本發(fā)明涉及糖尿病治療領域。本發(fā)明尤其涉及通過移植來自豬的朗格漢斯島來治療糖尿病，其中PKA和PKC路徑被轉基因地修飾，優(yōu)選地被組成性地激活。

背景技術：

I型糖尿病也稱為胰島素依賴性糖尿病(IDDM)或青少年糖尿病，這是一種慢性病。主要癥狀是高于正常值的血糖過高，這是由于朗格漢斯島的β細胞無法生產胰島素引起的。在絕大多數(shù)患者中，β細胞被T細胞所介導的自身免疫攻擊破壞。

常規(guī)治療是每天注射胰島素，以便補償胰腺產量的不足。然而，雖然可以挽救生命，但是用胰島素治療通常并不提供對血糖的充分控制，不能預防該疾病的威脅生命的并發(fā)癥。因此目前開發(fā)了其它治療。一些是基于胰腺或朗格漢斯島移植以恢復胰島素的正常生產。同種異體移植(將人來源的器官移植給人)因為人胰島組織的短缺以及每名接受者需要若干胰腺而受到限制。因此需要產胰島素細胞的替代來源。

豬胰島代表人胰島移植的一個有前景的替代方案，因為其可以大量獲得而不會引起倫理問題。豬β細胞所產生的胰島素與人胰島素只有一個氨基酸不同，并且已經長期用于治療糖尿病病人。此外，對豬細胞的基因改造在技術上是可能的并且應當解決與不協(xié)調的胰島異種移植相關的若干問題，例如通過最小化所需胰島的數(shù)目和血栓形成的風險兩者(Dufrane&Gianello,Transplantation,2008,86(6),753:60)。此外，在異種移植模型中的免疫抑制可以通過微囊封/巨囊封方法克服(Dufrane等人,2010,Transplantation,90(10):1054-1062；WO2007/144389和WO2010/032242)。

近十年來已經公開了若干臨床前豬到非人靈長動物研究，得到關于在接受者內產生胰島素的有前景的結果(清單請參見Dufrane&Gianello,Transplantation,2008,86(6),753:60)。具體來說，臨床研究目前針對人糖尿病患者，例如通過使用由Living Cell Technologies研發(fā)的產品其包括用海藻酸鹽囊封的豬胰島。

然而，豬胰島對葡萄糖刺激顯示相對弱的應答。當通過將葡萄糖濃度從靜止水平(1-2mM)增加到刺激水平(8-15mM)來刺激分離的豬胰島時，胰島素分泌的增加介于1.5倍與3倍之間(Crowther等人1989,Horm.Metabol.Res,21:590-595；Bertuzzi等人1995,FEBES Letters 379:21-25；Dufrane等人2007,Diabetes&Metabolism 33:430-438；Mueller等人2013,Xenotransplantation,20:75-81)。相比之下，當利用葡萄糖濃度的類似增加激發(fā)人、靈長動物或嚙齒動物胰島時，胰島素分泌增加12到16倍(Dufrane等人2007；Mueller等人2013)。當被移植到胰島素需求更高的生物體(例如非人靈長動物，且可能是人)中時，豬胰島的這種特性有時會令人對其作為糖尿病治療的效用產生懷疑。具體來說，與人胰島相比，豬胰島對血糖的應答更低，這導致需要移植大量的豬胰島以充分校正人葡萄糖水平，這也是治療方法的一個缺點，因為為了移植一名患者目前要使用若干頭豬。

因此需要一種通過豬胰島的異種移植治療糖尿病患者的改良方法。

在人β細胞中，響應于血糖水平的胰島素合成和分泌可能涉及兩種路徑：(i)PKC路徑，和(ii)PKA路徑。本文的申請人意外地證實，兩種路徑的組成性激活導致胰島素分泌的協(xié)同增加。這個結果尤其出乎意料，因為之前在現(xiàn)有技術中證實，在小鼠中PKC和PKA對胰島素分泌的作用甚至不具有累加性(Yang&Gillis,J.Gen.Physiol.,2004,124:641-651；Wan等人,J；Gen.Physiol.,2004,124:653-663)。

本發(fā)明因此涉及一種其中PKC和PKA路徑被組成性地激活的轉基因豬β細胞、轉基因豬胰島和轉基因豬，并且涉及其用于在有需要的受試對象中治療糖尿病的用途。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明因此涉及一種分離的轉基因豬β細胞，其中PKC和PKA路徑被組成性地激活。

在一個實施方案中，所述細胞包含組成性活性的乙酰膽堿受體，優(yōu)選毒蕈堿性受體，更優(yōu)選III型毒蕈堿性受體。在一個實施方案中，組成性活性的III型毒蕈堿性受體具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，或與SEQ ID NO:4具有至少70％序列同一性的序列。

在一個實施方案中，所述細胞表達GLP-1。在一個實施方案中，GLP1具有氨基酸序列SEQ ID NO:6，或與SEQ ID NO:6具有至少70％序列同一性的序列。

本發(fā)明還涉及一種分離的轉基因豬胰島，其包含本發(fā)明的豬β細胞。

本發(fā)明的另一個目標是一種用于獲得本發(fā)明的分離的轉基因豬β細胞或本發(fā)明的分離的轉基因豬胰島的離體方法，其中所述方法使用包含編碼組成性活性的III型毒蕈堿性受體的核酸序列的表達載體，和包含編碼GLP-1的核酸序列的表達載體。

本發(fā)明的另一個目標是一種分離的轉基因豬β細胞或分離的轉基因豬胰島，其通過用于獲得本發(fā)明的分離的轉基因豬β細胞或本發(fā)明的分離的轉基因豬胰島的離體方法而獲得。

本發(fā)明還涉及一種轉基因豬，其包含本發(fā)明的分離的轉基因豬β細胞或分離的轉基因豬胰島。

本發(fā)明還涉及一種裝置，其包含本發(fā)明的分離的轉基因豬β細胞或分離的轉基因豬胰島。在一個實施方案中，所述分離的轉基因豬β細胞或所述分離的轉基因豬胰島囊封在海藻酸鹽組合物中。

本發(fā)明的另一個目標是本發(fā)明的分離的轉基因豬β細胞或分離的轉基因豬胰島或裝置，其用于治療與內分泌胰腺或β細胞的功能受損相關的疾病、病癥或病狀。在一個實施方案中，所述與內分泌胰腺或β細胞的功能受損相關的疾病、病癥或病狀選自包括以下的組：I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隱匿性自身免疫糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、青年成熟期發(fā)病型糖尿病、新生兒糖尿病(例如永久性新生兒糖尿病或暫時性新生兒糖尿病)、前驅糖尿病、類固醇誘導的糖尿病、胰腺癌，尤其是內分泌胰腺癌，例如內分泌胰腺腫瘤和胰腺神經內分泌癌。

本發(fā)明的另一個目標是本發(fā)明的分離的轉基因豬β細胞或分離的轉基因豬胰島或裝置，其用于在有需要的受試對象體內調控血糖水平。

本發(fā)明的另一個目標是本發(fā)明的分離的轉基因豬β細胞或分離的轉基因豬胰島或裝置，其用于在有需要的受試對象體內恢復正常胰島素分泌水平。

定義

在本發(fā)明中，以下術語具有以下含義：

‐“分離的”是指器官、組織或細胞已經從其天然環(huán)境中分離并且至少約75％不含、80％不含、85％不含且優(yōu)選地約90％、95％、96％、97％、98％、99％不含與其天然地一起存在的其它細胞，但是缺少分離所述細胞所基于的細胞表面標志物。該術語包括從天然環(huán)境總體物理分離，例如從供體動物移除，和通過離解改變器官、組織或細胞與其鄰近細胞或與其直接接觸的細胞的關系。細胞群體的分離方法在所屬領域是眾所周知的并且包括(但不限于)通過流式細胞術、磁性選擇、親和色譜法、淘選或其組合的細胞分選。

‐“協(xié)同作用”定義兩種或更多種試劑的相互作用，它們以積極方式一起作用以產生比單獨工作的每種試劑的作用的總和更大的作用。

‐數(shù)字前的“約”意味著所述數(shù)字的值的加或減10％。

‐“治療”是指治療性治療；其中目的是預防或減緩(減輕)靶向的病理情況或病癥。需要治療的對象包括已經患有病癥的對象。如果在接受治療量的本發(fā)明的轉基因豬胰島或豬β細胞之后，受試對象顯示以下情況中一種或多種的可觀察到的和/或可測量到的降低或不存在，那么受試對象的疾病、病癥或病狀被成功地“治療”：胰島素分泌的改善；和/或與特定疾病或病狀相關的癥狀中一種或多種在某種程度上的減輕；發(fā)病率和死亡率的下降、血糖控制的改善和生活品質問題的改善。用于評估疾病的成功治療和改善的以上參數(shù)可以通過醫(yī)生熟悉的常規(guī)程序容易地測量。

‐“治療有效量”意思是在不對靶標造成顯著的負面或不利副作用的情況下實現(xiàn)以下目的的轉基因豬胰島或β細胞的水平或量：(1)減緩或停止與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀的一種或多種癥狀的發(fā)展、加劇或惡化；(2)使與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀的癥狀得到改善；(3)降低與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀的嚴重性或發(fā)病率；或(4)治愈與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀。根據(jù)本發(fā)明，治療有效量通常在與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀開始之后施用以獲得治療作用。

‐“植入”或“移植”(可互換使用)是指通過使器官、組織、細胞或組合物定位于期望部位的方法或途徑將器官、組織、細胞或組合物放入受試對象例如異種受試對象中。如本文所使用，異種受試對象是指其中引入或將要引入另一物種的細胞的接受者。具體來說，在本發(fā)明的上下文中，異種受試對象可指其中引入或將要引入豬細胞的靈長動物，優(yōu)選人。

‐“與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀”包括存在異常的內分泌胰腺或β細胞功能的病癥。此類異常內分泌胰腺功能可以包括正常內分泌胰腺功能受損或不存在，或存在異常內分泌胰腺功能。與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀的實例包括(但不限于)I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隱匿性自身免疫糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、青年成熟期發(fā)病型糖尿病、新生兒糖尿病(例如永久性新生兒糖尿病或暫時性新生兒糖尿病)、前驅糖尿病、類固醇誘導的糖尿病、胰腺癌，優(yōu)選是內分泌胰腺癌，例如內分泌胰腺腫瘤和胰腺神經內分泌癌。

‐“調控血糖水平”：維持血糖水平處在類似年齡和體重的正常非糖尿病個體的多項參數(shù)內。在一個實施方案中，調控血糖水平意味著恢復正常的空腹血糖水平。在一個實施方案中，正常的空腹血糖水平低于110mg/dL(6.1mmol/L)，優(yōu)選低于100mg/dL(5.6mmol/L)。

‐“海藻酸鹽”：海藻酸的鹽。從海藻分離的海藻酸是由兩種糖醛酸D-甘露糖醛酸和L-古羅糖醛酸組成的多糖醛酸。海藻酸基本上不溶于水。它與以下物質形成水溶性鹽：堿金屬，例如鈉、鉀和鋰；鎂；銨；和衍生自例如甲胺、乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺等低碳數(shù)胺的經取代銨陽離子。這些鹽在高于pH 4的水性介質中是可溶的，但是當pH被降到約pH 4以下時轉化為海藻酸。在存在適當濃度的成膠離子(例如鈣、鋇、鍶、鋅、銅(+2)、鋁和其混合物)的情況下形成熱不可逆的不溶于水的海藻酸鹽凝膠。海藻酸鹽凝膠可以通過浸泡在可溶陽離子的溶液中或成膠離子的螯合劑(如EDTA、檸檬酸鹽等)的溶液中而增溶。

具體實施方式

本發(fā)明因此涉及一種豬β細胞，優(yōu)選分離的豬β細胞，其中PKC和PKA路徑被組成性地激活，從而通過所述細胞誘導胰島素分泌的增加。根據(jù)本發(fā)明，PKC和PKA路徑的組成性激活是由本發(fā)明的豬β細胞的轉基因改造引起的。

胰島受副交感神經、交感神經和感覺神經支配。因此，胰島素分泌受副交感神經系統(tǒng)刺激并被交感神經系統(tǒng)抑制。乙酰膽堿(ACh)是副交感神經通過PKC路徑控制β細胞中所涉及的主要神經遞質。頭期(即在血糖水平的任何增加之前響應于感覺刺激的胰島素分泌)取決于副交感神經刺激，其隨后在整個進餐期間持續(xù)。ACh可以結合于β細胞質膜中存在的M3毒蕈堿性受體。這些受體(通過Gq)偶合于磷脂酶C(PLC)，PLC在激活后水解膜磷酸肌醇，例磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)。在胰島中，像其它細胞中一樣，這種水解導致形成兩種主要產物：肌醇-1,4,5-三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)。DAG可以激活PKC路徑，導致胰島素合成和分泌的增強。平行地，IP3可以結合于內質網上的IP3敏感性Ca²⁺通道，從而誘導細胞質內Ca²⁺的排出，這接著導致胰島素合成和分泌的增強。根據(jù)本發(fā)明，“PKC路徑”包括M3毒蕈堿性受體和下游元件(Gq蛋白、PLC、DAG、PKC…)。

來自回腸和結腸粘膜的L細胞分泌胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，并且來自十二指腸空腸粘膜的K細胞分泌葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)。這兩種激素結合于其對應的G蛋白偶合受體(GPCR)并且負責腸促胰島素作用，所述腸促胰島素作用在餐間發(fā)生并且通過在口服施用而不是靜脈內注射給定葡萄糖負載時胰島素分泌的更大刺激而在實驗上得到證明。這兩種激素的作用主要由通過蛋白激酶A和Epac2(即PKA路徑)作用的cAMP介導。PKA以及與分泌過程相關的蛋白質使葡萄糖轉運蛋白-2(Glut2)、K-ATP通道的Kir6.2和SUR1子單元磷酸化。小的GTPase Rap1可以通過尤其在葡萄糖誘導的胰島素分泌的第一個階段期間增加可輕易釋放的胰島素顆粒的數(shù)量而作為Epac2依賴性路徑的效應分子。根據(jù)本發(fā)明，“PKA路徑”包括GLP-1、GPCR和下游元件(腺苷酸環(huán)化酶、cAMP、PKA…)。

在一個實施方案中，PKC路徑的組成性激活是因為M3毒蕈堿性受體的組成性激活。PKC路徑的組成性激活因此可以通過測量從細胞流出的肌醇三磷酸(IP3)證明。實際上，導致PKC激活的磷脂酶C激活引起膜磷酸肌醇分解成IP3和二酰甘油(DAG)。在一個實施方案中，PKC路徑的組成性激活可以根據(jù)測試A證明，其中測試A包括用肌-[2-3H]肌醇裝載細胞2小時來標記肌醇池的第一步驟，以及在細胞中測量流出物3H并定量剩余信號的第二步驟，從而可以證明PKC路徑激活(Garcia等人,1988,Biochem J.,254,211-218)。

在一個實施方案中，PKC路徑的組成性激活誘導在測試A的條件中測量的總IP3與對照相比增加了至少5倍，優(yōu)選10、15、20、25或30倍或更高，其中所述對照優(yōu)選地對應于其中PKC路徑沒有被組成性地激活的細胞。

在另一個實施方案中，PKC路徑的組成性激活可以通過經由測量蛋白質的磷酸化形式(磷酸化PKC是這種酶的活性形式)的量評估PKC的組成性激活而證明。這可以例如通過來自本發(fā)明的轉基因豬β細胞的蛋白質提取物的蛋白質印跡法實現(xiàn)。特異性地識別磷酸化PKC的抗體可用于確定轉基因和野生型豬β細胞中的相比總PKC的被激活PKC的量。此類抗體的實例包括(但不限于)ab59411、ab75837、ab76016和ab32502(Abcam)。在一個實施方案中，可以測量磷酸化PKC/非磷酸化PKC(即活性PKC/非活性PKC)的比率。在一個實施方案中，PKC的組成性激活導致此比率與野生型細胞中所測量的比率相比增加2倍，優(yōu)選增加3、4、5、6、7、8、9、10倍或更高。

在一個實施方案中，腺苷酸環(huán)化酶激活導致從ATP分解形成cAMP，PKA路徑的組成性激活可以根據(jù)測試B證明，其中測試B通過使用市售的分析試劑盒(Ramos等人,2008,J Gen Physiol,132(3):329-338)測量β細胞中的總cAMP濃度來檢測因GLP-1與其膜受體的結合而導致的腺苷酸環(huán)化酶激活。

在一個實施方案中，PKA路徑的組成性激活對應于在測試B的條件中測量的總cAMP與對照相比增加了至少20、25、30或35倍或更高，其中所述對照優(yōu)選地對應于其中PKA路徑沒有被組成性地激活的細胞。

在另一個實施方案中，PKA路徑的組成性激活可以通過經由測量蛋白質的磷酸化形式(磷酸化PKA是這種酶的活性形式)評估PKA的組成性激活而證明。這可以例如通過來自本發(fā)明的轉基因豬β細胞的蛋白質提取物的蛋白質印跡法實現(xiàn)。特異性地識別磷酸化PKA的抗體可用于確定轉基因和野生型豬β細胞中的相比總PKA的被激活PKA的量。此類抗體的實例包括(但不限于)ab5815、ab118531和ab39218(Abcam)。在一個實施方案中，可以測量磷酸化PKA/非磷酸化PKA(即活性PKA/非活性PKA)的比率。在一個實施方案中，PKA的組成性激活導致此比率與野生型細胞中所測量的比率相比增加2倍，優(yōu)選增加3、4、5、6、7、8、9、10倍或更高。

在本發(fā)明的一個實施方案中，與天然豬β細胞相比，在測試C的條件中，轉基因豬β細胞能夠分泌至少約2、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10倍，優(yōu)選至少15倍，更優(yōu)選至少20倍，且甚至更優(yōu)選至少25倍的胰島素。

用于測定胰島素的分泌水平的測試C的方法可以例如如下所述：

1)將轉基因豬β細胞在37℃、5％CO²/95％O₂下，在含有10％熱滅活FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、5mmol/l葡萄糖的RMPI培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，

2)將所述轉基因豬β細胞在含有1mmol/L或15mmol/L葡萄糖的1mLKrebs-Ringer緩沖液中孵育2小時，

3)通過放射免疫分析法定量回收的培養(yǎng)基中和孵育的轉基因豬β細胞中的胰島素。

在一個實施方案中，PKC路徑的組成性激活是由乙酰膽堿受體、優(yōu)選毒蕈堿性受體、更優(yōu)選III型毒蕈堿性受體的組成性激活引起的。在一個實施方案中，轉基因豬β細胞在其膜上包含被組成性激活的III型毒蕈堿性受體。

可以通過所屬領域技術人員已知的體外方法證明轉基因豬β細胞的膜上的被組成性激活的III型毒蕈堿性受體的表達。此類方法的實例包括(但不限于)蛋白質印跡法，其使用針對III型毒蕈堿性受體的抗體或針對連接在被組成性激活的III型毒蕈堿性受體序列上的標簽的抗體(關于標簽的清單請參看下文)。

在一個實施方案中，可以通過所屬領域技術人員已知的體外方法證明轉基因豬β細胞的基因組中的被組成性激活的III型毒蕈堿性受體序列的整合。此類方法的實例包括(但不限于)RT-PCR，其使用例如以下引物對：正向引物：5’CCCAATTGATGTACCCATAC 3’(SEQ ID NO:17)-反向引物：5’GTGATCTGACTTCTGGTCTC 3’(SEQ ID NO:18)。

來自豬(山豬(Sus scrofa))的III型毒蕈堿性受體是對應于登錄號NP_001116570.1(蛋白質序列，SEQ ID NO:1)和NM_001123098.1(cDNA序列，SEQ ID NO:2)的乙酰膽堿受體。III型毒蕈堿性受體的激活可以誘導磷脂酶C的激活，其水解細胞膜磷脂，導致產生二酰甘油(DAG)和/或肌醇三磷酸(IP3)。DAG可以激活PKC路徑，導致胰島素合成和分泌的增強。平行地，IP3可以結合于內質網上的IP3敏感性Ca²⁺通道，從而誘導細胞質內Ca²⁺的排出。兩者都導致胰島素合成和分泌的增強。

在一個實施方案中，被組成性激活的III型毒蕈堿性受體具有序列SEQ ID NO:1，其中點突變(Gln490→Leu，位置490位于沒有第一個Met氨基酸(對應于起始密碼子)的序列中，并且因此涉及SEQ ID NO:1的位置491)引起組成性激活并且其中缺失一個區(qū)域以增加表達。在一個實施方案中，所述刪除包括SEQ ID NO:1的氨基酸275到470。

在一個實施方案中，被組成性激活的III型毒蕈堿性受體由核酸序列SEQ ID NO:3，或與SEQ ID NO:3具有至少70％、優(yōu)選75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方案中，被組成性激活的III型毒蕈堿性受體具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，或與SEQ ID NO:4具有至少70％、優(yōu)選75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的序列。

在一個實施方案中，被組成性激活的III型毒蕈堿性受體包含標簽，例如HA標簽(例如具有序列SEQ ID NO:13，由核苷酸序列SEQ ID NO:12編碼)。優(yōu)選地，經HA標記的被組成性激活的III型毒蕈堿性受體具有序列SEQ ID NO:21。

當用在兩種或更多種核酸序列或兩種或更多種多肽之間的關系中時，術語“同一性”或“相同”是指核酸序列或多肽之間的序列相關程度，如分別通過兩個或更多個核酸或氨基酸殘基的鏈段之間的匹配數(shù)所確定。“同一性”衡量兩個或更多個序列的較小之間的相同匹配的百分比，其中利用通過特定數(shù)學模型或計算機程序(即算法)所解決的空位比對(如果有的話)?？梢酝ㄟ^已知方法容易地計算相關核酸序列或多肽的同一性。此類方法包括(但不限于)在Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編輯,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編輯,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.編輯,M.Stockton Press,New York,1991；和Carillo等人,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)中描述的那些。用于測定同一性的優(yōu)選方法被設計成給出所測試序列之間的最大匹配。在公眾可獲得的計算機程序中描述了測定同一性的方法。用于測定兩個序列之間的同一性的優(yōu)選計算機程序方法包括GCG程序包，包括GAP(Devereux等人,Nucl.Acid.Res.\2,387(1984)；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,Wis.)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人,J.MoI.Biol.215,403-410(1990))。BLASTX程序從美國國家生物技術信息中心(NCBI)和其它來源(BLAST Manual,Altschul等人NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894；Altschul等人,上文)是公眾可獲得的。眾所周知的Smith Waterman算法也可用于確定同一性。

在一個實施方案中，PKA路徑的組成性激活是由本發(fā)明的豬β細胞表達GLP-1引起的。在一個實施方案中，轉基因豬β細胞包含整合于其基因組中的GLP-1序列。

可以通過所屬領域技術人員已知的體外方法證明轉基因豬β細胞的基因組中的GLP-1序列的整合。此類方法的實例包括(但不限于)RT-PCR，其使用例如以下引物對：正向引物：5’CCCGCCCAATTGATGGAGAC 3’(SEQ ID NO:15)-反向引物：5’TCCTCGGCCTTTCACCAGCC 3’(SEQ ID NO:16)。

在一個實施方案中，GLP-1由核酸序列SEQ ID NO:5或與SEQ ID NO:5具有至少70％，優(yōu)選75％、80％、85％、90％、95％或更高的序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方案中，GLP-1具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或與SEQ ID NO:6具有至少70％，優(yōu)選75％、80％、85％、90％、95％或更高的序列同一性的序列。

在一個實施方案中，GLP-1序列經過突變以增強GLP-1的半衰期。在一個實施方案中，用于增強GLP-1的半衰期的所述突變對應于SEQ ID NO:6的位置2中的丙氨酸殘基被絲氨酸殘基取代(A8S突變)。

在一個實施方案中，GLP-1包含A8S突變并且由核酸序列SEQ ID NO:19或與SEQ ID NO:19具有至少70％，優(yōu)選75％、80％、85％、90％、95％或更高的序列同一性的核酸序列編碼。在一個實施方案中，GLP-1包含A8S突變并且具有氨基酸序列SEQ ID NO:20或與SEQ ID NO:20具有至少70％，優(yōu)選75％、80％、85％、90％、95％或更高的序列同一性的序列。

在一個實施方案中，GLP1序列進一步包含允許其分泌的另一個序列。在一個實施方案中，所述另一個序列對應于Ig K鏈信號(核酸序列SEQ ID NO:7，氨基酸序列SEQ ID NO:8)。在一個實施方案中，核酸序列SEQ ID NO:7被插入到編碼GLP-1的核酸序列內在第一個ATG之后的位置。

在一個實施方案中，GLP1序列包含A8S突變和Ig K鏈信號。根據(jù)這個實施方案，GLP-1的氨基酸序列可以是SEQ ID NO:10，其由SEQ ID NO:9編碼。

在一個實施方案中，GLP-1序列包含弗林蛋白酶(furin)裂解位點，其被插入在Igk鏈信號與編碼GLP-1肽的第一個組氨酸的CAT之間。這個弗林蛋白酶位點的存在確保了合成的肽將在高爾基體中被加工并裂解以產生GLP-1的生物活性形式。這個弗林蛋白酶裂解位點的DNA序列是CGG GGC AGG CGG，其被包含在SEQ ID NO:9中。這個弗林蛋白酶裂解位點的肽序列是Arg Gly Arg Arg，其被包含在SEQ ID NO:10中。

本發(fā)明因此涉及一種轉基因豬β細胞，優(yōu)選地涉及一種分離的轉基因豬β細胞，其包含：

‐突變乙酰膽堿受體的序列、優(yōu)選地突變毒蕈堿性受體的序列、更優(yōu)選地突變III型毒蕈堿性受體的序列，且甚至更優(yōu)選地序列SEQ ID NO:4，其中所述突變受體被組成性地激活；和

‐編碼人GLP-1的序列，其優(yōu)選地具有序列SEQ ID NO:10。

在一個實施方案中，這兩個序列(突變乙酰膽堿受體的序列和編碼人GLP-1的序列)處于同一載體(即雙順反子載體)上。

本發(fā)明還涉及一種轉基因豬胰島，優(yōu)選地涉及一種分離的轉基因豬胰島，其包含如上文所述的至少一個轉基因β細胞。

在本發(fā)明的一個實施方案中，在測試D的條件中，與天然豬胰島相比，轉基因豬胰島能夠分泌至少約2、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10倍，優(yōu)選至少15倍，更優(yōu)選20倍，且甚至更優(yōu)選至少25倍的胰島素。

用于測定胰島素的分泌水平的測試D的方法可以例如如下所述：

1)將轉基因豬胰島在37℃、5％CO²/95％O₂下，在含有10％熱滅活FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、5mmol/l葡萄糖的RMPI培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，

2)將所述轉基因豬胰島在含有1mmol/L或15mmol/L葡萄糖的1mL Krebs-Ringer緩沖液中孵育2小時，

3)通過放射免疫分析法定量回收的培養(yǎng)基中和孵育的胰島中的胰島素。

根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的轉基因豬胰島包含如上文所述的轉基因β細胞。

在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因豬胰島展現(xiàn)豬胰島的正常生理結構，其中α細胞呈環(huán)形位于胰島周邊，而β細胞位于胰島中心。在一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因豬胰島具有在約50到500μm、優(yōu)選地約150到250μm范圍的大小。在一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因豬胰島的β/α細胞比例在約5/1到約20/1、優(yōu)選地約10/1到約12.5/1的范圍，更優(yōu)選地為約11.25/1。

本發(fā)明還涉及轉基因豬，其在胰腺內包含本發(fā)明的至少一個轉基因β細胞和/或至少一個轉基因豬胰島。

在本發(fā)明的一個實施方案中，轉基因豬不含傳染性微生物，以便限制異種移植期間疾病的傳播風險。作為一個實例，胰島可以從WO2006/110054中描述的AI豬提取，WO2006/110054以引用的方式并入本文中。這些豬居住在遙遠的奧克蘭島(新西蘭)上并且不含或準不含(quasi-free)豬內源逆轉錄病毒(PERV)和其它常見的豬傳染性病毒，包括PCMV、PLHV、EMCV、HEV和PCV。另一個實例是在嚴格的生物安全條件下飼養(yǎng)的不含特異性病原體(SPF)的NZ大白豬。

在本發(fā)明的一個實施方案中，轉基因改造在體內進行。

在一個實施方案中，轉基因改造離體進行，以便產生本發(fā)明的轉基因豬。使用離體方法產生轉基因豬的方法對于所屬領域技術人員是眾所周知的。在一個實施方案中，以下方法可用于獲得轉基因豬：

如下所述形成攜帶豬胰島素啟動子和轉基因序列的表達載體。從豬的耳活檢產生原代Gal^-/-和野生型成纖維細胞并體外培養(yǎng)，優(yōu)選地在含有10％FCS和10ng/ml的FGF的DMEM/TCM199中在5％CO₂和5％O₂中培養(yǎng)。

然后轉染生長中的培養(yǎng)物。在一個實施方案中，轉染通過電穿孔進行。在一個實施方案中，轉染通過化學轉染進行。在一個優(yōu)選實施方案中，轉染通過靈巧的電穿孔與化學轉染的組合進行，例如使用Nucleofector(Amaxa)。

被轉染的細胞然后擴增并冷凍以用于核轉移?？梢詳U增一小份所述細胞以進行PCR分析，從而確定轉基因的整合。

從在當?shù)赝涝讏霰煌涝椎难h(huán)母豬的卵巢回收卵母細胞。使選擇的卵母細胞體外成熟，優(yōu)選地在含有10％FCS的培養(yǎng)基DMEM/F12中在促性腺激素的存在下在5％CO₂和38.5℃下成熟42-44小時。在成熟結束時，去除卵丘細胞并選擇具有第一極體的卵母細胞用于進一步加工。

在本發(fā)明的一個實施方案中，用于核轉移的方法是基于無透明帶系統(tǒng)：通過短孵育時間的鏈霉蛋白酶(pronase)消化直到透明帶開始溶解來去除透明帶。然后用Hoechst對無透明帶的卵母細胞染色并在去核之前暴露于細胞松弛素B。使卵母細胞個別地分層為一排微滴并利用鈍頭微量吸管去核。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過常規(guī)的透明帶封閉方法制備卵母細胞：用于核轉移的細胞生長到融合和/或經歷血清饑餓24-48小時以同步其細胞周期。在操縱前，用胰蛋白酶將細胞處理為單細胞懸浮液并保持在室溫下直至使用。對于核轉移，在臨用前以高稀釋度將細胞散布在培養(yǎng)皿上(培養(yǎng)基液滴)，將去核的卵母細胞首先在含有植物血球凝集素的培養(yǎng)基中洗滌，然后立即滴在細胞上并翻轉直到兩個單元之間存在強接觸(Vajta等人,2003,Biology of reproduction,68:571-8)。

隨后使成對體(couplet)(去核的卵母細胞-體細胞)發(fā)生細胞融合。將成對體轉移到優(yōu)選地含有0.3M甘露醇、0.01mM Mg、PVA的陰離子培養(yǎng)基中，然后轉移到融合室中。通過傳遞雙重DC脈沖(例如1.2Kv/cm，持續(xù)30μsec)獲得融合。未融合的成對體可以再經受第二輪融合。在一個實施方案中，融合的成對體在通過持續(xù)30μsec的1.2KV/cm的雙重DC脈沖在含有1mM Ca的融合培養(yǎng)基中融合后的1-2小時內被激活，并在mSOFaa培養(yǎng)基中在5μM細胞松弛素B中孵育3.5-4小時。

在激活后，重構的無透明帶的胚胎可以在礦物油下的微滴中的改良的“孔中孔(well of the well)”系統(tǒng)(Vajta等人,2000,Molecular Reproduction and Development,55:256-64)中培養(yǎng)以防止胚胎之間的粘連。

在一個實施方案中，對于體外培養(yǎng)，制備20μl處于油下的mSOFaa微滴(Galli等人,2003,Cloning Stem Cells,5:223-232)，然后使用鈍頭小金屬裝置制備10到15個小坑。在每個小坑中，在所有培養(yǎng)期間，容納一個胚胎容納。在培養(yǎng)的第3天，用新鮮培養(yǎng)基替換一半培養(yǎng)基。在第5天，評估胚胎發(fā)育。將致密桑椹胚和早期囊胚轉移到同步接受者的子宮中。

可以通過超聲波診斷懷孕，例如在孕期第25天。在一個實施方案中，例如通過免疫細胞化學對收集的胎兒或新生動物進行分析以測定胰島中的轉基因表達。在一個實施方案中，在液氮中儲存胰腺細胞以用于未來的克隆?；谵D基因表達發(fā)現(xiàn)，使表達最好的胎兒經歷再克隆以產生轉基因豬胰島分離所必需的轉基因動物。在這種情況下，使所有的懷孕繼續(xù)到足月以生下活的動物。

根據(jù)一個實施方案，使用病毒載體，優(yōu)選地使用病毒，更優(yōu)選地使用選自包括慢病毒(例如具有不同包膜的HIV載體：VSV、γ逆轉錄病毒(MLV-A、RD114、GALV)、羅斯河病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒和腺相關病毒(AAV))的組的病毒進行轉基因改造。在一個優(yōu)選實施方案中，用于轉基因改造的載體是慢病毒。

根據(jù)一個實施方案，用于豬胰島細胞的轉基因改造的基因處于β細胞特異性豬胰島素啟動子的控制下，所述β細胞特異性豬胰島素啟動子具有或不具有通用啟動子例如UCOE啟動子(耐沉默)、CAGGS啟動子(巨細胞病毒(CMV)早期增強子元件與雞β肌動蛋白啟動子的組合)或CMV(巨細胞病毒)啟動子。在一個實施方案中，轉基因處于豬胰島素啟動子的控制下，優(yōu)選地所述胰島素啟動子是β豬胰島細胞所特有的，導致轉基因只在β細胞中表達。胰島素啟動子的核酸序列的一個實例包括(但不限于)SEQ ID NO:11。

在一個實施方案中，轉基因蛋白與另一個序列融合。在一個實施方案中，所述另一個序列融合在轉基因蛋白的C端。在另一個實施方案中，所述另一個序列融合在轉基因蛋白的N端。

在一個實施方案中，所述另一個序列將所述蛋白引導到分泌路徑。此類序列的實例包括(但不限于)Ig K鏈分泌信號(具有氨基酸序列SEQ ID NO:8，由SEQ ID NO:7編碼)。

在一個實施方案中，所述另一個序列是標簽，其例如允許所述轉基因蛋白的鑒別和分離。標簽的實例對于所屬領域技術人員是眾所周知的，并且包括(但不限于)血球凝集素標簽(HA標簽)、聚精氨酸標簽、聚組氨酸標簽、Myc標簽、Strep標簽、S-Tag、HAT標簽、3x Flag標簽、鈣調蛋白結合肽標簽、SBP標簽、殼聚糖結合結構域標簽、GST標簽、麥芽糖結合蛋白標簽、熒光蛋白標簽、T7標簽、V5標簽和Xpress標簽。在一個實施方案中，轉基因蛋白包含HA標簽，例如具有氨基酸序列YPYDVPDYA(SEQ ID NO:13)并由核酸序列SEQ ID NO:12編碼的HA標簽。

在一個實施方案中，轉基因在其3’端融合于允許轉錄的有效終止的另一個序列。

在一個實施方案中，轉基因與多聚腺苷酸序列融合。在一個實施方案中，轉基因與包含多聚腺苷酸序列的兔β球蛋白片段(例如具有序列SEQ ID NO:14)融合。

本發(fā)明的另一個目標是一種載體，其包含被組成性激活的乙酰膽堿受體、優(yōu)選地被組成性激活的毒蕈堿性受體、更優(yōu)選地被組成性激活的III型毒蕈堿性受體的核苷酸序列，甚至更優(yōu)選地具有核苷酸序列SEQ ID NO:3。優(yōu)選地，所述載體選自包括慢病毒的組，例如具有不同包膜的HIV載體：VSV、γ逆轉錄病毒(MLV-A、RD114、GALV)、羅斯河病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒和腺相關病毒(AAV)。優(yōu)選地，所述被組成性激活的乙酰膽堿受體的核苷酸序列處于β細胞特異性豬胰島素啟動子(例如具有序列SEQ ID NO:11的胰島素啟動子)的控制下。

在一個實施方案中，所述載體包含處于豬胰島素啟動子(在其序列上融合有HA標簽和多聚腺苷酸序列)控制下的被組成性激活的III型毒蕈堿性受體的核苷酸序列并且包含序列SEQ ID NO:22。

本發(fā)明的另一個目標是一種載體，其包含GLP-1的核苷酸序列，優(yōu)選地含有A8S突變和/或允許所編碼多肽的分泌的另一個序列，甚至更優(yōu)選地具有核苷酸序列SEQ ID NO:9。優(yōu)選地，所述載體選自包括慢病毒的組，例如具有不同包膜的HIV載體：VSV、γ逆轉錄病毒(MLV-A、RD114、GALV)、羅斯河病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒和腺相關病毒(AAV)。優(yōu)選地，所述GLP-1的核苷酸序列處于β細胞特異性豬胰島素啟動子例如胰島素啟動子的控制下。在一個實施方案中，所述胰島素啟動子是β豬胰島細胞所特有的，導致轉基因只在β細胞中表達。胰島素啟動子的核酸序列的一個實例包括(但不限于)SEQ ID NO:11。

在一個實施方案中，所述載體包含GLP1的核苷酸序列并且具有序列SEQ ID NO:23，所述GLP1包含A8S突變和Ig K鏈分泌信號兩者，處于豬胰島素啟動子的控制下并且在其序列上融合有多聚腺苷酸序列。

在一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因豬胰島或轉基因豬β細胞從至少6個月大、優(yōu)選地8個月大、更優(yōu)選地18個月大且甚至更優(yōu)選地2歲大的成年豬分離得到。轉基因豬胰島可以無時間延遲地用于移植患者，但是在有限的時期內發(fā)揮功能(例如當囊封在海藻酸鹽貼片中時，從成年豬分離的豬胰島一般可以在約4-6個月、優(yōu)選地約8個月的時期內在體內發(fā)揮功能)。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因豬胰島或轉基因豬β細胞從約3-4周大的新生豬分離得到。這些豬胰島必須培養(yǎng)約1周以便成熟，但是與從成年豬分離的豬胰島相比，在延長的時期內發(fā)揮功能。

在一個實施方案中，從新生豬分離的轉基因豬胰島在至少6個月、優(yōu)選地至少8個月、更優(yōu)選地至少12個月或更長的時期內在體內發(fā)揮功能。

如本文中所使用，成熟豬胰島對應于這樣的豬胰島，其(i)包含分化細胞，尤其是分化α和β細胞，和(ii)當用葡萄糖刺激時能夠分泌胰島素(這可以在測試D的條件中測量)。

可用于使從新生豬分離的轉基因豬胰島成熟的培養(yǎng)條件對于所屬領域技術人員是眾所周知的。可使用的培養(yǎng)基的一個非限制性實例是補充有0.25％BSA、10mM IBMX、100U/mL青霉素-鏈霉素、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺和10mM煙酰胺的HAM F10培養(yǎng)基。

用于從轉基因豬分離豬胰島的方法對于所屬領域技術人員是眾所周知的。在一個實施方案中，轉基因豬胰島的分離根據(jù)Dufrane等人,Xenotransplantation,2006和Dufrane等人,Transplantation,2006中描述的方案進行，該方案在下文簡略地加以總結。

根據(jù)一個實施方案，分離方案包括對豬放血以便降低胰腺血含量的步驟。簡言之，在腦死亡后，使動物保持心臟跳動直到摘除內臟的時候。通過切開頸動脈和頸靜脈進行放血，并吊住后腿將動物懸吊1到10分鐘，優(yōu)選地4到7分鐘。

簡言之，離體解剖胰腺。根據(jù)一個實施方案，用介于5到25分鐘之間的熱缺血進行胰腺的解剖。于是胰管暴露出來，并插入18號導管。然后借助于灌注液使腺體充滿冷儲存液。根據(jù)一個實施方案，每克組織使用1mL灌注液。將胰腺浸沒在保存液中進行儲存。根據(jù)一個實施方案，保存液是經典的威斯康辛大學液(UW，n＝6)或改良UW(UW-M；無羥乙基淀粉和低K⁺/高NA⁺)。

然后消化提取的胰腺。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，用優(yōu)選地由Roche/Boehringer Mannheim提供的釋放酶(Liberase)DL研究級(低分散酶(Dispase))酶進行胰腺離解。這種酶在低溫下，優(yōu)選地在約4℃到約12℃范圍的溫度下，優(yōu)選地在約8℃下以在約0.1到約1mg/mL范圍的濃度，優(yōu)選地以約0.5mg/mL的濃度溶解于UW-M液中。

根據(jù)一個實施方案，使用如Ricordi等人(1986,Diabetes,35:649-653)所述的動態(tài)方法消化胰腺。簡言之，將充滿這種酶的豬胰腺切片，裝載到Ricordi室(優(yōu)選地由具有7個玻璃球的316l不銹鋼制成)上，并在37℃下用加熱電路消化，并手動搖動該室。當樣品中出現(xiàn)大量的分離胰島時，冷卻消化電路，優(yōu)選地通過添加含10％NCS的冷Ham-F10培養(yǎng)基以便降低酶活性。然后用冷的培養(yǎng)基灌注約25到約40分鐘。將胰島、細胞和碎片收集在250mL管中并在4℃下離心(630g，持續(xù)3分鐘)。匯集所有的細胞沉淀并將其懸浮在200mL Ham-F10培養(yǎng)基中。

根據(jù)另一個實施方案，使用如O’Neil等人,2001所述的靜態(tài)方法消化胰腺。簡言之，用2到4倍體積(mL/g)的釋放酶PI灌注胰腺。對胰腺注射以便實現(xiàn)足夠的膨脹，將其放在無菌1L Nalgene罐中并通過在37℃下靜態(tài)孵育45到60分鐘來消化?；谀繙y檢查腺體，通過添加Ham-F10+20％NCS終止消化。通過具有1000μm孔徑的不銹鋼網過濾細胞懸浮液并在Ham-F10+20％NCS中稀釋。然后使消化的組織在6mm玻璃珠的床上通過并且穿過不銹鋼篩網。利用3到4L的冷Ham-F10+10％NCS將組織流出物收集在250mL圓錐管中并在4℃下以700rpm離心。將胰島、細胞和碎片收集在250mL管中并在4℃下離心(630g，持續(xù)3分鐘)。匯集所有的細胞沉淀并將其懸浮在200mL Ham-F10培養(yǎng)基中。

根據(jù)一個實施方案，在分離后，純化轉基因豬胰島。根據(jù)一個實施方案，使用如Dufrane等人Xenotransplantation,2006所述的不連續(xù)的Ficoll梯度進行轉基因豬胰島的純化。簡言之，使用不連續(xù)的Ficoll梯度，優(yōu)選地Ficoll Euro-Collins梯度在4℃下純化分離的胰島。將懸浮于75mL的Ficoll Euro-Collins溶液中的消化后的細胞沉淀(密度＝1.1g/cm³)放在平底管中。然后依序添加更低梯度的Ficoll(50mL的1.096g/cm³、50mL的1.060g/cm³和20mL的Ham-F10培養(yǎng)基)。Ham-F10培養(yǎng)基是F-10營養(yǎng)混合培養(yǎng)基并且是市售的，例如由N.V.Invitrogen,Belgium提供。在856g下將梯度管離心17分鐘后，從1.1/1.096和1.096/1.060界面收集胰島。將來自每個界面的胰島懸浮于含有50mL Ham-F10+10％NCS血清(NCS代表新生牛血清并且是市售的，例如由Biochrom AG,Germany提供)的兩個管中。將管在280g下離心3分鐘，移除上清液，并用150mL Ham-F10培養(yǎng)基洗滌細胞。這個程序可以重復，例如三次，并且最終將胰島懸浮于200mL Ham-F10培養(yǎng)基中。

本發(fā)明的另一個目標是一種包括本發(fā)明的轉基因豬胰島或轉基因β細胞的裝置。優(yōu)選地，本發(fā)明的裝置包括如上文所述的轉基因豬胰島。

根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的裝置是可植入或可移植的裝置。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的裝置是可注射的裝置。

根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明的裝置是生物耐久性的，這意味著在植入或注入受試對象時該裝置顯示提高的生物穩(wěn)定性。這種提高的生物穩(wěn)定性能夠使裝置中存在的細胞與當前情況相比在更長時期內保持在活體內，這將導致提高的治療功效。

在本發(fā)明的一個實施方案中，裝置可以是如WO02/32437中所述的血管化的皮下膠原蛋白管，以便允許形成預血管化的自體膠原蛋白貯庫，用于放置轉基因豬胰島或轉基因豬β細胞。簡言之，將具有松動地裝配的特氟龍棒的不銹鋼網的末端封閉管皮下插入預定移植接受者中。6周后移除特氟龍棒，留下高度血管化的膠原蛋白管。在一個實施方案中，將本發(fā)明的轉基因豬胰島或轉基因β細胞插入血管狀管中，然后用特氟龍塞子密封。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，裝置可以是基質制劑，其包括明膠、膠原蛋白和天然碳水化合物聚合物的制劑。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，裝置可以是血漿凝血酶凝塊，即利用異基因凝血酶產生的自體血漿凝塊。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，裝置可以是合適的生物相容性材料例如膠囊，用于對移植的轉基因豬胰島或β細胞提供額外的免疫保護。囊封系統(tǒng)在所屬領域是眾所周知的。有利的是，膠囊由半透膜制成，所述半透膜可透過葡萄糖、營養(yǎng)物和胰島素，但不能透過體液/細胞免疫組分。

在一個實施方案中，半透膜由選自包括海藻酸鹽、硝基纖維素、丙烯腈、瓊脂糖和聚四氟乙烯的組的材料制成。在一個優(yōu)選實施方案中，半透膜由海藻酸鹽制成。

在另一個實施方案中，裝置可以是用于活細胞的囊封系統(tǒng)，如WO2007/046719所述。根據(jù)這個實施方案，囊封系統(tǒng)包括生物耐久性組合物，其包括海藻酸鹽，所述海藻酸鹽富含甘露糖醛酸，尤其含有約50％到95％的甘露糖醛酸殘基，和具有<1.5的多分散指數(shù)的聚陽離子，例如聚-L-鳥氨酸。囊封系統(tǒng)可以是使用上文所述的組合物制備的生物相容性微膠囊，其包括：與陽離子交聯(lián)劑交聯(lián)的高甘露糖醛酸的海藻酸鹽的核心層，具有小于約1.5的多分散指數(shù)且形成半透膜的聚陽離子的中間層，和高甘露糖醛酸的海藻酸鹽的外層，所述微膠囊在核心層內包括或細胞。

在另一個實施方案中，裝置可以是如WO02/032437所述的微膠囊：用于此程序的海藻酸鈉是從原材料來源(海藻)提取的并制備成粉末狀超純形式。囊封程序涉及擠壓轉基因豬胰島或β細胞與海藻酸鈉溶液(1.6％)的混合物使其通過液滴生成針進入膠凝陽離子浴(氯化鈣)。被捕獲在海藻酸鈣凝膠中的胰島或β細胞然后用正電性的聚-L-鳥氨酸涂布，隨后用海藻酸鹽外涂層(0.05％)涂布。然后通過添加檸檬酸鈉使海藻酸鹽的中心核液化。優(yōu)選地，大多數(shù)膠囊含有3個轉基因豬胰島并且具有300到400μm的直徑。

在另一個實施方案中，裝置可以是如WO2010/032242所述的大膠囊。WO2010/032242公開一種用于通過人工膜移植和免疫分離細胞(例如功能細胞，典型地是朗格漢斯島)的系統(tǒng)，所述人工膜是通過將細胞巨囊封在水凝膠例如海藻酸鹽基質中提供的。形成巨囊封胰島的水凝膠，以便具有平坦的幾何構型，例如厚片、薄片或圓盤。典型地，海藻酸鹽結構具有至少一個基本上平坦的表面。海藻酸鹽包括超純級海藻酸鹽和交聯(lián)的指定組成，以便將細胞或組織片段囊封在水凝膠中。典型地，海藻酸鹽厚片以2,000-8,000個胰島/cm²的密度容納轉基因豬胰島。巨囊封胰島的海藻酸鹽典型地具有小于50％的古羅糖醛酸濃度，使得厚片是足夠柔性的，從而符合腎的形狀并安裝在腎的包膜下空間內，但是具有足夠的強度，從而維持厚片的整體物理特征。另外，海藻酸鹽包含大于1.5％的干物質含量，使得厚片具有足夠的強度和穩(wěn)定性以便能承受力。典型地，巨囊封的胰島厚片提供至少1:10(即以體積計的10％胰島)的胰島體積與海藻酸鹽體積的比率。對于一些應用，用于囊封胰島的海藻酸鹽補充有膠原蛋白。在一些應用中，將胰島布置在初級海藻酸鹽厚片的中心，并且補充性海藻酸鹽層圍繞囊封在初級海藻酸鹽厚片內的胰島。在此類應用中，醫(yī)藥級的膠原蛋白層可以和補充性海藻酸鹽層組合使用。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，裝置可以是如WO2007/144389所述的細胞裝置，所述裝置包括(a)具有第一側和第二側的膠原蛋白基質；(b)被吸收在膠原蛋白基質的第一側的第一細胞層；和(c)第一膠凝海藻酸鹽層和第二膠凝海藻酸鹽層；其中第一膠凝海藻酸鹽層完全覆蓋膠原蛋白基質的第一側和第一細胞層，并且其中第二膠凝海藻酸鹽層完全覆蓋膠原蛋白基質的第二側。

根據(jù)一個實施方案，利用Inotech囊封AG裝置(Dottikon,Switzerland)將新鮮分離的轉基因豬胰島或β細胞囊封在SLM 100海藻酸鹽基質(FMC BioPolymer,Norway)中。

優(yōu)選地，在植入或注入患者體內之前將本發(fā)明的裝置滅菌。有利的是，滅菌包括γ照射、電子束、環(huán)氧乙烷、高壓滅菌或在添加液體組分之前將裝置與醇接觸，或與NOx氣體接觸，氫氣等離子體滅菌。

優(yōu)選地，裝置具有低含量的內毒素。在一些實施方案中，細胞裝置具有小于100內毒素單位(EU)/g、小于90EU/g、小于80EU/g、小于70EU/g、小于60EU/g、小于50EU/g、小于40EU/g、小于30EU/g、小于20EU/g、小于10EU/g、小于5EU/g或小于1EU/g的內毒素水平。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，裝置可以是如WO02/060409所述的囊封室，所述裝置包括產生生物活性物質(例如胰島素)的細胞，例如轉基因豬胰島或β細胞，并且包括至少一個半透膜。所述裝置的半透膜可以包括生物相容性多孔聚碳酸酯膜，其中所述多孔聚碳酸酯膜在表面上通過產生極性位點而被修飾，并且其中所述多孔聚碳酸酯膜被至少一種親水聚合物涂布，例如纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯酯共聚物、聚乙二醇、親水性聚(甲基)丙烯酸酯、聚糖苷(polyoside)和殼聚糖。

本發(fā)明還涉及一種組合物，其包含本發(fā)明的轉基因豬β細胞、轉基因豬胰島或裝置。

本發(fā)明還涉及一種醫(yī)藥組合物，其包含本發(fā)明的轉基因豬β細胞、轉基因豬胰島或裝置以及至少一種藥學上可接受的賦形劑。如本文中所使用，“藥學上可接受的賦形劑”是指當施予動物、優(yōu)選人時不產生不利的、過敏的或其它不良反應的賦形劑。其包括任何和所有的溶劑、分散介質、涂料、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。對于人的施用，制劑應當符合管理部門例如FDA辦公室或EMA所要求的無菌性、致熱原性、一般安全和純度標準。

本發(fā)明還涉及一種藥物，其包含本發(fā)明的轉基因豬β細胞、轉基因豬胰島或裝置。

本發(fā)明的另一個目的涉及本發(fā)明的轉基因豬胰島、轉基因β細胞、裝置或組合物、醫(yī)藥組合物或藥物的用途，其用于治療與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀。此類疾病的實例包括(但不限于)I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隱匿性自身免疫糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、青年成熟期發(fā)病型糖尿病、新生兒糖尿病(例如永久性新生兒糖尿病或暫時性新生兒糖尿病)、前驅糖尿病、類固醇誘導的糖尿病、胰腺癌，尤其是內分泌胰腺癌，例如內分泌胰腺腫瘤和胰腺神經內分泌癌。

在一個實施方案中，所述疾病、病癥或病狀是糖尿病，例如I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隱匿性自身免疫糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、青年成熟期發(fā)病型糖尿病、新生兒糖尿病(例如永久性新生兒糖尿病或暫時性新生兒糖尿病)、前驅糖尿病、類固醇誘導的糖尿病。

本發(fā)明的另一個目標是本發(fā)明的轉基因豬胰島、轉基因β細胞、裝置或組合物、醫(yī)藥組合物或藥物，其用于在有需要的受試對象體內調控血糖水平。在一個實施方案中，調控血糖水平意味著恢復正常的空腹血糖水平，其中正常的空腹血糖水平優(yōu)選地對應于在類似年齡和體重的正常(即非糖尿病)個體中測量的空腹血糖水平。在一個實施方案中，正常的空腹血糖水平低于110mg/dL(即6.1mmol/L)，優(yōu)選低于100mg/dL(即5.6mmol/L)。

本發(fā)明的另一個目標是本發(fā)明的轉基因豬胰島、轉基因β細胞、裝置或組合物、醫(yī)藥組合物或藥物，其用于在有需要的受試對象體內恢復正常胰島素分泌水平。在一個實施方案中，正常胰島素分泌水平對應于通過在類似年齡和體重的正常非糖尿病個體中葡萄糖的指定攝取而誘導的胰島素分泌水平。在一個實施方案中，可以通過葡萄糖耐量測試(例如口服葡萄糖耐量測試(OGTT)或靜脈內葡萄糖耐量測試(IVGTT))來測量響應于葡萄糖攝取的胰島素分泌。在一個實施方案中，在非糖尿病受試對象的IVGTT中，在施用0.3-0.5g/kg的量的葡萄糖之后，胰島素分泌可以達到100μU/mL的最大值，然后降到基礎值(15-20μU/mL)。

本發(fā)明還涉及一種用于治療與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的轉基因豬胰島、轉基因豬β細胞、裝置或組合物、醫(yī)藥組合物或藥物施予有需要的受試對象，或由所述施予組成。此類疾病的實例包括(但不限于)I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隱匿性自身免疫糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、青年成熟期發(fā)病型糖尿病、新生兒糖尿病(例如永久性新生兒糖尿病或暫時性新生兒糖尿病)、前驅糖尿病、類固醇誘導的糖尿病、胰腺癌，尤其是內分泌胰腺癌，例如內分泌胰腺腫瘤和胰腺神經內分泌癌。

在一個實施方案中，所述疾病、病癥或病狀是糖尿病，例如I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠糖尿病、隱匿性自身免疫糖尿病、1.5型糖尿病、脂肪萎縮性糖尿病、青年成熟期發(fā)病型糖尿病、新生兒糖尿病(例如永久性新生兒糖尿病或暫時性新生兒糖尿病)、前驅糖尿病、類固醇誘導的糖尿病。

本發(fā)明的另一個目標是一種用于在有需要的受試對象體內調控血糖水平的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的轉基因豬胰島、轉基因β細胞、裝置或組合物、醫(yī)藥組合物或藥物施予所述受試對象。在一個實施方案中，調控血糖水平意味著恢復正常的空腹血糖水平，其中正常的空腹血糖水平優(yōu)選地對應于在類似年齡和體重的正常非糖尿病個體中測量的空腹血糖水平。在一個實施方案中，正常的空腹血糖水平低于110mg/dL(即6.1mmol/L)，優(yōu)選低于100mg/dL(即5.6mmol/L)。

本發(fā)明的另一個目標是一種用于在有需要的受試對象體內恢復正常胰島素分泌水平的方法，其包括將治療有效量的本發(fā)明的轉基因豬胰島、轉基因β細胞、裝置或組合物、醫(yī)藥組合物或藥物施予所述受試對象。在一個實施方案中，正常胰島素分泌水平對應于通過在類似年齡和體重的正常(即非糖尿病)個體中葡萄糖的指定攝取而誘導的胰島素分泌水平。在一個實施方案中，可以通過葡萄糖耐量測試(例如口服葡萄糖耐量測試(OGTT)或靜脈內葡萄糖耐量測試(IVGTT))來測量響應于葡萄糖攝取的胰島素分泌。在一個實施方案中，在非糖尿病受試對象的IVGTT中，在施用0.3-0.5g/kg的量的葡萄糖之后，胰島素分泌可以達到100μU/mL的最大值，然后降到基礎值(15-20μU/mL)。

本發(fā)明的另一個目標是一種用于在有需要的受試對象體內治療與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀、調控血糖水平或恢復正常胰島素分泌水平的方法，所述方法包括對所述受試對象施用治療有效量的轉基因豬β細胞或轉基因豬胰島，其中PKA和PKC路徑被組成性地激活，從而增加所述受試對象的胰島素分泌。

在一個實施方案中，所述胰島素分泌的增加是由以下原因引起的：所述轉基因細胞或胰島表達被組成性激活的M3毒蕈堿性受體，這導致PIP2水解的增加，從而引起IP3和DAG合成的增加，從而激活PKC路徑并增加細胞質內Ca²⁺的排出，從而增強胰島素合成和分泌。

在一個實施方案中，所述胰島素分泌的增加是由以下原因引起的：所述轉基因細胞或胰島表達GLP-1，從而激活腺苷酸環(huán)化酶，從而增加cAMP生產，從而

(i)激活蛋白激酶A(PKA)，從而激活胰島素分泌過程中涉及的蛋白質(例如PDX-1)；和

(ii)誘導構象變化，變成G蛋白Rap1，從而通過擴大可供直接釋放使用的顆粒池的大小來增強胰島素胞吐；

從而增強胰島素合成和分泌。

在一個實施方案中，本發(fā)明的轉基因豬胰島、轉基因豬β細胞、裝置或組合物、醫(yī)藥組合物或藥物通過植入、移植或注射施用。優(yōu)選地，施用在皮下、腹膜內、肌肉內、腎包膜中或腎包膜下進行。

根據(jù)一個實施方案，施用的轉基因豬β細胞或豬胰島的數(shù)量(即治療有效量)在10000到50000IEQ/kg體重，優(yōu)選地30000到50000IEQ/kg體重的范圍。IEQ意思是豬胰島當量。

根據(jù)一個實施方案，當使用裝置時，可施用一個或多個裝置，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多。

在一個實施方案中，有需要的受試對象另外接受免疫抑制治療。在一個實施方案中，轉基因豬胰島、轉基因豬β細胞、裝置或組合物、醫(yī)藥組合物或藥物和免疫抑制治療的施用可以是同時的或依序的。有利的是，免疫抑制治療包括施用選自包括達利珠單抗(daclizumab)、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素(rapamycin)、嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil)、環(huán)孢菌素(cyclosporine)、脫氧精胍菌素(deoxyspergualin)或脫氧精胍菌素類似物、可溶性補體受體1、抗CD154抗體、ATG、甲潑尼龍(methylprednisolone)、抗IL-2R抗體、巴利昔單抗(basiliximab)、FTY720、依維莫司(everolimus)、來氟米特(leflunomide)、西羅莫司(sirolimus)、貝拉西普(belatacept)、CTLA4-Ig、眼鏡蛇毒的組的至少一種產品，或由所述施用組成。

優(yōu)選地，當不用裝置施用改造的豬胰島時，進行免疫抑制治療。

優(yōu)選地，受試對象是哺乳動物，優(yōu)選靈長動物，包括人和非人靈長動物，更優(yōu)選人。在一個實施方案中，受試對象是雄性。在另一個實施方案中，受試對象是雌性。在另一個實施方案中，受試對象也可指寵物，例如狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠、雪貂、兔子等等。

根據(jù)一個實施方案，受試對象患有與內分泌胰腺或β細胞功能的缺陷或不存在相關的疾病、病癥或病狀。優(yōu)選地，受試對象患有I型糖尿病或II型糖尿病。

附圖說明

圖1是顯示成年豬和新生豬的分離豬胰島的胰島素分泌的柱狀圖。將200個胰島的多個批次在僅含有15mM葡萄糖(G15)或含有15mM葡萄糖(G15)與毛喉素(forskolin)(Fsk；1μM)、佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA；20nM)或Fsk和PMA兩者的組合的1ml krebs培養(yǎng)基中孵育。測量培養(yǎng)基中的胰島素分泌，并將其表示為每個胰島批次的總胰島素含量的百分比。柱體上的數(shù)字表示測試組中的胰島素分泌與僅15mM葡萄糖相比的倍數(shù)增加。*p<0.05。值是對于來自8個不同的成年豬制劑的n＝5-21和來自11個不同的新生豬制劑的n＝11-43的平均值±SEM。

圖2是顯示用1(G1)或15mM(G15)葡萄糖孵育的轉染Min6細胞的葡萄糖誘導的胰島素分泌的柱狀圖。成對柱體上的數(shù)字表示每組中的刺激比(G15/G1)。*p<0.05指示測試組與對照之間的顯著差異。值是對于來自7個不同實驗的n＝15-21的平均值±SEM。

圖3是兩個柱狀圖的組合，其顯示暴露于200MOI攜帶編碼GLP-1(GLP-1Ser8)、激活的毒蕈堿性受體(M3R)或兩者(GLP-1+M3R)的序列的病毒表達載體48小時期間的新生豬(A)和成年豬(B)的分離豬胰島的胰島素分泌。將200個胰島的多個批次在含有1mM葡萄糖(G1)或15mM葡萄糖(G15)的1ml krebs培養(yǎng)基中孵育。測量培養(yǎng)基中的胰島素分泌，并將其表示為每個胰島批次的總胰島素含量的百分比。*p<0.05。值是來自10個不同制劑的n＝38-46的平均值±SEM。

圖4是曲線圖，其顯示暴露于200MOI攜帶編碼GLP-1(GLP-1Ser8)、激活的毒蕈堿性受體(M3R)或兩者(GLP-1+M3R)的序列的病毒表達載體48小時期間的分離成年豬胰島的胰島素分泌。將600個胰島的多個批次在先含有1mM葡萄糖(G1)后含有15mM葡萄糖(G15)的krebs培養(yǎng)基中灌流，如圖的頂部所指示。然后測量流出物餾分中的胰島素分泌。值是來自4個不同制劑的n＝3-4的平均值±SEM。

實施例

進一步通過以下實施例說明本發(fā)明。

實施例1：

將分離的豬胰島在37℃、5％CO²/95％O₂下，在含有10％熱滅活FCS、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、5mmol/l葡萄糖的RMPI培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。然后將分離的豬胰島在含有1mmol/L或15mmol/L葡萄糖的1mL Krebs-Ringer緩沖液中孵育2小時，所述Krebs-Ringer緩沖液任選地補充有20nM佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯(PMA，PKC路徑的直接激活劑)和/或1μM毛喉素(PKA路徑的間接激活劑)。最終通過放射免疫分析法定量回收的培養(yǎng)基中和孵育的胰島中的胰島素。

如圖1所示，PMA對PKC的直接激活使葡萄糖誘導的胰島素分泌在從成年豬分離的分離豬胰島中增加至2倍，并在從新生豬分離的豬胰島中增加至高達8倍，從而提高豬胰島對葡萄糖的響應性。我們還觀察到當用毛喉素升高β細胞cAMP以激活PKA和Epac2時的略微較小的增加。有趣的是，當我們將轉基因豬胰島在15mM葡萄糖的存在下暴露于PMA和毛喉素兩者時，我們觀察到分泌應答的意外的協(xié)同作用，其然后在成年豬胰島中增加至大約6倍并在新生豬胰島中增加至25倍。這些結果因此證明PKC激活和PKA激活對胰島素分泌的意外的協(xié)同作用。

實施例2：

為了證實轉基因蛋白的表達、被靶向路徑的激活以及這種激活對葡萄糖誘導的胰島素分泌的作用，轉染鼠β細胞的一個品系(MIN6)。

通過RT-PCR在mRNA層面證實轉基因蛋白的表達。被激活的毒蕈堿性受體的序列與野生型受體在很大程度上不同，并且因此可使用對已添加到受體序列中的標簽具有特異性的抗體，通過對被轉染MIN6細胞提取物蛋白質印跡驗證蛋白質的表達。通過測量轉基因細胞和對照細胞中的胞內GLP-1的量以及測量培養(yǎng)基中的GLP-1分泌來證明GLP-1生產。

為了證明轉基因蛋白對胰島素分泌的作用，通過在靜態(tài)孵育實驗期間增加葡萄糖濃度來激發(fā)轉染的MIN6細胞和對照MIN6細胞。測量胰島素分泌，并且計算轉基因細胞和對照細胞的刺激指數(shù)，即高葡萄糖下的胰島素分泌與低葡萄糖下的胰島素分泌之間的比率。簡言之，將2×10⁵個細胞接種到12孔板中并培育48小時，然后用攜帶GLP-1(7-37)基因(GLP-1)、突變GLP-1(7-A8S-37)基因(GLP-1Ser8)或被組成性激活的毒蕈堿性受體基因(M3)的質粒中的一種轉染這些細胞。對照細胞僅僅暴露于無任何質粒DNA的Lipofectamine。轉染后48小時，使細胞饑餓，然后在含有1或15mM葡萄糖的1mL Krebs-Ringer緩沖液中孵育2小時。測量培養(yǎng)基中的胰島素分泌，并將其表示為細胞的總胰島素含量的百分比。

圖2顯示Min6細胞中GLP-1的轉基因表達引起葡萄糖誘導的胰島素分泌的不顯著的輕微增加(刺激指數(shù)2.6，對比對照細胞中的2.2)。有趣的是，編碼具有更大半衰期的經修飾GLP-1(GLP-1Ser8)的轉基因誘導了對于15mM葡萄糖的分泌應答的更顯著的增加(刺激指數(shù)3.2，對比對照細胞中的2.2)。被組成性激活的3型毒蕈堿性受體(M3)在Min6細胞中的表達顯著增加了由15mM葡萄糖誘導的胰島素分泌(刺激指數(shù)3.9，對比對照中的2.2)。

這些結果因此顯示，所用的質粒成功地誘導目的分子的表達，并且這種表達增加對葡萄糖的分泌應答。

實施例3：

在分離的豬胰島中評估PKA和PKC路徑的轉基因激活的作用。為此目的，將GLP-1Ser8和M3R序列插入pENTCMV腺病毒載體中以允許轉基因GLP-1(GLP-1Ser8)和被激活的毒蕈堿性受體(M3R)在原代胰島細胞中的表達。對于GLP-1和M3R的共同表達，將這兩個序列插入同一個雙順反子載體中以研究PKA和PKC的同時激活對于豬胰島的胰島素分泌的作用。在葡萄糖激發(fā)之前的48小時內，將在HAM F10中培育的新生豬胰島(小組A)和在RPMI中培育的成年豬胰島(小組B)以感染復數(shù)200(MOI＝200)暴露于GLP-1、M3R或GLP-1+M3R病毒表達載體。然后將胰島在含有1mM或15mM葡萄糖的1mL Krebs-Ringer緩沖液中孵育2小時。然后通過放射免疫分析法定量回收的培養(yǎng)基中和孵育的胰島中的胰島素。

如圖3所示，對照胰島中的刺激指數(shù)對于新生豬胰島來說是3.3，并且對于成年豬來說是3。表達GLP-1Ser8的胰島顯示提高的但與對照無顯著不同的胰島素分泌，在新生豬中的刺激指數(shù)為4.4，但在成年豬中對分泌不存在作用(分泌指數(shù)2.7)。當用M3R表達載體感染胰島時，胰島素分泌進一步增加，并且與對照相比的差異是顯著的，導致新生豬和成年豬中的刺激指數(shù)分別為5.4和4.1。最后，如同從實施例1所示的結果所預期的那樣，共同表達GLP-1和M3R的新生豬胰島顯示胰島素分泌的協(xié)同應答，因為其刺激指數(shù)為7.3。在成年豬胰島中也觀察到這種作用，但程度較低(刺激指數(shù)5.5)。

還在動態(tài)胰島灌流實驗中測試了轉基因PKA和PKC激活對葡萄糖誘導的胰島素分泌的作用。將對照和經病毒處理的成年豬胰島放置在用0.2μm濾器密封的灌流室中。首先在30分鐘內用1mM葡萄糖(G1)krebs培養(yǎng)基灌流胰島以進行平衡，然后在10分鐘內每隔2分鐘收集一次G1培養(yǎng)基，隨后用G15刺激30分鐘。如圖4所示并且與靜態(tài)孵育中所觀察到的一致，GLP-1表達對急性胰島素分泌幾乎沒有作用。M3R表達增加了兩個階段的葡萄糖誘導的胰島素分泌，但是當成年豬胰島共同表達GLP-1和M3R時，這種增加更大。

這些結果因此證實了使用藥理學激活豬胰島細胞中的PKA和PKC路徑所獲得的數(shù)據(jù)。我們的結論是，豬β細胞中這兩種路徑的同時激活將是獲得功能增強的豬胰島的最佳策略。