本發(fā)明涉及反芻動(dòng)物中的排卵調(diào)節(jié)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

奶牛的運(yùn)作需要針對(duì)理想效能及經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量的高效育種方案。牛奶產(chǎn)量取決于處于開始妊娠、分娩及哺乳期的運(yùn)作中的母牛。分娩之后，母牛可以產(chǎn)奶持續(xù)超過兩百天。然而，分娩后約150天之后，牛奶產(chǎn)量通常會(huì)快速下降?？s短分娩-泌乳周期中的產(chǎn)犢與后續(xù)妊娠之間的時(shí)間段會(huì)由此增加作為母牛對(duì)乳制品運(yùn)作的價(jià)值的牛奶產(chǎn)量。另外，在第一次產(chǎn)犢之后三十六個(gè)月，母牛的乳制品價(jià)值通常會(huì)快速下降。就飼料、開銷及其它成本而言，增加此時(shí)間期間母牛的妊娠次數(shù)會(huì)使動(dòng)物的投資回報(bào)達(dá)到最大。

高牛奶產(chǎn)量和高繁殖力的目標(biāo)可能難以同時(shí)實(shí)現(xiàn)。高牛奶產(chǎn)量會(huì)導(dǎo)致動(dòng)情持續(xù)時(shí)間縮短、無動(dòng)情體征的排卵以及與繁殖力直接相關(guān)的無排卵病狀，使得基本生殖管理工具、動(dòng)情檢測(cè)繼之以人工授精(AI)更加難以進(jìn)行有效地實(shí)施。生殖管理的效率可以通過使用調(diào)節(jié)和控制動(dòng)情周期和排卵的激素來增加。奶牛中的動(dòng)情周期可以通過例如促性腺激素釋放激素(GnRH)、黃體激素(LH)、前列腺素F_2a、雌激素、孕酮以及這些激素中的某些的合成類似物來操控。

處理方案為調(diào)節(jié)母牛動(dòng)情周期的三次注射方案。在母牛的育種周期的任意階段將GnRH注射于母牛中。GnRH刺激LH，所述LH刺激舊卵泡排卵和新卵泡生長(zhǎng)。在注射GnRH之后七天進(jìn)行使用前列腺素的第二次注射，實(shí)現(xiàn)任意活性黃體的變性(其將預(yù)防母牛排卵)。兩天后，投與第二次GnRH注射，使得卵從通過第一次GnRH注射刺激的卵泡得到釋放，即，排卵。授精的理想時(shí)間為第三次注射之后16小時(shí)，而奶牛的繁殖力會(huì)保持24小時(shí)。處理方案使得排卵在同時(shí)經(jīng)處理的奶牛中得到同步。然而，在相對(duì)精確的排程下，處理方案需要對(duì)每只母牛進(jìn)行四次處理，會(huì)增加處理成本并且使得大數(shù)目的動(dòng)物的處理困難或不可行。由于GnRH成本相對(duì)較高且陰道內(nèi)所投與的GnRH的生物可用性相對(duì)較低，使得難以進(jìn)行調(diào)節(jié)處理方案的工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及反芻動(dòng)物中的排卵調(diào)節(jié)領(lǐng)域。

在某些實(shí)施例中提供陰道內(nèi)調(diào)配物，其包括呈10w/w％到20w/w％的量的羧酸；熔融溫度在30℃與38℃之間的油性基質(zhì)以及GnRH或其類似物，其呈與約10μg與600μg之間的GnRH等效的量。

在某些實(shí)施例中，GnRH或其類似物以與140μg與550μg之間的GnRH量等效的量；或以與140μg與500μg之間的GnRH量等效的量；或以與140μg與300μg之間的GnRH量等效的量；或以與140μg與250μg之間的GnRH量等效的量；或以與140μg與200μg之間的GnRH量等效的量；或以與200μg與500μg之間的GnRH量等效的量；或以與200μg與400μg之間的GnRH量等效的量；或以與200μg與300μg之間的GnRH量等效的量；或以與280μg與550μg之間的GnRH量等效的量；或以與280μg與500μg之間的GnRH量等效的量；或以與280μg與400μg之間的GnRH量等效的量存在。

在某些實(shí)施例中，當(dāng)向雌性反芻動(dòng)物肌肉內(nèi)投與GnRH或其類似物時(shí)，其以GnRH或其類似物的ED70的140％與250％之間的量存在。

在某些實(shí)施例中，羧酸為檸檬酸、丁二酸、酒石酸、乙醇酸、抗壞血酸、乳酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸二鉀或其組合。油性基質(zhì)的OHV可以低于30，優(yōu)選地，低于20、更優(yōu)選地，低于15，例如，在5與15之間。

在某些實(shí)施例中，雌性反芻動(dòng)物為牛類動(dòng)物、山羊類動(dòng)物或綿羊類動(dòng)物。

在某些方面中提供一種根據(jù)上述實(shí)施例中的任一項(xiàng)通過使GnRH或其類似物與羧酸摻合；研磨GnRH或其類似物和羧酸；并且將所研磨的GnRH或其類似物和所研磨的羧酸分散于油性基質(zhì)中來制造調(diào)配物的方法。

在另一方面中提供一種根據(jù)先前實(shí)施例中的任一項(xiàng)通過陰道內(nèi)投與調(diào)配物來在動(dòng)情間期的反芻動(dòng)物中誘導(dǎo)排卵的方法。在某些方面中，陰道內(nèi)調(diào)配物提供為多組分調(diào)配物的一部分，其還包含前列腺素F2α和有效劑量的前列腺素以及另一有效劑量的GnRH或其類似物。在某些方面中，多組分調(diào)配物處于陰道內(nèi)裝置中，所述裝置被配置成在釋放前列腺素F2α之前釋放另一有效劑量的GnRH或其類似物6到10天，例如，7天、8天或9天。陰道內(nèi)裝置還可以被配置成在釋放前列腺素F2α之后釋放如本文所述的調(diào)配物約兩天。在某些方面中，另一有效劑量的GnRH或其類似物可與上文所述的陰道內(nèi)調(diào)配物相同。

附圖說明

圖1a和1b展示用乙酸高那瑞林(gonadorelin acetate)陰道內(nèi)處理的動(dòng)物的AUC的最小平方平均值(+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差)。

圖2a和2b展示用鹽酸高那瑞林陰道內(nèi)處理的動(dòng)物的AUC的最小平方平均值(+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差)。

具體實(shí)施方式

定義

為了更好地理解本發(fā)明，提供以下非限制性定義：

術(shù)語“GnRH”是指反芻動(dòng)物中所自然存在的GnRH形式。GnRH的實(shí)例包括(但不限于)牛GnRH、山羊GnRH、綿羊GnRH和其鹽。GnRH為氨基酸序列為SEQ ID NO:1的十肽(pyro-EHWSYGLRPG-NH₂)。通常使用GnRH的乙酸鹽、乙酸水合物及/或鹽酸鹽。

如應(yīng)用于GnRH或GnRH類似物的術(shù)語“ED70”是指GnRH或GnRH類似物的劑量，如可適用，當(dāng)在動(dòng)情周期的動(dòng)情間期階段中向反芻動(dòng)物投與時(shí)，其在70％的牛類反芻動(dòng)物中引起排卵。

術(shù)語與一定GnRH量“等效的GnRH類似物的量”是指GnRH量與類似物效力的比。舉例來說，效力比GnRH強(qiáng)50倍的2ng GnRH類似物等效于100ng GnRH。

調(diào)配物

本文中所公開的調(diào)配物適用于向反芻動(dòng)物，例如，牛類物種和綿羊類物種陰道內(nèi)投與GnRH。諸位發(fā)明人已出人意料地并且意外地發(fā)現(xiàn)，本文中所公開的調(diào)配物提供接近(例如，70％-75％)在肌肉內(nèi)投與后獲得的生物可用性的GnRH或GnRH類似物的生物可用性。使用本文中所公開的調(diào)配物獲得的GnRH高效陰道內(nèi)遞送提供增加的陰道內(nèi)遞送GnRH或GnRH類似物的經(jīng)濟(jì)性。另外，本文中所公開的調(diào)配物考慮到針對(duì)反芻動(dòng)物中的動(dòng)情周期同步和排卵誘導(dǎo)的“單觸式”方案，亦即僅需要單次投與激素的方案的設(shè)計(jì)。

提供增加的GnRH或GnRH類似物的生物可用性的調(diào)配物包括GnRH或GnRH類似物以及羧酸和油性基質(zhì)。GnRH或GnRH類似物通常以與10μg與600μg之間的GnRH量等效的量存在。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的調(diào)配物含有GnRH或其類似物，GnRH或其類似物的量范圍與140μg-600μg的GnRH量等效。在某些情況下，陰道內(nèi)調(diào)配物中的GnRH或GnRH類似物的有效量可基于肌肉內(nèi)投與時(shí)已知的有效GnRH量，針對(duì)投與陰道內(nèi)調(diào)配物和肌肉內(nèi)投與之后所獲得的相應(yīng)GnRH生物可用性進(jìn)行調(diào)整。在牛類動(dòng)物的情況下，舉例來說，某些GnRH產(chǎn)品建議每只經(jīng)肌肉內(nèi)投與的動(dòng)物100μg-200μg GnRH。對(duì)于提供的生物可用性為肌肉內(nèi)投與GnRH后獲得的生物可用性的75％的陰道內(nèi)GnRH調(diào)配物而言，調(diào)配物將包括約133μg-266μg GnRH的等效物。此類調(diào)配物可由此提供每只經(jīng)陰道內(nèi)投與的動(dòng)物例如140μg。

當(dāng)向一組動(dòng)物陰道內(nèi)投與時(shí)，調(diào)配物中所存在的GnRH或GnRH類似物的量?jī)?yōu)選產(chǎn)生同步排卵。因此，在不受理論束縛的情況下，當(dāng)向雌性反芻動(dòng)物肌肉內(nèi)投與時(shí)，陰道內(nèi)調(diào)配物可包括呈GnRH或GnRH類似物的ED70的140％與300％之間的量的GnRH或GnRH類似物。舉例來說，當(dāng)向雌性反芻動(dòng)物肌肉內(nèi)投與時(shí)，GnRH或其GnRH類似物可以與GnRH或GnRH類似物的ED70的140％-275％、140％-250％、140％-200％、180％-250％或200％-220％的GnRH量等效的量存在。

GnRH或GnRH類似物可以與140μg與550μg之間的GnRH量等效的量；或以與140μg與500μg之間的GnRH量等效的量；或以與140μg與300μg之間的GnRH量等效的量；或以與140μg與250μg之間的GnRH量等效的量；或以與140μg與200μg之間的GnRH量等效的量；或以與200μg與500μg之間的GnRH量等效的量；或以與200μg與400μg之間的GnRH量等效的量；或以與200μg與300μg之間的GnRH量等效的量；或以與280μg與550μg之間的GnRH量等效的量；或以與280μg與500μg之間的GnRH量等效的量；或以與280μg與400μg之間的GnRH量等效的量存在。

陰道內(nèi)GnRH調(diào)配物可包括GnRH和/或一種或多種GnRH鹽和/或一種或多種GnRH類似物。GnRH鹽包括例如(但不限于)GnRH鹽酸鹽、GnRH乙酸鹽及GnRH乙酸四水合物。GnRH類似物包括例如(但不限于)，亮丙立德(leuprolide；pyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt；SEQ ID NO:2)、布舍瑞林(buserelin；pyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Tbu)-Leu-Arg-Pro-NHEt；SEQ ID NO:3)、德舍瑞林(deslorelin；pyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NHEt；SEQ ID NO:4)和夫替瑞林(fertirelin；pyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHEt；SEQ ID NO:5)以及這些類似物的鹽和/或水合物。優(yōu)選的GnRH類似物為布舍瑞林。優(yōu)選的布舍瑞林的劑量為等于GnRH量的10％的量。

GnRH類似物在本領(lǐng)域中為眾所周知的。GnRH類似物的排卵誘導(dǎo)活性已很好地記載于可公開獲得的來源，諸如Pubmed數(shù)據(jù)庫中。此外，已研發(fā)出確定GnRH類似物的排卵誘導(dǎo)活性的適合模型。GnRH類似物的其它實(shí)例以及其排卵誘導(dǎo)活性公開在杜塔等人,《生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem Biophys Res.Commun.)》197881(2):382-390；Fujino等人,《生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem Biophys Res.Commun.)》1974 57(4):1248-1256；Dutta等人，《醫(yī)藥化學(xué)雜志(J Med.Chem.)》1978 21(10):1018-1024；Fujino等人,《生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem Biophys Res.Commun.)》1972 49(3):863-869中。因此，僅需要常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定相關(guān)GnRH類似物的排卵誘導(dǎo)活性。

多種油性基質(zhì)適用于本文所述的GnRH陰道內(nèi)調(diào)配物。通常，油性基質(zhì)含有單酸甘油酯、二酸甘油酯以及三酸甘油酯的混合物。單酸甘油酯、二酸甘油酯以及三酸甘油酯的相對(duì)量以及脂肪酸尾部的長(zhǎng)度會(huì)影響OHV值(游離羥基含量)。換句話說，OHV值提供關(guān)于油性基質(zhì)中的單酸甘油酯、二酸甘油酯以及三酸甘油酯的相對(duì)量的某些信息。在某些實(shí)施例中，油性基質(zhì)的OHV值低于30。因此，在不同實(shí)施例中，OHV值低于25、低于20、低于15、低于10或低于5。在一些實(shí)施例中，油性基質(zhì)的OHV值在約5與約15之間。

油性基質(zhì)的實(shí)例為系列栓劑。H15栓劑的OHV值在5與15之間。H系列為羥值高達(dá)15的硬脂。其大部分由三酸甘油酯以及比例為最多15％的二酸甘油酯以及不超過1％的單酸甘油酯組成。其特征為熔融溫度與固化溫度之間的極小差距，僅具有后硬化現(xiàn)象的小傾向(最大值為1.5℃)。

W系列產(chǎn)品為羥值(OHV)為20-50的硬脂。其由三酸甘油酯(65％-80％)、二酸甘油酯(10％-35％)以及單酸甘油酯(1％-5％)的混合物組成。由于其組成，這些WITEPSOL級(jí)在熔點(diǎn)與固化點(diǎn)之間具有較大差距，其對(duì)驟冷較不敏感(更有彈性)、固化較為緩慢且可以容易用自動(dòng)機(jī)且用小規(guī)模設(shè)備進(jìn)行處理。偏甘油酯內(nèi)含物還會(huì)減緩固體沉降并且促進(jìn)可較不容易吸收的活性化合物的吸收。

在某些方面中，油性基質(zhì)的OHV值低于30。因此，OHV值可低于25、低于20、低于15、低于10或低于5。在一些方面中，油性基質(zhì)的OHV值在約5與約15之間。

油性基質(zhì)的熔融溫度還可以低于反芻動(dòng)物的體溫。油性基質(zhì)的熔融溫度還可以在例如30℃與40℃之間，例如30.5℃-32.5℃、32.5℃-34.5℃、34.5℃-36.5℃、36.5℃-38.5℃以及38.5℃-40℃范圍內(nèi)。

不同羧酸適用于本文所述的GnRH陰道內(nèi)調(diào)配物。例示性羧酸包括(但不限于)檸檬酸、丁二酸、酒石酸、乙醇酸、抗壞血酸、乳酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸二鉀或其組合。通常，GnRH陰道內(nèi)調(diào)配物含有約8w/w％-20w/w％羧酸(例如，9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％)。

GnRH陰道內(nèi)調(diào)配物可通過將GnRH或GnRH類似物的固體形式和羧酸的固體形式分散于油性基質(zhì)中來制備?？稍诜稚⒂谟托曰|(zhì)中之前對(duì)GnRH或GnRH類似物和/或羧酸進(jìn)行處理(例如，研磨)以縮小粒度。

可通過(但不限于)向一只或多只牛投與GnRH或其GnRH類似物(稱為“GnRH-1”)、在其后5-9天內(nèi)向牛投與前列腺素F 2a，并且隨后在投與前列腺素之后約30-72小時(shí)向牛投與第二劑量的GnRH或GnRH類似物(稱為“GnRH-2”)來進(jìn)行使牛中的排卵同步的方案。在不受理論束縛的情況下，投與GnRH-1會(huì)在大部分所處理的動(dòng)物中誘導(dǎo)使卵泡波出現(xiàn)和卵泡生長(zhǎng)模式標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)勢(shì)卵泡排卵或黃體化。投與GnRH-2(誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)卵泡排卵)。所述GnRH陰道內(nèi)調(diào)配物適用于GnRH-1和/或GnRH-2投與中的任一種或兩種。

本文所述的GnRH陰道內(nèi)調(diào)配物可以用作多組分組合物的一部分。此類多組分可包含同步組分、前列腺素組分以及排卵誘導(dǎo)組分。本文所述的GnRH陰道內(nèi)調(diào)配物由此適用作同步組分、排卵誘導(dǎo)組分或同步組分和排卵誘導(dǎo)組分這兩者。按醫(yī)師需要，多組分組合物可裝載在被配置成用于遞送治療的陰道內(nèi)裝置中。陰道內(nèi)遞送裝置可首先配置成例如同步組分、前列腺素組分(遞送同步組分之后6-10天)以及排卵誘導(dǎo)組分(遞送前列腺素組分之后30-72小時(shí))。

在某些方面中，GnRH陰道內(nèi)調(diào)配物用作多組分組合物的同步組分和排卵誘導(dǎo)組分。在同步組分之后約7天遞送前列腺素組分，并且在前列腺素組分之后30-72小時(shí)遞送排卵誘導(dǎo)組分。

可適宜從被配置成用于定時(shí)遞送不同組分的裝置中投與多組分組合物。此類裝置可含有例如一個(gè)或多個(gè)儲(chǔ)槽和可編程處理單元。各個(gè)儲(chǔ)槽可含有同步組分、排卵誘導(dǎo)組分以及前列腺素組分。在預(yù)定時(shí)間處，可編程處理單元實(shí)現(xiàn)在反芻動(dòng)物的陰道中從裝置的儲(chǔ)槽釋放適合組分?？删幊烫幚韱卧ㄟ^儲(chǔ)槽壁的破裂和擠壓(例如，通過電力、機(jī)械力或滲透力)實(shí)現(xiàn)儲(chǔ)槽的內(nèi)含物到達(dá)裝置以外的此類釋放。

所有這些公開案在本文中以全文引用的方式并入，其程度如同每一篇個(gè)別公開案具體并且單獨(dú)說明為以引用方式并入。

盡管本文中已參考特定實(shí)施例描述本發(fā)明，但應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅僅說明本發(fā)明的原理和應(yīng)用。因此，應(yīng)理解，在不脫離如由以下權(quán)利要求所界定的本發(fā)明的精神和范疇的情況下，可對(duì)說明性實(shí)施例作出諸多修改并且可設(shè)計(jì)出其它配置。

在非限制性實(shí)例中進(jìn)一步解釋本發(fā)明。

實(shí)例

實(shí)例1：陰道內(nèi)乙酸高那瑞林的生物可用性

材料和方法

動(dòng)物和處理

動(dòng)物為成年哺乳期荷斯坦牛(holstein cattle)。其處于第一和第三產(chǎn)次之間，最少為分娩后50天并且并未妊娠。這些動(dòng)物分組圈養(yǎng)在具有砂墊層的現(xiàn)代散養(yǎng)式畜舍乳品廠中且其每天產(chǎn)奶兩次。在研究開始之前，根據(jù)具有單向處理結(jié)構(gòu)的隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)，將動(dòng)物分配到四個(gè)處理組中的一組：根據(jù)500kg-834kg的體重范圍對(duì)其進(jìn)行分組。處理組1(T01)(“陽性對(duì)照”)(n＝4)通過肌肉內(nèi)(IM)投藥接受220μg乙酸高那瑞林(200μg當(dāng)量(“eq”)高那瑞林)的PBS溶液；處理組2(T02)陰道內(nèi)(IVg)接受呈粉末形式的與40mg檸檬酸混合的4406μg乙酸高那瑞林(4000μg-eq高那瑞林)；處理組3(T03)陰道內(nèi)接受壓縮成丸粒的4406μg乙酸高那瑞林以及40mg檸檬酸；處理組4(T04)陰道內(nèi)接受分散于蠟質(zhì)基質(zhì)(H-15)中的4406μg乙酸高那瑞林以及40mg檸檬酸。在經(jīng)過IACUC批準(zhǔn)的Zoetis動(dòng)物使用方案下投與全部處理。

調(diào)配物

處理組1由溶解于25mL磷酸鹽緩沖生理鹽水中的1.37mg乙酸高那瑞林組成。所得55μg/mL溶液與50μg/mL高那瑞林等效。通過0.22μm過濾器對(duì)這一溶液進(jìn)行滅菌。投與4mL這一溶液來實(shí)現(xiàn)200μg高那瑞林的總劑量。處理組2由與400mg檸檬酸混合的4406μg乙酸高那瑞林組成，并且隨后研磨以實(shí)現(xiàn)較小、較為均一的粒度。以與4000μg高那瑞林等效的松散粉末形式投與這一混合物。處理組3由與320mg檸檬酸、960mg乳糖、960mg微晶、160mg交聯(lián)聚維酮以及6mg硬脂酸鎂混合的4406μg乙酸高那瑞林組成。隨后研磨此混合物以實(shí)現(xiàn)較小、較為均一的粒度，并且將305mg混合物壓縮成丸粒形式以制成每個(gè)劑量。每個(gè)丸粒含有與4000μg高那瑞林等效的4406μg乙酸高那瑞林。處理組4由通過使4406μg乙酸高那瑞林與40mg檸檬酸混合而產(chǎn)生的栓劑組成。研磨混合物以實(shí)現(xiàn)較小、較為均一的粒度，且隨后將其分配到2mL塑料管中的在60℃下熔融的260mgH15中。對(duì)此懸浮液進(jìn)行渦旋以確保均質(zhì)性。隨后對(duì)其冷卻以形成含有4000μg高那瑞林的劑量當(dāng)量的固體栓劑。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在研究開始之前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢查以確保其在臨床上是健康的，不存在殘疾并且具有正常生殖道。篩選牛奶以確保體細(xì)胞計(jì)數(shù)低于750,000個(gè)細(xì)胞/毫升并且乳腺區(qū)域不存在乳腺炎。采集體重以使動(dòng)物隨機(jī)化到處理組。喂以用于泌乳的代表行業(yè)的基礎(chǔ)常規(guī)摻合飼料口糧并且將飲食說明記錄在研究數(shù)據(jù)中。隨意提供水。本研究開始之前并未對(duì)動(dòng)情加以同步。在同一天投與全部處理。以IM推注形式將處理組1投與到每只動(dòng)物的肩膀區(qū)域中。用改良的馬類動(dòng)物子宮內(nèi)吸量管以推注形式將處理組2投與到陰道中。用改良的山羊口服投丸器以推注形式將處理組3和4投與到陰道中。在給藥前和給藥后0.33、0.75、1、1.5、2、4、7、12以及24小時(shí)時(shí)采集血液樣品。從這些樣品中分離血漿并且加以處理以用于GnRH分析。

血漿GnRH

將血液采集到含有0.6mL 3mM桿菌肽充當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┑念A(yù)冷卻的K2EDTA試管中之后，通過倒置試管至少5次對(duì)樣品加以混合。隨后把樣品置放在冰上且在15分鐘采集內(nèi)在4℃下離心。隨后把0.6mL血漿添加到2.0mL甲醇中且渦旋樣品60秒。如先前所述，在-20℃下冷凍樣品且運(yùn)送到Endolytics有限責(zé)任公司以用于通過RIA加以分析(Nett,T.M.,A.M.Akbar,W.R.White,M.T.Hedlund以及G.D.Niswender.1973.《血清中的促性腺激素釋放激素(GnRH)的放射免疫分析(Radioimmunoassay for gonadotropin-releasing hormone(GnRH)in serum.)》《臨床內(nèi)分泌學(xué)與新陳代謝雜志(J.Clin.Endocrinol.Metab.)》36:880-885)。

結(jié)果

組平均血漿高那瑞林濃度

如表1中所展示，接受4400μg IVg劑量(T02、T03、T04；20×IM劑量)的動(dòng)物達(dá)到的組平均血漿高那瑞林濃度比接受0.22mg IM劑量(T01)的動(dòng)物高。在接受IVg劑量(T02、T03、T04)的處理組中，T04經(jīng)歷最高平均血漿濃度。給藥后T02和T04IVg投藥的平均高那瑞林濃度分別比IM T01投藥高12小時(shí)和7小時(shí)。從給藥后大約45分鐘直到給藥后7小時(shí)，T03IVg投藥的平均高那瑞林濃度高于T01的平均高那瑞林濃度。T04中的血漿高那瑞林濃度最高，隨后為T02，隨后分別為T03和T01(對(duì)于全部處理，n＝4)。處理組2、T03以及T04接受的劑量比投與到T01的劑量高20×。截至投與劑量后24小時(shí)，全部處理的血漿高那瑞林水平均低于定量限值。

表1.

T01：220μg乙酸高那瑞林的PBS溶液(200μg-eq高那瑞林)

T02：4400μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸(粉末)(4000μg-eq高那瑞林)

T03：4400μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸(丸粒)(4000μg-eq高那瑞林)

T04：4400μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(4000μg-eq高那瑞林)

BLQ-低于定量限值

組平均藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

如表2中所表明，如歸因于20×較高劑量所期望，接受4400μg IVg劑量(T02、T03、T04)的動(dòng)物達(dá)到的平均Cmax和和平均AUC(暴露量)比接受220μg IM劑量(T01)的動(dòng)物高。

最高平均Cmax通過T04(IVg)達(dá)到，其比T01IM劑量的Cmax高大約15×且呈現(xiàn)IM劑量(劑量標(biāo)準(zhǔn)化之后)的75％的相對(duì)Cmax。T02和T03的平均Cmax值分別比T01高大約9×和5×。作為組平均Cmax與IM Cmax的比的Cmax分別在T04中為最大的，隨后為T02、T03，且隨后為T01(對(duì)于全部處理，n＝4)。生物可用性(F)和作為組平均AUC與IM AUC的比的AUC分別在T02中為最大的，隨后為T04、T03，且隨后為T01。處理組2、T03以及T04接受的劑量比投與到T01的劑量高20×。

T02、T03以及T04的IVg生物可用性(相對(duì)于IM劑量)分別為92％、42％以及72％。IVg生物可用性在T02中為最大的，但在確定高那瑞林或其類似物的生物活性時(shí)，Cmax和Tmax可能為更加切合的。

T01的IM投藥產(chǎn)生比IVg處理組中的任一組的Tmax要早的Tmax(20min)。在IVg投藥中，T04在大約26分鐘時(shí)展現(xiàn)最早Tmax，而T02和T03在大約37和90分鐘時(shí)達(dá)到其相應(yīng)Tmax。

表2

T01：220μg乙酸高那瑞林的PBS溶液(200μg-eq高那瑞林)

T02：4400μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸(粉末)(4000μg-eq高那瑞林)

T03：4400μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸(丸粒)(4000μg-eq高那瑞林)

T04：4400μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(4000μg-eq高那瑞林)F＝相對(duì)于IM劑量的IVg生物可用性

實(shí)例2：陰道內(nèi)投與乙酸高那瑞林的劑量線性

材料和方法

動(dòng)物和處理

動(dòng)物為成年哺乳期荷斯坦牛。其處于第一和第三產(chǎn)次之間，最少為分娩后50天并且并未妊娠。這些動(dòng)物分組圈養(yǎng)在具有砂墊層的現(xiàn)代散養(yǎng)式畜舍乳品廠中且其每天產(chǎn)奶兩次。在研究開始之前，根據(jù)具有單向處理結(jié)構(gòu)的隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)，將動(dòng)物分配到四個(gè)處理組中的一組：根據(jù)518kg-782kg的體重范圍對(duì)其進(jìn)行分組。處理組1(“陽性對(duì)照”)(n＝4)通過肌肉內(nèi)(IM)投藥接受220μg乙酸高那瑞林(200μg-eq高那瑞林)的PBS溶液；處理組2陰道內(nèi)接受分散于蠟質(zhì)基質(zhì)(H-15)中的220μg乙酸高那瑞林(200μg-eq高那瑞林)以及40mg檸檬酸；處理組3陰道內(nèi)接受分散于蠟質(zhì)基質(zhì)(H-15)中的440μg乙酸高那瑞林(400μg-eq高那瑞林)以及40mg檸檬酸；處理組4陰道內(nèi)接受分散于蠟質(zhì)基質(zhì)(H-15)中的880μg乙酸高那瑞林(800μg-eq高那瑞林)以及40mg檸檬酸。在經(jīng)過IACUC批準(zhǔn)的Zoetis動(dòng)物使用方案下投與全部處理。

調(diào)配物

處理組1由溶解于25mL磷酸鹽緩沖生理鹽水中的1.37mg乙酸高那瑞林組成。所得55μg/mL溶液與50μg/mL高那瑞林等效。通過0.22μm過濾器對(duì)這一溶液進(jìn)行滅菌。投與4mL這一溶液來實(shí)現(xiàn)200μg高那瑞林的總劑量。處理組2到4由通過使220μg、440μg或880μg乙酸高那瑞林分別與40毫克檸檬酸混合而產(chǎn)生的栓劑組成。研磨混合物以實(shí)現(xiàn)較小、較為均一的粒度，且隨后將其分配到2mL塑料管中的在60℃下熔融的260mg Witepsol H15中。對(duì)此懸浮液進(jìn)行渦旋以確保均質(zhì)性。隨后對(duì)其冷卻以形成分別含有200μg、400μg或800μg高那瑞林的劑量當(dāng)量的固體栓劑。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在研究開始之前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢查以確保其是健康的，不存在殘疾并且具有正常生殖道。篩選牛奶以確保體細(xì)胞計(jì)數(shù)低于750,000個(gè)細(xì)胞/毫升并且乳腺區(qū)域不存在乳腺炎。采集體重以使動(dòng)物隨機(jī)化到處理組。喂以用于泌乳的代表行業(yè)的基礎(chǔ)常規(guī)摻合飼料口糧并且將飲食說明記錄在研究數(shù)據(jù)中。隨意提供水。本研究開始之前并未對(duì)動(dòng)情加以同步。在同一天投與全部處理。以IM推注形式將處理組1投與到每只動(dòng)物的肩膀區(qū)域中。用改良的山羊口服投丸器以推注形式將處理組2、3和4投與到陰道中。在給藥之前和給藥后0.167、0.33、0.75、1、1.5、2、4、7小時(shí)時(shí)采集血液樣品。分離血漿并且加以處理以用于GnRH分析。

血漿GnRH

將血液采集到含有0.6mL 3mM桿菌肽充當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┑念A(yù)冷卻的K2EDTA試管中之后，通過倒置試管至少5次對(duì)樣品加以混合。隨后把樣品置放在冰上且在15分鐘采集內(nèi)在4℃下離心。隨后把0.6mL血漿添加到2.0mL甲醇中且渦旋樣品60秒。如先前所述，在-20℃下冷凍樣品且運(yùn)送到Endolytics有限責(zé)任公司以用于通過RIA加以分析(Nett,T.M.,A.M.Akbar,W.R.White,M.T.Hedlund以及G.D.Niswender.1973.《血清中的促性腺激素釋放激素(GnRH)的放射免疫分析》.《臨床內(nèi)分泌學(xué)與新陳代謝雜志》36:880-885)。

結(jié)果

逆轉(zhuǎn)換組平均血漿高那瑞林濃度

如表3中所表明，接受440μg和880μg IVg劑量(分別為T03和T04)的動(dòng)物達(dá)到的最高組平均血漿高那瑞林濃度比接受220μg IM劑量(T01)的動(dòng)物高。除通過T01投藥達(dá)到的最高血漿濃度外，通過IVg處理(T02、T03以及T04)展現(xiàn)的最高血漿濃度隨后也達(dá)到(分別為0.75h與0.333h)。盡管T01和T02中的動(dòng)物已接受乙酸高那瑞林的當(dāng)量劑量，但針對(duì)IVg投藥途徑(T02)的血漿濃度水平從未達(dá)到和IM投藥(T01)之后所展現(xiàn)的血漿水平一樣。T04中的血漿高那瑞林濃度最高，隨后為T03，隨后分別為T01和T02(對(duì)于全部處理，n＝4)。截至劑量后4小時(shí)，全部處理的血漿高那瑞林水平均低于定量限值。

表3.

T01：220μg乙酸高那瑞林的PBS溶液(200μg-eq高那瑞林)

T02：220μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(200μg-eq高那瑞林)

T03：440μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(400μg-eq高那瑞林)

T04：880μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(800μg-eq高那瑞林)

BLQ-低于定量限值(<1.9pg/mL)

組平均藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

如表4中所表明，接受440μg和880μg IVg劑量(T03、T04)的動(dòng)物達(dá)到的平均Cmax和AUC水平比接受220μg IM(T01)或IVg(T02)劑量的動(dòng)物高。在接受IVg投藥的那些動(dòng)物中，最高平均Cmax和AUC通過T04達(dá)到，其中Cmax比T01IM投藥的Cmax高大約1.8倍并且AUC高大約2.3倍。處理組3伴隨有與T01的平均Cmax和AUC大致相等的平均Cmax和AUC。與220μg IM劑量(T01)等效的IVg投藥(T02)產(chǎn)生分別呈IM劑量的大約43％和49％的Cmax和AUC。正如期望，在投藥后大約20分鐘時(shí)，高那瑞林的IM投藥(T01)產(chǎn)生比任意其它處理組的Tmax要早的Tmax。在IVg投藥中，T04在大約36分鐘時(shí)展現(xiàn)第二最早Tmax，而T02，且隨后T03在大約45分鐘時(shí)達(dá)到其相應(yīng)Tmax。

表4

T01：220μg乙酸高那瑞林的PBS溶液(200μg-eq高那瑞林)

T02：220μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(200μg-eq高那瑞林)

T03：440μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(400μg-eq高那瑞林)

T04：880μg乙酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(800μg-eq高那瑞林)

劑量比例性

如通過圖1A和1B所表明，當(dāng)陰道內(nèi)投與時(shí)，乙酸高那瑞林以及檸檬酸和Witepsol H15的調(diào)配物將提供與劑量成比例的Cmax和AUC。此比例性允許對(duì)為實(shí)現(xiàn)與IM投與乙酸高那瑞林之后所觀察到的高那瑞林血漿濃度相類似的血漿濃度所需的IVg劑量進(jìn)行估算。失擬測(cè)試產(chǎn)生呈0.6912(Cmax)和0.9686(AUC)的p值，其在0.1水平下均為不顯著的。

實(shí)例3.陰道內(nèi)投與鹽酸高那瑞林的劑量線性

材料和方法

動(dòng)物和處理

動(dòng)物為成年哺乳期荷斯坦牛。其處于第一和第三產(chǎn)次之間，最少為分娩后50天并且并未妊娠。這些動(dòng)物分組圈養(yǎng)在具有砂墊層的現(xiàn)代散養(yǎng)式畜舍乳品廠中且其每天產(chǎn)奶兩次。在研究開始之前，根據(jù)具有單向處理結(jié)構(gòu)的隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)，將動(dòng)物分配到四個(gè)處理組中的一組：其根據(jù)539kg-781kg的體重范圍進(jìn)行分組。處理組1(T01)(“陽性對(duì)照”)(n＝4)通過肌肉內(nèi)(IM)投藥接受212.3μg鹽酸高那瑞林(200μg-eq高那瑞林)的PBS溶液；處理組2(T02)陰道內(nèi)接受分散于蠟質(zhì)基質(zhì)(H-15)中的212.3μg鹽酸高那瑞林(200μg-eq高那瑞林)以及40mg檸檬酸；處理組3(T03)陰道內(nèi)接受分散于蠟質(zhì)基質(zhì)(H-15)中的424.6μg鹽酸高那瑞林(400μg-eq高那瑞林)以及40mg檸檬酸；處理組4(T04)陰道內(nèi)接受分散于蠟質(zhì)基質(zhì)(H-15)中的849.2μg鹽酸高那瑞林(800μg-eq高那瑞林)以及40mg檸檬酸。在經(jīng)過IACUC批準(zhǔn)的Zoetis動(dòng)物使用方案下進(jìn)行全部處理。

調(diào)配物

T01由溶解于25mL磷酸鹽緩沖生理鹽水中的1.37mg鹽酸高那瑞林組成。所得53.1μg/mL溶液與50μg/mL高那瑞林等效。通過0.22μm過濾器對(duì)這一溶液進(jìn)行滅菌。投與4mL這一溶液來實(shí)現(xiàn)200μg高那瑞林的總劑量。T02、T03以及T04由通過使212.3μg、424.6μg或849.2μg鹽酸高那瑞林分別與40mg檸檬酸混合而產(chǎn)生的栓劑組成。研磨混合物以實(shí)現(xiàn)較小、較為均一的粒度，且隨后將其分配到2mL塑料管中的在60℃下熔融的260mg Witepsol H15中。對(duì)此懸浮液進(jìn)行渦旋以確保均質(zhì)性。隨后對(duì)其冷卻以形成分別含有200μg、400μg或800μg高那瑞林的劑量當(dāng)量的固體栓劑。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在研究開始之前對(duì)動(dòng)物進(jìn)行檢查以確保其是健康的，不存在殘疾并且具有正常生殖道。篩選牛奶以確保體細(xì)胞計(jì)數(shù)低于750,000個(gè)細(xì)胞/毫升并且乳腺區(qū)域不存在乳腺炎。采集體重以使動(dòng)物隨機(jī)化到處理組。喂以用于泌乳的代表行業(yè)的基礎(chǔ)常規(guī)摻合飼料口糧并且將飲食說明記錄在研究數(shù)據(jù)中。隨意提供水。本研究開始之前并未對(duì)動(dòng)情加以同步。在同一天投與全部處理。以IM推注形式將T01投與到每只動(dòng)物的肩膀區(qū)域中。用改良的山羊口服投丸器以推注形式將T02、T03以及T04投與到陰道中。在給藥之前和給藥后0.167、0.33、0.75、1、1.5、2、4、7小時(shí)時(shí)采集血液樣品。分離血漿并且加以處理以用于GnRH分析。

血漿GnRH

將血液采集到含有0.6mL 3mM桿菌肽充當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿┑念A(yù)冷卻的K2EDTA試管中之后，通過倒置試管至少5次對(duì)樣品加以混合。隨后把樣品置放在冰上且在15分鐘采集內(nèi)在4℃下離心。隨后把0.6mL血漿添加到2.0mL甲醇中且渦旋樣品60秒。如先前所述，在-20℃下冷凍樣品且運(yùn)送到Endolytics有限責(zé)任公司以用于通過RIA加以分析(Nett,T.M.,A.M.Akbar,W.R.White,M.T.Hedlund以及G.D.Niswender.1973.《血清中的促性腺激素釋放激素(GnRH)的放射免疫分析》.《臨床內(nèi)分泌學(xué)與新陳代謝雜志》36:880-885)。

結(jié)果

逆轉(zhuǎn)換組平均血漿高那瑞林濃度

如表5中所表明，接受849.2μg IVg劑量(T04)的動(dòng)物達(dá)到最高組平均血漿高那瑞林濃度，其為接受212.3μg IM劑量(T01)的動(dòng)物的組平均血漿高那瑞林濃度的大約79％。通過T02和T03展現(xiàn)的最高血漿濃度分別為T01的大約20％和46％。盡管T01和T02中的動(dòng)物已接受鹽酸高那瑞林的當(dāng)量劑量，但其中經(jīng)IVg投與劑量(T02)的那些動(dòng)物的濃度從未達(dá)到其中經(jīng)IM投與劑量(T01)的那些動(dòng)物的濃度。除通過IM投藥途徑(T01)接受鹽酸高那瑞林的那些動(dòng)物外，接受鹽酸高那瑞林的IVg劑量(T02、T03以及T04)的全部處理隨后也展現(xiàn)最高血漿高那瑞林濃度。截至劑量后4小時(shí)，全部處理的血漿高那瑞林水平均低于定量限值。

表5

T01：212.3μg鹽酸高那瑞林的PBS溶液(200μg-eq高那瑞林)

T02：212.3μg鹽酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(200μg-eq高那瑞林)

T03：424.6μg鹽酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(400μg-eq高那瑞林)

T04：849.2μg鹽酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(800μg-eq高那瑞林)

BLQ-低于定量限值(<1.9pg/mL)

組平均藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)

如表6中所表明，接受849.2μg IVg劑量(T04)的動(dòng)物達(dá)到的平均AUC水平比接受212.3μg IM(T01)或IVg(T02)劑量的動(dòng)物高。在接受IVg投藥的那些動(dòng)物中，最高平均Cmax和AUC通過T04達(dá)到，其中Cmax為T01IM投藥的Cmax的大約85％并且AUC高大約1.5倍。T03伴隨有呈T01的平均Cmax和AUC大約一半的平均Cmax和AUC。與212.3μg IM劑量(T01)等效的IVg投藥(T02)產(chǎn)生分別為IM劑量的大約21％和32％的Cmax和AUC。正如期望，在投藥后大約13分鐘時(shí)，高那瑞林的IM投藥(T01)產(chǎn)生比任意其他處理組的Tmax要早的Tmax。在IVg投藥中，T02在大約32分鐘時(shí)展現(xiàn)第二最早Tmax，而T03和T04在大約39分鐘時(shí)達(dá)到其相應(yīng)Tmax。

表6

T01：212.3μg鹽酸高那瑞林的PBS溶液(200μg-eq高那瑞林)

T02：212.3μg鹽酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(200μg-eq高那瑞林)

T03：424.6μg鹽酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(400μg-eq高那瑞林)

T04：849.2μg鹽酸高那瑞林+40mg檸檬酸的蠟質(zhì)溶液(栓劑)(800μg-eq高那瑞林)

劑量比例性

如通過圖2a和2b所表明，當(dāng)陰道內(nèi)投與時(shí)，鹽酸高那瑞林以及檸檬酸和Witepsol H15的調(diào)配物將提供與劑量成比例的Cmax和AUC。此比例性允許對(duì)為實(shí)現(xiàn)與IM投與鹽酸高那瑞林之后所觀察到的高那瑞林血漿濃度相類似的血漿濃度所需的IVg劑量進(jìn)行估算。失擬測(cè)試產(chǎn)生呈0.8379(Cmax)和0.9616(AUC)的p值，其在0.1水平下均為不顯著的。