本發(fā)明涉及腫瘤特異性的肽-藥物偶聯(lián)物和包含所述偶聯(lián)物的藥物組合物。本發(fā)明還涉及此類偶聯(lián)物和組合物作為抗腫瘤劑用于哺乳動(dòng)物，特別是人的癌癥治療的用途。

背景和相關(guān)技術(shù)

與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞常常過(guò)表達(dá)某些蛋白酶。這促進(jìn)了對(duì)于靶向癌細(xì)胞的努力，通過(guò)將細(xì)胞毒性治療劑與被腫瘤蛋白酶裂解的肽連接，以在癌細(xì)胞附近或內(nèi)部釋放細(xì)胞毒性藥物同時(shí)不傷害或基本上不影響正常細(xì)胞。

美國(guó)專利號(hào)6,214,345公開了包括自切除接頭并且在腫瘤的部位處選擇性活化的腫瘤特異性肽-藥物偶聯(lián)物，其中所述藥物可以是絲裂霉素或阿霉素，并且自切除接頭是對(duì)-氨基芐醇。

表達(dá)天冬酰胺酶的細(xì)胞為肽-藥物偶聯(lián)物方法制造有吸引力的靶標(biāo)，這是因?yàn)樵S多腫瘤過(guò)表達(dá)這些蛋白酶。一種這樣的天冬酰胺酶，豆莢蛋白(legumain)在這方面吸引了特別的注意(Wu等人,Cancer R esearch 2006；66:970-980；Liu等人,Cancer Research 2003；63:2957–2964；Bajjuri等人,ChemMedChem.2011；6:.doi:10.1002/cmdc.201000478；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3549592/pdf/nihm 54-59 s-340268.pdf.)。

絲裂霉素、阿霉素和喜樹堿作為用于肽-藥物偶聯(lián)療法的藥物引已起了注意。美國(guó)專利號(hào)7,608,591；美國(guó)公開申請(qǐng)20110300147；美國(guó)公開申請(qǐng)20090175873；以及美國(guó)專利號(hào)8,314,060公開了用包含阿霉素的藥物來(lái)靶向豆莢蛋白的肽-藥物偶聯(lián)物的實(shí)例。

上述參考文獻(xiàn)中的每個(gè)的全文以引用方式并入本文。

這些先前的方法通常涉及藥物部分的化學(xué)修飾，其可能不利地影響藥物的功效。肽直接(通過(guò)C-末端羧基基團(tuán))與絲裂霉素的氮丙啶N原子偶聯(lián)產(chǎn)生仲酰胺，其是通常不受蛋白酶攻擊的官能團(tuán)。此外，對(duì)于絲裂霉素的研究表明NH基團(tuán)在氮丙啶環(huán)中對(duì)生物活性的作用。因此，存在對(duì)于將諸如絲裂霉素的抗腫瘤藥物靶向表達(dá)豆莢蛋白和其他天冬酰胺酶的腫瘤細(xì)胞的改進(jìn)偶聯(lián)物的需要。

附圖簡(jiǎn)述

圖1是顯示當(dāng)暴露于人血漿時(shí)N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[本文的綴合物8]的衰變速率作為時(shí)間的函數(shù)的圖。

圖2是顯示在施用N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素后Balb/c小鼠的體重作為時(shí)間的函數(shù)的圖。

圖3是顯示在施用N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素后Balb/c小鼠中的皮下CT-26同系結(jié)腸癌模型的腫瘤生長(zhǎng)曲線的圖。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的某些實(shí)施方案是肽-藥物偶聯(lián)物。此類偶聯(lián)物一般包括：1)可以被細(xì)胞蛋白酶裂解的肽部分，其結(jié)合2)自切除接頭，特別是對(duì)-氨基芐基氨基甲?；?qū)?氨基芐基碳酸酯部分，其接著結(jié)合3)細(xì)胞毒性藥物部分。在這些實(shí)施方案中，接頭部分附接到天冬酰胺殘基，在所述位置發(fā)生蛋白水解裂解。

在特定實(shí)施方案中，肽-藥物偶聯(lián)物具有下式1的結(jié)構(gòu)：

R-Y-Z-Asn-接頭-D(式I)

其中

R包括選自由以下組成的組的取代基：

i)來(lái)源于C₁至約C₂₀直鏈、支鏈或脂環(huán)族羧酸的?；?、氨基甲酰基、磺?；?、磷?；蛲榛淙芜x地被1至約5個(gè)羥基、胺基、羧基、磺酸基或磷酰基取代，

ii)具有1至約50個(gè)L-或D-氨基酸殘基的肽，以及

iii)分子量為400至約40,000的聚乙二醇；

Y是選自由Ala、Thr、Ser、Leu、Arg、Pro、Val、Tyr、Phe組成的組的氨基酸殘基；

Z是選自由Ala、Thr、Asn和Pro組成的組的氨基酸殘基；

Asn是天冬酰胺殘基；

接頭是對(duì)-氨基芐基氨基甲?；糠只?qū)?氨基芐基碳酸酯部分；

D是結(jié)合到接頭部分的抗腫瘤藥物部分，其中所述藥物選自由以下組成的組：絲裂霉素、阿霉素、氨基蝶呤、放線菌素、博來(lái)霉素、9-氨基-喜樹堿、N⁸-乙?；鶃喚?、1-(2-氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼、他利霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、喜樹堿、紫杉醇、拉霉素、鬼臼毒素、蛇形菌素(anguidine)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、嗎啉-阿霉素、正-(5,5-二乙酰氧基-戊基)阿霉素及其衍生物。

在式I的特定實(shí)施方案中：

R包括選自由以下組成的組的取代基：

i)來(lái)源于C1至約C20直鏈、支鏈或脂環(huán)族羧酸的?；?，其任選地被1至約5個(gè)羥基、胺基、羧基、磺酸基或磷酰基取代，

ii)具有1至約50個(gè)L-氨基酸殘基的肽，以及

iii)分子量為400至約40,000的聚乙二醇；

Y是選自由Ala、Thr、Ser、Leu、Arg、Pro、Val、Tyr、Phe組成的組的氨基酸殘基；

Z是選自由Ala、Thr、Asn和Pro組成的組的氨基酸殘基；

Asn是天冬酰胺殘基；

接頭是對(duì)-氨基芐基氨基甲?；糠郑?/p>

D是抗腫瘤藥物部分，其中所述藥物選自由絲裂霉素和阿霉素組成的組。

在式I的其他特定實(shí)施方案中：

R包括選自由以下組成的組的取代基：

i)來(lái)源于C1至約C20直鏈、支鏈或脂環(huán)族羧酸的酰基、氨基甲?；?、磺酰基、磷?；蛲榛?，其任選地被1至約5個(gè)羥基、胺基、羧基、磺酸基或磷?；〈?，

ii)具有1至約50個(gè)L-或D-氨基酸殘基的肽，以及

iii)分子量為400至約40,000的聚乙二醇；

Y是選自由Ala、Thr、Ser、Leu、Arg、Pro、Val、Tyr、Phe組成的組的氨基酸殘基；

Z是選自由Ala、Thr、Asn和Pro組成的組的氨基酸殘基；

Asn是天冬酰胺殘基；

接頭是對(duì)-氨基芐基碳酸酯部分；并且

D是結(jié)合到接頭部分的抗腫瘤藥物部分，并且其中所述藥物是喜樹堿。

在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括式II所示的式的二聚肽-藥物偶聯(lián)物：

D’-接頭-Asn-Z-Y-R’-Y-Z-Asn-接頭-D(式II)

其中D和D’是彼此相同、不同的細(xì)胞毒性藥物部分，并且獨(dú)立地選自由以下組成的組：絲裂霉素、阿霉素、氨基蝶呤、放線菌素、博來(lái)霉素、9-氨基-喜樹堿、N⁸-乙?；鶃喚贰?-(2-氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼、他利霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、喜樹堿、紫杉醇、拉霉素、鬼臼毒素、蛇形菌素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、嗎啉-阿霉素、正-(5,5-二乙酰氧基-戊基)阿霉素及其衍生物；

接頭是對(duì)-氨基芐基氨基甲酸酯部分或?qū)?氨基芐基碳酸酯部分，其中所述接頭可以是相同或不同的；

R’包括選自由以下組成的組的取代基：

i)選自由任選地被1至約5個(gè)羥基、胺基、羧基、磺酸基或磷?；〈膩?lái)源于C₁至約C₂₀直鏈、支鏈或脂環(huán)族羧酸的酰基、氨基甲?；?、磺?；?、磷?；蛲榛M成的組的雙官能團(tuán)，

ii)具有1至約50個(gè)L-或D-氨基酸殘基的肽，以及

iii)分子量為400至約40,000的聚乙二醇；并且

Y是選自由Ala、Thr、Ser、Leu、Arg、Pro、Val、Tyr、Phe組成的組的氨基酸殘基；

Asn是天冬酰胺殘基；并且

Z是選自由Ala、Thr、Asn和Pro組成的組的氨基酸殘基。

如將理解的，式II的偶聯(lián)物基本上是式I的偶聯(lián)物的二聚體形式，其可以使每個(gè)偶聯(lián)物的兩個(gè)細(xì)胞毒性藥物分子靶向靶細(xì)胞或組織。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種藥物組合物，其在至少一種藥學(xué)上可接受的載體中包含至少一種式I或式II的肽-藥物偶聯(lián)物。

在仍然進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種治療哺乳動(dòng)物(其可以是人)的癌癥的方法，其包括施用抗腫瘤有效量的本發(fā)明偶聯(lián)物或藥物組合物。

發(fā)明詳述

如此處所用的“絲裂霉素”是指從頭狀鏈霉菌(Streptomyces caespitosus)或淡紫灰鏈霉菌(Streptomyces lavendulae)分離的含氮丙啶的藥物家族的成員，并且特別包括絲裂霉素C和絲裂霉素A。

如本文所用的“阿霉素”是指來(lái)源于鏈霉菌細(xì)菌波賽鏈霉菌(Streptomyces peucetius var.caesius)的蒽環(huán)類家族的成員，并且包括阿霉素、柔紅霉素、表柔比星和伊達(dá)比星。

如此處所用的“喜樹堿”是指從喜樹(Camptotheca acuminata)及其化學(xué)衍生物分離的生物堿家族的成員，并且包括喜樹堿、伊立替康、拓?fù)涮婵岛捅R比替康。

本發(fā)明提供腫瘤特異性的肽-藥物偶聯(lián)物，其包括肽部分、自切除接頭和細(xì)胞毒性藥物部分，所述自切除接頭為對(duì)氨基芐基-氨基甲?；?qū)?氨基芐基碳酸酯(取決于包含在自切除接頭所附接的藥物中的官能團(tuán)的類型)。在偶聯(lián)物基本上無(wú)活性和無(wú)毒性的意義上，所述偶聯(lián)物用作前藥。肽部分可以被蛋白酶在體內(nèi)選擇性地裂解以釋放自切除接頭/細(xì)胞毒性藥物部分。在這種酶裂解后，自切除接頭自發(fā)水解以產(chǎn)生為其活性形式，但是更加直接針對(duì)靶向環(huán)境(諸如人類患者的腫瘤部位)的游離藥物。以這種方式，細(xì)胞毒性藥物靶向需要治療的特定部位，而減少除靶標(biāo)部位以外的部位處的細(xì)胞和組織損傷。

細(xì)胞毒性藥物部分具有化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)，藥物主鏈通過(guò)所述化學(xué)反應(yīng)性官能團(tuán)共價(jià)鍵合到自切除接頭。將細(xì)胞毒性藥物連接到自切除接頭的官能團(tuán)使得在自切除接頭水解時(shí)，細(xì)胞毒性藥物以細(xì)胞毒性活化形式被釋放。這種官能團(tuán)可包括，例如伯胺、仲胺或羥基。細(xì)胞毒性藥物包括絲裂霉素、阿霉素、氨基蝶呤、放線菌素、博來(lái)霉素、9-氨基-喜樹堿、N⁸-乙?；鶃喚?、1-(2-氯乙基)-1,2-二甲磺酰肼、他利霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、喜樹堿、紫杉醇、拉霉素、鬼臼毒素、蛇形菌素、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、嗎啉-阿霉素、正-(5,5-二乙酰氧基-戊基)阿霉素及其衍生物。優(yōu)選的實(shí)施方案是基于絲裂霉素、阿霉素和/或喜樹堿的。

在藥物(D)是絲裂霉素的具體實(shí)施方案中，肽-藥物偶聯(lián)物具有如式III所示的結(jié)構(gòu)(其中R如上所定義，并且Ala是丙氨酸殘基)：

式III

在藥物(D)是阿霉素的具體實(shí)施方案中，肽-藥物偶聯(lián)物具有如式IV所示的結(jié)構(gòu)(其中R如上所定義，并且Ala是丙氨酸殘基)：

式IV

在藥物(D)是喜樹堿的具體實(shí)施方案中，肽-藥物偶聯(lián)物具有如式V所示的結(jié)構(gòu)(其中R如上所定義，并且Ala是丙氨酸殘基)：

式V

在藥物(D)是絲裂霉素且藥物(D’)是阿霉素的二聚偶聯(lián)物的具體實(shí)施方案中，肽-藥物偶聯(lián)物具有如式VI所示的結(jié)構(gòu)(其中R'如上所定義，并且Ala是丙氨酸殘基)：

式VI

在藥物(D)是絲裂霉素且藥物(D')是喜樹堿的二聚偶聯(lián)物的具體實(shí)施方案中，肽-藥物偶聯(lián)物具有如式VII所示的結(jié)構(gòu)(其中R'如上定義，并且Ala是丙氨酸殘基)：

式VII

本發(fā)明的優(yōu)選偶聯(lián)物包括：

Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素：

N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素：

N^α-乙酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素；

N^α-丁酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素；

N^α-己酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素；

N^α-[-(2-酰胺-2-氧代乙氧基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素；以及

N^α-[-((2-酰胺-2-氧代乙氧基)(甲基)氨基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素；Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素；

N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素；

N^α-乙酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素；

N^α-丁酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素；以及

N^α-己酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素；

N^α-[-(2-酰胺-2-氧代乙氧基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素；以及

N^α-[-((2-酰胺-2-氧代乙氧基)(甲基)氨基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素；其中PABC是對(duì)-氨基芐基氨基甲?；宇^部分。

本發(fā)明的其他優(yōu)選偶聯(lián)物包括：

Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿；

N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿；

N^α-[-(2-酰胺-2-氧代乙氧基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿；以及

N^α-[-((2-酰胺-2-氧代乙氧基)(甲基)氨基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿

其中PABC是對(duì)-氨基芐基碳酸酯部分。

優(yōu)選的二聚偶聯(lián)物包括：

N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁴-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素–琥琥珀酰胺：

N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁵-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素-雙(O^α)-乙酰胺：

N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁵-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素-雙(N^α-甲基)-乙酰胺；

N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁴-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿–琥珀酰胺；

N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁵-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿-雙(O^α)-乙酰胺；以及

N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁵-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿-雙(N^α-甲基)-乙酰胺。

其中PABC是對(duì)-氨基芐基氨基甲?；?qū)?氨基芐基碳酸酯接頭部分。

肽-藥物偶聯(lián)物的制備

通常，式I和式II的肽-藥物偶聯(lián)物可使用可用材料和常規(guī)有機(jī)合成技術(shù)來(lái)制備。例如，所述類型的細(xì)胞毒性藥物是可商購(gòu)獲得的，并且它們的合成描述于科學(xué)文獻(xiàn)中。

通常，本發(fā)明的肽-藥物偶聯(lián)物可通過(guò)將藥物部分通過(guò)自切除接頭共價(jià)附接到肽序列來(lái)構(gòu)建。下面所示的制備的具體合成路線是可使用的那些的示例。

合成方案1示出用于生產(chǎn)肽-絲裂霉素偶聯(lián)物的合成路線：

合成方案1

合成方案2示出用于生產(chǎn)肽-阿霉素偶聯(lián)物的合成路線：

合成方案2

合成方案3示出用于生產(chǎn)肽-喜樹堿偶聯(lián)物的合成路線：

合成方案3

合成方案4示出用于生產(chǎn)阿霉素-肽-絲裂霉素偶聯(lián)物(二聚偶聯(lián)物)的合成路線：

合成方案4

合成方案5示出用于生產(chǎn)喜樹堿-肽-絲裂霉素偶聯(lián)物(二聚偶聯(lián)物)的合成路線：

合成方案5

通常對(duì)于所述的合成反應(yīng)：

a)采用標(biāo)準(zhǔn)肽合成方法用于Fmoc和三苯甲基遷放和肽偶聯(lián)；

b)通過(guò)在有機(jī)/水性溶劑混合物中使用EEDQ作為偶聯(lián)試劑，通過(guò)使N^α-Fmoc-Asn或三苯甲基保護(hù)的N^α-Fmoc-Asn與對(duì)-氨基芐醇反應(yīng)來(lái)使自切除接頭附接到氨基酸；

c)可以通過(guò)使對(duì)-硝基苯氯甲酸酯與N^α-Fmoc-Asn-PAB-OH或N^α-Fmoc-Ala-Ala–N-三苯甲基-Asn-PAB-OH反應(yīng)來(lái)獲得對(duì)-氨基芐醇的活化碳酸酯；

d)在HOBT存在下在DMF中，通過(guò)與N^α-Fmoc-Asn-PABC-PNP或N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-PNP的相應(yīng)活化碳酸酯反應(yīng)來(lái)獲得絲裂霉素和阿霉素的肽藥物偶聯(lián)物；

e)對(duì)于喜樹堿偶聯(lián)物的合成，使喜樹堿與三光氣反應(yīng)以原位提供喜樹堿氯甲酸酯，然后與N^α-Fmoc-Asn-PAB-OH偶聯(lián)以獲得相應(yīng)的N^α-Fmoc-Asn-PABC-喜樹堿；

f)通過(guò)肽偶聯(lián)方法與各種酸酐、酰氯或羧酸?；瘉?lái)獲得最終的肽-藥物偶聯(lián)物。

合成的最終偶聯(lián)物可以通過(guò)各種方法來(lái)純化，包括二氧化硅柱色譜、HPLC、離子交換色譜、酸/堿沉淀和結(jié)晶。

最終的偶聯(lián)物可通過(guò)¹H-NMR、¹³C-NMR、MS、LC/MS、UV/VIS和/或IR來(lái)表征。

許多所公開的偶聯(lián)物可以作為鹽酸鹽或其他鹽存在。藥物化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，鹽的選擇不是關(guān)鍵的，并且其他藥學(xué)上可接受的鹽可以通過(guò)熟知的方法制備且可以用于制備藥物組合物。參見例如，Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use.(P.Heinrich Stahl和Camille G.Wermuth編輯)International Union of Pure and Applied Chemistry,Wiley-VCH 2002 and L.D.Bighley,S.M.Berge,D.C.Monkhouse,in"Encyclopedia of Pharmaceutical Technology'.編輯J.Swarbrick和J.C.Boylan,第13卷,Marcel Dekker公司,New York,Basel,Hong Kong 1995,第453-499頁(yè)。

此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，不僅可以產(chǎn)生和使用多種鹽，而且可以從本文公開的偶聯(lián)物產(chǎn)生水合物、溶劑合物和多晶型物。此外，也可以容易地產(chǎn)生各種同位素取代的變體(通過(guò)例如，氘代替氫、¹³C代替碳、¹⁵N代替氮)。此類衍生物被考慮在本公開的范圍內(nèi)。

為了制備本發(fā)明的藥物組合物，將一種或多種偶聯(lián)物與至少一種藥學(xué)上可接受的載體相結(jié)合。“藥學(xué)上可接受的載體”是指適用于藥理學(xué)有效物質(zhì)的特定施用途徑的生物相容性化合物。它們包括穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑和乳化劑、用于改變滲透壓的鹽、包封劑、緩沖劑以及皮膚滲透促進(jìn)劑。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例描述于Remington的藥物科學(xué)(Alfonso R.Gennaro編輯,第18版,1990)中。一種載體或多種載體的特定選擇取決于預(yù)期的具體治療。用于藥物組合物及其組分的各種制劑描述于美國(guó)公開專利申請(qǐng)2014/0057844中，其公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。

偶聯(lián)物中細(xì)胞毒性藥物部分的選擇由待治療的癌癥的類型來(lái)指導(dǎo)。對(duì)于特定類型的癌癥或腫瘤的治療，細(xì)胞毒性藥物部分應(yīng)基于有效治療此類型癌癥的細(xì)胞毒性藥物。例如，基于絲裂霉素的藥物偶聯(lián)物可用于根據(jù)本領(lǐng)域目前已知和推薦的絲裂霉素施用方案或由其指導(dǎo)來(lái)治療癌癥。

本發(fā)明的偶聯(lián)物、組合物和方法可用于治療不同類型的癌癥，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、腸癌、皮膚癌以及前列腺癌。

施用途徑包括注射、口服、經(jīng)頰施用、腸胃外施用、吸入以及直腸施用。

待施用的偶聯(lián)物的劑量以及施用的具體途徑和方案取決于待治療的癌癥類型和特定癌癥病狀的情況，但可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

本發(fā)明的偶聯(lián)物可彼此組合使用并且與其他化療劑或治療組合使用。例如，使用本發(fā)明偶聯(lián)物的治療可與放射治療組合使用。

下面的實(shí)施例說(shuō)明了本發(fā)明的某些實(shí)施方案，并且應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而不是限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

生物活性

在體外和體內(nèi)兩種系統(tǒng)中測(cè)試本發(fā)明的代表性肽-藥物偶聯(lián)物以確定其生物活性。在這些測(cè)試中，通過(guò)測(cè)量偶聯(lián)物針對(duì)人癌癥來(lái)源的細(xì)胞的細(xì)胞毒性來(lái)確定細(xì)胞毒性藥物的偶聯(lián)物的效力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以使用表達(dá)期望的腫瘤相關(guān)蛋白酶(裂解本發(fā)明的偶聯(lián)物以釋放為活性形式的藥物的蛋白酶)的任何腫瘤細(xì)胞系代替在下面分析中使用的特定腫瘤細(xì)胞系。下面描述使用的代表性測(cè)試和獲得的結(jié)果。

測(cè)試I

人血漿穩(wěn)定性

用人血漿將20μL在DMSO儲(chǔ)備溶液中的500μM肽-藥物偶聯(lián)物N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[本文的化合物8]稀釋至1mL(最終濃度：10μM，2％DMSO)，并且將混合物在37℃下孵育。在0、0.25、0.5、1、2、4、6小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)移除100μL等分試樣，并且用含有甲苯磺丁脲(200ng/mL)作為內(nèi)標(biāo)的400μL冷乙腈稀釋。將樣品在14,000rpm下離心4分鐘。用300μL 0.1％甲酸HPLC水將100μL上述上清液稀釋，并且取10μL用于LC/MS/MS分析(柱：C-18；流動(dòng)相：0.1％甲酸的水溶液/0.1％甲酸的乙腈溶液；離子躍遷：Q1離子(m/z)＝840.5，Q2離子(m/z)＝462.2)。如圖1所示，肽-藥物偶聯(lián)物在人血漿中相對(duì)穩(wěn)定，其中半衰期大于15小時(shí)(T1/2>15h)。檢測(cè)到少于2％的游離藥物絲裂霉素。

測(cè)試II

體外細(xì)胞毒性測(cè)定

使用胰蛋白酶-EDTA收獲人癌細(xì)胞的單層培養(yǎng)物，并且將細(xì)胞計(jì)數(shù)并且在含有10％FBS的RPMI-1640或DMEM中重懸浮至1x10⁵/mL。將細(xì)胞(0.1mL/孔)添加到96孔微量滴定板的每個(gè)孔中，并且在37℃下，在5％CO₂的潮濕氣氛中孵育過(guò)夜。將培養(yǎng)基從板上移除，并且將絲裂霉素或偶聯(lián)物在培養(yǎng)基中的系列稀釋液(最終DMSO濃度<0.1％)添加到孔中。一式三份進(jìn)行所有稀釋。將藥物處理的細(xì)胞在37℃下，在5％CO₂的潮濕氣氛中再培養(yǎng)72小時(shí)。向每個(gè)孔中添加50μL冷TCA(50％，重量/體積)，并且將板在4℃下孵育1小時(shí)。用緩慢流動(dòng)的自來(lái)水將板洗滌三次，并且在室溫下干燥。向每個(gè)孔中添加50μL磺酰羅丹明B溶液(0.4％，重量/體積)，并且將板在室溫下放置1小時(shí)。用乙酸溶液(1％，體積/體積)沖洗板以去除未結(jié)合的染料并且在室溫下干燥。向每個(gè)孔中添加200μL的10mM Tris堿溶液，并且將板在回轉(zhuǎn)振蕩器上搖動(dòng)15分鐘以溶解蛋白結(jié)合染料。在微板讀取器中測(cè)量510nm處的孔光密度，并且通過(guò)GraphPad從每個(gè)實(shí)驗(yàn)中三次重復(fù)的三個(gè)分離實(shí)驗(yàn)來(lái)計(jì)算IC₅₀，并且表示為平均值(表1)。

表1 IC₅₀(μM，n＝3)

HCT116和HepG2人癌細(xì)胞系測(cè)定顯示，與母體藥物絲裂霉素相比，肽-藥物偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性降低了76至17倍，這取決于不同的腫瘤細(xì)胞系。在缺氧和酸性條件下，腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)豆莢蛋白在實(shí)體瘤的腫瘤微環(huán)境中過(guò)表達(dá)。然而，先前報(bào)道了細(xì)胞培養(yǎng)物中HCT116和HepG2兩種細(xì)胞系的豆莢蛋白表達(dá)的一定水平，其可導(dǎo)致如在此測(cè)定中觀察到的肽-藥物偶聯(lián)物的殘留活性。

測(cè)試III

Balb/c小鼠中的體內(nèi)最大耐受劑量(MTD)

在Balb/c小鼠中分別評(píng)估絲裂霉素及其肽-藥物偶聯(lián)物N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[化合物8]作為單一藥劑的耐受性。在治療后不同時(shí)間點(diǎn)處的不同組的體重結(jié)果如圖2所示。

在10mg/kg，每周一次絲裂霉素的劑量組中，觀察到動(dòng)物死亡。在5mg/kg組中，小鼠顯示立毛和遲鈍的行為。在5mg/kg絲裂霉素組中觀察到體重減輕(>15％)。同時(shí)，在25、50和100mg/kg，每周一次，共三次注射持續(xù)24天的劑量組中，對(duì)于肽-藥物偶聯(lián)物N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[8]，沒(méi)有觀察到異常的外觀和體重(<10％)。鼠毒性研究顯示，肽-藥物偶聯(lián)物N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[8]在體內(nèi)比母體藥物絲裂霉素毒性小得多。與母體藥物絲裂霉素相比，肽-藥物偶聯(lián)物的小鼠最大耐受劑量(MTD)增加至少20倍。

測(cè)試IV

體內(nèi)抗腫瘤活性

在Balb/c小鼠的皮下CT-26同系結(jié)腸癌模型上評(píng)估肽-藥物偶聯(lián)物N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[8]的殺腫瘤效果。每只小鼠在右側(cè)腹部皮下接種在0.1mL PBS中的CT-26腫瘤細(xì)胞(5x10⁵)。當(dāng)平均腫瘤尺寸達(dá)到大約180mm³(約10天后)時(shí)，通過(guò)靜脈內(nèi)施用：載體(2％DMA和98％的40％2HP-β-CD)、絲裂霉素(2mg/kg；5mg/kg，QW)和偶聯(lián)物N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[8](25mg/kg；50mg/kg，QW)持續(xù)三周，每只小鼠共注射三次來(lái)治療CT-26腫瘤小鼠。CT-26模型的腫瘤生長(zhǎng)曲線如圖3所示。

如先前報(bào)道的，即使CT-26細(xì)胞在體外具有腫瘤相關(guān)蛋白酶豆莢蛋白的弱表達(dá)(week expression)，其也在體內(nèi)在CT-26實(shí)體瘤微環(huán)境中的活的內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表面上的TME中大量表達(dá)，這是因?yàn)槎骨v蛋白表達(dá)是在缺氧和應(yīng)激條件下被誘導(dǎo)的。豆莢蛋白特異性活化偶聯(lián)物N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[8]在Balb/c小鼠的皮下CT-26合成結(jié)腸癌模型上表現(xiàn)出強(qiáng)的抗腫瘤功效，如圖3所示。在比其MTD低得多的50mg/kg劑量下，與未治療的對(duì)照相比，偶聯(lián)物顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)(T/C＝36.4％，p<0.01)。雖然在其MTD劑量(5mg/kg)處，母體藥物絲裂霉素表現(xiàn)出更弱的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果(T/C＝50.4％)。因此，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的肽-絲裂霉素偶聯(lián)物對(duì)宿主產(chǎn)生具有比母體藥物絲裂霉素更大效力和更低毒性的抗腫瘤活性。

合成實(shí)施例

實(shí)施例1

制備N^α-Fmoc-Ala-Ala[1]

將在CH₂Cl₂(50mL)中的N^α-Fmoc-Ala(1.58g，5.0毫摩爾)、N-羥基琥珀酰亞胺(0.63g，5.5毫摩爾)和DCC(1.03g，5.0毫摩爾)的溶液在5℃下攪拌6小時(shí)。將DCU濾出，并且將濾液濃縮。將殘余物再溶解于THF(50mL)中并且在冰箱(4℃)中保持過(guò)夜。濾出更多的DCU，并且將THF溶液添加到在25％THF/H₂O(80mL)中的丙氨酸(0.99g，7.5毫摩爾)和NaHCO₃(1.68g，20毫摩爾)的溶液中。將反應(yīng)混合物在25℃下劇烈攪拌5小時(shí)。通過(guò)濃縮去除THF，并且用濃HCl將水性懸浮液調(diào)節(jié)至pH4。將水性懸浮液在25℃下再攪拌3小時(shí)，并且通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，用去鹽水充分沖洗，并且在真空中用KOH干燥，得到白色固體產(chǎn)物(1.77g，83.7％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝383

實(shí)施例2

制備N^α-Fmoc-Asn-PAB-OH[2]

將在THF/H2O(100/20mL)中的N^α-Fmoc-Asn(1.77g，5.0毫摩爾)、對(duì)-氨基芐醇(0.86g，7.0毫摩爾)和EEDQ(1.48g，6毫摩爾)的溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。添加另外量的EEDQ(0.61g，2.5毫摩爾)，并且再攪拌24小時(shí)。通過(guò)濃縮去除THF，并且用NaOH/NaHCO₃水溶液(2/8g，200mL)稀釋殘余物懸浮液，并且攪拌3小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，用水沖洗并且再懸浮于10％檸檬酸(150mL)中。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，用10％檸檬酸隨后用去鹽水沖洗，并且在真空中干燥。將上面獲得的固體在乙酸乙酯(100mL)中研磨。通過(guò)過(guò)濾收集固體并且在真空中干燥，得到灰白色產(chǎn)物(0.95g，40％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝460

實(shí)施例3

制備N^α-Fmoc-Asn-PABC-PNP[3]

在室溫下，用對(duì)-硝基苯氯甲酸酯(0.4g，2.0毫摩爾)和吡啶(0.15g，2.0毫摩爾)處理在干燥THF/DMF(50/5mL)中的N^α-Fmoc-Asn-PAB-OH[2](0.75g，1.6毫摩爾)。16小時(shí)后，添加另外量的對(duì)-硝基苯氯甲酸酯(0.2g，1.0毫摩爾)，并且將反應(yīng)溶液再攪拌6小時(shí)。用乙酸乙酯(250mL)稀釋上述溶液，并且用5％檸檬酸(2x100mL)隨后用鹽水洗滌，用Na₂SO₄干燥，并且蒸發(fā)至干燥。將殘余物在50％EA/己烷中研磨，并且通過(guò)過(guò)濾收集固體，得到灰黃色(off-yellow)產(chǎn)物(0.8g，81％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝625

實(shí)施例4

制備N^α-Fmoc-Asn-PABC-絲裂霉素[4]

在室溫下，用HOBT(675mg，5.0毫摩爾)和DIEA(650mg，5.0毫摩爾)將在干燥DMF(15mL)中的N^α-Fmoc-Asn-PABC-PNP[3](624mg，1.0毫摩爾)和絲裂霉素(400mg，1.2毫摩爾)處理4小時(shí)。用乙酸乙酯(150mL)稀釋反應(yīng)混合物，并且用NaOH/NaHCO₃(1/4g，200mL)隨后用鹽水洗滌三次。用Na₂SO₄干燥有機(jī)層并且在減壓下濃縮至干燥。將殘余物在50％乙酸乙酯/己烷(50mL)中研磨，并且通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯/己烷沖洗并且在真空中干燥，得到紫色產(chǎn)物(635mg，76.3％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝820

實(shí)施例5

制備Asn-PABC-絲裂霉素[5]

在室溫下用20％嗎啉/NMP(15mL)處理N^α-Fmoc-Asn-PABC-絲裂霉素[4](624mg，0.76毫摩爾)。30分鐘后，添加50％乙酸乙酯/己烷(100mL)，并且去除上清液。將上述過(guò)程重復(fù)兩次。將殘余物再溶解于甲醇(25mL)中，并且將溶劑在減壓下蒸發(fā)至干燥。將殘余物在50％乙酸乙酯/己烷(100mL)中研磨并且在室溫下攪拌過(guò)夜。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯/己烷沖洗并且在真空中干燥，得到紫色產(chǎn)物(440mg，95.6％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝598

實(shí)施例6

制備N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[6]

在室溫下用PyBop(390mg，0.75毫摩爾)和DIEA(585mg，4.5毫摩爾)處理在NMP(15mL)中的Asn-PABC-絲裂霉素[5](440mg，0.73毫摩爾)和N^α-Fmoc-Ala-Ala[1](286mg，0.75毫摩爾)。1小時(shí)后，用乙酸乙酯(200mL)稀釋反應(yīng)混合物。用5％檸檬酸(3x100mL)、鹽水洗滌有機(jī)溶液，并且用Na₂SO₄干燥。在減壓下蒸發(fā)溶劑，并且將殘余物在50％乙酸乙酯/己烷(100mL)中研磨，并且在室溫下攪拌過(guò)夜。通過(guò)過(guò)濾收集固體，并且再懸浮于乙酸乙酯(50mL)中并超聲處理。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯充分沖洗并且在真空中干燥，得到紫色產(chǎn)物(530mg，75.4％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝962

實(shí)施例7

制備Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[7]

在室溫下在20％嗎啉/NMP(10mL)中處理N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[6](481mg，0.5毫摩爾)。30分鐘后，添加50％乙酸乙酯/己烷(150mL)，并且攪拌1小時(shí)。去除上清液，并且將殘余物在CH₂Cl₂(50mL)中研磨。通過(guò)過(guò)濾收集固體，并且再溶解于甲醇(20mL)中。在減壓下蒸發(fā)溶劑，并且將殘余物在乙酸乙酯中研磨。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯充分沖洗并且在真空中干燥，得到紫色產(chǎn)物(277mg，75％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝740

實(shí)施例8

制備N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[8]

在室溫下，用琥珀酸酐(50mg，0.5毫摩爾)和DIEA(130mg，1.0毫摩爾)處理在DMA/CH₂Cl₂(2/6mL)中的Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[7](260mg，0.35毫摩爾)。將反應(yīng)混合物攪拌過(guò)夜。向上述反應(yīng)混合物中添加乙醚(100mL)并且攪拌30分鐘。去除上清液，并且將所述過(guò)程重復(fù)兩次。將殘余物在2％HOAc/乙酸乙酯(50mL)中研磨，并且通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯充分沖洗并且在真空中干燥，得到紫色產(chǎn)物(265mg，90％產(chǎn)率)。

LC/MC：(M-H)^–＝838

實(shí)施例9

制備N^α-乙酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[9]

在室溫下，用乙酸酐(10mg，0.1毫摩爾)和DIEA(13mg，0.1毫摩爾)處理在DMA/CH₂Cl₂(1/3mL)中的Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[7](37mg，0.05毫摩爾)。30分鐘后，添加乙醚(50mL)，并且攪拌60分鐘。通過(guò)過(guò)濾收集軟固體，用乙醚沖洗并且再溶解于甲醇(5mL)中。在減壓下去除溶劑，并且將殘余物在50％乙酸乙酯/己烷(10mL)中研磨，并通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯/己烷充分沖洗，在真空中干燥，得到紫色產(chǎn)物(35mg，90％產(chǎn)率)。

LC/MC：(MH)⁺＝780；(M+Na)⁺＝805

實(shí)施例10

制備N^α-丁酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[10]

在室溫下，用丁酰氯(6.3mg，0.06毫摩爾)和DIEA(13mg，0.1毫摩爾)處理在DMA/CH₂Cl₂(1/3mL)中的Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[7](37mg，0.05毫摩爾)。30分鐘后，添加乙醚(50mL)，并且攪拌60分鐘。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙醚沖洗并且再溶解于甲醇(5mL)中。在減壓下去除溶劑，并且將殘余物在乙酸乙酯(10mL)中研磨。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯充分沖洗并且在真空中干燥，得到紫色產(chǎn)物(27mg，67％產(chǎn)率)。

LC/MC：(MH)⁺＝808；(M+Na)⁺＝833。

實(shí)施例11

制備N^α-己酰胺-Ala-Ala-Asn-PABC絲裂霉素[11]

在室溫下，用己酰氯(9.0mg，0.06毫摩爾)和DIEA(13mg，0.1毫摩爾)處理在DMA/CH₂Cl₂(1/3mL)中的Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[7](37mg，0.05毫摩爾)。30分鐘后，添加乙醚(50mL)，并且攪拌60分鐘。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙醚沖洗并且再溶解于甲醇(5mL)中。在減壓下去除溶劑，并且將殘余物在50％乙酸乙酯/己烷(10mL)中研磨。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯充分沖洗并且在真空中干燥，得到紫色產(chǎn)物(27mg，67％產(chǎn)率)。

LC/MC：(MH)⁺＝836；(M+Na)⁺＝860

實(shí)施例12

制備N^α-[-(2-酰胺-2-氧代乙氧基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[12]

在室溫下用1,4-二噁烷-2,6-二酮(70mg，0.6毫摩爾)和DIEA(60mg，0.5毫摩爾)將在THF/DMF(4/0.5mL)中的Ala-Ala-Asn-PANC-絲裂霉素[7](295mg，0.4毫摩爾)處理2小時(shí)。緩慢添加乙醚(10mL)，并且將混合物攪拌30分鐘。去除溶劑，并且將殘余物研磨并在乙酸乙酯中的1％乙酸中超聲處理。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯充分沖洗并且在真空中干燥，得到暗色產(chǎn)物(276mg，80％產(chǎn)率)。

LC/MC：(M-H)^-＝854

實(shí)施例13

制備N^α-[-((2-酰胺-2-氧代乙氧基)(甲基)氨基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[13]

在室溫下用4-甲基嗎啉-2,6-二酮(77mg，0.6毫摩爾)和DIEA(130mg，1.0毫摩爾)將在THF/DMF(4/0.5mL)中的Ala-Ala-Asn-PANC-絲裂霉素[7](295mg，0.4毫摩爾)處理2小時(shí)。緩慢添加乙醚(10mL)，并且將混合物攪拌30分鐘。去除溶劑，并且將殘余物研磨并在乙酸乙酯中的1％乙酸中超聲處理。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙酸乙酯充分沖洗并且在真空中干燥，得到暗色產(chǎn)物(339mg，97％產(chǎn)率)。

LC/MS：(M-H)^-＝867

實(shí)施例14

制備N^α-Fmoc-Asn(N-三苯甲基)-PAB-OH[14]

將在THF(50mL)中的N^α-Fmoc-Asn(N-三苯甲基)((1.49g，2.5毫摩爾)、對(duì)-氨基芐醇(0.37g，3.0毫摩爾)和EEDQ(0.74g，3毫摩爾)的溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。添加另外量的EEDQ(0.25g，1.0毫摩爾)，并且再攪拌6小時(shí)。用乙酸乙酯(300mL)稀釋反應(yīng)溶液，用0.1N HCl洗滌三次，并且用Na₂SO₄干燥。通過(guò)短硅膠塞過(guò)濾乙酸鹽溶液，用乙酸乙酯沖洗并且濃縮至干燥。將殘余物在乙醚中研磨，過(guò)濾，用乙醚沖洗并且在真空中干燥，得到白色固體(1.65g，93％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝702

實(shí)施例15

制備Asn(N-三苯甲基)-PAB-OH[15]

向在CH₂Cl₂(50mL)中的N^α-Fmoc-Asn(N-三苯甲基)-PAB-OH[14](1.6g，2.28毫摩爾)的溶液中添加DBU(1mL)。將反應(yīng)溶液攪拌15分鐘。用CH₂Cl₂(200mL)稀釋反應(yīng)溶液，用鹽水洗滌兩次，并且用Na₂SO₄干燥，過(guò)濾并且濃縮至干燥。將殘余物在己烷/乙醚(1/1)中研磨。通過(guò)過(guò)濾收集固體，用乙醚沖洗并且在真空中干燥，得到白色產(chǎn)物(1.1g，100％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝480

實(shí)施例16

制備N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn(N-三苯甲基)-PAB-OH[16]

將在NMP(20mL)中的Asn(N-三苯甲基)-PAB-OH[15](0.72g，1.5毫摩爾)、N^α-Fmoc-Ala-Ala[1](0.57g，1.5毫摩爾)、PyBop(0.94g，1.8毫摩爾)和DIEA(1.17g，9.0毫摩爾)的溶液在室溫下攪拌1小時(shí)。在冰-水溫度下向上述反應(yīng)中緩慢添加5％檸檬酸水溶液(150mL)，并且攪拌2小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，并且用5％檸檬酸溶液隨后用去鹽水沖洗。將固體再懸浮于NaHCO₃水溶液中，研磨，過(guò)濾，用去鹽水沖洗并且在真空中用KOH干燥，得到白色產(chǎn)物(1.1g，87％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝845

實(shí)施例17

制備N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn(N-三苯甲基)-PABC-PNP[17]

將在干燥THF中的N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn(N-三苯甲基)-PAB-OH[16](1.1g，1.3毫摩爾)、對(duì)-硝基苯氯甲酸酯(0.31g，1.6毫摩爾)和吡啶(0.13g，1.6毫摩爾)的溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。添加另外量的對(duì)-硝基苯氯甲酸酯(0.2g，1.0毫摩爾)和吡啶(0.08g，1.0毫摩爾)，并且再攪拌4小時(shí)。用乙酸乙酯(300mL)稀釋上述溶液，并且用5％檸檬酸溶液(3x100mL)隨后用鹽水洗滌，用Na₂SO₄干燥，過(guò)濾并且濃縮至干燥。將殘余物在乙醚中研磨，過(guò)濾，用乙醚沖洗并且在真空中干燥，得到灰白色產(chǎn)物(1.1g，83％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝1010

實(shí)施例18

制備N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-PNP[18]

將在TFA/CH₂Cl₂(6/24mL)中的N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn(N-三苯甲基)-PABC-PNP[17](1.0g，1毫摩爾)和TIPS(2.5mL)的溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。向上述反應(yīng)溶液中緩慢添加乙醚(150mL)并且將懸浮液攪拌1小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物并且用乙醚沖洗。將固體在乙酸乙酯中研磨，過(guò)濾，用乙酸乙酯沖洗并且在真空中干燥，得到灰白色產(chǎn)物(0.75g，97％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝767

實(shí)施例19

制備N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素[19]

將在干燥DMF(5mL)中的N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-PNP[18](383mg，0.5毫摩爾)、阿霉素鹽酸鹽(348mg，0.6毫摩爾)、HOB T(202mg，1.5毫摩爾)以及DIEA(325mg，2.5毫摩爾)的反應(yīng)溶液在暗處攪拌過(guò)夜。在冰-水溫度下向上述溶液中緩慢添加5％檸檬酸(100mL)，并且攪拌1小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，用5％檸檬酸隨后用去鹽水沖洗。將固體再懸浮于NaHCO₃水溶液中并且攪拌30分鐘。收集固體，用NaHCO₃溶液隨后用去鹽水充分沖洗。將固體再懸浮于異丙醇，10％甲醇/乙酸乙酯中，研磨，過(guò)濾并且在真空中干燥，得到暗紅色產(chǎn)物(550mg，94％產(chǎn)率)

LC/MS：MH)⁺＝1171

實(shí)施例20

制備Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素[20]

將在20％嗎啉/NMP(5mL)中的N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素[19](500mg，0.42毫摩爾)的溶液攪拌1小時(shí)。向上述反應(yīng)溶液中緩慢添加乙醚(50mL)并且將所得懸浮液攪拌30分鐘。倒出乙醚(重復(fù)三次)。將殘余物在乙酸乙酯，20％甲醇/乙酸乙酯中研磨。通過(guò)過(guò)濾收集固體并且在真空中干燥。將固體再懸浮于水中，超聲處理，過(guò)濾并且在真空中用KOH干燥，得到暗紅色產(chǎn)物(320mg，80％產(chǎn)率)。

LC/MC：(MH)⁺＝949

將用于制備實(shí)施例8、12和13的類似方法用于由化合物[20]來(lái)制備實(shí)施例21、22和23。

實(shí)施例21

N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素[21]

LC/MS：(MH)⁺＝1049

實(shí)施例22

N^α-[-(2-酰胺-2-氧代乙氧基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素[22]

LC/MS：(MH)⁺＝1065

實(shí)施例23

N^α-[-((2-酰胺-2-氧代乙氧基)(甲基)氨基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素[23]

LC/MS：(MH)⁺＝1078

實(shí)施例24

制備N^α-Fmoc-Asn-PABC-喜樹堿[24]

在冰水溫度下，在攪拌下向在干燥CH₂Cl₂(20mL)中的喜樹堿(348mg，1毫摩爾)和DAMP(366mg，3毫摩爾)的懸浮液中添加三光氣(100mg，0.33毫摩爾)。20分鐘后，將在干燥CH₂Cl₂(10mL)中的N^α-Fmoc-Asn-PAB-OH[2](459mg，1毫摩爾)的懸浮液添加到上述反應(yīng)混合物中并且在室溫下攪拌過(guò)夜。向所得反應(yīng)混合物中添加對(duì)-硝基苯氯甲酸酯(100mg，0.5毫摩爾)，然后添加另外量的DAMP(60mg，0.5毫摩爾)，并且將反應(yīng)混合物再攪拌4小時(shí)。濃縮后，用25％CH₂Cl₂/乙酸乙酯研磨所得殘余物，過(guò)濾，用25％CH₂Cl₂/乙酸乙酯沖洗并且在真空中干燥。將固體懸浮于NaHCO₃水溶液中，超聲處理，過(guò)濾，用NaHCO₃水溶液，隨后用5％檸檬酸、去鹽水充分沖洗，并且在真空中用KOH干燥，得到灰黃色產(chǎn)物(763mg，91％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝834

實(shí)施例25

制備Asn-PABC-喜樹堿[25]

將在2％DBU/CH₂Cl₂(15mL)中的N^α-Fmoc-Asn-PABC-喜樹堿[24](500mg，0.6毫摩爾)的溶液攪拌20分鐘。將乙醚(80mL)緩慢添加到上述反應(yīng)溶液中并且攪拌30分鐘。研磨沉淀物，通過(guò)過(guò)濾收集并且用乙醚充分沖洗。將固體在20％CH₂Cl₂/乙酸乙酯中再研磨，過(guò)濾并干燥。將固體再懸浮于NaHCO₃水溶液中，研磨，過(guò)濾，用去鹽水沖洗并且在真空中用KOH干燥，得到灰黃色產(chǎn)物(295mg，80％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝612

實(shí)施例26

制備N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿[26]

將在NMP(5mL)中的H₂N-Asn-PABC-喜樹堿[25](244mg，0.4毫摩爾)、N^α-Ala-Ala[1](190mg，0.5毫摩爾)、PyBop(260mg，0.5毫摩爾)以及DIEA(325mg，2.5毫摩爾)的溶液攪拌1小時(shí)。向上述反應(yīng)溶液中緩慢添加5％檸檬酸(50mL)并且將所得混合物攪拌30分鐘。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀物，用5％檸檬酸隨后用去鹽水沖洗，并且在真空中用KOH干燥。將固體在15％CH₂Cl₂/乙酸乙酯中研磨，超聲處理，過(guò)濾并且干燥，得到灰色產(chǎn)物(274mg，70％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝976

實(shí)施例27

制備Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿[27]

將在2％DBU/CH₂Cl₂(10mL)中的N^α-Fmoc-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿[26](487mg，0.5毫摩爾)的溶液攪拌10分鐘。向上述反應(yīng)溶液中緩慢添加乙醚(50mL)并且攪拌30分鐘。收集沉淀物，用乙醚沖洗。將固體懸浮于20％CH₂Cl₂/乙酸乙酯中，研磨，過(guò)濾，用乙酸乙酯沖洗并且干燥，得到灰色產(chǎn)物(290mg，77％產(chǎn)率)。

LC/MS：(MH)⁺＝754

將用于制備實(shí)施例8、12和13的類似方法用于由化合物[27]來(lái)制備實(shí)施例28、29和30。

實(shí)施例28

N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿[28]

LC/MS：(MH)⁺＝854

實(shí)施例29

N^α-[-(2-酰胺-2-氧代乙氧基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿[29]

LC/MS：(MH)⁺＝870

實(shí)施例30

N^α-[-((2-酰胺-2-氧代乙氧基)(甲基)氨基)乙酸]-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿[30]

LC/MS：(MH)⁺＝883

實(shí)施例31

制備N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁴-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素-琥珀酰胺[31]

將在NMP(2mL)中的N^α-琥珀酰胺酸-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素[8](85mg，0.1毫摩爾)、Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素[20](104mg，0.11毫摩爾)、PyBop(62mg，0.12毫摩爾)以及DIEA(78mg，0.6毫摩爾)的溶液攪拌1小時(shí)。添加乙醚(20mL)，并且將所得混合物攪拌并超聲處理。倒出乙醚(重復(fù)兩次)，并且將殘余物在甲醇中研磨，過(guò)濾并且干燥，得到暗色產(chǎn)物(100mg，57％產(chǎn)率)

LC/MS：(MH)⁺＝1770

實(shí)施例32

制備N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁵-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素-雙(O^α)-乙酰胺[32]

將用于制備實(shí)施例31的類似方法用于由化合物[20]和化合物[12]來(lái)制備實(shí)施例32。

LC/MS：(MH)⁺＝1786

實(shí)施例33

制備N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁵-Ala-Ala-Asn-PABC-阿霉素-雙(N^α-甲基)-乙酰胺[33]

將用于制備實(shí)施例31的類似方法用于由化合物[20]和化合物[13]來(lái)制備實(shí)施例33。

LC/MS：(MH)⁺＝1799

實(shí)施例34

制備N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁴-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿-琥珀酰胺[34]

將用于制備實(shí)施例31的類似方法用于由化合物[27]和化合物[8]來(lái)制備實(shí)施例34。

LC/MS：(MH)⁺＝1575

實(shí)施例35

制備N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁵-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿-雙(O^α)-乙酰胺[35]

將用于制備實(shí)施例31的類似方法用于由化合物[27]和化合物[12]來(lái)制備實(shí)施例34。

LC/MS：(MH)⁺＝1591

實(shí)施例36

制備N¹-Ala-Ala-Asn-PABC-絲裂霉素、N⁵-Ala-Ala-Asn-PABC-喜樹堿-雙(N^α-甲基)-乙酰胺[36]

將用于制備實(shí)施例31的類似方法用于由化合物[27]和化合物[13]來(lái)制備實(shí)施例34。

LC/MS：(MH)⁺＝1604

在實(shí)施例中使用的縮寫：

DCC＝二環(huán)己基碳二亞胺

DCM＝二氯甲烷

DCU＝二環(huán)己基脲

DIEA＝二異丙基乙胺

DMA＝二甲基乙酰胺

DMEM＝Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基

DMF＝N,N-二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲基亞砜

EDC＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺

EDTA＝N,N',N",N"',N""-乙二胺四乙酸

FBS＝胎牛血清

Fmon＝芴基甲氧基氨基甲?；?/p>

HATU＝1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-3-氧化物六氟磷酸鹽

HOBT＝N-羥基苯并三唑

HPLC＝高壓液相色譜

IR＝紅外光譜

LC/MS＝液相色譜/質(zhì)譜

MS＝質(zhì)譜

MTD＝最大耐受劑量

NMP＝N-甲基吡咯烷酮

NMR＝核磁共振

PABC＝對(duì)-氨基芐基氨基甲?；?/p>

PBS＝磷酸鹽緩沖鹽水

Py＝吡啶

QW＝每周

TCA＝三氯乙酸

Tr＝三苯甲基，三苯基甲基

UV/VIS＝紫外/可見光譜