本發(fā)明涉及特定的二烷基甘氨酸和三烷基甘氨酸賦形劑用于增加流感抗原的免疫原性的用途，以及涉及用于增加流感抗原的免疫原性的方法，涉及使用該方法可獲得的疫苗組合物，以及涉及該疫苗組合物在患者的疫苗接種中的用途。

背景技術(shù)：

流感病毒是正黏病毒科(Orthomyxoviridae family)的成員。存在三種流感病毒的亞型，命名為感染人類的A、B、和C。

流感的季節(jié)性流行可以快速傳遍世界各地并在醫(yī)院和其它醫(yī)療保健成本以及損失的生產(chǎn)力方面造成顯著的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織估計(jì)，在每年的流感流行中，存在三至五百萬的嚴(yán)重疾病的病例以及每年在世界各地大約250,000至500,000例死亡。

流感大流行會(huì)在具有高致病性和抗原新穎性的種群中出現(xiàn)新的流感病毒株時(shí)發(fā)生。在一年中，全球大流行可以折磨世界人口的20％至40％。例如1918-19年的大流行在世界范圍內(nèi)影響了2億人，致死3000萬以上。雖然，從那之后，醫(yī)療保健已顯著改善，開發(fā)了疫苗和抗病毒治療，但估計(jì)現(xiàn)今的大流行將導(dǎo)致全球二到七百萬的死亡。

在流感大流行將發(fā)生的情況下，一個(gè)可能出現(xiàn)的問題是，可能難以在所需時(shí)間內(nèi)制造需要用于疫苗的足夠量的流感抗原。另一個(gè)可能出現(xiàn)的問題是，流感疫苗可以需要數(shù)個(gè)星期來賦予免疫性，其可能不足夠快以防止或減少高度感染菌株的傳播。

因此存在對于具有增加的免疫原性(其可以比現(xiàn)有抗原更小量使用和/或更快速地賦予免疫性)的流感抗原的需要。

WO 2011/121301、WO 2011/121306和WO 2013/050780涉及特定賦形劑，包括二烷基甘氨酸和三烷基甘氨酸如二甲基甘氨酸(DMG)，用于穩(wěn)定病毒顆粒和/或多肽的用途。WO 2011/121305涉及類似的賦形劑用于在冷凍或干燥過程中穩(wěn)定鋁鹽佐劑的用途。這些參考文獻(xiàn)均沒有涉及增加流感抗原的免疫原性。

Reap等人的Journal of Laboratory and Clinical Medicine(1990),115(4),481-6描述了在兔模型中二甲基甘氨酸(DMG)的免疫調(diào)節(jié)能力。在用流感抗原接種之前和之后，兔被強(qiáng)迫喂食DMG。Reap等人并沒有描述在給予兔之前在DMG的存在下冷凍、冷凍干燥或加熱流感抗原。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明出乎意料的發(fā)現(xiàn)是，可以在二烷基甘氨酸和三烷基甘氨酸如二甲基甘氨酸(DMG)的存在下，通過冷凍、冷凍干燥或加熱流感抗原來增加流感抗原的免疫原性。相比于未修飾的流感抗原，得到的修飾的流感抗原具有增加的免疫原性。相比于已與二烷基甘氨酸/三烷基甘氨酸混合但沒有經(jīng)歷冷凍、冷凍干燥或加熱的流感抗原，得到的修飾的流感抗原也具有增加的免疫原性。

存在相關(guān)于修飾的流感抗原的增加的免疫原性的兩個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)。

首先，修飾的流感抗原可以使用比未修飾的流感抗原低得多的劑量來在患者中激發(fā)(illicit)相同的免疫應(yīng)答(immune response)。這種“抗原節(jié)約(antigen sparing)”的性能是非常有利的，特別是在其中數(shù)百萬患者需要接種疫苗的大流行情況下。

第二，修飾的流感抗原能夠比未修飾的流感抗原更快速地賦予患者免疫性。免疫性的更快起效也是非常有利的，特別是在其中重要的是試圖停止大流行的傳播的大流行情況下。

因此，本發(fā)明提供了賦形劑用于增加流感抗原的免疫原性的用途，該賦形劑是化學(xué)式(I)的化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽或酯：

其中：

R₁表示氫或C_1-6烷基；

R₂表示C_1-6烷基；并且

R₃表示C_1-6烷基，

該用途包括(a)冷凍，(b)熱處理，和/或(c)冷凍干燥包含流感抗原和賦形劑的水性組合物。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于增加流感抗原的免疫原性的方法，所述方法包括(a)冷凍、(b)熱處理、和/或(c)冷凍干燥包含流感抗原和賦形劑的水性組合物，該賦形劑是化學(xué)式(I)的化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽或酯：

其中：

R₁表示氫或C_1-6烷基；

R₂表示C_1-6烷基；并且

R₃表示C_1-6烷基。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了可以通過所述方法可獲得的疫苗組合物。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述疫苗組合物，用于在人或動(dòng)物患者中預(yù)防流感感染。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了所述疫苗組合物在制造用于在人或動(dòng)物患者中預(yù)防流感感染的藥物中的用途。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了在人或動(dòng)物患者中預(yù)防流感感染的方法，該方法包括將所述疫苗組合物給予所述患者。

附圖說明

圖1示出了在實(shí)施例2中對在第1和24天給予組合物A至F的小鼠，在不同的時(shí)間點(diǎn)測量的血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HIA)滴度。組合物A至C沒有用賦形劑處理。組合物A含有正常劑量的抗原，而組合物B和C含有1/100劑量的抗原。組合物D至F含有1/100劑量的抗原，但與賦形劑混合然后熱處理。組合物D至F的HIA滴度比用對照組合物B和C觀測到的顯著更高。

圖2示出了在實(shí)施例3中對在第1和24天給予組合物G至N的小鼠在不同的時(shí)間點(diǎn)測量的血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HIA)滴度。一旦HIA滴度大于50，認(rèn)為小鼠具有獲得免疫性。用賦形劑、佐劑和熱處理的組合(組合物N)最快速地獲得免疫性。

圖3示出了在實(shí)施例4中對在第1和24天給予組合物O至R的小鼠在不同的時(shí)間點(diǎn)測量的血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HIA)滴度。這些結(jié)果表明，用實(shí)施例3的組合物R中的二甲基甘氨酸也觀測到了用實(shí)施例1和2的聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)以及實(shí)施例3或組合物Q所觀測到的對流感抗原的影響。

具體實(shí)施方式

概要

本發(fā)明涉及，使用化學(xué)式(I)的賦形劑或其生理學(xué)上可接受的鹽或酯，如二甲基甘氨酸，來增加流感抗原的免疫原性。

通常將流感抗原與賦形劑混合以給出水性組合物，然后使水性組合物經(jīng)受處理，如冷凍、加熱和/或冷凍干燥，其增加流感抗原的免疫原性。相比于如果僅將流感抗原與賦形劑混合而沒有冷凍、加熱和/或冷凍干燥所觀測到的，在賦形劑的存在下冷凍、加熱和/或冷凍干燥流感抗原會(huì)增加抗原的免疫原性。

在處理過程中流感抗原和賦形劑相互作用，從而相比于在處理之前的流感抗原的免疫原性，增加了流感抗原的免疫原性。因此抗原的免疫原性在處理步驟過程中通常是增加的。

通常，該處理是冷凍或加熱或冷凍干燥，優(yōu)選冷凍或加熱，更優(yōu)選冷凍?？商鎿Q地，可以使用處理的組合，如冷凍隨后加熱或冷凍干燥，隨后加熱。在后一種情況下，通常在加熱之前重構(gòu)(reconstitute)冷凍干燥的組合物。

可以分別在冷凍、冷凍干燥或加熱以后，解凍、重構(gòu)或冷卻得到的組合物，并作為疫苗組合物給予患者。

水性組合物

水性組合物包含賦形劑和流感抗原。水性組合物通常是懸浮液或溶液。水性組合物是通過在水性溶劑中混合賦形劑和流感抗原來制備的?？梢允褂萌魏芜m宜的水性溶劑體系。水性溶劑可以是緩沖水(buffered water)。水性溶劑通常是HEPES緩沖的水、Tris緩沖的水、磷酸鹽緩沖的水或純水。

可選地，在與賦形劑和流感抗原混合之前，將一種或多種糖與水溶劑混合?？商鎿Q地，可以在賦形劑和流感抗原以后，將一種或多種糖與水溶劑混合。

可選地，在與賦形劑和流感抗原混合之前，將佐劑與水溶劑混合?？商鎿Q地，可以在賦形劑和流感抗原之后，將佐劑與水溶劑混合。

通常，如果存在佐劑，則將也存在一種或多種糖，因?yàn)樵撘环N或多種糖將通常使佐劑穩(wěn)定，特別是在處理步驟過程中。

在水性組合物中還可以存在其它成分。例如，還可以存在化學(xué)式(II)的化合物：

其中X表示-S(O)₂-并且R_a和R_b獨(dú)立地表示C_1-6烷基?；瘜W(xué)式(II)的優(yōu)選化合物是甲基磺酰基甲烷(MSM)，其中R_a和R_b均表示甲基。賦形劑和化學(xué)式(II)的化合物的組合可以在一起相互作用，從而在處理步驟過程中進(jìn)一步增加流感抗原的免疫原性。

水性組合物中的賦形劑的濃度通常在0.001M或更大的范圍內(nèi)，優(yōu)選0.01M或更大且更優(yōu)選0.1M或更大的范圍內(nèi)，例如0.1M至5.0M，或約0.5M。

如果使用一種或多種糖，則水性組合物中糖的濃度或糖的總濃度通常是1M或更小，優(yōu)選0.7M或更小，例如0.5M或更小或0.3M或更小。糖濃度或總濃度可以低至0.1mM或低至0.5mM。

采用的每種成分的具體濃度將取決于多種因素，包括流感抗原的性質(zhì)；使用的賦形劑；是否使用一種或多種糖(并且如果是，糖的特性)；是否存在佐劑；以及采取的具體的冷凍、冷凍干燥或熱處理步驟。

流感抗原

適用于本發(fā)明的流感抗原包括流感(類型A、B或C)疫苗的任何免疫原性組分。

流感抗原可以是全滅活的流感病毒或活的減毒的流感病毒。流感抗原可以是流感(類型A、B或C)的表面蛋白。具體地，流感抗原可以是血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)、核蛋白、M1、M2、NS1、NS2(NEP)、PA、PB1、PB1-F2和或PB2蛋白、或任何這些蛋白質(zhì)的免疫原性衍生物或片段。流感抗原可以是HA1、HA2、HA3、HA4、HA5、HA6、HA7、HA8、HA9、HA10、HA11、HA12、HA13、HA14、HA15和/或HA16、它們的任何免疫原性片段或衍生物、以及HA蛋白、片段或衍生物的任何組合。神經(jīng)氨酸酶可以是神經(jīng)氨酸酶1(N1)或神經(jīng)氨酸酶2(N2)。

賦形劑

賦形劑是化學(xué)式(I)的化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽或酯。

生理學(xué)上可接受的鹽通常是與生理上可接受的酸的鹽，因而包括用無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或有機(jī)酸如檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、馬來酸、扁桃酸、富馬酸或甲磺酸形成的那些。鹽酸鹽是優(yōu)選的。

酯通常是C_1-6烷基酯，優(yōu)選C_1-4烷基酯。因此酯可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基或叔丁基酯。乙基酯是優(yōu)選的。

如在本文中所使用的，C_1-6烷基基團(tuán)優(yōu)選是C_1-4烷基基團(tuán)。優(yōu)選的烷基基團(tuán)選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基和叔丁基。甲基和乙基是特別優(yōu)選的。

為避免疑義，化學(xué)式(I)的化合物的定義還包括其中羧酸根陰離子是質(zhì)子化的以產(chǎn)生-COOH并且銨陽離子結(jié)合藥學(xué)上可接受的陰離子的化合物。另外，為避免疑義，以上定義的化合物可以以任何對映體形式來使用。

通常，R₁表示氫或C_1-4烷基，優(yōu)選氫或C_1-3烷基，更優(yōu)選氫、乙基或甲基，最優(yōu)選氫或甲基。

通常，R₂表示C_1-4烷基，優(yōu)選C_1-3烷基，更優(yōu)選乙基或甲基，最優(yōu)選甲基。

通常，R₃表示C_1-4烷基，優(yōu)選C_1-3烷基，更優(yōu)選乙基或甲基，最優(yōu)選甲基。

R₂和R₃可以是相同或不同的，但優(yōu)選是相同的。當(dāng)R₁表示C_1-6烷基時(shí)，那么R₁、R₂和R₃可以是相同或不同的，但優(yōu)選是相同的。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，R₁表示氫并且R₂和R₃是如以上所定義的。因此，特別優(yōu)選的是，R₁表示氫并且R₂和R₃表示甲基，使得化學(xué)式(I)的化合物是二甲基甘氨酸。

在可替換的優(yōu)選的實(shí)施方式中，R₁表示C_1-6烷基并且R₂和R₃是如以上所定義的。因此，特別優(yōu)選的是，R₁至R₃均表示甲基，使得化學(xué)式(I)的化合物是三甲基甘氨酸。

可替換地，賦形劑可以是聚合物，如聚乙烯亞胺(polyethyleneimine)(PEI)，而非化學(xué)式(I)的化合物或其生理學(xué)上可接受的鹽或酯。

PEI是脂肪族多胺，其特征在于表示為-(CH₂-CH₂-NH)-的重復(fù)化學(xué)單元。在本文中提及的PEI包括聚乙烯亞胺均聚物或共聚物。聚乙烯亞胺共聚物可以是無規(guī)或嵌段共聚物。例如，PEI可以由聚乙烯亞胺和另一種聚合物如聚乙二醇(PEG)的共聚物組成。聚乙烯亞胺可以是線性或支鏈的。

提及的PEI還包括聚乙烯亞胺的衍生形式。聚乙烯亞胺在不同位置含有氮原子。氮原子存在于末端氨基基團(tuán)中，例如R-NH_2,，并且存在于內(nèi)部基團(tuán)中，如在聚合物結(jié)構(gòu)內(nèi)中斷烷基或亞烷基基團(tuán)的基團(tuán)，例如R-N(H)-R’，以及存在于聚合物分支的交叉處，例如R-N(-R’)-R”，其中R、R’和R”可以是例如亞烷基基團(tuán)。除了或代替氫原子，烷基或芳基基團(tuán)可以連接于氮中心。這樣的烷基和芳基基團(tuán)可以是取代的或未取代的。烷基基團(tuán)通常是C₁-C₄烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基或叔丁基。芳基基團(tuán)通常是苯基。

PEI可以是已共價(jià)連接于各種其它的聚合物如聚乙二醇的聚乙烯亞胺。已經(jīng)生成了PEI的其它的改性形式并且一些是可商購的：支化的PEI 25kDa,LMW-PEI 5.4kDa、偽樹枝狀PEI(pseudodendrimeric PEI)、PEI-SS-PEI、PEI-SS-PEG、PEI-接枝-PEG、PEG-共-PEI、PEG-接枝-PEI、PEI-共-L乳酰胺-共-琥珀酰胺、PEI-共-N-(2-羥乙基-乙烯亞胺)、PEI-共-N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺、PEI-接枝-PCL-嵌段-PEG、PEI-SS-PHMPA、PEI-接枝-葡聚糖10 000和PEI-接枝-轉(zhuǎn)鐵蛋白-PEG、-接枝-PEI。PEI可以是全甲基化聚乙烯亞胺或聚乙烯亞胺-乙磺酸。

可以獲得廣范圍的數(shù)均摩爾質(zhì)量(M_n)的PEI，例如300Da和800kDa之間。優(yōu)選地，數(shù)均摩爾質(zhì)量是300和2000Da之間、500和1500Da之間、1000和1500Da之間、10和100kDa之間、20和100kDa之間、30和100kDa之間、在40和100kDa之間、50和100kDa之間、60和100kDa之間、50和70kDa之間或55和65kDa之間。大約60kDa的相對高M(jìn)_n的PEI或1200Da的相對低M_n是適宜的。

優(yōu)選地，PEI的重均摩爾質(zhì)量(M_w)是500Da和1000kDa之間。最優(yōu)選地，PEI的M_w是500Da和2000Da之間、1000Da和1500Da之間、或1和1000kDa之間、100和1000kDa之間、250和1000kDa之間、500和1000kDa之間、600和1000kDa之間、750和1000kDa之間、600和800kDa之間、700和800kDa之間。大約750kDa的相對較高M(jìn)_w或大約1300Da的相對較低M_w是適宜的。

可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來確定PEI的重均摩爾質(zhì)量(M_w)和數(shù)均摩爾質(zhì)量(M_n)。例如，可以通過光散射、小角度中子散射(SANS)、X射線散射或沉降速度來確定M_w?？梢岳缤ㄟ^凝膠滲透色譜法、粘度測定法(Mark-Houwink等式)和依數(shù)性方法(colligative method)如蒸氣壓滲透法或端基滴定，來確定M_n。

各種形式的PEI是可商購的(例如Sigma、Aldrich)。例如，本文中使用的具有約60kDa的M_n和約750kDa的M_w的支化的、相對高分子量形式的PEI是可商購的(Sigma P3143)。這種PEI可以由以下化學(xué)式來表示：

本文中使用的相對低分子量形式的PEI也是可商購的(例如Aldrich482595)，其具有1300Da的M_w和1200Da的M_n。

糖

在水性組合物中可選地存在一種或多種糖?？梢源嬖趦煞N或更多種糖，例如兩種、三種或四種糖。優(yōu)選的是，存在一種或兩種糖，最優(yōu)選兩種糖。賦形劑和糖的組合可以在一起相互作用，從而在處理步驟過程中進(jìn)一步增加流感抗原的免疫原性。在處理步驟過程中，糖還幫助穩(wěn)定佐劑(當(dāng)存在時(shí))，特別是鋁鹽佐劑。

糖通常是單糖、二糖、三糖、四糖、糖醇或另一種寡糖。

通常，單糖是葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、甘油醛、半乳糖或甘露糖。通常，二糖是蔗糖、海藻糖、乳糖、纖維二糖、松二糖、麥芽酮糖、蜜二糖、異麥芽糖、或麥芽糖。通常，三糖是棉子糖、松三糖或傘形糖。通常，四糖是水蘇糖。通常，糖醇是甘露醇。寡糖的其它實(shí)例包括五糖毛蕊花糖。

通常，糖是非還原糖，例如蔗糖或棉子糖。

當(dāng)在水溶液中存在一種糖時(shí)，該糖優(yōu)選是甘露醇或蔗糖，優(yōu)選甘露醇。

當(dāng)在水懸浮液中存在兩種糖時(shí)，該糖優(yōu)選是蔗糖和棉子糖。

佐劑

在水性組合物中可選地存在佐劑。可以使用任何適宜的佐劑，但鋁鹽佐劑是優(yōu)選的。當(dāng)使用鋁鹽佐劑時(shí)，優(yōu)選的是，在水性組合物中還存在一種或多種糖，以在處理步驟過程中穩(wěn)定佐劑。

通常，鋁鹽是氫氧化鋁(Al(OH)₃)、磷酸鋁(AlPO₄)、鹽酸鋁、硫酸鋁、銨礬、鉀明礬或硅酸鋁。優(yōu)選地，使用的鋁鹽佐劑是氫氧化鋁或磷酸鋁。最優(yōu)選地，鋁鹽佐劑是氫氧化鋁(Al(OH)₃)。

通常，鋁鹽佐劑采取由鋁鹽制成的水合凝膠的形式，該水合凝膠是水性介質(zhì)中的顆粒懸浮液。鋁鹽佐劑的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，通常通過在明確限定和受控的化學(xué)環(huán)境中將鋁離子(通常作為硫酸鹽或氯化物)的水溶液暴露于堿性條件來制備氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑。這樣的方法可以，例如用來制備氫氧化鋁或磷酸鋁水合凝膠。

冷凍

可以通過任何適宜的方法來進(jìn)行水性組合物的冷凍。因此，可以通過浸沒在液氮或液氮蒸汽中，置于冷凍器中或使用干冰和醇冷凍浴，來進(jìn)行冷凍。

通常，將水性組合物冷凍至-4℃或以下，優(yōu)選-10℃或以下，更優(yōu)選至-20℃或以下，更優(yōu)選至-30℃。通常不在-100℃以下冷凍水性組合物?？梢詫⑺越M合物冷凍至例如約-80℃。

通常將水性組合物在期望的溫度下保持冷凍30分鐘或更久，優(yōu)選1小時(shí)或更久，例如2至24小時(shí)。

通常在用作疫苗以前，通過在室溫下放置，使得冷凍的水性組合物解凍。

可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來適當(dāng)優(yōu)化冷凍和解凍條件。

冷凍干燥

可以按照標(biāo)準(zhǔn)程序來進(jìn)行冷凍干燥。有三個(gè)主要階段：冷凍，初次干燥(primary drying)和二次干燥(secondary drying)。通常使用冷凍干燥機(jī)來進(jìn)行冷凍。在此步驟中，重要的是，將生物材料冷卻到低于其低共熔點(diǎn)(eutectic point)，材料的固相和液相可以共存的最低溫度。這確保在隨后的步驟中將發(fā)生升華而不是熔化?？商鎿Q地，無定形材料不具有低共熔點(diǎn)，但確實(shí)具有必須將產(chǎn)物保持在其以下的臨界點(diǎn)，以在初次和二次干燥過程中防止回熔(melt-back)或瓦解。

在初次干燥過程中，通過施加適當(dāng)水平的真空來控制壓力，同時(shí)供應(yīng)足夠的熱量，以使得水能夠升華。在此階段，升華至少50％，通常60至70％的材料中的水。初級干燥可能是緩慢的，因?yàn)檫^多的熱量可以降解或改變生物材料的結(jié)構(gòu)。冷凝器室和/或冷凝板提供通過再凝固，在其上俘獲水蒸氣的表面。

在二次干燥過程中，通過進(jìn)一步施加熱量來除去水合的水。通常，還降低壓力以促進(jìn)進(jìn)一步干燥。在冷凍干燥過程的完成以后，可以在密封之前用惰性氣體如氮?dú)鈦泶蚱普婵?，或可以在真空下密封材料?/p>

在用作疫苗以前，使用例如水或水性緩沖液，將冷凍干燥的組合物重構(gòu)為水性組合物。

可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來適當(dāng)優(yōu)化冷凍干燥條件。

熱處理

可以通過任何適宜的方法來進(jìn)行水性組合物的加熱處理。

通常，將水性組合物加熱至大于30℃，優(yōu)選大于40℃。更優(yōu)選地，將水性組合物加熱至30℃至80℃的溫度，例如35℃至60℃或40℃至50℃。優(yōu)選的溫度是約45℃。

一旦已將水性組合物至加熱期望的溫度，優(yōu)選將其保持在該溫度下30分鐘或更久，優(yōu)選1小時(shí)或更久，例如2小時(shí)至2周或4小時(shí)至24小時(shí)。

典型的熱處理包括加熱至約45℃并保持在該溫度下約7天。

在用作疫苗以前，通常使熱處理的水性組合物返回到室溫。

可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來適當(dāng)優(yōu)化熱處理?xiàng)l件。

免疫原性的增加

流感抗原的免疫原性是抗原在人或動(dòng)物的身體中引起免疫應(yīng)答的能力。可以通過使用用于預(yù)測免疫應(yīng)答的水平的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，如血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)，比較未修飾(對照)的流感抗原的免疫原性與根據(jù)本發(fā)明的修飾的流感抗原的免疫原性，來測量免疫原性的變化。

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適宜的技術(shù)來測量流感抗原的免疫原性。優(yōu)選的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。在以下實(shí)施例中，描述了用于此試驗(yàn)的示例性流程。

本發(fā)明的修飾的流感抗原的增加的免疫原性是指，用較小量的修飾的抗原可以獲得相同的免疫應(yīng)答。因此，如果給予患者劑量D的未修飾的抗原得到了一定水平的免疫原性，那么通常0.5D或更少，優(yōu)選0.1D或更少，更優(yōu)選0.01D或更少的劑量，將得到相同水平的免疫原性。通常在給予患者以后至少10天，例如在10天、15天或20天以后測量免疫原性。

本發(fā)明的修飾的流感抗原的增加的免疫原性是指，免疫性的引發(fā)比用未修飾的抗原更加快速地發(fā)生。因此，如果患者在給予給定劑量的未修飾的抗原以后需要時(shí)間T來獲得免疫性，那么對于給予相同劑量的修飾的抗原的患者通常將需要0.75T或更少時(shí)間，優(yōu)選0.5T或更少時(shí)間，最優(yōu)選0.2T或更少時(shí)間，來獲得免疫性。

疫苗組合物的使用

在冷凍、冷凍干燥、或加熱以后，可以分別解凍、重構(gòu)或冷卻得到的組合物，然后用作疫苗組合物。在使用之前，根據(jù)需要可以用例如磷酸鹽緩沖的鹽水或注射用水來稀釋疫苗組合物。

通常，疫苗組合物含有一種或多種不同的流感抗原，其至少一種是根據(jù)本發(fā)明制備的。在一種實(shí)施方式中，疫苗組合物含有兩種、三種或四種不同的流感抗原，優(yōu)選地其全部均是根據(jù)本發(fā)明制備的。

然后可以通過例如注射將得到的疫苗組合物給予需要疫苗接種的人或動(dòng)物患者。通常，患者是人。

優(yōu)選地，患者是具有“風(fēng)險(xiǎn)”群體的一部分的人。這樣的患者包括兒童、老年患者和/或患有肺病、糖尿病、癌癥、或腎或心臟問題的患者。特別優(yōu)選用本發(fā)明的疫苗組合物來治療此患者組，因?yàn)橄啾葮?biāo)準(zhǔn)疫苗，用本發(fā)明疫苗所得到的免疫性的快速引發(fā)會(huì)降低患者在疫苗接種和免疫性引發(fā)之間的時(shí)間段中被感染的風(fēng)險(xiǎn)。

優(yōu)選地，該患者以前已經(jīng)遭受對流感疫苗的不良反應(yīng)。特別優(yōu)選用本發(fā)明的疫苗組合物來治療此患者組，因?yàn)榭乖?jié)約效應(yīng)意味著，需要對患者遞送較少的疫苗組合物，因而降低對疫苗的過敏反應(yīng)或其它不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

以下實(shí)施例舉例說明本發(fā)明。

實(shí)施例1–疫苗組合物的制備

材料

均如獲得自商業(yè)來源(Aldrich)地使用二甲基甘氨酸(DMG)、蔗糖、棉子糖、HEPES(4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)緩沖劑、氯化鈉和無菌水。如獲得自商業(yè)來源(Source Bioscience)地使用Alhydrogel^TM。如獲得自商業(yè)來源(Sigma目錄號：P3143-50％w/v在水中的溶液；M_n 60,000)地使用聚乙烯亞胺(PEI)。全滅活流感A/Solomon Islands/2006H1N1抗原獲得自英國國家生物標(biāo)準(zhǔn)及控制研究所(National Institute for Biological Standards and Control)(NIBSC)。

組合物制備

150ml的HEPES緩沖液制備如下。在量筒中量出100ml的無菌水。用校準(zhǔn)檢查的天平稱出2.5g NaCl，并使用磁力攪拌器和棒溶解于無菌水中。加入6ml的1M HEPES并攪拌。當(dāng)完全溶解時(shí)，使用pH計(jì)和氫氧化鈉將pH改變到7.9。用無菌水將最終體積補(bǔ)足至150ml。然后在生物安全柜中通過0.2μm過濾單元過濾最終的HEPES緩沖液混合物。

在稱量所需要的在以下表1至3中描述的賦形劑組分以后，將它們放入50ml無菌燒瓶中。然后將大約6ml的HEPES緩沖液加入燒瓶并通過旋轉(zhuǎn)來混合內(nèi)含物。然后在+60℃水浴中加熱燒瓶和內(nèi)含物直到溶解。當(dāng)溶解時(shí)，測量混合物的體積并用更多的HEPES緩沖液將最終體積補(bǔ)足至10ml。在生物安全柜中通過0.2μm過濾裝置過濾賦形劑制劑。

使冷凍干燥的流感病毒抗原A/Solomon Islands/2006H1N1的小瓶從-20℃達(dá)到室溫，然后制備抗原在無菌水中的工作儲(chǔ)存液(working stock)。

如在以下表1至3中詳細(xì)說明的，制備玻璃螺旋蓋的小瓶(預(yù)先高壓滅菌的)。每個(gè)小瓶最終含有1ml的總體積。在需要的情況下，將500μl的Alhydrogel^TM儲(chǔ)存液(2％w/v的濃度，以產(chǎn)生1％w/v的最終濃度)用移液管吸取到每個(gè)小瓶。然后將流感病毒抗原儲(chǔ)存液用移液管吸取到每個(gè)小瓶，以在每個(gè)小瓶中產(chǎn)生2或0.2μg抗原的最終抗原濃度。將小瓶封蓋并通過簡單渦旋混合。

然后用下文描述的和如在表1至3中陳述的處理A至C之一來可選地處理小瓶。

·處理1–將小瓶存儲(chǔ)在45℃下7天，然后使其返回到室溫。

·處理2–將小瓶冷凍至-80℃，然后通過保持在室溫下使其解凍。

·處理3–在商用冷凍干燥器中，通過冷凍至–80℃并在真空下干燥16小時(shí)來冷凍干燥小瓶。然后將小瓶存儲(chǔ)在45℃下7天，接著重構(gòu)回到1ml的總體積并使其返回室溫。

表1

表2

表3

實(shí)施例2–抗原節(jié)約效應(yīng)

在第0天和第24天，將在實(shí)施例1中制備的組合物A至F皮下給予BALB-c小鼠。通過在不同的時(shí)間點(diǎn)測量取自小鼠的血液的血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HIA)滴度來確定組合物針對流感的保護(hù)效果。

血細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)包括以下步驟。

1.在56℃下滅活血清30分鐘。

2.通過用1％CRBC來預(yù)溫育血清30分鐘以除去非特異性雞紅細(xì)胞(CRBC)凝集活性。除去CRBC并分離血清。

3.在PBS/0.5％BSA中連續(xù)稀釋血清。

4.將流感病毒的HAU加入孔。

5.在室溫下溫育板30分鐘。

6.將1％CRBC/PBS懸浮液加入孔。

7.在室溫下溫育板30-45分鐘。

8.肉眼確定孔中的凝集。

9.記錄和報(bào)告HIA滴度，其中HIA滴度是形成CRBC小粒的最大稀釋系列的倒數(shù)。

結(jié)果描述于圖1。組合物D至F的這些結(jié)果表明，相比與對照組合物A，賦形劑與熱處理的組合導(dǎo)致相等或更好的HIA滴度。這是意想不到的，因?yàn)橄啾葘φ?與用組合物B所獲得的結(jié)果相比)，組合物D至F僅含有按重量計(jì)1％的抗原。

實(shí)施例3–加速免疫性的引起

在第0天和第24天，將在實(shí)施例1中制備的組合物G至N皮下給予BALB-c小鼠。通過如在實(shí)施例2中描述的測量HIA滴度，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)確定組合物針對流感的保護(hù)效果。

結(jié)果描述于圖2。一旦HIA滴度大于50，認(rèn)為小鼠具有獲得免疫性。用賦形劑、佐劑和熱處理的組合(組合物N)，最快速地獲得免疫性。

實(shí)施例4–用不同的賦形劑觀測到的類似結(jié)果

在第0天和第21天，將在實(shí)施例1中制備的組合物O至R皮下給予BALB-c小鼠。通過如在實(shí)施例2中描述的測量HAI滴度，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)確定組合物針對流感的保護(hù)效果。

結(jié)果描述于圖3。這些結(jié)果表明，用二甲基甘氨酸也觀測到了實(shí)施例1和2中用聚乙烯亞胺的所觀測到的對流感抗原的效果。因此，用二甲基甘氨酸也觀測到了用聚乙烯亞胺所觀測到的免疫性引發(fā)的加速和抗原節(jié)約效應(yīng)。