7.39(t,J＝7.9Hz,1H),7.46(d,J＝8.3Hz,2H),7.74(d,J＝8.8Hz,2H),7.79(d,J＝8.3Hz,1H),7.89(d,J＝6.0Hz,1H),8.54(s,1H),9.55(s,1H),10.45(s,1H)。LCMS(方法B):2.32min[MH]+＝573.2,[MNa]+＝595.2。
化合物18
步驟1：2-氟-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法C采用中間體B(60mg,0.14mmol)和3-氨基-4-氟磺酰胺(26mg,0.14mmol)，得到2-氟-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯-磺酰胺(50mg,60％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d4):δ3.60(s,3H),5.93(s,1H),7.34(m,5H),7.69(s,2H),7.61(m,4H),7.96-7.74(m,2H),8.36(s,1H),9.32(s,2H),10.49(s,1H)。LCMS(方法B):2.50min[MH]+＝592.2,[MNa]+＝614.1。
化合物19
步驟1：N,N,2-三甲基-5-硝基苯甲酰胺
將2-甲基-5-硝基苯甲酸(1g,5.5mmol)溶于SOCl2(15mL)，然后添加DMF(1滴)。反應(yīng)混合物回流4小時。減壓除去溶劑。加入DCM(10mL)，然后減壓濃縮反應(yīng)混合物。添加DCM/濃縮循環(huán)重復(fù)三次得到白色固體。將Me2NH.HCl(490mg,6.08mmol)和TEA(1.67g,16.6mmol)溶于DCM(20mL)。0℃下將DCM(5mL)中2-甲基-5-硝基苯甲酰氯(1.09g,5.5mmol)緩慢加至該混合物中。反應(yīng)混合物室溫攪拌16小時，用水(3x 30mL)洗滌和干燥有機相(Na2SO4)并濃縮得到N,N,2-三甲基-5-硝基苯甲酰胺(600mg,52.2％)，為白色固體。LCMS(方法B):1.06min[MH]+＝208.4。
步驟2：5-氨基-N,N,2-三甲基苯甲酰胺
將N,N,2-三甲基-5-硝基苯甲酰胺(300mg,1.44mmol)溶于甲醇(20mL)，然后添加濕Pd/C(10％,30mg)。氫氣下攪拌反應(yīng)混合物過夜。過濾除去催化劑，濾液減壓濃縮得到5-氨基-N,N,2-三甲基苯甲酰胺(180mg,70％)，為黃色固體，直接用于下一步驟。LCMS(方法B):0.30min[MH]+＝179.1。
步驟3：N,N,2-三甲基-5-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯甲酰胺
將2-氯-N-甲基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(來自中間體A的制備的步驟2,223mg,0.84mmol)和5-氨基-N,N,2-三甲基苯甲酰胺(150mg,0.84mmol)溶于1,4-二氧六環(huán)(4mL)，然后添加濃HCl(2滴)。反應(yīng)混合物120℃加熱3小時。除去溶劑，粗品用石油醚/DCM,1:1洗滌得到N,N,2-三甲基-5-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯甲酰胺(250mg,73％)，為黃色固體，其不需進一步純化用于下一步驟。LCMS(方法B):1.96min[MH]+＝407.2。
步驟4：5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-N,N,2-三甲基苯甲酰胺
向N,N,2-三甲基-5-((4-(甲基(4-硝基苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯甲酰胺(250mg,0.62mmol)的甲醇(10mL)溶液中加入鋅(400mg,6.2mmol)和NH4Cl飽和水溶液(10mL)。反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜。過濾除去固體并用甲醇(20mL)洗滌三次。收集濾液，除去有機溶劑得到殘留物，其用DCM(3x50mL)萃取。合并的有機層用水洗滌并用Na2SO4干燥。減壓除去溶劑得到5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-N,N,2-三甲基苯甲酰胺(150mg,64％)，為黃色固體。LCMS(方法B):1.12min[MH]+＝377.2。
步驟5：N,N,2-三甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯甲酰胺
向5-((4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)-N,N,2-三甲基苯甲酰胺(150mg,0.40mmol)的THF(15mL)溶液中加入1-異氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(80mg,0.40mmol)和DIEA(155mg,1.2mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜?；旌衔镎婵諠饪s，粗品用柱層析(DCM:甲醇,100至100:2)純化得到N,N,2-三甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯甲酰胺(82mg,35％)，為黃色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d4):δ2.16(m,3H),2.77(m,3H),3.01(m,3H),3.44(m,3H),6.00-6.37(m,1H),7.89-7.21(m,12H),9.32(s,1H),9.50(s,1H),10.56-10.78(m,1H)。LCMS(方法B):2.54min[MH]+＝580.3。
化合物20
3-((4-(甲基(4-(3-(2-甲基-4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)-胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
按照通用方法A采用中間體A(60mg,0.12mmol)和2-甲基-4-三氟甲氧基苯胺(24mg,0.13mmol)，經(jīng)柱層析(DCM/MeOH,100:0至98:2)純化后得到3-((4-(甲基(4-(3-(2-甲基-4-(三氟-甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(4mg,4％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,MeOD-d4):δppm 2.25(s,3H),3.32(s,3H),5.86(d,J＝6.8Hz,1H),7.03(m,2H),7.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.65(m,6H),7.83(m,2H),8.41(s,1H)。LCMS(方法B):2.48min[MH]+＝588.2,[MNa]+＝610.2。
化合物21
步驟1：2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺
按照通用方法C采用中間體A(100mg,0.43mmol)和3-氨基-4-甲基苯磺酰胺(43mg,0.23mmol)，得到2-甲基-5-((4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(100mg,75％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 2.56(s,3H),3.50(s,3H),5.99(m,1H),7.38(m,7H),7.65(m,5H),7.87(d,J＝7.2Hz,1H),8.36(s,1H),9.24(d,J＝3.6Hz,2H),10.50(s,1H)。LCMS(方法B):2.52min[MH]+＝588.2。
化合物22
步驟1：2-甲基-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酸甲酯
向NaH(60％,362mg,9.1mmol)在DMF(8mL)的混合物中加入2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酸甲酯(530mg,2.26mmol)?；旌衔?℃攪拌30分鐘，然后加入碘甲烷(1.29g,9.1mmol)。反應(yīng)室溫攪拌過夜。用106mg2-(4-(三氟甲氧基)苯基)乙酸甲酯重復(fù)另一批次。合并兩個批次并倒入水中。所得混合物用乙酸乙酯萃取。有機層用硫酸鈉干燥，濃縮并用柱層析(石油醚/乙酸乙酯,30:1)純化得到2-甲基-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酸甲酯，為黃色油(440mg,60％)。LCMS(方法B):2.85min[MH]+＝263.1。
步驟2：2-甲基-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酸
將氫氧化鈉溶液(1M,1.5mL)添加至2-甲基-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酸甲酯(50mg,0.19mmol)的甲醇(1.0mL)和THF(2.0mL)溶液中。反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜，然后加入HCl溶液(1M)使得pH＝1-2。所得混合物用乙酸乙酯萃取。有機層用硫酸鈉干燥并濃縮得到2-甲基-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酸(42mg,89％)，為棕色油。LCMS(方法B):2.80min[MH]+＝271.0。
步驟3：2-甲基-N-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酰胺
氮氣下，將2-甲基-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酸(270mg,1.09mmol)溶于SOCl2(4mL)，然后添加DMF(1滴)。于80℃攪拌所得混合物3小時。蒸去多余的SOCl2，所得殘留物溶于DCM(6mL)。0℃下，將該溶液緩慢地加至N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-甲基苯-1,4-二胺(來自中間體C的制備的步驟2，255mg,1.09mmol)和TEA(275mg,2.72mmol)的DCM(6mL)的溶液中。反應(yīng)室溫攪拌過夜。然后將混合物在1M HCl溶液和乙酸乙酯之間分層。分離有機層，用硫酸鈉干燥并濃縮得到殘留物，其用柱層析(DCM/MeOH,20:1)純化得到所需中間體(50mg,10％)，為黃色固體。LCMS(方法B):3.14min[MH]+＝465.1。
步驟4：2-甲基-N-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酰胺。
按照通用方法C采用2-甲基-N-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-2-(4-(三氟甲氧基)苯基)丙酰胺(步驟3)(50mg,0.107mmol)和3-氨基苯磺酰胺(18mg,0.107mmol)，得到2-甲基-N-(4-(甲基(2-((3-氨基磺?；交?胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-2-(4-(三氟-甲氧基)苯基)丙酰胺(30mg,47％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 1.60(s,6H),3.47(s,3H),5.94(br s,1H),7.38(m,6H),7.44(m,6H),7.52(m,4H),7.79(m,3H),7.88(d,J＝6.8Hz,1H),8.39(s,1H),9.41(s,1H),10.07(s,1H),10.40(s,1H)。LCMS(方法B):2.52min[MH]+＝601.2。
化合物23
步驟1：N-(2-甲氧基乙基)-3-硝基苯磺酰胺。
0℃下，向預(yù)冷的3-硝基苯-1-磺酰氯(5.0g,22.6mmol)的DCM(100mL)的溶液中加入三乙胺(12.6mL,90.4mmol)，然后滴加2-甲氧基乙胺(3.9mL,45.1mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌2小時，然后用水(50mL)稀釋。分離有機層并用DCM萃取水層兩次。合并的有機層用鹽水洗滌，用MgSO4干燥并減壓濃縮得到標題化合物(5.05g,86％)，為淡黃色油。1H NMR(600MHz,CDCl3):δppm 3.18(t,J＝7.5Hz,2H),3.24(s,3H),3.41(t,J＝7.5Hz,2H),7.72(dd,J＝7.8and 7.8Hz,1H),8.17(d,J＝7.8Hz,1H),8.40(d,J＝7.80Hz,1H),8.69(s,1H)。LCMS(方法A):4.73min[MH]+＝259.5。
步驟2：3-氨基-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺。
將N-(2-甲氧基乙基)-3-硝基苯磺酰胺(2.0g,7.68mmol)溶于MeOH(100mL)并用Pt/C筒(cartridge)在H-立方體(cube)裝置中氫化(滿H2模式,40℃,1mL/min，運行2次)。減壓濃縮溶劑得到標題化合物(1.8g,100％)，為淡黃色油。使用時未經(jīng)任何進一步純化。LCMS(方法A):3.87min[MH]+＝231.2。
步驟3：N-(4-((2-(3-(N-(2-甲氧基乙基)氨基磺?；?苯基胺基)嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酰胺。
將N-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酰胺(化合物5的制備的步驟3的產(chǎn)物,100mg,0.361mmol)和3-氨基-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺(來自上述步驟2,166mg,0.723mmol)溶于i-PrOH(5mL)，滴加濃縮HCl(5滴)至該攪拌的溶液中。反應(yīng)混合物80℃攪拌3小時，然后冷至室溫。過濾收集灰白色沉淀，并用EtOAc洗滌以及真空干燥得到標題化合物(90mg,53％)，為黃色固體。LCMS(方法A):4.25min[MH]+＝471.8
步驟4：3-(4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基胺基)-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺。
將N-(4-((2-(3-(N-(2-甲氧基乙基)氨基磺?；?苯基胺基)嘧啶-4-基)(甲基)胺基)苯基)乙酰胺(來自上述的步驟3,30mg,0.064mmol)溶于MeOH(1mL)。滴加乙酰氯(0.45mL,0.64mmol)，反應(yīng)混合物室溫攪拌16小時并真空濃縮得到標題化合物(25mg,89％)，為白色固體。LCMS(方法A):3.88min[MH]+＝429.4。
步驟5：N-(2-甲氧基乙基)-3-(4-(甲基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)-脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法A采用3-(4-((4-氨基苯基)(甲基)胺基)嘧啶-2-基胺基)-N-(2-甲氧基乙基)苯磺酰胺得到標題化合物，為淡黃色固體(4mg,10％)。1H NMR(600MHz,MeOD-d4):δppm 3.05(t,J＝8.0Hz,2H),3.24(s,3H),3.37(t,J＝8.0Hz,2H),3.50(s,3H),5.86(m,1H),7.20(d,J＝9.0Hz,1H),7.23(d,J＝8.4Hz,1H),7.42(d,J＝9.0Hz,2H),7.53(d,J＝9.0Hz,2H),7.56(d,J＝8.4Hz,2H),7.70(m,1H),7.78(m,1H),8.56(br s,1H)。LCMS(方法A):4.75min[MH]+＝632.5。
化合物24
步驟1：N-環(huán)丙基-4-硝基苯胺
向4-氟-1-硝基苯(5.0g,35.4mmol)的DMSO(15mL)溶液中加入環(huán)丙胺(4.0g,70.9mmol)和碳酸鉀(9.8g,70.9mmol)。于70℃攪拌反應(yīng)混合物16小時。冷卻混合物并將其倒入水中。過濾固體并干燥得到N-環(huán)丙基-4-硝基苯胺(6.1g,97％)，為黃色固體。LCMS(方法B):2.42[MH]+＝179.1。
步驟2：2-氯-N-環(huán)丙基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺
在90℃攪拌2-氯-N-環(huán)丙基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(500mg,2.81mmol)、2,4-二氯嘧啶(836mg,5.61mmol)、碳酸銫(1.82g,5.61mmol)在DMSO(10mL)中的混合物16小時。反應(yīng)混合物在乙酸乙酯和水之間分層。水相用乙酸乙酯萃取。合并的有機相用鹽水洗滌，硫酸鈉干燥,濃縮并用柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯,4:1)得到2-氯-N-環(huán)丙基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(500mg,61％)，為黃色固體。LCMS(方法B):2.57[MH]+＝291.1。
步驟3：N-1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-環(huán)丙基苯-1,4-二胺
向2-氯-N-環(huán)丙基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(500mg,1.72mmol)在甲醇(15mL)的混合物中加入鋅粉(1.12g,17.2mmol)和NH4Cl溶液(10mL)。于60℃攪拌反應(yīng)混合物3小時。除去甲醇，且混合物在乙酸乙酯和1M氫氧化鈉溶液之間分層。過濾固體。有機相用鹽水洗滌并干燥。除去溶劑得到N-1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-環(huán)丙基苯-1,4-二胺(440mg,98％)，為淡黃色固體。LCMS(方法B):1.06[MH]+＝261.1。
步驟4：1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(環(huán)丙基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
按照通用方法A采用N-1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-環(huán)丙基-苯-1,4-二胺(440mg,1.69mmol)和1-異氰酸基-4-(三氟甲氧基)苯(384mg,1.69mmol)，得到4-1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(環(huán)丙基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)-苯基)脲(500mg,61％)。LCMS(方法B):3.09[MH]+＝464.1。
步驟5：3-((4-(環(huán)丙基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)-苯基)胺基)-嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法C采用1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(環(huán)丙基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(93mg,0.20mmol)和3-氨基苯基磺酰胺(35mg,0.20mmol)，經(jīng)制備型TLC(DCM/MeOH,10:1)純化后，得到3-((4-(環(huán)丙基(4-(3-(4-(三氟-甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(40mg,33％)，為黃色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 0.56(m,2H),0.97(m,2H),3.22(m,1H),6.17(br s,1H),7.18(d,J＝8.4Hz,2H),7.32(m,6H),7.61(m,4H),7.91(d,J＝8.0Hz,1H),8.02(d,J＝6.0Hz,1H),8.17(s,1H),8.99(s,1H),9.07(s,1H),9.59(s,1H)。LCMS(方法B):2.52min[MH]+＝600.2,[MNa]+＝622.2。
化合物25
1-(4-(甲基(2-((3-(甲基磺?；?苯基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
按照通用方法C采用中間體C(100mg,0.23mmol)和3-甲基磺?；桨?47mg,0.23mmol)，經(jīng)柱層析(DCM/MeOH,100:1至60:1)純化后，得到1-(4-(甲基(2-((3-(甲基磺酰基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(80mg,61％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 3.17(s,3H),3.45(s,3H),5.82(d,J＝6Hz,1H),7.32(m,4H),7.52(m,2H),7.60(m,4H),7.91(m,2H),8.70(s,1H),8.94(s,1H),8.98(s,1H),9.67(s,1H)。LCMS(方法B):2.57min[MH]+＝573.2,[MNa]+＝595.2。
化合物26
步驟1：N-乙基-4-硝基苯胺
在底燒瓶中，將1-氟-4-硝基苯(3g,21.3mmol)、EtNH2.HCl(3.46g,42.5mmol)、K2CO3(6.46g,46.3mmol)溶于DMSO(20mL)。反應(yīng)混合物85℃攪拌過夜。將反應(yīng)混合物倒入水(200mL)和混合物攪拌0.5小時。過濾收集固體,并干燥得到N-乙基-4-硝基苯胺(2.9g,82％)，為黃色固體。LCMS(酸性，5min):2.25[M+H]+＝167.1。
步驟2：2-氯-N-乙基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺
將N-乙基-4-硝基苯胺(1g,6.02mmol)、2,4-二氯嘧啶(896mg,6.02mmol)和Cs2CO3(3.9g,12.04mmol)溶于DMSO(15mL)。于85℃加熱反應(yīng)混合物過夜。將反應(yīng)混合物倒入水(70mL)中，所得混合物用EtOAc萃取三次。合并的有機層用水洗滌三次并用Na2SO4干燥。除去溶劑得到2-氯-N-乙基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1g,60％)，為黃色固體，其直接用于下一步。LCMS(酸性，5min):2.60[M+H]+＝279.0。
步驟3：N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-乙基苯-1,4-二胺
將2-氯-N-乙基-N-(4-硝基苯基)嘧啶-4-胺(1g,3.59mmol)溶于甲醇(15mL)和飽和NH4Cl溶液(15mL)。加入鋅(粉末，2.13g,35.9mmol)。反應(yīng)混合物室溫攪拌過夜。減壓除去有機層。混合物用EtOAc(50mL)萃取三次，合并的有機層用水性NaCl(30mL)洗滌并用Na2SO4干燥。減壓除去溶劑，粗品殘留物用柱層析(DCM/甲醇,100至100:1)純化得到N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-乙基苯-1,4-二胺(200mg,23％)，為黃色固體。LCMS(酸性，5min):2.08[M+H]+＝249.0。
步驟4：1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(乙基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟-甲氧基)苯基)脲
按照通用方法A采用N1-(2-氯嘧啶-4-基)-N1-乙基苯-1,4-二胺和4-三氟苯基-異氰酸酯得到1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(乙基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)-苯基)脲。LCMS(酸性，5min):3.23min[MH]+＝452.1
步驟5：3-((4-(乙基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)-胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺。
按照通用方法C采用1-(4-((2-氯嘧啶-4-基)(乙基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲(220mg,0.487mmol)和3-氨基苯磺酰胺(84mg,0.487mmol)，經(jīng)柱層析(DCM/MeOH,100:0至97.5/2.5)純化后，得到3-((4-(乙基(4-(3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲基)苯基)胺基)嘧啶-2-基)胺基)苯磺酰胺(68mg,24％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 1.19(t,J＝7.2Hz,3H),4.00(t,J＝7.2Hz,2H),5.65(d,J＝6.0Hz,1H),7.43(m,8H),7.60(m,4H),7.86(m,2H),8.51(s,1H),8.91(s,1H),8.95(s,1H),9.50(s,1H)。LCMS(酸性，5min):2.50min[MH]+＝588.2。
化合物27
步驟1：甲基(3-硝基芐基)硫烷
將3-硝基芐溴(3.72g,17.2mmol)的乙醇(50mL)溶液冷至0℃。加入甲硫醇鈉(1.45g,20.7mmol)，反應(yīng)混合物室溫攪拌3小時。減壓濃縮反應(yīng)混合物并在水和乙酸乙酯之間分層。分離有機層并用硫酸鈉干燥得到甲基(3-硝基芐基)硫烷(被約26％的1-(乙氧基甲基)-3-硝基苯污染,3.22g,26％)，為黃色油。LCMS(方法B):2.48min[MNa]+＝206.0。
步驟2：1-((甲基磺?；?甲基)-3-硝基苯
將甲基(3-硝基芐基)硫烷(70％,3.22g,5.27mmol的純化合物)溶于DMF(50mL)。加入過硫酸氫鉀(Oxone)(9.72g,15.8mmol)，反應(yīng)室溫攪拌3天。所得混合物倒入水中，然后加入乙酸乙酯。分離有機層并用水和鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥并濃縮得到殘留物，其用柱層析(石油醚/乙酸乙酯,5:1至1:1)純化得到1-((甲基磺?；?甲基)-3-硝基苯(940mg,29％)，為白色固體。LCMS(方法B):0.51min[MNa]+＝238.0。
步驟3：3-((甲基磺?；?甲基)苯胺
將1-((甲基磺?；?甲基)-3-硝基苯(50mg,0.23mmol)溶于乙酸乙酯(3mL)并加入Pd/C(10％,7mg)。氫氣下室溫攪拌反應(yīng)混合物過夜。濾去Pd/C，濃縮濾液得到3-((甲基磺?；?甲基)苯胺(46mg,定量)，為灰色固體，直接用于下一步。LCMS(方法B):0.26min[MH]+＝186.1。
步驟4：1-(4-(甲基(2-((3-((甲基磺?；?甲基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)脲
按照通用方法C采用中間體C(108.7mg,0.248mmol)和(甲基磺?；?甲基)苯胺(46mg,0.248mmol)，經(jīng)柱層析(DCM/MeOH,20:1)純化后，得到1-(4-(甲基(2-((3-((甲基磺?；?甲基)苯基)胺基)嘧啶-4-基)胺基)苯基)-3-(4-(三氟-甲氧基)苯基)脲(57.7mg,40％)，為白色固體。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δppm 2.92(s,3H),3.42(s,3H),4.38(s,2H),5.81(d,J＝6Hz,1H),6.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.31(m,5H),7.59(m,4H),7.62(d,J＝8Hz,1H),7.89(m,2H),8.89(s,1H),8.95(s,1H),9.29(m,1H)。LCMS(方法B):2.55min[MH]+＝587.2。
表達構(gòu)建物
通過沉默取代(DNA2.0，CA),合成編碼小鼠(殘基1-464)或人(殘基1-471)MLKL的cDNA,以便消除幾個限制性位點。將編碼MLKL的cDNA連入多西環(huán)素可誘導的嘌呤霉素選擇性的載體pF TRE3G PGK puro中，如Moujalled DM等人，(2014)，Cell Death Dis 5：e1086；Moujalled DM等人，(2013)Cell Death Dis 4：e465；和Murphy JM等人，(2013)，Immunity 39(3)：443-453中所述。通過Sanger測序(Micromon DNA測序中心，VIC，澳大利亞，或通過DNA2.0)，對序列進行驗證。
通過用1.2μg載體DNA和兩種輔助質(zhì)粒(0.8μg pVSVg和2μg pCMVΔR8.2)一起轉(zhuǎn)染接種在10cm培養(yǎng)皿中的HEK293T細胞，以產(chǎn)生慢病毒顆粒，如Vince JE等人，(2007)，Cell 131(4)：682-693中所述。使用病毒上清液感染靶細胞，其中被轉(zhuǎn)染細胞在5μg/mL嘌呤霉素中進行選擇和維持。
試劑和抗體
在實驗室生產(chǎn)重組hTNF-Fc，如Bossen C等人，(2006)，生物化學雜志(The Journal of biological chemistry)281(20)：13964-13971。嘌呤霉素、多西環(huán)素和壞死抑素-1(Necrostatin-1)購自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)。Smac模擬物，即化合物A，先前已經(jīng)在Vince JE等人，(2007)，Cell 131(4)：682-693中描述。Q-VD-OPh-OPH購自安迪生物公司(R&D systems)。單克隆的大鼠抗小鼠MLKL抗體(克隆3H1)由沃爾特和伊萊扎學院的單克隆中心(Walter and Eliza Hall Institute Monoclonal Facility)在實驗室制備(現(xiàn)在可從密理博公司(Millipore)獲得，目錄號MABC604)?？功?肌動蛋白抗體購自西格瑪-奧德里奇；抗VDAC1抗體(AB10527)購自密理博公司(Millipore)；抗GAPDH抗體來自細胞信號技術(shù)公司(Cell Signaling Technologies)；抗FLAG抗體(M2)來自西格瑪。將一抗用于對攜帶轉(zhuǎn)移蛋白的膜進行蛋白質(zhì)印跡分析，并使用購自GE Healthcare和Jackson Immunoresearch的HRP-偶聯(lián)的二抗和ECL檢測方法(密理博公司)進行檢測。
細胞系和細胞死亡測試
從三種Mlk1-/-小鼠和三種同類(congenic)野生型小鼠中分離小鼠真皮成纖維細胞(MDF)，然后通過SV40大T抗原進行永生化，從而產(chǎn)生三種生物學上獨立的細胞系，如Murphy JM等人，(2013)，Immunity，39(3)：443-453中所述。從三個Ripk3-/-小鼠和同類野生型小鼠類似地制備永生化MDF。將MDF和HEK293T保持在補充有8-10％v/v胎牛血清(FCS)和5μg/mL嘌呤霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，以便細胞系用MLKL的誘導型表達構(gòu)建物進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)導。U937細胞在補充有8％v/v FCS的RPMI1640中培養(yǎng)。在24孔板中進行細胞死亡測試，每孔接種1×105個細胞。然后在10ng/mL或20ng/mL多西環(huán)素存在下在4小時內(nèi)貼壁的細胞，用壞死抑素(50μM)和Q-VD-OPh(5μM)的各種組合進行處理，30分鐘后加入TNF(100ng/mL)和Smac模擬物(500nM)。在MDF細胞處理24小時或U937細胞處理48小時后，收獲細胞，并使用BD FACSCalibur流式細胞儀定量PI陽性細胞(1μg/mL)。
圖1(C)證明化合物1從TSQ-誘導的壞死性凋亡中拯救了約50％的wtMDF,其中IC50為約500nM。
圖3(C)證明化合物1從TSQ-誘導的壞死性凋亡中拯救了約50％的wt U937細胞，其中IC50為50-100nM。
測試化合物1-4從TSQ-誘導的壞死性凋亡中拯救wt U937細胞的能力，在表1中示出。
圖2(B)證明，化合物1在濃度≥5μM時的毒性會誘導野生型MDF的死亡。顯示了三次重復(fù)實驗的平均值±SEM。
圖3(D)顯示了化合物1經(jīng)基因編輯從而刪除MLKL的U937細胞中的毒性。在不存在MLKL時，經(jīng)TSQ刺激的細胞與未刺激的細胞表現(xiàn)相當。TS處理說明細胞保留了發(fā)生凋亡死亡的能力，并且這不受化合物1處理的影響。數(shù)據(jù)顯示為2次獨立實驗的平均值±SD。圖4(A)表明，索拉非尼(一種具有與化合物1類似的蛋白激酶靶標譜的蛋白激酶抑制劑)在野生型MDF中不抑制TSQ-誘導的壞死性凋亡。顯示了三次重復(fù)實驗的平均值±SEM。
圖4(B)證明索拉非尼(一種具有與化合物1類似的蛋白激酶靶標譜的蛋白激酶抑制劑)在野生型U937細胞中不抑制TSQ-誘導的壞死性凋亡。顯示了重復(fù)實驗的平均值±SEM。
統(tǒng)計分析
誤差條代表指定數(shù)目的獨立和/或生物學重復(fù)(不是技術(shù)重復(fù))的平均值±SD或SEM(在圖例中指定)。
組分分離和藍色非變性PAGE
將MDF接種在6孔板中(每孔5×105個細胞)，并貼壁過夜。在1μM測試化合物或DMSO對照的存在下，用TSQ刺激細胞達6小時。通過刮擦收獲細胞，在PBS中洗滌一次，并在含有0.025％洋地黃皂苷(BIOSYNTH，Staad，瑞士)且補充有無EDTA的完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche)、2μM N-乙基馬來酰亞胺和磷酸酶抑制劑(5mMβ-甘油磷酸鹽、1mM鉬酸鈉、1mM焦磷酸鈉和100μM氟化鈉)的緩沖液(20mM Hepes(pH 7.5)，100mM KCl，2.5mM MgCl2和100mM蔗糖)中進行滲透化處理。通過臺盼藍吸收證實滲透化作用，并通過在11,000×g離心5分鐘分離胞質(zhì)和粗膜組分。將洋地黃皂苷加入細胞質(zhì)部分至終濃度為1％，將粗膜組分進一步溶解于滲透化緩沖液(添加1％洋地黃皂苷)中，并在冰上孵育20分鐘。將粗膜懸浮液以11,000×g離心5分鐘，將上清液與細胞質(zhì)部分一起上樣于4-16％Bis-Tris非變性PAGE凝膠(LifeTechnologies)上。在將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF后，對PVDF進行脫色，并通過將PVDF膜在室溫下浸泡在6M鹽酸胍、10mM Tris-HCl pH 7.5和5mM 2-巰基乙醇中2小時，來顯示MLKL表位。通過如上所述的抗-MLKL抗體(3H1)的蛋白質(zhì)印跡法，檢測含有MLKL的復(fù)合物。
圖1(D)證明，在藍色非變性PAGE的抗-MLKL印跡分析中，化合物1阻滯易位至膜組分。通過對于GADPH和VDAC1的對照印跡，來說明細胞質(zhì)和膜組分的純度和蛋白質(zhì)豐度。
重組蛋白表達和純化
具有由pFastBac HTb載體編碼的常規(guī)N-末端His6標簽或在pFastBac1載體中引入經(jīng)修飾的2xHis6標簽(MSHHHHHHGSAGSAKKKGSAGSAHHHHHHGSA)的重組小鼠(殘基179-464)和人(190-471)MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域，根據(jù)Murphy JM等人，(2013)，Immunity 39(3)：443-453和Murphy JM等人，(2014)，The Biochemical journal 457(2)：323-334中建立的程序，在Sf21昆蟲細胞中進行表達并加以純化。簡言之，通過Ni2+-親和層析(羅氏His標簽樹脂)，從Sf21裂解物中純化這些蛋白質(zhì)。然后在廣泛透析之前，通過在25℃下與TEV蛋白酶溫育1小時以切割掉常規(guī)的His6標簽；進一步進行Ni2+-層析以消除未消化的蛋白質(zhì)和TEV蛋白酶，隨后進行Superdex-200凝膠過濾層析(GE Healthcare)。蛋白質(zhì)在200mM NaCl、20mM HEPES pH 7.5(用于熱穩(wěn)定性位移測試)或100mM NaCl、20mM HEPES pH 7.5(用于NMR研究)中洗脫。未切割的帶2xHis6標記的假激酶Ni2+-洗脫液，通過離心超濾進行濃縮并進行Superdex-200凝膠過濾層析(GE Healthcare)，其中用200mM NaCl、20mM Tris pH8、10％甘油、0.5mM TCEP進行洗脫，然后用于表面等離子共振實驗。如先前在Murphy JM等人(2013)，Immunity 39(3)：443-453和Cook WD等人，(2014)Cell Death Diff(出版中)中所述，在Sf21細胞中表達和純化重組mRIPK3激酶結(jié)構(gòu)域。
使用如Hercus TR等人，(2013)，PloS one 8(8)：e74376和Murphy JM等人，(2010)，Growth factors 28(2)：104-110所述的已建立的策略，從大腸桿菌(BL21Codon Plus)制備重組小鼠MLKL(1-169)。簡言之，將編碼mMLKL(1-169)的cDNA，按讀框連入卡那霉素選擇性載體pETNusH HTb，以便能夠表達具有N端的TEV蛋白酶可切割的NusA-His6標簽的融合蛋白。將細菌在含有50μg/mL卡那霉素的超級肉湯培養(yǎng)基(Super Broth)中在37℃下培養(yǎng)直至達到OD595為約0.6-0.8，然后將溫度降至18℃，20分鐘后通過加入1mM IPTG誘導表達。將細胞在18℃下再培養(yǎng)16小時，通過離心收獲細胞，重懸于補充有1mM PMSF的0.2M NaCl、5mM咪唑、20mM HEPES pH7.5、5mM 2-巰基乙醇中，通過超聲裂解并通過離心去除碎片。通過注射器驅(qū)動的0.45μM過濾，澄清上清液，并通過蠕動泵將其加到NiMAC柱(Novagen，Madison，WI)上。在用7-10倍柱體積的裂解緩沖液(裂解緩沖液含有35mM咪唑，pH7.5)洗滌后，NusA-His6-mMLKL(1-169)用0.2M NaCl，250mM咪唑，20mM HEPES pH7.5,5mM 2-巰基乙醇進行洗脫，并在20℃下用0.5mg TEV蛋白酶溫育2小時以便將mMLKL(1-169)與融合標簽切開。除了TEV蛋白酶切割步驟之外，所有其它純化步驟均在4℃下進行。接著，在0.2M NaCl、20mM HEPES pH 7.5中徹底透析裂解反應(yīng)以除去咪唑，然后進行回收透析液，并重新上樣于經(jīng)重整的NiMAC盒，并用裂解緩沖液進行洗滌。將流出物通過離心超濾進行濃縮，并上樣于Superdex-200、24mL凝膠過濾柱(GE Healthcare)，并在100mM KCl、10mM Tris-HCl pH 8.0中洗脫，以用于AUC研究。
熱位移測試法以篩選小分子相互作用物
在150mM NaCl、20mM Tris pH 8.0、1mM DTT中稀釋蛋白質(zhì)至2.6μM，總反應(yīng)體積為25μL后，如先前在Murphy JM等人(2013)，Immunity 39(3)：443-453、Murphy JM等人(2014)，生物化學雜志(The Biochemical journal)457(2)：323-334和Murphy JM，等人(2014)，生物化學雜志(The Biochemical journal)457(3)：369-377中所述，使用Corbett Real Time PCR儀進行熱位移測試。使用SYPRO橙(Molecular Probes，CA)，通過在530nm檢測熒光來檢測蛋白質(zhì)熱解折疊。加入0.2mM的ATP并用作配體結(jié)合的陽性對照。以40μM的最終濃度加入測試化合物。正ΔTm值表示配體結(jié)合于蛋白質(zhì)并賦予免于變性的保護。所示數(shù)據(jù)代表三個獨立實驗。
圖1(A)顯示化合物1的熱位移測試，它證實了化合物1是MLKL的相互作用物。
表面等離子體共振(SPR)結(jié)合實驗
通過在Biacore T200儀器(GE Healthcare)上的SPR，測定化合物1結(jié)合于小鼠MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域的動力學。根據(jù)制造商的說明，將帶有雙His標簽的MLKL和不相關(guān)的陰性對照參照蛋白固定在負載Ni2+的NTA捕獲芯片上。在一些情況下，通過Ni2+/NTA螯合，在含有預(yù)先固定有次氮基三乙酸(NTA)的羧甲基化葡聚糖表面的系列S傳感器芯片上捕獲雙His-標記的蛋白質(zhì)。然后將表面活化并用NHS/EDC混合物進行增強，然后His捕獲的蛋白質(zhì)以琥珀酰胺酯形式共價偶聯(lián)到表面的。稍后注入乙醇胺以封閉任何未反應(yīng)的酯。未結(jié)合的Ni2+和非共價結(jié)合的蛋白通過注射EDTA進行洗脫。
典型的固定水平為2000-3000響應(yīng)單位(RU)。將流動池1留空作為參考表面。在25℃下，在含有20mM HEPES(pH 8.0)、200mM NaCl和0.005％(v/v)表面活性劑P20的運行緩沖液中進行固定實驗。
在運行緩沖液(添加2％v/v DMSO)中進行結(jié)合實驗?；衔?的6個濃度范圍為3.125μM至200μM(溶于添加了2％v/v DMSO的運行緩沖液中)，以100μL/min的流速流過固定的蛋白質(zhì)，結(jié)合階段為30s，解離階段為90s。用Biacore T200評估軟件，對數(shù)據(jù)進行簡化、進行溶劑校正以及并進行雙重參考。將數(shù)據(jù)整體擬合至兩狀態(tài)動力學相互作用模型，并由(kd/ka)比確定Kd。從穩(wěn)態(tài)結(jié)合曲線和最大觀察響應(yīng)單位(RU)水平推斷出1：1結(jié)合化學計量。
圖1(B)證明化合物1以9.3μM的Kd值結(jié)合于小鼠MLKL(179-464)假激酶結(jié)構(gòu)域。
圖3(B)證明化合物1以4.4μM的Kd值結(jié)合人MLKL(190-471)假激酶結(jié)構(gòu)域。
也通過SPR測定化合物2-4以確定結(jié)合親和力?；衔?-4的結(jié)合親和力示于表1中。
飽和度轉(zhuǎn)移差(STD)NMR光譜
在STD實驗的每個樣品中，核苷酸溶于NMR緩沖液(20mM HEPES，pH 7.5、200mM NaCl、90％D2O、10％H2O)，終濃度為200μM。對于每種核苷酸制備三種不同的樣品：(1)ATP或ADP，加入與含蛋白質(zhì)樣品的等體積的蛋白質(zhì)緩沖液；(2)ATP或ADP，添加MLKL假性激酶結(jié)構(gòu)域，終濃度為2μM；(3)ATP或ADP，添加MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域(2μM)與測試化合物(200μM)。在裝配有CryoprobeTM的Bruker AVANCE Ultrashield 600MHz光譜儀上，在283K下記錄NMR光譜。1H化學位移參照4.70ppm的1H2O信號。蛋白質(zhì)共振的飽和性通過以-0.5ppm為中心的4s系列的高斯脈沖實現(xiàn)。對于參考光譜，在中心為20,000Hz偏共振的頻率處應(yīng)用類似的飽和脈沖。在采集之前，使用15ms T2-自旋鎖定時間段，以允許殘留的蛋白質(zhì)信號衰減。NMR數(shù)據(jù)在3.2版本TOPSPIN(Bruker BioSpin)中處理。
圖2(A)顯示化合物1的STD NMR測試。STD NMR光譜顯示了與小鼠MLKL結(jié)合的核苷酸。數(shù)據(jù)顯示，化合物1可以與(i)ATP和(ii)ADP競爭結(jié)合于小鼠MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域。偏離共振光譜的低場區(qū)域顯示，在不存在蛋白質(zhì)時檢測到200μM ATP(i)或ADP(ii)的峰。在2μM小鼠MLKL(179-464)存在時，在ATP(i)或ADP(ii)上進行的STD-NMR實驗中觀察到用星號標記的峰，這確認了核苷酸結(jié)合。在200μM化合物1存在下，這些峰減少，這證實在化合物1的存在下ATP和ADP被從小鼠MLKL(179-464)中置換掉。
圖3(A)顯示化合物1的STD NMR測定。STD NMR光譜顯示了核苷酸與人MLKL的結(jié)合。數(shù)據(jù)顯示，化合物1可以與(i)ATP和(ii)ADP競爭結(jié)合于人MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域。偏離共振光譜的低場區(qū)域顯示，在不存在蛋白質(zhì)時檢測到200μM ATP(i)或ADP(ii)的峰。在2μM人MLKL(190-471)存在時，在ATP(i)或ADP(ii)上進行的STD-NMR實驗中觀察到用星號標記的峰，這確認了核苷酸結(jié)合。在200μM化合物1存在下，這些峰減少，這證實在化合物1的存在下ATP和ADP被從人MLKL(190-471)中置換掉。
體外激酶測試
如先前在Murphy JM等人，(2013)，Immunity 39(3)：443-453和Cook WD等人，(2014)Cell Death Diff(出版中)所述，進行體外激酶測試，不同點在于：加入DMSO對照或在0.5％v/v的最終DMSO中加入高達12.5μM的試驗化合物。
圖2(C)證明，相對于DMSO對照(“0”泳道)，化合物1對重組RIPK3激酶活性沒有影響。≥10μM的化合物1濃度，可重復(fù)地導致小鼠MLKL(179-464)的磷酸化增加。所示的實驗表示了三次獨立測定。左圖，干燥的考馬斯染色的4-12％Bis-Tris凝膠；右圖，相同凝膠的放射自顯影。
1.2測試結(jié)果
如上所述測試本發(fā)明描述的化合物。測試結(jié)果列于下表中。
表1:該表顯示了通過SPR測定的測試化合物的結(jié)合親和力和測試化合物從TSQ誘導的壞死性凋亡中拯救U937細胞的能力
化合物3(衍生自化合物1的類似物)與MLKL蛋白的ATP結(jié)合位點的結(jié)合，描述于圖5(A)和(B)中。
使用體外激酶測試，檢查化合物1結(jié)合于MLKL假激酶結(jié)構(gòu)域?qū)νㄟ^上游激活劑RIPK3的MLKL磷酸化的作用。測定表明，重組RIPK3的催化活性和RIPK3介導的MLKL磷酸化都不被化合物1抑制。相反，在＞5μM化合物1存在下，RIPK3-介導的MLKL磷酸化增強。圖2(D)證明，相對于DMSO對照(“0”泳道)，化合物1對重組RIPK3激酶活性沒有影響?！?0μM的化合物1濃度，可重復(fù)地導致MLKL(179-464)磷酸化增加。所示的實驗表示了三次獨立測定。左圖，干燥的考馬斯染色的4-12％Bis-Tris凝膠；右圖，相同凝膠的放射自顯影。
篩選用于抑制TSQ誘導的壞死性凋亡的化合物，96孔板格式。
細胞系ID：U937人組織細胞白血病細胞系。
細胞濃度(細胞/孔)：在120μL培養(yǎng)基中每孔35,000個，在加入抑制劑和死亡刺激物之前，立即計數(shù)并鋪板。加入化合物和死亡刺激物后，最終孔體積150μL。
細胞生長培養(yǎng)基：補充有7.4％v/v FCS(Gibco，Precision Plus，貨號#1221437)的HTRPMI(WEHI培養(yǎng)基，含有L-谷氨酰胺和青霉素、鏈霉素)
孵育時間(小時)：加入化合物和死亡刺激物后，孵育48小時
DMSO終濃度(％v/v)：0.2％
化合物濃度-log效價：
10000nM、5000nM、1000nM、500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM；
死亡刺激混合物中的化合物及其最終濃度：
hTNF-Fc(100ng/mL)-由Silke lab，WEHI生產(chǎn)
化合物A(500nM)-Simac模擬物，Tetrelogic公司
Q-VD-OPh(10μM)-MP Biomedicals
分析：
細胞用PI染色(1μg/ml)處理并通過流式細胞術(shù)分析
結(jié)果解讀：
涉及TSQ混合物的測試(T：TNF；S：Smac模擬物；Q：Q-VD-OPh)：TSQ處理確保細胞特異性地發(fā)生壞死性細胞死亡。TNF激活TNF受體，Smac模擬物將信號導離促炎癥信號傳導并朝向RIP1/RIP3-介導的細胞死亡途徑，而Q-VD-OPh確保凋亡反應(yīng)被阻斷，僅留下程序性壞死反應(yīng)。在PI染色后，通過流式細胞術(shù)測量它們阻斷細胞死亡的能力，來評價在該TSQ-誘導測試中測得的所述化合物(在DMSO中的溶液)的活性。
計數(shù)篩選：平行地，測試所有化合物影響細胞活力的能力。在無TSQ混合物情況下，用化合物在DMSO中溶液處理相同的U937細胞。此計數(shù)篩選可以評估脫靶效果。在這種情況下，也在PI染色后通過流式細胞術(shù)測量細胞活力。
上述化合物的篩選結(jié)果示于下表2中。
表2：該表顯示了上述化合物和對比化合物的基于細胞的測試結(jié)合數(shù)據(jù)的結(jié)果
聚肌胞(Poly(I：C))實驗
將轉(zhuǎn)化的iBMDM分在24孔板(60.000細胞/孔)中，48小時后用不同濃度的化合物1處理。0.5小時后，加入聚肌胞(poly：IC)(50ug/mL)和zVAD(25uM)。48小時后收獲細胞。通過碘化丙啶染色和流式細胞術(shù)分析細胞死亡。
圖6的結(jié)果證明，化合物1抑制聚肌胞和zVAD誘導的壞死性凋亡。已知聚肌胞和zVAD誘導的細胞死亡獨立于RIPK1發(fā)生，這表明化合物1通過靶向MLKL而抑制壞死性凋亡。
在整個說明書中，詞語“包括”或其變體例如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”將被理解為暗示包括所述元素、整數(shù)或步驟，或者所述元素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其它元素、整數(shù)或步驟，或其它元素、整數(shù)或步驟的組。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不脫離本發(fā)明的廣泛通用范圍的情況下，可以對上述實施例進行多種變化和/或修改。因此，在所有方面，這些實施例都被認為是說明性的而不是限制性的。
序列表
<110> 催化劑治療私人有限公司
<120> 抑制壞死性凋亡的方法
<130> 515172
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 471
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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Arg Cys Glu Glu Met Lys Tyr Cys Lys Lys Gln Cys Arg Arg Leu Gly
20 25 30
His Arg Val Leu Gly Leu Ile Lys Pro Leu Glu Met Leu Gln Asp Gln
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Gly Lys Arg Ser Val Pro Ser Glu Lys Leu Thr Thr Ala Met Asn Arg
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Phe Lys Ala Ala Leu Glu Glu Ala Asn Gly Glu Ile Glu Lys Phe Ser
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Arg Arg Ala Phe Gln Met Leu Arg Arg Asp Asn Glu Lys Ile Glu Ala
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Ala Pro Val Ala Ile Lys Val Phe Lys Lys Leu Gln Ala Gly Ser Ile
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<213> 小鼠
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1 5 10 15
Gln Cys Glu Lys Met Lys Tyr Cys Arg Lys Gln Cys Gln Arg Leu Gly
20 25 30
Asn Arg Val His Gly Leu Leu Gln Pro Leu Gln Arg Leu Gln Ala Gln
35 40 45
Gly Lys Lys Asn Leu Pro Asp Asp Ile Thr Ala Ala Leu Gly Arg Phe
50 55 60
Asp Glu Val Leu Lys Glu Ala Asn Gln Gln Ile Glu Lys Phe Ser Lys
65 70 75 80
Lys Ser His Ile Trp Lys Phe Val Ser Val Gly Asn Asp Lys Ile Leu
85 90 95
Phe His Glu Val Asn Glu Lys Leu Arg Asp Val Trp Glu Glu Leu Leu
100 105 110
Leu Leu Leu Gln Val Tyr His Trp Asn Thr Val Ser Asp Val Ser Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Trp Gln Gln Glu Asp Arg Gln Asp Ala Glu Glu Asp Gly
130 135 140
Asn Glu Asn Met Lys Val Ile Leu Met Gln Leu Gln Ile Ser Val Glu
145 150 155 160
Glu Ile Asn Lys Thr Leu Lys Gln Cys Ser Leu Lys Pro Thr Gln Glu
165 170 175
Ile Pro Gln Asp Leu Gln Ile Lys Glu Ile Pro Lys Glu His Leu Gly
180 185 190
Pro Pro Trp Thr Lys Leu Lys Thr Ser Lys Met Ser Thr Ile Tyr Arg
195 200 205
Gly Glu Tyr His Arg Ser Pro Val Thr Ile Lys Val Phe Asn Asn Pro
210 215 220
Gln Ala Glu Ser Val Gly Ile Val Arg Phe Thr Phe Asn Asp Glu Ile
225 230 235 240
Lys Thr Met Lys Lys Phe Asp Ser Pro Asn Ile Leu Arg Ile Phe Gly
245 250 255
Ile Cys Ile Asp Gln Thr Val Lys Pro Pro Glu Phe Ser Ile Val Met
260 265 270
Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Thr Leu Arg Glu Leu Leu Asp Arg Glu Lys
275 280 285
Asp Leu Thr Met Ser Val Arg Ser Leu Leu Val Leu Arg Ala Ala Arg
290 295 300
Gly Leu Tyr Arg Leu His His Ser Glu Thr Leu His Arg Asn Ile Ser
305 310 315 320
Ser Ser Ser Phe Leu Val Ala Gly Gly Tyr Gln Val Lys Leu Ala Gly
325 330 335
Phe Glu Leu Ser Lys Thr Gln Asn Ser Ile Ser Arg Thr Ala Lys Ser
340 345 350
Thr Lys Ala Glu Arg Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Val Ser Pro Glu Arg
355 360 365
Leu Lys Asn Pro Phe Cys Leu Tyr Asp Ile Lys Ala Glu Ile Tyr Ser
370 375 380
Phe Gly Ile Val Leu Trp Glu Ile Ala Thr Gly Lys Ile Pro Phe Glu
385 390 395 400
Gly Cys Asp Ser Lys Lys Ile Arg Glu Leu Val Ala Glu Asp Lys Lys
405 410 415
Gln Glu Pro Val Gly Gln Asp Cys Pro Glu Leu Leu Arg Glu Ile Ile
420 425 430
Asn Glu Cys Arg Ala His Glu Pro Ser Gln Arg Pro Ser Val Asp Gly
435 440 445
Ile Leu Glu Arg Leu Ser Ala Val Glu Glu Ser Thr Asp Lys Lys Val
450 455 460
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