本發(fā)明涉及原位組織工程領(lǐng)域，更具體地涉及旨在提供可用作例如血管、輸尿管和/或血液透析過程中的插管部位的組織結(jié)構(gòu)的原位組織工程。

背景技術(shù)：

在動(dòng)脈旁路手術(shù)和血液透析血管通路中，需要血管移植物。然而，由于先前所得或先前存在的血管疾病，自體血管并不總是可用的，并且由于感染、狹窄和血栓形成，合成血管通常具有差的通暢率。

因此，最近的方法旨在例如通過體外方法、使用隨時(shí)間被宿主細(xì)胞和基質(zhì)替代的支架或通過原位血管組織工程提供完全生物血管。

原位血管組織工程在20世紀(jì)70年代首次提出，使用所謂的火花芯軸(Sparks mandrill)來產(chǎn)生圍繞多孔滌綸網(wǎng)形成的組織囊(Sparks 1969Ann Thorac Surg Aug；8(2):104-13；Sparks 1970Ann Surg Nov；172(5):787-94)。將這個(gè)芯軸(mandrill)在肌肉中植入了幾個(gè)月。然而，移植物由于血栓形成和動(dòng)脈瘤形成而大部分失效(Hallin 1975Am Surg Sep；41(9):550-4；Hallin and Sweetman 1976Am J Surg Aug；132(2):221-3；Roberts and Hopkinson1977Nov 5；2(6096):1190-1)。

其他小組也研究了原位組織工程方法，但該方法使用腹膜(Campbell et al 1999Circ Res Dec 3；85(12):1173-8)或皮下袋(Sakai et al 2009J of Biomedical Materials Research Part B:Applied Biomaterials:Vol90B(1):412-410；Watanabe et al 2011J of Biomedical Materials Research B:Applied Biomaterials Vol90B(1):120-126)作為生物反應(yīng)器。然而，腹膜內(nèi)植入和隨后的收集是相當(dāng)有侵入性的，并引起粘連形成的風(fēng)險(xiǎn)，這可能阻礙成功的臨床實(shí)施。此外，并非所有植入物都被包封了(Campbell et al 1999CircRes Dec 3；85(12):1173-8)，因此必須植入若干裝置。Sakai和Watanabe的方法也留下了優(yōu)化例如植入物和所產(chǎn)生組織的特性的空間。本發(fā)明規(guī)避和/或解決了與早期方法相關(guān)的一些問題，且目的在于改進(jìn)原位組織工程(特別是原位血管組織工程)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種不同的方法，其中使用人或動(dòng)物體的皮下空間作為生物反應(yīng)器，在原位快速產(chǎn)生完全生物組織工程化血管。使用皮下空間作為生物反應(yīng)器具有容易實(shí)現(xiàn)以及存在組織工程化血管所需的大多數(shù)組分(例如膠原、彈性蛋白、成纖維細(xì)胞和大血管網(wǎng)絡(luò))的優(yōu)點(diǎn)。此外，在一些臨床環(huán)境例如血液透析血管通路中，就是需要血管移植物的位置。

此概念利用針對(duì)合成模具(例如圓柱形聚合物桿)的異物反應(yīng)，所述聚合物桿將引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致其被組織結(jié)構(gòu)包封。這種管狀組織結(jié)構(gòu)可以形成組織工程化血管的基礎(chǔ)。

本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)節(jié)植入材料特性，即材料類型、表面改性和生物活性涂層，可以改善皮下植入的合成桿周圍的組織結(jié)構(gòu)形成。與旨在引起盡可能少的組織反應(yīng)的大多數(shù)研究相比，本發(fā)明的原位組織工程方法的目的在于故意引起顯著的組織反應(yīng)，這對(duì)細(xì)胞類型、基質(zhì)形成、所產(chǎn)生組織的排列和分布有特定要求。

此外，本發(fā)明人克服了關(guān)于制造具有合格特性、用于人或更大動(dòng)物(>50kg)、由聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)共聚物組成的大直徑桿(例如30-100mm)的問題。使用由兩個(gè)半部(halves)組成的模腔設(shè)計(jì)新的壓模原理，所述模腔的兩個(gè)半部可以分離以使桿無損移除。

詳細(xì)描述

本發(fā)明提供了一種裝置，其(至少部分或全部)采用直徑為3-20mm的桿的形狀，其中裝置的表面包括能夠引起異物反應(yīng)的緩慢生物降解的材料或不可生物降解材料，其含量為例如以裝置的重量計(jì)，至少0.5wt％、5wt％、10wt％或20wt％。外層的表面，即裝置的(外)表面的均方根粗糙度(Rq)為至少100nm，優(yōu)選至少125nm，更優(yōu)選至少150nm。不排除Rq可以為至多300nm、500nm、1000nm、2000nm、5000nm或甚至更多。

如即將闡明的，表面材料不應(yīng)當(dāng)快速降解，并且當(dāng)被皮下插入人體或動(dòng)物體內(nèi)時(shí)能夠引起異物反應(yīng)，即在將裝置皮下插入人或動(dòng)物體之后例如6周內(nèi)，組織結(jié)構(gòu)將包封該裝置。在本發(fā)明中，緩慢生物降解或不可生物降解意指當(dāng)存在于人或動(dòng)物體的皮下空間時(shí)，在例如6周的時(shí)間內(nèi)，少于10wt％的材料隨時(shí)間降解。此外，裝置可以完全由所述材料組成，或者只有裝置的外層可以包括所述緩慢生物降解的材料或不可生物降解的材料。例如，外層可以包括占所述外層總重量的至少50wt％、70wt％、80wt％、90wt％、95wt％的緩慢生物降解的材料或不可生物降解的材料。在本發(fā)明中，術(shù)語“層”不旨在表示必須與裝置的內(nèi)部具有不同組成或以其他方式與裝置的內(nèi)部明顯區(qū)別開的部分。該術(shù)語僅指裝置的外面(外周)部分，比如具有1-20mm的厚度。例如，外層可以形成整個(gè)裝置，但是也可以預(yù)見裝置的芯是中空的或具有不同組成，其中所述芯被外層包圍。在特定實(shí)施方案中，裝置包括比PEOT/PBT 300/55/45(稍后描述)更剛性(更不柔性)的內(nèi)芯(例如，具有1-20mm的直徑)以減少裝置在使用過程中斷裂的機(jī)會(huì)。

均方根粗糙度(Rq)可以使用例如PicoScan Controller 2500–Quadrexed Multimode(美國(guó)Molecular Imaging公司)經(jīng)由原子力顯微鏡(AFM)測(cè)定，掃描尺寸為(約)100μm²(10×10μm)并使用模式。優(yōu)選地，使用Nanoscope軟件(版本：2002，Digital Instrument Veeco)通過調(diào)整不同的參數(shù)(即積分增益和比例增益)處理圖像以優(yōu)化表面掃描。

技術(shù)人員清楚，粗糙度分析可包括Ra、Rq和Rmax的測(cè)量(Gadelmawla et al 2002；Journal of Materials Processing Technology 123:133–145)。Ra是最普遍使用的。Ra是算術(shù)平均高度參數(shù)或中心線平均值，且被定義為“在一個(gè)采樣長(zhǎng)度上相對(duì)于平均線的粗糙度不規(guī)則性的平均絕對(duì)偏差。它沿著評(píng)估長(zhǎng)度將所有峰和谷(孔)進(jìn)行平均，給出表面的大致描述，并中和特異點(diǎn)。Rq是對(duì)應(yīng)于Ra的均方根粗糙度參數(shù)。Rq代表“表面高度分布的標(biāo)準(zhǔn)偏差”，并且對(duì)偏離平均線的大偏差比Ra更敏感：

Rq可以使用掃描探針圖像處理器和SPIPTM(版本4.2.2.0，或更新版本)軟件來確定，其中可以分析即測(cè)量圖像的表面粗糙度，例如，通過點(diǎn)擊“分析粗糙度”來測(cè)量。如上所述，可以在100μm²的表面積上進(jìn)行粗糙度測(cè)量。有關(guān)Rq測(cè)量的更多細(xì)節(jié)，請(qǐng)參見Gadelmawla et al 2002；Journal of Materials Processing Technology 123:133–145。

此外，在本發(fā)明內(nèi)，桿(形狀)意指(大致為)圓柱體(形狀)，其中盡管外周也可為橢圓形或另一彎曲形狀，但優(yōu)選圓形。而且，盡管外周形狀優(yōu)選對(duì)稱，但外周形狀不一定必須對(duì)稱?？梢赃M(jìn)一步將桿(形狀)在任何地方沿其縱向方向彎曲(例如具有S形)，和/或一個(gè)或兩個(gè)縱向端部的邊緣為圓形使得至少部分邊緣(邊)棱角較少。此外，桿形狀可以包括在一個(gè)或兩個(gè)端面中的凹部(或凹口)。還將闡明的是，裝置作為一個(gè)整體不一定必須具有桿形狀，只要裝置的一部分具有桿形狀即可?？梢詾槊總€(gè)患者制作定制桿，所述定制桿具有針對(duì)所需應(yīng)用的形狀(即長(zhǎng)度和直徑)。桿的直徑?jīng)Q定了要獲得的組織結(jié)構(gòu)的內(nèi)徑。這樣組織結(jié)構(gòu)可以與患者的原生血管吻合。

優(yōu)選地，能夠引發(fā)異物反應(yīng)的(表面)材料是(或包含一種或多種)聚合物，例如聚酯、聚碳酸酯、聚原酸酯、聚磷酸酯、聚酐、聚磷腈、聚羥基鏈烷酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯富馬酸酯、聚對(duì)苯二甲酸酯或上述一種或多種的共聚物；或基于聚環(huán)氧烷和對(duì)苯二甲酸酯的共聚物，或更優(yōu)選聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，后者優(yōu)選由式A/B/C表示，其中

-A是指在共聚物反應(yīng)中使用的初始聚乙二醇(PEG)的(平均)分子量，其為200-400，優(yōu)選275-325，更優(yōu)選290-310；

-B是指共聚物中聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)的重量百分比(wt％)，其為40-70，優(yōu)選50-60，更優(yōu)選53-57；以及

-C是指共聚物中聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)的重量百分比，其為30-60，優(yōu)選40-50，更優(yōu)選43-47。

最優(yōu)選的PEOT/PBT嵌段共聚物是300/55/45(從荷蘭格羅寧根PolyVation B.V.獲得)。此外，材料優(yōu)選不包含硅酮和/或(聚)丙烯酸酯。

該裝置可以具有30-800mm的長(zhǎng)度和/或2-100mm或3-20mm的直徑，優(yōu)選40-300mm或50-150mm的長(zhǎng)度和/或6-10mm的直徑。這些尺寸的優(yōu)點(diǎn)是提供的組織結(jié)構(gòu)將具有與人類自然血管相似的尺寸。

如前所述，可以根據(jù)其粗糙度(Rq)充分描述裝置的外表面，因?yàn)榇植诙仁窃谔囟ǖ募?xì)胞類型組成、基質(zhì)形成、所產(chǎn)生組織的排列和分布的情況下引起所需異物反應(yīng)響應(yīng)的決定因素。然而，除了粗糙度(Rq)之外，裝置的(外層)表面可以進(jìn)一步通過其多孔結(jié)構(gòu)來表征。所述表面可以具有能夠如下定義的多孔結(jié)構(gòu)：

-孔密度為每100μm² 10-80個(gè)孔，優(yōu)選20-60個(gè)孔，更優(yōu)選25-50個(gè)孔，甚至更優(yōu)選每100μm² 35-45個(gè)孔；

-平均孔徑為0.4-1.8μm，優(yōu)選為0.6-1.3μm，更優(yōu)選為0.8-1.0μm，甚至更優(yōu)選為0.85-0.95μm。

孔密度可以通過對(duì)從各自表面隨機(jī)選擇的(至少)9個(gè)25000μm²(放大率500×)的部分中的孔數(shù)(表面中的微小的谷/孔)取平均值來測(cè)定，正如基于掃描電子顯微鏡圖像(例如，使用Philips XL30ESEM-FEG SEM)所測(cè)定的那樣。優(yōu)選地，對(duì)具有至少0.025μm²的直徑的孔進(jìn)行計(jì)數(shù)。

類似地，平均孔徑可以通過從對(duì)各自表面隨機(jī)選擇的(至少)9個(gè)25000μm²(放大率500×)的部分中找到的所有孔的直徑取平均值來確定(例如，通過SEM)。對(duì)于孔密度和孔徑，可以使用ImageJ 1.46r(或更新版本)分析圖像以提供孔尺寸測(cè)量，優(yōu)選通過應(yīng)用閾值并進(jìn)一步反轉(zhuǎn)圖像從而僅測(cè)量孔，其中比例尺線用作參照。優(yōu)選地，平均直徑為具有至少0.025μm直徑的孔的平均直徑。

此外，本發(fā)明的裝置可以具有(外層)表面，該表面的潤(rùn)濕性特征在于根據(jù)捕泡法測(cè)定的接觸角為至少75°，優(yōu)選至少80°，最優(yōu)選至少90°。捕泡法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，且涉及使用液滴形狀分析測(cè)量2μL水滴與表面之間的接觸角(參見實(shí)施例2)。

根據(jù)本發(fā)明將顯而易見的是，所述裝置(外層)表面所需的均方根粗糙度(Rq)、潤(rùn)濕性和/或孔可通過化學(xué)蝕刻獲得，優(yōu)選通過將所述裝置表面暴露于鹵化碳溶劑或有機(jī)溶劑(如氯仿和/或二氯甲烷)以獲得所需特性，例如將裝置浸入所述溶劑中。技術(shù)人員將清楚，裝置外表面的至少一部分，不一定是整個(gè)表面，應(yīng)當(dāng)具有所述的Rq、潤(rùn)濕性和/或孔結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及一種裝置，其包括在一個(gè)或兩個(gè)縱向端部的30mm內(nèi)、優(yōu)選10mm內(nèi)的凹部。優(yōu)選地，裝置的一個(gè)或兩個(gè)端面包括凹部(例如參見圖2B)。盡管這樣的凹部最初作為制造誤差出現(xiàn)，但是我們發(fā)現(xiàn)其可以有利地用于將裝置縫合至裝置所插入的皮下空間的(周圍)組織，以避免裝置的遷移。如在實(shí)施例1中可以看到的，在沒有縫合裝置的情況下，可能發(fā)生裝置遷移并且在收獲時(shí)裝置不再在原位，即不再在裝置所插入的皮下空間內(nèi)。

換言之，所述凹部可用于縫合裝置使得裝置在預(yù)期的時(shí)間段停留在預(yù)期的位置。例如，針可以插入到凹部中并且容易地僅穿入裝置直徑的一部分。在沒有凹部的情況下，所述針將必須穿入整個(gè)直徑，或者穿入靠近裝置邊緣的部分，這可能造成不期望的裝置損壞。

此外或可選地，裝置的一個(gè)或兩個(gè)縱向端部處的邊緣(邊)可以是圓形的，例如使得邊緣(邊)的至少一部分沒有棱角或棱角較少(參見例如圖2A)。當(dāng)然，在這方面圓形不是指邊緣的圓狀或橢圓狀外周形狀，而是指從裝置的一個(gè)或兩個(gè)端面(基部)到其縱向表面的圓形過渡。這可以通過相應(yīng)地調(diào)整生產(chǎn)該裝置的方法中使用的模腔的桿形狀來實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以這種方式可以防止或減少患者褥瘡潰瘍的發(fā)生，并且可以減少裝置從患者身體自然擠出的可能性。

在任選地可與前述實(shí)施方案組合的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，裝置在一個(gè)或兩個(gè)縱向端部(沿其縱向方向)的50mm以內(nèi)彎曲，或優(yōu)選40mm以內(nèi)、30mm以內(nèi)，或更優(yōu)選20mm以內(nèi)或10mm以內(nèi)彎曲，優(yōu)選其中該裝置具有S形(沿縱向方向)，這意味著彎曲方向(基本)相反。當(dāng)然，這可以通過調(diào)整生產(chǎn)該裝置的方法中使用的模腔的桿形狀來實(shí)現(xiàn)。所述彎曲和/或S形將導(dǎo)致具有類似形狀的組織結(jié)構(gòu)，該具有類似形狀的組織結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)為當(dāng)用于血液透析手術(shù)中的血管通路時(shí)，其可以更容易和牢固地連接到患者的動(dòng)脈和/或靜脈。

準(zhǔn)備血管通路是開始血液透析之前的重要一步。血管通路是在透析期間血液被移除并返回的身體部位，即插管部位。為了最大化在血液透析治療期間清潔的血液的量，血管通路應(yīng)當(dāng)允許每時(shí)間單位內(nèi)的高血流體積。這可以通過使用本發(fā)明的用于將動(dòng)脈連接到靜脈的組織結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。S形組織結(jié)構(gòu)是有利的，因?yàn)榻M織結(jié)構(gòu)的兩個(gè)縱向端部的邊可以更加容易且牢固地連接到動(dòng)脈和靜脈，如圖10所示。這防止組織結(jié)構(gòu)從動(dòng)脈和/或靜脈松動(dòng)。

本發(fā)明的裝置還可以任選地至少部分地涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白例如膠原和/或生長(zhǎng)因子(例如TGF-β)，以便當(dāng)裝置被皮下插入人或動(dòng)物體中時(shí)進(jìn)一步調(diào)節(jié)組織反應(yīng)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚，本發(fā)明的裝置適合于皮下植入。優(yōu)選地，該裝置不包括毒性物質(zhì)，即導(dǎo)致急性或遲發(fā)性疾病的物質(zhì)，或者已知導(dǎo)致這些疾病的患病率增加至少10％的物質(zhì)。同時(shí)或可選地，當(dāng)將該裝置皮下插入人體或動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，該裝置能夠引起異物反應(yīng)，即當(dāng)該裝置皮下插入人或動(dòng)物體內(nèi)例如1-6周時(shí)，其將被組織結(jié)構(gòu)包封。

雖然本發(fā)明特別關(guān)注(至少部分)呈桿形狀的裝置，但是其它形狀也是可能的，例如片形(例如1mm、2mm、3mm、4mm或5mm厚)、球形或其它形狀，使得裝置在皮下空間中的植入產(chǎn)生具有所需形狀的組織結(jié)構(gòu)，例如類似于待替換的患者的(患病的)中空器官的中空組織結(jié)構(gòu)，所述待替換的患者的(患病的)中空器官例如血管、輸尿管、膀胱等。

本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)該裝置的方法，特別是具有特定表面粗糙度(Rq)的桿形狀的裝置。該方法包括以下步驟：

a)提供模塑設(shè)備，其包括：

-模腔，其至少部分地呈至少一個(gè)桿的形狀，所述桿的直徑為3-20mm，其中所述桿形狀由至少兩個(gè)模具部件(的U形內(nèi)表面)限定；

b)任選地通過使用壓制裝置，使流體(例如熔融的、液體的)聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)共聚物填充至少一個(gè)桿形狀的模腔的至少一部分；

c)使共聚物固化；

d)將所述至少兩個(gè)模具部件與固化的共聚物分離以獲得至少一個(gè)直徑為3-20mm的桿形狀裝置；

e)將所述至少一個(gè)獲得的裝置暴露于氯仿和/或二氯甲烷5-15秒以獲得至少一個(gè)直徑為3-20mm的桿形狀裝置，其中所述裝置包括聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，并且其中所述裝置的外表面的均方根粗糙度(Rq)為至少100nm，優(yōu)選至少150nm，甚至更優(yōu)選至少175nm，最優(yōu)選至少180nm。

在步驟a)中，提供模塑設(shè)備，例如其可以是壓縮模塑設(shè)備，如實(shí)施例3和圖1中的壓縮模塑設(shè)備。模塑可以被視為使用稱為模具的剛性框架來使液體的或柔軟的原材料成型。與此相應(yīng)，本發(fā)明的模塑設(shè)備具有模腔，該模腔至少部分地具有該方法的產(chǎn)品的形狀，即直徑為3-20mm，優(yōu)選為4-15mm，更優(yōu)選為6mm-10mm的至少一個(gè)桿形狀。

從圖1中可以看出，模腔可以包括多個(gè)桿形狀的子腔，例如1-10、1-20或10-100個(gè)，或者圖1的實(shí)施例中的恰好10個(gè)。這些桿形狀的子腔可以連接到腔室，該腔室可用于提供模塑材料或在其中存儲(chǔ)模塑材料，隨后允許模塑材料由腔室流入或壓入桿形狀的子腔中，任選地通過使用與腔室相適的諸如沖頭的壓制裝置。通過在設(shè)有液體或可模塑的模塑材料的腔室內(nèi)沿著桿形狀空腔的方向移動(dòng)沖頭，所述空腔將填充有模塑材料。

模腔的至少一個(gè)桿形狀由至少兩個(gè)(優(yōu)選剛好兩個(gè))模具部件的U形內(nèi)表面限定。換言之，所述模具部件的這些內(nèi)表面至少部分地遵循(follow)桿形狀的外周，優(yōu)選地兩個(gè)模具部件各自覆蓋外周的40-60％，更優(yōu)選地約50％。桿的縱向端部不需要由模具部件的內(nèi)表面限定，即桿形狀的縱向端部可以終止于(另一個(gè))子腔中或可以是開放的。

在步驟b)中，允許流體聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)共聚物(PEOT/PBT，從荷蘭格羅寧根PolyVation B.V.獲得)填充至少一個(gè)桿形狀的模腔的至少一部分。這可以通過例如加熱共聚物到至少高于其熔化溫度的溫度以獲得流體可模塑共聚物，然后使流體可模塑共聚物填充至少一個(gè)桿形狀的模腔來完成，任選地通過使用諸如沖頭的壓制裝置來進(jìn)行上述操作。使用壓制裝置具有減少最終產(chǎn)品中氣泡出現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)。

優(yōu)選地，聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)共聚物由式A/B/C表示，其中

-A是指在共聚物反應(yīng)中使用的初始聚乙二醇(PEG)的(平均)分子量，其為200-400，優(yōu)選275-325，更優(yōu)選290-310；

-B是指共聚物中聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)的重量百分比，其為40-70，優(yōu)選50-60，更優(yōu)選53-57；以及

-C是指共聚物中聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)的重量百分比，其為30-60，優(yōu)選40-50，更優(yōu)選43-47。

最優(yōu)選的PEOT/PBT嵌段共聚物是300/55/45(從荷蘭格羅寧根PolyVation B.V.獲得)。

在步驟c)中，使共聚物在模腔內(nèi)固化。這可以通過使共聚物冷卻至低于其熔化溫度的溫度來進(jìn)行。

在步驟d)中，將至少兩個(gè)模具部件與固化的共聚物分離以獲得至少一個(gè)桿形狀的裝置。進(jìn)一步優(yōu)選的是所述至少兩個(gè)模具部件不用于將模塑材料壓至模腔中和/或在步驟d)之前不分離所述至少兩個(gè)模具部件，因?yàn)檫@可以使用沖頭來完成。該裝置可以連接到另外的固化共聚物，該固化共聚物不一定是桿形的。

使用至少兩個(gè)模具部件(每個(gè)都具有U形內(nèi)表面)形成至少一個(gè)桿形狀的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是其允許移除至少一個(gè)裝置而不對(duì)其造成損壞。如果桿形的腔是固定的，裝置只能通過從其一個(gè)端部拉動(dòng)或按壓來移除，那么損壞所述裝置的可能性會(huì)更大。

在步驟e)中，將至少一個(gè)獲得的裝置暴露于鹵化碳或有機(jī)溶劑優(yōu)選氯仿和/或二氯甲烷中，以上操作以獲得所需特性(例如Rq)的方式進(jìn)行和/或持續(xù)一段時(shí)間以獲得所需特性(例如Rq)。這可以通過將裝置浸漬、浸沒或沉浸在氯仿和/或二氯甲烷中指定的時(shí)間來進(jìn)行。這樣將獲得具有所需表面特性和直徑的桿形狀的至少一個(gè)裝置，其中當(dāng)皮下插入時(shí)，該裝置能夠引起異物反應(yīng)。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述裝置完全由PEOT/PBT嵌段共聚物組成，或者包含相對(duì)于裝置總重量至少70wt％、80wt％、90wt％、95wt％，甚至99wt％的所述材料。裝置的外表面具有至少100nm的均方根粗糙度(Rq)，優(yōu)選至少125nm，更優(yōu)選至少150nm，甚至更優(yōu)選至少175nm，最優(yōu)選至少180nm，和/或至多300nm、1000nm或3000nm的均方根粗糙度(Rq)。

該方法允許生產(chǎn)至少一個(gè)裝置，例如桿狀合成模具，當(dāng)其插入人或動(dòng)物體的皮下空間1-6周時(shí)，將引起異物(或炎癥)反應(yīng)，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)包封模具。該組織結(jié)構(gòu)可以形成組織工程化血管的基礎(chǔ)。

本發(fā)明還提供了一種用于提供組織結(jié)構(gòu)的方法，其中所述方法包括以下步驟：

a)將本發(fā)明的裝置插入人或動(dòng)物體的皮下空間中1-6周，優(yōu)選2-4周的時(shí)間，以在裝置上形成組織結(jié)構(gòu)；

b)優(yōu)選從皮下空間移除裝置以及任選地在其上形成的組織結(jié)構(gòu)?？稍趶钠は驴臻g移除之前或之后分離裝置和組織結(jié)構(gòu)；

c)優(yōu)選地，用生物可降解片材覆蓋所述組織結(jié)構(gòu)；

d)優(yōu)選地，將組織結(jié)構(gòu)連接到靜脈、動(dòng)脈和/或人工腎(該步驟可以在步驟c)之前或之后)。

例如，步驟a)中，例如在上肢(上臂或前臂)中，形成約1cm的小切口后可形成縱向皮下袋，并且裝置可插入所述袋中。可以閉合切口以防止感染，僅1-6周或2-4周后，可以通過例如制作一個(gè)切口來制作通向皮下袋的通路。然后，可以移除裝置和任選地在其上形成的任何組織結(jié)構(gòu)(步驟b)。因此，組織結(jié)構(gòu)可能(原位)保留在皮下空間中，然后可以將組織結(jié)構(gòu)的一端連接到例如動(dòng)脈，另一端連接到例如靜脈。

還提供了通過該方法獲得的組織結(jié)構(gòu)。

類似地，本發(fā)明提供了通過手術(shù)或療法對(duì)人或動(dòng)物體進(jìn)行治療中使用的物質(zhì)，其中所述物質(zhì)是PEOT/PBT，優(yōu)選PEOT/PBT為300/55/45，更優(yōu)選所述物質(zhì)為本發(fā)明的裝置(的形狀)，其中所述使用包括以下步驟：

a)將所述物質(zhì)插入人或動(dòng)物體的皮下空間中1-6周，優(yōu)選2-4周，以使組織結(jié)構(gòu)形成在所述物質(zhì)上；

b)優(yōu)選從皮下空間移除所述物質(zhì)和任選地在其上形成的組織結(jié)構(gòu)。可以在從皮下空間移除之前或之后分離所述物質(zhì)和組織結(jié)構(gòu)。而且，這里也可以應(yīng)用如上所述的步驟c)和/或d)。

如上所述的方法可產(chǎn)生中空管狀的(分離的，即在人或動(dòng)物體外的)組織結(jié)構(gòu)，其特征在于所述組織結(jié)構(gòu)的5μm厚的橫截面具有以下免疫組織化學(xué)參數(shù)：

-相對(duì)于總面積的15-25％的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)陽性面積，通過使抗α-SMA的抗體(從荷蘭Dako公司得到，1:1000)可視化來測(cè)量；

-相對(duì)于總面積的90-100％的膠原蛋白陽性面積，通過苦味酸-天狼星紅(picrosirus red)染色(例如Polysciences Inc試劑盒)測(cè)量；

優(yōu)選：

-相對(duì)于總面積的0-10％的CD45陽性面積，通過使抗CD45的抗體(荷蘭Immunologic公司，1:50，熱誘導(dǎo)的0.1％胰蛋白酶抗原修復(fù))可視化來測(cè)量；和/或

-相對(duì)于總面積的0-5％的CD68陽性面積，通過使抗CD68的抗體(例如AbD、Serotec、克隆MAC387，1:10)可視化來測(cè)量；和/或

-相對(duì)于總面積的50-70％的波形蛋白陽性面積，通過使抗波形蛋白的抗體(荷蘭Immunologic公司；1：300，熱誘導(dǎo)的蛋白酶K抗原修復(fù))可視化來測(cè)量。

橫截面優(yōu)選取自組織結(jié)構(gòu)的中間，其中橫截面橫切縱向方向?？梢允褂肐mageJ圖像處理和分析軟件(版本1.33或更新版本，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院開發(fā))進(jìn)行定量，其中特異性染色區(qū)域的百分比(例如可視化的抗體特異性結(jié)合區(qū)域的百分比)可相對(duì)于橫截面的總面積進(jìn)行測(cè)定?；诒硎舅鰴M截面面積的至少10％的圖像進(jìn)行量化也是足夠的。

組織結(jié)構(gòu)的組成可以包含壁，所述壁包括周向排列的αSMA陽性、肌間線蛋白陰性的肌成纖維細(xì)胞，和周向排列的波形蛋白陽性、αSMA陰性的成纖維細(xì)胞；和細(xì)胞外基質(zhì)，所述細(xì)胞外基質(zhì)包括周向排列的I型和III型膠原以及糖胺聚糖，并進(jìn)一步包括任意白細(xì)胞和/或異物巨細(xì)胞。在組織結(jié)構(gòu)縱向長(zhǎng)度的至少80％上壁厚度可以是0.5-5mm或1-4mm。

我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的具有上述參數(shù)和/或組成的組織結(jié)構(gòu)具有根據(jù)ISO7198準(zhǔn)則(優(yōu)選其中的第一方法)測(cè)定的至少1700mmHg，優(yōu)選至少2000mmHg的平均爆裂壓力，這對(duì)于植入動(dòng)脈循環(huán)中而言是足夠用的。此外，我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)ISO 7198準(zhǔn)則測(cè)定的縫合強(qiáng)度為至少2.5N，優(yōu)選至少3N，更優(yōu)選至少3.5N，并且我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)ISO 7198測(cè)定的順應(yīng)性為至少5％/100mmHg，優(yōu)選6％/100mmHg，更優(yōu)選7.5％/100mmHg。不受理論的束縛，本發(fā)明人相信膠原在組織結(jié)構(gòu)中的(高)交聯(lián)水平允許具有高的平均爆裂壓力和縫合強(qiáng)度。

組織結(jié)構(gòu)可以轉(zhuǎn)分化為功能性血管，這可以通過將組織結(jié)構(gòu)暴露于血流和血壓而引發(fā)。因此組織結(jié)構(gòu)可以用作例如功能性血管和/或用作血液透析手術(shù)的插管部位。

還設(shè)想將組織結(jié)構(gòu)用作輸尿管(將尿從腎引導(dǎo)到膀胱的管)或尿道(將尿從膀胱引導(dǎo)到生殖器的管)。還可以預(yù)見，組織結(jié)構(gòu)可用作膀胱和皮膚表面之間的導(dǎo)管，例如像Mitrofanoff手術(shù)要達(dá)成的目標(biāo)一樣(Mingin and Baskin 2003,Int Braz J Urol 29(1):53–61)。

優(yōu)選地，組織結(jié)構(gòu)在離一個(gè)或兩個(gè)縱向端部的50mm以內(nèi)彎曲，或優(yōu)選40mm、30mm以內(nèi)，或更優(yōu)選20mm以內(nèi)彎曲，優(yōu)選地，其中裝置具有S形。這通過使用特別調(diào)整的裝置實(shí)現(xiàn)，該裝置如前文所述在離一個(gè)或兩個(gè)縱向端部的50mm以內(nèi)彎曲，或優(yōu)選40mm以內(nèi)、30mm以內(nèi)，或更優(yōu)選20mm以內(nèi)彎曲。

本發(fā)明還提供了用作(在通過手術(shù)或療法對(duì)人或動(dòng)物體進(jìn)行的治療中)血管的組織結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地其中血管用作血液透析的插管部位(即血管通路)。還預(yù)見到(在通過手術(shù)或療法對(duì)人或動(dòng)物體進(jìn)行的治療中)用作動(dòng)靜脈移植物植入的組織結(jié)構(gòu)。例如，這涉及治療有需要的患者的方法，所述方法包括植入組織結(jié)構(gòu)，優(yōu)選皮下植入組織結(jié)構(gòu)。獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在于組織結(jié)構(gòu)對(duì)于患者是自體的(供體和受體是相同的)。如果組織結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)的地方在其預(yù)期使用的位置附近(例如，10cm、8cm、5cm、2cm以內(nèi)或更小的范圍內(nèi))，組織結(jié)構(gòu)甚至可以是原位的。例如，為了替換患病血管(如在動(dòng)脈旁路手術(shù)中)或創(chuàng)建用于血液透析的插管部位(即血管通路)而實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。

用可生物降解的片材(例如從Xeltis獲得的彈性聚合物，如厚度小于3mm、2mm或1mm的聚己內(nèi)酯，即PCL)(至少部分地)覆蓋組織結(jié)構(gòu)可能是有利的。片材的厚度可以為200-800μm，優(yōu)選300-500μm。同樣參見圖11。當(dāng)組織結(jié)構(gòu)用于患者承壓的部位時(shí)，該片材可以給予組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步的支撐，以便進(jìn)一步防止可能導(dǎo)致出血的結(jié)構(gòu)撕裂。使用片材還可以刺激彈性蛋白形成。在本發(fā)明中，可生物降解是指當(dāng)片材存在于人或動(dòng)物體的皮下空間時(shí)會(huì)隨時(shí)間降解，使得其可以在一段時(shí)間(例如1、2或3個(gè)月)內(nèi)消失。

此外，設(shè)想組織結(jié)構(gòu)可以通過例如(人造或聚合物)管連接到(可佩戴的)人造腎。這使得血液透析可在醫(yī)院外進(jìn)行，例如在家進(jìn)行。此外，設(shè)想組織結(jié)構(gòu)可以連接到外周動(dòng)脈從而例如為患有外周動(dòng)脈阻塞性疾病的患者(例如在腿中)創(chuàng)建動(dòng)脈旁路移植物。

本發(fā)明的方法允許身體產(chǎn)生自己的組織工程化血管，得到了與例如由使用以接種有血管細(xì)胞的合成支架的體外方法組成的現(xiàn)有技術(shù)組織工程方法相比，費(fèi)力較少且耗時(shí)短的方法。

附圖說明

圖1：傳遞模塑設(shè)備，其包括沖頭(1)、室(2)、十個(gè)直徑為8mm的桿形狀的模腔(3)，其中所述桿由兩個(gè)半模(4)的內(nèi)表面限定。A：側(cè)視圖；B：沒有沖頭的俯視圖，顯示表示兩個(gè)半模之間的邊界的中間虛線。

圖2：A：在縱向端部具有圓形邊(邊緣)的本發(fā)明的桿。B：在桿的縱向端部表面上具有凹部的桿。

圖3：不同表面處理和曝光時(shí)間之前和之后PA300、PA1000和PCL的3D AFM圖像(掃描尺寸為1μm²，CHCl₃除外，CHCl₃的掃描尺寸為25μm²)。

圖4：不同孵育時(shí)間(1s、5s、10s)后氯仿蝕刻桿的SEM圖像。比例尺：20μm(除了左上的比例尺為2μm)。

圖5：附著到經(jīng)歷不同表面處理的PA300桿上的大鼠真皮成纖維細(xì)胞(RDF，左)和巨噬細(xì)胞(右)的DNA測(cè)定分析。

圖6：(a)經(jīng)過不同處理的桿的AFM粗糙度定量(掃描尺寸1μm時(shí)的Rq)。處理時(shí)間如下：X＝未改性；Ar＝氬30分鐘；Ox＝氧5分鐘；CHF₃＝三氟甲烷2.5分鐘+NaOH＝氫氧化鈉10分鐘；CHCl₃＝氯仿10秒。每個(gè)經(jīng)處理的桿的粗糙度增加倍數(shù)顯示在其條狀圖的上方。(b)親水處理(70-40°)由Ar、O₂和NaOH組成，而疏水處理(85-110°)由CHF₃和CHCl₃組成)。(c)蛋白質(zhì)吸收測(cè)定：未改性桿對(duì)預(yù)選的改性桿。

圖7：A的量化：膠原的絕對(duì)量，B：α-SMA(即肌成纖維細(xì)胞)的絕對(duì)量，C：α-SMA的百分比，即與圍繞未改性Pa300桿形成的組織囊中的肌成纖維細(xì)胞相比，圍繞經(jīng)改性(Ar 30分鐘；Ox 5分鐘；CHF₃ 2.5分鐘；NaOH10分鐘；CHCl₃ 10秒)和涂覆的桿形成的組織囊中的肌成纖維細(xì)胞。

圖8：在豬中皮下植入氯仿處理的桿表現(xiàn)出了主要由膠原、肌成纖維細(xì)胞和殘余炎性細(xì)胞組成的厚組織囊。

圖9：將圖8的組織囊作為頸動(dòng)脈插入移植物植入豬中。血管移植術(shù)后4周，87％的移植物保持通暢。如圖9所示，在組織學(xué)水平上，α-SMA陽性細(xì)胞的量顯著增加。

圖10：連接動(dòng)脈(左，A)和靜脈(右，B)的S形組織結(jié)構(gòu)。箭頭表示血流的方向?？梢詫⒉骞芡肝鲠槻迦虢M織結(jié)構(gòu)中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用生物可降解片材(例如，由PCL制成)覆蓋(S形)組織結(jié)構(gòu)的外周。

圖11：皮下放置桿形狀的裝置。數(shù)字描述：1.頭靜脈；2.桿形狀裝置；3.橈動(dòng)脈；4.尺骨；5.橈骨。異物反應(yīng)過程：a.蛋白沉積在裝置上；b.粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞附著在裝置上；C.成纖維細(xì)胞的流入；d.通過成纖維細(xì)胞合成膠原以及炎性細(xì)胞分解(resolution)。

實(shí)施本發(fā)明方法中使用的常規(guī)技術(shù)的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。

實(shí)施例1原位血管組織工程

本實(shí)施例描述了產(chǎn)生自體的完全生物組織工程化血管(TEBV)的原位血管組織工程方法。研制了聚合物桿，其在植入時(shí)引起炎癥反應(yīng)，最終被管形纖維細(xì)胞組織囊包封，所述組織囊可形成TEBV的基礎(chǔ)。通過調(diào)節(jié)植入材料特性，可以定制組織反應(yīng)以優(yōu)化組織囊形成。將由聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)(PEOT/PBT)和聚乙二醇(PCL)組成的桿以及經(jīng)氣體等離子體處理、經(jīng)化學(xué)蝕刻且涂覆有生長(zhǎng)因子的桿皮下植入大鼠中，并測(cè)試其改變組織反應(yīng)的能力。3周后，收獲并分析周圍形成有組織囊的桿。組織囊主要由周向排列的膠原和肌成纖維細(xì)胞組成。實(shí)際上，不同的植入材料導(dǎo)致組織囊形成的明顯差異。通過改變植入材料特性，可以定制組織囊組成、細(xì)胞分布和組織排列，從而產(chǎn)生TEBV的合格基礎(chǔ)。

材料和方法

桿的制作

采用快速原型裝置(Moroni et al 2006Biomaterials Mar；27(7):974-85)(德國(guó)Envisiontec,GmbH)作為熔融擠出機(jī)制造直徑為1.75mm、最小長(zhǎng)度2cm、由彈性共聚物聚(對(duì)苯二甲酸氧化乙烯酯)-聚(對(duì)苯二甲酸丁二醇酯)(PEOT/PBT，荷蘭IsoTis Orthopaedics SA)組成的實(shí)心圓柱形桿。在該共聚物的制造期間，可以改變PEOT/PBT的比例和所使用的初始PEG的分子量，使得能夠調(diào)節(jié)材料性質(zhì)例如潤(rùn)濕性(Deschamps et al 2002J Control Release Jan 17；78(1-3):175-86)和蛋白質(zhì)吸附(Mahmood et al 2004Exp Cell Res Dec 10；301(2):179-88)。簡(jiǎn)言之，將加載到注射器的PEOT/PBT顆粒加熱至180-200℃。施加4-5巴的氮?dú)庖詳D出熔融的聚合物。使用兩種不同組成的PEOT/PBT：PEOT/PBT重量百分比為55/45(Polyactive/Pa300)和PEOT/PBT重量百分比為70/30PEOT/PBT(1000/Pa1000)，共聚物反應(yīng)中使用的初始聚乙二醇(PEG)的分子量分別為300g/mol和1000g/mol。采用因其生物相容性而眾所周知的聚-ε-己內(nèi)酯(PCL)為對(duì)照使用熔融擠出機(jī)(Axon mini-extruder，瑞典Axon AB Plastmaskiner公司)制造相似尺寸的桿。將PCL粒料(Purasorb PC 12，荷蘭Purac Biomaterials公司)加熱至170℃并攪拌(0.6cc/轉(zhuǎn))直至PCL完全熔融。隨后將其在25巴的壓力下通過毛細(xì)管擠出以制造圓柱形桿。

植入材料的改性

為了進(jìn)行氯仿蝕刻，將未改性的Pa300桿浸沒在氯仿(荷蘭Merck Millipore)中10秒，并劇烈空氣干燥以使剩余的氯仿蒸發(fā)。然后在超純水中洗滌桿，在42kHz下超聲處理15分鐘，兩次，以確保完全除去氯仿，隨后空氣干燥。對(duì)于氧氣等離子體處理，用100豪托的氧氣在30W或100W下處理未改性的Pa300桿5分鐘(反應(yīng)離子蝕刻，Teske，荷蘭特文特大學(xué))。所有改性的和未改性的桿通過γ輻射(Isotron，荷蘭)以>25kGy的劑量滅菌。此外，在無菌條件下于流動(dòng)箱中，將無菌的100W氧處理的Pa300桿在TGF-β溶液中浸漬1分鐘。TGF-β溶液由在無菌I型大鼠膠原(5mg/mL，英國(guó)Culturex公司)中混合的活化TGF-β3(英國(guó)R&D Systems公司)組成，得到的TGF-β濃度為10ng/mL膠原。作為對(duì)照，將類似的氧處理的Pa300桿在不含TGF-β的I型大鼠尾膠原中浸涂1分鐘。將桿空氣干燥并直接用于植入。

大鼠模型

將十五只13周齡的雄性Wistar大鼠(法國(guó)Charles Rivers)飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室籠中，Wistar大鼠隨意攝取食物和水。所有操作在異氟烷吸入麻醉下進(jìn)行。將4個(gè)桿植入每只大鼠腹部區(qū)域的皮下空間。植入5次作為對(duì)照的未改性的PCL桿，并且將所有未改性的PA300和Pa1000桿以及所有改性并經(jīng)涂覆的Pa300桿植入9次。在約1cm的小水平切口形成后，形成縱向皮下袋并將桿插入該袋中。隨后，使用4-0薇喬(vicryl)縫線(荷蘭Johnson&Johnson公司)閉合切口。大鼠通過術(shù)前注射對(duì)乙酰氨基酚(perfalgan，200mg/kg)直接接受術(shù)后鎮(zhèn)痛。此外，在手術(shù)后至多一天，將對(duì)乙酰氨基酚(2.7mg/mL)加入到飲用水中。三周后，收獲在其周圍形成有組織囊的桿，并處死動(dòng)物。

組織囊的分析

將組織囊固定在4％多聚甲醛中，加工并包埋在石蠟中。制備每個(gè)組織囊兩個(gè)部分的5μm連續(xù)橫切片(cross-sections)用于組織學(xué)分析、免疫組織化學(xué)分析和形態(tài)計(jì)量分析。所有樣品用蘇木精-焰紅染料-藏紅花(haematoxylin-phloxine-saffron，HPS)常規(guī)染色。為了表征細(xì)胞外基質(zhì)，每個(gè)組織囊的連續(xù)切片使用用于膠原的苦味酸-天狼星紅、用于糖胺聚糖的阿爾新藍(lán)(pH2.5)和用于彈性蛋白的weighert’s彈性蛋白染色。切片用茜素紅染色以評(píng)估潛在的鈣化。使用自發(fā)熒光顯影彈性蛋白，藍(lán)光激發(fā)彈性蛋白，并用光譜顯微鏡(Nuance Fx，美國(guó))進(jìn)行去混和(unmix)。使用明視野顯微鏡和偏振光分析苦味酸-天狼星紅染色的切片以區(qū)分I型膠原和III型膠原。將組織囊的所有切片與天然大鼠主動(dòng)脈中間層的類似切片進(jìn)行比較。使用免疫組織化學(xué)來表征組織囊的細(xì)胞組成，采用抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的抗體(α-SMA，荷蘭Dako公司；1:1000)表征肌成纖維細(xì)胞，采用波形蛋白(荷蘭Immunologic公司；1:300，熱誘導(dǎo)蛋白酶K抗原修復(fù))表征成纖維細(xì)胞，采用肌間線蛋白(荷蘭Immunologic公司；1:250，熱誘導(dǎo)的0.1％胰蛋白酶抗原修復(fù))表征收縮性平滑肌細(xì)胞，采用CD45(荷蘭Immunologic公司；1:50，熱誘導(dǎo)0.1％胰蛋白酶抗原修復(fù))表征白細(xì)胞，采用Von Willebrandfactor(荷蘭Dako公司，1:300，熱誘導(dǎo)0.1％胰蛋白酶抗原修復(fù))表征內(nèi)皮細(xì)胞，并用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯影。如其他地方所述(Roy-Chaudhury et al 2007Am J Kidney Dis Nov；50(5):782-90)，區(qū)分成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和收縮平滑肌細(xì)胞。使用同種型抗體獲得陰性對(duì)照。此外，在從組織囊擠出桿后，用亞甲基藍(lán)對(duì)桿進(jìn)行染色以確定是否有任何組織粘附到桿上。

組織形態(tài)學(xué)

使用全景載片掃描儀(匈牙利3D Histec公司)獲得染色切片的明視野圖像。使用ImageJ進(jìn)行定量。使用苦味酸-天狼星紅和α-SMA染色的切片分別定量總膠原面積和總肌成纖維細(xì)胞面積(μm²)。使用α-SMA染色切片的DAB染色面積(μm²)除以5μm²橫截面載玻片的總組織囊面積來測(cè)量α-SMA陽性面積百分比。

統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。所有數(shù)據(jù)采用SPSS用單向方差分析(ANOVA)試驗(yàn)進(jìn)行分析。進(jìn)行Tukey事后分析以比較所有不同桿的表面粗糙度灰度值和所有未改性桿的組織形態(tài)計(jì)量結(jié)果。進(jìn)行Dunett事后分析以比較所有改性并經(jīng)涂覆的Pa300桿與未改性的Pa300桿的組織形態(tài)計(jì)量結(jié)果。P值<0.05被認(rèn)為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著的。

結(jié)果

植入材料

SEM圖像證實(shí)所有未改性的桿具有完全平滑的表面，而通過氧氣等離子體處理和氯仿蝕刻進(jìn)行的表面改性確實(shí)導(dǎo)致表面形貌的顯著改變，產(chǎn)生不同的均勻圖案化的表面。而氯仿蝕刻導(dǎo)致形成0.5-5μm的孔以及一些罕見的10-20μm的較大的孔。氧處理導(dǎo)致尖峰，與30W氧氣等離子體處理相比，100W氧氣等離子體處理的深度更大。伽瑪輻射不影響表面形貌(未給出數(shù)據(jù))。在從組織囊擠出后對(duì)桿進(jìn)行的亞甲基藍(lán)染色顯示沒有組織殘留在未改性桿上，幾乎沒有任何組織殘留在表面改性并經(jīng)涂覆的桿上(未給出數(shù)據(jù))。

一般組織囊形成

一個(gè)Pa1000桿在收獲時(shí)不再位于原位。在所有其他情況下，皮下植入后三周成功收獲所有桿。桿由充分血管化的組織囊完全包封，在桿的邊緣處具有更顯著的組織反應(yīng)。組織囊與周圍皮下組織一體化，但可容易地收獲且隨后從桿上平滑地?cái)D出。組織學(xué)顯示圍繞不同類型的桿形成的組織囊特別是在膠原和肌成纖維細(xì)胞含量的相對(duì)比例上具有可辨別的變化?？傮w上，組織囊的基質(zhì)主要由周向排列的I型膠原和III型膠原和糖胺聚糖(GAG)組成，組成與天然大鼠動(dòng)脈相當(dāng)。然而，與天然血管相比，彈性蛋白僅以極少量局部存在。在細(xì)胞組成方面，組織囊主要由周向排列的α-SMA陽性、肌間線蛋白陰性的肌成纖維細(xì)胞組成。剩余的細(xì)胞主要是周向排列的波形蛋白陽性、α-SMA陰性的成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞比率在不同類型的桿之間不同。在所有組織囊中，僅存在很少的肌間線蛋白陽性的平滑肌細(xì)胞。CD45陽性的白細(xì)胞幾乎不存在(<1％)，并且在接觸表面處沒有異物巨細(xì)胞形成。茜素紅染色顯示在所有組織囊中都沒有鈣化的跡象(未給出數(shù)據(jù))。圍繞組織囊的皮下空間中的膠原部分地與組織囊結(jié)盟(co-align)，形成具有松散排列的膠原、一些成纖維細(xì)胞和小血管的外膜層。

圍繞未改性的桿形成的組織囊

首先，評(píng)價(jià)三種類型的未改性的桿在植入后影響組織反應(yīng)的能力，此能力導(dǎo)致組織囊組成的顯著差異(p<0.05)。盡管生物相容性PCL桿被具有少量肌成纖維細(xì)胞的、薄壁的、相對(duì)脫細(xì)胞組織囊包封，但Pa1000和Pa300桿都被主要由肌成纖維細(xì)胞組成的更厚的富含細(xì)胞的組織囊包封。與PCL相比，在Pa300(分別p＝0.048和p＝0.006)和Pa1000(分別p＝0.010和p＝0.013)桿周圍形成的組織囊中絕對(duì)肌成纖維細(xì)胞面積以及肌成纖維細(xì)胞的百分比顯著更大。在組織學(xué)和組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方面，在Pa300和Pa1000周圍形成的組織囊之間沒有明顯差異。然而，Pa300桿具有如下優(yōu)點(diǎn)：其在植入期間不易碎，因此在收獲組織囊期間不易破裂，而桿的破裂可損傷組織囊(Pa300相比于Pa1000桿)。因此對(duì)由Pa300組成的桿進(jìn)行表面改性。

表面改性Pa300桿周圍的組織囊形成

組織形態(tài)計(jì)量學(xué)顯示，與未改性的Pa300桿相比，在所有改性桿周圍形成的組織囊具有更大的壁厚，因此具有更高的膠原和肌成纖維細(xì)胞含量。如圖7所示，對(duì)于每種類型的Pa300桿改性，這些量均不同。涂覆膠原的桿引起組織囊中最大的膠原增加(p<0.05)，而涂覆TGF-β的桿趨向于增加膠原的量(p＝0.07)。盡管在改性桿周圍形成的組織囊中α-SMA(即肌成纖維細(xì)胞)的絕對(duì)量增加，但是涂覆膠原的桿和涂覆TGF-β的桿以及氧處理的桿中α-SMA(即肌成纖維細(xì)胞)的百分比與未改性的對(duì)應(yīng)物相比較低。相比之下，氯仿蝕刻的桿形成了α-SMA(即肌成纖維細(xì)胞)百分比增加的組織囊(圖7)。由于這些定量不能解釋組織囊的不均勻性和形態(tài)，還評(píng)價(jià)了組織囊的整體外觀和其成分分布。我們觀察到不同類型的桿之間形態(tài)學(xué)上的顯著差異。氧處理的桿形成了具有相當(dāng)厚的壁但更松散地排列的組織囊。與未改性的桿相比，涂覆膠原的桿和涂覆TGF-β的桿都導(dǎo)致密集排列的厚組織囊。然而，與未改性的桿相比，肌成纖維細(xì)胞的相對(duì)比例較低，在整個(gè)組織囊壁中肌成纖維細(xì)胞相對(duì)隨機(jī)分布。另一方面，氯仿處理的桿產(chǎn)生相當(dāng)厚的組織囊，其具有均勻分布的壁厚度。此外，組織囊?guī)缀跬耆擅芗帕械木鶆蚍稚⒌募〕衫w維細(xì)胞組成。

使用異物反應(yīng)產(chǎn)生組織工程血管構(gòu)建體

產(chǎn)生的組織囊主要由GAG、周向排列的膠原和肌成纖維細(xì)胞組成。即使誘發(fā)的反應(yīng)本質(zhì)上是炎癥反應(yīng)，組織囊中幾乎不存在任何白細(xì)胞或異物巨細(xì)胞。這可能取決于植入時(shí)間的長(zhǎng)度。異物反應(yīng)是動(dòng)態(tài)的，從由嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞主導(dǎo)的急性炎癥期開始，在幾周內(nèi)隨著(肌)成纖維細(xì)胞的流入和基質(zhì)形成，在更加纖維化的反應(yīng)中炎癥反應(yīng)消失(resolves)。經(jīng)過一段時(shí)間后，相當(dāng)脫細(xì)胞的膠原組織囊保留下來。基于后者并與我們的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，三周的植入期對(duì)于在大鼠中獲得基質(zhì)和富含細(xì)胞的非炎性組織囊來說似乎是最佳的。

通過改變植入材料特性調(diào)節(jié)異物反應(yīng)

本研究清楚地表明植入物性質(zhì)可以在形態(tài)和組成方面有利地影響組織反應(yīng)。與常規(guī)PCL相比，在Pa300和Pa1000桿周圍形成的組織囊在組成上顯著不同。但是通過表面處理和生物活性涂層獲得了在組織的組成和形態(tài)方面更顯著的差異。我們證明，與其未改性的對(duì)應(yīng)物相比，氯仿蝕刻和氧等離子體處理的表面導(dǎo)致組織囊中肌成纖維細(xì)胞和膠原含量的增加。氯仿處理產(chǎn)生了粗糙度顯著增加的圖案化表面。植入物表面特性和形貌的后續(xù)差異影響在植入材料周圍形成的組織的組成和形態(tài)。有趣的是，氯仿蝕刻的表面和氧等離子體處理的表面之間的形貌結(jié)構(gòu)和粗糙度的明顯變化引起組織排列的顯著差異。雖然氧處理的桿導(dǎo)致厚的組織囊，但是松散的排列對(duì)血管構(gòu)造體是不利的。相比之下，氯仿蝕刻桿的植入導(dǎo)致最均勻分布的、強(qiáng)壁的、膠原和成肌纖維細(xì)胞豐富的組織囊。因此，我們認(rèn)為這些桿最有利于為TEBV產(chǎn)生合格的基礎(chǔ)。

通過材料的生物活性涂層調(diào)節(jié)異物反應(yīng)

除了純粹的表面改性，改性的桿還用膠原和膠原/TGF-β涂覆。TGF-β誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化。與未改性的桿相比，單獨(dú)用膠原涂覆桿和用膠原/TGF-β涂覆桿都導(dǎo)致膠原形成和壁厚度的最大增加。然而，與單獨(dú)的膠原涂覆相比，膠原/TGF-β涂覆沒有導(dǎo)致顯著不同的組織囊，這表明結(jié)果僅僅歸因于膠原。盡管膠原涂覆的桿和膠原/TGF-β涂覆的桿導(dǎo)致最大的壁厚度，但是較低的肌成纖維細(xì)胞百分比及其隨機(jī)分布使得在我們看來這些涂層與例如產(chǎn)生富含肌成纖維細(xì)胞、均勻分布的組織囊的氯仿處理的Pa300桿相比不太有利于作為血管組織工程的生物活性模具。

結(jié)論

我們得到的組織囊形成TEBV的基礎(chǔ)，所述TEBV的基礎(chǔ)一旦移植到脈管系統(tǒng)可能進(jìn)一步重塑。事實(shí)上，肌成纖維細(xì)胞(存在于組織囊中的主要細(xì)胞類型)是具有收縮裝置的可塑細(xì)胞，并且如果被刺激可以合成細(xì)胞外基質(zhì)。重要的是，流動(dòng)和循環(huán)應(yīng)變是基質(zhì)合成甚至肌成纖維細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的強(qiáng)大刺激因素。因此，當(dāng)移植入脈管系統(tǒng)并暴露于高流動(dòng)時(shí)，這些組織囊可能及時(shí)分化并向更加血管樣的表型發(fā)展。

該研究說明，通過利用針對(duì)圓柱形聚合物桿的組織反應(yīng)可以產(chǎn)生用于TEBV的管狀基礎(chǔ)。通過改變植入材料特性可以調(diào)整組織反應(yīng)，從而為TEBV產(chǎn)生合格的基礎(chǔ)。

實(shí)施例2不同表面處理后桿的表面表征

制作Pa300、Pa1000和PCL桿。簡(jiǎn)言之，將聚合物顆粒裝載到不銹鋼注射器中并通過固定在設(shè)備的移動(dòng)X軸臂上的熱固性盒單元在T＝180-200℃的溫度下加熱。在熔融態(tài)，通過加壓帽將4-5巴的氮?dú)馐┘拥阶⑸淦?。將纖維排列模型加載在Bioplotter計(jì)算機(jī)輔助制造軟件(CAM，瑞士PrimCAM公司)上。選擇外徑(OD)為2.2mm的針以獲得1.75mm的桿。采用氮?dú)馇鍧嵥鰲U。氣體等離子體桿在真空室中孵育。使用Harrick等離子體清潔器(PDC-002；美國(guó)紐約Harrick Plasma Ithaca公司)在0.133mbar和高設(shè)置(740V DC，40mA DC，29.6W)下進(jìn)行氬等離子體處理，處理時(shí)間分別為30、45和60分鐘。使用反應(yīng)離子蝕刻(RIE)系統(tǒng)(Etch RIE Tetske，Nanolab，特文特大學(xué))在100毫托和30W下進(jìn)行5分鐘、10分鐘和15分鐘的氧和三氟甲烷處理。在1M和4M濃度下進(jìn)行5分鐘、10分鐘和15分鐘的氫氧化鈉蝕刻。二氯甲烷或氯仿蝕刻的桿暴露1秒、5秒或10秒(浸漬)。在無機(jī)和有機(jī)蝕刻后，將桿用MilliQ水漂洗一次，并進(jìn)一步超聲處理2次，每次15分鐘，以除去殘余物。

原子力顯微鏡(AFM)-表面粗糙度和3D圖像

為了進(jìn)行AFM分析，將樣品固定在具有雙面膠帶的磁盤上。經(jīng)由AFM使用具有超銳TESP懸臂的Tapping 1模式(PicoScan Controller2500，美國(guó)Molecular Imaging公司)進(jìn)行表面粗糙度分析，Tapping 1模式：42N/m、320kHz、2-5nm ROC，無涂層(Bruker AFM探針)。使用掃描探針圖像處理器和SPIPTM(版本4.2.2.0)軟件確定粗糙度測(cè)量結(jié)果(Ra、Rq和Rmax)。對(duì)于納米尺度結(jié)構(gòu)(X、Ar、O₂、CF₃和NaOH)，Rq測(cè)量在1μm²表面積上進(jìn)行，對(duì)于微米結(jié)構(gòu)(CHCl₃)，Rq測(cè)量在10μm²的表面積上進(jìn)行。記錄聚合物表面的高質(zhì)量三維(3D)圖像，并在隨機(jī)不同的表面位置重復(fù)三次以驗(yàn)證觀察到的特性的再現(xiàn)性，并取其平均值。

接觸角和x射線光子光譜

使用捕泡法通過靜態(tài)水接觸角測(cè)量進(jìn)行潤(rùn)濕性測(cè)量。使用基于錄像機(jī)的光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)xOCA 15(德國(guó)菲爾德爾斯塔特DataPhysicsInstruments GmbH)進(jìn)行測(cè)量。通過使用電子調(diào)節(jié)的Hamilton注射器和針在膜上施加水泡(2μL)來測(cè)定水接觸角。使用SCA20軟件(德國(guó)菲爾德爾斯塔特DataPhysics Instruments GmbH)計(jì)算接觸角。隨后，將桿轉(zhuǎn)移到XPS室。XPS室(Omicron Nanotechnology GmbH)具有低于1×10^-10毫巴的基礎(chǔ)壓力。使用單色Al Kα(XM 1000)X射線源和EA 125電子能量分析儀進(jìn)行測(cè)量。所有光譜在恒定分析器能量(CAE)模式下獲得。XPS譜線由噴射電子的殼識(shí)別(1s、2s、2p等)。

細(xì)胞培養(yǎng)和增殖

將購自Tebu-bio(R106-05n，Cell Application，Inc)的新生大鼠真皮成纖維細(xì)胞(RDF)用包含α-MEM(Gibco)、10％胎牛血清(Lonza)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco)、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素(Gibco)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)。RDF在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以3000個(gè)細(xì)胞/cm²的初始接種密度擴(kuò)增并每2-3天補(bǔ)給一次。在用胰蛋白酶消化進(jìn)行細(xì)胞接種前，在80-90％融匯下收獲細(xì)胞。從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得大鼠肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞系NR8383，并保持在巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包括不含酚紅的α-MEM，添加有L-谷氨酰胺(Gibco)、15％胎牛血清(Lonza)、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素(Gibco)，最佳細(xì)胞接種密度為200000個(gè)活細(xì)胞/ml。通過將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)燒瓶中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。通過用細(xì)胞刮刀(德國(guó)Sigma-Aldrich)刮擦進(jìn)行細(xì)胞收集。所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在37℃下5％CO₂潮濕氣氛中進(jìn)行。

成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的單一培養(yǎng)細(xì)胞接種

將改性的和未改性的桿切成每個(gè)樣品1cm的桿并用70％乙醇滅菌。將桿在培養(yǎng)基中預(yù)孵育4小時(shí)，所述培養(yǎng)基包括不含酚紅的α-MEM，添加有L-谷氨酰胺(Gibco)、10％胎牛血清(Lonza)、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素(Gibco)。將瓊脂糖模具(3％wt/v)放置在桿的下面以防止細(xì)胞附著到48孔板上并用于最佳的靜態(tài)細(xì)胞接種。將RDF(以50000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞接種密度)和巨噬細(xì)胞(以100000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞接種密度)接種在500μl體積中。用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，Invitrogen Life Technologies)沖洗樣品，并在第1天和第3天收集樣品用于DNA測(cè)定，用亞甲基藍(lán)(MB)和掃描電子顯微鏡(SEM)成像。

細(xì)胞增殖測(cè)定

使用CyQuant細(xì)胞增殖測(cè)定試劑盒(Molecular Probes)測(cè)量總DNA以評(píng)估細(xì)胞粘附和增殖。簡(jiǎn)言之，吸出培養(yǎng)基，并用PBS輕輕洗滌樣品。然后將樣品收集到500μl eppendorf管中，并在-80℃冷凍。在冷凍-融化三次后，室溫(RT)下向樣品中加入250μl裂解緩沖液(1:20裂解緩沖液20×)，處理至少1小時(shí)，再加入裂解緩沖液Rnase處理1小時(shí)。隨后，將細(xì)胞裂解物和CyQuant GR染料(1x)在白色96孔板中1:1混合，并在黑暗中孵育15分鐘。使用分光光度計(jì)(VICTOR3Multilabel Plate Reader Perkin Elmer)分別在480nm和520nm的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量熒光。

亞甲基藍(lán)染色、免疫染色和掃描電子顯微鏡

從細(xì)胞培養(yǎng)物樣品(n＝4)中吸出培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞，并在室溫下用新制備的10％甲醛的PBS溶液固定30分鐘。用PBS沖洗后，將樣品(n＝2)在1％亞甲藍(lán)的PBS溶液中孵育1-2分鐘，并再用PBS沖洗以除去非特異性染色。在Olympus SZ-III-立體顯微鏡中檢查樣品以觀察樣品上的細(xì)胞分布。對(duì)于其他固定樣品(n＝2)，在用PBS沖洗后，用0.1％Triton X-100的PBS溶液的在4℃下透化15分鐘，并在室溫下用1％牛血清白蛋白(BSA)封閉1小時(shí)。細(xì)胞用Vincullin-FITC(1:400)、鬼筆環(huán)肽-德克薩斯紅(Phalloidin-Texas Red，1:100)和Dapi(1:100)染色，其間包括3×洗滌步驟。通過熒光顯微鏡(Nikon Eclipse E600)獲得圖像。然后，所有染色的樣品(n＝4)經(jīng)歷70％-80％-90％-100％的脫水步驟，每步的孵育時(shí)間為30分鐘。100％脫水后，將樣品儲(chǔ)存在浸沒在100％乙醇中的組織袋中，并轉(zhuǎn)移至臨界點(diǎn)干燥器室(CPD 030臨界點(diǎn)干燥器，Leica)。在4℃下，將100％乙醇與液體二氧化碳交換，液體二氧化碳在40℃下轉(zhuǎn)變?yōu)闅鈶B(tài)。在1毫巴壓力下排出二氧化碳?xì)怏w。在除去所有氣體之后，樣品準(zhǔn)備好在40mA的電流和100毫托的分壓下進(jìn)行30秒的金濺射。使用Philips XL30ESEM-FEG掃描電子顯微鏡(SEM)在10kV和10mm的工作距離下研究細(xì)胞的形態(tài)。

TGF-β1、IL-1β、IL-6和IL-10的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)

在不同的點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)基，并根據(jù)制造商的說明書(DuoSetELISA顯影試劑盒，R&D Systems Europe Ltd.)使用ELISA測(cè)定法定量TGF-β1、IL-1β、IL-6和IL-10的細(xì)胞因子分泌。簡(jiǎn)言之，用每孔100μL捕獲抗體包被96孔微孔板，并在室溫下溫育過夜。每個(gè)孔用洗滌緩沖液洗滌三次，并用封閉緩沖液封閉至少1小時(shí)。將100μL樣品、標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吩谑覝叵聹赜?小時(shí)。根據(jù)制造標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后洗滌該板，加入100μL檢測(cè)抗體，并在室溫下溫育2小時(shí)。沖洗后，加入100μL鏈霉親和素-HRP并在室溫下溫育20分鐘。再次洗滌該板，并在室溫下加入100μL底物溶液，孵育20分鐘。最后，向每個(gè)孔中加入50μL終止溶液。使用酶標(biāo)儀在450nm和540nm波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)量。

用于膠原和彈性蛋白表達(dá)的Sircol和Fastin測(cè)定

通過膠原和彈性蛋白染色測(cè)定測(cè)量在培養(yǎng)4和7天后合成并沉積在桿上的彈性蛋白和膠原的量。使用冷酸胃蛋白酶(0.1mg/ml 0.5M乙酸)對(duì)樣品(n＝4)進(jìn)行膠原提取，并在4℃下放置過夜。在加入Sircol染料試劑之前進(jìn)一步分離和濃縮膠原。根據(jù)基于苦味酸-天狼星紅的比色SirCol^TM膠原染料結(jié)合測(cè)定試劑盒(Biocolor Ltd.)進(jìn)行測(cè)定，并使用酶標(biāo)儀在540nm下測(cè)量。首先將用于彈性蛋白定量的桿(n＝4)在100℃下加熱1小時(shí)并用0.25M草酸提取α-彈性蛋白。使用Fastin彈性蛋白測(cè)定試劑盒(Biocolor Ltd)并使用酶標(biāo)儀在513nm進(jìn)行測(cè)量來進(jìn)一步定量彈性蛋白。

統(tǒng)計(jì)分析

所有生化測(cè)定用一式三份的生物樣品進(jìn)行。除非圖例中另有說明，否則用Tukey多重比較檢驗(yàn)(p<0.05)通過雙向方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于所有的圖，以下限定均適用：*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。

結(jié)果

從圖3可以看出：不同表面處理和曝光時(shí)間之前和之后PA300、PA1000和PCL的3D AFM圖像(掃描尺寸為1μm²，CHCl₃除外，CHCl₃的掃描尺寸為25μm²)。圖5：附著到PA300桿上的大鼠真皮成纖維細(xì)胞(RDF，左)和巨噬細(xì)胞(右)的DNA測(cè)定分析。未改性(X)桿經(jīng)受氬等離子體處理30分鐘、45分鐘和60分鐘(Ar30-45-60，從左到右的柱)、氧氣或三氟甲烷等離子體處理2.5分鐘、5分鐘、10分鐘(O₂ 2.5-5-10，CHF₃2.5-5-10，從左到右的柱)。其它未改性的桿使用1M或4M濃度的氫氧化鈉濕法蝕刻5至10分鐘(NaOH：1M：5-10，NaOH：4M：5-10，從左至右的柱)或使用氯仿或二氯甲烷濕法蝕刻1秒、5秒或10秒(CHCl₃：1-5-10s，CH₂Cl₂-10s，從左到右的柱)。第3天時(shí)增加的倍數(shù)可以在單個(gè)柱上方看到。除了CHF₃ 5-10樣品，所有處理的RDF附著均在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有所增加。在Ar、Ox和CHCl₃處理后巨噬細(xì)胞附著在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有所增加。星號(hào)(*，P<0.05)表示每種處理類型的最佳參數(shù)。因此，在所有表面改性的桿中觀察到細(xì)胞粘附的增加，而與其它聚合物類型相比，Pa300顯示出最顯著的增加。

從圖6可以看出：(a)AFM粗糙度定量(掃描尺寸為1μm時(shí)的Rq)。處理時(shí)間如下：X＝未改性；Ar＝氬30分鐘；Ox＝氧5分鐘；CHF₃＝三氟甲烷2.5分鐘+NaOH＝氫氧化鈉10分鐘；CHCl₃＝氯仿10秒。每個(gè)處理?xiàng)U的粗糙度增加倍數(shù)顯示在其柱的上方。(b)親水處理(70-40°)由Ar、O₂和NaOH組成，而疏水處理(85-110°)由CHF₃和CHCl₃組成)。(c)蛋白質(zhì)吸收測(cè)定：未改性桿對(duì)預(yù)選的改性桿。改性桿中的蛋白質(zhì)吸收通過未改性桿中的蛋白質(zhì)吸收來歸一化，從而顯示不同處理之間的倍數(shù)差異。藍(lán)色星號(hào)(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)表示與未改性桿(X)相比的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的值，黑色星號(hào)表示每種處理間的相互比較。

結(jié)果進(jìn)一步表明，CHCl₃處理(10秒)的桿提供了最大量的TGF-β1、IL-β1、IL-6和IL-10，并在遞送增加的膠原和彈性蛋白分泌間具有理想的平衡，而這種平衡決定了組織生成和功能的最終結(jié)果。對(duì)未改性桿和預(yù)選的改性桿的XPS測(cè)量顯示可以看到氧含量2倍增加的組(Ar、Ox、NaOH和CHCl₃)和5倍減少的組(CHF₃)。

實(shí)施例3概念研究在豬中的證明

對(duì)于豬模型，需要大直徑PEOT/PBT 300桿(4.2mm)。不幸的是，使用快速成型(例如使用Bioplotter裝置，Envisiontec GmbH)不可能生產(chǎn)這些大直徑桿。熔融擠出產(chǎn)生了不期望的宏觀表面粗糙度，因而也是不利的。壓縮模塑似乎是最好的生產(chǎn)方法，其中將聚合物粒料放置在模腔中，之后通過頂部力閉合此腔，將模具加熱至高于聚合物的熔點(diǎn)的溫度。然后可以在模具冷卻后移走產(chǎn)品。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，使用兩個(gè)加熱夾具、熱電偶和具有溫度設(shè)定點(diǎn)和讀數(shù)的控制裝置直接加熱單腔壓縮模具。在短時(shí)間范圍內(nèi)，聚合物熔融并流過模腔。然而，由于PEOT/PBT材料的高粘性，無法在不損壞桿的情況下移走桿。因此，設(shè)計(jì)了新的壓縮模具原理，其使用由兩個(gè)可彼此分離的半部組成的模腔以允許桿的無損移除(參見實(shí)施例3)。

按照上述方法制作的PA300桿。隨后，這些桿按照與植入大鼠中的較小桿相同的處理方法用氯仿處理10秒。在豬中皮下植入這些棒顯示出更厚的組織囊，其主要由膠原、肌成纖維細(xì)胞和殘余炎性細(xì)胞組成(圖8)。這些組織囊的機(jī)械評(píng)估顯示平均爆裂壓力>2000mmHg，足以植入動(dòng)脈循環(huán)中。接下來，將這些組織囊作為頸動(dòng)脈插入移植物植入豬體內(nèi)。血管移植術(shù)后4周，87％的移植物保持通暢。在組織學(xué)水平上，α-SMA陽性細(xì)胞的量大大增加(圖9)。令人驚訝的是，在血管移植后4周，組織囊壁大部分由肌間線蛋白陽性平滑肌細(xì)胞填充。插管研究顯示移除透析針后平均止血時(shí)間<2分鐘。

實(shí)施例4支撐片材

制作由聚ε-己內(nèi)酯(PCL，荷蘭Purac Biomaterials)組成的外部靜電紡絲片材，其纖維厚度為10±2μm，孔隙率為90±3％且總厚度為約400μm。使用配備有50N測(cè)力傳感器的單軸拉伸臺(tái)(Mecmesin，MultiTest1-i)測(cè)量440μm厚的γ-滅菌片材(n＝3)的拉伸強(qiáng)度。以10mm/min的速度拉伸樣品，記錄時(shí)間、位移和力。楊氏模量由應(yīng)力/應(yīng)變曲線的線性部分確定。作為參考，測(cè)量了綿羊肺動(dòng)脈的樣品(n＝18)。使用>25kGy的γ輻射(荷蘭Synergy Health)對(duì)桿和片材進(jìn)行滅菌。使用SEM評(píng)價(jià)γ輻射對(duì)氯仿蝕刻的桿和PCL片材的表面的影響。與肺動(dòng)脈的1Mpa拉伸強(qiáng)度相比，我們發(fā)現(xiàn)PCL片材(n＝3)的拉伸強(qiáng)度為9MPa。通過使用片材覆蓋組織結(jié)構(gòu)，即將片材固定在組織結(jié)構(gòu)周圍，該片材可用于支撐本發(fā)明的組織結(jié)構(gòu)。