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發(fā)明背景

少突膠質(zhì)細(xì)胞是存在于脊椎動(dòng)物中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞。它們產(chǎn)生富含脂質(zhì)的層狀髓鞘，其覆蓋神經(jīng)元軸突并產(chǎn)生限定的電絕緣區(qū)段以使動(dòng)作電位傳導(dǎo)速度最大化。髓磷脂對(duì)于軸突完整性和存活也是重要的，并且已顯示即使影響少突膠質(zhì)細(xì)胞代謝的小變化也可導(dǎo)致神經(jīng)退化。Kassmann,C.M.等,Nature Genet.39:969-976(2007)。髓鞘化過(guò)程在人類中特別重要，因?yàn)槿四X具有較高含量的有髓鞘神經(jīng)元(白質(zhì))，并且髓鞘化在出生之后持續(xù)并貫穿一生。Bartzokis,G.,Adolescent Psychiat.29:55-96(2005)。這表明少突膠質(zhì)細(xì)胞不只提供惰性絕緣，而且髓鞘化是動(dòng)態(tài)過(guò)程，從而影響認(rèn)知功能乃至行為。

多發(fā)性硬化癥(MS)、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、白質(zhì)消融性疾病、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher disease)和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良是脫髓鞘或髓鞘形成障礙病癥的實(shí)例。此外，少突膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵作用正顯現(xiàn)在許多其它神經(jīng)病癥和神經(jīng)退化性病狀，包括肌萎縮性側(cè)索硬化、亨廷頓氏病(Huntington’s disease)、阿爾茨海默氏病(Alzheimer's disease)和精神分裂癥中。Bernstein,H.G.等,Schizophr.Res.161:4-18(2015)；Behrendt,G.等,Glia 61:273-286(2013)；Kang,J.等,Ann.Vasc.Surg.27:487-496(2013)；Fennema-Notestine,C.等,Neurology 63:989-995(2004)。人少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(OPC)可用于開(kāi)發(fā)體外髓鞘化測(cè)定以篩選髓鞘形成性化合物，并且最終可變?yōu)樽泽w細(xì)胞補(bǔ)充療法的來(lái)源。特定來(lái)說(shuō)，從誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)產(chǎn)生用于自體細(xì)胞療法的患者特異性細(xì)胞近來(lái)已作為一種有前途的構(gòu)思而出現(xiàn)。Wang,S.等,Cell Stem Cell 12:252-264(2013)；Goldman,S.A.等,Science 338:491-495(2012)。

對(duì)人少突膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)和人髓鞘化的研究已受阻于由活檢或尸檢獲取原代細(xì)胞受到限制。在最近20年內(nèi)，多能干細(xì)胞(PSC)已被用作一種可從其產(chǎn)生任何所需細(xì)胞類型的替代性適用來(lái)源。這已通過(guò)在體外重演胚胎發(fā)育的基本步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)。Irion,S.等,Cold Spring Harb.Sym.73:101-110(2008)。值得注意的是，在小鼠與人之間，譜系定型的大多數(shù)關(guān)鍵路徑是高度保守的，并且因此，由小鼠發(fā)育生物學(xué)獲得的見(jiàn)地已成功應(yīng)用于從人PSC(hPSC)產(chǎn)生眾多細(xì)胞類型，包括少突膠質(zhì)細(xì)胞。Murry,C.E.等,Cell 132:661-680(2008)。

在小鼠中，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體產(chǎn)生于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞(pMN)域內(nèi)。在小鼠胚胎發(fā)育期間，視黃酸(RA)和音猬因子(sonic hedgehog，SHH)路徑在確定pMN域方面是關(guān)鍵的。這個(gè)研究結(jié)果已在體外培養(yǎng)中用于使神經(jīng)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成pMN域的祖細(xì)胞，從而表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子OLIG2。Wichterle,H.等,Cell 110:385-397(2002)。在10μM的濃度下的RA已在大多數(shù)方法中用于使人胚胎干細(xì)胞(hESC)分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞。Izrael,M.等,Mol.Cell.Neurosci.34:310-323(2007)；Nistor,G.I.等,Glia 49:385-396(2005)。Zhang實(shí)驗(yàn)室證明SHH為誘導(dǎo)OLIG2⁺NKX2.2⁺祖細(xì)胞以及它們轉(zhuǎn)變成表達(dá)SOX10、PDGFRα和最終O4的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(OPC)所必需。Hu,B.Y.等,Development 136:1443-1452(2009a)。相較于小鼠模型，OPC在人模型中的出現(xiàn)被顯著延遲；在人模型中，在OLIG2⁺祖細(xì)胞的峰值與OPC的峰值之間存在10周延長(zhǎng)時(shí)期。Hu,B.Y.等,Nat.Protoc.4:1614-1622(2009b)。

若干小組已設(shè)計(jì)用以使PSC分化成OPC的方案。Numasawa-Kuroiwa,Y.等；Stem Cell Rep.2:648-661(2014)；Stacpoole,S.R.等,Stem Cell Rep.1:437-450(2013)；Wang等,(2013)；Liu,Y.等,Nat.Protoc.6:640-655(2011)；Sim,F.J.等,Nat.Biotechnol.29:934-941(2011)。然而，這些分化方案是冗長(zhǎng)的和低效的；它們的實(shí)際應(yīng)用受限于獲得表達(dá)O4抗原的OPC需要超過(guò)120天的培養(yǎng)時(shí)間。此外，所得O4⁺細(xì)胞的報(bào)道效率在4％至47％的范圍內(nèi)。此外，許多分化方案已僅使用一種或兩種hESC株系加以優(yōu)化，并且它們?cè)趇PSC株系的情況下的可再現(xiàn)性是有爭(zhēng)論的。Alsanie,W.等,Stem Cells Devel.22:2459-2476(2013)。

因此，在相對(duì)較短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量純化OPC的改進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化方案是高度合乎需要的。此外，這個(gè)方案在不同PSC株系之間應(yīng)是可再現(xiàn)的，并且應(yīng)是高度高效的。

發(fā)明概述

以下概述本發(fā)明的一些主要方面。額外方面描述于本公開(kāi)的發(fā)明詳述、實(shí)施例、附圖和權(quán)利要求章節(jié)中。本公開(kāi)的各章節(jié)中的描述意圖與其它章節(jié)聯(lián)合加以閱讀。此外，本公開(kāi)的各章節(jié)中所述的各個(gè)實(shí)施方案可以各種不同方式加以組合，并且所有所述組合都意圖屬于本發(fā)明的范圍。

本發(fā)明提供一種在75天內(nèi)產(chǎn)生40％至70％O4⁺OPC的強(qiáng)力分化方案。Douvaras,P.等,Stem Cell Rep.3:250-259(2014)(以引用的方式整體并入本文)。也提供一種用于在僅55天分化之后獲得約30％O4⁺OPC，從而導(dǎo)致成本實(shí)質(zhì)性降低的策略。Douvaras,P.等,Nat.Protoc.(2015)(以引用的方式整體并入本文)。當(dāng)純化時(shí)，O4⁺細(xì)胞能夠進(jìn)行移入，并且在短期(16周)移植研究中移入顫抖(shi/shi)小鼠模型中，顯示與人胎兒OPC類似的髓鞘化潛力。在OPC表達(dá)O4而非PDGFRα所處的階段，通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)純化它們，此舉消除污染細(xì)胞，并且使致腫瘤潛力最小。我們的方案在使用超過(guò)9種hPSC株系的情況下加以驗(yàn)證，其中對(duì)于各株系觀察到極其一致結(jié)果。因此，本發(fā)明提供一種用以從包括胚胎干細(xì)胞(ESC)和iPSC的PSC高效獲得OPC和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的高度可再現(xiàn)方案。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生OLIG2+OPC的方法，所述方法包括：(a)通過(guò)以下方式來(lái)制備PSC集落：(i)在低密度下在表面上接種PSC；以及(ii)在貼壁培養(yǎng)中培養(yǎng)所述PSC 1-2天，由此制備PSC集落；(b)在包含低濃度的RA、至少一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和至少一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述PSC集落至匯合，其中所述培養(yǎng)的首日是第0天；(c)在包含Smoothened激動(dòng)劑(SAG；3-氯-N-[(1r,4r)-4-(甲氨基)環(huán)己基]-N-[3-(吡啶-4-基)苯甲基]苯并[b]噻吩-2-甲酰胺)和低濃度的RA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)匯合細(xì)胞直至細(xì)胞過(guò)度匯合，其中所述細(xì)胞表達(dá)OLIG2；由此產(chǎn)生OLIG2+OPC。

在另一方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生O4+OPC的方法，所述方法包括：(a)在包含Smoothened激動(dòng)劑和低濃度的RA的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)OLIG2+OPC的三維細(xì)胞聚集物約8天；(b)在包含血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophin)3(NT3)的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)所述細(xì)胞聚集物約10天；(c)在2個(gè)球體/cm²的密度下再涂鋪所述細(xì)胞聚集物；以及(d)在貼壁培養(yǎng)中在包含(i)抗壞血酸(AA)或(ii)PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞聚集物直至細(xì)胞為O4+；由此產(chǎn)生O4+OPC。可通過(guò)以下方式來(lái)產(chǎn)生成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞：在不存在PDGF、HGF、IGF-1和NT3下培養(yǎng)O4+OPC約3周；由此產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞，其中所述少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)髓磷脂堿性蛋白(MBP+)。

在另一方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括：(a)通過(guò)以下方式來(lái)制備PSC集落：(i)在低密度下在表面上接種PSC；以及(ii)在貼壁培養(yǎng)中培養(yǎng)所述PSC 1-2天，由此制備PSC集落；(b)在包含低濃度的RA、至少一種TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和至少一種BMP信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述PSC集落至匯合，其中所述培養(yǎng)的首日是第0天；(c)在包含Smoothened激動(dòng)劑和低濃度的RA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)匯合細(xì)胞直至細(xì)胞過(guò)度匯合，其中所述細(xì)胞是OLIG2+OPC；(d)從所述表面提升所述細(xì)胞，由此允許形成三維細(xì)胞聚集物；(e)在包含Smoothened激動(dòng)劑和低濃度的RA的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)所述細(xì)胞聚集物約8天；(f)在包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)所述細(xì)胞聚集物約10天；(g)在2個(gè)球體/cm²的密度下再涂鋪所述細(xì)胞聚集物；(h)在貼壁培養(yǎng)中在包含(i)AA或(ii)PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞聚集物直至細(xì)胞為O4+；由此產(chǎn)生O4+OPC；以及(i)在包含AA并且缺乏PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述O4+OPC直至細(xì)胞為MBP+；由此產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞。

本發(fā)明的另一方面是一種產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括：(a)在貼壁培養(yǎng)中在包含低濃度的RA的培養(yǎng)基中以單層形式培養(yǎng)PSC，(i)第0天至第8天進(jìn)行雙重SMAD抑制，以及(ii)第8天至第12天使用SHH或Smoothened激動(dòng)劑，以產(chǎn)生OLIG2+細(xì)胞；(b)通過(guò)(i)第12天至第20天在包含SHH或Smoothened激動(dòng)劑和低濃度的RA的培養(yǎng)基中，以及(ii)第20天至第30天在包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)步驟(a)的細(xì)胞來(lái)富集OLIG2+細(xì)胞；(c)第30天至第75天在貼壁培養(yǎng)中在包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)的細(xì)胞以產(chǎn)生O4+OPC；以及(d)第75天至第95天在貼壁培養(yǎng)中在包含AA并且缺乏PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述O4+OPC；由此產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞。

本發(fā)明的另一方面是一種產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞的方法，所述方法包括：(a)在貼壁培養(yǎng)中在包含低濃度的RA的培養(yǎng)基中以單層形式培養(yǎng)PSC，(i)第0天至第8天進(jìn)行雙重SMAD抑制，以及(ii)第8天至第12天使用SHH或Smoothened激動(dòng)劑，以產(chǎn)生OLIG2+細(xì)胞；(b)通過(guò)(i)第12天至第20天在包含SHH或Smoothened激動(dòng)劑和低濃度的RA的培養(yǎng)基中，以及(ii)第20天至第30天在包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)步驟(a)的細(xì)胞來(lái)富集OLIG2+細(xì)胞；以及(c)第30天至第60天在貼壁培養(yǎng)中在包含AA并且缺乏PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)的細(xì)胞；由此產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞。

也提供一種鑒定促進(jìn)髓鞘化的化合物的方法，所述方法包括：(a)通過(guò)本發(fā)明方法來(lái)產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞；(b)使所述少突膠質(zhì)細(xì)胞與候選化合物接觸；以及(c)確定所述候選化合物是否促進(jìn)神經(jīng)元髓鞘化。

另一實(shí)施方案是一種治療受試者的神經(jīng)疾病或病癥的方法，所述方法包括：(a)通過(guò)本發(fā)明方法來(lái)產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞；以及(b)向所述受試者施用有效量的所述少突膠質(zhì)細(xì)胞，其中所述少突膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)所述受試者的神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘形成；由此治療所述受試者的所述神經(jīng)疾病。

本發(fā)明也涵蓋通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞以及包含它們的非人哺乳動(dòng)物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示遵循選項(xiàng)A(圖1A)和選項(xiàng)B(圖1B)的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的時(shí)間軸。三角形表示用以通過(guò)免疫熒光評(píng)估階段特異性標(biāo)志物的表達(dá)的推薦時(shí)間點(diǎn)。SB：SB431542；LDN：LDN193189；SAG：Smoothened激動(dòng)劑；T3：三碘甲狀腺原氨酸；RA：全反式視黃酸；PDGF：血小板源性生長(zhǎng)因子；HGF：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；IGF-I：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；NT3：神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素3；AA：抗壞血酸。

圖2顯示獲得OLIG2⁺祖細(xì)胞需要RA和SHH。圖2A顯示在不同RA和SHH條件下分化的第14天對(duì)OLIG2-GFP細(xì)胞的活體成像和流式細(xì)胞計(jì)量定量。從第0天開(kāi)始在100nM的濃度下使用RA導(dǎo)致最高GFP⁺細(xì)胞產(chǎn)率。圖2B顯示在第8天向最佳RA條件添加SHH或SAG之間通過(guò)活體成像和FACS分析進(jìn)行的比較。陰性：hESC株系RUES1。圖2C顯示在最優(yōu)RA和SHH條件下PAX6、OLIG2和NKX2.2的時(shí)序基因表達(dá)概況。誤差棒是SEM(N＝3)。使用RUES1細(xì)胞和OLIG2-GFP報(bào)道體株系獲得類似的結(jié)果。圖2D顯示對(duì)未分選細(xì)胞、分選GFP⁺細(xì)胞或GFP^-細(xì)胞的球體形成的評(píng)估。僅GFP⁺細(xì)胞形成球體，從而提供GFP⁺群體富集。

圖3顯示獲得OLIG2⁺祖細(xì)胞需要SHH和雙重SMAD抑制。圖3A顯示相較于僅從第0天開(kāi)始暴露于RA的細(xì)胞，從第0天開(kāi)始使用RA以及從第8天開(kāi)始使用SHH/SAG的培養(yǎng)物之間在分化的第14天OLIG2、PTCH1和SHH的mRNA水平。未暴露于SHH/SAG的樣品中的內(nèi)源性SHH水平較高。誤差棒是SEM(N＝3)。圖3B顯示在分化的前12天中僅暴露于RA或暴露于RA和SAG的細(xì)胞之間在分化的第75天對(duì)O4⁺細(xì)胞的FACS分析。觀察到在初始分化步驟中未提供以SAG的細(xì)胞中，O4⁺群體降低56％。陰性對(duì)照：僅APC綴合二級(jí)抗體。圖3C顯示在不同SMAD抑制劑下分化的第14天的活體成像和FACS分析。一大群GFP⁺細(xì)胞僅在雙重抑制SMAD蛋白下存在，從而指示RA與雙重抑制SMAD之間具有協(xié)同作用。DSi：雙重SMAD抑制；SB：SB431542；LDN：LDN189193。

圖4顯示從人多能干細(xì)胞產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞。圖4A顯示從hPSC至成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化方案的圖解。圖4B-4M是RUES1細(xì)胞的體外少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的依序步驟，其顯示：在第8天的PAX6⁺神經(jīng)干細(xì)胞(B)，在第12天的多層結(jié)構(gòu)的相差(C)，在第18天的OLIG2⁺NKX2.2⁺前OPC(D)，SOX10⁺OLIG2⁺早期OPC(E)，對(duì)O4⁺晚期OPC的活體成像(F)，O4⁺細(xì)胞的用以突顯分枝突起的剪修圖像(G)，共同表達(dá)OLIG2的O4⁺OPC(H)，共同表達(dá)SOX10的O4⁺OPC(I)，共同表達(dá)SOX10和NG2的分選O4⁺OPC(J)，在低(K)和較高(x64)放大倍數(shù)(L)下的終末分化的MBP⁺少突膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的MAP2⁺和GFAP⁺細(xì)胞(M)。PSC：多能干細(xì)胞；NSC：神經(jīng)干細(xì)胞；OPC：少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞；OL：少突膠質(zhì)細(xì)胞；pO/L：聚L-鳥(niǎo)氨酸/層粘連蛋白。

圖5顯示增殖性少突膠質(zhì)細(xì)胞和其它神經(jīng)細(xì)胞類型。圖5A顯示在分化的第50天OLIG2、SOX10和Ki67的代表性免疫熒光染色。在OLIG2與SOX10之間存在幾乎完全共同定位。圖5B顯示對(duì)Ki67⁺細(xì)胞的時(shí)序定量，其顯示在分化的第30天與第50天之間增殖的OLIG2⁺和SOX10⁺祖細(xì)胞的百分比。誤差棒是SEM(N＝2)。圖5C顯示在第73天培養(yǎng)物的免疫熒光圖像，其顯示O4⁺細(xì)胞的數(shù)目較高，但幾乎沒(méi)有細(xì)胞共同表達(dá)Ki67。圖5D顯示在移除生長(zhǎng)因子之后4周共同表達(dá)MBP的O4⁺細(xì)胞的百分比(神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基)。誤差棒是SEM(N＝4)。圖5E顯示在分化的第78天–第88天3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中MAP2⁺神經(jīng)元和GFAP⁺星形細(xì)胞相對(duì)于細(xì)胞總數(shù)的百分比。誤差棒是SEM(N＝3)。

圖6顯示遵循選項(xiàng)B方案，在分化的第53天(圖6A、6D)、第63天(圖6B、6E)和第73天(圖6C、6F)的活體O4成像。圖6A-6C顯示在低放大倍數(shù)下的代表性區(qū)域；O4⁺細(xì)胞的數(shù)目隨時(shí)間增加。圖6D-6F分別顯示圖6A-6C的較高放大倍數(shù)圖像以突顯細(xì)胞的形態(tài)。圖6G顯示在使用選項(xiàng)B(“快速”)方案(第55天、第63天和第75天)和選項(xiàng)A(“原始”)方案的情況下，在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)計(jì)算的O4⁺細(xì)胞出現(xiàn)率的代表性實(shí)例。比例尺：500μm(6A-6C)；200μm(6D-6F)。

圖7顯示hPSC分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的基本步驟。圖7A顯示在分化的第8天的PAX6⁺神經(jīng)干細(xì)胞(PAX6，綠色；核用DAPI染色，藍(lán)色)。圖7B顯示在第12天的培養(yǎng)物的描繪三維結(jié)構(gòu)的典型形態(tài)。圖7C顯示在第12天的OLIG2和NKX2.2表達(dá)，如通過(guò)免疫熒光分析所示(OLIG2，綠色；NKX2.2，紅色；核用DAPI染色，藍(lán)色)。圖7D顯示球體選擇：箭號(hào)指示良好球體，其是圓形、金色/棕色，具有暗色核心以及具有在300μm與800μm之間的直徑。感嘆號(hào)指示一對(duì)接合球體，其可通過(guò)溫和吸移來(lái)破壞成單一球體。應(yīng)避開(kāi)的聚集物是小型和透明的(箭頭)或極大和在形狀方面不規(guī)則的，通常通過(guò)機(jī)械消化而獲得(星形)。圖7E顯示對(duì)第56天共同表達(dá)NKX2.2(綠色)、SOX10(紅色)和OLIG2(藍(lán)色)的祖細(xì)胞的免疫熒光染色。圖7F顯示O4(綠色)活體染色，其顯示細(xì)胞的高度分枝形態(tài)。圖7G顯示在分化結(jié)束時(shí)的MBP⁺(紅色)少突膠質(zhì)細(xì)胞(核用DAPI染色，藍(lán)色)。圖7H在較高放大倍數(shù)(64x)下顯示MBP⁺(紅色)少突膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。MAP2⁺(綠色)和GFAP⁺(藍(lán)色)細(xì)胞也存在于培養(yǎng)物中。圖7I顯示在分選之后24小時(shí)純化O4⁺細(xì)胞仍然保留典型分枝形態(tài)。比例尺：500μm(圖7A、7B、7G)；200μm(圖7C、7E、7F、7I)；1mm(圖7D)。

圖8顯示PPMS iPSC株系的產(chǎn)生和表征。圖8A顯示對(duì)PPMS株系的mRNA/miRNA重新編程，其顯示在第7天的代表性皮膚纖維母細(xì)胞、在第12天明顯的iPSC樣集落、和在重新編程的第15天的TRA-1-60⁺集落。圖8B顯示PPMS-iPSC 102的多能性標(biāo)志物的免疫熒光。圖8C顯示在體外通過(guò)類胚體達(dá)成自發(fā)性分化之后內(nèi)胚層標(biāo)志物AFP、中胚層標(biāo)志物αSMA和外胚層標(biāo)志物βIII-微管蛋白的免疫熒光。核用DAPI染色。圖8D顯示在將PPMS iPSC注射至免疫缺陷小鼠中之后體內(nèi)畸胎瘤形成物的H&E染色切片，其顯示來(lái)自腺組織(內(nèi)胚層)、軟骨(中胚層)和色素上皮(外胚層)的代表性結(jié)構(gòu)。圖8E顯示未分化PPMS-iPSC和親本纖維母細(xì)胞相對(duì)于hESC株系的多能性基因表達(dá)。ANPEP基因?yàn)槔w維母細(xì)胞所特有。圖8F顯示細(xì)胞發(fā)生分析；所有PPMS-iPSC株系都顯示正常核型。

圖9顯示對(duì)在iPSC株系的情況下畸胎瘤形成物的表征。代表性圖片來(lái)自在將來(lái)自iPSC株系102的細(xì)胞移植至免疫缺陷小鼠中之后體內(nèi)畸胎瘤形成物的內(nèi)胚層(圖9A)、外胚層(圖9B)和中胚層(圖9C)。

圖10顯示PPMS-iPSC在體外產(chǎn)生OPC和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。圖10A-10I是PPMS iPSC的體外少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的依序步驟，其顯示：在第8天的PAX6⁺細(xì)胞(A)，在第12天的相差多層結(jié)構(gòu)(B)，在第12天的OLIG2⁺和NKX2.2⁺細(xì)胞(C)，SOX10⁺OLIG2⁺早期OPC(D)，對(duì)第73天O4⁺晚期OPC的活體成像(E)，O4⁺細(xì)胞的用以突顯分枝突起的剪修圖像(F)，在低(G)和較高(x64)放大倍數(shù)(H)下的終末分化的MBP⁺少突膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中的MAP2⁺細(xì)胞(I)。圖10J顯示在從RUES1和PPMS iPSC分化75天之后通過(guò)FACS分析對(duì)O4⁺細(xì)胞的定量。門(mén)控基于二級(jí)Ab-APC僅用于O4染色，并且PE綴合同種型對(duì)照用于PDGFRα染色(陰性)。總O4⁺細(xì)胞出現(xiàn)率(O4和⁺⁺)顯示于括號(hào)中。

圖11顯示在移植以進(jìn)行體內(nèi)研究之前對(duì)細(xì)胞的表征。圖11A顯示FACS圖，其顯示在生長(zhǎng)在MEF上的iPSC株系中存在多能性標(biāo)志物，并且在分化的第81天在細(xì)胞中缺乏相同標(biāo)志物。圖11B是顯示在分離和低溫保存以進(jìn)行體內(nèi)移植之前用于分選O4⁺細(xì)胞的更嚴(yán)格門(mén)控的圖。圖11C顯示在48小時(shí)的恢復(fù)時(shí)期期間，在低溫保存之后涂鋪的O4⁺分選細(xì)胞的明視野圖像。圖11D顯示在分選OPC的情況下的活體O4染色，其顯示O4和適當(dāng)分枝形態(tài)得以保留。

圖12顯示PPMS源性O(shè)PC移入并在體內(nèi)分化成髓鞘形成性少突膠質(zhì)細(xì)胞。圖12A顯示移植至新生顫抖/rag2小鼠中的人PPMS iPSC源性O(shè)4⁺OPC。在16周時(shí)，人細(xì)胞展現(xiàn)致密移入胼胝體中(hNA，紅色)。許多已分化成MBP表達(dá)性少突膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)，并且遍及胼胝體彌漫性分布。圖12B是顯示小鼠軸突(神經(jīng)絲；NF，紅色)和MBP⁺人少突膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)共同定位的共焦圖像。圖12C和圖12D顯示有髓鞘軸突的電子顯微照片，其展現(xiàn)具有交替主致密線(箭頭)和周期內(nèi)線的特征性緊實(shí)髓磷脂。圖12E顯示移植的人細(xì)胞保留祖細(xì)胞特征，其中約80％的hNA+細(xì)胞表達(dá)OLIG2(綠色；16周)。圖12F顯示在16周時(shí)，個(gè)別NG2細(xì)胞已開(kāi)始向上覆大腦皮質(zhì)中遷移。圖12G顯示iPSC源性O(shè)4分選OPC在體內(nèi)顯示有限雙潛力：發(fā)現(xiàn)僅少許GFAP⁺星形細(xì)胞接近于側(cè)腦室。

圖13顯示已從其獲得iPSC株系的MS患者和健康個(gè)體的人口統(tǒng)計(jì)信息。

圖14顯示皮膚纖維母細(xì)胞向iPSC的重新編程。圖14A顯示在重新編程的第3天，可見(jiàn)在它們的形態(tài)方面具有明顯變化的纖維母細(xì)胞。圖14B顯示在第7天的使用nGFP mRNA加以評(píng)估的轉(zhuǎn)染效率。圖14C顯示在第12天的iPSC樣集落。圖14D顯示在無(wú)飼養(yǎng)層條件下擴(kuò)增的iPSC克隆。

圖15顯示使用nanostring分析對(duì)iPSC株系的多能性的表征。圖15A顯示對(duì)源于MS患者或健康對(duì)照的3種hESC株系、2種纖維母細(xì)胞株系和5種iPSC株系的nanostring分析；iPSC株系不可與hESC株系區(qū)分。圖15B顯示體外自發(fā)性類胚體分化從所有胚層產(chǎn)生細(xì)胞。自左至右：AFP⁺內(nèi)胚層細(xì)胞，Tuji1⁺外胚層細(xì)胞，aSMA⁺中胚層細(xì)胞。

圖16顯示一種用以了解多發(fā)性硬化癥的方法。

發(fā)明詳述

我們開(kāi)發(fā)了一種用以使用化學(xué)成分確定的富含生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基從PSC產(chǎn)生人少突膠質(zhì)細(xì)胞的強(qiáng)力、快速和可再現(xiàn)的分化方案。我們的方案模擬發(fā)育期間的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。在8天內(nèi)，PSC分化成PAX6⁺神經(jīng)干細(xì)胞，其至第12天產(chǎn)生OLIG2⁺祖細(xì)胞。OLIG2⁺細(xì)胞通過(guò)共同表達(dá)NKX2.2而大約在第18天變得定型成少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系，接著通過(guò)上調(diào)SOX10和PDGFRα而大約在第40天分化成早期OPC。表達(dá)由O4抗體識(shí)別的硫酸化糖脂質(zhì)抗原的晚期OPC(O4+)大約在第50天出現(xiàn)，并且至分化的75天達(dá)到細(xì)胞群體的40-70％。O4⁺少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞分選來(lái)分離以進(jìn)行髓鞘化研究，或可終末分化成成熟MBP⁺少突膠質(zhì)細(xì)胞。我們的少突膠質(zhì)細(xì)胞分化方案的時(shí)間軸顯示于圖1中。

基于由對(duì)嚙齒動(dòng)物脊髓胚胎發(fā)育的研究獲得的知識(shí)選擇我們利用來(lái)產(chǎn)生少突膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)路徑。Hu等(2009a)。在體外，RA和SHH信號(hào)傳導(dǎo)模擬pMN環(huán)境，從而誘導(dǎo)PSC分化成OLIG2祖細(xì)胞。在我們的培養(yǎng)中，通過(guò)Smoothened激動(dòng)劑而非人重組SHH蛋白來(lái)活化SHH信號(hào)傳導(dǎo)。我們發(fā)現(xiàn)使RA和SHH信號(hào)傳導(dǎo)與活化素/nodal/TGFβ抑制(通過(guò)SB431542)和BMP4抑制(通過(guò)LDN193189)組合產(chǎn)生最高OLIG2⁺祖細(xì)胞產(chǎn)率。由于SB431542和LDN193189的協(xié)同作用，在第12天，超過(guò)70％的細(xì)胞表達(dá)OLIG2。這是我們的方案與Wang等(2013)的方案之間的關(guān)鍵差異。抑制活化素/nodal/TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)與BMP信號(hào)傳導(dǎo)兩者也被稱為“雙重SMAD抑制”。

在我們的方法與先前公開(kāi)方案之間存在若干其它重要差異。舉例來(lái)說(shuō)，與懸浮培養(yǎng)相對(duì)比，我們?cè)谫N壁培養(yǎng)中開(kāi)始在雙重SMAD抑制的情況下進(jìn)行神經(jīng)誘導(dǎo)。Wang等(2013)；Hu等(2009b)；Nistor等(2005)。使用這個(gè)方法，我們?cè)诘?天僅以10,000個(gè)細(xì)胞/cm²起始，而仍然實(shí)現(xiàn)神經(jīng)祖細(xì)胞的極大擴(kuò)增，并且最終充足產(chǎn)生OPC。此外，發(fā)現(xiàn)我們掌握的最優(yōu)RA濃度是約100nM，其比由其它小組使用的濃度低100倍。Gil,J.E.等,FEBS Letters 583:561–567(2009)；Izrael等(2007)；Nistor等(2005)。此外，在無(wú)外源性SHH的情況下用單獨(dú)RA誘導(dǎo)驚人地產(chǎn)生龐大OLIG2⁺細(xì)胞群體。我們確認(rèn)Smoothened激動(dòng)劑是SHH的高效替代物，并且實(shí)際上顯示我們掌握的優(yōu)越功效(Stacpoole等2013)。此外，值得注意的是，我們的發(fā)明首次顯示在不存在纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)信號(hào)傳導(dǎo)下通過(guò)RA來(lái)誘導(dǎo)OLIG2。已知RA和FGF信號(hào)傳導(dǎo)的組合在雞發(fā)育期間促進(jìn)OLIG2表達(dá)，并且已用于人ESC與iPSC兩者的體外分化。Pouya,A.等,PLoS One6:e27925(2011)；Nistor等(2005)；Novitch,B.G.等,Neuron 40:81-95(2003)。新近研究表明堿性FGF(bFGF)為腹側(cè)前腦來(lái)源的少突膠質(zhì)細(xì)胞的特化所必需，而它在來(lái)自脊髓的少突膠質(zhì)細(xì)胞的特化期間抑制神經(jīng)元分化。Stacpoole等(2013)。然而，我們已在我們的體外分化期間在不存在任何外源性FGF下獲得高OPC產(chǎn)率。最后，在第12天細(xì)胞球體從貼壁培養(yǎng)轉(zhuǎn)變成懸浮培養(yǎng)被證明是富集OLIG2⁺細(xì)胞群體，并且使我們的培養(yǎng)物的分化限定于少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系的關(guān)鍵步驟。

我們也提供首個(gè)證據(jù)表明可通過(guò)使PPMS患者皮膚纖維母細(xì)胞重新編程來(lái)獲得髓鞘形成性少突膠質(zhì)細(xì)胞。關(guān)于MS源性iPSC的唯一先前報(bào)道顯示少突膠質(zhì)細(xì)胞可在體外從來(lái)自單一35歲RRMS患者的整合性的逆轉(zhuǎn)錄病毒重新編程化iPSC株系分化。Song,B.等,Stem Cell Res.8:259–273(2012)。我們證明由源于來(lái)自兩種性別而且年齡是50-62歲的PPMS患者的4種無(wú)整合iPSC株系的OPC達(dá)成的體內(nèi)髓鞘化。因此，本發(fā)明不同于使用iPSC源性O(shè)PC的新近研究，其中我們的iPSC株系源于PPMS患者。此外，已使用晚期OPC標(biāo)志物O4分選用于體內(nèi)移植的細(xì)胞以最大程度限定分化潛力。盡管存在這些差異，但相較于先前報(bào)道的未分選iPSC源性O(shè)PC，PPMS源性O(shè)4⁺分選OPC展現(xiàn)類似移入效率，類似有絲分裂分?jǐn)?shù)和類似比例的宿主包鞘軸突，同時(shí)產(chǎn)生較少GFAP⁺星形細(xì)胞?？傊?，我們的數(shù)據(jù)顯示PPMS源性O(shè)PC在體內(nèi)至少與健康iPSC源性細(xì)胞(Wang等,2013)同等高效，并且確定我們的iPSC獲得和OPC誘導(dǎo)方案可從單患者樣品產(chǎn)生髓鞘形成性少突膠質(zhì)細(xì)胞，其可用于針對(duì)MS的自體細(xì)胞補(bǔ)充療法中。

本發(fā)明的一特定實(shí)施方案是一種通過(guò)首先制備PSC集落來(lái)產(chǎn)生OLIG2+OPC的方法。在低密度下接種(涂鋪)PSC，并且在貼壁培養(yǎng)中使其生長(zhǎng)約1-2天?！暗兔芏取币庵讣s8,000至約11,000個(gè)細(xì)胞/cm²。優(yōu)選在約9,500至約10,500個(gè)細(xì)胞/cm²下，更優(yōu)選在10,000個(gè)細(xì)胞/cm²下接種細(xì)胞。在1-2天之后，PSC形成集落，其優(yōu)選是直徑約75μm至約300μm，更優(yōu)選是直徑約100μm至約250μm。

術(shù)語(yǔ)“PSC”具有它在本領(lǐng)域中的常用含義，即能夠發(fā)育成內(nèi)胚層、外胚層和中胚層細(xì)胞的自我復(fù)制性細(xì)胞。優(yōu)選地，PSC是hPSC。PSC包括ESC和iPSC，優(yōu)選是hESC和hiPSC?？蓪SC接種在包含基質(zhì)(諸如凝膠或基底膜基質(zhì))的表面上。一優(yōu)選基質(zhì)是由恩格布里斯-霍爾姆-斯旺(Engelbreth-Holm-Swarm，EHS)小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)混合物，以包括和的商標(biāo)名銷售。其它適合基質(zhì)包括不限于膠原蛋白(collagen)、纖維結(jié)合蛋白(fibronectin)、明膠、層粘連蛋白(laminin)、聚賴氨酸、玻連蛋白(vitronectin)及其組合。

在其中培養(yǎng)PSC的培養(yǎng)基優(yōu)選包含rho相關(guān)蛋白質(zhì)激酶(ROCK)的抑制劑，例如GSK269962、GSK429286、H-1152、HA-1077、RKI-1447、噻唑威(thiazovivin)、Y-27632或其衍生物。

接著在包含低濃度的RA、至少一種TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和至少一種BMP信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的培養(yǎng)基中以單層形式培養(yǎng)PSC集落至匯合，其中在這個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的首日是第0天?！癛A的低濃度”是約10nM至約250nM。RA的濃度優(yōu)選是約10nM至約100nM、或約25nM至約100nM、或約20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、以及優(yōu)選約100nM或更小。TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑包括例如GW788388、LDN193189、LY2109761、LY2157299和LY364947。TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)的一優(yōu)選抑制劑是小分子SB431542。BMP信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑包括例如DMH1、多索莫非(dorsomorphin)、K02288和諾金(Noggin)。BMP信號(hào)傳導(dǎo)的一優(yōu)選抑制劑是小分子LDN193189。

細(xì)胞在約第8天達(dá)到匯合并表達(dá)PAX6，此時(shí)在包含SHH或Smoothened激動(dòng)劑和低濃度的RA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)匯合細(xì)胞。Smoothened激動(dòng)劑包括例如SAG和樸莫伐明(purmorphamine)。SHH可為重組人SHH。優(yōu)選地，培養(yǎng)基缺乏SHH。從PSC轉(zhuǎn)變成OLIG2⁺祖細(xì)胞伴有大量增殖，在理想情況下至約第12天，這導(dǎo)致培養(yǎng)物變得過(guò)度匯合，從而產(chǎn)生細(xì)胞形成性三維結(jié)構(gòu)?！斑^(guò)度匯合”意指細(xì)胞開(kāi)始彼此堆積，以致并非所有細(xì)胞都與培養(yǎng)表面完全接觸，并且一些細(xì)胞完全不與培養(yǎng)表面接觸，而是僅與其它細(xì)胞接觸。優(yōu)選地，至約第12天，至少約50％、60％或70％的過(guò)度匯合細(xì)胞為OLIG2+。

如果OLIG2+細(xì)胞將進(jìn)一步分化成O4+細(xì)胞，那么從培養(yǎng)表面提升過(guò)度匯合細(xì)胞，此允許形成細(xì)胞聚集物或球體。OLIG2^-細(xì)胞不形成聚集物，因此這個(gè)方法富集OLIG2⁺群體，而OLIG2^-細(xì)胞在隨后培養(yǎng)基更換期間被逐漸消除。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“聚集物”和“球體”可互換使用，并且是指優(yōu)選但未必具有至少約100個(gè)細(xì)胞的多細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)。

提升可以機(jī)械方式用細(xì)胞刮削器或其它適合器具進(jìn)行或以化學(xué)方式進(jìn)行?；瘜W(xué)提升可使用蛋白水解酶實(shí)現(xiàn)，所述蛋白水解酶例如膠原蛋白酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶樣蛋白酶、諸如以商標(biāo)名銷售的重組酶、諸如以商標(biāo)名銷售的天然源性酶及其組合?；瘜W(xué)提升也可使用諸如EDTA的螯合劑或諸如尿素的化合物進(jìn)行。機(jī)械提升或脫離提供細(xì)胞死亡最少的優(yōu)勢(shì)，然而，它產(chǎn)生大小可變的聚集物，因此需要通過(guò)手動(dòng)挑選過(guò)程來(lái)選擇適合球體。良好球體被確定為具有圓形、金色/棕色，具有暗色核心以及具有在約300μm與約800μm之間的直徑的那些。使用諸如酶消化的化學(xué)方法使細(xì)胞脫離主要產(chǎn)生適于進(jìn)一步培養(yǎng)的球體。因此，不需要手動(dòng)挑選球體，并且可使脫離步驟適合于自動(dòng)化并用于高通量研究中。然而，酶消化使細(xì)胞死亡增加，從而產(chǎn)生較低數(shù)目的球體。

我們進(jìn)一步提供一種從OLIG2+OPC產(chǎn)生O4+OPC的方法。在包含Smoothened激動(dòng)劑和低濃度的RA的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)OLIG2+OPC的三維聚集物約8天?？赏ㄟ^(guò)例如如上所述的本發(fā)明方法或通過(guò)本領(lǐng)域中已知的其它方法產(chǎn)生OLIG2+OPC。在包含Smoothened激動(dòng)劑和RA的培養(yǎng)基中約8天之后，使培養(yǎng)基更換為包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3以及任選胰島素(優(yōu)選約10μg/ml至約50μg/ml，更優(yōu)選約25μg/ml)、T3(優(yōu)選約20ng/ml至約100ng/ml，更優(yōu)選約60ng/ml)、生物素(優(yōu)選約50ng/ml至約150ng/ml，更優(yōu)選約100ng/ml)和/或cAMP(優(yōu)選約100nM至約5μM，更優(yōu)選約1μM)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基優(yōu)選缺乏bFGF和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。如果OLIG2+細(xì)胞是通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生，那么懸浮培養(yǎng)優(yōu)選開(kāi)始于約第12天，并且在包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)優(yōu)選開(kāi)始于約第20天。

在包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中懸浮約10天之后，在貼壁培養(yǎng)中在約2個(gè)球體/cm²的密度下涂鋪細(xì)胞聚集物。(這優(yōu)選在約第30天，其中方法開(kāi)始于在包含RA、至少一種TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和至少一種BMP信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)PSC的第0天。)在其上涂鋪和培養(yǎng)細(xì)胞聚集物的表面可包含細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(例如膠原蛋白、纖維結(jié)合蛋白、層粘連蛋白)和/或帶正電荷的聚氨基酸(例如聚精氨酸、聚賴氨酸、聚鳥(niǎo)氨酸)。優(yōu)選地，表面包含層粘連蛋白和/或聚鳥(niǎo)氨酸。

在涂鋪細(xì)胞聚集物后，可繼續(xù)使用包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基(選項(xiàng)A)，或可使用包含AA并且缺乏生長(zhǎng)因子(例如PDGF、HGF、IGF-1、NT3、bFGF和/或EGF)的培養(yǎng)基(選項(xiàng)B)。包含AA的培養(yǎng)基可任選包含胰島素、T3、生物素和/或cAMP。至涂鋪之后約45天，在包含PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞最優(yōu)地為O4+。優(yōu)選地，至涂鋪之后約45天(第75天)，這些細(xì)胞中的至少約35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％為O4+。至涂鋪之后約25天，在包含AA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞最優(yōu)地為O4+。優(yōu)選地，至涂鋪之后約25天(第55天)，這些細(xì)胞中的至少約20％、25％、30％、35％或40％為O4+。優(yōu)選地，至涂鋪之后約33天(第63天)，這些細(xì)胞中的至少約30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％為O4+。優(yōu)選地，至涂鋪之后約45天(第75天)，這些細(xì)胞中的至少約35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％為O4+。

可通過(guò)在不存在PDGF、HGF、IGF-1和NT3下培養(yǎng)O4+OPC約3周直至細(xì)胞為MBP+來(lái)產(chǎn)生表達(dá)髓磷脂堿性蛋白的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞。優(yōu)選地，在缺乏PDGF、HGF、IGF-1和NT3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20天之后，至少約20％、25％、30％、35％、40％或45％的O4+OPC為MBP+。這對(duì)于“選項(xiàng)A”細(xì)胞發(fā)生在約第95天，而對(duì)于“選項(xiàng)B”細(xì)胞發(fā)生在約第60天。培養(yǎng)“選項(xiàng)B”細(xì)胞直至至少約第75天導(dǎo)致MBP+表達(dá)性細(xì)胞的效率較高。

本發(fā)明也涵蓋通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的OPC、少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓磷脂產(chǎn)生性細(xì)胞以及包含它們的非人哺乳動(dòng)物，優(yōu)選是小鼠和/或大鼠。髓磷脂產(chǎn)生性細(xì)胞是產(chǎn)生髓磷脂的任何細(xì)胞，包括不限于少突膠質(zhì)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，髓磷脂產(chǎn)生性細(xì)胞從PSC分化，并且在所述實(shí)施方案中，PSC可為iPSC。iPSC可源于受試者的體細(xì)胞。在一個(gè)方面，受試者患有脫髓鞘或髓鞘形成障礙疾病或病癥。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于從患有MS，特別是PPMS的患者產(chǎn)生病毒性和無(wú)整合iPSC的方法。我們的分化方案可用于使所述iPSC高效分化成OPC和功能性少突膠質(zhì)細(xì)胞，如由顫抖小鼠中的體內(nèi)髓鞘化所證明。

本發(fā)明也提供一種關(guān)于神經(jīng)疾病，優(yōu)選脫髓鞘或髓鞘形成障礙疾病或病癥的模型系統(tǒng)。在一個(gè)方面，模型系統(tǒng)包含從源于患有脫髓鞘或髓鞘形成障礙病狀的受試者的iPSC分化的髓磷脂產(chǎn)生性細(xì)胞。模型系統(tǒng)可進(jìn)一步包含已向其中移植髓磷脂產(chǎn)生性細(xì)胞的非人哺乳動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，非人哺乳動(dòng)物是小鼠或大鼠。由本發(fā)明提供的模型系統(tǒng)可用于研究脫髓鞘或髓鞘形成障礙疾病或病癥，包括了解潛在機(jī)理以及確定治療靶標(biāo)。

本發(fā)明也提供用于通過(guò)根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生OPC或少突膠質(zhì)細(xì)胞；以及向受試者施用有效量的所述細(xì)胞來(lái)治療和/或預(yù)防所述受試者的神經(jīng)疾病或病癥的方法。一旦被移植，少突膠質(zhì)細(xì)胞或已在體內(nèi)分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞的OPC即促進(jìn)受試者的神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘形成。因此，本發(fā)明提供本發(fā)明的OPC或少突膠質(zhì)細(xì)胞治療和/或預(yù)防受試者的神經(jīng)疾病或病癥的用途。神經(jīng)疾病或病癥可為脫髓鞘或髓鞘形成障礙疾病或神經(jīng)退化性疾病。神經(jīng)疾病或病癥可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)或兩者。在一些實(shí)施方案中，脫髓鞘或髓鞘形成障礙疾病是炎癥性脫髓鞘疾病(諸如多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)炎、德維克病(Devic disease)、急性散播性腦脊髓炎和橫貫性脊髓炎)、病毒性脫髓鞘、由獲得性代謝病癥引起的脫髓鞘、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(包括髓鞘形成不足疾病，諸如佩利措伊斯-梅茨巴赫病和遺傳性痙孿性截癱)、X染色體關(guān)聯(lián)的蛋白脂質(zhì)蛋白產(chǎn)生病癥、代謝脫髓鞘和溶酶體貯積病癥(諸如異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良-MLD、泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease)、山多夫氏病(Sandhoff's disease)和克拉伯氏病(Krabbe's disease))、白質(zhì)消融性疾病和腦室周圍白質(zhì)軟化。MS以及特別是PPMS也是可通過(guò)本發(fā)明方法治療或預(yù)防的病狀。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的OPC或少突膠質(zhì)細(xì)胞源于從受試者的體細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC。

與它用于自體細(xì)胞移植的潛力一起，iPSC技術(shù)正作為一種用于開(kāi)發(fā)新藥以及獲得對(duì)疾病發(fā)病機(jī)理的見(jiàn)地的工具而出現(xiàn)。Han,S.S.W.等,Neuron.70:626-644(2011)。本發(fā)明的方法和細(xì)胞將輔助開(kāi)發(fā)對(duì)促進(jìn)髓鞘化的化合物的高通量體外篩選。Lee,S.等,Nat Protoc.8:771-782(2013)。為此，我們提供一種鑒定促進(jìn)髓鞘化的化合物的方法，所述方法包括通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生髓磷脂產(chǎn)生性細(xì)胞；使所述髓磷脂產(chǎn)生性細(xì)胞與候選化合物接觸；以及確定所述候選化合物是否促進(jìn)神經(jīng)元髓鞘化。在一個(gè)實(shí)施方案中，化合物是用于治療神經(jīng)疾病或病癥，諸如脫髓鞘或髓鞘形成障礙病狀的候選治療劑，并且方法包括確定所述候選治療劑是否對(duì)神經(jīng)元髓鞘化具有有益作用，其中所述有益作用指示候選治療劑供治療脫髓鞘或髓鞘形成障礙疾病或病癥使用。有益作用可為例如防止神經(jīng)元脫髓鞘，降低神經(jīng)元脫髓鞘，增加神經(jīng)元傳導(dǎo)性和/或增強(qiáng)神經(jīng)元髓鞘化。優(yōu)選地，以高通量形式執(zhí)行方法。

本發(fā)明的細(xì)胞、系統(tǒng)和方法也可適用于研究神經(jīng)疾病。特定來(lái)說(shuō)，此處所述的PPMS iPSC株系提供一種用以探究神經(jīng)退化過(guò)程，特別是MS中的神經(jīng)退化過(guò)程的新資源(圖16)。

除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本說(shuō)明書(shū)和隨附權(quán)利要求中所用，單數(shù)形式“一”和“所述/該”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。術(shù)語(yǔ)“一”以及術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(種)或多個(gè)(種)”和”至少一個(gè)(種)”可互換使用。

此外，“和/或”應(yīng)視為特定公開(kāi)兩個(gè)指定特征或組分中的各個(gè)，伴有或不伴有另一個(gè)。因此，如諸如“A和/或B”的短語(yǔ)中所用的術(shù)語(yǔ)“和/或”意圖包括A和B、A或B、A(單獨(dú))和B(單獨(dú))。同樣，如諸如“A、B和/或C”的短語(yǔ)中所用的術(shù)語(yǔ)“和/或”意圖包括A、B和C；A、B或C；A或B；A或C；B或C；A和B；A和C；B和C；A(單獨(dú))；B(單獨(dú))；和C(單獨(dú))。

除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與由本發(fā)明所相關(guān)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。舉例來(lái)說(shuō)，The Dictionary of Cell and Molecular Biology(第5版J.M.Lackie編,2013)、Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(第2版R.Cammack等編,2008)以及The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology,P-S.Juo,(第2版2002)可提供技術(shù)人員以本文所用的一些術(shù)語(yǔ)的一般性定義。

單位、前綴和符號(hào)以它們的國(guó)際單位制(Système International de Unites；SI)接受形式表示。數(shù)值范圍包括界定范圍的數(shù)值。本文提供的標(biāo)題并非是對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，所述各個(gè)方面或?qū)嵤┓桨缚赏ㄟ^(guò)參考說(shuō)明書(shū)整體而得到。因此，通過(guò)參考說(shuō)明書(shū)整體，以下緊接著定義的術(shù)語(yǔ)得以更充分闡釋。

每當(dāng)以措辭“包含”描述實(shí)施方案時(shí)，包括以“由…組成”和/或“基本上由…組成”描述的另外類似實(shí)施方案。

就“受試者”或“個(gè)體”或“患者”來(lái)說(shuō)，其意指需要診斷、預(yù)后或療法的任何受試者，特別是哺乳動(dòng)物受試者。哺乳動(dòng)物受試者包括人、家養(yǎng)動(dòng)物、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、體育動(dòng)物和動(dòng)物園動(dòng)物，包括例如人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、豬等。

諸如“治療”或“用以治療”或“緩和”或“用以緩和”的術(shù)語(yǔ)是指治愈、減緩、減輕診斷的病理性病狀或病癥的癥狀和/或使診斷的病理性病狀或病癥的進(jìn)展停止的治療措施。因此，需要治療者包括已患有病癥的那些。在某些實(shí)施方案中，如果患者顯示與疾病或病癥相關(guān)的癥狀例如完全、部分或短暫緩和或消除，那么受試者的神經(jīng)疾病或病癥，特別是脫髓鞘或髓鞘形成障礙疾病或病癥根據(jù)本文提供的方法得以成功“治療”。

“預(yù)防”是指防止和/或減緩所靶向的病理性病狀或病癥的發(fā)展的防治性或預(yù)防性措施。因此，需要預(yù)防者包括易患或易感于疾病或病癥的那些。在某些實(shí)施方案中，如果相比于尚未經(jīng)受本發(fā)明方法的患者，患者短暫或永久顯現(xiàn)較少或嚴(yán)重性較小的與疾病或病癥相關(guān)的癥狀，或較晚發(fā)作與疾病或病癥相關(guān)的癥狀，那么神經(jīng)疾病或病癥，特別是脫髓鞘或髓鞘形成障礙疾病或病癥根據(jù)本文提供的方法得以成功預(yù)防。

本發(fā)明進(jìn)一步描述于以下非限制性實(shí)施例中。

實(shí)施例

實(shí)施例1.少突膠質(zhì)細(xì)胞從hESC株系分化

我們使用OLIG2-GFP敲入hESC報(bào)道體株系(Liu等,2011)來(lái)通過(guò)活體熒光成像追蹤OLIG2⁺祖細(xì)胞。首先，我們?cè)谫N壁培養(yǎng)中使用雙重SMAD信號(hào)傳導(dǎo)抑制來(lái)誘導(dǎo)PAX6⁺細(xì)胞。Chambers,S.M.等,Nat Biotechnol.27:275-80(2009)。接著，為模擬胚胎脊髓環(huán)境，我們?cè)诟鞣N時(shí)間施加不同濃度的RA和/或SHH，并且通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)定量OLIG2-GFP表達(dá)(圖2A)。從誘導(dǎo)開(kāi)始施加100nM RA產(chǎn)生40.6％的OLIG2⁺祖細(xì)胞，而從第8天開(kāi)始在100ng/ml下添加SHH使產(chǎn)率增加至57.7％(圖2B)。引起關(guān)注的是，在前12天期間無(wú)外源性SHH的細(xì)胞顯示SHH mRNA上調(diào)(圖3A)，并且分化成O4⁺細(xì)胞，但相較于用SHH處理的細(xì)胞，效率較低(圖3B)。

我們接著用SAG替換重組人SHH蛋白，此使產(chǎn)率進(jìn)一步增加至70.1％OLIG2⁺祖細(xì)胞(圖2B)。在第12天，使細(xì)胞脫離并放置至低附著板中以促進(jìn)它們聚集成球體。為形成球體所需的最小細(xì)胞數(shù)目是至少100個(gè)細(xì)胞，并且我們注意到球體中的大多數(shù)細(xì)胞為GFP⁺。為對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步探究，我們關(guān)于GFP分選第12天培養(yǎng)物，并且觀察到僅GFP⁺細(xì)胞形成聚集物(圖2C)。這表明單獨(dú)聚集步驟提供OLIG2⁺群體富集。

接著，我們通過(guò)使第二hESC株系(RUES1)分化，以及通過(guò)qRT-PCR比較PAX6、OLIG2和NKX2.2的轉(zhuǎn)錄物水平來(lái)驗(yàn)證初始步驟朝向OLIG2⁺祖細(xì)胞的產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)遵循與OLIG2-GFP株系的時(shí)序樣式類似的時(shí)序樣式，其中PAX6誘導(dǎo)大約第7天，OLIG2峰值大約第13天，并且NKX2.2的可持續(xù)高水平在第10天之后(圖2D)?；谶@些結(jié)果，我們使用非遺傳修飾的RUES1株系來(lái)開(kāi)發(fā)方案的從OLIG2⁺祖細(xì)胞至MBP⁺成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞的隨后步驟(圖4A)。PAX6⁺細(xì)胞在第7天產(chǎn)生，并且至第12天，它們排列成多層結(jié)構(gòu)(圖4B、4C)。從第12天至第30天，使細(xì)胞以球體形式生長(zhǎng)，接著涂鋪于聚L-鳥(niǎo)氨酸/層粘連蛋白(pO/L)涂布的培養(yǎng)皿上以進(jìn)行方案的其余部分。

為促進(jìn)朝向O4⁺階段成熟，從第20天開(kāi)始，添加PDGF-AA、HGF、IGF1和NT3至培養(yǎng)基中。OLIG2⁺祖細(xì)胞上調(diào)NKX2.2，接著上調(diào)SOX10，并且最終成熟成晚期OPC，通過(guò)O4活體染色以及通過(guò)它們的高度分枝突起所鑒定(圖4D-4G)。表達(dá)OLIG2、SOX10和NG2的O4⁺OPC(圖4H-4J)早在第50天即出現(xiàn)，并且它們的數(shù)目大約第75天顯著增加。在分化期間，40-50％的祖細(xì)胞具有增殖性，如通過(guò)Ki67染色所指示。然而，高度分枝的O4⁺細(xì)胞在體外不分裂(圖5A-5C)。另外，在從培養(yǎng)基撤除生長(zhǎng)因子之后，34±4％的O4⁺OPC持續(xù)至少2周分化成MBP⁺成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖4K-4L、圖5D)。這些培養(yǎng)物也由其它細(xì)胞類型，即總細(xì)胞的分別15±2％GFAP⁺星形細(xì)胞和20±2％MAP2⁺神經(jīng)元組成(圖4M、圖5E)。

我們也使用替代性策略來(lái)在僅培養(yǎng)55天之后產(chǎn)生約30％O4⁺細(xì)胞，從而顯著降低分化時(shí)長(zhǎng)和成本。早在第30天即從培養(yǎng)基撤除有絲分裂原PDGF、NT3、IGF-1和HGF，此時(shí)接種所選球體。這導(dǎo)致在第55天出現(xiàn)O4⁺細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)以使O4⁺細(xì)胞的出現(xiàn)率增加至與較長(zhǎng)久方案類似的水平(圖6)。

如表1中所示，在9種不同PSC株系的情況下，O4效率在28％至80％的范圍內(nèi)，并且在4種株系中的平均值大于60％。用O4抗體染色細(xì)胞，并且通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)來(lái)分析。測(cè)試1種hESC株系(RUES1)和8種hiPSC株系。使用不同批次的各株系在不同繼代下進(jìn)行技術(shù)平行測(cè)定。結(jié)果也表示為平均百分比±SEM。

表1.在約75天分化之后的O4⁺OPC百分比

N＝技術(shù)重復(fù)測(cè)定的數(shù)目

在兩種策略中，撤除有絲分裂原均驅(qū)動(dòng)OPC終末分化成表達(dá)MBP的少突膠質(zhì)細(xì)胞，但在這些培養(yǎng)條件下MBP⁺細(xì)胞不與軸突纖維對(duì)準(zhǔn)(圖7G、7H)。對(duì)于髓鞘化研究，可通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)純化O4⁺OPC，并且在體內(nèi)進(jìn)行移植。也可在分選之后立刻低溫保存O4⁺細(xì)胞，并且在移植之前24-48小時(shí)解凍。

如上所述，在方案的各個(gè)階段，通過(guò)qRT-PCR或免疫熒光來(lái)檢查培養(yǎng)物的適當(dāng)標(biāo)志物的表達(dá)。當(dāng)在第8天關(guān)于PAX6(圖7A)以及在第12天關(guān)于OLIG2和NKX2.2(圖7C)對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行免疫熒光分析時(shí)，出現(xiàn)率應(yīng)大于90％(對(duì)于PAX6⁺細(xì)胞)、70％(對(duì)于OLIG2⁺細(xì)胞)和30％(對(duì)于OLIG2⁺/NKX2.2⁺細(xì)胞)。至第40-50天，SOX10應(yīng)被表達(dá)，并且應(yīng)與OLIG2和NKX2.2共同定位(圖7E)。第50至75天，可進(jìn)行活體O4染色以檢測(cè)O4⁺細(xì)胞的出現(xiàn)和它們的擴(kuò)增(圖6A-6F、圖7F)。在人發(fā)育中，OPC的特征在于表達(dá)PDGFRα和NG2，隨后表達(dá)O4。Jakovcevski,I.等,Front Neuroanat.3:5(2009)。在我們的培養(yǎng)條件下，至第75天，大多數(shù)O4⁺細(xì)胞已喪失PDGFRα，但已保留NG2表達(dá)。在這個(gè)階段，我們未在培養(yǎng)中觀察到任何殘余多能細(xì)胞。

最后，O4⁺細(xì)胞可通過(guò)FACS分離，或進(jìn)一步分化成MBP⁺少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖7G、7H)。其它細(xì)胞類型也存在于第75天培養(yǎng)物中，但百分比較低。我們通常發(fā)現(xiàn)占總細(xì)胞群體的約15％的GFAP⁺細(xì)胞和約20％βIII-微管蛋白⁺細(xì)胞(圖7H)。在最終分化步驟之后，當(dāng)在神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞2周時(shí)，約35％的O4⁺細(xì)胞也應(yīng)表達(dá)MBP。

實(shí)施例2.少突膠質(zhì)細(xì)胞從PPMS-iPSC株系分化

為顯示我們的方案可應(yīng)用于iPSC株系，我們從4名PPMS患者獲得皮膚活檢體。從活檢體建立纖維母細(xì)胞培養(yǎng)物，并且使用以修飾的mRNA的混合物(Warren等,Cell Stem Cell.7:618-30(2010))以及一組用以改進(jìn)最難應(yīng)對(duì)的株系的重新編程效率的miRNA(Stemgent)進(jìn)行的每日轉(zhuǎn)染來(lái)產(chǎn)生iPSC。從重新編程的第12天至第15天，通過(guò)活體染色來(lái)鑒定TRA-1-60⁺集落(圖8A)，挑選，擴(kuò)增，并且通過(guò)免疫熒光來(lái)表征其多能性標(biāo)志物(圖8B)。

對(duì)7個(gè)多能性基因的表達(dá)剖析確認(rèn)所有4種iPSC株系都展現(xiàn)與參照hESC株系類似的，以及與親本纖維母細(xì)胞相異的概況(圖8C)。所有iPSC株系都顯示正常核型(圖8D)，并且能夠在體外通過(guò)自發(fā)性類胚體分化(圖8E)，以及在體內(nèi)通過(guò)畸胎瘤測(cè)定(圖8F；圖9)分化成具有3個(gè)胚層的細(xì)胞類型。

接著，我們?cè)u(píng)估方案是否可用我們的PPMS-iPSC株系再現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)所有測(cè)試iPSC株系的表現(xiàn)都與RUES1株系類似(圖10A-10I)。方案是極度可再現(xiàn)的和高度高效的，如由分選的O4⁺OPC的出現(xiàn)率所計(jì)算，其中從RUES1獲得多達(dá)70％O4⁺細(xì)胞，并且從PPMS iPSC株系獲得43.6％-62.1％。另外，我們發(fā)現(xiàn)O4⁺部分含有伴有PDGFRα的雙重陽(yáng)性細(xì)胞的子群體(圖10J)。O4⁺細(xì)胞可易于通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)純化，冷凍以及解凍，而不喪失它們的形態(tài)(圖11D)。

實(shí)施例3.由PPMS源性晚期OPC對(duì)小鼠腦進(jìn)行軸突髓鞘化

為驗(yàn)證通過(guò)我們的方案獲得的OPC具有髓鞘形成功能，我們將第75天FACS純化O4⁺細(xì)胞(10⁵個(gè)細(xì)胞/動(dòng)物)注射至新生免疫損害顫抖小鼠的前腦中(圖11A)。注射的細(xì)胞中的任何污染iPSC都被清除，如通過(guò)對(duì)多能性標(biāo)志物SSEA4和TRA-1-60的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析所示(圖11B)。然而，我們?cè)隗w內(nèi)移植之前純化我們的培養(yǎng)物以保留用于向臨床研究轉(zhuǎn)化的潛力。將細(xì)胞冷凍，解凍，并且在移植之前使其恢復(fù)24-48小時(shí)(圖11C)。在12-16周處死動(dòng)物，此時(shí)人hNA⁺細(xì)胞遍及胼胝體和前腦白質(zhì)加以分布。在12周時(shí)，胼胝體中的hNA⁺細(xì)胞密度是34,400±3,090個(gè)細(xì)胞/mm³，并且至16周，人細(xì)胞的數(shù)目已從12周以來(lái)近似加倍。我們未觀察到存在細(xì)胞團(tuán)或明顯腫瘤發(fā)生，并且在12周時(shí)，移入的hNA⁺細(xì)胞的增殖分?jǐn)?shù)是17％，并且在16周時(shí)，降低至僅8％Ki67⁺，此時(shí)僅5％的細(xì)胞為PCNA⁺。重要的是，胼胝體中超過(guò)80％的hNA⁺細(xì)胞共同表達(dá)OLIG2蛋白，從而表明移入的細(xì)胞限定于少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系(圖12E)。此外，發(fā)現(xiàn)在12和16周時(shí)，人MBP⁺少突膠質(zhì)細(xì)胞彌漫性遍及移入的胼胝體(圖12A)。在16周時(shí)，在移入的小鼠胼胝體內(nèi)，31±3％的宿主小鼠軸突被包鞘(圖12B)。

對(duì)16周齡胼胝體的透射電子顯微術(shù)檢查揭示存在交替主致密線和周期內(nèi)線的成熟緊實(shí)髓磷脂(圖12C、12D)；而未注射的顫抖/rag2小鼠具有稀薄和松散覆蓋的髓磷脂。同樣，如通過(guò)g比率測(cè)量結(jié)果評(píng)估的髓磷脂包鞘厚度反映若干胼胝體軸突中正常髓磷脂的恢復(fù)。

在12周時(shí)，移植的hNA⁺細(xì)胞在胼胝體中保持為NG2⁺OPC(圖12E)，并且至16周，它們開(kāi)始向上覆大腦皮質(zhì)遷移(圖12F)。極少數(shù)O4分選細(xì)胞經(jīng)受分化而成為hGFAP⁺星形細(xì)胞，并且大多數(shù)hGFAP⁺細(xì)胞定位于SVZ以及在腦室周圍(圖12G)，從而表明局部環(huán)境可誘導(dǎo)這些區(qū)域中的星形細(xì)胞分化。類似地，hNESTIN表達(dá)性細(xì)胞很少見(jiàn)于胼胝體中，并且同樣集中在SVZ中。重要的是，未在任何移入動(dòng)物中檢測(cè)到βIII-微管蛋白⁺神經(jīng)元?？傊覀兊臄?shù)據(jù)證明PPMS源性O(shè)4分選細(xì)胞能夠在體內(nèi)達(dá)成成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞分化以及形成類似于腦中正常髓磷脂的致密緊實(shí)髓磷脂。

實(shí)施例4.實(shí)施例1-3的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)程序

細(xì)胞系

使用3種hESC株系和4種hiPSC株系。RUES1和HUES 45均是NIH核準(zhǔn)的hESC株系；OLIG2-GFP報(bào)道體株系源于BG01hESC株系(University of Texas Health Science Center at Houston)。4種iPSC株系在我們的實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)mRNA/miRNA方法(Stemgent)而由PPMS患者的皮膚活檢體獲得。

hPSC培養(yǎng)條件

用HUESM(人胚胎干性培養(yǎng)基(HUman Embryonic Stem Medium))培養(yǎng)基和10ng/ml bFGF(Stemcell Technologies)于小鼠胚胎纖維母細(xì)胞(MEF)層上培養(yǎng)和擴(kuò)增hESC和hiPSC株系。對(duì)于少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，使細(xì)胞適應(yīng)于在涂布的培養(yǎng)皿和mTeSR1培養(yǎng)基(Stemcell Technologies)上培養(yǎng)。HUESM由全都購(gòu)自Life Technologies(Grand Island,NY)的Knockout-DMEM、20％Knock-out血清、2mM glutamax、0.1mM NEAA、1X P/S和0.1mMβ-巰基乙醇組成。在所有分化階段，細(xì)胞都在5％CO₂孵育器中加以培養(yǎng)。

詳細(xì)分化方案

將PSC于含有10μM ROCK抑制劑Y-27632(Stemgent；Cambridge,MA)的mTeSR1培養(yǎng)基(Stemcell Technologies；Vancouver,BC,Canada)中在10x10³個(gè)細(xì)胞/cm²的密度下涂鋪在(BD Biosciences；San Jose,CA)上24小時(shí)。涂鋪的hPSC的這個(gè)密度是優(yōu)化的以至第8天產(chǎn)生匯合孔，并且在分化的第12天產(chǎn)生多層結(jié)構(gòu)。這個(gè)設(shè)置不需要大量PSC擴(kuò)增，因?yàn)?孔板的僅1個(gè)孔(80％匯合)含有足以分化和分離至少2x10⁶個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞。孵育細(xì)胞1-2天，直至hPSC集落達(dá)到100-250μm的直徑。

在分化誘導(dǎo)當(dāng)天(第0天)，將培養(yǎng)基變換為神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其是含有10μM小分子SB431542(Stemgent)和250nM LDN193189(Stemgent)以及100nM全反式RA(Sigma-Aldrich；St.Louis,MO)的mTeSR定制培養(yǎng)基(Stemcell Technologies)。mTeSR定制培養(yǎng)基與可商購(gòu)獲得的mTeSR-1培養(yǎng)基具有相同組成，但不具有5種維持多能性的因子，即氯化鋰、GABA、哌啶酸、bFGF和TGFβ1(Stemcell Technologies)。替代mTeSR定制培養(yǎng)基，我們也可使用添加約25μg/ml胰島素的DMEM/F12。每日進(jìn)行培養(yǎng)基更換直至第8天，其中每天添加新鮮RA、SB431542和LDN193189至培養(yǎng)基中。

至第8天，細(xì)胞應(yīng)達(dá)到匯合，并且PAX6表達(dá)應(yīng)處于它的峰值(圖7A)。在第8天，將培養(yǎng)基變換為含有100nM RA、1μM SAG(EMD Millipore；Billerica,MA)或100ng/ml rhSHH(R&D Systems；Minneapolis,MN)的N₂培養(yǎng)基，每日更換，其中每天添加新鮮RA和SAG至培養(yǎng)基中。

至第12天，過(guò)度匯合細(xì)胞進(jìn)行堆積，并且3D結(jié)構(gòu)明顯可見(jiàn)(圖7B)；這是繼續(xù)進(jìn)行分化之前的重要檢查點(diǎn)。細(xì)胞表達(dá)OLIG2和NKX2.2(圖7C)。在第12天，以機(jī)械方式或以酶法使粘著細(xì)胞脫離以允許形成球體。球體形成使OLIG2⁺祖細(xì)胞富集。僅OLIG2⁺細(xì)胞聚集成球體，而OLIG2^-細(xì)胞保持為單細(xì)胞。使用機(jī)械單層分散，我們獲得最高數(shù)目的球體，并且最終獲得最高數(shù)目的O4⁺細(xì)胞。使用酶促單層分散，我們以較低數(shù)目獲得更均一球體。對(duì)于機(jī)械脫離，使用細(xì)胞提升器使細(xì)胞脫離，所述提升器將單細(xì)胞層破壞成小團(tuán)塊以使?fàn)I養(yǎng)物可到達(dá)聚集物內(nèi)的所有細(xì)胞。在顯微鏡下檢查各孔以確保無(wú)細(xì)胞保持附著。對(duì)于酶消化，添加(1ml/2ml DMEM/F12培養(yǎng)基)至各孔中以使培養(yǎng)物解離成單細(xì)胞混懸液。

將聚集物于含有1μM SAG的N₂B₂₇培養(yǎng)基中再涂鋪至超低附著板中，每隔一天更換培養(yǎng)基。在第20天，將培養(yǎng)基變換為PDGF培養(yǎng)基，并且每隔一天進(jìn)行2/3培養(yǎng)基更換。在培養(yǎng)基更換期間，使用溫和吸移來(lái)使彼此粘著的任何聚集物分開(kāi)。在第30天，將球體在2個(gè)球體/cm²的密度(6孔板中每孔約20個(gè)球體)下涂鋪于用聚L-鳥(niǎo)氨酸氫溴酸鹽(50μg/ml；Sigma-Aldrich)和層粘連蛋白(20μg/ml；Life Technologies)涂布的板上。這個(gè)密度是優(yōu)化的以允許細(xì)胞從球體向外遷移，增殖并到方案結(jié)束時(shí)擴(kuò)散至整個(gè)培養(yǎng)皿而無(wú)需傳代。我們使用p200吸移器來(lái)挑選具有300與800μm之間的直徑，具有暗色中心的圓形、金色/棕色聚集物(圖7D)。我們避開(kāi)完全透明的球體，因?yàn)檫@些不分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞。

在這個(gè)階段，在含有有絲分裂原的培養(yǎng)基中(選項(xiàng)A)或在無(wú)任何有絲分裂原的培養(yǎng)基中(選項(xiàng)B)培養(yǎng)涂鋪的球體。選項(xiàng)A是優(yōu)化的以獲得最高O4⁺細(xì)胞產(chǎn)率，而選項(xiàng)B被開(kāi)發(fā)來(lái)提供方案的較短時(shí)和成本較小形式。

選項(xiàng)A

在第30天將球體于PDGF培養(yǎng)基中涂鋪在如上所述的pO/L板上，每隔一天更換2/3的PDGF培養(yǎng)基直至分化的第75天。從第55天開(kāi)始，通過(guò)活體O4染色來(lái)評(píng)估O4⁺細(xì)胞的出現(xiàn)(圖6)。在第75天，可通過(guò)FACS分離O4+OPC(圖7I)?；蛘?，對(duì)于終末少突膠質(zhì)細(xì)胞分化(圖7G、7H)，從第75天開(kāi)始在神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，每3天更換2/3的培養(yǎng)基，持續(xù)2周。

選項(xiàng)B

在第30天將球體于神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基中涂鋪在如上所述的pO/L板上，每隔一天更換2/3的神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基直至分化的第55天。在第55天，O4⁺細(xì)胞通過(guò)活體O4染色來(lái)顯像(圖6A-F、圖7F)或通過(guò)FACS分離(圖6G)。在第75天，可通過(guò)FACS分離O4+OPC?；蛘撸古囵B(yǎng)物保持在神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基中直至第75天以增加O4+細(xì)胞的效率(圖6)。我們?cè)诩s第60天開(kāi)始觀察到MBP+細(xì)胞。

對(duì)于選項(xiàng)A方案與選項(xiàng)B方案兩者，在第30天的聚集物和在分化結(jié)束時(shí)的細(xì)胞均可以活力>70％加以低溫保存。聚集物的活力基于在解凍之后重新附著于pO/L涂布的培養(yǎng)皿上的解凍球體的數(shù)目?？稍诜诌x之后立刻冷凍分選的O4⁺細(xì)胞。分選的O4⁺細(xì)胞的預(yù)期解凍后活力是70–80％。

表2提供用于方案中的培養(yǎng)基組成的清單。

表2.詳細(xì)培養(yǎng)基組成

從穿孔活檢體獲得皮膚纖維母細(xì)胞

從MS患者和健康個(gè)體獲得皮膚活檢體(圖13)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)診斷準(zhǔn)則，紐約蒂施多發(fā)性硬化癥研究中心(Tisch Multiple Sclerosis Research Center of New York)的4名去識(shí)別化患者被診斷有PPMS。在機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)核準(zhǔn)(BRANY)和知情同意書(shū)后獲得他們的活檢體。所有患者都是高加索人?；颊?02和107是男性，分別是56和61歲；患者104和109是女性，分別是62和50歲。

將3mm的皮膚活檢體收集在由RPMI 1460(Life Technologies)和1X抗生素-抗霉菌素(Life Technologies)組成的活檢體收集培養(yǎng)基中。將活檢體切成較小斷片(<1mm)，并且涂鋪于TC處理的35mm培養(yǎng)皿上5分鐘以進(jìn)行干燥，并且最后將它們?cè)谟蒏nockout DMEM、2mM GLUTAMAX^TM、0.1mM NEAA、0.1mMβ-巰基乙醇、10％胎牛血清(FBS)、1X青霉素-鏈霉素(P/S；全都來(lái)自Life Technologies)和1％核苷(EMD Millipore)組成的活檢體涂鋪培養(yǎng)基中孵育5天或直至最早纖維母細(xì)胞從活檢體長(zhǎng)出?；蛘撸?7℃下用1000U/ml膠原蛋白酶1A(Sigma-Aldrich)消化活檢體1.5小時(shí)，洗滌，收集，并且于活檢體涂鋪培養(yǎng)基中涂鋪于1％明膠涂布的35mm培養(yǎng)皿上5天。接著在由DMEM(Life Technologies)、2mM GLUTAMAX^TM、0.1mM NEAA、0.1mMβ-巰基乙醇、10％FBS和1X P/S組成的培養(yǎng)基中擴(kuò)增纖維母細(xì)胞，每隔一天更換培養(yǎng)基。

皮膚纖維母細(xì)胞的重新編程

使用Stemgent mRNA/miRNA試劑盒使處于3至5代的皮膚纖維母細(xì)胞重新編程，所述試劑盒導(dǎo)致通過(guò)OCT4、SOX2、KLF4、cMYC和LIN28的修飾RNA來(lái)產(chǎn)生無(wú)整合無(wú)病毒人iPSC(圖14)。已發(fā)現(xiàn)添加一組特定miRNA會(huì)增加重新編程的效率(Stemgent)。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，將纖維母細(xì)胞于培養(yǎng)基中以5.5x10³個(gè)細(xì)胞/cm²密度涂鋪于基質(zhì)膠涂布的6孔或12孔板上。次日，用含有B18R的NuFF條件化Pluriton重新編程培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。使用STEMFECT^TM如下連續(xù)11天轉(zhuǎn)染細(xì)胞：第0天，僅miRNA；第1天至第3天，僅mRNA混合物，第4天，miRNA加mRNA混合物；第5天至第11天，僅mRNA混合物。在第11天之后，挑選活體TRA-1-60染色陽(yáng)性可見(jiàn)集落，并且在使用HUESM培養(yǎng)基的情況下再涂鋪在MEF上。

畸胎瘤測(cè)定

根據(jù)由哥倫比亞機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)核準(zhǔn)的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

使用膠原蛋白酶(Sigma-Aldrich)在37℃下使iPSC集落解離15分鐘，洗滌，收集，并且再混懸于200μl HUESM中。接著使細(xì)胞與200μl Matrigel^TM(BD Biosciences)在冰上混合，并且皮下注射至免疫缺陷小鼠(Jackson Laboratory；Bar Harbor,ME)中。使畸胎瘤生長(zhǎng)9–12周，通過(guò)解剖加以分離，并且在4℃下于4％PFA中固定過(guò)夜。使固定組織包埋在石蠟中，以10μm厚度切片，并且用蘇木精和曙紅(H&E)染色。

體外自發(fā)性分化

用(Life Technologies)在37℃下使iPSC解離5分鐘，并且于無(wú)bFGF的HUESM中接種至超低附著6孔板中，每隔一天更換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)3周之后，將類胚體(EB)涂鋪于1％明膠涂布的TC處理培養(yǎng)皿上，再持續(xù)2周。在室溫下將EB和它們的外生長(zhǎng)物于4％PFA中固定8分鐘，并且針對(duì)適當(dāng)標(biāo)志物進(jìn)行免疫染色。

RNA分離和qRT-PCR

使用含QIAshredder的RNeasy Plus小型試劑盒(Qiagen；Hilden,Germany)進(jìn)行RNA分離。簡(jiǎn)要來(lái)說(shuō)，集結(jié)細(xì)胞，用PBS洗滌，并且再混懸于溶解緩沖液中。接著將樣品儲(chǔ)存在-80℃下直至根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)一步處理。將RNA洗脫于30μl無(wú)RNA酶ddH₂O中，并且用NanoDrop 8000分光光度計(jì)(Thermo Scientific；Somerset,NJ)定量。

對(duì)于qRT-PCR，使用GoScript^TM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega；Madison,WI)，用0.5μg RNA和隨機(jī)引物合成cDNA。接著將20ng cDNA連同10μl qPCR主混合物和1μl各引物(10nM)一起以20μl反應(yīng)形式裝載至96孔反應(yīng)板中，并且在Stratagene Mx300P qPCR系統(tǒng)(Agilent Technologies；Santa Clara,CA)中操作所述板。表3列出引物序列。

表3.用于qRT-PCR的引物的序列

對(duì)多能性的Nanostring分析

如先前所述從未分化iPSC和hESC HUES45分離RNA。裝載RNA(100ng/樣品)以用于根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)與特定報(bào)道體編碼組和捕集探針組(NanoString Technologies；Seattle,WA)雜交。相對(duì)于以下持家基因使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：ACTB、POLR2A、ALAS1。數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于hESC株系的表達(dá)的倍數(shù)變化(HUES45＝1)。參見(jiàn)圖15。

核型確定

所有iPSC株系都經(jīng)受由Cell Line Genetics進(jìn)行的細(xì)胞發(fā)生分析以確認(rèn)正常核型。

免疫染色和成像

將細(xì)胞于PBS-T(含有0.1％曲通(Triton)-X100的PBS)中洗滌3次，每次10分鐘，在阻斷血清(含5％山羊或驢血清的PBS-T)中孵育2小時(shí)，并且在4℃下施加初級(jí)抗體過(guò)夜(表4)。次日，將細(xì)胞于PBS-T中洗滌3次，每次15分鐘，與二級(jí)抗體一起在室溫(RT)下孵育2小時(shí)，于PBS-T中洗滌3次，每次10分鐘，用DAPI在室溫下復(fù)染15分鐘，并且于PBS中洗滌2次。Invitrogen^TM Alexa Fluor二級(jí)抗體山羊或驢抗小鼠、大鼠、兔、山羊和雞488、555、568和647在1:500稀釋度下加以使用(Life Technologies)。

使用配備有針對(duì)熒光的Olympus DP30BW黑白數(shù)碼相機(jī)和針對(duì)H&E染色的DP72數(shù)碼彩色相機(jī)的Olympus IX71倒置顯微鏡獲得圖像。使用Olympus軟件DP Manager或用ImageJ以數(shù)碼方式施加熒光色。對(duì)于計(jì)數(shù)，將至少3個(gè)非重疊區(qū)域輸入ImageJ，設(shè)定閾值，并且手動(dòng)評(píng)分。

流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)

通過(guò)在37℃下進(jìn)行處理25分鐘來(lái)以酶法收集細(xì)胞以獲得單細(xì)胞混懸液。接著將細(xì)胞再混懸于100μl的它們的含有適量初級(jí)抗體或熒光綴合抗體的相應(yīng)培養(yǎng)基中，并且在冰上避光孵育30分鐘。當(dāng)使用二級(jí)抗體時(shí)，用PBS洗滌初級(jí)抗體，并且在冰上施加二級(jí)抗體30分鐘。染色的細(xì)胞或GFP表達(dá)性細(xì)胞用PBS洗滌，并且立刻在使用100μm陶瓷噴嘴和20psi的5激光器BD Biosciences ARIA-IIuTM細(xì)胞分選儀上分選。DAPI用于排除死細(xì)胞。使用BD FACSDivaTM軟件分析流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)數(shù)據(jù)。

向顫抖(shi/shi)x Rag2-^/-小鼠中移植。

所有使用顫抖/rag2小鼠(University of Rochester；Windrem,M.S.等,Cell Stem Cell.2:553-565(2008))的實(shí)驗(yàn)都根據(jù)由水牛城大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)核準(zhǔn)的方案進(jìn)行。使先前已低溫保存的FACS分選O4⁺OPC解凍，并且在手術(shù)之前通過(guò)于PDGF培養(yǎng)基中涂鋪在pO/L培養(yǎng)皿上來(lái)使其恢復(fù)1-2天。通過(guò)在每μl 1x10⁵個(gè)細(xì)胞下再混懸細(xì)胞來(lái)制備注射用細(xì)胞。

如先前所述進(jìn)行注射。Sim,F.J.等(2011)。使用低溫使幼仔麻醉，并且在兩側(cè)各部位中在1.1mm的深度下將5x 10⁴個(gè)細(xì)胞注射至出生后2-3天幼仔的胼胝體中。通過(guò)牽拉式玻璃吸移器注射細(xì)胞，穿過(guò)頭顱直接插入推定靶標(biāo)部位中。在12-16周，將動(dòng)物處死并依次用鹽水和4％多聚甲醛灌注。切割小鼠前腦的低溫保存冠狀切片(16μm)，并且每160μm進(jìn)行取樣。Sim,F.J.等(2011)。用小鼠抗人核(hNA)鑒定人細(xì)胞，并且用MBP標(biāo)記髓磷脂堿性蛋白表達(dá)性少突膠質(zhì)細(xì)胞。人星形細(xì)胞和OPC用分別針對(duì)hGFAP和hNG2的人特異性抗體染色。用SMI311和SMI312的1:1混合物染色小鼠神經(jīng)絲(NF)。Invitrogen^TM Alexa Fluor二級(jí)抗體山羊抗小鼠488、594和647在1:500稀釋度下加以使用(Life Technologies)。對(duì)于透射電子顯微術(shù)，如先前所述處理組織。Sim,F.J.等,Molec.Cell.Neurosci.20:669-682(2002)。表4提供所用初級(jí)抗體的清單。

表4.初級(jí)抗體

參考文獻(xiàn)

除本公開(kāi)的其它章節(jié)中引用的文件之外，以下參考文獻(xiàn)也可提供額外背景。本公開(kāi)中引用的所有參考文獻(xiàn)都據(jù)此以引用的方式整體并入本文。此外，本文引用或提及的任何產(chǎn)品的任何制造商說(shuō)明書(shū)或目錄都以引用的方式并入本文。以引用的方式并入本文本的文件或其中任何教義可用于實(shí)施本發(fā)明。以引用的方式并入本文本的文件不被承認(rèn)是先前技術(shù)。

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對(duì)特定實(shí)施方案的先前描述將充分揭示本發(fā)明的一般特性以致他人可在不脫離本發(fā)明的一般概念下，在不進(jìn)行過(guò)度實(shí)驗(yàn)下，應(yīng)用屬于本領(lǐng)域中的人士的普通技能的知識(shí)來(lái)容易地修改和/或改適所述特定實(shí)施方案以達(dá)成各種應(yīng)用。因此，基于本文呈現(xiàn)的教義和指導(dǎo)，所述改適和修改意圖在公開(kāi)的實(shí)施方案的等效物的含義和范圍內(nèi)。應(yīng)了解本文的措辭或術(shù)語(yǔ)是出于描述而非限制目的，因此本說(shuō)明書(shū)的術(shù)語(yǔ)或措辭應(yīng)由熟練技術(shù)人員根據(jù)教義和指導(dǎo)加以解釋。通過(guò)以下權(quán)利要求來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明。

序列表

<110> 紐約干細(xì)胞基金會(huì)有限公司

V?福薩蒂

P?道瓦拉斯

<120> 源于多能干細(xì)胞的功能性少突膠質(zhì)細(xì)胞及其制備和使用方法

<130> NYSC1250-1WO

<150> US 62/002,048

<151> 2014-05-22

<160> 10

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

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<212> DNA

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