本申請要求南非臨時專利申請?zhí)?014/01988的優(yōu)先權(quán)，其以引用方式結(jié)合于本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腺牧豆(Prosopis glandulosa)用于治療和增強肌肉組織的用途。

背景技術(shù)：

依據(jù)積累的科學(xué)證據(jù)，顯然的是，在草藥物質(zhì)(herbal substance)中存在的植物化學(xué)品(phyto-chemical)對長期人體健康具有有益效果并且可以用來有效治療各種疾病。

許多研究已表明，抗氧化劑(如在草藥制劑中發(fā)現(xiàn)的)，可以導(dǎo)致在耐力鍛煉中的延長性能(通過減少氧化應(yīng)激(oxidative stress)[Zheng et al.,2012；Chen et al.,201 1；Bucci,2000]，以及有助于肌肉再生過程，從而導(dǎo)致在肌肉損傷以后的加速肌肉恢復(fù))。高麗參(Korean ginseng)是顯示出增強鍛煉和運動性能的草藥制劑的一個實例[Chen et al.,201 1；Bucci,2000；Wang et al.,2010]，以及例如，葡萄籽衍生的多酚，最近被描述為提供加速骨骼肌恢復(fù)[Myburgh et al.,2012；Kruger et al.,2014]。

然而，許多草藥(herbal remedy)增強鍛煉和運動性能或減少炎癥(作為損傷的結(jié)果)的能力是基于坊間說法并且缺乏科學(xué)證據(jù)。因此，作為結(jié)果，當(dāng)服用未研究的市售草藥補充劑(herbal supplement)時，許多人經(jīng)歷不愉快或不期望的副作用，這是由于不正確的劑量以及與其它處方藥的相互作用。此外，還已知合成藥物用于增強運動性能或恢復(fù)。然而，在競技體育中，這些藥物中的許多藥物(如非甾體抗炎藥)是不允許的。

附圖說明

圖1示出在實驗性挫傷以后隨著時間的推移，通過H&E染色的超微結(jié)構(gòu)變化(ultrastructural change)。圖(A)示出未受損樣品，圖(B-D)示出在損傷后3小時(B)、1天(C)和7天(D)取自PLA動物的的樣品；圖(E-G)、(H-J)和(K-M)分別示出在PG-CHR、PG-AI和NSAID組中的類似的時間點。比例尺(scale bar)是100μm；圖(B)、(E)、(H)和(K)示出肌纖維破壞和血管破壞；自損傷后1天(圖(C)、(F)、(I)和(L))，免疫細(xì)胞滲入(infiltration)受傷部位是可見的。實心白色箭頭指示紅細(xì)胞，實心黑色箭頭指向新再生的肌纖維以及虛線箭頭指示免疫細(xì)胞。

圖2示出在挫傷以后，在具有/沒有腺牧豆治療的情況下，中性粒細(xì)胞(neutrophil)(His48染色)滲入受傷部位。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。通過雙向ANOVA(two-way ANOVA)來進行分析。n＝5/時間點/組；實線表示隨著時間的推移的差異以及黑虛線表示在特定時間點時的組差異；顯著性：所有組：***p<0.0001未受損傷的相對于1天；1小時相對于1天；3小時相對于1天；1天相對于7天。1天：***p<0.0001PLA相對于PG-CHR；PLA相對于NSAID；**p<0.05PLA相對于PG-AI。

圖3示出在挫傷以后，在具有/沒有腺牧豆治療的情況下，巨噬細(xì)胞滲入受傷部位。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。通過雙向ANOVA進行分析。n＝5/時間點/組；實線表示隨著時間的差異；顯著性：所有組：**p<0.001未受損傷的相對于1天；1小時相對于1天；3小時相對于1天；7天相對于1天。

圖4示出在挫傷以后在骨骼肌中的ADAM₁₂表達。(A)代表性的蛋白質(zhì)印跡。頂部4帶表示ADAM₁₂表達以及底部帶表示β-微管蛋白表達(證實蛋白質(zhì)的等量加載)；(B)針對所有不同組的合并數(shù)據(jù)；(C)在每個實驗組中，在不同時間點之間觀測到的統(tǒng)計差異。相對于未受損傷的值來表示這些值。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；通過雙向ANOVA進行分析；n＝5/時間點/組；實線表示隨著時間的差異以及黑虛線表示在特定時間點的組差異；顯著性：***p<0.0001，**p<0.001以及*p<0.05。

圖5示出在挫傷以后在骨骼肌中的結(jié)蛋白(desmin)表達。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；通過雙向ANOVA進行分析；n＝5/時間點/組；黑色實線(PLA)表示隨著時間的差異，藍色實線(PG-CHR)、紅色實線(PG-AI)和黑虛線表示在特定時間點的組差異；顯著性：***p<0.0001，**p<0.001以及*p<0.05。

圖6示出在對照和腺牧豆治療的大鼠中大鼠比目魚肌(soleus muscle)的力-頻率關(guān)系特征。(A)示出在不同頻率下由比目魚肌產(chǎn)生的比力(specific force)以及(B)示出當(dāng)相對于產(chǎn)生的最大力表示時在每個頻率下產(chǎn)生的力。在增加的脈沖頻率下，通過簡短、反復(fù)刺激產(chǎn)生力-頻率曲線。使用這種方案對于每個肌肉所實現(xiàn)的最大力被認(rèn)為是F_max。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。通過雙向ANOVA進行分析。n＝10；**p<0.001PLA相對于PG(10Hz至100Hz)。

圖7示出在對照和腺牧豆治療的大鼠中比目魚肌的疲勞特性。(A)示出由比目魚肌產(chǎn)生的比力以及(B)示出力，其表示為產(chǎn)生的初始力的％。在間歇收縮的2分鐘時間段內(nèi)，通過在40Hz的頻率下(預(yù)定為F_max)，刺激肌肉2秒并停止2秒，來確定肌肉疲勞。在疲勞方案期間，以20秒間隔，來測量力。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。通過雙向ANOVA進行分析。n＝10；**p<0.001t＝0分鐘；PG相對于PLA；***p<0.0001t＝0分鐘相對于t＝120分鐘PLA；PG。

圖8示出在疲勞以前以及在疲勞以后5和20分鐘的強直性力產(chǎn)生(tetanic force production)。通過在其超最大電壓(supra-maximal voltge)下在40Hz的頻率下，刺激肌肉來產(chǎn)生強直性收縮(tetanic contraction)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；通過雙向ANOVA進行分析；n＝10；*p<0.05PLA相對于PG(疲勞前)；**p<0.001PLA相對于PLA(5分鐘相對于20分鐘)；PG相對于PG(5分鐘相對于20分鐘)；***p<0.0001PLA相對于PLA(疲勞前相對于5分鐘)；PG相對于PG(疲勞前相對于5分鐘)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的第一實施方式，提供了用于治療或增強受試者的肌肉組織的組合物，所述組合物包含來自腺牧豆或其提取物的植物材料。

植物材料可以是來自腺牧豆植物的任何部分，如葉、花、根、莖、樹皮、種子等。優(yōu)選地，植物材料是來自腺牧豆的種子莢(seed pod)，以及甚至更優(yōu)選地，植物材料是來自已被干燥和研磨的種子莢。

所述組合物可以進一步包含藥用賦形劑、粘合劑、佐劑或填料。

所述組合物可以為口服制劑的形式，如以下形式：片劑、舌下片劑、糯米紙囊劑(wafer)、香囊、膠囊、懸液、糖漿、粉末、液體飲料或可食用條(edible bar)。可替換地，所述組合物可以為局部制劑的形式，如懸液、凝膠、乳膏(cream)或軟膏(ointment)，其可以施加于肌肉組織的區(qū)域中的皮膚。所述組合物還可以為注射制劑的形式。所述組合物還可以為營養(yǎng)或膳食補充劑(supplement)的形式。

待治療或增強的肌肉組織優(yōu)選是骨骼肌。

在一種實施方式中，所述組合物是用于預(yù)防、最小化或治療肌肉損傷，如直接沖擊傷(direct impact injury)。所述直接沖擊傷可以是挫傷(contusion injury)。

在另外的或可替代的實施方式中，所述組合物可以用于增強肌肉力量(muscle strength)。

所述受試者可以是人。

可以旨在以約50至約200mg/kg/天的腺牧豆，如約100mg/kg/天，的每日劑量，將所述組合物給予受試者。

根據(jù)本發(fā)明的第二實施方式，提供了腺牧豆或其部分或提取物在制造用于治療或增強受試者的肌肉組織的藥物的方法中的用途。

所述藥物可以是基本上如上所述的組合物。

根據(jù)本發(fā)明的第三實施方式，提供了用于治療或增強受試者的肌肉組織的方法，所述方法包括將來自腺牧豆或其提取物的植物材料給予受試者的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的第四實施方式，提供了用于預(yù)防、治療或最小化受試者的肌肉損傷的方法，所述方法包括將來自腺牧豆或其提取物的植物材料給予受試者的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的第五實施方式，提供了用于增加受試者的肌肉力量的方法，所述方法包括將來自腺牧豆或其提取物的植物材料給予受試者的步驟。

具體實施方式

本文描述了來自腺牧豆(Prosopis glandulosa(Torr.)[Fabaceae])樹(俗稱牧豆樹(Honey mesquite))的植物材料的用途。所述植物材料通常是來自該樹的干燥和研磨莢，但還可以來自該樹的其它部分，如葉、樹皮或根。

由于它們的高蛋白質(zhì)含量，北美沙漠的西南地區(qū)的居民已傳統(tǒng)上將腺牧豆的莢用作食品或一般食品補充劑(general food supplement)[Simpson,1977；Zimmermann,1991]。這種植物品種常見于南非的北部和西北部開普(Cape)的干燥、干旱地區(qū)[Jurriaanse,1973；Harding,1987]，但由于其侵入性的潛力，按照1983年的農(nóng)業(yè)資源保護法(Conservation of Agricultural Resources Act of 1983)(1983年第43號法案(Act No.43of 1983))，現(xiàn)在分類為第2類入侵者(invader)[Zimmermann,1991]。

對于腺牧豆植物已經(jīng)進行了很少的研究并且可以尋到的關(guān)于其潛在臨床益處的僅有的文獻是來自申請人自己的關(guān)于糖尿病和心血管健康的研究[26,27,George et al.,2011；Huisamen et al.,2012]。申請人不知道關(guān)于腺牧豆對在損傷以后的力生成(force generation)、疲勞耐受性或肌肉恢復(fù)的影響的任何文獻。

申請人現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，腺牧豆的給予導(dǎo)致肌肉力量的增加并且還有效用于肌肉損傷和炎癥的損傷前和/或損傷后治療。因此，來自腺牧豆的材料可以用于輔助運動能力(aiding sporting ability)，用于膳食或營養(yǎng)補充劑中以增強肌肉功能或性能，作為預(yù)防性慢性補充劑來用于預(yù)防或最小化肌肉損傷，或作為急性治療應(yīng)用，用于在損傷后的治療或加快恢復(fù)。

軟組織損傷是很常見的，占所有運動損傷的35％至55％[1]。軟組織損傷可以導(dǎo)致顯著的疼痛、腫脹和青腫(bruising)，并最終導(dǎo)致受影響肌肉的延遲和受損的功能[2]。肌肉損傷的病理生理學(xué)是一個復(fù)雜的過程，經(jīng)歷一系列的重疊階段，其包括纖維性瘢痕組織(fibrotic scar tissue)的退化(degeneration)、發(fā)炎、再生和形成[3,4,5,6]。對骨骼肌的損傷不僅傷害肌細(xì)胞，而且可能導(dǎo)致毛細(xì)血管破裂、浸潤性出血(infiltrative bleeding)、發(fā)炎、氧化應(yīng)激和纖維化，其取決于損傷的程度。發(fā)炎是這些過程的中心，其中炎性細(xì)胞因子主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞環(huán)境，從而在很大程度上控制其它修復(fù)過程的進展。

最近幾年，研究人員已集中于炎癥的操作以加速肌肉再生，例如，通過靶向在發(fā)炎階段激活的免疫細(xì)胞[7,8]。響應(yīng)于趨化信號，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞進入損傷的部位，并吞噬局部碎片[5,9,10]。中性粒細(xì)胞，連同巨噬細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞一起，釋放氧自由基，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激和對未受原發(fā)性損傷(primary injury)影響的周圍組織的直接損害，其導(dǎo)致繼發(fā)性肌肉損傷(secondary muscle damage)。然而，即使巨噬細(xì)胞的早期表型部分有助于炎癥應(yīng)答的可持續(xù)性以及因而有助于繼發(fā)性損害，但這些細(xì)胞還分泌各種生長因子，其直接促進組織修復(fù)和再生[5,11]。另外，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均刺激T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子(IL-1、IL-6、IL-8)和其它趨化因子，其不可避免地導(dǎo)致衛(wèi)星細(xì)胞的招募(recruitment)，因此具有用于肌肉再生的更大能力(capacity)[5,12,13]。因此明顯的是，炎癥應(yīng)答，即使是對繼發(fā)性損害的貢獻者，對于在損傷以后骨骼肌的修復(fù)是至關(guān)重要的。因此，在該總過程被長期嚴(yán)重減弱(blunt)的情況下，如通過非甾體抗炎藥(NSAID)治療，則潛在臨床結(jié)果可能不是最佳的，從而導(dǎo)致延遲和/或不完全的組織愈合、以及過度瘢痕形成，其會增加損傷復(fù)發(fā)的風(fēng)險。有證據(jù)表明，借助于前列腺素抑制劑(NSAID)，對環(huán)氧化酶-2途徑的長期抑制(連續(xù)7天以上)會損害肌肉修復(fù)[4,14,15]。除使用NSAID之外，還存在各種其它肌肉損傷治療選項，如RICE方法(休息、冰、加壓(compression)和提升(elevation))[4,16,17,18]、治療性超聲波[19,20]、高壓氧療(hyperbaric oxygen therapy)[21]和生長因子的使用[22]。然而，這些療法仍然不是最佳的，因為在許多情況下它并不轉(zhuǎn)化為增加肌管形成，因此并不增強肌肉愈合[19,20]或可能與嚴(yán)重的風(fēng)險和副作用相關(guān)[23]。

身體疲勞，還被稱為外周性疲勞，表示為在長時間活動期間的肌肉性能劣化[Roots et al.,2008；Fitts,1994]。這種力的減小是可逆的，因為在充足休息和適當(dāng)營養(yǎng)以后可以恢復(fù)肌肉性能。

由兩個主要因素來確定肌肉力量生成的大小，即，(i)招募以產(chǎn)生力的肌肉的大小和(ii)肌纖維類型[Maughan et al.,1983；Lee et al.,2013]。在收縮期間的力生成與在肌動蛋白和肌球蛋白鏈之間進行的交聯(lián)的數(shù)目相關(guān)[Fitts et al.,1991]。因此，形成的交聯(lián)越多，則收縮力越強。因此，最大收縮力取決于肌肉含有的纖維的數(shù)目。纖維類型也起著重要作用，因為不同類型的肌纖維具有不同的收縮性能[Schaiffino and Reggiani,2011]。已知，由高比例的慢縮(slow-twitch)(I型)纖維組成的肌肉將比具有高比例的快縮(fast-twitch)(II型)纖維的相似尺寸的肌肉相對更弱。響應(yīng)于體力活動、環(huán)境和病理狀況的變化來調(diào)節(jié)纖維組成[Schiaffino et al.,2007]，例如，耐力運動訓(xùn)練誘導(dǎo)快至慢纖維類型轉(zhuǎn)換，從而將肌纖維轉(zhuǎn)化到增加的氧化代謝[Demirel et al.,1999；Pette and Staron,2001；Yuan et al.,2011]。導(dǎo)致纖維類型轉(zhuǎn)變的另外的因素包括機械負(fù)載和卸載、激素和衰老[Pette and Staron,2001]。

這項研究的數(shù)據(jù)表示，腺牧豆治療可能證明是有益的，作為補充劑，幫助身體能力，以及導(dǎo)致在挫傷以后比沒有治療或用NSAID進行治療更加有效的肌肉修復(fù)。

在南非，腺牧豆被分類為入侵樹，以及可能在其他國家也是如此的事實說明這些發(fā)現(xiàn)的民族藥理學(xué)意義。經(jīng)濟的、自然的和易得的物質(zhì)用作治療可能不僅在體育競技場和衛(wèi)生部門而且在植物和野生動物保護方面均產(chǎn)生深遠的影響。

現(xiàn)在將通過以下非限制性實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

實施例1：腺牧豆用于軟組織損傷的預(yù)防和治療應(yīng)用

研究了腺牧豆作為在挫傷以后的可能的損傷前和/或損傷后治療選項。研究了對中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞滲入受傷部位的影響，以及在肌肉再生的情況下的相關(guān)后果。在肌肉損傷和炎癥的治療中常用的公認(rèn)的NSAID(雙氯芬酸(diclofenac))用作比較對照。

材料和方法

動物

將年齡匹配和體重匹配的成年雄性Wistar大鼠分為四個主要組，即：(1)對照安慰劑(PLA)；(2)PG-CHR，在損傷前以及在損傷后用腺牧豆治療8周直到處死的時候的動物；(3)PG-AI，在損傷以后用腺牧豆治療(首次治療，在損傷以后2小時)，直到處死的時候的動物以及(4)NSAID，在損傷以后直接用Voltaren(雙氯芬酸)治療，直到處死的時候的動物。所有四個組細(xì)分為處死以及t＝0小時(損傷前)、損傷后1小時、3小時、1天和7天的數(shù)據(jù)收集時間點。每個主要組具有n＝25，即，5只大鼠/時間點/組(共計100只大鼠)。

在方案開始時，在不同實驗組中的大鼠的體重進行匹配(PLA：456.47±9.74g；PG-CHR：445.98±11.21g；PG-AI：439.12±14.84g；NSAID：442.25±12.58g)。

腺牧豆和雙氯芬酸治療

僅由干研磨的腺牧豆莢組成的腺牧豆粉用于此實驗[26]。為了準(zhǔn)備治療，為在治療組中的每只動物每天稱重來自P.Schoeman的腺牧豆粉并設(shè)置成1mL體積的可商購的明膠/果凍立方體的混合物。單獨地用這些果凍立方體(cube)來喂養(yǎng)每只動物8周，以確保絕對順從性(compliance)和劑量控制(dose control)?；跒槌扇艘?guī)定的每日劑量(可商購的食品補充劑)來計算100mg/kg/天腺牧豆的劑量。本申請人先前已表明，此劑量會在大鼠中引發(fā)有益的代謝變化[26,27]。在8周實驗期期間，對照動物接受安慰劑果凍立方體。

雙氯芬酸，已知的NSAID，作為用于治療的抗炎作用的陽性對照。在損傷后的不同的時間段以后，將形式為來自Novartis的Voltaren的雙氯芬酸鈉局部應(yīng)用于在大鼠的后肢上的受傷部位。Voltaren的劑量計算為57.14mg/kg/天，其等于0.57mg/kg雙氯芬酸。基于為成人規(guī)定的每日劑量來計算該劑量。

實驗肌肉挫傷的引起和樣品收集

利用由Stratton et al.(1984)[28]首先描述的并由Myburgh和同事(2012)[7]為我們的實驗室優(yōu)化的質(zhì)量下降模型損傷(mass-drop model injury)來對大鼠后肢產(chǎn)生挫傷。簡要地說，該技術(shù)需要從50cm的高度將200g重物落到戊巴比妥鈉(40mg/kg，腹腔內(nèi))麻醉大鼠的右腓腸肌的內(nèi)側(cè)面上。這種挫傷是中度嚴(yán)重，并不導(dǎo)致骨損傷或影響受傷動物的步態(tài)。

為了樣品收集，通過戊巴比妥鈉過量(200mg/kg，腹腔內(nèi))來安樂死大鼠并收獲損傷的腓腸肌的中央部分。將收獲的肌肉分為兩部分，一部分經(jīng)處理用于免疫組織化學(xué)分析，而另一部分則快速凍結(jié)(snap-freeze)用于蛋白質(zhì)印跡分析。

肌肉組織學(xué)和免疫組織化學(xué)

對于橫斷面組織學(xué)和免疫組織化學(xué)，將肌肉固定在10％甲醛生理鹽水(formal saline)中，處理并包埋在石蠟中。制備5微米厚橫截面(Leica RM 2125RT microtome,Nussloch,德國)并用蘇木精和曙紅(H&E)加以染色，用于定性組織學(xué)分析。

用完全自動化Leica Bond-Max Autostainer系統(tǒng)(Leica Microsystems,德國)并利用板載檢測試劑盒(onboard detection kit)(其包括Bond Epitope Retrieval Solution、過氧化物嵌段(peroxide block)、一抗、后主要試劑(post primary reagent)、Bond Wash溶液和Bond Polymer[29,30])，借助于小鼠抗大鼠His48(中性粒細(xì)胞；1:200；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)、山羊抗小鼠F4/80(巨噬細(xì)胞；1:200；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)和兔抗人結(jié)蛋白(1:200；Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)抗體來進行免疫染色。DAB(3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽)用作色素原(chromogen)(Leica Microsystems,德國)。在整個研究中使用適當(dāng)?shù)年栃詫φ铡?/p>

圖像分析

對于每種抗體，在每個時間點，通過分析來自每個肌肉樣品的兩個切片來獲得所有成像數(shù)據(jù)。利用裝備有彩色數(shù)碼相機(Nikon 5.0Mega Pixels Color Digital Camera head DS-Fi2)的顯微鏡(Nikon ECLIPSE E400，使用了400x物鏡)，在受傷部位中，成像5個視場(field of view)/切片。在本文中呈現(xiàn)的圖像僅是在200×放大率下獲取的那些圖像的部分圖像。照片用來計數(shù)陽性標(biāo)記的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和結(jié)蛋白染色。手動計數(shù)免疫細(xì)胞并利用NIS-Elements BR成像軟件包，表示為在受傷部位中陽性標(biāo)記的免疫細(xì)胞/視場(350μm2)的平均數(shù)。為了細(xì)胞被分類為真正的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，它必須分別具有多葉核或單核，并具有周圍細(xì)胞質(zhì)。

蛋白質(zhì)印跡

通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)來確定蛋白質(zhì)水平[26]。簡要地說，從腓腸肌組織提取蛋白質(zhì)，在SDS聚丙烯酰胺凝膠上加載和分離相等濃度的總蛋白，并電轉(zhuǎn)移到ImmobilonTM-P PVDF膜。麗春紅(Ponceau red)可逆染色用來確定蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效率。在ADAM₁₂一抗(1:5000；Abeam,英格蘭,英國)中溫育膜過夜。為了檢測，使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗(1:4000；Amersham Life Sciences,Sandton,JHB，南非)。利用ECL檢測試劑(Amersham Life Sciences,Sandton,JHB，南非)來可視化抗原-抗體復(fù)合物并暴露于放射自顯影膠片(Hyperfilm ECL,RPN 2103)，然后檢測光發(fā)射。通過密度法(UN-SCAN-IT；Silk Scientific Inc.,Utah,UT,美國)來分析所有膠片并以任意單位(AU)來表示歸一化數(shù)據(jù)。在所有情況下，通過在0.2M NaOH中溫育來剝離膜，并用抗β-微管蛋白的抗體(1:1000；Cell Signalling Technology,Beverley,MA,美國)再印跡以證實橫過測試樣品的蛋白質(zhì)負(fù)荷的均勻性。

統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。通過雙向ANOVA，接著Bonferroni事后檢驗，來分析統(tǒng)計顯著性。p<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計顯著的。利用GraphPad Prism版本5來進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

結(jié)果

慢性腺牧豆治療加速肌肉超微結(jié)構(gòu)的修復(fù)

挫傷后纖維結(jié)構(gòu)的定性微觀分析表明，不論是否治療，對肌腹的鈍力(blunt force)會顯著損壞和破壞骨骼肌纖維，從而導(dǎo)致在損傷以后的1小時和3小時在間質(zhì)空間(interstitial space)中的紅細(xì)胞累積(圖1B、E、H、K)。沒有包括在損傷以后的1小時的代表性圖片，因為不能在視覺上容易地識別在損傷后1和3小時之間的差異。在治療組和未治療組中均存在水腫，其由在早期時間點的纖維之間的間質(zhì)空間的加寬得到證實。在安慰劑(PLA)和治療組之間的組織學(xué)比較說明了在所有四個組中在損傷后1天免疫細(xì)胞的顯著流入。然而，當(dāng)與所有其它組相比時，在用腺牧豆(PG-CHR)慢性治療的組中，這種流入是相對有限的。在PLA、損傷后治療組(PG-AI)和非甾體抗炎治療(NSAID)組的受傷部位中免疫細(xì)胞仍然是可見的最長達損傷后第7天(圖1D、J、M)，但是在相同時間點在PG-CHR組中則是不可檢測的(圖1G)。到第7天，僅慢性治療的腺牧豆組(圖1G)呈現(xiàn)接近正常的肌肉結(jié)構(gòu)，其指示成功進行肌肉再生。

腺牧豆治療鈍化了對挫傷的中性粒細(xì)胞應(yīng)答

關(guān)于中性粒細(xì)胞滲入，在各種實驗組之間，明確的差異是明顯的。在損傷以前，在任何實驗組中，不存在中性粒細(xì)胞，而挫傷導(dǎo)致在損傷以后第1天中性粒細(xì)胞的顯著的(在30和40倍之間)瞬時升高，到損傷后第7天，其正?；?p<0.0001)(圖2)。與未治療組(PLA)相比，在損傷后第1天，PG-CHR(p<0.0001)、PG-AI(p<0.001)以及NSAID治療組(p<0.0001)顯示顯著較低數(shù)量的中性粒細(xì)胞。此外，在這三個治療組中，如在損傷后第1天所評估的，中性粒細(xì)胞(neutrophil)應(yīng)答的大小是相似的。

腺牧豆治療并不影響對挫傷的巨噬細(xì)胞應(yīng)答

如同中性粒細(xì)胞數(shù)據(jù)，在未受損傷的對照樣品中，巨噬細(xì)胞的存在是不可檢測的(圖3)。在評估的時間點中，在所有四個實驗組中，在受傷部位中存在的巨噬細(xì)胞峰值數(shù)(peak number)(p<0.001)是在損傷以后的1天。到損傷以后的第7天，這些增加的值再次正?；?p<0.001)。在評估的時間點，似乎沒有治療具有對巨噬細(xì)胞滲入的任何作用。

響應(yīng)于慢性腺牧豆治療，增強了ADAM₁₂表達

按照蛋白質(zhì)印跡分析，自損傷后3小時起，衛(wèi)星細(xì)胞增殖標(biāo)記，ADAM₁₂，的表達顯著升高(p<0.0001)并且這種顯著升高保持至少24小時(p<0.0001)，其中，在所有實驗組中，在損傷以后的第7天，表達再次正?；轿词軗p傷的水平(p<0.0001)(圖4A、B)。在評估的所有三種治療中，當(dāng)與PLA組比較時，用腺牧豆(PG-CHR)進行8周慢性治療在損傷后的第1天顯示最顯著的效果，具有ADAM₁₂的顯著增加的(p<0.05)表達。當(dāng)與PLA比較時，雖然損傷后治療(PG-AI)似乎在第3小時時抑制ADAM₁₂表達，但它伴隨ADAM₁₂表達的顯著增加(3至1天)。在3小時時，NSAID治療與類似抑制的ADAM₁₂表達關(guān)聯(lián)，但借助于這種治療，在損傷以后1天保持相對抑制。確實，與慢性治療的腺牧豆組相比，在損傷后的3小時和1天，NSAID組均表達較低水平的ADAM₁₂，對于后者顯著如此(p<0.001)。為了清楚起見，在每個實驗組中在不同時間點之間觀測到的統(tǒng)計差異示于圖4C。

響應(yīng)于慢性腺牧豆治療增加了結(jié)蛋白表達

發(fā)現(xiàn)在損傷以后結(jié)蛋白表達穩(wěn)步增加，其中在所有四個不同實驗組中，最高值是在7天損傷后時間點。在7天損傷后時間點時，與所有其它組相比，慢性治療的腺牧豆組(PG-CHR)顯示顯著升高的結(jié)蛋白表達(圖5)。雖然損傷后腺牧豆治療對結(jié)蛋白的表達沒有影響，但當(dāng)與所有其它組相比時，NSAID治療組顯示顯著降低的結(jié)蛋白表達，指示延遲的再生。

討論

發(fā)現(xiàn)慢性腺牧豆治療顯著減少中性粒細(xì)胞滲入受傷部位，暗示減少的促炎信號和可能更少中性粒細(xì)胞相關(guān)的繼發(fā)性損害。為支持這種解釋，觀測到ADAM₁₂(損傷后第1天)和結(jié)蛋白(損傷后第7天)的表達的相關(guān)的顯著增加，這提示增強的再生過程。

在腺牧豆治療和NSAID治療之間的較大差異是明顯的。

先前在體內(nèi)模型中沒有測量在損傷以后在不同時間點時在腓腸肌中的ADAM₁₂表達的水平。以下事實(即相對于PLA，在早期時間點時，慢性腺牧豆治療增加ADAM₁₂表達)表明通過增強早期增殖，所述治療可以促進更有效的恢復(fù)。與之形成鮮明對比，NSAID治療導(dǎo)致顯著抑制的ADAM₁₂表達(尤其是在3小時時)，其指向?qū)π迯?fù)的抑制作用。依據(jù)結(jié)蛋白應(yīng)答，這種不希望的效果也是明顯的。

結(jié)蛋白水平在肌生成期間通常顯著增加并在新成熟的肌纖維中保持上升[49]，這解釋了在我們的方案的時間過程中的相對較晚的應(yīng)答。在第7天，以及依據(jù)提示更有效的肌纖維修復(fù)的其它數(shù)據(jù)，在慢性腺牧豆治療以后，結(jié)蛋白表達是顯著較高的。相比之下，在NSAID治療以后，結(jié)蛋白表達顯著低于PLA，再次指向NSAID對修復(fù)的抑制作用，如在文獻[3]中所建議的。

實施例2：腺牧豆對肌肉力量的影響

通過電刺激來自大鼠的分離的比目魚肌，研究了腺牧豆對疲勞的影響以及確定了在疲勞期以后的恢復(fù)程度以及在具有和沒有腺牧豆治療的情況下力量發(fā)展的大小。

材料和方法

化學(xué)品

使用的所有化學(xué)品均購買自Merck(Pty)Ltd，南非。腺牧豆制劑是如在實施例1中所描述的。

腺牧豆治療方案

用腺牧豆粉，以100mg/kg/天的劑量來治療大鼠，總共10周。每天為在治療組中的每只動物稱重腺牧豆并設(shè)置在1ml體積的可商購的明膠/果凍立方體的混合物中。單獨地用這些果凍立方體喂養(yǎng)每只動物，以確保絕對順從性和劑量控制?；跒槌扇艘?guī)定的每日劑量來計算100mg/kg/天腺牧豆的劑量，其先前已由本申請人說明以引起代謝變化[George et al.,2011；Huisamen et al.,2012]。為使動物習(xí)慣于研究者和果凍立方體的味道，在開始實際治療程序以前，給所有動物喂養(yǎng)安慰劑果凍立方體(沒有腺牧豆的果凍立方體)1周。在8周實驗期期間，對照動物接受安慰劑果凍立方體。

分組

將年齡和體重匹配的雄性Wistar大鼠分為2組：對照安慰劑組(PLA)，其接收正常大鼠食物顆粒和沒有腺牧豆的果凍立方體，以及腺牧豆組(PG)，其接收正常大鼠食物和混入果凍立方體中的腺牧豆(在每個組中n＝10)。采用總共20個分離的肌肉，即，10只動物/實驗組(治療相對于無治療)。

處死和樣品收集

在腺牧豆治療10周以后，稱量動物(以確定體重)，然后接收過量的戊巴比妥鈉(200mg/kg，腹腔內(nèi))。持續(xù)監(jiān)測動物直到失去知覺，其由在捏腳(foot pinch)以后完全缺乏反應(yīng)所指示。

肌肉疲勞刺激方案

通過先前由Gordon et al.(2010)的El-Khoury et al.(2012)描述的方法來確定骨骼肌疲勞。在用過量的戊巴比妥鈉(200mg/kg，腹腔內(nèi))來安樂死動物以后，除去具有完整的腱插入物(tendinous insertion intact)的比目魚肌中的一個，并放入冰冷的Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)中。KHB溶液含有(以mM為單位)：NaCl 119、KCl 4.74、CaCl₂.2H₂O 1.25、MgSO₄.7H₂O 0.6、KH₂PO₄ 1.2、NaHCO₃ 24.9、Na₂SO₄ 0.6和葡萄糖10。然后從冷KHB緩沖液移開完整的比目魚肌并垂直懸在一對鉑電極之間(在含有KHB溶液的25ml水夾套的器官浴(organ bath)中)。連續(xù)充氣(95％O₂/5％CO₂)KHB以保持pH在7.4下并將KHB的溫度保持在25℃下。體外大鼠骨骼肌的生理穩(wěn)定性是溫度依賴性的，以及，與37℃的體內(nèi)溫度相比，直徑為1-2mm的肌條的穩(wěn)定性在25℃下是更好的[Segal et al.,1986]。將肌肉的基底(base)固定于不動鉤并將另一端系連于等長力傳感器(isometric force transducer)?？梢酝ㄟ^微定位器來調(diào)節(jié)力傳感器的位置，因而改變預(yù)載。在開始電刺激以前，讓肌肉穩(wěn)定30分鐘。

在30分鐘的平衡期以后，確定最佳長度(即，產(chǎn)生最大等長抽搐力(maximal isometric twitch force)的肌肉長度)和超最大電壓(supramaximal voltage)。通過分別在增加的肌肉長度和電壓下來生成單一抽搐收縮(twitch contraction)，直至觀測不到單一抽搐力(single-twitch force)生產(chǎn)的增加，來確定針對每個肌肉的這些參數(shù)。然后在整個刺激方案中使用產(chǎn)生最高單抽搐幅度的肌肉長度和電壓。對于所有抽搐(twitch)和強直性(tetanic)收縮，脈沖持續(xù)時間設(shè)置為1毫秒。所述刺激方案構(gòu)成如下：生成單一抽搐、用于確定F_max強直收縮(tetanus)的力頻率曲線、用于確定耐疲勞性的2分鐘刺激期以及在疲勞以后的5和20分鐘時借助于兩組強直收縮刺激來結(jié)束(end off)。利用在增加的脈沖頻率下的簡短的反復(fù)刺激(1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100Hz 3秒，允許在每個刺激之間的2分鐘恢復(fù)間隔)來確定F_max。使用此方案為每只動物達到的最大力被認(rèn)為是F_max。在F_max確定以后的10分鐘休息期以后，經(jīng)2分鐘期間的間歇收縮，在40Hz(預(yù)定為F_max)的頻率下，刺激肌肉2秒并停止2秒，來確定肌肉疲勞率。在疲勞期間，在20秒間隔下測量力。在疲勞方案以前(BF)和以后(AF)，確定抽搐幅度(twitch amplitude)(力)、收縮時間(到峰值張力的時間)和半松弛時間(峰值力衰減50％的時間)。收縮時間(至峰值張力的時間)被定義為從單一抽搐的基底到峰值所流逝的時間。半松弛時間被定義為從單一抽搐的峰值到一半返回到基線的抽搐幅度的點所流逝的時間。通過AD Instruments Bridge Amp和Powerlab 4/30來收集所有肌肉功能數(shù)據(jù)，并用Chart5PowerLab軟件(ADInstruments,Inc.,Colorado Springs,CO)加以分析。

以N/cm²的肌肉橫截面積為單位來計算比力。通過肌肉的干重除以最佳長度和肌肉密度(假定是1.056g/cm³)的乘積來近似后者。利用已知重量來校準(zhǔn)力傳感器。將收縮時間和半松弛時間測量為等長抽搐動力學(xué)(isometric twitch kinetics)的指數(shù)。對于疲勞方案，通過將在每個20秒時間點產(chǎn)生的力表示為在疲勞試驗開始時的初始力的百分比來歸一化數(shù)值。

統(tǒng)計分析

除非另有說明，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)。通過學(xué)生t檢驗來評估兩組之間的統(tǒng)計顯著性，以及兩組或更多組之間，使用雙向ANOVA，接著Bonferroni事后檢驗。p<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計顯著的。利用GraphPad Prism 5來進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

結(jié)果

腺牧豆治療對體重和肌肉生物測定的影響

在10周腺牧豆治療的開始時，大鼠進行體重匹配，以及發(fā)現(xiàn)治療對體重增加沒有影響。骨骼肌生物測定(biometrics)(質(zhì)量、最佳長度和寬度)，其是力輸出的關(guān)鍵決定因素，沒有顯示在治療組和未治療組之間的顯著差異(表1)。在本質(zhì)上，PLA和PG的比目魚肌在生物測量學(xué)上是相似的。

表1：在腺牧豆治療以后實驗動物的生物測量特征

數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；通過學(xué)生t檢驗進行分析；n＝10

比目魚肌的收縮性能

當(dāng)比較PLA(BF)與PLA(AF)以及PG(BF)與PG(AF)時，肌肉疲勞的引起導(dǎo)致由比目魚肌產(chǎn)生的抽搐力和峰強直性力的顯著降低。因此，作為結(jié)果，與疲勞前相比，在疲勞以后，抽搐/強直收縮比顯著減小。盡管隨之而來的疲勞，但收縮時間不受腺牧豆治療的影響，并一直保持恒定。十周的腺牧豆治療充分增加了由比目魚肌所產(chǎn)生的力，如由在基線(PG(AF)相對于PLA(AF))處的顯著升高的抽搐力和峰強直性力生產(chǎn)所說明的。與未治療的對照相比，腺牧豆治療還導(dǎo)致疲勞后顯著增加的半松弛時間(表2)。

表2：在疲勞以前和在疲勞以后來自對照與腺牧豆治療的大鼠的比目魚肌的收縮性能

數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM；通過雙向ANOVA進行分析；n＝10

力-頻率關(guān)系

力-頻率關(guān)系(其是在肌肉激活頻率和隨之而來的等長力輸出之間的S形(sigmoid)關(guān)系)，對于在治療組和未治療組中的肌肉，顯示類似的趨勢。這種趨勢示于圖6(B)，表示在每個頻率下產(chǎn)生的力，其表示為產(chǎn)生的最大力的％。相比之下，在不同頻率下產(chǎn)生的力的絕對值表明與未經(jīng)治療大鼠相比，在所有不同頻率下，在電刺激期間，經(jīng)治療大鼠的比目魚肌產(chǎn)生顯著更大的力(P<.001)。如圖6(A)所示，由未經(jīng)治療大鼠的比目魚肌產(chǎn)生的力逐步從在5Hz的頻率下的15.34±2.92N/cm²增加到在40Hz的頻率下的47.77±5.73N/cm²的最大力，其后產(chǎn)生的力緩慢下降到在100Hz的頻率下等于38.55±6.27N/cm²的力。經(jīng)治療大鼠跟隨類似的趨勢，但在顯著更高水平。在慢慢下降到在100Hz的頻率下的53.48±6.41N/cm²的力以前，由腺牧豆治療的大鼠的比目魚肌產(chǎn)生的力逐步從在5Hz的頻率下的24.37±3.18N/cm²增加到在40Hz的頻率下的61.65±5.05N/cm²的最大力。在40Hz的頻率下，在兩組中，產(chǎn)生的力的水平達到最大值。

疲勞特性

2分鐘間歇性刺激(疲勞方案)足以顯著降低由治療組和未治療組產(chǎn)生的力至少50％。換句話說，在2分鐘疲勞方案以后測得的力是50％低于在疲勞的引起以前所測得的力(18.03±3.36相對于42.62±5.00N/cm²；P<.0001)[圖7B]。腺牧豆治療不能降低疲勞耐受性，因為在治療組相對于未治療組之間，在2分鐘疲勞方案期間的任何點，疲勞發(fā)展不是顯著不同的。然而，當(dāng)與未治療組相比時，在治療組中產(chǎn)生的初始力是顯著較高的(56.39±4.21相對于42.62±5.00N/cm²；P<.001)。

在疲勞以前和在疲勞以后的收縮性能

當(dāng)比較PLA(BF)與PLA(AF)以及PG(BF)與PG(AF)時，肌肉疲勞的引起導(dǎo)致由比目魚肌產(chǎn)生的抽搐力和峰強直性力的顯著降低。因此，作為結(jié)果，與疲勞前相比，在疲勞以后抽搐/強直收縮比顯著減小。盡管隨之而來的疲勞，但收縮時間不受腺牧豆治療的影響，一直保持恒定。十周的腺牧豆治療充分增加了由比目魚肌產(chǎn)生的力，如由在基線(PG(AF)相對于PLA(AF))處顯著升高的抽搐力和峰強直性力生產(chǎn)所說明的。與未治療的對照相比，腺牧豆治療還導(dǎo)致疲勞后顯著增加的半松弛時間[表2]。

討論

在這項研究中，本申請人檢查了在健康大鼠的電場刺激期間腺牧豆對比目魚肌的可能的強度增加影響。疲勞前以及在疲勞以后5分鐘和20分鐘產(chǎn)生強直性力(圖8)。從此數(shù)據(jù)可以清楚地看出，在疲勞方案以后5分鐘產(chǎn)生的力顯著低于疲勞前產(chǎn)生的力。這是一個良好的跡象，在疲勞方案后，肌肉確實被耗盡(exhaust)。然而，在20分鐘休息期以后，比目魚肌可以恢復(fù)其力量，如圖8所示。在疲勞以后20分鐘，產(chǎn)生的力如同初始力(疲勞前)。

在運動誘發(fā)疲勞期間還變化的另一個方面是肌肉松弛的放緩[Allen et al.,2008]。在本研究中，在對照組或治療組中，在疲勞以前和在疲勞以后，在半松弛時間的初始階段中不存在顯著差異(表2)。然而，當(dāng)用腺牧豆治療大鼠16周并電刺激至疲勞(PG(AF))時，在疲勞以后5分鐘(PLA(AF))，它們的比目魚肌以比未經(jīng)治療大鼠的比目魚肌顯著更慢的速率進行松弛(表2)。

重要的是，在疲勞的引起以前，當(dāng)刺激肌肉以產(chǎn)生單一抽搐或強直收縮時，經(jīng)治療大鼠(PG)的比目魚肌產(chǎn)生顯著較高的力(表2)。在力-頻率關(guān)系確定期間觀測到同樣的現(xiàn)象。如圖6(A)所示，由未經(jīng)治療大鼠的比目魚肌產(chǎn)生的力逐步增加以達到其在40Hz下的最大力，此后，產(chǎn)生的力再次緩慢下降。雖然在治療組中觀測到類似的趨勢，但在所有不同頻率下，由經(jīng)治療大鼠的比目魚肌產(chǎn)生的比力是顯著較高的(圖6(A))。圖6(B)(其示出在每個頻率下所產(chǎn)生的最大力的％)，示出類似的趨勢，其中在相應(yīng)的頻率下被刺激以后治療和未治療的比目魚肌均產(chǎn)生力。當(dāng)與疲勞以后(5分鐘)直接產(chǎn)生的力比較時，在對照(PLA)和治療(PG)組中，20分鐘休息期允許肌肉恢復(fù)大部分的其初始力。已知，運動誘發(fā)疲勞是可逆的，以及在適度的休息期以后，肌肉能夠生成和疲勞前所生成的力相同的力[Allen et al.,2008]。因此，可以假設(shè)，如果讓肌肉完全恢復(fù)，則在這項研究中看到的對力的增強的影響將持續(xù)。

主要通過肌肉的大小和肌纖維類型來確定肌肉力量生成的大小[Maughan et al.,1983；Lee et al.,2013]。在這項研究中，在不同實驗組中沒有發(fā)現(xiàn)生物測定的顯著差異，即，肌肉的重量、長度和寬度，因此肌肉似乎是表型上相似的(表1)。肌肉力量增加的可能的解釋可能是，腺牧豆治療導(dǎo)致肌纖維類型的轉(zhuǎn)變，即從慢縮表型到快縮表型。已知，不是所有肌纖維都是一樣的，以及它們的差異在于許多因素如代謝、收縮持續(xù)時間以及發(fā)展最大張力所需的時間。骨骼肌纖維主要分為三類，氧化慢縮纖維(oxidative slow-twitch fiber)、氧化快縮纖維(oxidative fast-twitch fiber)和糖酵解快縮纖維(glycolytic fast-twitch fiber)。按照獲自本研究的結(jié)果，看樣子似乎是，轉(zhuǎn)變是從氧化慢縮表型到氧化快縮表型。關(guān)于疲勞發(fā)展，氧化慢縮纖維和氧化快縮纖維類似地反應(yīng)，即，均發(fā)現(xiàn)它們是"耐疲勞的"[Sllverthorn,2004]。在這項研究的數(shù)據(jù)中還可以看到關(guān)于疲勞發(fā)展的這種相似性，因為在治療組和未治療組之間沒有觀測到顯著差異。這些肌肉以相同的速率疲勞。此外,氧化快縮纖維發(fā)展最大張力所需的時間是比氧化慢縮纖維發(fā)展最大張力所需的時間更快的[Sllverthorn,2004]。在這些結(jié)果中這種現(xiàn)象也是明顯的，因為在未治療組中肌肉的收縮時間是比治療組的肌肉的收縮時間相對更慢的(表2)，即，經(jīng)治療動物的肌肉以更快的速率收縮，因此更快地達到其最大張力。含有快縮纖維的運動單元(motor unit)通常大于含有慢縮纖維的運動單元。這種差異不可避免地意味著，相比于當(dāng)刺激慢縮纖維運動單元時，當(dāng)刺激單一快縮纖維運動單元時，更多的肌纖維收縮。因此，因為在快縮纖維運動單元中更多纖維被刺激以收縮，所以快縮纖維會產(chǎn)生更大的力。因此，由高比例的慢縮纖維組成的肌肉將相對弱于相似尺寸的具有高比例的快縮纖維的肌肉。

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