本申請(qǐng)要求2014年4月10日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/977,751、2014年4月30日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/986,479、2014年10月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2/058,973、2014年12月5日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2/088,363、2014年12月9日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2/089,730和2014年12月11日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?2/090845的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益。上述申請(qǐng)的全部公開(kāi)內(nèi)容特別地通過(guò)引用全文并入。

序列表的引用

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明的方面涉及制備含有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法。公開(kāi)的方法涉及從混合的T細(xì)胞群選擇和/或分離CD4+和/或CD8+T細(xì)胞，然后使所述CD4+和/或CD8+T細(xì)胞在一種或多種細(xì)胞因子的存在下，在分離的培養(yǎng)物中激活、基因修飾和增殖，所述細(xì)胞因子維持細(xì)胞的存活、移入和/或增殖以及促進(jìn)細(xì)胞表面受體如CD62L、CD28和/或CD27的保留。

背景技術(shù)：

同種異體的造血干細(xì)胞移植(HSCT)后，急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)復(fù)發(fā)可以發(fā)生。因此，許多人相信這樣的方法是無(wú)效的。人T淋巴細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移具有有效治療許多晚期癌癥還有惡性腫瘤的潛力，所述人T淋巴細(xì)胞通過(guò)基因轉(zhuǎn)移被工程化以表達(dá)對(duì)存在于腫瘤細(xì)胞或惡性B細(xì)胞表面上的分子特異性的嵌合抗原受體(CAR)。然而，為了有效并長(zhǎng)期持久地治療，在轉(zhuǎn)移至患者后，施用的包括嵌合抗原受體的T細(xì)胞希望地具有高存活率和增殖率。用于治療的T細(xì)胞也希望地適于移入。盡管在本領(lǐng)域具有極大的成就，仍然存在對(duì)另外的有效的細(xì)胞治療的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文描述的本發(fā)明的方面包括制備含有用于人治療的嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法。供選擇的方案包括使用從混合的T細(xì)胞群中選擇、富集和/或分離表達(dá)CD4+和/或CD8+的T細(xì)胞的方法，所述T細(xì)胞如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化的前體的T細(xì)胞，所述工程化的前體希望地是iPS細(xì)胞。一旦選擇、富集和/或分離，則使表達(dá)CD4+和/或CD8+的T細(xì)胞激活、基因修飾并增殖，優(yōu)選地在分隔的、富集的或分離的培養(yǎng)物中，在一種或多種細(xì)胞因子存在下進(jìn)行激活、基因修飾并增殖，所述細(xì)胞因子能被外源地提供給T細(xì)胞，例如為除了可以由細(xì)胞產(chǎn)生或存在于培養(yǎng)基中的任何細(xì)胞因子之外的細(xì)胞因子，并且支持、促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于細(xì)胞的存活、移入和/或增殖，以及優(yōu)選地支持、促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于保留細(xì)胞表面受體，如CD62L、CD28和/或CD27。本文也包括通過(guò)將一種或多種類(lèi)型的基因工程化T細(xì)胞或包括如本文描述的基因工程化T細(xì)胞的組合物施用于有需要的受試者治療、抑制、改善或清除癌癥的方法。

本文描述的本發(fā)明的某些方面涉及制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法。所述的某些方法，這些方法通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)踐：從混合的T細(xì)胞群分隔、分離或富集表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群以產(chǎn)生分隔的、分離的或富集的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激這些分隔的、富集的或分離的T細(xì)胞群以產(chǎn)生刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞因子刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，所述細(xì)胞因子能被外源地提供給T細(xì)胞，例如為除了可以由細(xì)胞產(chǎn)生或存在于培養(yǎng)基中的任何細(xì)胞因子以外的細(xì)胞因子；通過(guò)選擇標(biāo)記序列富集轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分隔的、富集的或分離的轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；以及增殖分隔的、富集的或分離的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群至少兩天，以獲得具有嵌合抗體的所述基因修飾的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，可以增殖表達(dá)CD8+的T細(xì)胞和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞至少或等于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，通過(guò)親和性選擇具有存在于CD8和/或CD4上的表位的T細(xì)胞，進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔或富集CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔或富集CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，通過(guò)免疫磁性選擇進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔或富集CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，基因修飾的CD8+T細(xì)胞和/或CD4+T細(xì)胞包括促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性(engraftment fitness)的至少一種受體。在一些供選擇的方案中，至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，通過(guò)使CD8+和/或CD4+T細(xì)胞與抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒接觸，進(jìn)行刺激分離的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，抗體結(jié)合支持物包括抗TCR、抗CD2、抗CD3、抗CD4和/或抗CD28抗體。在一些供選擇的方案中，抗體結(jié)合支持物包括抗CD3和/或抗CD28抗體。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記的第四序列。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。在一些供選擇的方案中，標(biāo)記序列編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL7、IL-15和/或IL-21，細(xì)胞因子的量可以提供為0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.6ng/mL、0.7ng/mL、0.8ng/mL、0.9ng/mL或1.0ng/mL或由任意兩個(gè)前述的量限定的范圍內(nèi)的量和/或10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL或100U/mL或由任意兩個(gè)前述的量限定的范圍內(nèi)的量。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21，其中細(xì)胞因子的量提供為0.5ng/mL和/或50U/mL。在一些供選擇的方案中，接觸進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)這些值限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在一些供選擇的方案中，用分離的、純化的、富集的或分隔的CD4+細(xì)胞執(zhí)行方法，所述CD4+細(xì)胞不存在、實(shí)質(zhì)上貧化或富集超過(guò)CD8+細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，用分離的、純化的、富集的或分隔的CD8+細(xì)胞執(zhí)行方法，所述CD8+細(xì)胞不存在、實(shí)質(zhì)上貧化或富集超過(guò)CD4+細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD4+的T細(xì)胞至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在一些供選擇的方案中，增殖CD8+T細(xì)胞至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括移除抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒。在一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括深低溫保藏基因修飾的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，通過(guò)親和性選擇具有存在于CD8和/或CD4上的表位的T細(xì)胞，進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔、富集或分離表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔、富集或分離表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，通過(guò)免疫磁性選擇進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔、富集或分離表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，基因修飾的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞包括至少一種促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于移入適合性的受體。在一些供選擇的方案中，至少一種促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于移入適合性的受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在優(yōu)選的供選擇的方案中，至少一種促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于移入適合性的受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，通過(guò)使表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞與抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒接觸進(jìn)行刺激分離的、富集的或分隔的T細(xì)胞群。在這些供選擇的方案的一些中，抗體結(jié)合支持物包括抗TCR、抗CD2、抗CD3、抗CD4和/或抗CD28抗體。在優(yōu)選的供選擇的方案中，抗體結(jié)合支持物包括抗CD3和/或抗CD28抗體。

在許多前述的供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列。在這些供選擇的方案的一些中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列，所述間隔區(qū)在某些供選擇的方案中可包括IgG4鉸鏈。在許多前述的供選擇的方案中，載體是病毒載體或微環(huán)。

在許多前述的供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。優(yōu)選地，病毒載體是慢病毒載體。在許多前述的供選擇的方案中，標(biāo)記序列編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在許多前述的供選擇的方案中，使用的至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或IL-21并且所述細(xì)胞因子能被外源地提供給T細(xì)胞，例如為除了可以由細(xì)胞產(chǎn)生或存在于培養(yǎng)基中的任何細(xì)胞因子以外的細(xì)胞因子。

在希望的可選擇的實(shí)施方式中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-7、IL-15和/或IL-21。在許多前述的供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在優(yōu)選的供選擇的方案中，接觸時(shí)間進(jìn)行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)這些時(shí)間點(diǎn)限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在許多前述的供選擇的方案中，在表達(dá)CD8+的細(xì)胞不存在或與未分隔的、未富集的或未分離的T細(xì)胞群的天然群相比具有減少量的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞下，用分離的、分隔的或富集的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞執(zhí)行方法，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞。在許多前述的供選擇的方案中，在表達(dá)CD4+的細(xì)胞不存在或與未分隔的、未富集的或未分離的T細(xì)胞群的天然群相比具有減少量的表達(dá)CD4+的細(xì)胞下，用分離的、分隔的或富集的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群執(zhí)行方法，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞。在許多前述的供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD4+的T細(xì)胞至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間。在許多前述的供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD8+的T細(xì)胞至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間。

在許多前述的供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括移除抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒。在許多前述的供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在許多前述的供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在許多前述的供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分，如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,446,179中可獲得的，特別地通過(guò)引用全文并入本文。在許多前述的供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在許多前述的供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括深低溫保藏基因修飾的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞。

本發(fā)明的另外的方面涉及基因修飾的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述基因修飾的T細(xì)胞群包括大量親和性選擇的富集形式的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞，所述富集形式的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞如從表達(dá)CD8-和/或CD4-的T細(xì)胞富集、表達(dá)CD8-和/或CD4-的T細(xì)胞不存在或從表達(dá)CD8-和/或CD4-的T細(xì)胞分離，其中所述大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞具有刺激的CD2、CD3、CD4和/或CD28受體，其中所述大量親和性選擇的或富集的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼嵌合抗原受體的基因和編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記的基因，并且其中所述大量親和性選擇的或富集的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞已經(jīng)被至少一種細(xì)胞因子重刺激，所述細(xì)胞因子可以被外源地提供給T細(xì)胞，例如為除了可以由細(xì)胞產(chǎn)生或存在于培養(yǎng)基中的任何細(xì)胞因子以外，如使所述細(xì)胞與外源添加的細(xì)胞因子接觸至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間。在一些供選擇的方案中，所述大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞進(jìn)一步包括至少一種促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于移入適合性的受體。在一些供選擇的方案中，至少一種促進(jìn)、誘導(dǎo)、改善或有助于移入適合性的受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，至少一種促進(jìn)、誘導(dǎo)、改善或有助于移入適合性的受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞進(jìn)一步包括具有編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列的載體。

一些供選擇的方案涉及基因修飾的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，基因修飾的T細(xì)胞群包括大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞，所述CD8+和/或CD4+T細(xì)胞不存在、實(shí)質(zhì)上貧化或富集超過(guò)CD8-和/或CD4-T細(xì)胞，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞具有刺激的CD2、CD3、CD4和/或CD28受體，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼嵌合抗原受體的基因和細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記的基因，并且其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞已經(jīng)被至少一種細(xì)胞因子重刺激。在一些供選擇的方案中，所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括促進(jìn)、提高、改善或有助于移入適合性的至少一種受體。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、提高、改善或有助于移入適合性的至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、提高、改善或有助于移入適合性的至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括具有編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記的第四序列的載體。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。在一些供選擇的方案中，細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在一些供選擇的方案中，群包括分離的、純化的、分隔的或富集的CD8+T細(xì)胞，所述CD8+T細(xì)胞不存在、實(shí)質(zhì)上貧化或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，群包括分離的、純化的、分隔的或富集的CD4+T細(xì)胞，所述CD4+T細(xì)胞不存在、實(shí)質(zhì)上貧化或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞是前體T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，前體T細(xì)胞是造血干細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列，如包括IgG4鉸鏈的間隔區(qū)。在一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體或微環(huán)。在一些供選擇的方案中，細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分，如在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,446,179中可獲得的，特別地通過(guò)引用全文并入本文。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在一些供選擇的方案中，基因修飾的T細(xì)胞(如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞)群包括分離的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞，所述表達(dá)CD8+的T細(xì)胞不存在表達(dá)CD4+的T細(xì)胞或與未分隔的、未富集的或未分離的T細(xì)胞群的天然群相比具有減少量的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，基因修飾的T細(xì)胞(如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞)群包括分離的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞，所述表達(dá)CD4+的T細(xì)胞不存在表達(dá)CD8+的T細(xì)胞或與未分隔的、未富集的或未分離的T細(xì)胞群的天然群相比具有減少量的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞。

本發(fā)明的另外的方面涉及用于人治療的包含藥用賦形劑的組合物或產(chǎn)品組合；和至少一個(gè)如前段所述的基因修飾的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含在混合的群中或以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1或10∶1的比或由任意兩個(gè)前述的比限定的范圍內(nèi)的比聯(lián)合施用的、如上所述的基因修飾的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和如上所述的基因修飾的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。

本發(fā)明的另外的方面涉及治療、抑制或減輕有需要的受試者的疾病的方法，所述方法包括將至少一種如上所述的組合物或產(chǎn)品組合施用于受試者。在一些供選擇的方案中，方法包括預(yù)先或在施用表達(dá)CD8+的T細(xì)胞之前，施用包含表達(dá)CD4+的T細(xì)胞(如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞)的組合物或產(chǎn)品組合，以及在其他供選擇的方案中，在施用表達(dá)CD4+的T細(xì)胞之前施用表達(dá)CD8+的細(xì)胞，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞。在許多供選擇的方案中，鑒別或選擇受試者以接受抗癌治療。在許多前述方法中，方法也涉及測(cè)量或評(píng)價(jià)疾病的抑制。在許多前述方法中，方法也涉及在施用如上所述的組合物或產(chǎn)品組合之前、期間或之后，向所述受試者提供另外的抗癌治療。

在許多前述方法中，通過(guò)過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移將組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。在一些供選擇的方案中，在受試者接受了另一形式的抗癌治療后將組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。在許多前述方法中，受試者患有白血病。在許多前述方法中，受試者具有復(fù)發(fā)性和/或化學(xué)治療難治性CD19+兒童急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。在許多前述方法中，受試者具有復(fù)發(fā)性和/或化學(xué)治療難治性CD19+急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。在許多前述方法中，受試者患有自身免疫疾病。在許多前述方法中，受試者患有HSCT后復(fù)發(fā)。

因此，本發(fā)明的一些方面涉及如下供選擇的方案：

1.制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，包括：

從混合的T細(xì)胞群分隔或富集表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群以產(chǎn)生分隔的或富集的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；

刺激分隔的或富集的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；

用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；

使轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸，如接觸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，所述細(xì)胞因子可以被外源地提供給T細(xì)胞，例如為除了可以由細(xì)胞產(chǎn)生或存在于培養(yǎng)基中的任何細(xì)胞因子以外的細(xì)胞因子；

通過(guò)選擇標(biāo)記序列富集轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；以及

增殖富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。

2.供選擇的方案1的方法，其中通過(guò)親和性選擇具有存在于CD8和/或CD4上的表位的T細(xì)胞，進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔或富集CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。

3.供選擇的方案1或2的方法，其中通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔或富集CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。

4.供選擇的方案1或2的方法，其中通過(guò)免疫磁性選擇進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔或富集CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。

5.供選擇的方案1-4中任一項(xiàng)的方法，其中基因修飾的CD8+T細(xì)胞和/或CD4+T細(xì)胞包括促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體。

6.供選擇的方案5的方法，其中至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。

7.供選擇的方案5或6的方法，其中至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。

8.供選擇的方案1-7中任一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)使CD8+T細(xì)胞和/或CD4+T細(xì)胞與抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒接觸進(jìn)行刺激分離的T細(xì)胞群。

9.供選擇的方案8的方法，其中抗體結(jié)合支持物包括抗TCR、抗CD2、抗CD3、抗CD4和/或抗CD28抗體。

10.供選擇的方案8或9的方法，其中抗體結(jié)合支持物包括抗CD3和/或抗CD28抗體。

11.供選擇的方案1-10中任一項(xiàng)的方法，其中載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記的第四序列。

12.供選擇的方案1-11中任一項(xiàng)的方法，其中載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。

13.供選擇的方案12的方法，其中間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。

14.供選擇的方案1-13中任一項(xiàng)的方法，其中載體是病毒載體。

15.供選擇的方案14的方法，其中病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。

16.供選擇的方案14或15的方法，其中病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。

17.供選擇的方案14-16中任一項(xiàng)的方法，其中病毒載體是慢病毒載體。

18.供選擇的方案1-17中任一項(xiàng)的方法，其中標(biāo)記序列編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。

19.供選擇的方案1-18中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或IL-21。

20.供選擇的方案1-19中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種細(xì)胞因子包括IL7、IL-15和/或IL-21，所述細(xì)胞因子可以以0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.6ng/mL、0.7ng/mL、0.8ng/mL、0.9ng/mL或1.0ng/mL或由任意兩個(gè)前述的量限定的范圍內(nèi)的量和/或以10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL或100U/mL或由任意兩個(gè)前述的量限定的范圍內(nèi)的量提供。

21.供選擇的方案1-19中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21，其中細(xì)胞因子的量以0.5ng/mL和/或50U/mL提供。

22.供選擇的方案1-21中任一項(xiàng)的方法，其中接觸進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)這些值限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。

23.供選擇的方案1-20或22中任一項(xiàng)的方法，其中用分離的、純化的、富集的或分隔的CD4+細(xì)胞，在CD8+細(xì)胞不存在、實(shí)質(zhì)上貧化或所述CD4+細(xì)胞富集超過(guò)CD8+細(xì)胞的情況下進(jìn)行所述方法。

24.供選擇的方案1-19、21或22中任一項(xiàng)的方法，其中方法用分離的、純化的、富集的或分隔的CD8+細(xì)胞，在CD4+細(xì)胞不存在、實(shí)質(zhì)上貧化或所述CD8+細(xì)胞富集超過(guò)CD4+細(xì)胞的情況下進(jìn)行所述方法。

25.供選擇的方案1-20、22或23中任一項(xiàng)的方法，其中表達(dá)CD4+的T細(xì)胞增殖至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。

26.供選擇的方案1-19、21、22或24中任一項(xiàng)的方法，其中，所述CD8+T細(xì)胞增殖至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。

27.供選擇的方案8-26中任一項(xiàng)的方法，其中方法進(jìn)一步包括移除抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒。

28.供選擇的方案1-27中任一項(xiàng)的方法，其中嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。

29.供選擇的方案1-28中任一項(xiàng)的方法，其中嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。

30.供選擇的方案1-29中任一項(xiàng)的方法，其中嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。

31.供選擇的方案1-30中任一項(xiàng)的方法，其中嵌合抗原受體的配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。

32.供選擇的方案1-31中任一項(xiàng)的方法，其中方法進(jìn)一步包括深低溫保藏基因修飾的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞。

33.基因修飾的T細(xì)胞群，包括：

大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞，所述CD8+和/或CD4+T細(xì)胞不存在CD8-和/或CD4-T細(xì)胞、實(shí)質(zhì)上貧化CD8-和/或CD4-T細(xì)胞或富集超過(guò)CD8-和/或CD4-T細(xì)胞，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞具有刺激的CD2、CD3、CD4和/或CD28受體，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼嵌合抗原受體和細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記的基因，并且其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞已經(jīng)被至少一種細(xì)胞因子重刺激。

34.供選擇的方案33的基因修飾的T細(xì)胞群，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括促進(jìn)、提高、改善或有助于移入適合性的至少一種受體。

35.供選擇的方案33或34的基因修飾的T細(xì)胞群，其中促進(jìn)、提高、改善或有助于移入適合性的至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。

36.供選擇的方案34或35的基因修飾的T細(xì)胞群，其中促進(jìn)、提高、改善或有助于移入適合性的至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。

37.供選擇的方案33-36中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括具有編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記的第四序列的載體。

38.供選擇的方案37的基因修飾的T細(xì)胞群，其中載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。

39.供選擇的方案38的基因修飾的T細(xì)胞群，其中間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。

40.供選擇的方案33-39中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中載體是病毒載體。

41.供選擇的方案40的基因修飾的T細(xì)胞群，其中病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。

42.供選擇的方案40或41的基因修飾的T細(xì)胞群，其中病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。

43.供選擇的方案40-42中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中病毒載體是慢病毒載體。

44.供選擇的方案33-43中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。

45.供選擇的方案37-44中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。

46.供選擇的方案37-45中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。

47.供選擇的方案37-46中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。

48.供選擇的方案37-47中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。

49.供選擇的方案33-48中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中群包括分離的、純化的、分隔的或富集的CD8+T細(xì)胞，所述CD8+T細(xì)胞不存在CD4+T細(xì)胞、實(shí)質(zhì)上貧化CD4+T細(xì)胞或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞。

50.供選擇的方案33-48中任一項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群，其中群包括分離的、純化的、分隔的或富集的CD4+T細(xì)胞，所述CD4+T細(xì)胞不存在CD8+T細(xì)胞、實(shí)質(zhì)上貧化CD8+T細(xì)胞或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞。

51.用于人治療的組合物或產(chǎn)品組合，包含：

藥用賦形劑；和

至少一種根據(jù)供選擇的方案33-50中任一項(xiàng)或多項(xiàng)的基因修飾的T細(xì)胞群。

52.供選擇的方案51的組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含供選擇的方案49的基因修飾的T細(xì)胞群。

53.供選擇的方案47的組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含供選擇的方案50的基因修飾的T細(xì)胞群。

54.供選擇的方案47的組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含以1∶1的比混合或聯(lián)合施用的供選擇的方案49的基因修飾的T細(xì)胞群和供選擇的方案50的基因修飾的T細(xì)胞群。

55.一種治療、抑制或減輕有需要的受試者的疾病的方法，包括：

將至少一種供選擇的方案51-54中任一項(xiàng)或多項(xiàng)的組合物或產(chǎn)品組合施用于受試者。

56.供選擇的方案55的方法，其中方法包括施用供選擇的方案52的組合物或產(chǎn)品組合。

57.供選擇的方案55的方法，其中方法包括施用供選擇的方案53的組合物或產(chǎn)品組合。

58.供選擇的方案56的方法，其中方法進(jìn)一步包括施用供選擇的方案53的組合物或產(chǎn)品組合。

59.供選擇的方案57的方法，其中方法進(jìn)一步包括施用供選擇的方案52的組合物或產(chǎn)品組合.

60.供選擇的方案55的方法，其中方法包括施用供選擇的方案54的組合物或產(chǎn)品組合，如通過(guò)這樣的方法，其中在施用表達(dá)CD4+的T細(xì)胞之前，施用表達(dá)CD8+的T細(xì)胞，如在施用CD4+T細(xì)胞前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60分鐘或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間定義的范圍內(nèi)的時(shí)間段。

61.供選擇的方案55-60中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中鑒別或選擇受試者以接受抗癌治療。

62.供選擇的方案55-61中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量或評(píng)價(jià)疾病的抑制。

63.供選擇的方案55-62中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括在施用供選擇的方案51-54中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的組合物或產(chǎn)品組合之前、期間或之后，向所述受試者提供另外的抗癌治療。

64.供選擇的方案55-63中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中通過(guò)過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移向所述受試者施用供選擇的方案51-54中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的組合物或產(chǎn)品組合。

65.供選擇的方案55-64中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中在所述受試者接受了另一種形式的抗癌治療后，將供選擇的方案51-54中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。

66.供選擇的方案55-65中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中在所述受試者接受了另一種形式的抗癌治療后，將供選擇的方案51-54中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。

67.供選擇的方案55-66中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中受試者患有白血病。

68.供選擇的方案55-67中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中受試者具有復(fù)發(fā)性和/或化學(xué)治療難治性CD19+兒童急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。

69.供選擇的方案55-68中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中受試者具有復(fù)發(fā)性和/或化學(xué)治療難治性CD19+急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。

70.供選擇的方案55-69中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中受試者患有自身免疫疾病。

71.供選擇的方案55-70中任意一項(xiàng)或多項(xiàng)的方法，其中受試者患有HSCT后復(fù)發(fā)。

附圖說(shuō)明

圖1A顯示了從第0天到第65天過(guò)繼轉(zhuǎn)移承載CAR的T細(xì)胞之后的11名患者中，承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。圖1B顯示了經(jīng)3個(gè)劑量處理之后的承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量。

圖2A顯示了從第0天到第65天過(guò)繼轉(zhuǎn)移承載CAR的T細(xì)胞的患者的外周血中，承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞的存留率。圖2B顯示了在3個(gè)劑量處理之后的承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞的存留率。

圖3A顯示了從第0天到第65天過(guò)繼轉(zhuǎn)移承載CAR的T細(xì)胞之后的患者的骨髓中，承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞的存留率。圖3B顯示了在3個(gè)劑量處理之后的患者的骨髓中承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞的存留率。

圖4顯示了在3個(gè)劑量之后的患者X中急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)的百分比。

圖5顯示了研究中所用的患者特征的表格。

圖6顯示了與疾病和劑量相關(guān)的CNS淋巴瘤的發(fā)展。如顯示的，兩幅柱狀圖表示經(jīng)歷包括承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞的處理的患者數(shù)量和其在3次處理之后的疾病的嚴(yán)重程度。

圖7顯示了在患有ALL的患者的異常MRI中的4級(jí)腦病。第一幅圖表示在用承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞處理之后的結(jié)果。

圖8顯示了經(jīng)用承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞處理后的急性皮膚移植物抗宿主病(GVHD)。如圖A所示，S03在CAR T細(xì)胞移入后第17天重新發(fā)展出2級(jí)急性皮膚GVHD。在圖B中，皮膚活組織檢查揭示了僅9％的皮膚局部T細(xì)胞標(biāo)記了EGFRt+，而79％的循環(huán)T細(xì)胞標(biāo)記了EGFRt+。在圖C中，在同一時(shí)間的外周血顯示大多數(shù)T細(xì)胞是CAR+的T細(xì)胞。將該受試者以2周療程的1mg/kg強(qiáng)的松處理，隨后在6周的時(shí)間內(nèi)快速減少，并判斷GVHD。盡管用強(qiáng)的松處理，受試者仍具有持續(xù)存留的CAR+T細(xì)胞。

圖9顯示了在用承載抗CD19 CAR的T細(xì)胞處理之后經(jīng)歷作為微小殘留病(MRD)的標(biāo)記的Ig或TCR的患者的表格。

圖10顯示了抗CD19CAR T細(xì)胞的同種異體的造血干細(xì)胞移植后的患者概況的表格。

圖11顯示了在抗CD19 CAR T細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植(HSCT)之后，從外周血和CSF分離的細(xì)胞的FACS散點(diǎn)分析。

圖12顯示了3個(gè)劑量的抗CD19 CAR T細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植后腫瘤負(fù)荷與響應(yīng)。

圖13顯示了3個(gè)劑量的造血干細(xì)胞移植之后的患者的緩解持續(xù)時(shí)間。

圖14顯示了在第7天時(shí)2個(gè)劑量的抗CD19 CAR T細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植后，腫瘤負(fù)荷與響應(yīng)。

圖15顯示了在3個(gè)劑量的抗CD19 CAR T細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植后的患者中的CAR/EGFRt+T細(xì)胞存留的量級(jí)和持續(xù)時(shí)間。

圖16顯示了在3個(gè)劑量的抗CD19 CAR T細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植后B細(xì)胞發(fā)育不全的持續(xù)時(shí)間。

圖17顯示了3個(gè)劑量的抗CD19 CAR T細(xì)胞的造血干細(xì)胞移植后的患者的CRS概況。

圖18顯示了說(shuō)明制備基因修飾的T細(xì)胞的兩個(gè)流程圖。如描述的，初始的擴(kuò)增方法批量處理不總是立即起始。單采血液成分術(shù)產(chǎn)品(Apheresis product)的部分總是進(jìn)行Ficoll處理。如果沒(méi)有要起始批量培養(yǎng)，那么冷凍保存通過(guò)Ficoll分隔分離的產(chǎn)品。

圖19顯示了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的不同方法的比較流程圖。

圖20顯示了使用不同濃度的細(xì)胞在起子培養(yǎng)物中的細(xì)胞生長(zhǎng)中的最初比較。如所示的，PD0064是PD0063供體，所述PD0063供體是富集的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞，PD0064用于在起始時(shí)在T25瓶中測(cè)試起始細(xì)胞密度。實(shí)驗(yàn)測(cè)試了兩個(gè)細(xì)胞密度，在實(shí)驗(yàn)期間當(dāng)體積早期增加時(shí)，兩個(gè)細(xì)胞密度均顯示了更大的生存力和擴(kuò)增。

圖21顯示了細(xì)胞生長(zhǎng)的初始比較。這是用于向當(dāng)前使用的更新的制備方法過(guò)渡的全面數(shù)據(jù)。

圖22顯示了說(shuō)明用于測(cè)試表達(dá)CD4+和CD8+的T細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子的混合物變化的流程圖。

圖23A-F說(shuō)明了在表達(dá)CD4+和CD8+的T細(xì)胞生長(zhǎng)期間測(cè)試的細(xì)胞因子的比較。

圖24A-F說(shuō)明了在表達(dá)CD4+和CD8+的T細(xì)胞生長(zhǎng)期間測(cè)試的細(xì)胞因子的比較。

圖25A-B顯示了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子比較。對(duì)PD0059供體樣品，進(jìn)行與PD0051相同的細(xì)胞因子測(cè)試實(shí)驗(yàn)，除了測(cè)試新的CD4和CD8供體(PD0057)以外。

圖26顯示了說(shuō)明源自測(cè)試不同細(xì)胞因子混合物的實(shí)驗(yàn)的初始擴(kuò)增方法和當(dāng)前的擴(kuò)增方法的流程圖.

圖27顯示了樣品PD0080、PD084和PD0085的擴(kuò)增比較。這些實(shí)驗(yàn)是“早期擴(kuò)增”方法的重復(fù)。

圖28顯示了對(duì)PD0044產(chǎn)生基因修飾的細(xì)胞的測(cè)試。對(duì)于第一比例放大的PLAT-02(I期和II期試驗(yàn))使用來(lái)自深低溫保藏的選擇的細(xì)胞的“預(yù)先通過(guò)鑒定的細(xì)胞(pre-qual)”。

圖29顯示了對(duì)PD0046從按比例放大的PLAT-02“質(zhì)量鑒定(Qual run)#1”產(chǎn)生基因修飾的細(xì)胞的測(cè)試。

圖30顯示了PD0063從按比例放大或PLAT-02“質(zhì)量鑒定(Qual run)#2”產(chǎn)生基因修飾的細(xì)胞的測(cè)試。生長(zhǎng)曲線顯示來(lái)自細(xì)胞的兩個(gè)V-197袋的TNC。珠移除和EGFRt富集對(duì)于表達(dá)CD4+的T細(xì)胞發(fā)生在D+14天之后，對(duì)于表達(dá)CD8+的T細(xì)胞發(fā)生在D+15天之后。表達(dá)CD8+的T細(xì)胞生長(zhǎng)于IL-2(50U/mL)/IL-15(0.5ng/mL)中，表達(dá)CD4+的T細(xì)胞生長(zhǎng)于IL-7(5ng/mL)/IL-15(0.5ng/mL)中。對(duì)表達(dá)CD4+的T細(xì)胞，珠移除和EGFRt富集發(fā)生在第12天，以及對(duì)表達(dá)CD8+的T細(xì)胞，珠移除和EGFRt富集發(fā)生在第13天。

圖31A-B顯示了在細(xì)胞因子存在下生長(zhǎng)時(shí)從批量PBMC培養(yǎng)物中擴(kuò)增細(xì)胞。如所示的，表達(dá)CD4+的T細(xì)胞(●)在IL2和IL15存在下生長(zhǎng)。表達(dá)CD8+的T細(xì)胞(■)在IL7和IL15存在下生長(zhǎng)。

圖32A-B顯示了在細(xì)胞因子混合物中的富集的表達(dá)CD8+和CD4+的T細(xì)胞的擴(kuò)增。如樣品PD0044所示，富集的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞在IL2和IL15的存在下擴(kuò)增。在樣品PD0044中，富集的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞在IL7和IL15的存在下擴(kuò)增超過(guò)20天。

圖33顯示了使用如圖18的流程圖所示的早期方法擴(kuò)增富集的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞和表達(dá)CD8+的T細(xì)胞。所示的是在樣品14602-S01、14602-S02和14602-S03/14602-S03-02中的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

圖34顯示了使用如圖18的流程圖所示的早期方法擴(kuò)增富集的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞和表達(dá)CD8+的T細(xì)胞。所示的是在樣品14602-S04/14602-S04-02、14602-S05、14602-SO6和14602-S06-2/14602-S06-04中的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

圖35顯示了使用如圖18的流程圖所示的早期方法擴(kuò)增富集的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞和表達(dá)CD8+的T細(xì)胞。所示是在樣品14602-S07、14602-S08和14602-S09中的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

圖36顯示了在樣品14602-S10、14602-S11、14602-S12和14602-S13中擴(kuò)增細(xì)胞。

圖37顯示了在樣品14602-S14、14602-S15和14602-S16中擴(kuò)增細(xì)胞。

圖38顯示了在細(xì)胞擴(kuò)增后富集的表達(dá)CD4+和CD8+的T細(xì)胞的延伸的表型。

圖39A-B顯示了用來(lái)自樣品PD00044和PD00046的細(xì)胞注射的小鼠的存存活。記載了PD00046細(xì)胞具有移入適合性標(biāo)記的表達(dá)(CD27、CD28、CD127和CD62L)。

圖40顯示了用來(lái)自PD0044和PD0046細(xì)胞批次的細(xì)胞處理的小鼠的平均腫瘤進(jìn)展。

圖41顯示了測(cè)試用針對(duì)移入適合性制備的T細(xì)胞處理的小鼠的腫瘤進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)建立。

圖42顯示了在施用于動(dòng)物的當(dāng)天和在細(xì)胞因子生長(zhǎng)條件下來(lái)自樣品PD0051和PD00055的表達(dá)CD4+和表達(dá)CD8+的T細(xì)胞之間的比較

圖43顯示了用PBS、PD0051(正常擴(kuò)增細(xì)胞)和PD00055(在細(xì)胞因子組合存在下擴(kuò)增的細(xì)胞)處理的三組小鼠的比較。

圖44顯示了通過(guò)檢測(cè)EGFRt CAR標(biāo)記檢測(cè)在小鼠的外周血中的T細(xì)胞存留。

圖45顯示了用于測(cè)試三組小鼠的實(shí)驗(yàn)建立，以確定在抗原重復(fù)暴露(encounter)下，在體外不同細(xì)胞因子條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞之間的殺傷能力在體內(nèi)的差異。

圖46顯示了處理后從第0天至第120天，PD0051和PD0055處理的小鼠的腫瘤進(jìn)展。

圖47顯示了用重復(fù)抗原暴露攻擊的PD0051和PD0055細(xì)胞。

圖48顯示了JME13-29重復(fù)Raji腫瘤攻擊“正常擴(kuò)增細(xì)胞”與用細(xì)胞因子組合脈沖的T細(xì)胞。

圖49顯示了確定在與PLAT-01(I期臨床試驗(yàn))和PLAT-02(I期和II期臨床試驗(yàn))以及“中間”方案相同條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞之間在殺傷能力方面在體內(nèi)是否具有差異的實(shí)驗(yàn)建立。

圖50顯示了表明來(lái)自表達(dá)CD8+的T細(xì)胞和表達(dá)CD4+的T細(xì)胞的EGFRt的細(xì)胞產(chǎn)品和水平。

圖51顯示了用特定劑量調(diào)整的T細(xì)胞處理后的平均腫瘤進(jìn)展。

圖52顯示了T細(xì)胞處理的給藥組中的PLAT比較。

圖53A-E顯示了來(lái)自在相似給藥濃度下的產(chǎn)品PLAT-1.00、PLAT-1.33、PLAT-1.67和PLAT-2.00的T細(xì)胞的比較。圖中說(shuō)明了個(gè)體動(dòng)物的腫瘤進(jìn)展。每排的開(kāi)始顯示每個(gè)PLAT組以不同劑量調(diào)整分組，然后是梳理出個(gè)體組。

圖54顯示了用來(lái)自產(chǎn)品PLAT-1.00、PLAT-1.33、PLAT-1.67和PLAT-2.00的T細(xì)胞處理的小鼠的劑量調(diào)整存活率。圖說(shuō)明了細(xì)胞處理的給藥組內(nèi)的PLAT比較。

圖55顯示了存活曲線的PLAT比較。圖說(shuō)明了在用特定劑量的T細(xì)胞處理后的平均腫瘤進(jìn)展。

圖56顯示了對(duì)T細(xì)胞治療響應(yīng)的小鼠的存活率，其中T細(xì)胞在正常擴(kuò)增方法下生長(zhǎng)或在細(xì)胞因子存在下生長(zhǎng)。圖也顯示了小鼠在T細(xì)胞處理后是否發(fā)展出異種移植宿主疾病。

圖57顯示了對(duì)T細(xì)胞治療響應(yīng)的小鼠的存活率，其中T細(xì)胞在正常擴(kuò)增方法下生長(zhǎng)或在細(xì)胞因子存在下生長(zhǎng)。圖也顯示了小鼠在T細(xì)胞處理后是否發(fā)展出異種移植宿主疾病。

圖58A-C顯示了對(duì)T細(xì)胞治療響應(yīng)的小鼠的存活率，其中T細(xì)胞在正常擴(kuò)增方法下生長(zhǎng)或在細(xì)胞因子存在下生長(zhǎng)。圖也顯示了小鼠在T細(xì)胞處理后是否發(fā)展出異種移植宿主疾病。

圖59A-H顯示了對(duì)T細(xì)胞治療響應(yīng)的小鼠的存活率，其中T細(xì)胞在正常擴(kuò)增方法下生長(zhǎng)或在細(xì)胞因子存在下生長(zhǎng)。圖也顯示了小鼠在T細(xì)胞處理后是否發(fā)展出異種移植宿主疾病。

圖60A-D顯示了對(duì)T細(xì)胞治療響應(yīng)的小鼠的存活率，其中T細(xì)胞在正常擴(kuò)增方法下生長(zhǎng)或在細(xì)胞因子存在下生長(zhǎng)。圖也顯示了小鼠在T細(xì)胞處理后是否發(fā)展出異種移植宿主疾病。

圖61顯示了JME14-03N組在T細(xì)胞處理后51天、在51天和在90天的表格。

具體實(shí)施方式

提供下面的定義以促進(jìn)對(duì)本文描述的數(shù)個(gè)供選擇的方案的理解。

如本文使用的，“一個(gè)/一種(a)”或“一個(gè)/一種(an)”可表示一個(gè)/一種或多于一個(gè)/一種。

如本文使用的，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸或寡核苷酸如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段以及通過(guò)任意的連接、斷裂、核酸內(nèi)切酶作用、核酸外切酶作用產(chǎn)生的片段和通過(guò)合成產(chǎn)生產(chǎn)生的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)的單體組成，或由天然存在的核苷酸的類(lèi)似物(如對(duì)映異構(gòu)體形式的天然存在的核苷酸)的單體組成，或兩者的組合組成。修飾的核苷酸可具有在糖部分和/或在嘧啶或嘌呤堿基部分的改變。糖修飾包括，例如用鹵素、烷基、胺和疊氮基取代一個(gè)或多個(gè)羥基，或糖可以被官能化為醚類(lèi)或酯類(lèi)。此外，可以用空間或電子相似結(jié)構(gòu)，如氮雜糖和碳環(huán)糖類(lèi)似物取代全部糖部分。在堿基部分修飾的例子包括包括烷基化的嘌呤和嘧啶、?；泥堰驶蜞奏せ蚱渌熘碾s環(huán)取代。核酸單體可以通過(guò)磷酸二酯鍵或這樣的連鍵的類(lèi)似物連接。磷酸二酯鍵的類(lèi)似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等。術(shù)語(yǔ)“核酸分子”也包括所謂的“肽核酸”，其包括連接于聚酰胺骨架的天然存在或修飾的核酸堿基。核酸可以是單鏈的或雙鏈的。

如本文使用的“基因修飾”，是指使用通過(guò)基因工程技術(shù)改變的遺傳物質(zhì)如核酸修飾有機(jī)體或細(xì)胞如細(xì)菌、T細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、真核細(xì)胞、昆蟲(chóng)、植物或哺乳動(dòng)物的方法。例如，可以通過(guò)以下方法將核酸如DNA插入宿主基因組：首先使用分子克隆方法分離和復(fù)制感興趣的遺傳物質(zhì)以產(chǎn)生DNA序列或通過(guò)合成DNA；然后將該構(gòu)建體插入宿主有機(jī)體。也可以使用核酸酶移除或“敲除”基因?；虼虬惺遣煌募夹g(shù)，其使用同源重組以改變內(nèi)源基因，并且可以用于刪除基因，移除外顯子，添加基因或引入點(diǎn)突變。

本文描述了通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行的基因修飾?！稗D(zhuǎn)導(dǎo)”是指通過(guò)載體的方式將遺傳物質(zhì)例如DNA或RNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的方法。常用技術(shù)使用病毒載體、電穿孔和化學(xué)試劑以增加細(xì)胞通透性。通過(guò)病毒或經(jīng)由病毒載體可以轉(zhuǎn)移DNA。如本文描述，提供了修飾免疫CD4+和/或CD8+T細(xì)胞的方法。為了獲得治療性基因的高表達(dá)和/或增加細(xì)胞表面上的嵌合抗原受體的量，例如，可以用編碼嵌合抗原受體的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞?？梢允褂貌《净蛐揎桾細(xì)胞。通常用于基因治療的病毒是腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。

已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，其使用重組感染性病毒顆粒以遞送編碼嵌合抗原受體的核酸。這表現(xiàn)了當(dāng)前優(yōu)選的轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的方法。如本文描述，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體可以包括源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載體。因此，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)方法是很多的但基本上用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入和表達(dá)遺傳物質(zhì)。數(shù)種上述技術(shù)可以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞，包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染；原生質(zhì)體融合；電穿孔和用重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染。通過(guò)電穿孔和通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒感染已經(jīng)成功轉(zhuǎn)導(dǎo)了原代T淋巴細(xì)胞。如此，反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體可以提供用于在真核細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)移的高效的方法。反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體提供用于基因轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞中的高效的方法。此外，反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒的整合以控制方式發(fā)生并導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞一個(gè)或幾個(gè)拷貝的新遺傳信息的穩(wěn)定整合。

如本文描述的“表達(dá)載體”或載體是編碼在宿主細(xì)胞中表達(dá)的基因的核酸分子。典型地，表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、基因和轉(zhuǎn)錄終止子。基因表達(dá)通常置于啟動(dòng)子的控制之下，并且這樣的基因被稱(chēng)為“可操作地連接于”啟動(dòng)子。相似地，如果調(diào)控元件調(diào)節(jié)核心啟動(dòng)子的活性，調(diào)控元件和核心啟動(dòng)子是可操作地連接的。

在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分隔、分離或富集表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群；刺激分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；通過(guò)選擇由標(biāo)記序列編碼的標(biāo)記，富集、分隔或分離轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、分隔的或分離的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；以及增殖富集的、分隔的或分離的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。在該方法的一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在該方法的一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在該方法的一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在該方法的一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。

“前導(dǎo)序列”也稱(chēng)為“5非翻譯區(qū)(5’UTR)”，是位于起始密碼子上游并對(duì)調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯重要的mRNA區(qū)。在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，編碼嵌合抗原受體的載體包括編碼前導(dǎo)序列的序列。

如本文描述的“配體”是指可以與另一分子或生物分子形成復(fù)合體用于生物目的例如信號(hào)觸發(fā)的小分子。結(jié)合可以通過(guò)分子間的力例如離子鍵、氫鍵和范德華相互作用發(fā)生。結(jié)合于受體蛋白的配體可以改變?nèi)S結(jié)構(gòu)并確定其功能狀態(tài)。

通過(guò)示例而非限制，配體可以包括底物、蛋白、小分子、抑制劑、激活劑和神經(jīng)遞質(zhì)。配體結(jié)合的強(qiáng)度被稱(chēng)為配體親和力，并可以通過(guò)直接相互作用和溶劑效應(yīng)確定。配體可以通過(guò)“配體結(jié)合域”結(jié)合。配體結(jié)合域可以指能結(jié)合特異性配體的結(jié)構(gòu)中的保守序列。不作為限制，配體結(jié)合域可以是對(duì)一種或多種配體特異性的特異性蛋白域。

“特異性的”或“特異性”可以指配體對(duì)于結(jié)合配偶體，或可供選擇地，結(jié)合配偶體對(duì)于配體的特征，并可以包括互補(bǔ)形狀、電荷和結(jié)合的疏水特異性。結(jié)合特異性可以包括立體專(zhuān)一性、區(qū)域選擇性和化學(xué)選擇性。

“信號(hào)傳導(dǎo)域”也稱(chēng)為“共刺激域”，是與細(xì)胞內(nèi)部相互作用的蛋白或受體蛋白的胞內(nèi)域或胞漿域，并通過(guò)傳遞信號(hào)起作用。存在于細(xì)胞的胞內(nèi)部分的蛋白部分也被稱(chēng)作“內(nèi)域(endodomain)”。該相互作用可以通過(guò)經(jīng)由特異性蛋白-蛋白或蛋白-配體相互作用與效應(yīng)分子或效應(yīng)蛋白連通的胞內(nèi)域發(fā)生，所述效應(yīng)分子或效應(yīng)蛋白反過(guò)來(lái)可以沿信號(hào)鏈發(fā)送信號(hào)到達(dá)其目的地。

信號(hào)傳導(dǎo)域或共刺激域也指信號(hào)傳導(dǎo)部分，所述信號(hào)傳導(dǎo)部分向T細(xì)胞提供除了由例如TCR/CD3復(fù)合體的CD3ζ鏈提供的初級(jí)信號(hào)以外的信號(hào)，介導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答例如免疫應(yīng)答、激活、增殖、分化、細(xì)胞因子分泌、溶細(xì)胞活性、穿孔素和/或顆粒酶活性等。信號(hào)傳導(dǎo)域或共刺激域可以包括以下的所有或部分，但不限制于：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和/或與CD83特異性結(jié)合的配體。

“選擇性標(biāo)記序列”是引入載體或細(xì)胞的基因，所述基因提供用于人工選擇的特征。選擇性標(biāo)記序列或標(biāo)記序列可以是可篩選標(biāo)記以允許研究者區(qū)分需要的和不想要的細(xì)胞，或富集特定的細(xì)胞類(lèi)型。在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，提供了載體，其中載體編碼包括標(biāo)記序列的嵌合抗原受體，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記。

在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分隔、分離或富集表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群以產(chǎn)生刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，所述細(xì)胞因子優(yōu)選為外源添加的細(xì)胞因子，例如為除了由T細(xì)胞產(chǎn)生的或存在于培養(yǎng)基中的任何細(xì)胞因子以外的細(xì)胞因子；通過(guò)選擇由標(biāo)記序列編碼的標(biāo)記，分隔、富集或分離轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、分隔的或分離的轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；以及增殖富集的、分隔的或分離的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。

在該方法的一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列。在該方法的一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在該方法的一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在該方法的一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在該方法的一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在該方法的一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在該方法的一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。在該方法的一些供選擇的方案中，標(biāo)記序列編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在該方法的一些供選擇的方案中，載體包括編碼標(biāo)記序列的序列。在這些供選擇的方案的一些中，標(biāo)記序列是截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。

如本文描述的“密碼子優(yōu)化”是指改變密碼子為已知增加最大蛋白表達(dá)效率的密碼子的設(shè)計(jì)過(guò)程。在一些供選擇的方案中，描述了用于在人體中表達(dá)的密碼子優(yōu)化，其中可以通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的算法進(jìn)行密碼子優(yōu)化以產(chǎn)生針對(duì)在人體中具有高mRNA和蛋白產(chǎn)量?jī)?yōu)化的合成基因轉(zhuǎn)錄物。含有用于在人體中密碼子優(yōu)化的算法的程序是容易獲得的。這樣的程序可以包括例如OptimumGene^TM或算法。此外，可以商業(yè)地獲得人密碼子優(yōu)化序列，例如從Integrated DNA Technologies。

在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分隔、分離或富集表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，所述細(xì)胞因子優(yōu)選為外源添加的細(xì)胞因子，例如為除了由T細(xì)胞產(chǎn)生的或存在于培養(yǎng)基中的任何細(xì)胞因子以外的細(xì)胞因子；通過(guò)選擇由標(biāo)記序列編碼的標(biāo)記，富集、分離或分隔轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、分離的或分隔的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；以及增殖富集的、分隔的或分離的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。在該方法的一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列。在該方法的一些供選擇的方案中，載體的序列是針對(duì)在人體中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化的。在一些供選擇的方案中，載體的序列被優(yōu)化為具有特別地針對(duì)在人細(xì)胞中最大蛋白表達(dá)的選擇的密碼子，這可以增加T細(xì)胞的蛋白或CAR的濃度。

也可以進(jìn)行優(yōu)化以減少多核苷酸中二級(jí)結(jié)構(gòu)的發(fā)生。在該方法的一些供選擇的方案中，也可以進(jìn)行載體中序列的優(yōu)化以減少總GC/AT比。嚴(yán)格的密碼子優(yōu)化會(huì)導(dǎo)致不想要的二級(jí)結(jié)構(gòu)或?qū)е露?jí)結(jié)構(gòu)的不希望的高GC含量。如此，二級(jí)結(jié)構(gòu)影響轉(zhuǎn)錄效率。在密碼子使用優(yōu)化后，可以使用如GeneOptimizer的程序以避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和優(yōu)化GC含量。在初始密碼子優(yōu)化后，這些另外的程序可以用于進(jìn)一步的優(yōu)化和錯(cuò)誤檢查以限制可在第一輪優(yōu)化后發(fā)生的二級(jí)結(jié)構(gòu)。用于優(yōu)化的可供選擇的程序是容易獲得的。在該方法的一些供選擇的方案中，載體包括為避免二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化的序列和/或序列被優(yōu)化為減少總GC/AT比的序列和/或序列被優(yōu)化以在人體中表達(dá)的序列。

標(biāo)記域也可以為本文描述的供選擇的實(shí)施方案提供重要的方面。利用細(xì)胞表面上的標(biāo)記域可以在與施用T細(xì)胞或轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞存在相關(guān)的毒性事件的事件中使轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞消融。例如，在EGFRt標(biāo)記序列的情況下，EGFR的全長(zhǎng)抗體可以用于結(jié)合于表達(dá)EGFR的細(xì)胞，并經(jīng)由抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)殺傷細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，對(duì)標(biāo)記域特異性的抗體可以連接于細(xì)胞毒性劑如放射性核素或毒素，導(dǎo)致產(chǎn)生能夠在在體內(nèi)消融或殺傷轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的治療劑。在一些供選擇的方案中，提供標(biāo)記序列用于富集和細(xì)胞選擇。在本文描述的示例性的供選擇的方案中，EGFRt標(biāo)記序列用于純化和富集使得針對(duì)EGFRt標(biāo)記進(jìn)行免疫磁性選擇的方法。

如本文描述的“間隔區(qū)”可以指長(zhǎng)度為如下的多肽鏈：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239或240個(gè)氨基酸或由任意兩個(gè)前述的長(zhǎng)度限定的范圍內(nèi)的長(zhǎng)度。間隔區(qū)可以包括任意的20個(gè)氨基酸，例如以任意順序以在嵌合抗原受體中建立希望長(zhǎng)度的多肽鏈，所述多肽鏈包括氨基酸精氨酸、組氨酸、賴(lài)氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和/或色氨酸。間隔區(qū)序列可以是嵌合抗原受體的scFv與跨膜域之間的接頭。在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在該方法的一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括長(zhǎng)度為如下的序列：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239或240個(gè)氨基酸或由任意兩個(gè)前述的長(zhǎng)度限定的范圍內(nèi)的長(zhǎng)度。在該方法的一些供選擇的方案中，間隔區(qū)存在于嵌合抗原受體的scFv和跨膜區(qū)之間。

如本文描述的“IgG4鉸鏈”是指在IgG4抗體的重鏈和輕鏈之間的多肽域。在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分隔、富集或分離表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，所述細(xì)胞因子優(yōu)選為外源添加的細(xì)胞因子，例如為除了由T細(xì)胞產(chǎn)生的或存在于培養(yǎng)基中的任何細(xì)胞因子以外的細(xì)胞因子；通過(guò)選擇由標(biāo)記序列編碼的標(biāo)記，富集轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、分隔的或分離的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；以及增殖富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。

在該方法的一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記的第四序列。在該方法的一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括人抗體的鉸鏈區(qū)。在該方法的一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在一些供選擇的方案中，IgG4鉸鏈區(qū)是修飾的IgG4鉸鏈。如本文描述的“修飾的IgG4鉸鏈”可以指與如SEQ ID NO：1(SEQ ID NO：1；ESKYGPPCPPCP)、SEQ ID NO：2(SEQ ID NO：2；YGPPCPPCP)、SEQ ID NO：3(SEQ ID NO：3；KYGPPCPPCP)或SEQ ID NO：4(SEQ ID NO：4；EVVKYGPPCPPCP)中所記載的鉸鏈區(qū)氨基酸序列具有至少90％、92％、95％或100％的序列一致性或由任意兩個(gè)前述的百分比限定的范圍內(nèi)的序列一致性的鉸鏈區(qū)。如上文提及的，可以針對(duì)在人體中表達(dá)使任意一個(gè)或多個(gè)這些序列密碼子優(yōu)化，并且可以使任意一個(gè)或多個(gè)這些序列密碼子優(yōu)化以減少二級(jí)結(jié)構(gòu)或GC/AT比，并且任意一個(gè)或多個(gè)這些序列可以是由至少兩個(gè)同種型基因產(chǎn)生的共有序列。

“跨膜域”是可位于細(xì)胞的雙層中以錨定嵌入生物膜的蛋白的疏水性蛋白的區(qū)域。不作為限制，跨膜域的拓?fù)鋵W(xué)可以是跨膜α螺旋。在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，載體包括編碼跨膜域的序列。在該方法的一些供選擇的方案中，跨膜域包括CD28跨膜序列或其片段，所述CD28跨膜序列或其片段為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度或由任意兩個(gè)前述的長(zhǎng)度限定的范圍內(nèi)的長(zhǎng)度。在該方法的一些供選擇的方案中，CD28跨膜序列或其片段包括長(zhǎng)度為28個(gè)氨基酸。在該方法的一些供選擇的方案中，跨膜域包括SEQ ID NO：5(SEQ ID NO：5；MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV)中所記載的序列。

“信號(hào)傳導(dǎo)域”也稱(chēng)為“共刺激域”，是與細(xì)胞內(nèi)部相互作用的蛋白或受體蛋白的胞內(nèi)域或胞漿域，并通過(guò)傳遞信號(hào)起作用。存在于細(xì)胞的胞內(nèi)部分的蛋白部分也被稱(chēng)作“內(nèi)域”。該相互作用可以通過(guò)經(jīng)由特異性蛋白-蛋白或蛋白-配體相互作用與效應(yīng)分子或效應(yīng)蛋白連通的胞內(nèi)域發(fā)生，所述效應(yīng)分子或效應(yīng)蛋白反過(guò)來(lái)可以沿信號(hào)鏈發(fā)送信號(hào)到達(dá)其目的地。信號(hào)傳導(dǎo)域或共刺激域也是指信號(hào)傳導(dǎo)部分，所述信號(hào)傳導(dǎo)部分向T細(xì)胞提供除了由例如TCR/CD3復(fù)合體的CD3ζ鏈提供的初級(jí)信號(hào)以外的信號(hào)，介導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答例如免疫應(yīng)答、激活、增殖、分化、細(xì)胞因子分泌、溶細(xì)胞活性、穿孔素和/或顆粒酶活性等。信號(hào)傳導(dǎo)域或共刺激域可以包括以下的所有或部分，但不限制于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和/或B7-H3和/或與CD83特異性結(jié)合的配體。

在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，編碼嵌合抗原受體的載體進(jìn)一步包括用于共刺激域的序列，其中共刺激域是與其他胞內(nèi)介質(zhì)相互作用以介導(dǎo)包括免疫應(yīng)答、激活、增殖、分化、細(xì)胞因子分泌、溶細(xì)胞活性、穿孔素和/或顆粒酶活性等的細(xì)胞應(yīng)答的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。在該方法的一些供選擇的方案中，載體包括編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的序列。在該方法的一些供選擇的方案中，信號(hào)傳導(dǎo)域包括4-1BB域和/或CD3-ζ域。在一些供選擇的方案中，4-1BB域包括在SEQ ID NO：6(SEQ ID NO：6；KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)中所記載的序列。在一些供選擇的方案中，CD3-ζ域包括在SEQ ID NO：7(SEQ ID NO：7；RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR)所記載的序列。

如本文描述的“嵌合抗原受體”(CAR)也被稱(chēng)為嵌合T細(xì)胞受體，是指人工T細(xì)胞受體或基因工程受體，其將希望的特異性移植至免疫效應(yīng)細(xì)胞上。這些受體例如可以用于將單克隆抗體或其結(jié)合部分的特異性移植至T細(xì)胞上；將編碼CAR的序列轉(zhuǎn)移至由反轉(zhuǎn)錄病毒載體促進(jìn)的受體細(xì)胞。CAR的結(jié)構(gòu)可以包括源自單克隆抗體的單鏈可變區(qū)片段(scFv)，所述單克隆抗體融合于CD3-ζ跨膜域和內(nèi)域。這樣的分子導(dǎo)致響應(yīng)于通過(guò)其靶標(biāo)的scFv識(shí)別的ζ信號(hào)的傳遞。

在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分隔、分離或富集表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激分離的、分隔的或富集的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸，如接觸至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；通過(guò)選擇標(biāo)記序列編碼的標(biāo)記富集、分隔或分離轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、分隔的或分離的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；以及增殖富集的、分隔的或分離的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體對(duì)CD19是特異性的。

使用稱(chēng)為“過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移”的技術(shù)，這些人工T細(xì)胞受體或CAR可以用于癌癥或病毒感染的治療。從患者中移除T細(xì)胞并修飾該T細(xì)胞，以便所述T細(xì)胞表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞或病毒，或病毒感染的細(xì)胞上顯示的分子特異性的受體?；蚬こ蘐細(xì)胞被重新引入患者體內(nèi)，所述基因工程T細(xì)胞可以識(shí)別和殺傷癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞，或促進(jìn)清除病毒。在一些供選擇的方案中，提供了治療、抑制或減輕有需要的受試者的疾病的方法。

在某些方面，方法可以包括施用至少一種組合物或產(chǎn)品組合，其中至少一種組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，其中基因修飾的T細(xì)胞群包括大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞，所述大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞不存在、富集自、實(shí)質(zhì)上分隔自或?qū)嵸|(zhì)上分離自表達(dá)CD8-和/或CD4-的T細(xì)胞，其中所述大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞具有刺激的CD2、CD3、CD4和/或CD28受體，其中所述大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼嵌合抗原受體和細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記的基因并且，其中所述大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞已經(jīng)被至少一種細(xì)胞因子重刺激如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間。在一些供選擇的方案中，通過(guò)過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移將至少一種組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。

如本文描述的“抗體”是指由免疫系統(tǒng)使用的漿細(xì)胞產(chǎn)生的用于鑒別和中和外來(lái)物如細(xì)菌和病毒的大的Y形蛋白?？贵w蛋白可包括四條多肽鏈；由二硫鍵連接的兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈。每條鏈由稱(chēng)作免疫球蛋白域的結(jié)構(gòu)域組成。這些域可以含有70-110個(gè)氨基酸并根據(jù)它們的大小和功能分為不同的類(lèi)別。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域是抗體片段，希望地是其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，存在于CAR上的抗體片段或其結(jié)合部分對(duì)CD19是特異性的。

“單鏈可變區(qū)片段”或scFv是包括以短接頭肽連接的免疫球蛋白的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)的融合蛋白。不作為限制，接頭可以包括用于柔性的甘氨酸和親水性氨基酸，如用于溶解性的絲氨酸或蘇氨酸。接頭可連接VH的N末端和VL的C末端，或者其可以連接VH的C末端和VL的N末端。在一些供選擇的方案中，存在于CAR上的配體結(jié)合域是單鏈可變區(qū)片段(scFv)。在一些供選擇的方案中，存在于CAR上的scFv域?qū)Υ嬖谟谀[瘤細(xì)胞上的CD19是特異性的。

“FMC63”是CD19特異性的單克隆抗體。CD19是在白細(xì)胞的表面上發(fā)現(xiàn)的蛋白，并且CD19可以與B淋巴細(xì)胞的抗原受體組裝以降低抗原受體依賴(lài)性刺激的閾值。CD19表達(dá)于濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞上。CD19存在于來(lái)自在發(fā)育為未成熟B細(xì)胞(B-cell blasts)的過(guò)程中的最早期可識(shí)別的B譜系細(xì)胞(earliest recognizable B-1ineage cells)，但是在成熟為漿細(xì)胞時(shí)丟失的B細(xì)胞上。CD19與CD21和CD81結(jié)合主要起B(yǎng)細(xì)胞共受體的作用。激活時(shí)，CD19的胞漿尾部變?yōu)榱姿峄?，?dǎo)致通過(guò)Src家族激酶結(jié)合和PI-3激酶募集。如T細(xì)胞上，數(shù)種表面分子形成抗原受體，并形成B淋巴細(xì)胞上的復(fù)合物。

CD19中的突變與表征為抗體產(chǎn)生減少的重度免疫缺陷綜合征相關(guān)。例如，在急性骨髓性白血病中，CD19的異常表達(dá)是單核細(xì)胞譜系的標(biāo)記。因?yàn)镃D19是B細(xì)胞的標(biāo)志，因此該蛋白可以用于診斷由該類(lèi)型的細(xì)胞引起的癌癥，尤其是B細(xì)胞淋巴瘤。自2011年以來(lái)，靶向CD19的治療已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)入試驗(yàn)。最新的在開(kāi)發(fā)工作中的實(shí)驗(yàn)性抗CD19藥物通過(guò)利用CD19的存在將治療特異性地指向B細(xì)胞癌癥。然而，目前顯現(xiàn)出該蛋白通過(guò)穩(wěn)定MYC癌蛋白的濃度在驅(qū)動(dòng)這些癌癥的生長(zhǎng)中起積極作用。因此，CD19和其下游信號(hào)傳導(dǎo)是引人注目的治療靶點(diǎn)。

在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分隔、富集、分離或純化表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的、分隔的、富集的或純化的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激分離的、分隔的、富集的或純化的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；通過(guò)選擇標(biāo)記富集轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；以及增殖富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。

在該方法的一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列。在該方法的一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在該方法的一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。

如本文描述的T細(xì)胞的“純化”，指的是高度純化的、功能性T細(xì)胞的分離，所述T細(xì)胞用于研究或用于產(chǎn)生用于治療的T細(xì)胞的方法。如本文描述T細(xì)胞的“分離”或T細(xì)胞的“分隔”指的是從污染的細(xì)胞群或其他組分中分離或分隔希望的T細(xì)胞、T細(xì)胞群或亞群，例如通過(guò)使用如間接淘選(indirect panning)等的技術(shù)。在該方法中，可以通過(guò)細(xì)胞結(jié)合于附著在支持物如塑料或聚碳酸酯表面、珠、顆粒、板或孔上的抗體的能力分離、分隔或選擇細(xì)胞。細(xì)胞可以基于具體的細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合。在一些情況下，希望的T細(xì)胞群是“富集的”意思是希望的T細(xì)胞群在富集之后大于該T細(xì)胞所來(lái)源的天然群的T細(xì)胞群。

在制備基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，使用CD8特異性抗體和/或CD4特異性抗體從不希望的組分中分離、富集、純化或分隔表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在該方法的一些供選擇的方案中，使用流式細(xì)胞術(shù)分離、富集或純化表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，使用免疫磁性選擇分離、富集、純化或分隔表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在該方法的一些供選擇的方案中，使用抗CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28、CD8、CD4和/或CD62L的抗體分離、富集、純化或分隔表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在該方法的一些供選擇的方案中，通過(guò)使用抗CD27、CD28和/或CD62L的抗體分離、富集、純化或分隔表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，用分離的、富集的或分隔的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞，在用于分離、富集或純化的混合T細(xì)胞群中不存在表達(dá)CD8+的細(xì)胞或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞比表達(dá)CD8+的細(xì)胞的量更豐富的情況下執(zhí)行所述方法。在一些供選擇的方案中，用分離的、富集的或分隔的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞，在用于分離、富集或純化的混合T細(xì)胞群中不存在表達(dá)CD4+的細(xì)胞或表達(dá)CD8+的T細(xì)胞比表達(dá)CD4+的細(xì)胞的量更豐富的情況下執(zhí)行所述方法。

T細(xì)胞的“刺激”或激活是指誘導(dǎo)T細(xì)胞起始應(yīng)答如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答，例如增殖，同時(shí)保存T細(xì)胞的生存力和免疫功能的方法。例如，刺激性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至TCR/CD3和CD8可觸發(fā)生理學(xué)激活和人T細(xì)胞的增殖。在適當(dāng)?shù)拇碳ぶ?，T細(xì)胞可以在體外大量增殖。在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分離、分隔、富集或純化表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的、分隔的、純化的或富集的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激分離的、分隔的、純化的或富集的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群；通過(guò)選擇標(biāo)記序列編碼的標(biāo)記，富集、分隔或分離轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；以及增殖富集的、分離的或分隔的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群至少1天，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，用抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒進(jìn)行刺激。在一些供選擇的方案中，用包括抗TCR、抗CD2、抗CD3、抗CD4和/或抗CD28抗體的抗體結(jié)合支持物進(jìn)行刺激。在一些供選擇的方案中，用包括抗CD3和/或抗CD28抗體的抗體結(jié)合支持物進(jìn)行刺激。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括移除抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒。

如本文使用的“T細(xì)胞”或“T淋巴細(xì)胞”可以來(lái)自任何哺乳動(dòng)物，優(yōu)選靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，包括人或猴子，伴侶動(dòng)物如狗、貓或馬，或家畜如綿羊、山羊或牛。在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞是與受體受試者同種異體的(來(lái)自相同物種但不同的供體)；在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞是自體的(供體與受體是相同的)；在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞是同基因的(供體與受體不同但是是同卵雙胞胎)。

從始至終同義使用的“表達(dá)CD8+的T細(xì)胞”或“CD8+T細(xì)胞”也被稱(chēng)為T(mén)C、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、CTL、T殺傷細(xì)胞、溶細(xì)胞的T細(xì)胞或殺傷T細(xì)胞。如本文描述，CD8+T細(xì)胞是可以殺傷癌細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞或損傷的細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞表達(dá)可以識(shí)別特異性抗原的T細(xì)胞受體(TCR)。CD8+T細(xì)胞在表面上表達(dá)CD8。表達(dá)CD8+的T細(xì)胞具有產(chǎn)生一些細(xì)胞因子的能力，然而CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量不具有促進(jìn)、改善、有助于或誘導(dǎo)移入適合性的濃度。

從始至終同義使用的“表達(dá)CD4+的T細(xì)胞”或“CD4+T細(xì)胞”也被稱(chēng)為T(mén)輔助細(xì)胞，其在免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。CD4+T細(xì)胞也通過(guò)釋放T細(xì)胞細(xì)胞因子幫助其他免疫細(xì)胞的活性。這些細(xì)胞幫助、抑制或調(diào)控免疫應(yīng)答。它們?cè)贐細(xì)胞抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換中，在細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活和生長(zhǎng)中以及在使吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞的殺菌活性最大化中是必需的。表達(dá)CD4+的T細(xì)胞具有產(chǎn)生一些細(xì)胞因子的能力，然而CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量不具有促進(jìn)、改善、有助于或誘導(dǎo)移入適合性的濃度。

成熟T細(xì)胞表達(dá)表面蛋白CD4，并被稱(chēng)為CD4+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞通常被視作具有作為免疫系統(tǒng)中的輔助T細(xì)胞的預(yù)定義的作用。例如，當(dāng)抗原提呈細(xì)胞在II類(lèi)MHC上表達(dá)抗原時(shí)，CD4+細(xì)胞會(huì)通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞相互作用的結(jié)合(例如CD40和CD40L)和通過(guò)細(xì)胞因子幫助那些細(xì)胞。然而，存在少有的例外；例如，調(diào)控T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的亞群表達(dá)CD4。所有后者的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群不能認(rèn)為是T輔助細(xì)胞。

如本文使用的“中樞記憶”T細(xì)胞(“T_CM”)是指在其表面上表達(dá)CD62L或CCR-7和CD45RO，而與初始細(xì)胞相比不表達(dá)CD45RA或CD45RA表達(dá)減少的抗原刺激過(guò)的(antigen experienced)CTL。在一些供選擇的方案中，中樞記憶細(xì)胞對(duì)CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和/或CD95的表達(dá)呈陽(yáng)性，并且與初始細(xì)胞相比具有減少的CD45RA表達(dá)。

如本文使用的“效應(yīng)記憶”T細(xì)胞(或“T_EM”)是指與中樞記憶細(xì)胞相比在其表面不表達(dá)CD62L或CD62L的表達(dá)減少，并且與初始細(xì)胞相比不表達(dá)CD45RA或CD45RA的表達(dá)減少的抗原刺激過(guò)的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，與初始細(xì)胞或中樞記憶細(xì)胞相比，效應(yīng)記憶細(xì)胞對(duì)于CD62L和/或CCR7的表達(dá)呈陰性，并具有可變的CD28和/或CD45RA的表達(dá)。

如本文使用的“初始”T細(xì)胞是指與中樞記憶細(xì)胞或效應(yīng)記憶細(xì)胞相比表達(dá)CD62L和/或CD45RA，和/或不表達(dá)CD45RO的未經(jīng)抗原刺激過(guò)的T淋巴細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，初始CD8+T淋巴細(xì)胞被表征為表達(dá)初始T細(xì)胞的表型標(biāo)記(包括CD62L、CCR7、CD28、CD127和/或CD45RA)。

如本文使用的“效應(yīng)”“T_E”T細(xì)胞是指與中樞記憶T細(xì)胞或初始T細(xì)胞相比，不表達(dá)CD62L、CCR7、CD28或CD62L、CCR7、CD28的表達(dá)減少，并且對(duì)于顆粒酶B和/或穿孔素呈陽(yáng)性的抗原刺激過(guò)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。

如本文描述的“移入適合性”是指在細(xì)胞通過(guò)過(guò)繼轉(zhuǎn)移進(jìn)入體內(nèi)(例如血流)后，細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的能力。移入通?？梢园l(fā)生在轉(zhuǎn)移之后2至4周內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)頻繁對(duì)特異性細(xì)胞檢查血球計(jì)數(shù)監(jiān)控移入。在提供的治療、抑制或減輕受試者疾病的方法的一些供選擇的方案中，方法可以包括施用如本文描述的包括基因修飾的T細(xì)胞的組合物或產(chǎn)品組合。在一些供選擇的方案中，方法可以進(jìn)一步包括通過(guò)檢查對(duì)表達(dá)嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的血球計(jì)數(shù)，例如通過(guò)鑒別與轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)記的存在或不存在，監(jiān)測(cè)受試者。

具有改善的移入適合性的T細(xì)胞在細(xì)胞表面上可以具有提供T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生和長(zhǎng)期維持的特異性標(biāo)記。存在對(duì)于T細(xì)胞激活和存活已知的數(shù)種蛋白。CD28是表達(dá)于T細(xì)胞上的蛋白，所述CD28提供T細(xì)胞激活和存活需要的共刺激信號(hào)。CD27是T細(xì)胞免疫的產(chǎn)生和長(zhǎng)期維持所需要的。它結(jié)合于配體CD70，并在調(diào)控B細(xì)胞激活和免疫球蛋白合成中起關(guān)鍵作用。L-選擇素也稱(chēng)為CD62L，是淋巴細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞粘附分子。L-選擇素起“歸巢受體”的作用以使淋巴細(xì)胞或T細(xì)胞經(jīng)高內(nèi)皮靜脈(high endothelial venues)進(jìn)入次級(jí)淋巴組織。存在于內(nèi)皮細(xì)胞上的配體會(huì)結(jié)合于表達(dá)L-選擇素的淋巴細(xì)胞，使通過(guò)血液的淋巴細(xì)胞運(yùn)輸(trafficking)減慢，并所述配體可以在該部位促進(jìn)進(jìn)入次級(jí)淋巴器官。在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，T細(xì)胞包括促進(jìn)、誘導(dǎo)、改善或有助于移入適合性的至少一種受體。在一些供選擇的方案中，至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在本文提供的一些供選擇的方案中，描述了這樣的方法，其中表達(dá)CD4+的T細(xì)胞和表達(dá)CD8+的T細(xì)胞通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)載體形式的遺傳物質(zhì)基因修飾，使得基因修飾的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞和表達(dá)CD8+的T細(xì)胞表達(dá)特異性嵌合抗原受體。在基因修飾的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞和表達(dá)CD8+的T細(xì)胞的一些供選擇的方案中，基因修飾的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞進(jìn)一步被修飾以改善或提高移入適合性。

如本文描述的“細(xì)胞因子”指的是在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中重要的小蛋白(5-25kDa)。細(xì)胞因子被細(xì)胞釋放，并影響其他細(xì)胞的行為，有時(shí)影響釋放細(xì)胞本身如T細(xì)胞。細(xì)胞因子可包括，例如趨化因子、干擾素、白介素、淋巴因子和腫瘤壞死因子。細(xì)胞因子可以通過(guò)一系列的細(xì)胞產(chǎn)生，所述細(xì)胞可包括例如免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞，以及內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和多種基質(zhì)細(xì)胞。

細(xì)胞因子可以通過(guò)受體起作用，由于細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)體液免疫應(yīng)答和基于細(xì)胞的免疫應(yīng)答之間的平衡并且細(xì)胞因子可以調(diào)控具體細(xì)胞群的成熟、生長(zhǎng)和響應(yīng)性，因此細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中是重要的。一些細(xì)胞因子通過(guò)復(fù)合方式提高或抑制其他細(xì)胞因子的作用。不作為限制，細(xì)胞因子可以包括例如酰化刺激蛋白、脂肪因子、白蛋白干擾素(Albinterferon)、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、趨化因子、集落刺激因子、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL9、紅細(xì)胞生成素、Gc-MAF、粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子的IL 10家族、細(xì)胞因子的IL 17家族、IL1A、IL1B、炎性體、干擾體(Interferome)、干擾素、干擾素β1a、干擾素β1b、干擾素γ、I型干擾素、II型干擾素、III型干擾素、自介素、白介素1家族、白介素1受體拮抗劑、白介素10、白介素12、白介素12亞單位β、白介素13、白介素15、白介素16、白介素2、白介素23、白介素23亞單位α、白介素34、白介素35、白介素6、白介素7、白介素8、白介素36、白血病抑制因子、白細(xì)胞促進(jìn)因子、淋巴因子、淋巴毒素、淋巴毒素α、淋巴毒素β、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞炎性蛋白、巨噬細(xì)胞激活因子、單核因子、肌因子(Myokine)、肌聯(lián)素(Myonectin)、煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、抑癌蛋白M、奧普瑞白介素、血小板因子4、促炎性細(xì)胞因子、Promega促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素(Promegapoietin)、RANKL、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1、黑色素瘤藥物(Talimogene laherparepvec)、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子、XCL1、XCL2、GM-CSF和/或XCR1。在制備基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，使轉(zhuǎn)導(dǎo)的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的、CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在該方法的一些供選擇的方案中，使用的至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，與細(xì)胞因子接觸的時(shí)間為至少1天，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間。

如本文描述的“白介素”或IL是免疫系統(tǒng)主要依賴(lài)的細(xì)胞因子。本文可使用的白介素的例子，例如包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、Il-7、IL-8/CXCL8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和/或IL-36。使T細(xì)胞與白介素接觸可具有促進(jìn)、支持、誘導(dǎo)或改善細(xì)胞的移入適合性的作用。IL-1，例如可以在T細(xì)胞的成熟和增殖中起作用。IL-2，例如，可以刺激T細(xì)胞應(yīng)答的生長(zhǎng)和分化。IL-3，例如，可以促進(jìn)骨髓系祖細(xì)胞的分化和增殖。IL-4，例如，可以促進(jìn)增殖和分化。IL-7，例如，可以促進(jìn)淋巴系祖細(xì)胞的分化和增殖，涉及B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的存活、發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)。IL-15，例如，可誘導(dǎo)天然殺傷細(xì)胞的產(chǎn)生。IL-21，例如，共刺激CD8+T細(xì)胞的激活和增殖，增加NK細(xì)胞毒性，增加CD40驅(qū)動(dòng)的B細(xì)胞增殖、分化和同種型轉(zhuǎn)換，并促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化。

在一些供選擇的方案中，提供了制備基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群純化、分隔、富集或分離CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的、分隔的、富集的或純化的T細(xì)胞群，所述CD8+T細(xì)胞和/或CD4+T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激分離、分隔、富集或純化的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；通過(guò)選擇標(biāo)記序列編碼的標(biāo)記，富集、分離或分隔轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、分離的或分隔的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；以及增殖富集的、分離的或分隔的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群至少1天，如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-18、IL-15、IL-2和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL/7、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在該方法的一些供選擇的方案中，細(xì)胞因子接觸進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在一些供選擇的方案中，添加至少一種細(xì)胞因子改善、提高、促進(jìn)或誘導(dǎo)移入適合性。在一些供選擇的方案中，以5ng/mL重組人IL-7(rhIL-7)和/或0.5ng/mL重組人IL-15(rhIL-15)接觸，例如增殖富集的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，以50U/mL重組人IL-2(rhIL-2)和/或0.5ng/mL重組人IL-15(rhIL-15)接觸，例如增殖富集的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞。在更多供選擇的方案中，以0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.6ng/mL、0.7ng/mL、0.8ng/mL、0.9ng/mL或1.0ng/mL rhIL-7或由任意兩個(gè)前述的量限定的范圍內(nèi)的量的rhIL-7和/或0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.6ng/mL、0.7ng/mL、0.8ng/mL、0.9ng/mL或1.0ng/mL rhIL-15或由任意兩個(gè)前述的量限定的范圍內(nèi)的量的rhIL-15接觸，例如增殖富集的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞。在更多供選擇的方案中，以10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL或100U/mL rhIL-2或由任意兩個(gè)前述的量限定的范圍內(nèi)的量的rhIL-2和/或0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.6ng/mL、0.7ng/mL、0.8ng/mL、0.9ng/mL或1.0ng/mL rhIL-7和/或0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.3ng/mL、0.4ng/mL、0.5ng/mL、0.6ng/mL、0.7ng/mL、0.8ng/mL、0.9ng/mL或1.0ng/mL rhIL-15或由任意兩個(gè)前述的量限定的范圍內(nèi)的量的rhIL-15接觸，例如增殖富集的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案，將前述的細(xì)胞因子和量聯(lián)合施用于T細(xì)胞，例如以混合的方式，或在添加一種之后不久添加另一種，以及在其他供選擇的方案中，使前述的細(xì)胞因子與T細(xì)胞分開(kāi)接觸，例如以1-10分鐘或1-10小時(shí)的時(shí)間段分開(kāi)。

本文中“富集的”和“貧化的”也用于描述在混合物中細(xì)胞類(lèi)型的量，指的是使細(xì)胞的混合物經(jīng)受過(guò)程或步驟，導(dǎo)致“富集的”類(lèi)型數(shù)量增加以及“貧化的(depleted)”類(lèi)型數(shù)量減少。因此，根據(jù)經(jīng)受富集過(guò)程的原始細(xì)胞群的來(lái)源，混合物或組合物可以包含60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多或由任意兩個(gè)這些值(數(shù)量或計(jì)數(shù))限定的范圍內(nèi)的任意值的“富集的”細(xì)胞，和40％、30％、20％、10％、5％或1％或更少或由任意兩個(gè)這些值(數(shù)量或計(jì)數(shù))限定的范圍內(nèi)的任意值的“貧化的”細(xì)胞。在制備基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，預(yù)期通過(guò)親和性選擇細(xì)胞表面標(biāo)記，富集轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，使得產(chǎn)生富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。

“增殖細(xì)胞”或增殖是指使細(xì)胞增殖、擴(kuò)增、生長(zhǎng)和復(fù)制。例如，典型地可以在適于T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的條件下孵育CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的培養(yǎng)物。在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD4+的T細(xì)胞至少1天，并可以增殖20天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD8+的T細(xì)胞至少1天，并可以增殖20天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。

如本文描述的“親和性選擇”是指，通過(guò)存在于細(xì)胞上的分子或標(biāo)記或表位與結(jié)合親和劑結(jié)合，選擇特異性分子或具有選擇性細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞，這使得選擇出感興趣的特異性分子或細(xì)胞。可以通過(guò)例如抗體、綴合的抗體、凝集素、適體和/或肽進(jìn)行親和性選擇。在制備基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，通過(guò)親和性選擇具有存在于CD8和/或CD4上的表位的T細(xì)胞，進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在該方法的一些供選擇的方案中，使用抗CD8或抗CD4抗體或其結(jié)合部分選擇出感興趣的細(xì)胞。在該方法的一些供選擇的方案中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在該方法的一些供選擇的方案中，通過(guò)免疫磁性選擇進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在該方法的一些供選擇的方案中，抗CD8或抗CD4抗體綴合于固體支持物，例如惰性珠或惰性顆粒。

如本文描述的“T細(xì)胞前體”指可以遷移至胸腺并成為不表達(dá)T細(xì)胞受體的T細(xì)胞前體的淋巴樣前體細(xì)胞。所有T細(xì)胞來(lái)源于骨髓中的造血干細(xì)胞。來(lái)自造血干細(xì)胞的造血祖細(xì)胞(淋巴系祖細(xì)胞)位于胸腺并通過(guò)細(xì)胞分裂擴(kuò)增以產(chǎn)生一大群不成熟的胸腺細(xì)胞。最早的胸腺細(xì)胞既不表達(dá)CD4也不表達(dá)CD8，并且因此被分類(lèi)為雙陰性(CD4^-CD8^-)細(xì)胞。隨著胸腺細(xì)胞通過(guò)發(fā)育進(jìn)展，它們成為雙陽(yáng)性胸腺細(xì)胞(CD4⁺CD8⁺)，并且最終成熟為單陽(yáng)性(CD4⁺CD8^-或CD4^-CD8⁺)胸腺細(xì)胞，然后從胸腺釋放至外周組織。大約98％的胸腺細(xì)胞在胸腺中的發(fā)育過(guò)程中通過(guò)陽(yáng)性選擇或陰性選擇失敗而死亡，而其他2％的胸腺細(xì)胞存活并離開(kāi)胸腺成為成熟的免疫活性T細(xì)胞。

前體T細(xì)胞的雙陰性(DN)階段集中于產(chǎn)生功能性β-鏈，而雙陽(yáng)性(DP)階段集中于產(chǎn)生功能性α-鏈，最終產(chǎn)生功能性αβT細(xì)胞受體。由于發(fā)育中的胸腺細(xì)胞進(jìn)展經(jīng)過(guò)4個(gè)DN階段(DN1、DN2、DN3和DN4)，T細(xì)胞表達(dá)不變的α-鏈但是重排β-鏈基因座。如果重排的β-鏈成功地與不變的α-鏈配對(duì)，產(chǎn)生停止β-鏈的重排(并沉默交互等位基因)，并且導(dǎo)致產(chǎn)生細(xì)胞增殖的信號(hào)。雖然這些信號(hào)需要在細(xì)胞表面處的這種前-TCR，但是他們依賴(lài)于結(jié)合于前-TCR的配體。這些胸腺細(xì)胞然后將表達(dá)CD4和CD8兩者并進(jìn)展至發(fā)生α-鏈選擇的雙陽(yáng)性(DP)階段。如果重排的β-鏈沒(méi)有導(dǎo)致任意信號(hào)傳導(dǎo)(例如由于不能與不變的α-鏈配對(duì))，細(xì)胞可能由于被忽略而死亡(缺少信號(hào)傳導(dǎo))。

如本文描述的“造血干細(xì)胞”或“HSC”，是可以引起骨髓系細(xì)胞的前體細(xì)胞，所述骨髓系細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞/血小板、樹(shù)突狀細(xì)胞和淋巴系(例如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞)。HSC具有異源群體，其中存在三類(lèi)干細(xì)胞，通過(guò)他們的在血液中淋巴系與骨髓系后代的比例(L/M)區(qū)分他們。

“深低溫保藏”是通過(guò)冷卻至零下溫度保存細(xì)胞、完整組織或易于損傷的物質(zhì)的方法。在低溫下，任何可對(duì)細(xì)胞、組織或問(wèn)題中的物質(zhì)引起傷害的酶活性或化學(xué)活性均有效停止。深低溫保藏方法尋求達(dá)到低溫而不引起在冷凍過(guò)程中因冰的形成而引起另外的損傷。傳統(tǒng)的深低溫保藏依賴(lài)于用稱(chēng)為深低溫保護(hù)劑的一類(lèi)分子包覆要冷凍的物質(zhì)。由于許多低溫保護(hù)劑的固有毒性，新的方法被持續(xù)地研究。深低溫保藏方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的一些供選擇的方案中，方法可以進(jìn)一步包括深低溫保藏基因修飾的T細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，提供了基因修飾的T細(xì)胞群，其中基因修飾的T細(xì)胞群，如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞(所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞)，包括大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞，所述表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或分離自CD8-和/或CD4-T細(xì)胞，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞具有刺激的CD2、CD3、CD4和/或CD28受體，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼嵌合抗原受體和細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記的基因，并且其中所述大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞已經(jīng)被至少一種細(xì)胞因子重刺激如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間。在一些供選擇的方案中，通過(guò)本文提供的方法產(chǎn)生選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL/7、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在基因修飾的T細(xì)胞群的一些供選擇的方案，大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括促進(jìn)、誘導(dǎo)、提高或有助于移入適合性的至少一種受體。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)、提高或有助于移入適合性的至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、提高、有助于或誘導(dǎo)移入適合性的至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，大量親和性選擇的表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞進(jìn)一步包括具有編碼前導(dǎo)序列的第一序列，編碼配體結(jié)合域的第二序列，編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記的第四序列的載體。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。在一些供選擇的方案中，細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在一些供選擇的方案中，群包括分離的或富集的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞，所述表達(dá)CD8+的T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，群包括分離的或富集的CD4+的T細(xì)胞，所述CD4+的T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD8+T細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療組合物是對(duì)治療疾病或癌癥有用的。在一些供選擇的方案中，提供了用于人治療的組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含藥用賦形劑和根據(jù)任意一種或多種可供選擇的T細(xì)胞的至少一種基因修飾的T細(xì)胞群或如本文描述制備或獲得的基因修飾的T細(xì)胞群。在用于人治療的組合物或產(chǎn)品組合的一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞，其中群包括分離的CD8+T細(xì)胞，不存在，富集超過(guò)，實(shí)質(zhì)上貧化CD4+T細(xì)胞。在用于人治療的組合物或產(chǎn)品組合的一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞，其中群包括分離的CD4+T細(xì)胞，不存在，富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD8+T細(xì)胞。在用于人治療的組合物或產(chǎn)品組合一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含1∶1的不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞，與不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，將基因修飾的T細(xì)胞群以CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10或由任意兩個(gè)這些比限定的范圍內(nèi)的比混合并施用或作為單獨(dú)的制劑聯(lián)合施用于有需要的受試者。在一些供選擇的方案中，將基因修飾的T細(xì)胞群以CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞的比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10或由任意兩個(gè)這些比限定的范圍內(nèi)的比混合并施用或作為單獨(dú)的制劑聯(lián)合施用于有需要的受試者。

如本文描述的“藥用賦形劑”或藥物溶媒可以指用作溶劑的載體或惰性介質(zhì)，于所述溶劑中配制和或施用用于治療的藥學(xué)活性劑或T細(xì)胞。溶媒可包括聚合物膠束、脂質(zhì)體、基于脂蛋白的載體、納米顆粒載體、樹(shù)枝狀分子和/或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于T細(xì)胞的溶媒。理想的溶媒或賦形劑可以是無(wú)毒性的、生物可相容的、無(wú)免疫原性的、生物可降解的并可以避免被宿主的防御機(jī)制識(shí)別。

在一些供選擇的方案中，提供了用于人治療的組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含藥用賦形劑和至少一種本文描述的任意的供選擇的方案中的基因修飾的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，賦形劑是藥物溶媒。在一些供選擇的方案中，藥物溶媒包括藥物組合物。

急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)或急性淋巴樣白血病是白細(xì)胞的癌癥，被表征為癌性的、未成熟白細(xì)胞(也稱(chēng)為成淋巴細(xì)胞)的過(guò)度產(chǎn)生。在具有ALL的患者中，成淋巴細(xì)胞在骨髓中過(guò)度產(chǎn)生，并持續(xù)增殖，通過(guò)抑制正常細(xì)胞例如紅血球和白細(xì)胞及血小板在骨髓中的產(chǎn)生和通過(guò)擴(kuò)散至其他器官，導(dǎo)致?lián)p傷和死亡。ALL在兒童期最常見(jiàn)，發(fā)病高峰在2-5歲以及在相對(duì)更高的年齡有另一高峰。

ALL的癥狀表明功能性血細(xì)胞產(chǎn)生減少，因?yàn)榘籽±速M(fèi)正常用于產(chǎn)生新的功能性血細(xì)胞的骨髓的資源。癥狀可包括發(fā)燒、感染風(fēng)險(xiǎn)增加、流血傾向增加、貧血、心跳過(guò)速、疲勞和頭痛。50-70％的兒童和40-50％的成人在初始治療后獲得完全地緩解，但是然后遭受復(fù)發(fā)，這些人能夠進(jìn)入第二次完全緩解。在第一次緩解后對(duì)復(fù)發(fā)的治療可以是標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)治療或?qū)嶒?yàn)性藥物或更積極的治療如干細(xì)胞移植。然而，對(duì)其他如急性骨髓性白血病和ALL，自發(fā)的涉及同種異體的造血干細(xì)胞移植(HSCT)的死亡率減少，可小于癌癥復(fù)發(fā)的可能性和相關(guān)的死亡率，因此同種異體治療對(duì)這些病癥可以是優(yōu)選的。因此需要這樣的方法改善用于治療白血病、髓性白血病和ALL的細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，提供了治療、抑制或減輕有需要的受試者的疾病，如癌癥，如ALL的方法，其中方法包括將至少一種本文描述的任意一個(gè)或多個(gè)供選擇的方案的組合物或產(chǎn)品組合施用于受試者，其中組合物或產(chǎn)品組合包含具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞，其中T細(xì)胞是轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞和/或CD4+T細(xì)胞。在該方法的一些供選擇的方案中，方法包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，所述基因修飾的T細(xì)胞群包括分離的CD8+T細(xì)胞，所述CD8+T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD4+T細(xì)胞。在該方法的一些供選擇的方案中，方法包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，所述基因修飾的T細(xì)胞群包括分離的CD4+T細(xì)胞，所述分離的CD4+T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞群包括分離的CD4+T細(xì)胞，所述CD4+T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD8+T細(xì)胞。在該方法的一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群所述T細(xì)胞群包括分離的CD8+T細(xì)胞，所述CD8+T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD4+T細(xì)胞。在該方法的一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含比為1∶1的不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞和不存在、富集超過(guò)或?qū)嵸|(zhì)上貧化CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，將基因修飾的T細(xì)胞群以CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10或由任意兩個(gè)這些比限定的范圍內(nèi)的比混合并施用或作為單獨(dú)的制劑聯(lián)合施用于有需要的受試者。在一些供選擇的方案中，將基因修飾的T細(xì)胞群以CD8+T細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞的比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10或由任意兩個(gè)這些比限定的范圍內(nèi)的比混合并施用或作為單獨(dú)的制劑聯(lián)合施用于有需要的受試者。在一些供選擇的方案中，鑒別或選擇受試者以接受抗癌治療。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括測(cè)量或評(píng)價(jià)疾病的抑制。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括在施用本文描述的任意一個(gè)或多個(gè)供選擇的方案的組合物或產(chǎn)品組合之前、期間或之后，向所述受試者提供另外的抗癌治療。在該方法的一些供選擇的方案中，通過(guò)過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移將本文描述的任意一個(gè)或多個(gè)供選擇的方案的組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。在一些供選擇的方案中，在所述受試者接受另一形式的抗癌治療后，將本文描述的任意一個(gè)或多個(gè)供選擇的方案的組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。在一些供選擇的方案中，在所述受試者接受另一形式的抗癌治療后，將本文描述的任意一個(gè)或多個(gè)供選擇的方案的組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。在一些供選擇的方案中，受試者患有白血病。在一些供選擇的方案中，受試者具有復(fù)發(fā)性和/或難治性CD19+兒童急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。在該方法的一些供選擇的方案中，受試者具有復(fù)發(fā)性和/或化學(xué)治療難治性CD19+急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。在該方法的一些供選擇的方案中，受試者患有自身免疫疾病。在該方法的一些供選擇的方案中，受試者患有HSCT后復(fù)發(fā)。

另外的供選擇的方案

載體、細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的方法

本文描述的組合物提供表達(dá)CD4+和/或CD8+的T淋巴細(xì)胞，所述T淋巴細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞。可以根據(jù)已知的技術(shù)收集T淋巴細(xì)胞，并且可以通過(guò)已知的技術(shù)富集或貧化細(xì)胞，如親和性結(jié)合于抗體如流式細(xì)胞術(shù)和/或免疫磁性選擇。在富集和/或貧化步驟之后，可以根據(jù)已知的技術(shù)進(jìn)行希望的T淋巴細(xì)胞的體外擴(kuò)增(包括但不限于Riddell等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,040,177，據(jù)此特別地通過(guò)引用全文并入)。在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞是自體T細(xì)胞，即獲得自細(xì)胞被遞送的患者。在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞是前體T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，前體T細(xì)胞是造血干細(xì)胞(HSC)。

例如，可以通過(guò)以下方法擴(kuò)增希望的T細(xì)胞群或亞群，即在體外將初始T淋巴細(xì)胞群添加至培養(yǎng)基中，然后添加至培養(yǎng)基飼養(yǎng)細(xì)胞如不分裂的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，(例如，這樣使得產(chǎn)生的細(xì)胞群對(duì)要擴(kuò)增的初始群中的每個(gè)T淋巴細(xì)胞含有至少5、10、20或40或更多個(gè)PBMC飼養(yǎng)細(xì)胞)；以及溫育培養(yǎng)物(例如，溫育足以擴(kuò)增T細(xì)胞的數(shù)量的時(shí)間)。不分裂的飼養(yǎng)細(xì)胞可以包括γ-輻射的PBMC飼養(yǎng)細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，用γ射線以3000、3200、3300、3400、3500或3600拉德或由任意兩個(gè)前述的拉德值限定的范圍內(nèi)的拉德輻射PBMC以防止細(xì)胞分裂。如需要，T細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞添加至培養(yǎng)基的順序可以顛倒?？梢栽谶m于T淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下溫育培養(yǎng)物。對(duì)人T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，例如溫度一般會(huì)在至少25℃，優(yōu)選30℃，更優(yōu)選37℃或由任意兩個(gè)這些溫度限定的范圍內(nèi)的其他溫度。

擴(kuò)增的T淋巴細(xì)胞包括可對(duì)人腫瘤或病原體上存在的抗原具有特異性并表達(dá)嵌合抗原受體的CD8⁺細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和CD4⁺輔助T淋巴細(xì)胞。

在另一供選擇的方案中，擴(kuò)增方法或增殖可以進(jìn)一步包括添加不分裂的EBV轉(zhuǎn)化的淋巴樣干細(xì)胞(LCL)作為飼養(yǎng)細(xì)胞?？梢杂?000、7000、8000、9000或10,000拉德，或由任意兩個(gè)前述的拉德值限定的范圍內(nèi)的拉德的γ射線輻射LCL?？梢砸匀魏芜m當(dāng)?shù)牧刻峁㎜CL飼養(yǎng)細(xì)胞，如LCL飼養(yǎng)細(xì)胞與初始T淋巴細(xì)胞比為至少10∶1。

在另一供選擇的方案中，擴(kuò)增方法或增殖可以進(jìn)一步包括將抗CD3和/或抗CD28抗體添加至培養(yǎng)基(例如，濃度為至少0.5ng/ml)。在另一種供選擇的方案中，制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法可進(jìn)一步包括將IL-2、IL-15和/或IL-21添加至培養(yǎng)基(例如，其中IL-2的濃度為至少10個(gè)單位/ml)。在另一種供選擇的方案中，制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法可進(jìn)一步包括將IL-7、IL-15和/或IL21添加至培養(yǎng)基(例如，其中IL-7的濃度為至少10個(gè)單位/ml)。在分離T淋巴細(xì)胞后，無(wú)論在擴(kuò)增前或擴(kuò)增后可以將細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和輔助T淋巴細(xì)胞兩者都分類(lèi)為初始T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞亞群。

也可以通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得CD8+細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，通過(guò)鑒別與CD8+細(xì)胞的那些類(lèi)型中的每一種相關(guān)的細(xì)胞表面抗原將CD8+細(xì)胞進(jìn)一步分選為初始細(xì)胞、中樞記憶細(xì)胞和效應(yīng)記憶細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，記憶T細(xì)胞存在于CD8+外周血淋巴細(xì)胞的CD62L+和CD62L-兩個(gè)亞集中。在用抗CD8和抗CD62L抗體染色后，將PBMC分選為CD62L-CD8+和CD62L+CD8+部分。在一些供選擇的方案中，中樞記憶T_CM的表型標(biāo)記的表達(dá)包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127，和/或?qū)︻w粒酶B和/或CD45RA呈陽(yáng)性或是低的。在一些供選擇的方案中，中樞記憶T細(xì)胞是CD28+、CD27+、CD45RO+、CD62L+和/或CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，初始CD8+T淋巴細(xì)胞被表征為初始T細(xì)胞的包括CD62L、CCR7、CD27、CD28、CD3、CD127和/或CD45RA的表型標(biāo)記的表達(dá)。

可以通過(guò)使用對(duì)表面標(biāo)記特異的特異性抗體和同種型匹配對(duì)照抗體的流式細(xì)胞術(shù)確定細(xì)胞或細(xì)胞群對(duì)具體的細(xì)胞表面標(biāo)記是否呈陽(yáng)性或是否表達(dá)具體的細(xì)胞表面標(biāo)記。對(duì)標(biāo)記陰性的細(xì)胞群指與特異性抗體不存在高于同種型對(duì)照的顯著結(jié)合的細(xì)胞群，表明缺乏所述標(biāo)記的表達(dá)；陽(yáng)性指細(xì)胞群的統(tǒng)一結(jié)合高于同種型對(duì)照，表明標(biāo)記表達(dá)。在一些供選擇的方案中，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的表達(dá)的減少指平均熒光強(qiáng)度損失1log10和/或顯示出標(biāo)記的細(xì)胞的百分比與參比細(xì)胞群相比減少至少20％的細(xì)胞、25％的細(xì)胞、30％的細(xì)胞、35％的細(xì)胞、40％的細(xì)胞、45％的細(xì)胞、50％的細(xì)胞、55％的細(xì)胞、60％的細(xì)胞、65％的細(xì)胞、70％的細(xì)胞、75％的細(xì)胞、80％的細(xì)胞、85％的細(xì)胞、90％的細(xì)胞、95％的細(xì)胞和100％的細(xì)胞或由任意兩個(gè)這些值限定的％范圍內(nèi)的任意％。在一些供選擇的方案中，對(duì)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記呈陽(yáng)性的細(xì)胞群指顯示出標(biāo)記的細(xì)胞的百分比當(dāng)與參比細(xì)胞群相比時(shí)，為至少50％的細(xì)胞、55％的細(xì)胞、60％的細(xì)胞、65％的細(xì)胞、70％的細(xì)胞、75％的細(xì)胞、80％的細(xì)胞、85％的細(xì)胞、90％的細(xì)胞、95％的細(xì)胞或100％的細(xì)胞或由任意兩個(gè)這些值限定的％范圍內(nèi)的任意％。

通過(guò)鑒別具有細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞群將CD4+T輔助細(xì)胞分為初始細(xì)胞、中樞記憶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法可以獲得CD4+淋巴細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，初始CD4+T淋巴細(xì)胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD27+、CD28+和/或CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，中樞記憶CD4+細(xì)胞是CD62L+和/或CD45RO+。在一些供選擇的方案中，效應(yīng)CD4+細(xì)胞是CD62L-和/或CD45RO-。在一些供選擇的方案中，效應(yīng)CD4+細(xì)胞是CD28+、CD27+和/或CD62L+。

在一些供選擇的方案中，可通過(guò)用抗原刺激初始T淋巴細(xì)胞或抗原特異性T淋巴細(xì)胞獲得抗原特異性CD4+群和CD8+群。例如，可以通過(guò)從感染的受試者中分離T細(xì)胞并在體外用相同抗原刺激產(chǎn)生針對(duì)巨細(xì)胞病毒抗原的抗原特異性T細(xì)胞系或克隆。也可以使用初始T細(xì)胞?？梢允褂脕?lái)自腫瘤細(xì)胞的任意數(shù)量的抗原作為靶標(biāo)以引起T細(xì)胞應(yīng)答。在一些供選擇的方案中，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療組合物在對(duì)包括實(shí)體瘤、惡性血液腫瘤、乳腺癌或黑色素瘤的疾病或紊亂治療中是有用的。

T淋巴細(xì)胞群的修飾

在一些供選擇的方案中，根據(jù)本發(fā)明將功能性基因引入待用于免疫治療的T細(xì)胞可以是希望的。例如，引入的基因或多個(gè)基因可以通過(guò)促進(jìn)轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞的生存力和/或功能改善治療的療效；或所述功能性基因可以提供遺傳標(biāo)記以及允許在體內(nèi)存活或遷移的選擇和/或評(píng)價(jià)；或所述功能性基因可以合并改善免疫治療的安全性的功能，例如通過(guò)使細(xì)胞易受體內(nèi)陰性選擇的影響，如Lupton S.D.等人，分子和細(xì)胞生物學(xué)(Mol.and Cell Biol.)，11：6(1991)；和Riddell等人，人基因治療(Human Gene Therapy)3：319-338(1992)描述；也可參見(jiàn)Lupton等人的公開(kāi)PCT/US9I/08442和PCT/US94/05601，描述了源自將顯性陽(yáng)性選擇標(biāo)記與陰性選擇標(biāo)記融合的雙功能選擇融合基因的用途，在此特別地通過(guò)引用將其二者全文并入。這可以根據(jù)已知的技術(shù)(見(jiàn)例如Riddell等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,040,177，第14-17欄，在此特別地通過(guò)引用將其全文并入)或根據(jù)本公開(kāi)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的其變體。在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞是前體T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，前體T細(xì)胞是造血干細(xì)胞(HSC)。

在一些供選擇的方案中，用如本文描述的嵌合受體修飾T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞獲得自要治療的受試者，在其他供選擇的方案中，淋巴細(xì)胞獲得自同種異體的人供體，優(yōu)選健康的人供體。在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞是前體T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，前體T細(xì)胞是造血干細(xì)胞(HSC)。

在一些供選擇的方案中，如本文描述，嵌合受體包括特異性結(jié)合于細(xì)胞上的表面分子的配體結(jié)合域、多肽間隔區(qū)區(qū)域、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域是源自單克隆抗體(mAb)的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的單鏈抗體片段(scFv)。經(jīng)通過(guò)將CD28和/或4-1BB的共刺激域融合于CD3ζ鏈的嵌合受體也可提供共刺激信號(hào)。嵌合受體對(duì)從HLA獨(dú)立的細(xì)胞表面分子是特異性的，因此克服了TCR識(shí)別的局限，包括HLA限制性和在腫瘤細(xì)胞上低水平的HLA表達(dá)。

在一些供選擇的方案中，可以將相同或不同的嵌合受體引入CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的每個(gè)群中。在一些供選擇的方案中，在這些群中的每一個(gè)中的嵌合受體具有特異性結(jié)合于在細(xì)胞上的相同配體的配體結(jié)合域。細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)組件可以不同。在一些供選擇的方案中，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域與CD4+輔助T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域相同。在其他供選擇的方案中，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域與CD4+輔助T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域不同。在一些供選擇的方案中，抗CD19 CAR被引入一個(gè)淋巴細(xì)胞群，以及EGFR特異性CAR被引入另一淋巴細(xì)胞群。

在一些供選擇的方案中，在如本文描述的在轉(zhuǎn)導(dǎo)之前將CD4或CD8T淋巴細(xì)胞中的每一個(gè)分選為初始細(xì)胞、中樞記憶細(xì)胞、效應(yīng)記憶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，在轉(zhuǎn)導(dǎo)之后將CD4或CD8T淋巴細(xì)胞中的每一個(gè)分選為初始細(xì)胞、中樞記憶細(xì)胞、效應(yīng)記憶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞。

已經(jīng)發(fā)展了各種轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)利用用于基因遞送的重組感染病毒顆粒。這代表當(dāng)前優(yōu)選的轉(zhuǎn)導(dǎo)本文描述的T淋巴細(xì)胞的方法。已經(jīng)用于該方法的病毒載體包括源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒載體和反轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載體。因此，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)方法是很多的但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引入和表達(dá)遺傳物質(zhì)的基本功能。數(shù)種上述的技術(shù)已經(jīng)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞或淋巴樣細(xì)胞，所述技術(shù)包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染；原生質(zhì)體融合；電穿孔；和用重組腺病毒、腺伴隨病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒載體感染。通過(guò)電穿孔和通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒感染已經(jīng)成功轉(zhuǎn)導(dǎo)了原代T淋巴細(xì)胞。

反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體提供了用于將基因轉(zhuǎn)移入真核細(xì)胞的高效的方法。此外，反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒的整合以控制的方式發(fā)生，并導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞中新的遺傳信息的一個(gè)或幾個(gè)拷貝的穩(wěn)定整合。

在一些供選擇的方案中，在T細(xì)胞中包括使在體外選擇陰性選擇性表型的細(xì)胞成為可能的陽(yáng)性標(biāo)記可能是有用的。陽(yáng)性選擇性標(biāo)記可以是基因，該基因在引入宿主細(xì)胞時(shí)，表達(dá)允許對(duì)攜帶該基因的細(xì)胞陽(yáng)性選擇的顯性表型。該類(lèi)型的基因是本領(lǐng)域已知的，并且包括尤其是給予潮霉素B抗性的潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)、來(lái)自Tn5的編碼抗生素G418抗性的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo或aph)、二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、腺苷脫氨酶基因(ADA)和多藥抗性(MDR)基因。在一些供選擇的方案中，陽(yáng)性標(biāo)記是用于細(xì)胞選擇的EGFR截短的蛋白。

如本領(lǐng)域熟知的可以采用各種方法轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，使用慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些供選擇的方案中，CD4+和CD8+細(xì)胞各自可以分別用編碼嵌合受體的表達(dá)載體修飾以形成定義的群。在一些供選擇的方案中，然后通過(guò)分選對(duì)那些細(xì)胞群中的每一個(gè)獨(dú)特的細(xì)胞表面抗原，將這些細(xì)胞進(jìn)一步分選為如上文描述的初始細(xì)胞、中樞記憶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的亞群。

在一些供選擇的方案中，選擇了響應(yīng)于抗原或腫瘤靶標(biāo)增殖的CD4+和CD8+細(xì)胞。例如，當(dāng)用抗原和腫瘤靶標(biāo)刺激時(shí)，與假轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，選擇了快速增殖的CD4+細(xì)胞或選擇了CD8+轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，選擇對(duì)承載抗原的細(xì)胞有細(xì)胞毒性的CD4+和CD8+細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，預(yù)期與CD8+細(xì)胞相比CD4+是弱細(xì)胞毒性的。

在另一種供選擇的方案中，選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的淋巴細(xì)胞，如CD8中樞記憶細(xì)胞，使用為特別類(lèi)型的癌癥建立的動(dòng)物模型以提供體內(nèi)細(xì)胞殺傷。這樣的動(dòng)物模型對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并且排除人類(lèi)。如本文描述，不是所有轉(zhuǎn)導(dǎo)入淋巴細(xì)胞的嵌合受體構(gòu)建體提供體內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，雖然這種能力能被激活并在體外殺傷細(xì)胞。

本公開(kāi)預(yù)期將在組合物中使用CD4+和CD8+T細(xì)胞的組合。在一種供選擇的方案中，可以將嵌合受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞的組合物與相同配體特異性的嵌合受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞組合，或與對(duì)有區(qū)別的腫瘤配體特異性的嵌合受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞組合。在其他供選擇的方案中，將嵌合受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞與對(duì)表達(dá)于腫瘤上的不同配體特異性的嵌合受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞組合。在又一種供選擇的方案中，將嵌合受體修飾的CD4+和CD8+細(xì)胞組合。在一些供選擇的方案中，可以以不同的比組合CD8+和CD4+細(xì)胞，例如CD8+與CD4+的比為1∶1，CD8+與CD4+的比為10∶1或CD8+與CD4+的比為100∶1或由任意兩個(gè)前述比值限定的范圍內(nèi)的比。在一些供選擇的方案中，在體外和/或在體內(nèi)測(cè)試組合的群的細(xì)胞增殖并且選擇提供細(xì)胞增殖的細(xì)胞的比。

如本文描述，本公開(kāi)預(yù)期CD4+和CD8+細(xì)胞可以進(jìn)一步被分隔為亞群，如初始細(xì)胞、中樞記憶細(xì)胞和效應(yīng)記憶細(xì)胞群。如本文描述，在一些供選擇的方案中，初始CD4+細(xì)胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD28+、CD27+和/或CD4+陽(yáng)性T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，中樞記憶CD4+細(xì)胞是CD62L陽(yáng)性的和/或CD45RO陽(yáng)性的。在一些供選擇的方案中，效應(yīng)CD4+細(xì)胞是CD62L陰性的和/或CD45RO陽(yáng)性的。這些群中的每個(gè)可以被嵌合受體獨(dú)立修飾。在一些供選擇的方案中，中樞記憶CD4+細(xì)胞是CD62L+、CD28+和/或CD27+細(xì)胞。

在對(duì)承載嵌合受體的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和/或選擇后，細(xì)胞群優(yōu)選在體外擴(kuò)增直到獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞以提供對(duì)人受試者的至少一次輸注典型地為約10⁴個(gè)細(xì)胞/kg至10⁹個(gè)細(xì)胞/kg。在一些供選擇的方案中，在抗原承載細(xì)胞、抗CD3、抗CD28、和IL 2、IL-7、IL 15或IL-21或其組合存在下培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，在抗體結(jié)合支持物，如珠或顆粒的存在下刺激T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，用抗體結(jié)合支持物刺激T細(xì)胞，其中抗體結(jié)合支持物包括抗TCR、抗CD2、抗CD3、抗CD4和/或抗CD28抗體。在一些供選擇的方案中，用抗體結(jié)合支持物刺激T細(xì)胞，其中抗體結(jié)合支持物包括抗CD3和/或抗CD28抗體。

可以將CD4+和CD8+細(xì)胞的亞群中彼此組合。在具體的供選擇的方案中，將修飾的初始或中樞記憶CD4+細(xì)胞與修飾的中樞記憶CD8+T細(xì)胞組合以對(duì)抗原承載細(xì)胞如在細(xì)胞表面上包括CD19的B細(xì)胞提供協(xié)同的細(xì)胞毒性作用。

組合物

本公開(kāi)提供了過(guò)繼細(xì)胞免疫治療組合物，該組合物包含如本文描述的基因修飾的T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑。

在一些供選擇的方案中，T淋巴細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括如本文所述的對(duì)與疾病或紊亂相關(guān)的配體特異的胞外抗體可變域、可定制的間隔區(qū)、跨膜域和T細(xì)胞受體或其他受體的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。在其他供選擇的方案中，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療組合物進(jìn)一步包含提供細(xì)胞免疫應(yīng)答的嵌合受體修飾的腫瘤特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括如本文所述的對(duì)與疾病或紊亂相關(guān)的配體特異的胞外單鏈抗體、可定制的間隔區(qū)、跨膜域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。

在一些供選擇的方案中，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療組合物包含嵌合受體修飾的腫瘤特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑，所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑提供細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD8+T細(xì)胞與源自CD45RO-CD62L+和/或CD4+T細(xì)胞的抗原反應(yīng)嵌合受體修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞的組合，以及藥學(xué)上可接受的載體，所述嵌合受體包括對(duì)與疾病或紊亂相關(guān)的配體特異性的胞外單鏈抗體、可定制的間隔區(qū)、跨膜域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。

在其他供選擇的方案中，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療組合物包含與提高CD8+免疫應(yīng)答的抗原反應(yīng)嵌合受體修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞組合的抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑，所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑提供源自患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中輔助T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括對(duì)與疾病或紊亂相關(guān)的配體特異性的胞外抗體可變域、可定制的間隔區(qū)、跨膜域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。

在進(jìn)一步的供選擇的方案中，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療組合物包含提高CD8+免疫應(yīng)答的抗原反應(yīng)嵌合受體修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞，其中輔助T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括對(duì)與疾病或紊亂相關(guān)的配體特異性的胞外抗體可變域、可定制的間隔區(qū)、跨膜域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域

在一些供選擇的方案中，CD4+T輔助淋巴細(xì)胞選自由初始CD4+T細(xì)胞、中樞記憶CD4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞和混合CD4+T細(xì)胞組成的組。在一些供選擇的方案中，CD4+輔助淋巴細(xì)胞是初始CD4+T細(xì)胞，其中初始CD4+T細(xì)胞包括CD45RO-、CD45RA+、CD62L+CD28+、CD27+和/或CD4+。在一些供選擇的方案中，CD8+T細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞選自由初始CD8+T細(xì)胞、中樞記憶CD8+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞和混合CD8+T細(xì)胞組成的組。在一些供選擇的方案中，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是中樞記憶T細(xì)胞，其中中樞記憶T細(xì)胞包括CD45RO+、CD62L+、CD27+、CD28+和/或CD8+T細(xì)胞。在其他的供選擇的方案中，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是中樞記憶T細(xì)胞，以及CD4+輔助T淋巴細(xì)胞是初始或中樞記憶CD4+T細(xì)胞。

本公開(kāi)提供了制備過(guò)繼免疫治療組合物的方法和使用這些組合物對(duì)患有疾病或紊亂的受試者進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的用途或方法。可通過(guò)使用疾病或紊亂的動(dòng)物模型和施用細(xì)胞并確定轉(zhuǎn)移細(xì)胞的存留和/或增殖能力來(lái)確定嵌合受體修飾的T細(xì)胞的增殖和存留。在其他供選擇的方案中，可以通過(guò)用抗原承載細(xì)胞進(jìn)行的多周期激活來(lái)測(cè)試增殖和激活。

在一些供選擇的方案中，制備組合物的方法包括：獲得修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞，其中修飾的輔助T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括如本文所述的對(duì)腫瘤細(xì)胞表面分子特異的配體結(jié)合域、定制的間隔區(qū)、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。

在另一供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括獲得修飾的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其中修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD8+細(xì)胞，所述嵌合受體包括如本文描述的對(duì)腫瘤細(xì)胞表面分子特異的配體結(jié)合域、定制的間隔區(qū)、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。

在另一種供選擇的方案中，方法包括獲得修飾的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其中修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD8+細(xì)胞，所述嵌合受體包括如本文描述的對(duì)腫瘤細(xì)胞表面分子特異的配體結(jié)合域、定制的間隔區(qū)、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域，并進(jìn)一步包括將修飾的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞與CD4+輔助細(xì)胞淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑組合。

在上文以及在實(shí)例中已經(jīng)描述了用嵌合受體修飾的CD4+和CD8+細(xì)胞的制劑。抗原特異性T淋巴細(xì)胞可以獲得自患有疾病或紊亂的患者，或可以通過(guò)在體外在抗原存在下刺激T淋巴細(xì)胞制備。未選擇用于抗原特異性的CD4+和/或CD8+T淋巴細(xì)胞亞群也可以如本文描述被分離并且在制備方法中組合。在一些供選擇的方案中，可以通過(guò)至少兩代評(píng)價(jià)細(xì)胞群的組合的細(xì)胞表面標(biāo)記的一致性、增殖能力以具有一致的細(xì)胞分化狀態(tài)。通過(guò)將表達(dá)靶配體的細(xì)胞系與嵌合受體修飾的T細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)量控制，以確定嵌合受體修飾的T細(xì)胞是否使用本領(lǐng)域已知的細(xì)胞毒性、增殖或細(xì)胞因子產(chǎn)生測(cè)定識(shí)別細(xì)胞系?？梢酝ㄟ^(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定嵌合受體修飾的T細(xì)胞上的細(xì)胞分化狀態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)記。在一些供選擇的方案中，CD8+細(xì)胞上的標(biāo)記和細(xì)胞分化狀態(tài)包括CD3、CD8、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4、CD45RO和/或CD45RA。在一些供選擇的方案中，CD4+細(xì)胞上的標(biāo)記和細(xì)胞分化狀態(tài)包括CD3、CD4、CD62L、CD28、CD27、CD69、CD25、PD-1、CTLA-4CD45RO和/或CD45RA。在一些供選擇的方案中，標(biāo)記包括CD45 RA、CD45RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，標(biāo)記包括CD27、CD28和/或CD62L。

一些供選擇的方案涉及用于治療、抑制或減輕有需要的受試者的疾病如癌癥，如ALL的方法，所述方法包括對(duì)有需要的患者抑制或延遲癌癥的進(jìn)展和/或轉(zhuǎn)移的方法，抑制或減少腫瘤或癌細(xì)胞存在的方法和/或抑制或減少靶標(biāo)表達(dá)CD19的細(xì)胞群的方法。這樣的方法涉及將提供細(xì)胞免疫應(yīng)答的基因修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑施用于有需要的受試者或患者，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括：編碼配體結(jié)合域的多核苷酸，其中配體是腫瘤特異性抗原或表達(dá)于靶T細(xì)胞群(例如CD19)上的任意其他分子，所述靶T細(xì)胞群適于通過(guò)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)識(shí)別和清除；編碼多肽間隔區(qū)的多核苷酸，其中多肽間隔區(qū)具有定制的長(zhǎng)度，其中間隔區(qū)提供與參比嵌合受體相比提高的T細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞因子產(chǎn)生；編碼跨膜域的多核苷酸；和編碼一個(gè)或多個(gè)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域的多核苷酸。

本公開(kāi)也提供在患有疾病或紊亂，如癌癥，如ALL的受試者中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法，所述方法包括：施用如本文描述的表達(dá)嵌合受體的淋巴細(xì)胞的組合物。在其他供選擇的方案中，方法包括將提供細(xì)胞免疫應(yīng)答的基因修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑施用于受試者，其中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括：如本文描述的對(duì)細(xì)胞表面分子特異性的配體結(jié)合域、定制的間隔區(qū)域、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域；以及將基因修飾的輔助T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑施用于受試者，所述基因修飾的輔助T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑引起直接識(shí)別和提高基因修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞基因細(xì)胞制劑介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，其中輔助T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括：如本文描述的對(duì)細(xì)胞表面分子特異性的配體結(jié)合域、定制的間隔區(qū)域、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。

雖然不限制本公開(kāi)的范圍，認(rèn)為在施用前選擇可以在體內(nèi)存留和增殖的嵌合受修飾的T細(xì)胞群可導(dǎo)致能夠使用低劑量的T細(xì)胞并提供更均一的治療活性。在一些供選擇的方案中，T細(xì)胞的劑量可以減少至少10％、20％或30％或更多。T細(xì)胞的劑量的減少可有利地減少風(fēng)險(xiǎn)或腫瘤溶解綜合征和細(xì)胞因子風(fēng)暴。

在另一種供選擇的方案中，在患有疾病或紊亂的受試者中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法包括：將基因修飾的輔助T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑施用于受試者，其中修飾的輔助T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合受體包括如本文描述的對(duì)腫瘤細(xì)胞表面分子特異性的配體結(jié)合域、定制的間隔區(qū)域、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括將基因修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑施用于受試者，其中修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞制劑包括具有嵌合受體的CD4+細(xì)胞，所述嵌合受體包括如本文描述的對(duì)腫瘤細(xì)胞表面分子特異性的配體結(jié)合域、定制的間隔區(qū)域、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域。

另一種供選擇的方案描述了對(duì)患有疾病或紊亂的受試者進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法，所述方法包括：分析受試者的生物樣品的與疾病或紊亂相關(guān)的靶分子(例如CD19)的存在，并施用本文描述的過(guò)繼免疫治療組合物，其中嵌合受體特異性結(jié)合于靶分子(CD19)。

在一些供選擇的方案中，在引入嵌合受體之前CD4+T輔助淋巴細(xì)胞選自由初始CD4+T細(xì)胞、中樞記憶CD4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞和混合CD4+T細(xì)胞組成的組。在特別的供選擇的方案中，CD4+輔助淋巴細(xì)胞是初始CD4+T細(xì)胞，其中初始CD4+T細(xì)胞包括CD45RO-、CD45RA+、CD28+、CD27+、CD62L+和/或CD4+。在另一種供選擇的方案中，在引入嵌合受體之前CD8+T細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞選自由初始CD8+T細(xì)胞、中樞記憶CD8+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+T細(xì)胞和混合CD8+T細(xì)胞組成的組。在特別的供選擇的方案中，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是中樞記憶T細(xì)胞，其中中樞記憶T細(xì)胞包括CD45RO+、CD62L+、CD28+、CD28+和/或CD8+。在特別的供選擇的方案中，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞是中樞記憶T細(xì)胞，以及CD4+輔助T淋巴細(xì)胞是初始CD4+T細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞均是用嵌合受體基因修飾的，所述嵌合受體包括特異性結(jié)合于細(xì)胞表面分子的抗體重鏈域。在其他供選擇的方案中，CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域與CD4輔助T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域相同。在另一種供選擇的方案中，CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域與CD4輔助T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)域不同。

可以施用本文描述的供選擇的方案的受試者包括人、其他靈長(zhǎng)類(lèi)如猴子和猿類(lèi)，伴侶動(dòng)物如狗、貓和馬，以及家畜動(dòng)物如豬、山羊、綿羊和牛。受試者可以是雄性或雌性，并且可以是任何適當(dāng)?shù)哪挲g，包括嬰幼兒、少年、青少年、成年和老年受試者。方法對(duì)治療例如CD19承載癌癥或細(xì)胞是有用的。

可以根據(jù)基于本公開(kāi)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的已知的技術(shù)或其變體在用于過(guò)繼免疫治療的方法和組合物中利用如上文制備的細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，通過(guò)以下方式配制細(xì)胞，即首先從細(xì)胞培養(yǎng)基中收獲細(xì)胞，然后洗滌并在適于以治療有效量施用的介質(zhì)和容器系統(tǒng)(“藥學(xué)上可接受的”載體)中濃縮細(xì)胞。適當(dāng)?shù)妮斪⒔橘|(zhì)可以是等滲介質(zhì)制劑，典型為生理鹽水、Normosol R(Abbott)或勃脈力A(Plasma-Lyte A)(Baxter)，而且也可以利用5％葡萄糖的水溶液或乳酸林格氏液?？梢杂锰ヅＱ逖a(bǔ)充輸注介質(zhì)。然后用細(xì)胞因子處理細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，與非細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群相比移入適合性提高或改善。為了產(chǎn)生移入適合性希望的改善的細(xì)胞，在T細(xì)胞的增殖期間希望地在體外添加細(xì)胞因子。如此，在修飾的T細(xì)胞的增殖期間，通過(guò)添加細(xì)胞因子進(jìn)行細(xì)胞因子-刺激分隔的CD4+和CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，用至少一種細(xì)胞因子刺激CD4+T細(xì)胞，其中至少一種細(xì)胞因子包括IL/7、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，用至少一種細(xì)胞因子刺激CD8+T細(xì)胞，其中至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21.

組合物中的細(xì)胞的治療或抑制有效的量是至少2個(gè)細(xì)胞亞集(例如1個(gè)CD8+中樞記憶T細(xì)胞亞集和1個(gè)CD4+輔助T細(xì)胞亞集)或是更典型地大于10²個(gè)細(xì)胞以及高達(dá)10⁶，高達(dá)以及包括10⁸或10⁹個(gè)細(xì)胞，以及可以大于10¹⁰個(gè)細(xì)胞或由任意兩個(gè)這些值限定的范圍內(nèi)的任意其他值。細(xì)胞的數(shù)量如同組合物中包括的細(xì)胞的類(lèi)型一樣，將取決于組合物預(yù)期的最終用途。例如，如果對(duì)具體抗原特異的細(xì)胞是希望的，那么群體將含有大于70％，一般大于80％、85％和90-95％的這樣的細(xì)胞。對(duì)本文提供的用途，細(xì)胞一般是以升或更少的體積計(jì)，可以是500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少，或由任意兩個(gè)這些值限定的范圍內(nèi)的任意其他值。因此希望的細(xì)胞的密度典型地大于10⁴個(gè)細(xì)胞/ml，以及一般為大于10⁷個(gè)細(xì)胞/ml，一般地10⁸個(gè)細(xì)胞/ml或更大。可以將臨床相關(guān)數(shù)量的免疫細(xì)胞分配至多次輸注物中，所述輸注物累積地等于或超過(guò)10⁶、10⁷、10⁸、10⁸、10⁹、10¹⁰或10¹¹個(gè)細(xì)胞或由任意兩個(gè)這些值限定的范圍內(nèi)的任意其他值。

在一些供選擇的方案中，本發(fā)明的淋巴細(xì)胞可用于賦予個(gè)體免疫性?！懊庖咝浴钡囊馑际桥c對(duì)病原體導(dǎo)致的感染或?qū)α馨图?xì)胞應(yīng)答針對(duì)的腫瘤的應(yīng)答相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)身體癥狀的減少。施用的細(xì)胞的量通常在存在于對(duì)病原體具有免疫性的正常個(gè)體的范圍內(nèi)。因此，通常通過(guò)輸注施用細(xì)胞，每次輸注在2個(gè)細(xì)胞、高達(dá)至少10⁶至3×10¹⁰個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)，優(yōu)選在至少10⁷至10⁹個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)。通過(guò)單次輸注或通過(guò)在一段時(shí)間內(nèi)的多次輸注施用T細(xì)胞。然而，因?yàn)轭A(yù)計(jì)不同個(gè)體在應(yīng)答能力上的變化，輸注的細(xì)胞的類(lèi)型和量，以及多次輸注給予的輸注的數(shù)量和時(shí)間范圍由主治醫(yī)師確定并可以由常規(guī)檢查確定。使用如本文例示的本發(fā)明的快速擴(kuò)增方法可容易獲得充足水平的T淋巴細(xì)胞(包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和/或輔助T淋巴細(xì)胞)的代次。見(jiàn)例如Riddell等人的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,040,177第17欄，特別地通過(guò)引用全文并入本文。

在一些供選擇的方案中，如本文描述的組合物經(jīng)靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、瘤內(nèi)、骨髓內(nèi)、淋巴結(jié)內(nèi)和/或腦脊髓液內(nèi)施用。

在一些供選擇的方案中，如本文描述的組合物與化學(xué)治療劑和/或免疫抑制劑施用。在供選擇的方案中，首先向患者施用抑制或破壞其他免疫細(xì)胞的化學(xué)治療劑，隨后施用本文描述的組合物。在一些情況下，可以完全避免化學(xué)治療。

施用于ALL的患者

從獲得自研究參與者的單采血液成分術(shù)(apheresis)產(chǎn)品分離CD4和CD8T細(xì)胞亞集。在用抗CD3×CD28珠刺激后，用指導(dǎo)共表達(dá)FMC63scFv：IgG4鉸鏈：CD28tm：4-1BB：ζCAR和選擇并追蹤自殺構(gòu)建體EGFRt的SIN慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞系。在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)受EGFRt免疫磁性陽(yáng)性選擇的時(shí)間期間，使用重組人細(xì)胞因子增殖轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞至適合于臨床使用超過(guò)10-20天的數(shù)量。在進(jìn)行淋巴細(xì)胞清除性化學(xué)治療(lymphodepleting chemotherapy)之后不久，將深低溫保藏的CD4/EGFRt+和CD8/EGFRt+T細(xì)胞產(chǎn)品解凍并臨床輸注，以使患者接受表明的方案規(guī)定的劑量水平(1＝0.5×10⁶/kg；2＝1×10⁶/kg；3＝5×10⁶/kg)的1∶1比的EGFRt+CD4和CD8T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，以5ng/mL重組人IL-7(rhIL-7)和/或0.5ng/mL重組人IL-15(rhIL-15)接觸，例如增殖富集的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，以50U/mL重組人IL-2(rhIL-2)和/或0.5ng/mL重組人IL-15(rhIL-15)接觸，例如增殖富集的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞。

所有入選的受試者(n＝16)具有滿足給藥規(guī)范的細(xì)胞產(chǎn)品，并且準(zhǔn)備好輸注。以不同的劑量水平(0.5×10⁶/kg-5×10⁶/kg的范圍)治療13名受試者(6個(gè)月-3歲/p HSCT)。輸注耐受良好，僅1例AE＞2級(jí)(與DMSO相關(guān)的3級(jí)過(guò)敏)。13名受試者中有12名對(duì)ORR具有響應(yīng)，即92％。13名受試者中有11名獲得MRD陰性CR(85％)。帶有高疾病負(fù)荷的受試者與MRD陰性骨髓相比具有更高的峰值PB CAR T細(xì)胞水平(62.7％相對(duì)于19.6％)。觀察到骨髓(n＝12)、外周血(n＝12)和CSF中的CAR T細(xì)胞擴(kuò)增的積累。丟失其T細(xì)胞移植物的5名受試者的平均存留持續(xù)時(shí)間為63天(范圍為42-150天)。

12名響應(yīng)受試者中的每一名發(fā)展了一些程度的CRS，以發(fā)熱和低血壓為標(biāo)志性癥狀。兩名受試者S02和S09需要針對(duì)sCRS的免疫調(diào)節(jié)治療(兩名用托珠單抗(tocilizumab)治療，并且一名添加地塞米松治療)。13名這些患者中的4名發(fā)展了腦病(2名1級(jí)、1名3級(jí)和1名4級(jí))。4級(jí)腦病是DLT，且伴隨癲癇和與PRES相似的異常MRI結(jié)果。MRI結(jié)果在治療后9周正?；鞘茉囌咴趶闹委熼_(kāi)始6個(gè)月的最后一次評(píng)估時(shí)保持具有癲癇。

如顯示的，定義的組合物CD4：CD8 CD19CAR/EGFRt+T細(xì)胞的規(guī)定劑量水平/kg的輸注在遭受HSCT后復(fù)發(fā)的小兒和年輕成人ALL患者中產(chǎn)生了令人鼓舞的MRD陰性CR的比率。因此，由16名入選患者中的每一個(gè)產(chǎn)生供體衍生的產(chǎn)物是可行的。對(duì)13名可評(píng)價(jià)的患者預(yù)期的毒性包括約30％ICU入住率的CRS，嚴(yán)重程度為輕度至重度的腦病。在所有劑量水平都觀察到了MRD陰性響應(yīng)，雖然早期數(shù)據(jù)顯示劑量逐漸上升時(shí)持久性提高。

雖然一名患者在T細(xì)胞治療后發(fā)展出急性GVHD，初步評(píng)估顯示CAR T細(xì)胞不是這種響應(yīng)的媒介。有趣地，強(qiáng)的松不影響T細(xì)胞移植物的持久性。如此，保持標(biāo)記CD28、CD27和CD62L的細(xì)胞與沒(méi)有用定義的細(xì)胞因子混合物處理并缺少移入適合性的標(biāo)記的細(xì)胞相比顯示高持久性，后者是當(dāng)前的處理方法所使用的T細(xì)胞。

圖18所示的是描述用于制備包括嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法的發(fā)展歷程的流程圖。如表明的，當(dāng)前的制備工序不具有Ficoll處理，而最初的實(shí)驗(yàn)方法包括Ficoll處理步驟。如圖19的流程圖所示還測(cè)試了細(xì)胞濃度的初始變化。在細(xì)胞因子的存在下還擴(kuò)增了細(xì)胞(圖20)。

如圖20所示，用供體樣品PD0064：PD0063 CD8+富集的T細(xì)胞在起始時(shí)在T25瓶中測(cè)試起始細(xì)胞密度。在正常的PLAT-02培養(yǎng)條件，IL-2(50U/ml)+IL-15(0.5ng/mL)下測(cè)試兩種細(xì)胞(來(lái)自PD0064、PD0063)。通過(guò)添加培養(yǎng)基和細(xì)胞因子使終細(xì)胞濃度達(dá)0.7×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，將來(lái)自供體樣品PD0080的細(xì)胞用于研究中以在Tx天測(cè)試細(xì)胞的擴(kuò)增(“早期擴(kuò)增”)?；谥榇碳さ娜兆颖欢x為第+0天，“Tx”自始至終是指第+1天。PD0063CD8+細(xì)胞被用作富集的起始物質(zhì)。使用與PD0064：PD0063 CD8+富集的細(xì)胞相同的細(xì)胞因子條件。實(shí)驗(yàn)測(cè)試了兩種細(xì)胞的密度，均顯示當(dāng)在細(xì)胞因子存在下細(xì)胞早期體積增加時(shí)，細(xì)胞更大的生存力和擴(kuò)增性。在上下文中“體積增加”是指用于在Tx之后初始喂養(yǎng)的培養(yǎng)基/細(xì)胞因子添加的體積在“早期擴(kuò)增”條件下更大，導(dǎo)致“早期擴(kuò)增”條件下的培養(yǎng)物中在該點(diǎn)的細(xì)胞密度降低。

如圖21所示的是細(xì)胞樣品PD104和PD0116的生長(zhǎng)和在實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)的比較。在添加如下的細(xì)胞因子，并且各自的濃度為：對(duì)于CD8+T細(xì)胞添加IL-2(50U/ml)+IL-15(0.5ng/mL)以及對(duì)于CD4+T細(xì)胞添加IL-7(5ng/mL)+IL-15(0.5ng/mL)下，將PD0104：PD0063 CD8+和CD4+富集的細(xì)胞用于重復(fù)前面的實(shí)驗(yàn)以測(cè)試在Tx天擴(kuò)增至0.7×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞(“早期擴(kuò)增”)。生長(zhǎng)和生存力顯著提高。這些曲線就生長(zhǎng)/珠移除/選擇/深低溫保藏的時(shí)機(jī)而言模擬在臨床產(chǎn)品所觀察到的現(xiàn)象。

將PD0116：PD0046 CD8+和CD4+富集的細(xì)胞用于重復(fù)前面的實(shí)驗(yàn)以測(cè)試在Tx天擴(kuò)增至0.7×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞(“早期擴(kuò)增”)。正常的PLAT-02培養(yǎng)條件，對(duì)于CD8細(xì)胞添加IL-2(50U/ml)+IL-15(0.5ng/mL)以及對(duì)于CD4細(xì)胞添加IL-7(5ng/mL)+IL-15(0.5ng/mL)。在V-197袋中PD116以180×10⁶個(gè)細(xì)胞開(kāi)始，然后在轉(zhuǎn)移袋中進(jìn)行磁性富集和離心感染細(xì)胞(spinoculation)。如所示的，從這些條件，生長(zhǎng)和生存力顯著提高。這些曲線就T細(xì)胞的生長(zhǎng)、珠移除、選擇和深低溫保藏的時(shí)機(jī)而言模擬在臨床產(chǎn)品所觀察到的現(xiàn)象。

通過(guò)添加培養(yǎng)基和細(xì)胞因子至終體積為0.7×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，將PD0116：PD0046 CD8+和CD4+富集的細(xì)胞用于重復(fù)實(shí)驗(yàn)以測(cè)試在Tx天擴(kuò)增細(xì)胞(“早期擴(kuò)增”)。執(zhí)行正常的PLAT-02培養(yǎng)條件，其中對(duì)于CD8細(xì)胞添加IL-2(50U/ml)+IL-15(0.5ng/mL)以及對(duì)于CD4細(xì)胞添加IL-7(5ng/mL)+IL-15(0.5ng/mL)。在V-197袋中PD116以180×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL開(kāi)始，然后在轉(zhuǎn)移袋中進(jìn)行磁性富集和離心感染細(xì)胞。這是用于向更新的制備方法過(guò)渡的全面數(shù)據(jù)。如圖21所示，與CD4+細(xì)胞相比，CD8+細(xì)胞的生長(zhǎng)擴(kuò)增增加。用于CD4+和CD8+細(xì)胞的細(xì)胞因子和使用的細(xì)胞因子的組合的變化描述于如圖22所示的流程圖中。

還對(duì)來(lái)自供體的CD8+和CD4+細(xì)胞測(cè)試了不同細(xì)胞因子條件。如圖23中圖片A-F所示，用IL2/IL15、IL7/IL15、IL2/IL7/IL15、IL2脈沖及IL7/IL15、僅IL2、IL2脈沖及IL7/IL21和IL2/IL15測(cè)試來(lái)自PD0047和PD0040的樣品。這包括單獨(dú)用IL-2(脈沖)溫育5天，然后添加IL-7/IL-21，然后所述IL-7/IL-21在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在；單獨(dú)用IL-2(脈沖)溫育5天，然后添加IL-7/IL-21和IL2/IL15，然后所述IL-7/IL-21和IL2/IL15在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在。PD0040：PD0038 CD8+富集的T細(xì)胞用于測(cè)試不同細(xì)胞因子混合物。每個(gè)條件的濃度是IL-2(50U/mL)、IL-7(5ng/mL)、IL-15(0.5ng/mL)。條件#4是IL-2脈沖5天，然后是IL-7/IL-21在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在。從小規(guī)模試驗(yàn)推測(cè)出倍數(shù)生長(zhǎng)和TNC。當(dāng)前使用的IL-2/IL-15顯示最佳擴(kuò)增。在該研究中，證實(shí)了IL-2/IL-15組合導(dǎo)致最佳擴(kuò)增。

如顯示的，PD0047：PD0038 CD8+富集的細(xì)胞用于測(cè)試不同細(xì)胞因子混合物。使用10U/mL終濃度的“低劑量”IL-2測(cè)試相同的細(xì)胞因子混合物。在不同組合中使用的個(gè)體細(xì)胞因子的濃度是：如圖例中所述的IL-2(50U/mL)和(10U/mL)，IL-7(5ng/mL)、IL-15(0.5ng/mL)、IL-21(5ng/mL)。脈沖條件是IL-2脈沖5天，然后是IL-7/IL-21在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在。從小規(guī)模試驗(yàn)推測(cè)出倍數(shù)生長(zhǎng)和TNC。IL-2/IL-15組合顯示最佳擴(kuò)增，并用于下面的實(shí)驗(yàn)?！罢！眲┝康腎L-2顯示最佳生長(zhǎng)。圖片A顯示在與不同的細(xì)胞因子條件溫育之后，PD0047在溫育第15天(D15)的結(jié)果和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較和以及陽(yáng)性細(xì)胞百分比(CD3+、CD62L+、CD3+/CD62L+/CD45RO-、CD28+、CDD45RA+/CD4RO-、CD45RA+/CD45RO_和CD45RA-/CD45RO+)。

圖片B顯示如上所表明的PD0047在第21天(D21)溫育之后的結(jié)果和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較以及陽(yáng)性細(xì)胞百分比。圖片C顯示PD0040第21天和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較，其中在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)22天后檢測(cè)總細(xì)胞數(shù)。圖片D顯示PD0040第21天和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較，如表明的在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)22天后檢測(cè)CD3+細(xì)胞生長(zhǎng)。圖片E顯示PD0047和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較，其中在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)22天后檢測(cè)總細(xì)胞數(shù)。圖片F(xiàn)顯示PD0047和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較，其中培養(yǎng)物生長(zhǎng)22天后檢測(cè)CD3+細(xì)胞生長(zhǎng)。如顯示的，PD0040：PD0038 CD8+富集的細(xì)胞用于測(cè)試不同細(xì)胞因子混合物。每個(gè)條件的濃度是：IL-2(50U/mL)、IL-7(5ng/mL)、IL-15(0.5ng/mL)。條件#4是IL-2脈沖5天，然后是IL-7/IL-21在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在。從小規(guī)模試驗(yàn)推測(cè)出倍數(shù)生長(zhǎng)和TNC。IL-2/IL-15組合顯示最佳擴(kuò)增并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外，PD0047：PD0038 CD8+富集的細(xì)胞用于測(cè)試不同細(xì)胞因子混合物。使用10U/mL終濃度的“低劑量”IL-2測(cè)試相同的細(xì)胞因子混合物。每個(gè)條件的濃度是：如圖例所述的IL-2(50U/mL)和(10U/mL)，IL-7(5ng/mL)、IL-15(0.5ng/mL)、IL-21(5ng/mL)。脈沖條件是IL-2脈沖5天，然后是IL-7/IL-21在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在。然后從小規(guī)模試驗(yàn)推測(cè)出倍數(shù)生長(zhǎng)和TNC。上文描述的研究中使用的IL-2/IL-15細(xì)胞因子組合顯示最佳擴(kuò)增?！罢！眲┝康腎L-2也顯示最佳生長(zhǎng)。用于表型生長(zhǎng)的流式細(xì)胞術(shù)是可使用的，并且在本文的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中說(shuō)明。

圖24所示的是測(cè)試細(xì)胞因子的不同組合的一系列實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。用PD0051：來(lái)自?xún)蓚€(gè)不同供體的CD8+細(xì)胞測(cè)試使用IL-2(50U/mL)和IL-15(0.5ng/mL)的“正?！奔?xì)胞因子條件。脈沖條件是IL-2脈沖5天，然后是IL-7(5ng/mL)、IL-21(5ng/mL)在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在。所示的倍數(shù)生長(zhǎng)和TNC來(lái)自從30×10⁶個(gè)細(xì)胞開(kāi)始的規(guī)模試驗(yàn)。當(dāng)前使用的IL-2/IL-15組合顯示了最佳擴(kuò)增，但是也可以從用IL-2脈沖然后轉(zhuǎn)換為IL-7/IL-21的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增。倍數(shù)擴(kuò)增在脈沖條件下與PD0047相似。

對(duì)于PD0055，測(cè)試與評(píng)估PD0051相同的細(xì)胞因子條件，但是使用CD4+供體細(xì)胞(與以上相同的供體PD0038)。細(xì)胞因子條件是IL-7(5ng/mL)和IL-15(0.5ng/mL)用于實(shí)驗(yàn)。脈沖條件是IL-2脈沖5天，然后是IL-7(5ng/mL)、IL-21(5ng/mL)在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在。倍數(shù)生長(zhǎng)和TNC來(lái)自從30×10⁶個(gè)細(xì)胞開(kāi)始的規(guī)模試驗(yàn)。當(dāng)前使用的IL-7/IL-15組合顯示通常的擴(kuò)增，然而從用IL-2脈沖然后轉(zhuǎn)換為IL-7/IL-21的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)更好的擴(kuò)增。圖片A顯示在第15天的PD0051和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較以及供體與供體細(xì)胞因子比較的陽(yáng)性細(xì)胞百分比(EGFRt+、EGFRt+/CD4+、EGFRt+/CD8+、CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD4+/CD8+、CD3+/CD8+、CD62L+、CD3+/CD8+、CD62L+、CD3+/CD28+、CD27+、CD127+、CD45RA+/CD45RO-、CD45RA+/CD45RO_/CD45RO_/CD45RA-、CD62+/CD28+)。圖片B顯示在第17天(D17)的PD0055和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較以及陽(yáng)性細(xì)胞百分比。圖片C顯示PD0051生長(zhǎng)曲線和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較，其中在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)20天后檢測(cè)總細(xì)胞數(shù)。圖片D顯示PD0051和用不同細(xì)胞因子生長(zhǎng)的比較，如表明的培養(yǎng)物生長(zhǎng)20天后檢測(cè)CD3+細(xì)胞生長(zhǎng)。圖片C和D顯示PD0051的生長(zhǎng)曲線(總細(xì)胞和CD3+)，比較了通過(guò)培養(yǎng)物中20天用表明的不同細(xì)胞因子溫育細(xì)胞后的生長(zhǎng)。圖片E和F顯示在表明的時(shí)間點(diǎn)即在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的第17天，用表明的不同細(xì)胞因子溫育后的供體PD0055的生長(zhǎng)曲線(總細(xì)胞和CD3+)。

圖25所示的是細(xì)胞因子測(cè)試實(shí)驗(yàn)，其中評(píng)價(jià)不同的細(xì)胞因子的組合對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增的影響。例如PD0059，進(jìn)行與所示的PD0051相同的細(xì)胞因子測(cè)試實(shí)驗(yàn)，除了該實(shí)驗(yàn)涉及測(cè)試新的CD4+和CD8+供體(PD0057)。對(duì)于CD4細(xì)胞使用IL-7(5ng/mL)和IL-15(0.5ng/mL)測(cè)試“正常”細(xì)胞因子條件，以及對(duì)于CD8+細(xì)胞使用IL-2(50U/mL)和IL-15(0.5ng/mL)測(cè)試“正常”細(xì)胞因子條件。脈沖條件是IL-2脈沖5天，然后是IL-7(5ng/mL)、IL-21(5ng/mL)在培養(yǎng)物的剩余物中一直存在。倍數(shù)生長(zhǎng)和TNC來(lái)自從30×10⁶個(gè)細(xì)胞開(kāi)始的規(guī)模試驗(yàn)。本研究中的“正?！奔?xì)胞因子組合導(dǎo)致了擴(kuò)增；用IL-2脈沖然后轉(zhuǎn)換為IL-7/IL-21之后觀察到良好的擴(kuò)增。

對(duì)PD0078，進(jìn)行與PD0051中相似的細(xì)胞因子研究，除了用不同的CD4+和CD8+供體(PD0063)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以外。使用“正常”細(xì)胞因子條件進(jìn)行測(cè)試，即對(duì)于CD4細(xì)胞使用IL-7(5ng/mL)和IL-15(0.5ng/mL)，對(duì)于CD8細(xì)胞使用IL-2(50U/mL)和IL-15(0.5ng/mL)，與僅有IL-2的條件對(duì)比。所有生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)第14天(D+14)處在正常平臺(tái)期，然后將培養(yǎng)物選擇為EGFRt。選擇CD8+細(xì)胞后沒(méi)有觀察到生存力和生長(zhǎng)的恢復(fù)。如圖片A所示的是解凍細(xì)胞后的陽(yáng)性細(xì)胞百分比。圖片B顯示了PD0059PLAT-02細(xì)胞因子對(duì)比。圖片C顯示了PD0059PLAT-02細(xì)胞因子對(duì)比和CD3+細(xì)胞生長(zhǎng)。圖片D顯示了PD0078生長(zhǎng)曲線。圖片D顯示了PD0078生長(zhǎng)曲線和CD3+細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖26所示的是說(shuō)明基于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞擴(kuò)增的初始擴(kuò)增方法以及更新的(或“當(dāng)前的”)擴(kuò)增方法的兩個(gè)流程圖，然后這些流程圖用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖27所示的是來(lái)自PD0080、PD0084和PD0085的樣品的生長(zhǎng)曲線，以及所有三個(gè)之間的比較。這三個(gè)實(shí)驗(yàn)是“早期擴(kuò)增”方法的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)這些實(shí)驗(yàn)，使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子條件：對(duì)于CD8+T細(xì)胞，IL-2(50U/mL)+IL-15(0.5ng/mL)；對(duì)于CD4+T細(xì)胞，IL-7(5ng/mL)+IL-15(0.5ng/mL)。對(duì)于PD0080，使用PD0063CD8+T細(xì)胞一式兩份地測(cè)試兩個(gè)起始密度。經(jīng)過(guò)在轉(zhuǎn)導(dǎo)日的3小時(shí)溫育后，每個(gè)細(xì)胞重復(fù)中的一個(gè)接受高達(dá)約0.7×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL的量。對(duì)于PD0084，評(píng)估兩種另外的CD8+供體T細(xì)胞的早期擴(kuò)增作用。使用30×10⁶個(gè)細(xì)胞的起始條件作為每個(gè)供體的對(duì)照，使用60×10⁶個(gè)細(xì)胞的起始密度與早期擴(kuò)增一起用作測(cè)試條件。對(duì)于PD0085，進(jìn)行與PD0084相似的測(cè)試，除了用CD4+T細(xì)胞測(cè)試早期擴(kuò)增以外。再次將30×10⁶起始細(xì)胞密度用作“正?！睂?duì)照條件，并且將60×10⁶個(gè)細(xì)胞的起始密度用作測(cè)試條件。

如圖28所示，PD0038起始物質(zhì)包括選擇的CD4+和CD8+細(xì)胞。生長(zhǎng)曲線顯示來(lái)自匯集在一起的細(xì)胞的兩個(gè)V-197袋的TNC。從早期發(fā)展來(lái)看，意圖是在深低溫保藏之前匯集至50∶50CD4∶CD8產(chǎn)品。流數(shù)據(jù)顯示匯集產(chǎn)品解凍后。珠移除和EGFRt富集，對(duì)于CD4+T細(xì)胞發(fā)生在D+14，對(duì)于CD8+細(xì)胞發(fā)生在D+15。CD8+T細(xì)胞生長(zhǎng)于IL-2(50U/mL)/IL-15(0.5ng/mL)中，并且CD4+T細(xì)胞生長(zhǎng)于IL-7(5ng/mL)/IL-15(0.5ng/mL)中。該方法改變?yōu)閷⒎指舻漠a(chǎn)品深低溫保藏并在解凍時(shí)以50∶50產(chǎn)品輸注。

圖29所示的是PD0046的生長(zhǎng)曲線。生長(zhǎng)曲線顯示來(lái)自在一起的細(xì)胞的兩個(gè)V-197袋的TNC。在早期發(fā)展中，具有在深低溫保藏前匯集50∶50CD4∶CD8產(chǎn)品的意圖。流數(shù)據(jù)顯示匯集產(chǎn)品解凍后。然后發(fā)生珠移除和EGFRt富集。CD4+T細(xì)胞發(fā)生在D+14，CD8+T細(xì)胞發(fā)生在D+15。CD8+T細(xì)胞生長(zhǎng)于IL-2(50U/mL)/IL-15(0.5ng/mL)中，以及CD4+T細(xì)胞生長(zhǎng)于IL-7(5ng/mL)/IL-15(0.5ng/mL)中。然而，該產(chǎn)品沒(méi)有起太大作用，因?yàn)楣w細(xì)胞解凍不充分。隨后使用細(xì)胞測(cè)試10％HA解凍并被證明要好得多。

圖30所示的是PD0063的生長(zhǎng)曲線。生長(zhǎng)曲線顯示來(lái)自在一起的細(xì)胞的兩個(gè)V-197袋的TNC。珠移除和EGFRt富集，然后顯示CD4+T細(xì)胞發(fā)生在D+14，CD8+T細(xì)胞發(fā)生在D+15。CD8+細(xì)胞生長(zhǎng)于IL-2(50U/mL)/IL-15(0.5ng/mL)中，并且CD4+細(xì)胞生長(zhǎng)于IL-7(5ng/mL)/IL-15(0.5ng/mL)中。然后發(fā)生珠移除和EGFRt富集。

圖31所示的是在細(xì)胞因子存在下生長(zhǎng)時(shí)從批量PBMC培養(yǎng)物中擴(kuò)增細(xì)胞。如所示的，CD4+細(xì)胞(●)在IL2和IL15存在下生長(zhǎng)。CD8+細(xì)胞(■)在IL7和IL15存在下生長(zhǎng)。圖31A和圖31B的下圖(表型比較)顯示了在不同條件下溫育后在其表面上表達(dá)指示的標(biāo)記的總細(xì)胞百分比，所述不同條件中的每一種均導(dǎo)致細(xì)胞表達(dá)移入適合性的標(biāo)記，例如CD62L、CD28、CD27、CD45RA。在IL-2/IL-15中生長(zhǎng)CD8富集培養(yǎng)物和在IL-7/IL-15中生長(zhǎng)CD4富集培養(yǎng)物產(chǎn)生兩種培養(yǎng)物的穩(wěn)健擴(kuò)增和記憶表型的強(qiáng)烈表達(dá)。

圖32所示的是富集的CD8+和CD4+細(xì)胞在細(xì)胞因子混合物中的擴(kuò)增。如樣品PD0044所示，富集的CD8+T細(xì)胞在IL2和IL15的存在下擴(kuò)增(上部圖片)。在樣品PD0044中，富集的CD4+T細(xì)胞在IL7和IL15的存在下擴(kuò)增超過(guò)20天。如所示的，匯集的CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD3、CD4、CD8、CD62L、CD28、CD27、CD45RA和CD45RO。還測(cè)試了樣品14602-S14(見(jiàn)圖32B)。如所示的，在IL-2/IL-15中生長(zhǎng)CD8富集的培養(yǎng)物和在IL-7/IL-15中生長(zhǎng)CD4富集的培養(yǎng)物產(chǎn)生兩種培養(yǎng)物的穩(wěn)健擴(kuò)增和記憶表型的強(qiáng)烈表達(dá)。重要地，從產(chǎn)生并示于圖31和圖32的數(shù)據(jù)，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞最佳地與不同細(xì)胞因子組合生長(zhǎng)，使得在這些研究中CD4+T細(xì)胞最佳用IL7和IL15進(jìn)行，而在這些研究中CD8+T細(xì)胞生長(zhǎng)最佳用IL2和IL15進(jìn)行。用它們各自的最佳細(xì)胞因子組合生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞在細(xì)胞擴(kuò)增后具有表型，其中細(xì)胞表達(dá)表面標(biāo)記CD45RA、CD62L、CD28和CD27，所述表面標(biāo)記表明在過(guò)繼轉(zhuǎn)移時(shí)高的或改善的或提高的移入適合性。

圖33所示的是來(lái)自使用細(xì)胞擴(kuò)增的原始PLAT-02(I期和II期臨床試驗(yàn))方法的14602-S01至14602-SO6的樣品。在深低溫保藏之前，細(xì)胞對(duì)EGFRt呈陽(yáng)性。測(cè)試細(xì)胞的生存力。如底部的表所示，細(xì)胞14602-SO3 CD8+和14602-SO3-CD8+細(xì)胞不表達(dá)CD3、CD62L、CD27、CD127、CD45RA/CD45RO-或CD45RA。

圖34所示的是對(duì)具有CD4+和CD8+T細(xì)胞兩者的細(xì)胞產(chǎn)品14602-SO4和14602-SO4-02的測(cè)試。細(xì)胞使用“早期擴(kuò)增”方法生長(zhǎng)于培養(yǎng)物中。在深低溫保藏之前測(cè)試細(xì)胞對(duì)EGFRt表達(dá)呈陽(yáng)性。

圖35所示的是來(lái)自樣品14602-SO7、14602-SO8和14602-SO9的細(xì)胞。使用早期擴(kuò)增方法擴(kuò)增CD4+和CD8+細(xì)胞。在上部圖片中，如表格中所示的14602-SO7 CD4+細(xì)胞和14602-SO7 CD8+細(xì)胞顯示在不同時(shí)間表達(dá)不同標(biāo)記(包括CD3、CD62L、CD27、CD27、CD127和CD45RA+)的細(xì)胞的百分比。在底部的圖片中在培養(yǎng)10天后樣品14602-SO8 CD4+和CD8+富集的T細(xì)胞保持存活。

圖36所示的是從批量樣品14602-S10、14602-S11、14602-S12和14602-S13中測(cè)試細(xì)胞的生存力。如所附表格顯示，在深低溫保藏前細(xì)胞均表達(dá)EGFRt。在至少12天的細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)試細(xì)胞的生存力。

圖37所示的是從批量樣品14602-S14、14602-S15、14602-S16和14602-S13中測(cè)試細(xì)胞的生存力。如所附表格顯示，在深低溫保藏前細(xì)胞均表達(dá)EGFRt。在至少12天的細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)試細(xì)胞的生存力。

如圖38所示的來(lái)自樣品14602的細(xì)胞對(duì)CD3、CD62L、CD28、CD127、CD45RA+/CD45RO-、CD45RA和CD45RO呈陽(yáng)性，CD4+和CD8+T細(xì)胞富集自所述的樣品14602的細(xì)胞。這些是特定的標(biāo)記，用于表明在用CD4+和CD8+細(xì)胞的特定的細(xì)胞因子組合處理后，CD4+和CD8+細(xì)胞二者均具有高水平的移入適合性。

圖39所示的是接種腫瘤(存活、腫瘤進(jìn)展)后的T細(xì)胞施用后小鼠的結(jié)果。如所示，用來(lái)自樣品PD0046的細(xì)胞注射小鼠表明細(xì)胞具有高的、改善的或提高的移入適合性，由于小鼠在用多種濃度的細(xì)胞施用80天后能夠存活。由于存活率百分比在第40天下降，樣品PD00044不具有高的、改善的或提高的移入適合性(圖39B)。

如圖40所示的是用來(lái)自PD0044和PD0046細(xì)胞批次的細(xì)胞處理的小鼠的平均腫瘤進(jìn)展。如圖所示，如果用來(lái)自PD0046批次的CD8+和CD4+T細(xì)胞施用于小鼠，則小鼠的腫瘤進(jìn)展減少，其中細(xì)胞最初在對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞合適的細(xì)胞因子混合物中生長(zhǎng)(對(duì)于CD4+T細(xì)胞：IL7/IL15，以及對(duì)于CD8+T細(xì)胞：IL2/IL15)。作為對(duì)照，溶媒細(xì)胞用PD0044和PD0046進(jìn)行的任一項(xiàng)研究中均不使腫瘤發(fā)展停止。如底部的圖片所示，在用來(lái)自PD0044樣品的細(xì)胞處理的小鼠中，腫瘤進(jìn)展增加，并且具體為當(dāng)用最小濃度的T細(xì)胞處理時(shí)大幅增加。與溶媒對(duì)照對(duì)比腫瘤進(jìn)展減少。

作為進(jìn)一步的測(cè)試，測(cè)試了三組小鼠，其中每個(gè)組具有總數(shù)為5只小鼠/組。對(duì)A組，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)安慰劑處理小鼠。B組利用來(lái)自“正?！睌U(kuò)增的細(xì)胞，所述細(xì)胞具有用Zrx-014轉(zhuǎn)導(dǎo)的1∶1EGFRt+CD4∶CD8。使用的細(xì)胞來(lái)自組PD0055#1(供體PD0038 CD4用5ng/ml IL7和0.5ng/ml IL15，S 1D14在75.9％EGFRt+下)和組PD0051#1(供體PD0038 CD8用50U/ml IL2和0.5ng/ml IL15，S1D21在76.8％EGFRt+下)。C組利用以細(xì)胞因子處理液“脈沖”的細(xì)胞，所述細(xì)胞包括用Zrx-014轉(zhuǎn)導(dǎo)的1∶1EGFRt+CD4∶CD8，PD0055#2(供體PD0038 CD4用50U/ml IL2脈沖5天，然后5ng/ml IL7和5ng/ml IL21，S1D21在89.5％EGFRt+下)。

如圖42所示的是對(duì)解凍后的細(xì)胞的FACS分析，所述細(xì)胞在JME13-25(PD0051和PD00055細(xì)胞)中用于注射到小鼠體內(nèi)。如所示的，兩種細(xì)胞樣品均具有表達(dá)EGFRt的CD8+和CD4+T細(xì)胞。

如圖43所示的是來(lái)自用安慰劑PBS(A組)、B組(PD00051“正常擴(kuò)增細(xì)胞”)和C組(PD00055，用細(xì)胞因子組合脈沖的細(xì)胞)處理的A、B和C組的三組小鼠。如所示的，A組中用安慰劑處理的小鼠具有在第20天明顯可見(jiàn)的腫瘤進(jìn)展。對(duì)于用PD0051(正常擴(kuò)增細(xì)胞)處理的B組小鼠，顯示在兩只小鼠中腫瘤進(jìn)展大幅增加。在C組中，用PD00055處理的小鼠僅顯示少量的腫瘤進(jìn)展，因此表明在用于處理前用細(xì)胞因子混合物處理的細(xì)胞具有更高的移入適合性。

如圖44所示的是施用3天后在小鼠中表達(dá)CAR的T細(xì)胞的存留。如表明的，與正常擴(kuò)增的細(xì)胞以及CD8+T細(xì)胞相比，表達(dá)CAR的CD4+T細(xì)胞具有更高的存留。

在用表達(dá)CAR的T細(xì)胞的T細(xì)胞治療之后檢測(cè)腫瘤進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)之后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定在在抗原重復(fù)暴露下在體外不同細(xì)胞因子條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞之間的殺傷能力在體內(nèi)是否具有差異(圖45)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)，使用3組小鼠，其中每組使用3只小鼠。對(duì)于A組，用安慰劑(PBS)處理小鼠。B組通過(guò)“正常擴(kuò)增方法”(“正常的”用Zrx-014轉(zhuǎn)導(dǎo)的1∶1EGFRt+CD4∶CD8PD0055#1(供體PD0038 CD4，用5ng/ml IL7和0.5ng/ml IL15，S1D14在75.9％EGFRt+下)PD0051#1(供體PD0038 CD8，用50U/ml/IL2和0.5ng/ml IL15，S1D21在76.8％EGFRt+下))擴(kuò)增的細(xì)胞處理(圖18)。C組用在擴(kuò)增過(guò)程中用細(xì)胞因子脈沖的細(xì)胞(“脈沖的”用Zrx-014轉(zhuǎn)導(dǎo)的1∶1EGFRt+CD4∶CD8，PD0055#2(供體PD0038 CD4，用50U/ml IL2脈沖5天，然后5ng/ml IL7和5ng/ml IL21，S1D11在81.2％EGFRt+下)PD0051#2(供體PD0038 CD8，用50U/ml IL2脈沖5天，然后5ng/ml IL7和5ng/ml IL21，S1D21在89.5％EGFRt+下))處理。

如圖46所示，A組小鼠在注射PBS后第20天死亡。用通過(guò)“正常擴(kuò)增方法”擴(kuò)增的細(xì)胞處理的B組小鼠在第120天，在一只小鼠中具有腫瘤進(jìn)展。然而，對(duì)于用以細(xì)胞因子擴(kuò)增的細(xì)胞處理的小鼠，在第120天小鼠沒(méi)有腫瘤。如此的數(shù)據(jù)表明用對(duì)CD4+和CD8+特異性的細(xì)胞因子混合物處理的細(xì)胞導(dǎo)致更高的移入率和小鼠增加的存活率。另外，在預(yù)防腫瘤進(jìn)展中細(xì)胞是更有效的。

如圖47所示，當(dāng)用PD0051和PD0055細(xì)胞在腫瘤接種后處理小鼠時(shí)，小鼠具有100％的存活率。然而，當(dāng)使用PD0055細(xì)胞處理時(shí)，腫瘤進(jìn)展顯示降低。

如圖48所示，檢測(cè)用安慰劑、在“正常擴(kuò)增”方法下生長(zhǎng)的T細(xì)胞和以細(xì)胞因子組合脈沖的T細(xì)胞處理的小鼠的平均腫瘤進(jìn)展。對(duì)在第0天的實(shí)驗(yàn)，將小鼠接種腫瘤，在第6天對(duì)腫瘤成像。在第7天，施用T細(xì)胞或安慰劑。然后在第14天和第21天重復(fù)接種腫瘤。

在第28、35、49、63、78、92、105和120天檢測(cè)小鼠的腫瘤進(jìn)展，其中拍下腫瘤的圖像。如各組小鼠所示的，在用以細(xì)胞因子脈沖的細(xì)胞處理的小鼠中腫瘤進(jìn)展降低，因此表明以細(xì)胞因子脈沖的細(xì)胞比在正常條件下沒(méi)有細(xì)胞因子擴(kuò)增的細(xì)胞具有更高的、改善的或提高的移入適合性。

如圖49所示，建立實(shí)驗(yàn)以確定在與PLAT-01和PLAT-02以及“中間”方案相同條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞之間在殺傷能力方面在體內(nèi)是否具有差異。對(duì)于實(shí)驗(yàn)，在腫瘤接種后的小鼠處理中使用17組，每組5只小鼠測(cè)試細(xì)胞。各組給予細(xì)胞劑量(1.25×10⁶、2.5×10⁶、5×10⁶、10×10⁶)每種產(chǎn)品條件，如圖49的表中所示的。在同一天將細(xì)胞解凍、計(jì)數(shù)并注射入小鼠體內(nèi)。如圖50所示，是來(lái)自?xún)煞N擴(kuò)增方法的不同細(xì)胞產(chǎn)品中的CD4+和CD8+細(xì)胞的量和細(xì)胞中它們的EGFRt的量。

如圖51所示，將17組小鼠接種腫瘤，然后用在正常擴(kuò)增方法下擴(kuò)增的T細(xì)胞或以細(xì)胞因子組合脈沖的T細(xì)胞以劑量調(diào)整處理。如圖中所見(jiàn)，以更高濃度的PLAT-1.00細(xì)胞給藥的小鼠的腫瘤進(jìn)展降低。以PLAT-2.00給藥的小鼠也可見(jiàn)在以更高濃度的細(xì)胞施用25天后腫瘤發(fā)展降低。然而，對(duì)于用PLAT-1.33給藥的小鼠，無(wú)論細(xì)胞濃度，可見(jiàn)小鼠腫瘤進(jìn)展增加，表明這些細(xì)胞的低的或降低的移入適合性。對(duì)于給予來(lái)自PLAT-1.67的細(xì)胞的小鼠，當(dāng)在施用中以最高濃度細(xì)胞處理時(shí)，小鼠具有降低的腫瘤進(jìn)展。然而如圖50所記載的，PLAT-1.33的細(xì)胞也具有低的EGFRt計(jì)數(shù)，這也說(shuō)明細(xì)胞表面上CAR量的減少。

圖51所示的是PD104和PD116細(xì)胞產(chǎn)品之間的初始比較，對(duì)于PD0104產(chǎn)品，PD0063 CD8+和CD4+富集的細(xì)胞用于重復(fù)試驗(yàn)以測(cè)試在第Tx天細(xì)胞擴(kuò)增至0.7×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL(“早期擴(kuò)增”)。對(duì)于正常PLAT-02培養(yǎng)條件，對(duì)于CD8+細(xì)胞使用IL-2(50U/ml)+IL-15(0.5ng/mL)，以及對(duì)于CD4+T細(xì)胞使用IL-7(5ng/mL)+IL-15(0.5ng/mL)。生長(zhǎng)和生存力顯著增加。這些曲線就生長(zhǎng)/珠移除/選擇/深低溫保藏的時(shí)機(jī)而言模擬在臨床產(chǎn)品所觀察到的現(xiàn)象。

如圖52所示，用PLAT-1.00、PLAT-1.33、PLAT-1.67和PLAT-2.00的劑量調(diào)整的細(xì)胞產(chǎn)品處理。如所有圖中所示，細(xì)胞的最低濃度在腫瘤進(jìn)展處理中是有效性最小。然而，顯示最大移入適合性的細(xì)胞是更高濃度的PLAT-1.00和the PLAT-2.00。

如圖53所示，所有細(xì)胞在濃度1.25x10⁶下有效性最小。來(lái)自PLAT-1.00的細(xì)胞顯示在抑制腫瘤進(jìn)展時(shí)是最有效的，表明細(xì)胞的移入適合性與其他組相比是優(yōu)越的或改善的或提高的，并且表明用細(xì)胞因子處理也促進(jìn)、改善或提高細(xì)胞的移入適合性。如在5×10⁶的濃度下所示，與用于處理小鼠的其他組的細(xì)胞相比，在第25天腫瘤進(jìn)展停止，

如圖54所示，如果用2.5×10⁶至10×10⁶個(gè)細(xì)胞每劑的細(xì)胞劑量處理小鼠，小鼠具有更高的存活率。然而，用來(lái)自PLAT-1.00產(chǎn)品的細(xì)胞處理的小鼠具有更長(zhǎng)的存活率，表明來(lái)自該組的T細(xì)胞更穩(wěn)健并展示了更高的、改善的或提高的移入適合性。

如圖55所示，小鼠的存活決定于細(xì)胞的劑量濃度。對(duì)于所有細(xì)胞，在使用最低劑量的T細(xì)胞處理下，小鼠的存活率減少。然而，如前面所示的用來(lái)自PLAT-1.00產(chǎn)品的細(xì)胞處理的小鼠具有更長(zhǎng)的存活率，表明來(lái)自該組的T細(xì)胞更穩(wěn)健并具有改善的移入適合性。

另外的供選擇的方案

在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分隔、分離或富集CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分離的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞；刺激獲得的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體和標(biāo)記序列，其中所述標(biāo)記序列編碼細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群與至少一種細(xì)胞因子接觸，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；通過(guò)選擇標(biāo)記序列富集轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；以及增殖富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群至少1天，以獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，通過(guò)親和性選擇具有存在于CD8和/或CD4上的表位的T細(xì)胞從混合的T細(xì)胞群分隔CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，通過(guò)免疫磁性選擇進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，基因修飾的CD8+T細(xì)胞和/或CD4+T細(xì)胞包括至少一種促進(jìn)移入適合性的受體。在一些供選擇的方案中，至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，通過(guò)使CD8+和/或CD4+T細(xì)胞與抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒接觸進(jìn)行刺激分離的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，抗體結(jié)合支持物包括抗TCR、抗CD2、抗CD3、抗CD4和/或抗CD28抗體。在一些供選擇的方案中，抗體結(jié)合支持物包括抗CD3和/或抗CD28抗體。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。在一些供選擇的方案中，標(biāo)記序列編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL/7、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，接觸進(jìn)行2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)這些值限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在一些供選擇的方案中，用不存在CD8+細(xì)胞的分離的CD4+細(xì)胞執(zhí)行方法。在一些供選擇的方案中，用不存在或富集超過(guò)CD4+細(xì)胞的分離的CD8+細(xì)胞執(zhí)行方法。在一些供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD4+的T細(xì)胞至少1天，以及可增殖20天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在一些供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD8+的T細(xì)胞至少1天，以及可增殖20天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括移除抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒。在一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，嵌合抗原受體的配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括深低溫保藏基因修飾的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，提供了基因修飾的T細(xì)胞群，其中基因修飾的T細(xì)胞群包括大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞，所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或分離自CD8-和/或CD4-T細(xì)胞，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞具有刺激的CD2、CD3、CD4和/或CD28受體，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼嵌合抗原受體和細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記的基因，并且其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞已經(jīng)被至少一種細(xì)胞因子重刺激。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-18、IL-15、IL-2和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL/7、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括具有編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列的載體。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。在一些供選擇的方案中，細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在一些供選擇的方案中，群包括不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，群包括不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，提供了用于人治療的組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含藥用賦形劑和至少一種基因修飾的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，至少一種基因修飾的T細(xì)胞群包括大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞，所述親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或分離自CD8-和/或CD4-T細(xì)胞，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞具有刺激的CD2、CD3、CD4和/或CD28受體，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼嵌合抗原受體和細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記的基因，并且其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞已經(jīng)被至少一種細(xì)胞因子重刺激。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL/7、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括具有編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列的載體。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。

在一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。在一些供選擇的方案中，細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在一些供選擇的方案中，至少一個(gè)群包括不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，至少一個(gè)群包括不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，其中基因修飾的T細(xì)胞群包括不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，其中基因修飾的T細(xì)胞群包括不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，群包括以1∶1的比混合或聯(lián)合施用的不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞與不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。

在一些供選擇的方案中，提供了治療、抑制或減輕有需要的受試者的疾病的方法，其中方法包括將至少一種組合物或產(chǎn)品組合施用于受試者。在一些供選擇的方案中，至少一種組合物或產(chǎn)品組合包括藥用賦形劑和至少一種基因修飾的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，至少一種基因修飾的T細(xì)胞群包括大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞，所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞不存在、富集超過(guò)或分離自CD8-和/或CD4-T細(xì)胞，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞具有刺激的CD2、CD3、CD4和/或CD28受體，其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括編碼嵌合抗原受體和細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記的基因，并且其中所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞已經(jīng)被至少一種細(xì)胞因子重刺激。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL/7、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在一些供選擇的方案中，所述大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括促進(jìn)移入適合性的至少一種受體。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)、有助于或提高移入適合性的至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，大量親和性選擇的CD8+和/或CD4+T細(xì)胞進(jìn)一步包括具有編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列的載體。在一些供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列。在一些供選擇的方案中，間隔區(qū)包括IgG4鉸鏈。在一些供選擇的方案中，載體是病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。在一些供選擇的方案中，病毒載體是慢病毒載體。在一些供選擇的方案中，細(xì)胞表面選擇性標(biāo)記編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括抗體或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括單鏈可變區(qū)片段(scFv)或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域包括FMC63或其結(jié)合部分。在一些供選擇的方案中，配體結(jié)合域?qū)D19是特異性的。在一些供選擇的方案中，至少一個(gè)群包括不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，至少一個(gè)群包括不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，其中基因修飾的T細(xì)胞群包括不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，組合物或產(chǎn)品組合包含基因修飾的T細(xì)胞群，其中基因修飾的T細(xì)胞群包括不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，群包括以1∶1的比混合或聯(lián)合施用的不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞與不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，方法包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含至少一個(gè)群，其中至少一個(gè)群包括不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，方法包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含至少一個(gè)群，其中至少一個(gè)群包括不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，方法包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包含至少一個(gè)群，其中至少一個(gè)群包括以1∶1的比混合或聯(lián)合施用的不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞與不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包括至少一個(gè)群，其中至少一個(gè)群包括不存在或富集超過(guò)CD4+T細(xì)胞的分離的CD8+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括施用組合物或產(chǎn)品組合，其中組合物或產(chǎn)品組合包括至少一個(gè)群，其中至少一個(gè)群包括不存在或富集超過(guò)CD8+T細(xì)胞的分離的CD4+T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，鑒別或選擇受試者以接受抗癌治療。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括測(cè)量或評(píng)價(jià)疾病的抑制。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括在施用如上所述的組合物或產(chǎn)品組合之前、期間或之后，向所述受試者提供另外的抗癌治療。在一些供選擇的方案中，通過(guò)過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移將組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。在一些供選擇的方案中，在所述受試者接受另一形式的抗癌治療后，將組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。在一些供選擇的方案中，在所述受試者接受另一形式的抗癌治療后，將組合物或產(chǎn)品組合施用于所述受試者。在一些供選擇的方案中，受試者患有白血病。在一些供選擇的方案中，受試者具有復(fù)發(fā)性和/或化療難治性CD19+兒童急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。在一些供選擇的方案中，受試者具有復(fù)發(fā)性和/或化學(xué)治療難治性CD19+急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)。在一些供選擇的方案中，受試者患有自身免疫疾病。在一些供選擇的方案中，受試者患有HSCT后復(fù)發(fā)。

關(guān)于本文任何實(shí)質(zhì)上復(fù)數(shù)和/或單數(shù)術(shù)語(yǔ)的使用，在適合于上下文和/或本申請(qǐng)時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從復(fù)數(shù)翻譯為單數(shù)和/或從單數(shù)翻譯為復(fù)數(shù)。為了清晰，本文中不同的單數(shù)/復(fù)數(shù)交換可被特別地提出。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，通常本文使用的術(shù)語(yǔ)，尤其在所附的權(quán)利要求中(例如所附權(quán)利要求的主體)的術(shù)語(yǔ)通常意指“開(kāi)放性”術(shù)語(yǔ)(例如術(shù)語(yǔ)“包括(including)”應(yīng)該被解釋為“包括但不限于”，術(shù)語(yǔ)“具有”應(yīng)該被解釋為“至少具有”，術(shù)語(yǔ)“包括(includes)”應(yīng)該被解釋為“包括但不限于”等)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步理解如果意圖引入的權(quán)利要求記載的具體數(shù)字，這樣的意圖將明確記載在權(quán)利要求中，并且如不存在這樣的記載，則不存在這樣的意圖。例如，為了幫助理解，下面所附的權(quán)利要求可以包含介紹性短語(yǔ)“至少一個(gè)”和“一個(gè)或多個(gè)”的使用以介紹權(quán)利要求記載。然而，這樣的短語(yǔ)的使用不應(yīng)被解釋為暗示通過(guò)不定冠詞“a”或“an”介紹權(quán)利要求記載限制任何包含這樣的介紹的權(quán)利要求記載的特定權(quán)利要求至僅含有一個(gè)這樣的記載的供選擇的方案，即使當(dāng)相同權(quán)利要求包括介紹性短語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)”或“至少一個(gè)”以及不定冠詞如“a”或“an”(例如“a”和/或“an”應(yīng)該被解釋為“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”)；同樣適于用于介紹權(quán)利要求記載的定冠詞的使用。另外，即使明確記載介紹的權(quán)利要求記載的具體數(shù)字，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到這樣的記載應(yīng)該被解釋為意思至少是引用的數(shù)字(例如“兩個(gè)記載”的直接記載，沒(méi)有其他修飾，意思是至少兩個(gè)記載，或兩個(gè)或多個(gè)記載)。此外，在使用類(lèi)似于“A、B和C中的至少一個(gè)等”慣例的那些情況下，通常這樣的結(jié)構(gòu)意指就本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解慣例(例如“具有A、B和C中的至少一個(gè)的系統(tǒng)”這個(gè)意義而言，將包括但不限于具有單獨(dú)A、單獨(dú)B、單獨(dú)C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等)。在類(lèi)似于“A、B或C中的至少一個(gè)等”慣例的那些情況下，通常這樣的結(jié)構(gòu)意指就本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解慣例(例如“具有A、B或C中的至少一個(gè)的系統(tǒng)”這個(gè)意義而言，將包括但不限于具有單獨(dú)A、單獨(dú)B、單獨(dú)C、A和B一起、A和C一起、B和C一起和/或A、B和C一起等的系統(tǒng))。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)進(jìn)一步理解事實(shí)上呈現(xiàn)兩個(gè)或更多個(gè)可供選擇的術(shù)語(yǔ)的任何轉(zhuǎn)折性詞語(yǔ)和/或轉(zhuǎn)折性短語(yǔ)，不論在說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)或附圖中，應(yīng)該被理解為預(yù)期包括術(shù)語(yǔ)中的一個(gè)、術(shù)語(yǔ)中的任一個(gè)或兩個(gè)術(shù)語(yǔ)的可能性，例如短語(yǔ)“A或B”會(huì)被理解為包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

更多供選擇的方案

在一些供選擇的方案中，通過(guò)親和性選擇具有存在于CD8和/或CD4上的表位的T細(xì)胞，從混合的T細(xì)胞群分隔、富集或分離表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔、富集或分離表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，通過(guò)免疫磁性選擇進(jìn)行從混合的T細(xì)胞群分隔、富集或分離表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，基因修飾的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞包括促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于移入適合性的至少一種受體。在一些供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于移入適合性的至少一種受體是CD45 RA、CD45 RO、CCR7、CD25、CD127、CD57、CD137、CD27、CD28和/或CD62L。在優(yōu)選的供選擇的方案中，促進(jìn)、誘導(dǎo)或有助于移入適合性的至少一種受體是CD27、CD28和/或CD62L。在一些供選擇的方案中，通過(guò)使表達(dá)CD8+和/或CD4+的T細(xì)胞與抗體結(jié)合支持物如珠或顆粒接觸進(jìn)行刺激分離的、富集的或分隔的T細(xì)胞群。在這些供選擇的方案的一些中，抗體結(jié)合支持物包括抗TCR、抗CD2、抗CD3、抗CD4和/或抗CD28抗體。在優(yōu)選的供選擇的方案中，抗體結(jié)合支持物包括抗CD3和/或抗CD28抗體。

在許多前述的供選擇的方案中，載體進(jìn)一步包括編碼前導(dǎo)序列的第一序列、編碼配體結(jié)合域的第二序列、編碼信號(hào)傳導(dǎo)域的第三序列和編碼選擇性標(biāo)記序列的第四序列。在這些供選擇的方案的一些中，載體進(jìn)一步包括編碼間隔區(qū)的序列，所述間隔區(qū)在一些供選擇的方案中可包括IgG4鉸鏈。在許多前述的供選擇的方案中，載體是病毒載體或微環(huán)。

在許多前述的供選擇的方案中，病毒載體源自猿猴病毒40、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒。在一些供選擇的方案中，病毒載體是重組腺病毒、腺伴隨病毒、慢病毒或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。優(yōu)選地，病毒載體是慢病毒載體。在許多前述的供選擇的方案中，標(biāo)記序列編碼截短的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFRt)。在許多前述的供選擇的方案中，使用的至少一種細(xì)胞因子包括GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-15、IL-2和/或IL-21，并且所述細(xì)胞因子被外源地提供給T細(xì)胞，例如為除了可通過(guò)細(xì)胞產(chǎn)生或存在于培養(yǎng)基中的任意細(xì)胞因子以外的細(xì)胞因子。

在希望的可選擇的實(shí)施方式中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-7、IL-15和/或IL-21。在許多前述的供選擇的方案中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-15和/或IL-21。在希望的可選擇的實(shí)施方式中，至少一種細(xì)胞因子包括IL-21和另一細(xì)胞因子；和/或包括IL-7和至少一種其他細(xì)胞因子；和/或包括IL-15和至少一種其他細(xì)胞因子，如包括IL-21和IL-15、包括IL-21和IL-7，或包括IL-15和IL-7，或包括IL-2和IL-15，或包括IL-7和IL-15。在優(yōu)選的供選擇的方案中，接觸時(shí)間進(jìn)行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)這些時(shí)間點(diǎn)限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。在許多前述的供選擇的方案中，在表達(dá)CD8+的T細(xì)胞不存在或與未分隔的、未富集的或未分離的T細(xì)胞群的天然群相比具有減少量的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞下，用分離的、分隔的或富集的CD4+細(xì)胞執(zhí)行方法，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞。在許多前述的供選擇的方案中，在表達(dá)CD4+的T細(xì)胞不存在或與未分隔的、未富集的或未分離的T細(xì)胞群的天然群相比具有減少量的表達(dá)CD4+的T細(xì)胞下，用分離的、分隔的或富集的表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群執(zhí)行這些方法，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，所述工程化前體希望地是iPS細(xì)胞。在許多前述的供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD4+的T細(xì)胞至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間。在許多前述的供選擇的方案中，增殖表達(dá)CD8+的T細(xì)胞至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間點(diǎn)限定的時(shí)間范圍內(nèi)的任意時(shí)間。

在一些供選擇的方案中，提供了制備具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括從混合的T細(xì)胞群分隔或富集表達(dá)CD8+的T細(xì)胞群和/或表達(dá)CD4+的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生分隔的或富集的T細(xì)胞群，所述T細(xì)胞是如源自胸腺細(xì)胞的T細(xì)胞或源自工程化前體的T細(xì)胞，其中所述前體任選地是iPS細(xì)胞；刺激分隔的或富集的T細(xì)胞群，以產(chǎn)生刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群；用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，其中載體編碼嵌合抗原受體；使轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群與外源地提供的至少一種細(xì)胞因子接觸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，其中借此方法獲得具有嵌合抗原受體的所述基因修飾的T細(xì)胞，其中所述方法從而獲得所述具有嵌合抗原受體的基因修飾的T細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括通過(guò)選擇標(biāo)記，富集轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群，以產(chǎn)生富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞群和/或CD4+T細(xì)胞群。在一些供選擇的方案中，標(biāo)記由載體編碼并任選地是細(xì)胞表面標(biāo)記。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括增殖富集的、轉(zhuǎn)導(dǎo)的、細(xì)胞因子刺激的CD8+T細(xì)胞和/或CD4+T細(xì)胞的群至少1天，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天或由任意兩個(gè)前述的時(shí)間段限定的范圍內(nèi)的一段時(shí)間。

在一些供選擇的方案中，提供了產(chǎn)生基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括：將編碼重組蛋白的載體引入CD4+富集的T細(xì)胞組合物的細(xì)胞內(nèi)，以及與包括IL-7和IL-15的細(xì)胞因子的組合溫育CD4+富集的T細(xì)胞組合物的細(xì)胞；和/或?qū)⒕幋a重組蛋白的載體引入CD8+富集的T細(xì)胞組合物的細(xì)胞內(nèi)以及與包括IL-2和IL-15的細(xì)胞因子的組合溫育CD8+富集的T細(xì)胞組合物的細(xì)胞，其中方法借此產(chǎn)生了轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+富集的群和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+富集的群。在一些供選擇的方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+富集的群與參考富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞群相比，具有更高水平的CD62L、CD27和/或CD28的表面表達(dá)，和/或在施用于受試者時(shí)與參考富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞群相比，具有增加的移入適合性和/或擴(kuò)增和/或存留的指標(biāo)，其中參考群是通過(guò)另一種方法制備的CD4+-富集的群，所述另一種方法與該方法相同，除了用單獨(dú)的IL-2替代細(xì)胞因子的組合以外。在一些供選擇的方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+富集的群與參考富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞群相比，具有更高水平的CD62L、CD27和/或CD28的表面表達(dá)，和/或在施用于受試者時(shí)與參考富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞群相比，具有升高的移入適合性和/或擴(kuò)增和/或存留的指標(biāo)，其中參考群是通過(guò)另一種方法制備的CD8+-富集的群，所述另一種方法與該方法相同，除了用單獨(dú)的IL-2替代細(xì)胞因子的組合以外。

在一些供選擇的方案中，提供了產(chǎn)生基因修飾的T細(xì)胞的方法，其中方法包括：將編碼重組蛋白的載體引入CD4+富集的T細(xì)胞組合物的細(xì)胞內(nèi)，以及與第一細(xì)胞因子的組合溫育CD4+富集的T細(xì)胞組合物的細(xì)胞；和將編碼重組蛋白的載體引入CD8+富集的T細(xì)胞組合物的細(xì)胞內(nèi)，以及與第二細(xì)胞因子的組合溫育CD8+富集的T細(xì)胞組合物的細(xì)胞，所述第二細(xì)胞因子的組合區(qū)別于第一細(xì)胞因子的組合，其中借此方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+富集的群和轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+富集的群。在一些供選擇的方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+富集的群與通過(guò)另一種方法制備的參考富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞群相比，具有更高水平的CD62L、CD27和/或CD28的表面表達(dá)，所述另一種方法與該方法相同，除了第一和第二細(xì)胞因子的組合是相同的以外，和/或在施用于受試者時(shí)與參考富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞群相比，具有增加的移入適合性和/或擴(kuò)增和/或存留的指標(biāo)。在一些供選擇的方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+富集的群與通過(guò)另一種方法制備的參考富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞群相比，具有更高水平的CD62L、CD27和/或CD28的表面表達(dá)，所述另一種方法與該方法相同，除了第一和第二細(xì)胞因子的組合是相同的以外，和/或在施用于受試者時(shí)與參考富集的轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞群相比，具有增加的移入適合性和/或擴(kuò)增和/或存留的指標(biāo)。在一些供選擇的方案中，第一組合包括IL-7和IL-15，以及第二組合包括IL-2和IL-15。在一些供選擇的方案中，添加細(xì)胞因子組合以起始轉(zhuǎn)導(dǎo)，任選地在起始轉(zhuǎn)導(dǎo)的同一天添加細(xì)胞因子組合。在一些供選擇的方案中，IL-2的濃度在適當(dāng)?shù)那闆r下為或約為50U/mL，IL-15的濃度在適當(dāng)?shù)那闆r下為或約為0.5ng/mL和/或IL-7的濃度在適當(dāng)?shù)那闆r下為或約為5ng/mL。在一些供選擇的方案中，細(xì)胞因子的組合添加至CD4+富集的和/或添加至CD8+富集的組合物包含增加組合物的體積以減少細(xì)胞密度，其中細(xì)胞在所述組合物中溫育。在一些供選擇的方案中，移入適合性的指標(biāo)包括在組合物中的細(xì)胞的百分比和細(xì)胞表面標(biāo)記的群的總表面表達(dá)水平，所述細(xì)胞表面標(biāo)記選自由CD62L、CD27和/或CD28組成的組。在一些供選擇的方案中，移入適合性的指標(biāo)包括施用時(shí)在受試者中的存留。在一些供選擇的方案中，細(xì)胞源自受試者。在一些供選擇的方案中，轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+和/或CD4+細(xì)胞在施用于所述細(xì)胞所源自的受試者時(shí)存留至少為或約為將細(xì)胞注射入受試者后的30或60天。在一些供選擇的方案中，重組蛋白是嵌合抗原受體。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括在轉(zhuǎn)導(dǎo)前，富集T細(xì)胞組合物的表達(dá)CD4的細(xì)胞，以此產(chǎn)生這樣轉(zhuǎn)導(dǎo)的富集的CD4+富集的T細(xì)胞組合物，和/或在轉(zhuǎn)導(dǎo)前，富集T細(xì)胞組合物的表達(dá)CD8的細(xì)胞，以此產(chǎn)生這樣轉(zhuǎn)導(dǎo)的富集的CD8+富集的T細(xì)胞組合物。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括深低溫保藏工程化細(xì)胞。在一些供選擇的方案中，方法進(jìn)一步包括將工程化細(xì)胞施用于受試者，和任選地進(jìn)一步包括在所述施用之前匯集轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+富集的和轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+富集的組合物。

在一些供選擇的方案中，通過(guò)更多供選擇的方案的該部分的前面段落中列出的方法的任意供選擇的方案產(chǎn)生細(xì)胞或組合物。在一些供選擇的方案中，預(yù)期通過(guò)前面段落中列出的任意的方法的供選擇的方案或組合物的供選擇的方案產(chǎn)生的施用細(xì)胞的方法。在一些供選擇的方案中，將細(xì)胞或組合物施用于受試者。在一些供選擇的方案中，施用于細(xì)胞所源自的受試者。

在一些供選擇的方案中，提供了過(guò)繼細(xì)胞治療的方法，其中方法包括：(a)在刺激條件下和在IL-15和IL-7存在下溫育CD4+富集的T細(xì)胞組合物，以此產(chǎn)生擴(kuò)增的CD4+組合物；(b)在刺激條件下和在IL-15和IL-2存在下單獨(dú)地溫育CD8+富集的T細(xì)胞組合物以此產(chǎn)生擴(kuò)增的CD8+組合物；以及(c)施用擴(kuò)增的CD4+和擴(kuò)增的CD8+群至受試者，任選地同時(shí)進(jìn)行。在一些供選擇的方案中，CD4+和CD8+群獲得自受試者。在一些供選擇的方案中，所記載的細(xì)胞因子中的一個(gè)或多個(gè)或細(xì)胞因子的組合進(jìn)一步包括CD21。在一些供選擇的方案中，CD4+-富集的群或其中T細(xì)胞的總數(shù)包括至少70、80、90、95、96、97、98或99％CD4+細(xì)胞，和/或CD8+-富集的群或其中T細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)包括至少70、80、90、95、96、97、98或99％CD8+細(xì)胞。

另外，在依據(jù)Markush組描述本公開(kāi)的特征或方面時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，進(jìn)而也依據(jù)Markush群組的任意單個(gè)成員或成員子組來(lái)描述本公開(kāi)。