本申請(qǐng)要求2014年4月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)61/985,924的權(quán)益，其通過(guò)引用以全文并入本文。

背景技術(shù)：

免疫系統(tǒng)的功能是保護(hù)身體免受有害抗原、細(xì)菌、病毒、毒素、來(lái)自另一個(gè)人或物種的血液或組織和癌細(xì)胞的影響。免疫系統(tǒng)病癥可以導(dǎo)致免疫系統(tǒng)活動(dòng)過(guò)度或活動(dòng)減退。在免疫系統(tǒng)活動(dòng)過(guò)度的情況下，身體攻擊并損害其自身的組織。在免疫系統(tǒng)活動(dòng)減退(也稱(chēng)為免疫缺陷)的情況下，身體抗擊外來(lái)抗原的能力減弱，這通常導(dǎo)致更高的易感染性。

精氨酸酶使L-精氨酸代謝為L(zhǎng)-鳥(niǎo)氨酸和尿素。除了該酶在肝的尿素循環(huán)中的基本作用以外，精氨酸酶還在一些哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的一些細(xì)胞中表達(dá)。然而，還不清楚干擾L-精氨酸代謝是否可用來(lái)治療免疫病況。重要的是，將外源性精氨酸酶配制為適合于臨床施用的治療劑存在若干挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療有需要的受試者中的炎性疾病的方法，該方法包括向該受試者施用治療有效量的純化精氨酸酶或其功能性片段。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)炎癥的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的純化精氨酸酶或其功能性片段，其中所述施用調(diào)節(jié)所述炎癥。

在一些實(shí)施方案中，所述純化精氨酸酶是重組精氨酸酶。在一些實(shí)施方案中，該重組精氨酸酶是聚乙二醇化的(pegylated)。在一些實(shí)施方案中，該重組精氨酸酶的功能性片段是聚乙二醇化的。在一些實(shí)施方案中，該聚乙二醇化的重組精氨酸酶是重組人精氨酸酶I或其功能性片段。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)炎癥的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段，其中所述施用調(diào)節(jié)所述炎癥。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了純化的重組精氨酸酶或其功能性片段在制備用于治療受試者中的炎性疾病的藥物中的用途。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包含純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)或其功能性片段和至少一個(gè)聚乙二醇寡聚體的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，該聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)聚乙二醇寡聚體，其中每個(gè)聚乙二醇寡聚體的分子量為約20千道爾頓至約40千道爾頓。在一些實(shí)施方案中，該聚乙二醇化的重組精氨酸酶I蛋白質(zhì)或其功能性片段包含約4個(gè)至約13個(gè)聚乙二醇寡聚體，其中每個(gè)聚乙二醇寡聚體的分子量為約5千道爾頓。

在一些實(shí)施方案中，所述純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段通過(guò)抑制T細(xì)胞極化來(lái)調(diào)節(jié)炎癥。在一些實(shí)施方案中，所述純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放來(lái)抑制T細(xì)胞極化。在一些實(shí)施方案中，所述純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段調(diào)節(jié)白介素6(IL-6)的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段調(diào)節(jié)干擾素γ(INFγ)的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段的施用使受試者的血漿中精氨酸的水平消耗至10μM以下。

在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物和方法提供了一種用于治療自身免疫病癥的方法。在一些實(shí)施方案中，該自身免疫病癥是多發(fā)性硬化。在一些實(shí)施方案中，該自身免疫病癥是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容提供了一種治療有需要的受試者中的骨病況的方法，該方法包括向該受試者施用治療有效量的純化精氨酸酶或其功能性片段。在一些情況下，該骨病況是骨質(zhì)疏松癥。在其他情況下，該骨病況是炎癥。

在一些實(shí)施方案中，所述純化的重組人精氨酸酶I為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。在一些實(shí)施方案中，所述重組人精氨酸酶I是聚乙二醇化的。

援引并入

本說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)均通過(guò)引用并入本文，其程度如同特別且單獨(dú)地指出每個(gè)單獨(dú)的出版物、專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用而并入。

附圖說(shuō)明

圖1示出了在巨噬細(xì)胞中LPS對(duì)精氨酸酶I的上調(diào)。

圖2示出了精氨酸酶I表達(dá)的增加，伴隨著PTEN的損失。

圖3示出了在PTEN缺乏的巨噬細(xì)胞中C/EBPβ的功能。

圖4示出了PI3K的組成性激活促進(jìn)精氨酸酶I表達(dá)和向細(xì)胞外空間內(nèi)的釋放。

圖5示出了精氨酸酶I對(duì)T細(xì)胞極化的抑制。

圖6示出了用重組人精氨酸酶I治療本領(lǐng)域公認(rèn)的多發(fā)性硬化模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠——的結(jié)果。

圖7描繪了測(cè)量用重組人精氨酸酶I治療的關(guān)節(jié)炎小鼠的多個(gè)臨床參數(shù)的圖。

圖8示出了在用重組人精氨酸酶I治療的關(guān)節(jié)炎小鼠中的爪腫脹減輕。

圖9示出了在用人重組人精氨酸酶I治療的關(guān)節(jié)炎小鼠中的白介素6(IL-6)全身性釋放減少。

圖10描繪了測(cè)量在膠原免疫后促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)的圖。

圖11是描繪用重組人精氨酸酶I治療的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型的臨床評(píng)分的圖。

圖12描繪了在用重組人精氨酸酶I治療的EAE小鼠中免疫細(xì)胞群體的熒光激活細(xì)胞分選分析。

圖13描繪了熒光激活細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明用重組人精氨酸酶I治療防止了T細(xì)胞增殖。

圖14是用于優(yōu)化包含純化精氨酸酶I的藥物組合物的過(guò)程的示意圖。

圖15是示出通過(guò)用mPEG-MAL聚乙二醇化(-SH修飾)的純化的重組人精氨酸酶I消耗血清精氨酸的圖。

圖16是示出采用在Lys殘基上聚乙二醇化的多種純化的重組人精氨酸酶消耗血清精氨酸的圖。

圖17是示出多種純化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)通過(guò)胺(–NH₂)綴合的聚乙二醇化程度的圖。

圖18是示出純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I的表位分析的圖。

圖19示出了用純化的人精氨酸酶I抑制的來(lái)自髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)再刺激的T細(xì)胞的IFNγ和IL-17A mRNA表達(dá)水平。

圖20示出了用純化的人精氨酸酶I抑制的來(lái)自髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)再刺激的T細(xì)胞的IFNγ和IL-17A蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

圖21示出了用重組人精氨酸酶I治療的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠的臨床評(píng)分的改善。

圖22是破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)的示意圖。

圖23是示出用重組人精氨酸酶I處理的分化野生型骨髓衍生的巨噬細(xì)胞的破骨細(xì)胞試驗(yàn)的圖。

圖24是顯示在破骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中精氨酸酶I的表達(dá)可能丟失的圖。

圖25示出了在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中添加重組精氨酸酶I可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成。

圖26是示出破骨細(xì)胞發(fā)生的阻斷可依賴(lài)于重組人精氨酸酶I(recArgI)的催化功能的圖。

圖27是示出一項(xiàng)試驗(yàn)的圖，在該試驗(yàn)中，將重組精氨酸酶I添加至造血干細(xì)胞沒(méi)有影響破骨細(xì)胞形成。

圖28是示出在破骨細(xì)胞發(fā)生的第0天或第6天，不同劑量的重組人精氨酸酶I(recArgI)的影響的圖。

圖29是示出在與重組人精氨酸酶I(recArgI)一起溫育及不溫育的情況下，在分化7天后破骨細(xì)胞發(fā)生基因的mRNA表達(dá)水平的圖。

具體實(shí)施方式

大部分生物每天暴露于許多不同的抗原。然而，一些動(dòng)物具有能夠?qū)@樣的抗原作出應(yīng)答并防止引發(fā)或形成疾病的免疫系統(tǒng)。為了正常地起作用，免疫系統(tǒng)必須檢測(cè)到多種多樣的抗原，如病毒、寄生蟲(chóng)或變應(yīng)原，并在體內(nèi)引發(fā)對(duì)外來(lái)物質(zhì)、異常細(xì)胞和/或異常組織的應(yīng)答。在對(duì)未知抗原的應(yīng)答中，健康的免疫系統(tǒng)開(kāi)始產(chǎn)生抗體。

然而，在一些疾病中，免疫系統(tǒng)可能開(kāi)始產(chǎn)生攻擊身體自身組織而非抗擊感染的抗體。這可導(dǎo)致自身免疫疾病。癌性生長(zhǎng)，包括惡性癌性生長(zhǎng)，也可以被受試者的先天免疫細(xì)胞識(shí)別并引起免疫應(yīng)答。先天免疫細(xì)胞的激活觸發(fā)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，這些途徑需要嚴(yán)格控制以便引起足夠的免疫應(yīng)答。

精氨酸酶I是尿素循環(huán)的關(guān)鍵元件，它將精氨酸轉(zhuǎn)化為尿素，并且主要在肝臟中有活性。精氨酸酶I還在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮功能性作用。例如，T細(xì)胞依賴(lài)于半必需氨基酸精氨酸而成熟并對(duì)感染作出應(yīng)答。先天免疫細(xì)胞中精氨酸酶I的表達(dá)導(dǎo)致在炎性病況下生理系統(tǒng)的精氨酸水平的消耗。例如，骨髓細(xì)胞中的精氨酸酶I表達(dá)可導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)反應(yīng)性，并妨礙T輔助細(xì)胞功能。

在小鼠中，精氨酸酶I由單核細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞表達(dá)。對(duì)于人類(lèi)，精氨酸酶I在粒細(xì)胞/嗜中性粒細(xì)胞中組成型表達(dá)并參與殺真菌活動(dòng)。表達(dá)精氨酸酶I的巨噬細(xì)胞被一些人認(rèn)為是替代性激活的(alternatively activated)，或是M2巨噬細(xì)胞，參與組織再生和修復(fù)，也參與針對(duì)多細(xì)胞病原體和寄生蟲(chóng)的免疫防御。鼠骨髓細(xì)胞中的精氨酸酶I表達(dá)由Th2細(xì)胞因子IL-4/IL-13調(diào)節(jié)。然而，不清楚人精氨酸酶I和鼠精氨酸酶I是否通過(guò)類(lèi)似的作用機(jī)理起作用。

PI3K/PTEN信號(hào)傳導(dǎo)途徑在許多生理學(xué)上重要的過(guò)程如先天免疫、細(xì)胞存活、增殖、遷移和代謝中發(fā)揮功能性作用。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以下調(diào)一些細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放。這些信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程被脂質(zhì)磷酸酶PTEN(PI3K途徑的一種拮抗劑)嚴(yán)格調(diào)控。PTEN是一種腫瘤抑制物，其負(fù)責(zé)響應(yīng)于Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑的細(xì)胞因子如白介素6(IL-6)產(chǎn)生量提高。PI3K激活被認(rèn)為是促炎性的，并且PI3K途徑的調(diào)節(jié)對(duì)于將免疫細(xì)胞正確引導(dǎo)至感染或炎癥部位是不可缺少的。

我們?cè)诒疚闹忻枋隽吮碚飨蚺囵B(yǎng)的細(xì)胞和小鼠模型中添加重組聚乙二醇化精氨酸酶I的實(shí)驗(yàn)。所述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了細(xì)胞外精氨酸酶I可以對(duì)免疫細(xì)胞發(fā)揮強(qiáng)效的抗炎作用。含有高含量精氨酸酶I的、來(lái)源于幼稚PTEN^-/-巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示了在培養(yǎng)的細(xì)胞和動(dòng)物模型中促炎性T細(xì)胞極化細(xì)胞因子的表達(dá)減少。

本文公開(kāi)的發(fā)明提供了通過(guò)向受試者施用重組精氨酸酶I蛋白質(zhì)以調(diào)節(jié)PI3K/PTEN信號(hào)傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞因子分泌來(lái)治療與免疫系統(tǒng)相關(guān)的病況的組合物和方法。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的發(fā)明提供了一種通過(guò)向受試者施用治療有效量的純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I來(lái)調(diào)節(jié)炎癥的方法。

本公開(kāi)內(nèi)容證實(shí)，在生理系統(tǒng)中持續(xù)的精氨酸酶I表達(dá)的功能性結(jié)果是在體外和體內(nèi)由T細(xì)胞介導(dǎo)的病理生理效應(yīng)的減弱功能而形成低炎性環(huán)境。該發(fā)現(xiàn)提供了一種用于調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的強(qiáng)力且有效的方法。這樣的調(diào)節(jié)提供了對(duì)于多種免疫病況如多發(fā)性硬化和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效治療。此外，采用本發(fā)明的重組精氨酸酶調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)可以與外科手術(shù)一起使用，例如，以提供在器官移植過(guò)程中降低細(xì)胞/組織排斥的可能性的低炎性環(huán)境。

在一些方面，本公開(kāi)內(nèi)容提供了一種調(diào)節(jié)炎癥的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段。在一些情況下，該純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段通過(guò)抑制T細(xì)胞極化來(lái)調(diào)節(jié)炎癥。在一些情況下，該純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放來(lái)抑制T細(xì)胞極化。

本公開(kāi)內(nèi)容的另一方面提供了一種包含與至少一個(gè)聚乙二醇寡聚體綴合的純化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)的藥物組合物。在一些情況下，所述至少一個(gè)聚乙二醇寡聚體為甲氧基聚乙二醇。

本公開(kāi)內(nèi)容還證實(shí)了精氨酸酶在骨生理學(xué)中的功能性作用。骨形成是包括許多個(gè)階段的多重復(fù)雜過(guò)程，并且每一個(gè)階段呈現(xiàn)為治療性干預(yù)的潛在目標(biāo)。炎癥還可干擾脊椎動(dòng)物身體修復(fù)骨量(bone mass)的能力。在一些方面，本公開(kāi)內(nèi)容證實(shí)了在破骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中精氨酸酶I的表達(dá)丟失，并且在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中添加重組精氨酸酶I可以至少調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞發(fā)生。本公開(kāi)內(nèi)容還證實(shí)了對(duì)破骨細(xì)胞發(fā)生的阻斷依賴(lài)于重組精氨酸酶I的催化功能。該發(fā)現(xiàn)提示對(duì)精氨酸酶表達(dá)的調(diào)節(jié)可以提供對(duì)于包括骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的多種骨病況的有效治療。通過(guò)減小骨中的慢性炎癥(該慢性炎癥可以是骨質(zhì)疏松癥中的惡化因素)，對(duì)精氨酸酶I表達(dá)的調(diào)節(jié)還可以提供對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的有效治療。

治療免疫病癥、骨病況和癌癥的方法

本公開(kāi)內(nèi)容的方法、組合物和試劑盒可以包括治療、抑制、逆轉(zhuǎn)或減輕疾病的方法。在一些情況下，該疾病可以是自身免疫疾病。在一些情況下，該疾病可以是骨病況，如骨質(zhì)疏松癥。在一些情況下，所述調(diào)節(jié)通過(guò)施用治療有效劑量的重組精氨酸酶蛋白質(zhì)或其功能性片段而實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，該蛋白質(zhì)是重組人精氨酸酶I或其功能性片段。

精氨酸酶I是先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)劑。許多患有免疫系統(tǒng)病癥和癌癥的受試者可以受益于重組人精氨酸酶I的使用。受試者可以是人、非人靈長(zhǎng)類(lèi)如黑猩猩和其他猿和猴物種；農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家畜如兔、狗和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，包括嚙齒類(lèi)動(dòng)物如大鼠、小鼠和豚鼠等。受試者可以是任意年齡的。受試者可以是例如中老年者、成年者、青少年、青春期前少年、兒童、幼兒(toddler)、嬰兒。

本文還認(rèn)識(shí)到了重組精氨酸酶蛋白質(zhì)在治療多種骨病況如骨質(zhì)疏松癥或骨炎癥中的治療潛力。脊椎動(dòng)物骨骼例如人類(lèi)骨骼的強(qiáng)度和完整性依賴(lài)于破骨細(xì)胞的骨吸收與成骨細(xì)胞的骨形成之間的微妙平衡。在骨質(zhì)疏松癥中，該平衡向有利于破骨細(xì)胞的方向移動(dòng)，并且骨吸收超過(guò)骨形成。在一些情況下，重組精氨酸酶蛋白質(zhì)或其片段可以使破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞形成之間的平衡移動(dòng)。

免疫系統(tǒng)中多種細(xì)胞的活性可以由重組精氨酸酶I來(lái)調(diào)節(jié)。活性可由重組精氨酸酶I調(diào)節(jié)的細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括：B細(xì)胞；CD4；CD8；血細(xì)胞，包括紅細(xì)胞和白細(xì)胞；樹(shù)突細(xì)胞，包括樹(shù)突狀抗原呈遞細(xì)胞；巨噬細(xì)胞；記憶B細(xì)胞；記憶T細(xì)胞；單核細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞；嗜中性粒細(xì)胞；T輔助細(xì)胞；以及T殺傷細(xì)胞。多種其他細(xì)胞的活性也可以由重組精氨酸酶I來(lái)調(diào)節(jié)?；钚钥捎芍亟M精氨酸酶I調(diào)節(jié)的細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括造血干細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨原細(xì)胞、骨細(xì)胞以及它們的前體或衍生物。

可采用本文公開(kāi)的純化精氨酸酶治療的免疫疾病或病況的實(shí)例包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎、銀屑病、葡萄膜炎、1型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、濕疹、硬皮病、潰瘍性直腸炎、重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)、DiGeorge綜合征、共濟(jì)失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、季節(jié)性變態(tài)反應(yīng)、常年性變態(tài)反應(yīng)、食物變態(tài)反應(yīng)、全身性過(guò)敏反應(yīng)(anaphylaxis)、肥大細(xì)胞增多癥、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、帕金森病、阿爾茨海默病、脾功能亢進(jìn)、白細(xì)胞粘附缺陷、X連鎖淋巴組織增生病、X連鎖無(wú)丙種球蛋白血癥、選擇性免疫球蛋白A缺乏、高IgM綜合征、HIV、自身免疫性淋巴組織增生綜合征、Wiskott-Aldrich綜合征、慢性肉芽腫病、普通可變型免疫缺陷(CVID)、高免疫球蛋白E綜合征、橋本甲狀腺炎、急性炎性病況、慢性炎性病況和癌癥。

在一些實(shí)施方案中，骨病況可以采用純化精氨酸酶治療。骨病況的非限制性實(shí)例包括：骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、成骨不全、纖維發(fā)育不良(fibrous dysplasis)或骨髓炎。在一些情況下，該骨病況與破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞功能的誤調(diào)節(jié)有關(guān)。

在一些實(shí)施方案中，癌癥對(duì)采用純化精氨酸酶的治療敏感。癌癥的非限制性實(shí)例包括：急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓樣白血病、腎上腺皮質(zhì)癌、AIDS相關(guān)癌癥、AIDS相關(guān)淋巴瘤、肛門(mén)癌、闌尾癌、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦腫瘤如小腦星形細(xì)胞瘤、腦星形細(xì)胞瘤/惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層瘤、視通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、支氣管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原發(fā)灶未知的癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、小腦星形細(xì)胞瘤、子宮頸癌、兒童癌癥、慢性淋巴細(xì)胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性病癥、結(jié)腸癌、皮膚T-細(xì)胞淋巴瘤、結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、生殖細(xì)胞瘤、膽囊癌、胃癌、胃腸道類(lèi)癌瘤、胃腸道間質(zhì)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、多毛細(xì)胞白血病、頭頸癌、心臟癌癥、肝細(xì)胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼內(nèi)黑色素瘤、胰島細(xì)胞癌、卡波西肉瘤、腎癌、喉癌、嘴唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌如非小細(xì)胞和小細(xì)胞肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血癥、骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤/骨肉瘤、髓母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、間皮瘤、隱匿原發(fā)灶轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌、口腔癌(mouth cancer)、多發(fā)性?xún)?nèi)分泌瘤綜合征、骨髓增生異常綜合征、髓樣白血病、鼻腔和鼻旁竇癌、鼻咽癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細(xì)胞肺癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤/骨惡性纖維組織細(xì)胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、胰腺癌、胰島細(xì)胞胰腺癌、鼻旁竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、松果體星形細(xì)胞瘤、松果體生殖細(xì)胞瘤、垂體腺瘤、胸膜肺母細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞瘤形成、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、前列腺癌、直腸癌、腎細(xì)胞癌、腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮膚癌、梅克爾細(xì)胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、T細(xì)胞淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲狀腺癌、滋養(yǎng)細(xì)胞瘤(妊娠期的)、原發(fā)部位不明的癌癥、尿道癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥(macroglobulinemia)和腎母細(xì)胞瘤(Wilms tumor)。

所述治療可以包括采用本公開(kāi)內(nèi)容的精氨酸酶治療受試者(例如患有疾病的患者和/或具有病況的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物)。該疾病可以是自身免疫疾病。該疾病可以是炎性疾病。該受試者可以是人?？稍诩膊〉呐R床發(fā)作之前向受試者提供治療。可在疾病的臨床發(fā)作之后向受試者提供治療。可在疾病的臨床發(fā)作后1天、1周、6個(gè)月、12個(gè)月或2年向受試者提供治療?？稍诩膊〉呐R床發(fā)作之后向受試者提供治療超過(guò)1天、超過(guò)1周、超過(guò)1個(gè)月、超過(guò)6個(gè)月、超過(guò)12個(gè)月、超過(guò)2年或更長(zhǎng)時(shí)間?？稍诩膊〉呐R床發(fā)作之后向受試者提供治療少于1天、少于1周、少于1個(gè)月、少于6個(gè)月、少于12個(gè)月或少于2年。治療還可以包括在臨床試驗(yàn)中治療人。治療可以包括向受試者施用藥物組合物，諸如本公開(kāi)內(nèi)容通篇描述的藥物組合物中的一種或多種。治療可以包括在體內(nèi)調(diào)節(jié)內(nèi)源性精氨酸的水平。

突變的重組精氨酸酶

精氨酸酶I蛋白質(zhì)的持續(xù)表達(dá)可在臨床上用來(lái)在體外和體內(nèi)提供低炎性環(huán)境(例如，在實(shí)施例1和圖1至圖6中進(jìn)一步描述)。然而，在配制用于治療目的的純化精氨酸酶中遇到的一個(gè)挑戰(zhàn)是在溶液中由于鏈間二硫鍵形成而引起的蛋白質(zhì)聚集體的形成。為了克服在制備適合于臨床施用的純化精氨酸酶中的一些挑戰(zhàn)，在野生型人精氨酸酶I的序列中進(jìn)行了一系列突變。表1描述了為減少純化重組精氨酸酶I在溶液中的聚集而設(shè)計(jì)的人精氨酸酶I的多個(gè)位點(diǎn)特異性突變體。表1還描述了包含分子標(biāo)簽的多個(gè)人精氨酸酶I序列(SEQ ID NO:9-16)。

突變重組精氨酸酶可以包含一個(gè)或多個(gè)突變。用于改善精氨酸酶I的流變學(xué)的適宜的氨基酸修飾可以是保守或非保守突變?？梢赃M(jìn)行突變使得編碼的氨基酸被修飾為極性的、非極性的、堿性的或酸性的氨基酸。本發(fā)明的重組精氨酸酶可以是野生型人精氨酸酶。本發(fā)明的重組精氨酸酶可以是突變的人精氨酸酶。重組精氨酸酶I可以由重組DNA生成，例如采用生物分子工程化技術(shù)。純化的精氨酸酶I可以是從粗提取物如全細(xì)胞裂解物中提取的精氨酸酶。純化的重組精氨酸酶I可以是從例如為表達(dá)該重組精氨酸酶I而設(shè)計(jì)的生物系統(tǒng)的粗提取物中純化得到的精氨酸酶I。

表1公開(kāi)了多種突變重組人精氨酸酶I的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO:1對(duì)應(yīng)于野生型人精氨酸酶。SEQ ID NO:2-8是SEQ ID NO:1的突變序列。SEQ ID NO:2包含C303→A303突變。SEQ ID NO:3包含C168→A168突變。SEQ ID NO:4包含C45→A45突變。SEQ ID NO:5包含C303→A303和C168→A168雙重突變。SEQ ID NO:6包含C303→A303和C45→A45雙重突變。SEQ ID NO:7包含C168→A168和C45→A45雙重突變。SEQ ID NO:8包含C303→A303、C168→A168和C45→A45三重突變。

重組人精氨酸酶I可以具有工程化至重組核酸序列中的分子標(biāo)簽。分子標(biāo)簽可有助于從粗表達(dá)系統(tǒng)中純化重組精氨酸酶。分子標(biāo)簽可以是例如，多組氨酸標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽或殼多糖結(jié)合蛋白(CBP)標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，分子標(biāo)簽包括多組氨酸標(biāo)簽。分子標(biāo)簽可以存在于例如重組精氨酸酶的氨基末端或羧基末端。

表1還公開(kāi)了包含分子標(biāo)簽的多種突變重組人精氨酸酶的蛋白質(zhì)序列。SEQ ID NO:9對(duì)應(yīng)于包含多組氨酸標(biāo)簽的野生型人精氨酸酶。SEQ ID NO:10-16是包含標(biāo)簽的SEQ ID NO:1的突變序列。SEQ ID NO:10包含多組氨酸標(biāo)簽和C303→A303突變。SEQ ID NO:11包含多組氨酸標(biāo)簽和C168→A168突變。SEQ ID NO:12包含多組氨酸標(biāo)簽和C45→A45突變。SEQ ID NO:13包含多組氨酸標(biāo)簽、C303→A303和C168→A168雙重突變。SEQ ID NO:14包含多組氨酸標(biāo)簽、C303→A303和C45→A45雙重突變。SEQ ID NO:15包含多組氨酸標(biāo)簽、C168→A168和C45→A45雙重突變。SEQ ID NO:16包含C303→A303、C168→A168和C45→A45三重突變。在一些情況下，治療性重組人精氨酸酶可以是表1中描述的精氨酸酶的功能性片段。

重組精氨酸酶或其功能性片段可以例如在體內(nèi)由細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、合成細(xì)胞或在體外由不含細(xì)胞的系統(tǒng)或化學(xué)合成來(lái)表達(dá)/產(chǎn)生。重組精氨酸酶I可以由簡(jiǎn)并密碼中的密碼子的任意組合來(lái)編碼。在一些實(shí)施方案中，核苷酸通過(guò)參考遺傳密碼來(lái)替換，使得密碼子被改變?yōu)榫幋a相同氨基酸殘基的不同密碼子。在一些實(shí)施方案中，如表1所述改變半胱氨酸殘基的身份可以導(dǎo)致在溶液中蛋白質(zhì)聚集減少：約2％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％或約95％。

在一些實(shí)施方案中，如表1所述改變半胱氨酸殘基的身份可以導(dǎo)致在溶液中不大于1％的聚集、不大于2％的聚集、不大于5％的聚集、不大于10％的聚集、不大于15％的聚集、不大于20％的聚集、不大于25％的聚集、不大于30％的聚集、不大于35％的聚集、不大于40％的聚集、不大于45％的聚集、不大于50％的聚集、不大于55％的聚集、不大于60％的聚集、不大于65％的聚集、不大于70％的聚集、不大于75％的聚集、不大于80％的聚集、不大于85％的聚集、不大于90％的聚集或不大于95％的聚集。

在一些情況下，改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸的身份可以減少重組精氨酸酶I在溶液中的聚集特性(profile)。在一些情況下，重組精氨酸酶I或其功能性片段包含1個(gè)氨基酸突變、2個(gè)氨基酸突變、3個(gè)氨基酸突變、4個(gè)氨基酸突變、5個(gè)氨基酸突變、6個(gè)氨基酸突變、7個(gè)氨基酸突變、8個(gè)氨基酸突變、9個(gè)氨基酸突變、10個(gè)氨基酸突變、11個(gè)氨基酸突變、12個(gè)氨基酸突變、13個(gè)氨基酸突變、14個(gè)氨基酸突變、15個(gè)氨基酸突變、16個(gè)氨基酸突變、17個(gè)氨基酸突變、18個(gè)氨基酸突變、19個(gè)氨基酸突變、20個(gè)氨基酸突變、21個(gè)氨基酸突變、22個(gè)氨基酸突變、23個(gè)氨基酸突變、24個(gè)氨基酸突變、25個(gè)氨基酸突變、26個(gè)氨基酸突變、27個(gè)氨基酸突變、28個(gè)氨基酸突變、29個(gè)氨基酸突變、30個(gè)氨基酸突變、31個(gè)氨基酸突變、32個(gè)氨基酸突變、33個(gè)氨基酸突變、34個(gè)氨基酸突變、35個(gè)氨基酸突變、36個(gè)氨基酸突變、37個(gè)氨基酸突變、38個(gè)氨基酸突變、39個(gè)氨基酸突變、40個(gè)氨基酸突變、41個(gè)氨基酸突變、42個(gè)氨基酸突變、43個(gè)氨基酸突變、44個(gè)氨基酸突變、45個(gè)氨基酸突變、46個(gè)氨基酸突變、47個(gè)氨基酸突變、48個(gè)氨基酸突變、49個(gè)氨基酸突變或50個(gè)氨基酸突變。

重組精氨酸酶或其功能性片段可以從例如細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、合成細(xì)胞中純化或從不含細(xì)胞的系統(tǒng)中純化。在一些實(shí)施方案中，該重組精氨酸酶是部分純化的。在一些實(shí)施方案中，該重組精氨酸酶基本上是純的。在一些實(shí)施方案中，該重組精氨酸酶為至少95％純。在一些實(shí)施方案中，該重組精氨酸酶為99％純。

純化的重組精氨酸酶或其功能性片段可以為至少1％純、至少2％純、至少3％純、至少4％純、至少5％純、至少6％純、至少7％純、至少8％純、至少9％純、至少10％純、至少11％純、至少12％純、至少13％純、至少14％純、至少15％純、至少16％純、至少17％純、至少18％純、至少19％純、至少20％純、至少21％純、至少22％純、至少23％純、至少24％純、至少25％純、至少26％純、至少27％純、至少28％純、至少29％純、至少30％純、至少31％純、至少32％純、至少33％純、至少34％純、至少35％純、至少36％純、至少37％純、至少38％純、至少39％純、至少40％純、至少41％純、至少42％純、至少43％純、至少44％純、至少45％純、至少46％純、至少47％純、至少48％純、至少49％純、至少50％純、至少51％純、至少52％純、至少53％純、至少54％純、至少55％純、至少56％純、至少57％純、至少58％純、至少59％純、至少60％純、至少61％純、至少62％純、至少63％純、至少64％純、至少65％純、至少66％純、至少67％純、至少68％純、至少69％純、至少70％純、至少71％純、至少72％純、至少73％純、至少74％純、至少75％純、至少76％純、至少77％純、至少78％純、至少79％純、至少80％純、至少81％純、至少82％純、至少83％純、至少84％純、至少85％純、至少86％純、至少87％純、至少88％純、至少89％純、至少90％純、至少91％純、至少92％純、至少93％純、至少94％純、至少95％純、至少96％純、至少97％純、至少98％純、至少99％純、至少99.1％純、至少99.2％純、至少99.3％純、至少99.4％純、至少99.5％純、至少99.6％純、至少99.7％純、至少99.8％純或至少99.9％純。

聚乙二醇化的重組精氨酸酶

精氨酸酶或其功能性片段可以采用一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子(PEG)進(jìn)行修飾。PEG寡聚體共價(jià)附接至藥物或治療性蛋白質(zhì)可以降低來(lái)自受試者的免疫系統(tǒng)的重組精氨酸酶I的免疫原性和抗原性。PEG寡聚體共價(jià)附接至藥物或治療性蛋白質(zhì)可以增大重組精氨酸酶的流體動(dòng)力學(xué)大小，這可以延長(zhǎng)聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I在溶液中的半衰期。用于本發(fā)明的PEG寡聚體可以為，例如，—(CH₂CH₂O)_n—或—(CH₂CH₂O)_n—CH₂CH₂—，但還可以包括聚亞烷基二醇，包括但不限于聚丙二醇或聚丁二醇、甲氧基聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇丙酸(mPEG-酸)，其中n可以為約1至約400。

精氨酸酶或其功能性片段可以采用多種類(lèi)型的PEG分子進(jìn)行修飾。在一些實(shí)施方案中，PEG寡聚體是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)。在一些實(shí)施方案中，PEG寡聚體是甲氧基聚乙二醇丙酸(mPEG-酸)。在一些情況下，本公開(kāi)內(nèi)容提供了包含純化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)和至少一個(gè)聚乙二醇寡聚體的藥物組合物。在一些情況下，該聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)聚乙二醇寡聚體。在一些情況下，該聚乙二醇寡聚體的分子量為約20千道爾頓至約40千道爾頓。在一些情況下，該聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)包含約4個(gè)聚乙二醇分子至約13個(gè)聚乙二醇寡聚體。在一些情況下，該聚乙二醇寡聚體的分子量為約5千道爾頓。

精氨酸酶或其功能性片段共價(jià)附接至感興趣的聚乙二醇聚合物可以改變?cè)摼彼崦傅奈锢砘瘜W(xué)特性?？梢酝ㄟ^(guò)與PEG結(jié)合而改變的物理化學(xué)特性的實(shí)例包括免疫原性、體外和體內(nèi)生物活性、吸收速率和生物利用度、生物分布、藥代動(dòng)力學(xué)(PK)和藥效學(xué)譜(PD)和毒性。在一些實(shí)施方案中，聚乙二醇化的精氨酸酶具有降低的免疫原性。–NH₂、–COOH、–OH、–SH和二硫鍵是精氨酸酶的氨基酸側(cè)鏈中可以與PEG寡聚體反應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)的實(shí)例。N-末端中的胺和C-末端中的羧基基團(tuán)也可以與PEG寡聚體反應(yīng)。

用于蛋白質(zhì)聚乙二醇化的PEG試劑可以是活化的PEG?；罨腜EG可以用于胺聚乙二醇化、硫醇聚乙二醇化或N-末端聚乙二醇化。PEG試劑能夠以不同長(zhǎng)度、形狀和化學(xué)性質(zhì)商購(gòu)獲得，以使它們與蛋白質(zhì)的特定官能團(tuán)反應(yīng)以用于它們的共價(jià)附接。PEG的商業(yè)供應(yīng)商的非限制性實(shí)例包括NOF Corporation(日本)；SunBio(韓國(guó))；Chirotech Technology Limited(英國(guó))；JenKem(中國(guó))；Creative PEGWorks(美國(guó))、Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI)、Dendritech(Midland,MI)或Polysciences^TM(Warrington,PA)。

適用于本發(fā)明的商購(gòu)可得的PEG的非限制性實(shí)例包括但不限于可從Nektar Therapeutics,San Carlos,CA獲得的那些PEG，諸如mPEG-NH₂(分子量約10kDa，約20kDa)、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基α-甲基丁酸酯(SMB)、SMB-PEG-SMB、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、支鏈PEG N-羥基琥珀酰亞胺(mPEG2-NHS)、mPEG-CM-HBA-NHS、NHS-HBA-CM-PEG-CM-HBA-NHS、mPEG-ButyrALD、ButyrALD-PEG-ButyrALD、支鏈PEG ButyrALD(mPEG2-ButyrALD)、鄰吡啶基硫酯(mPEG-OPTE)、mPEG馬來(lái)酰亞胺(MAL)、MAL-PEG-MAL、支鏈PEG馬來(lái)酰亞胺(mPEG2-MAL)、叉形馬來(lái)酰亞胺(mPEG-MAL2和mPEG2-MAL2)、mPEG-鄰吡啶基二硫化物(mPEG-OPSS)、OPSS-PEG-OPSS、mPEG-SH、SH-PEG-SH、胺-PEG-酸、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、MAL-PEG-NHS、乙烯基砜-PEG-NHS、丙烯酸酯-PEG-NHS酯。

可在胺聚乙二醇化中使用的PEG的非限制性實(shí)例包括例如由Jenken Technology USA制造的PEG，諸如：Y形PEG NHS酯、Y形PEG羧基、葡萄糖PEG NHS酯、半乳糖PEG NHS酯、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基羧甲基酯、甲氧基PEG羧基、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基丁酸酯、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基己酸酯、甲氧基PEG己酸、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基琥珀酰胺、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基戊二酰胺、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基碳酸酯、甲氧基PEG硝基苯基碳酸酯、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基琥珀酸酯、甲氧基PEG琥珀酰亞胺基戊二酸酯。可在硫醇聚乙二醇化中使用的PEG的非限制性實(shí)例包括Y形PEG馬來(lái)酰亞胺、甲氧基PEG馬來(lái)酰亞胺、甲氧基PEG乙烯基砜、甲氧基PEG硫醇?？稍贜-末端聚乙二醇化中使用的PEG的非限制性實(shí)例包括例如由Jenken Technology USA制造的PEG，諸如：Y形PEG醛、Y形PEG乙醛、Y形PEG丙醛、甲氧基PEG丙醛。

在一些情況下，重組精氨酸酶或其功能性片段可具有與它所附接的PEG寡聚體相比更小的分子量。PEG寡聚體的分子量可以為例如不大于100千道爾頓(kDa)、不大于95千道爾頓、不大于90千道爾頓、不大于85千道爾頓(kDa)、不大于80千道爾頓(kDa)、不大于75千道爾頓(kDa)、不大于70千道爾頓(kDa)、不大于65千道爾頓(kDa)、不大于60千道爾頓(kDa)、不大于55千道爾頓(kDa)、不大于50千道爾頓(kDa)、不大于45千道爾頓(kDa)、不大于40千道爾頓(kDa)、不大于35千道爾頓(kDa)、不大于30千道爾頓(kDa)、不大于25千道爾頓(kDa)、不大于20千道爾頓(kDa)、不大于15千道爾頓(kDa)、不大于10千道爾頓(kDa)、不大于5千道爾頓(kDa)、不大于1千道爾頓(kDa)或不大于500道爾頓(Da)。

在一些情況下，PEG分子的分子量可以為大于500道爾頓(Da)、大于1千道爾頓(kDa)、大于5千道爾頓(kDa)、大于10千道爾頓(kDa)、大于15千道爾頓(kDa)、大于20千道爾頓(kDa)、大于25千道爾頓(kDa)、大于30千道爾頓(kDa)、大于35千道爾頓(kDa)、大于40千道爾頓(kDa)、大于45千道爾頓(kDa)、大于50千道爾頓(kDa)、大于55千道爾頓(kDa)、大于60千道爾頓(kDa)、大于65千道爾頓(kDa)、大于70千道爾頓(kDa)、大于75千道爾頓(kDa)、大于80千道爾頓(kDa)、大于85千道爾頓(kDa)、大于90千道爾頓(kDa)、大于95千道爾頓(kDa)、大于100千道爾頓(kDa)。

在一些情況下，PEG寡聚體的分子量可以為約1千道爾頓(kDa)至約5千道爾頓(kDa)、約1千道爾頓(kDa)至約10千道爾頓(kDa)、約10千道爾頓(kDa)至約20千道爾頓(kDa)、約10千道爾頓(kDa)至約30千道爾頓(kDa)、約10千道爾頓(kDa)至約40千道爾頓(kDa)、約10千道爾頓(kDa)至約50千道爾頓(kDa)、約20千道爾頓(kDa)至約30千道爾頓(kDa)、約20千道爾頓(kDa)至約40千道爾頓(kDa)、約20千道爾頓(kDa)至約50千道爾頓(kDa)、約30千道爾頓(kDa)至約40千道爾頓(kDa)、約30千道爾頓(kDa)至約50千道爾頓(kDa)。

在一些實(shí)施方案中，PEG寡聚體的分子量為約5千道爾頓(kDa)。在一些實(shí)施方案中，PEG寡聚體的分子量為約20千道爾頓(kDa)至約40千道爾頓(kDa)。

采用PEG寡聚體修飾的重組精氨酸酶

本公開(kāi)內(nèi)容提供了可附接至諸如SEQ ID NO:1-16的重組精氨酸酶以改變或改善流變學(xué)性質(zhì)的PEG寡聚體。PEG寡聚體還可以附接至所述重組精氨酸酶的功能性片段。所述改善可以導(dǎo)致改進(jìn)的制劑。PEG寡聚體可以共價(jià)附接至重組精氨酸酶。PEG寡聚體可以附接至重組精氨酸酶的N-末端、C-末端或通過(guò)其側(cè)鏈附接。例如，PEG寡聚體可以附接至重組精氨酸酶的氨基酸序列的末端，或者可以附接至側(cè)鏈，諸如賴(lài)氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或谷氨酸殘基的側(cè)鏈?？梢越?jīng)由酰胺鍵、酯鍵、醚鍵、氨基甲酸酯鍵或硫醚鍵進(jìn)行所述附接。

在一些情況下，聚乙二醇分子與純化的重組人精氨酸酶I的半胱氨酸殘基綴合。在一些情況下，聚乙二醇分子與純化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)的胺殘基綴合。在一些情況下，聚乙二醇分子與純化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)的N-末端綴合。圖14示出了一種用來(lái)評(píng)估重組人精氨酸酶I的聚乙二醇化的過(guò)程。

藥物組合物

本發(fā)明的藥物組合物可以是本文所述的任何重組精氨酸酶與其他化學(xué)組分如載體、穩(wěn)定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑的組合。該藥物組合物將促進(jìn)所述重組精氨酸酶向生物體的施用。藥物組合物可作為藥物組合物以治療有效量通過(guò)多種形式和途徑施用，所述形式和途徑包括例如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、直腸、氣霧劑、腸胃外、眼部、經(jīng)肺、經(jīng)皮、陰道、經(jīng)眼、經(jīng)鼻和局部施用。藥物組合物可以以局部或全身性方式施用，例如，通過(guò)將重組精氨酸酶直接注射至器官，任選地在儲(chǔ)庫(kù)(depot)中。

腸胃外注射劑可以被配制用于團(tuán)注或連續(xù)輸注。所述藥物組合物可以是適合于腸胃外注射的形式，作為油性或水性媒介物(vehicle)中的無(wú)菌懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑等配制劑。用于腸胃外給藥的藥物制劑包括水溶性形式的重組精氨酸的水溶液?？蓪⒅亟M精氨酸的懸浮液配制為油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。該懸浮液還可以含有增加重組精氨酸酶的溶解度和/或減少重組精氨酸酶的聚集以允許制備高度濃縮溶液的適宜的穩(wěn)定劑或試劑?；蛘?，該重組精氨酸酶可以是凍干的或?yàn)榉勰┬问?，以供在使用前用合適的媒介物例如無(wú)菌無(wú)熱原水來(lái)重建。在一些實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)施用本發(fā)明的純化的聚乙二醇化的重組精氨酸酶。

所述重組精氨酸酶可以局部施用，并且可以被配制成多種可局部施用的組合物，諸如溶液、懸浮液、洗劑、凝膠、糊劑、藥棒、香膏、乳膏和軟膏。這樣的藥物組合物可含有增溶劑、穩(wěn)定劑、張度增強(qiáng)劑、緩沖液和防腐劑。

在實(shí)施本文提供的治療或使用方法時(shí)，將治療有效量的本文所述的重組精氨酸酶以藥物組合物的形式施用于罹患影響免疫系統(tǒng)的病況的受試者。在一些實(shí)施方案中，該受試者是哺乳動(dòng)物，如人。根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度、受試者的年齡和相對(duì)健康狀況、所用化合物的效力和其他因素，治療有效量可以大范圍地變化。

藥物組合物可以利用一種或多種生理學(xué)上可接受的包含賦形劑和助劑的載體來(lái)配制，所述載體有助于將活性化合物加工成可以在藥學(xué)上使用的制劑。制劑可以根據(jù)所選擇的給藥途徑來(lái)改進(jìn)。包含本文所述化合物的藥物組合物可以通過(guò)例如混合、溶解、造粒、制錠、磨細(xì)、乳化、包封、包埋或壓縮工藝來(lái)制備。所述藥物組合物可以包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，以及游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽形式的本文所述的化合物。

用于制備包含本文所述化合物的重組精氨酸酶的方法包括將該重組精氨酸酶與一種或多種惰性的、藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體一起配制以形成固體、半固體或液體組合物。固體組合物包括例如粉劑、片劑、可分散顆粒劑、膠囊劑、扁囊劑和栓劑。液體組合物包括例如溶解有重組精氨酸酶的溶液、包含重組精氨酸酶的乳液或含有脂質(zhì)體、微束或包含本文所公開(kāi)的重組精氨酸酶的納米顆粒的溶液。半固體組合物包括例如凝膠、懸浮液和乳膏。所述組合物可以是液體溶液或懸浮液，適合于在使用前在液體中溶解或懸浮的固體形式，或作為乳液。這些組合物還可以含有少量的無(wú)毒、輔助性物質(zhì)，諸如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖劑以及其他藥學(xué)上可接受的添加劑。

藥學(xué)上可接受的賦形劑的非限制性實(shí)例可見(jiàn)于例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.編著,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第十七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，所述每一篇文獻(xiàn)均通過(guò)引用以其全文并入。

給藥方法

可以施用本文所述的含有重組精氨酸酶或重組精氨酸酶的功能性片段的藥物組合物以用于預(yù)防性和/或治療性處理。在治療性應(yīng)用中，可將所述組合物以足以治愈或至少部分控制疾病或病況的癥狀或足以治好、治愈、改善或減輕病況的量施用于已患有該疾病或病況的受試者。還可以施用重組精氨酸酶以減小病況發(fā)展、罹患(contracting)或惡化的可能性。用于這一應(yīng)用的有效量可根據(jù)疾病或病況的嚴(yán)重程度和病程、既往療法、受試者的健康狀況、體重和對(duì)藥物的反應(yīng)以及治療醫(yī)生的判斷而不同。在一些實(shí)施方案中，本文描述的發(fā)明提供了一種治療受試者中的炎性疾病的方法，該方法包括向該受試者施用治療有效量的純化的重組精氨酸酶。在一些實(shí)施方案中，該炎性疾病是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在一些實(shí)施方案中，該炎性疾病是多發(fā)性硬化。在一些實(shí)施方案中，該炎性疾病是骨中的慢性或急性炎癥。在一些實(shí)施方案中，該純化的重組精氨酸酶是聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I。在一些實(shí)施方案中，該人精氨酸酶I是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。在一些實(shí)施方案中，該聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。

多種重組精氨酸酶可以以任意順序或同時(shí)施用。在一些情況下，重組精氨酸酶的多個(gè)功能性片段可以以任意順序或同時(shí)施用。如果同時(shí)施用，多種重組精氨酸酶可以以單次、統(tǒng)一的形式如靜脈內(nèi)注射劑提供，或者以多次的形式例如作為多次靜脈內(nèi)注射劑或丸劑提供?？梢詫⑺鲋亟M精氨酸酶共同或分別地包裝在單個(gè)包裝或多個(gè)包裝中。可以以多劑量給予一種或全部重組精氨酸酶。如果不同時(shí)施用，多個(gè)劑量之間的時(shí)間選擇可以變化長(zhǎng)達(dá)約一個(gè)月。

可以將本發(fā)明的化合物和組合物包裝為試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括關(guān)于所述化合物和組合物的用法的書(shū)面說(shuō)明。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)炎癥的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I，其中所述施用調(diào)節(jié)所述炎癥。在一些實(shí)施方案中，施用治療有效量的純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I至少24小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，施用治療有效量的純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I至少一周。在一些實(shí)施方案中，施用治療有效量的純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I至少兩周。

可以在疾病或病況發(fā)生之前、過(guò)程中或之后施用本文所述的重組精氨酸酶或其功能性片段，并且施用含有重組精氨酸酶的組合物的時(shí)機(jī)選擇可以不同。例如，該重組精氨酸酶可以用作預(yù)防劑，并且可以向具有病況或疾病傾向的受試者連續(xù)施用以便減少該疾病或病況發(fā)生的可能性?？稍诎Y狀發(fā)作過(guò)程中或在癥狀發(fā)作之后盡快將所述重組精氨酸酶施用于受試者?？稍诎Y狀發(fā)作時(shí)立即、癥狀發(fā)作的前3小時(shí)內(nèi)、癥狀發(fā)作的前6小時(shí)內(nèi)、癥狀發(fā)作的前24小時(shí)內(nèi)、癥狀發(fā)作的前48小時(shí)內(nèi)或從癥狀發(fā)作起的任何時(shí)間段內(nèi)開(kāi)始施用所述重組精氨酸酶。最初施用可以經(jīng)由任何實(shí)用途徑，諸如通過(guò)利用本文所述的任何制劑的本文所述的任何途徑。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I的施用是靜脈內(nèi)施用。可以在檢測(cè)到或懷疑免疫疾病或病況的發(fā)作之后，一旦可行就施用重組精氨酸酶，并且施用治療該免疫疾病所需的時(shí)間長(zhǎng)度，例如，約24小時(shí)至約48小時(shí)，約48小時(shí)至約1周、約1周至約2周、約2周至約1個(gè)月、約1個(gè)月至約3個(gè)月。在一些實(shí)施方案中，可以施用重組精氨酸酶至少24小時(shí)、至少48小時(shí)、至少72小時(shí)、至少96小時(shí)、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1個(gè)月、至少2個(gè)月、至少3個(gè)月、至少4個(gè)月、至少5個(gè)月、至少6個(gè)月、至少7個(gè)月、至少8個(gè)月、至少9個(gè)月、至少10個(gè)月、至少11個(gè)月、至少12個(gè)月、至少1年、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。治療的長(zhǎng)度可對(duì)于每一個(gè)受試者而不同。在一些實(shí)施方案中，所述重組精氨酸酶的聚乙二醇化調(diào)節(jié)重組精氨酸酶的體內(nèi)半衰期。

劑量

本文所述的藥物組合物可以是適合于精確劑量的單次施用的單位劑型。在單位劑型中，所述制劑被分成含有適量的一種或多種化合物的單位劑量。該單位劑量可以是含有離散量的所述制劑的包裝的形式。非限制性實(shí)例是包裝的片劑或膠囊劑以及小瓶或安瓿中的粉劑?？梢詫⑺詰腋∫航M合物包裝在單劑量的不能重復(fù)密封的容器中。多劑量的能重復(fù)密封的容器可以例如與防腐劑或不與防腐劑聯(lián)合使用。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物不包含防腐劑。用于腸胃外注射的制劑可以以單位劑型例如在安瓿中提供，或在具有防腐劑的多劑量容器中提供。

本文所述的重組精氨酸酶或其功能性片段可以以約1mg至約2000mg、約5mg至約1000mg、約10mg至約500mg、約50mg至約250mg、約100mg至約200mg、約1mg至約50mg、約50mg至約100mg、約100mg至約150mg、約150mg至約200mg、約200mg至約250mg、約250mg至約300mg、約300mg至約350mg、約350mg至約400mg、約400mg至約450mg、約450mg至約500mg、約500mg至約550mg、約550mg至約600mg、約600mg至約650mg、約650mg至約700mg、約700mg至約750mg、約750mg至約800mg、約800mg至約850mg、約850mg至約900mg、約900mg至約950mg或約950mg至約1000mg的范圍存在于組合物中。

本文所述的重組精氨酸酶或其功能性片段可以以約1mg、約2mg、約3mg、約4mg、約5mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約125mg、約150mg、約175mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg、約1000mg、約1050mg、約1100mg、約1150mg、約1200mg、約1250mg、約1300mg、約1350mg、約1400mg、約1450mg、約1500mg、約1550mg、約1600mg、約1650mg、約1700mg、約1750mg、約1800mg、約1850mg、約1900mg、約1950mg或約2000mg的量存在于組合物中。

本發(fā)明的聚乙二醇化的重組精氨酸酶或其功能性片段的治療有效劑量可以為約1ng/kg至約10ng/kg、約1ng/kg至約100ng/kg、約1ng/kg至約1mg/kg、約1ng/kg至約10mg/kg、約1ng/kg至約100mg/kg、約1ng/kg至約250mg/kg、約1ng/kg至約500mg/kg、約1ng/kg至約750mg/kg、約1ng/kg至約1,000mg/kg、約1ng/kg至約1,250mg/kg、約1ng/kg至約1,500mg/kg、約1ng/kg至約1,750mg/kg、約1ng/kg至約2,000mg/kg、約10ng/kg至約100ng/kg、約10ng/kg至約1mg/kg、約10ng/kg至約10mg/kg、約10ng/kg至約100mg/kg、約10ng/kg至約500mg/kg、約10ng/kg至約750mg/kg、約10ng/kg至約1,000mg/kg、約10ng/kg至約1,250mg/kg、約10ng/kg至約1,500mg/kg、約10ng/kg至約2,000mg/kg、約100ng/kg至約1mg/kg、約100ng/kg至約10mg/kg、約100ng/kg至約100mg/kg、約100ng/kg至約250mg/kg、約100ng/kg至約500mg/kg、約100ng/kg至約750mg/kg、約100ng/kg至約1,000mg/kg、約100ng/kg至約1,250mg/kg、約100ng/kg至約1,500mg/kg、約100ng/kg至約1,750mg/kg、約100ng/kg至約2,000mg/kg、約1mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約100mg/kg、約1mg/kg至約500mg/kg、約1mg/kg至約750mg/kg、約1mg/kg至約1,000mg/kg、約1mg/kg至約1,250mg/kg、約1mg/kg至約1,500mg/kg、約1mg/kg至約1,750mg/kg、約1mg/kg至約2,000mg/kg、約10mg/kg至約100mg/kg、約10mg/kg至約500mg/kg、約10mg/kg至約750mg/kg、約10mg/kg至約1,000mg/kg、約10mg/kg至約1,250mg/kg、約10mg/kg至約1,500mg/kg、約10mg/kg至約1,750mg/kg、約10mg/kg至約2,000mg/kg、約100mg/kg至約500mg/kg、約100mg/kg至約750mg/kg、約100mg/kg至約1,000mg/kg、約100mg/kg至約1,250mg/kg、約100mg/kg至約1,500mg/kg、約100mg/kg至約1,750mg/kg、約100mg/kg至約2,000mg/kg、約500mg/kg至約750mg/kg、約500mg/kg至約1,000mg/kg、約500mg/kg至約1,250mg/kg、約500mg/kg至約1,500mg/kg、約500mg/kg至約1,750mg/kg、約500mg/kg至約2,000mg/kg、約750mg/kg至約1,000mg/kg、約750mg/kg至約1,250mg/kg、約750mg/kg至約1,500mg/kg、約750mg/kg至約1,750mg/kg、約750mg/kg至約2,000mg/kg、約1,000mg/kg至約1,250mg/kg、約1,000mg/kg至約1,500mg/kg、約1,000mg/kg至約1,750mg/kg或約1,000mg/kg至約2,000mg/kg。

在一些實(shí)施方案中，純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段的治療有效量為約1mg/kg至約10mg/kg。在一些實(shí)施方案中，純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I的治療有效量為約10mg/kg至約100mg/kg。在一些實(shí)施方案中，純化的聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I或其功能性片段的治療有效量大于100mg/kg。

藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)測(cè)量

藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)數(shù)據(jù)可以通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)獲得。描述特定組合物的適當(dāng)?shù)乃幋鷦?dòng)力學(xué)和藥效學(xué)譜組分可由于不同受試者中的藥物代謝的差異而不同。藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)譜可以基于一組受試者的平均參數(shù)的測(cè)定。這組受試者包括適合于測(cè)定代表性平均值的任何合理數(shù)目的受試者，例如，5個(gè)受試者、10個(gè)受試者、15個(gè)受試者、20個(gè)受試者、25個(gè)受試者、30個(gè)受試者、35個(gè)受試者或更多。通過(guò)計(jì)算全部受試者的每個(gè)所測(cè)參數(shù)的測(cè)量值的平均值來(lái)確定該平均值。

如本文所述，可以調(diào)節(jié)劑量以獲得所需的藥代動(dòng)力學(xué)或藥效學(xué)譜，諸如所需的或有效的血液譜。為了在體外更好地表征重組人精氨酸酶I的酶動(dòng)力學(xué)，測(cè)量了五種不同的重組精氨酸酶的K_m、V_max、K_cat和K_cat/Km。

表2顯示了五種人重組精氨酸酶的酶動(dòng)力學(xué)研究的總結(jié)。

所述藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以是適合于描述本發(fā)明的重組精氨酸酶I或其功能性片段的血漿譜的任何參數(shù)。例如，可以在給藥例如約零分鐘、約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約6分鐘、約7分鐘、約8分鐘、約9分鐘、約10分鐘、約11分鐘、約12分鐘、約13分鐘、約14分鐘、約15分鐘、約16分鐘、約17分鐘、約18分鐘、約19分鐘、約20分鐘、約21分鐘、約22分鐘、約23分鐘、約24分鐘、約25分鐘、約26分鐘、約27分鐘、約28分鐘、約29分鐘、約30分鐘、約31分鐘、約32分鐘、約33分鐘、約34分鐘、約35分鐘、約36分鐘、約37分鐘、約38分鐘、約39分鐘、約40分鐘、約41分鐘、約42分鐘、約43分鐘、約44分鐘、約45分鐘、約46分鐘、約47分鐘、約48分鐘、約49分鐘、約50分鐘、約51分鐘、約52分鐘、約53分鐘、約54分鐘、約55分鐘、約56分鐘、約57分鐘、約58分鐘、約59分鐘、約60分鐘、約零小時(shí)、約0.5小時(shí)、約1小時(shí)、約1.5小時(shí)、約2小時(shí)、約2.5小時(shí)、約3小時(shí)、約3.5小時(shí)、約4小時(shí)、約4.5小時(shí)、約5小時(shí)、約5.5小時(shí)、約6小時(shí)、約6.5小時(shí)、約7小時(shí)、約7.5小時(shí)、約8小時(shí)、約8.5小時(shí)、約9小時(shí)、約9.5小時(shí)、約10小時(shí)、約10.5小時(shí)、約11小時(shí)、約11.5小時(shí)、約12小時(shí)、約12.5小時(shí)、約13小時(shí)、約13.5小時(shí)、約14小時(shí)、約14.5小時(shí)、約15小時(shí)、約15.5小時(shí)、約16小時(shí)、約16.5小時(shí)、約17小時(shí)、約17.5小時(shí)、約18小時(shí)、約18.5小時(shí)、約19小時(shí)、約19.5小時(shí)、約20小時(shí)、約20.5小時(shí)、約21小時(shí)、約21.5小時(shí)、約22小時(shí)、約22.5小時(shí)、約23小時(shí)、約23.5小時(shí)或約24小時(shí)之后的一個(gè)時(shí)刻獲得藥代動(dòng)力學(xué)譜。

所述藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以是適合于描述重組精氨酸酶I或其功能性片段的任何參數(shù)。C_max可以為例如，不小于約1μg/mL；不小于約5μg/mL；不小于約10μg/mL；不小于約15μg/mL；不小于約20μg/mL；不小于約25μg/mL；不小于約50μg/mL；不小于約75μg/mL；不小于約100μg/mL；不小于約200μg/mL；不小于約300μg/mL；不小于約400μg/mL；不小于約500μg/mL；不小于約600μg/mL；不小于約700μg/mL；不小于約800μg/mL；不小于約900μg/mL；不小于約1000μg/mL；不小于約1250μg/mL；不小于約1500μg/mL；不小于約1750μg/mL；不小于約2000μg/mL；或適合于描述本文所述的精氨酸酶的藥代動(dòng)力學(xué)譜的任何其他C_max。C_max可以為例如，約1μg/mL至約5,000μg/mL；約1μg/mL至約4,500μg/mL；約1μg/mL至約4,000μg/mL；約1μg/mL至約3,500μg/mL；約1μg/mL至約3,000μg/mL；約1μg/mL至約2,500μg/mL；約1μg/mL至約2,000μg/mL；約1μg/mL至約1,500μg/mL；約1μg/mL至約1,000μg/mL；約1μg/mL至約900μg/mL；約1μg/mL至約800μg/mL；約1μg/mL至約700μg/mL；約1μg/mL至約600μg/mL；約1μg/mL至約500μg/mL；約1μg/mL至約450μg/mL；約1μg/mL至約400μg/mL；約1μg/mL至約350μg/mL；約1μg/mL至約300μg/mL；約1μg/mL至約250μg/mL；約1μg/mL至約200μg/mL；約1μg/mL至約150μg/mL；約1μg/mL至約125μg/mL；約1μg/mL至約100μg/mL；約1μg/mL至約90μg/mL；約1μg/mL至約80μg/mL；約1μg/mL至約70μg/mL；約1μg/mL至約60μg/mL；約1μg/mL至約50μg/mL；約1μg/mL至約40μg/mL；約1μg/mL至約30μg/mL；約1μg/mL至約20μg/mL；約1μg/mL至約10μg/mL；約1μg/mL至約5μg/mL；約10μg/mL至約4,000μg/mL；約10μg/mL至約3,000μg/mL；約10μg/mL至約2,000μg/mL；約10μg/mL至約1,500μg/mL；約10μg/mL至約1,000μg/mL；約10μg/mL至約900μg/mL；約10μg/mL至約800μg/mL；約10μg/mL至約700μg/mL；約10μg/mL至約600μg/mL；約10μg/mL至約500μg/mL；約10μg/mL至約400μg/mL；約10μg/mL至約300μg/mL；約10μg/mL至約200μg/mL；約10μg/mL至約100μg/mL；約10μg/mL至約50μg/mL；約25μg/mL至約500μg/mL；約25μg/mL至約100μg/mL；約50μg/mL至約500μg/mL；約50μg/mL至約100μg/mL；約100μg/mL至約500μg/mL；約100μg/mL至約400μg/mL；約100μg/mL至約300μg/mL；或約100μg/mL至約200μg/mL。

本文所述的精氨酸酶I或其功能性片段的T_max可以為例如，不大于約0.5小時(shí)、不大于約1小時(shí)、不大于約1.5小時(shí)、不大于約2小時(shí)、不大于約2.5小時(shí)、不大于約3小時(shí)、不大于約3.5小時(shí)、不大于約4小時(shí)、不大于約4.5小時(shí)、不大于約5小時(shí)或適合于描述本文所述化合物的藥代動(dòng)力學(xué)譜的任何其他T_max。T_max可以為例如，約0.1小時(shí)至約24小時(shí)；約0.1小時(shí)至約0.5小時(shí)；約0.5小時(shí)至約1小時(shí)；約1小時(shí)至約1.5小時(shí)；約1.5小時(shí)至約2小時(shí)；約2小時(shí)至約2.5小時(shí)；約2.5小時(shí)至約3小時(shí)；約3小時(shí)至約3.5小時(shí)；約3.5小時(shí)至約4小時(shí)；約4小時(shí)至約4.5小時(shí)；約4.5小時(shí)至約5小時(shí)；約5小時(shí)至約5.5小時(shí)；約5.5小時(shí)至約6小時(shí)；約6小時(shí)至約6.5小時(shí)；約6.5小時(shí)至約7小時(shí)；約7小時(shí)至約7.5小時(shí)；約7.5小時(shí)至約8小時(shí)；約8小時(shí)至約8.5小時(shí)；約8.5小時(shí)至約9小時(shí)；約9小時(shí)至約9.5小時(shí)；約9.5小時(shí)至約10小時(shí)；約10小時(shí)至約10.5小時(shí)；約10.5小時(shí)至約11小時(shí)；約11小時(shí)至約11.5小時(shí)；約11.5小時(shí)至約12小時(shí)；約12小時(shí)至約12.5小時(shí)；約12.5小時(shí)至約13小時(shí)；約13小時(shí)至約13.5小時(shí)；約13.5小時(shí)至約14小時(shí)；約14小時(shí)至約14.5小時(shí)；約14.5小時(shí)至約15小時(shí)；約15小時(shí)至約15.5小時(shí)；約15.5小時(shí)至約16小時(shí)；約16小時(shí)至約16.5小時(shí)；約16.5小時(shí)至約17小時(shí)；約17小時(shí)至約17.5小時(shí)；約17.5小時(shí)至約18小時(shí)；約18小時(shí)至約18.5小時(shí)；約18.5小時(shí)至約19小時(shí)；約19小時(shí)至約19.5小時(shí)；約19.5小時(shí)至約20小時(shí)；約20小時(shí)至約20.5小時(shí)；約20.5小時(shí)至約21小時(shí)；約21小時(shí)至約21.5小時(shí)；約21.5小時(shí)至約22小時(shí)；約22小時(shí)至約22.5小時(shí)；約22.5小時(shí)至約23小時(shí)；約23小時(shí)至約23.5小時(shí)；或約23.5小時(shí)至約24小時(shí)。

本文所述的精氨酸酶I或其功能性片段的AUC_(0-inf)可以為例如，不小于約100μg·hr/mL、不小于約125μg·hr/mL、不小于約150μg·hr/mL、不小于約175μg·hr/mL、不小于約200μg·hr/mL、不小于約250μg·hr/mL、不小于約300μg·hr/mL、不小于約350μg·hr/mL、不小于約400μg·hr/mL、不小于約500μg·hr/mL、不小于約600μg·hr/mL、不小于約700μg·hr/mL、不小于約800μg·hr/mL、不小于約900μg·hr/mL、不小于約1000μg·hr/mL、不小于約2000μg·hr/mL、不小于約3000μg·hr/mL、不小于約4000μg·hr/mL、不小于約5000μg·hr/mL、不小于約6000μg·hr/mL、不小于約7000μg·hr/mL、不小于約8000μg·hr/mL、不小于約9000μg·hr/mL、不小于約10000μg·hr/mL、不小于約11000μg·hr/mL、不小于約12000μg·hr/mL、不小于約13000μg·hr/mL、不小于約14000μg·hr/mL、不小于約15000μg·hr/mL、不小于約16000μg·hr/mL、不小于約17000μg·hr/mL、不小于約18000μg·hr/mL、不小于約19000μg·hr/mL、不小于約20000μg·hr/mL、不小于約21000μg·hr/mL、不小于約22000μg·hr/mL、不小于約23000μg·hr/mL、不小于約24000μg·hr/mL、不小于約25000μg·hr/mL、不小于約26000μg·hr/mL、不小于約27000μg·hr/mL、不小于約28000μg·hr/mL、不小于約29000μg·hr/mL、不小于約30000μg·hr/mL、不小于約31000μg·hr/mL、不小于約32000μg·hr/mL、不小于約33000μg·hr/mL、不小于約34000μg·hr/mL、不小于約35000μg·hr/mL或適合于描述本文所述精氨酸酶的藥代動(dòng)力學(xué)譜的任何其他AUC_(0-inf)。

本文所述的精氨酸酶I或其功能性片段的AUC_(0-inf)可以為例如，約1,000μg·hr/mL至約1,250μg·hr/mL；約1,250μg·hr/mL至約1,500μg·hr/mL；約1,500μg·hr/mL至約1,750μg·hr/mL；約1,750μg·hr/mL至約2,000μg·hr/mL；約2,000μg·hr/mL至約2,500μg·hr/mL；約2,500μg·hr/mL至約3,000μg·hr/mL；約3,000μg·hr/mL至約3,500μg·hr/mL；約3,500μg·hr/mL至約4,000μg·hr/mL；約4,000μg·hr/mL至約4,500μg·hr/mL；約4,500μg·hr/mL至約5,000μg·hr/mL；約5,000μg·hr/mL至約5,500μg·hr/mL；約5,500μg·hr/mL至約6,000μg·hr/mL；約6,000μg·hr/mL至約6,500μg·hr/mL；約6,500μg·hr/mL至約7,000μg·hr/mL；約7,000μg·hr/mL至約7,500μg·hr/mL；約7,500μg·hr/mL至約8,000μg·hr/mL；約8,000μg·hr/mL至約8,500μg·hr/mL；約8,500μg·hr/mL至約9,000μg·hr/mL；約9,000μg·hr/mL至約9,500μg·hr/mL；約9,500μg·hr/mL至約10,000μg·hr/mL；約10,000μg·hr/mL至約20,000μg·hr/mL；約20,000μg·hr/mL至約30,000μg·hr/mL；約30,000μg·hr/mL至約40,000μg·hr/mL；約40,000μg·hr/mL至約50,000μg·hr/mL；約50,000μg·hr/mL至約60,000μg·hr/mL；約60,000μg·hr/mL至約70,000μg·hr/mL；約70,000μg·hr/mL至約80,000μg·hr/mL；約80,000μg·hr/mL至約90,000μg·hr/mL；或約90,000μg·hr/mL至約100,000μg·hr/mL。

本文所述的重組人精氨酸酶I或其功能性片段的血漿濃度可以為例如，不小于約1μg/mL、不小于約2μg/mL、不小于約3μg/mL、不小于約4μg/mL、不小于約5μg/mL、不小于約6μg/mL、不小于約7μg/mL、不小于約8μg/mL、不小于約9μg/mL、不小于約10μg/mL、不小于約11μg/mL、不小于約12μg/mL、不小于約13μg/mL、不小于約14μg/mL、不小于約15μg/mL、不小于約16μg/mL、不小于約17μg/mL、不小于約18μg/mL、不小于約19μg/mL、不小于約20μg/mL、不小于約21μg/mL、不小于約22μg/mL、不小于約23μg/mL、不小于約24μg/mL、不小于約25μg/mL、不小于約26μg/mL、不小于約27μg/mL、不小于約28μg/mL、不小于約29μg/mL、不小于約30μg/mL、不小于約31μg/mL、不小于約32μg/mL、不小于約33μg/mL、不小于約34μg/mL、不小于約35μg/mL、不小于約36μg/mL、不小于約37μg/mL、不小于約38μg/mL、不小于約39μg/mL、不小于約40μg/mL、不小于約41μg/mL、不小于約42μg/mL、不小于約43μg/mL、不小于約44μg/mL、不小于約45μg/mL、不小于約46μg/mL、不小于約47μg/mL、不小于約48μg/mL、不小于約49μg/mL、不小于約50μg/mL、不小于約51μg/mL、不小于約52μg/mL、不小于約53μg/mL、不小于約54μg/mL、不小于約55μg/mL、不小于約56μg/mL、不小于約57μg/mL、不小于約58μg/mL、不小于約59μg/mL、不小于約60μg/mL、不小于約61μg/mL、不小于約62μg/mL、不小于約63μg/mL、不小于約64μg/mL、不小于約65μg/mL、不小于約66μg/mL、不小于約67μg/mL、不小于約68μg/mL、不小于約69μg/mL、不小于約70μg/mL、不小于約71μg/mL、不小于約72μg/mL、不小于約73μg/mL、不小于約74μg/mL、不小于約75μg/mL、不小于約76μg/mL、不小于約77μg/mL、不小于約78μg/mL、不小于約79μg/mL、不小于約80μg/mL、不小于約81μg/mL、不小于約82μg/mL、不小于約83μg/mL、不小于約84μg/mL、不小于約85μg/mL、不小于約86μg/mL、不小于約87μg/mL、不小于約88μg/mL、不小于約89μg/mL、不小于約90μg/mL、不小于約91μg/mL、不小于約92μg/mL、不小于約93μg/mL、不小于約94μg/mL、不小于約95μg/mL、不小于約96μg/mL、不小于約97μg/mL、不小于約98μg/mL、不小于約99μg/mL、不小于約100μg/mL、不小于約105μg/mL、不小于約110μg/mL、不小于約115μg/mL、不小于約120μg/mL、不小于約125μg/mL、不小于約130μg/mL、不小于約135μg/mL、不小于約140μg/mL、不小于約145μg/mL、不小于約150μg/mL、不小于約155μg/mL、不小于約160μg/mL、不小于約165μg/mL、不小于約170μg/mL、不小于約175μg/mL、不小于約180μg/mL、不小于約185μg/mL、不小于約190μg/mL、不小于約195μg/mL、不小于約200μg/mL、不小于約205μg/mL、不小于約210μg/mL、不小于約215μg/mL、不小于約220μg/mL、不小于約225μg/mL、不小于約230μg/mL、不小于約235μg/mL、不小于約240μg/mL、不小于約245μg/mL、不小于約250μg/mL或本文所述化合物的任何其他血漿濃度。

血漿濃度可以為例如，約1μg/mL至約2μg/mL；約1μg/mL至約5μg/mL；約5μg/mL至約10μg/mL；約10μg/mL至約25μg/mL；約25μg/mL至約50μg/mL；約50μg/mL至約75μg/mL；約75ng/mL至約100μg/mL；約100μg/mL至約150μg/mL；約100μg/mL至約200μg/mL about 150μg/mL至約200μg/mL；約200μg/mL至約250μg/mL；約250μg/mL至約300μg/mL；約300μg/mL至約350μg/mL；約350μg/mL至約400μg/mL；約400μg/mL至約450μg/mL；約450μg/mL至約500μg/mL；約500μg/mL至約600μg/mL；約600μg/mL至約700μg/mL；約700μg/mL至約800μg/mL；約800μg/mL至約900μg/mL；約900μg/mL至約1,000μg/mL；約1,000μg/mL至約1,100μg/mL；約1,100μg/mL至約1,200μg/mL；約1,200μg/mL至約1,300μg/mL；約1,300μg/mL至約1,400μg/mL；約1,400μg/mL至約1,500μg/mL；約1,500μg/mL至約1,600μg/mL；約1,600μg/mL至約1,700μg/mL；約1,700μg/mL至約1,800μg/mL；約1,800μg/mL至約1,900μg/mL；或約1,900μg/mL至約2,000μg/mL。

實(shí)施例1.采用重組精氨酸酶I調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。

進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)來(lái)表征純化精氨酸酶在調(diào)節(jié)免疫病況如與炎癥相關(guān)的病況中的功能。

材料與方法

小鼠：floxed PTEN小鼠由Tak W.Mak(Suzuki,A.等人2001.T cell-specific loss of Pten leads to defects in central and peripheral tolerance.Immunity 14:523-534)描述。LysM cre小鼠最初由Clausen等人(Clausen,B.E.等人Transgenic Res.8:265-277)描述。采用回交至少10代的C57Bl/6背景的8-12周齡野生型、floxed PTEN cre陽(yáng)性和cre陰性小鼠進(jìn)行同窩出生仔畜對(duì)照實(shí)驗(yàn)。在膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)中使用DBA小鼠。所有動(dòng)物均被飼養(yǎng)和安置在維也納醫(yī)科大學(xué)(Medical University of Vienna)的12h/12h晝/夜循環(huán)和恒溫的SPF設(shè)施中。使用兩種性別的小鼠，并且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)性別特異性的差異。

基因型分型：小鼠在出生后3-4周做耳切(earmarking)。來(lái)自裂解的(蛋白酶K裂解緩沖液)耳組織的DNA利用GoTaq聚合酶(Promega^TM)進(jìn)行直接PCR。采用以下引物進(jìn)行特定的PCR：PTEN引物：正向，5′-CTCCTCTACTCCATTCTTCCC-3′，反向，5′-ACTCCCACCAATGAACAAAC-3′；cre引物：正向，5′-TCGCGATTATCTTCTATATCTTCAG-3′，反向，5′-GCTCGACCAGTTTAGTTACCC-3′。

原代巨噬細(xì)胞的制備和培養(yǎng)：通過(guò)將2ml 4％巰基乙酸鹽(Sigma^TM)注射入腹膜腔，然后在3天后用空培養(yǎng)基進(jìn)行腹腔灌洗，來(lái)產(chǎn)生巰基乙酸鹽引發(fā)的腹膜巨噬細(xì)胞。將分離出的巨噬細(xì)胞以1x 10⁶個(gè)細(xì)胞/ml的濃度接種在補(bǔ)充有10％FCS、1％青霉素/鏈霉素/兩性霉素B、1％L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)基(Invitrogen^TM)中，并在37℃下5％CO₂的氣氛中培養(yǎng)。使細(xì)胞復(fù)原過(guò)夜，并通過(guò)給巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)充以下試劑和細(xì)胞因子進(jìn)行體外刺激：100ng/ml超純大腸桿菌(E.coli)O111:B4脂多糖(LPS)(Invivogen^TM)、100nM渥曼青霉素(wortmannin)(Sigma^TM)、10或200μM N-羥基-L-精氨酸(Calbiochem^TM)或5ng/ml重組小鼠IL-4/IL-13(R&D Systems^TM)。刺激進(jìn)行3、8或24hr以分別用于RNA提取、ABCD測(cè)定或蛋白質(zhì)分離和細(xì)胞因子測(cè)量。

骨髓衍生的樹(shù)突細(xì)胞(BMDC)的制備和培養(yǎng)：從標(biāo)示的小鼠的股骨和脛骨沖洗出骨髓細(xì)胞，并在37℃下5％CO₂的氣氛中在補(bǔ)充有20ng/ml重組小鼠GM-CSF(R&D Systems^TM)的完全RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在分離后的第3天和第6天用補(bǔ)充有20ng/ml GM-CSF的新鮮培養(yǎng)基更換所述培養(yǎng)基的一半。收獲樹(shù)突細(xì)胞(DC)并在第7天激活，且利用針對(duì)CD80(PE-Cy5^TM)和MHC-II(PerCP-eFluor 710^TM)(eBioscience^TM)的熒光綴合抗體通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定成熟狀態(tài)。將樣品與抗體混合物在4℃下一起溫育15min，隨后將其捕獲在LSRII流式細(xì)胞儀(Beckton Dickinson^TM)上。利用FlowJo^TM Software 10.0(Treestar^TM)軟件來(lái)分析數(shù)據(jù)。

免疫印跡分析：將細(xì)胞均質(zhì)化并在Laemmli緩沖液中裂解。在10％變性聚丙烯酰胺凝膠上通過(guò)SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，在電泳之后用考馬斯亮藍(lán)(Thermo Scientific Pierce^TM)染色。將蛋白質(zhì)印跡到聚偏氟乙烯膜(PVDF^TM,Millipore^TM)上，并且在用5％奶粉/0.1％吐溫20封閉之后與第一抗體溫育過(guò)夜。使用以下抗體：雞抗精氨酸酶1(由Dr.Morris惠贈(zèng))，針對(duì)iNOS(NEB^TM)、PTEN、STAT6、pSTAT6(Cell Signaling Technology^TM)、C/EBPβ(Santa Cruz Biotech)或β-肌動(dòng)蛋白(Sigma^TM)的兔抗體。在與相應(yīng)的過(guò)氧化物酶綴合的第二抗體在室溫(RT)下一起溫育2hr且隨后采用SuperSignal West Femto(Pierce^TM)顯色之后，利用化學(xué)發(fā)光法(FluorChem HD2化學(xué)發(fā)光成像儀，Alpha Innotech^TM)來(lái)檢測(cè)信號(hào)。根據(jù)它們的分子量分析條帶。

抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物DNA(ABCD)測(cè)定：將細(xì)胞用裂解緩沖液(10mM Tris pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA pH 8.0，10％甘油，0.5％NP-40，1mM DTT，蛋白酶抑制劑)裂解，超聲處理(6次脈沖2秒)，離心，并將上清液與緩沖液H(20mM HEPES pH 7.9，50mM KCl，20％甘油，1mM DTT，0.1％NP-40)、2.μg 5'-生物素化的寡核苷酸和20.μg鯡精DNA在37℃下一起溫育5min，然后在冰上溫育1h。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照(comp)，添加了10倍過(guò)量的非生物素化的寡核苷酸。陰性對(duì)照(nc)含有細(xì)胞裂解物、鯡精DNA和緩沖液H。將緩沖液H平衡的鏈霉抗生物素-瓊脂糖珠子(Novagen^TM)添加至pull-down和對(duì)照，隨后在旋轉(zhuǎn)器上于4℃溫育30nin。將珠子離心，用緩沖液H洗滌數(shù)次，在Laemmli緩沖液中煮沸，并通過(guò)SDS-PAGE分離。通過(guò)Western印跡法(Santa Cruz Biotech^TM)檢測(cè)C/EBPβ。5'-生物素化的和非生物素化的寡核苷酸從MicroSynth定購(gòu)：C/EBPβ_for：TAT TAG CCA ATA TTA GCC AAT ATT AGC CAA TAT TAG CCA，C/EBPβ_rev：TGG CTA ATA TTG GCT AAT ATT GGC TAA TAT TGG CTA ATA。

總RNA分離、反轉(zhuǎn)錄和定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)：按照制造商的說(shuō)明將細(xì)胞均質(zhì)化并用Trifast Reagent(PEQLAB Biotechnology GmbH^TM)進(jìn)行分離。如指導(dǎo)手冊(cè)中所述，使用高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas^TM)轉(zhuǎn)錄cDNA。使用Fast SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems^TM)，采用StepOne Real-Time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems^TM)和表3中的引物，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR對(duì)mRNA的表達(dá)予以量化。根據(jù)它們的解鏈曲線的質(zhì)量一式兩份地測(cè)定樣品。將靶基因的水平相對(duì)于HPRT或GAPDH進(jìn)行歸一化，并描述為相對(duì)于未受刺激的細(xì)胞的誘導(dǎo)倍數(shù)。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)：由淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞分泌的選定細(xì)胞因子的上清液水平通過(guò)利用商購(gòu)可得的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)(全部來(lái)自eBioscience)來(lái)測(cè)定，以供根據(jù)制造商的方案量化IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12/23(p40/共同亞單位)和IL-17A。在用LPS刺激后24h，分析巨噬細(xì)胞上清液中的IL-6和IL-12/23。對(duì)在第4天收集的同種異體的混合白細(xì)胞反應(yīng)的和髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)免疫的小鼠的再刺激的脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的上清液，測(cè)定IL-2、IFN-γ和IL-17A。簡(jiǎn)而言之，培養(yǎng)板用捕獲抗體包被、封閉，并加載經(jīng)稀釋的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品以供過(guò)夜溫育。接著，將培養(yǎng)板與檢測(cè)抗體，且隨后與鏈霉抗生物素-HRP(R&D Systems^TM)一起溫育，以用于顯色TMB 2-組分微孔過(guò)氧化物酶。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的誘發(fā)和離體再刺激：將小鼠分為4組，每組由4至8只小鼠組成(參見(jiàn)表4中的研究設(shè)計(jì))。簡(jiǎn)而言之，為免疫小鼠注射150μl乳液，該乳液含有等份MOG_35-55(1mg/ml,Charite Berlin^TM)和IFA(Sigma^TM)，補(bǔ)充有10mg/ml結(jié)核分枝桿菌H37Ra(Difco^TM)。

在免疫時(shí)和免疫后第二天，通過(guò)腹膜內(nèi)途徑施用200ng百日咳毒素(Calbiochem^TM)。對(duì)于純化的重組人精氨酸酶I的體內(nèi)施用，小鼠在免疫前第-4天和第-2天靜脈內(nèi)注射10mg/kg體重的劑量，或在免疫前第-4天、第-2天和免疫后第5天和第7天靜脈內(nèi)注射10mg/kg體重或1mg/kg體重的劑量。每天觀察小鼠的臨床體征。將EAE的進(jìn)展分為4個(gè)臨床階段：0期：無(wú)體征，1期：完全軟尾(floppy tail)，2期：嚴(yán)重的輕截癱，3期：四肢輕癱，4期：垂死狀態(tài)。對(duì)于離體刺激，將淋巴細(xì)胞和脾細(xì)胞分離并用30μg/ml同源MOG-肽刺激3天，以用于增殖分析和細(xì)胞因子測(cè)定。

混合白細(xì)胞反應(yīng)(MLR)：如上所述生成野生型DC。在分化的第6天將所述細(xì)胞的一部分用30μg/ml純化重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO:9)刺激24小時(shí)，另一部分用作未受刺激的對(duì)照。在不存在純化重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO:9)的情況下(通過(guò)準(zhǔn)確洗滌而去除)，在分化的第7天進(jìn)行MLR。簡(jiǎn)而言之，將所有細(xì)胞激活并加載LPS(100ng/ml，Invitrogen^TM)和卵清蛋白(50μg/ml，Sigma^TM)4小時(shí)，洗滌，并與OT-II細(xì)胞共同培養(yǎng)。采用泛T細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec^TM)經(jīng)由陽(yáng)性磁法細(xì)胞分選(positive magnetic cell sorting)從OT-II小鼠的脾中分離出應(yīng)答的(responder)T細(xì)胞，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)(Sigma^TM)用7μM CFSE/1x 10⁷細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。洗滌DC(100 000個(gè)細(xì)胞)并與應(yīng)答的T細(xì)胞(500 000個(gè)細(xì)胞)以500μl總體積接種在48孔中。在共同培養(yǎng)的第3天，收獲細(xì)胞、固定并使之經(jīng)歷細(xì)胞內(nèi)染色。為了增殖，將細(xì)胞收獲在TruCount管中并針對(duì)CFSE稀釋進(jìn)行分析。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的CD4*T細(xì)胞表型分析：從第3天的MLR體外培養(yǎng)物中分離出細(xì)胞并用PMA/離子霉素(Sigma^TM)與Golgi-Stop(BD Biosciences^TM)共同再刺激，且針對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子進(jìn)行分析。以下抗體用于細(xì)胞因子染色：抗小鼠CD4–PerCP(克隆RM4-5，BD Pharmingen^TM)、CD25-PE-Cy7(克隆PC61.5)、IL-2-450(克隆JES6-5H4)、IL-10-Alexa647(克隆JES5-16E3)、IL-17A-PE-Cy7(克隆17B7)、IFNγ-PE(克隆XMG1.2，全部來(lái)自eBioscience^TM)。在LSR 2流式細(xì)胞儀(BD Biosciences^TM)和FlowJo^TM軟件第10.0版(Treestar^TM)上進(jìn)行細(xì)胞捕獲和數(shù)據(jù)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)：通過(guò)使用非配對(duì)雙尾Student’s t檢驗(yàn)計(jì)算數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性。使用兩因素ANOVA分析來(lái)隨時(shí)間分析兩個(gè)組。利用GraphPad Prism軟件(GraphPad^TM Software,La Jolla,USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表示為平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。p值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)上顯著的(p值表示如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。

結(jié)果

為了更好地表征精氨酸酶I表達(dá)與免疫細(xì)胞激活之間的生物串?dāng)_(crosstalk)，研究了精氨酸酶I mRNA在不同條件下的表達(dá)概況。在缺乏PTEN的樹(shù)突細(xì)胞和同窩出生仔畜來(lái)源的對(duì)照細(xì)胞的全基因組篩選中，我們鑒定出了提高的精氨酸酶I mRNA水平。圖1示出了在巨噬細(xì)胞中LPS對(duì)精氨酸酶I的上調(diào)。在圖1中，巰基乙酸鹽引起的腹膜巨噬細(xì)胞(tPM)用大腸桿菌O111:B4LPS誘導(dǎo)8h和24h。精氨酸酶I表達(dá)在LPS刺激后8小時(shí)在mRNA水平上(圖1，A圖)和在LPS誘導(dǎo)后24小時(shí)內(nèi)在蛋白質(zhì)水平上(圖1，B圖)增加。選擇這些時(shí)間點(diǎn)以用于進(jìn)一步分析巨噬細(xì)胞中獨(dú)立于PI3K/PTEN信號(hào)傳導(dǎo)途徑的LPS介導(dǎo)的精氨酸酶I表達(dá)。

缺乏PTEN的巨噬細(xì)胞中精氨酸酶I的高表達(dá)提示，參與先天免疫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一個(gè)或多個(gè)組分可以調(diào)節(jié)或精氨酸酶I表達(dá)或被精氨酸酶I表達(dá)調(diào)節(jié)。圖2示出了精氨酸酶I表達(dá)的增加，伴隨著PTEN的損失。圖2中的A圖示出了在未受刺激的、缺乏PTEN的幼稚腹膜巨噬細(xì)胞中精氨酸酶I mRNA的顯著上調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)在固有的腹膜巨噬細(xì)胞和無(wú)菌炎癥誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞中進(jìn)行(圖2，B圖和C圖)。根據(jù)上調(diào)的精氨酸酶I mRNA表達(dá)，觀察到在未受刺激的PTEN^-/-tPM中stabilin 1的mRNA水平增加(圖2，D圖)和YM1和FIZZ的表達(dá)減少(圖2，E圖和F圖)。還證實(shí)了在PTEN陰性細(xì)胞中精氨酸酶I的蛋白質(zhì)表達(dá)的增加。

為了進(jìn)一步評(píng)估精氨酸酶I響應(yīng)于LPS誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)事件的功能，在LPS激活后24小時(shí)分析了精氨酸酶I在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)水平(圖2，H圖和I圖)。從同窩出生仔畜對(duì)照小鼠中收獲的野生型巨噬細(xì)胞顯示精氨酸酶I的輕微上調(diào)。值得注意的是，在LPS刺激的缺乏PTEN的巨噬細(xì)胞中，突出的M1標(biāo)志物iNOS的表達(dá)也得到增強(qiáng)。

進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步研究免疫細(xì)胞中精氨酸酶I的更廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)理：1)用LPS刺激野生型巨噬細(xì)胞；2)用真菌PI3K抑制劑渥曼青霉素抑制刺激，據(jù)報(bào)道該抑制劑在體外和體內(nèi)LPS誘導(dǎo)時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞因子合成(Guha,M.和N.Mackman.2002.The phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway limits lipopolysaccharide activation of signaling pathways and expression of inflammatory mediators in human monocytic cells.J.Biol.Chem.277:32124-32132)；Schabbauer,G.等人2004.PI3K-Akt pathway suppresses coagulation and inflammation in endotoxemic mice.Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.24:1963-1969)；以及采用3)精氨酸酶抑制劑N-羥基-去甲-L-精氨酸(L-nor-Arg)。精氨酸酶I的抑制顯著增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞中IL-6的產(chǎn)生量(圖2，J圖)。還評(píng)估了與野生型巨噬細(xì)胞相比，精氨酸酶特異性抑制劑對(duì)PTEN^-/-巨噬細(xì)胞的減少的細(xì)胞因子產(chǎn)生量的影響。經(jīng)采用L-nor-Arg處理，在缺乏PTEN的tPM中確實(shí)發(fā)現(xiàn)了野生型IL-6產(chǎn)生量的顯著但僅部分的恢復(fù)(圖2，K圖)。

在缺乏PTEN的過(guò)表達(dá)精氨酸酶的tPM中，藥理學(xué)精氨酸酶抑制和抗炎性表型的消融支持精氨酸酶I有助于炎性應(yīng)答的PI3K介導(dǎo)的調(diào)節(jié)的觀點(diǎn)。

巨噬細(xì)胞中的PTEN缺失上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ，該轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于精氨酸酶I啟動(dòng)子激活是至關(guān)重要的。為了闡明負(fù)責(zé)精氨酸酶I的PTEN介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，分析了若干潛在的候選轉(zhuǎn)錄因子(TF)。精氨酸酶I的最突出的調(diào)節(jié)劑是STAT 6，它在巨噬細(xì)胞中被IL-4和/或IL-13激活(Gordon,S.和F.O.Martinez.2010.Alternative activation of macrophages:mechanism and functions.Immunity 32:593-604)。未受刺激的tPM——來(lái)源于同窩出生仔畜對(duì)照動(dòng)物的缺乏PTEN的細(xì)胞或野生型細(xì)胞——沒(méi)有顯示出通過(guò)磷酸特異性STAT6抗體測(cè)得的STAT6總蛋白質(zhì)含量或激活的STAT6的任何明顯變化。另一種候選轉(zhuǎn)錄因子是C/EBPβ，它已顯示出有助于精氨酸酶I的模式識(shí)別受體介導(dǎo)的調(diào)節(jié)(El Kasmi,K.C.等人2008.Toll-like receptor-induced arginase 1in macrophages thwarts effective immunity against intracellular pathogens.Nat.Immunol.9:1399-1406)。

為了表征通過(guò)調(diào)節(jié)上游因子調(diào)節(jié)精氨酸酶I表達(dá)的機(jī)理，分析了PTEN對(duì)C/EBPβ的調(diào)節(jié)和隨后C/EBPβ對(duì)精氨酸酶I的組成性上調(diào)。圖3示出了C/EBPβ在缺乏PTEN的巨噬細(xì)胞中的功能。圖3中的小圖A示出了在缺乏PTEN的tPM中C/EBPβ蛋白質(zhì)的上調(diào)。圖3中的小圖B示出了C/EBPβ、LAP和LAP*的兩個(gè)同種型獲得了相同的結(jié)果。在LPS誘導(dǎo)后8小時(shí)內(nèi)觀察到轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)一步誘導(dǎo)。然而，至少在我們已經(jīng)評(píng)估的時(shí)間點(diǎn)處(8h)，我們無(wú)法鑒定到當(dāng)TLR4激活時(shí)PTEN缺失對(duì)C/EBPβ的額外的上調(diào)。因?yàn)樵贚PS誘導(dǎo)后24h觀察到最大的精氨酸酶I表達(dá)，因此我們不能排除C/EBPβ差異表達(dá)可能在激活的缺乏PTEN的巨噬細(xì)胞中更早地發(fā)生。

由于C/EBPβ是作用于特定DNA元件的轉(zhuǎn)錄因子，所以研究了C/EBPβ與含有若干不同TF共有結(jié)合位點(diǎn)的精氨酸酶增強(qiáng)子元件的結(jié)合。利用跨越位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3.8kb的精氨酸酶增強(qiáng)子內(nèi)的C/EBPβ共有位點(diǎn)的生物素化的寡核苷酸，用抗生物素蛋白生物素偶聯(lián)DNA(ABCD)結(jié)合試驗(yàn)評(píng)估C/EBPβDNA結(jié)合性質(zhì)。在過(guò)表達(dá)C/EBPβ的HEK細(xì)胞中測(cè)試該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的適宜性。過(guò)表達(dá)的C/EBPβ有效地結(jié)合能夠與結(jié)合它的轉(zhuǎn)錄因子(特別是LAP*同種型)共同沉淀的寡核苷酸。接著，分析在巨噬細(xì)胞中PTEN缺乏對(duì)C/EBPβDNA結(jié)合的影響。首先，驗(yàn)證用于ABCD結(jié)合試驗(yàn)的裂解物中C/EBPβ的存在。通過(guò)相對(duì)于GAPDH進(jìn)行再檢驗(yàn)來(lái)確定ABCD試驗(yàn)的相等輸入(圖3，小圖C)。TF與精氨酸酶寡核苷酸的結(jié)合的分析表明，除了增加的蛋白質(zhì)水平外，還發(fā)生了增強(qiáng)的C/EBPβ的結(jié)合。LAP*被鑒定為與精氨酸酶增強(qiáng)子寡核苷酸結(jié)合的主要同種型(圖3，小圖D)。

這些數(shù)據(jù)提示了精氨酸酶I表達(dá)經(jīng)由C/EBPβ的PI3K/PTEN調(diào)節(jié)的潛在機(jī)理。

實(shí)施例2.精氨酸酶I的細(xì)胞外活性

為了研究精氨酸酶I的細(xì)胞作用位點(diǎn)，分析了腹膜巨噬細(xì)胞的上清液(SN)。出乎意料地，精氨酸酶I被釋放到細(xì)胞外空間內(nèi)。這與精氨酸酶I對(duì)應(yīng)物iNOS相反。

為了進(jìn)一步評(píng)估精氨酸酶I在細(xì)胞因子產(chǎn)生中的作用和抗原呈遞細(xì)胞極化T細(xì)胞的潛力，轉(zhuǎn)移了針對(duì)野生型骨髓衍生的GM-CSF分化的樹(shù)突細(xì)胞調(diào)適的培養(yǎng)基，并分析它們對(duì)LPS的炎性應(yīng)答。圖4示出了PI3K的組成性激活促進(jìn)精氨酸酶I表達(dá)和向細(xì)胞外空間內(nèi)的釋放。令人驚訝地，數(shù)據(jù)顯示了T細(xì)胞極化細(xì)胞因子IL-6和IL-12p40的蛋白質(zhì)水平的下調(diào)，該p40是IL-12和IL-23的共同亞單位(也表示為IL-12/23)(圖4，小圖D)。接著，利用純化的重組人精氨酸酶I(recArgI)，我們嘗試用來(lái)自缺乏PTEN的巨噬細(xì)胞的精氨酸酶I條件培養(yǎng)基的高表達(dá)模擬生理環(huán)境。為此，將由LPS刺激的樹(shù)突細(xì)胞與純化的重組人精氨酸酶I一起預(yù)溫育。檢測(cè)到與用條件培養(yǎng)基處理類(lèi)似的IL-6和IL-12/23的降低的表達(dá)水平。與IL-6相比，表達(dá)的減少在IL-12/23表達(dá)上更顯著(圖4，小圖E)。

為了進(jìn)一步表征精氨酸酶I表達(dá)與PTEN表達(dá)之間的生物串?dāng)_，測(cè)定了缺乏PTEN的細(xì)胞中精氨酸酶I和IL-4/IL-13的表達(dá)。PTEN的缺乏導(dǎo)致精氨酸酶I的高度增加的表達(dá)水平，甚至在未受刺激的腹膜巨噬細(xì)胞tPM中亦是如此(圖4，小圖A)。這些發(fā)現(xiàn)令人驚奇且出乎意料。為了量化這些結(jié)果，分析了來(lái)源于5只野生型同窩出生仔畜和PTEN^-/-動(dòng)物的巨噬細(xì)胞。在PTEN^-/-巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到細(xì)胞外精氨酸酶I表達(dá)的大于10倍的增加(圖4，小圖B和C)。此外，我們?cè)u(píng)估了響應(yīng)于LPS和平行于IL-4和IL-13的組合激活的精氨酸酶I分泌。在這兩種情況下，我們觀察到在缺乏PTEN的巨噬細(xì)胞中分泌增加，這在有限程度上還可以在野生型細(xì)胞中看到(圖4，小圖B底部)。

結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞的細(xì)胞外環(huán)境中精氨酸酶I的存在可能以旁分泌方式表現(xiàn)出抗炎性質(zhì)。

實(shí)施例3.游離精氨酸酶I強(qiáng)效地抑制T細(xì)胞極化。

為了分析重組人精氨酸酶I對(duì)抗原呈遞和T細(xì)胞極化性質(zhì)的影響，骨髓衍生的GM-CSF分化的野生型樹(shù)突細(xì)胞用重組精氨酸酶I預(yù)調(diào)適過(guò)夜，然后向細(xì)胞加載卵清蛋白(Ova)和用LPS刺激。為了避免對(duì)T細(xì)胞的潛在影響，通過(guò)多個(gè)洗滌步驟從DC中去除recArgI，然后將它們與分離的OT-II T細(xì)胞以5:1的比例一起培養(yǎng)。如通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得的，以30μg/ml濃度的重組精氨酸酶I處理樹(shù)突細(xì)胞并未改變?cè)虳C激活標(biāo)志物CD80和MHCII的表面表達(dá)。

在共同培養(yǎng)DC和T細(xì)胞3天之后評(píng)估MLR的結(jié)果。圖5示出了精氨酸酶I對(duì)T細(xì)胞極化的抑制。我們觀察到表達(dá)Th1和Th17特征細(xì)胞因子IFNγ(圖5，小圖A和B)和IL17A(圖5，小圖D和E)的CD4⁺T細(xì)胞的顯著減少。我們注意到存在產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞，但是數(shù)目低。在LPS/Ova引發(fā)(priming)之后在MLR過(guò)程中分泌的T細(xì)胞細(xì)胞因子的分析顯示IFNγ的釋放的顯著差異，而IL-17A則沒(méi)有顯著不同(圖5，小圖C和F)。評(píng)估了在分裂的T細(xì)胞中如通過(guò)CFSE稀釋測(cè)得的增殖。然而，在重組精氨酸酶I的存在下我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著變化(圖5，小圖G和H)。數(shù)據(jù)表明，在抗原呈遞細(xì)胞的存在下細(xì)胞外精氨酸酶I減輕(ameliorate)T細(xì)胞引發(fā)，從而降低在Th1細(xì)胞中優(yōu)先極化的能力。

為了進(jìn)一步證實(shí)這一假設(shè)，對(duì)在T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的臨床相關(guān)模型中重組精氨酸酶I在體內(nèi)抑制T細(xì)胞極化的能力進(jìn)行了表征。

實(shí)施例4.重組精氨酸酶I在多發(fā)性硬化的治療中的作用

自身免疫疾病的特征在于失調(diào)的免疫系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型是本領(lǐng)域公認(rèn)的多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型。為了研究重組精氨酸酶I調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力，對(duì)用純化精氨酸酶治療的多發(fā)性硬化小鼠模型的應(yīng)答進(jìn)行了表征。EAE小鼠反映出一些但非全部的人自身免疫病理學(xué)特征(Lassmann,H.和H.J.van.2011.The molecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis.FEBS Lett.585:3715-3723)。通過(guò)用CFA中的MOG_35-55肽免疫在野生型小鼠中誘發(fā)EAE(Lassmann,H.和H.J.van.2011.The molecular basis of neurodegeneration in multiple sclerosis.FEBS Lett.585:3715-3723)。此外，施用百日咳毒素。

如下對(duì)重組精氨酸酶I在減輕疾病進(jìn)展中的潛在功效進(jìn)行表征：為了確定治療的時(shí)間表，當(dāng)抗原呈遞和T細(xì)胞極化仍然進(jìn)行時(shí)，如表4所示，精氨酸酶以?xún)煞N不同濃度在免疫之前施用及免疫之后立刻施用。

圖6示出了用重組人精氨酸酶I治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的結(jié)果。對(duì)照組在12天后發(fā)生了EAE的可見(jiàn)體征，進(jìn)一步增加直到第17天。用重組精氨酸酶I(10mg/kg)預(yù)治療對(duì)疾病的進(jìn)程沒(méi)有任何影響(圖6，小圖C)。與之相對(duì)，用重組精氨酸酶I(10mg/kg)進(jìn)行預(yù)治療和后治療表征為疾病發(fā)作以及等級(jí)的顯著降低(圖6，小圖A)。在相同的實(shí)驗(yàn)設(shè)置下，測(cè)試聚乙二醇化的精氨酸酶I(SEQ ID NO:9)的最小治療有效劑量(1mg/kg)。治療延緩了疾病的發(fā)作，但是用較低劑量的聚乙二醇化的精氨酸酶I治療則沒(méi)有顯著抑制疾病進(jìn)展和嚴(yán)重程度(圖6，小圖B)。

為了在分子水平上分析MOG特異性T細(xì)胞應(yīng)答，我們收獲了脾和引流淋巴結(jié)(腹股溝的)，并在體外用MOG₃₅-55肽再刺激來(lái)源于重組人精氨酸酶治療的和對(duì)照的EAE小鼠的脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞。在沒(méi)有被外源性刺激進(jìn)一步激活的情況下再刺激細(xì)胞導(dǎo)致IFNγ和IL-17A向上清液中的分泌顯著增加(參見(jiàn)圖6，小圖D-G中的對(duì)照相對(duì)于對(duì)照+MOG)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在預(yù)治療和后治療組(1mg/kg以及10mg/kg重組精氨酸酶I)中減少的IFNγ(圖6，小圖D和E)和IL-17A(圖6，小圖F和G)水平的高度顯著性差異，特別是在引流淋巴結(jié)中。這些數(shù)據(jù)表明，通過(guò)減弱CD4⁺T細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)于發(fā)展成EAE不可缺少的細(xì)胞因子IFNγ和IL-17A的能力，在抗原呈遞階段至少較高濃度的重組精氨酸酶I治療有效地減弱了小鼠中的EAE病理學(xué)。

實(shí)施例5.重組精氨酸酶I在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中的作用

關(guān)節(jié)炎是與不同水平的疼痛、腫脹、關(guān)節(jié)僵直和有時(shí)與關(guān)節(jié)周?chē)某志锰弁聪嚓P(guān)的自身免疫病況。存在超過(guò)100種不同形式的關(guān)節(jié)炎，包括類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和相關(guān)自身免疫疾病。膿毒性關(guān)節(jié)炎由關(guān)節(jié)感染引起。

患有關(guān)節(jié)炎的個(gè)體的主訴是關(guān)節(jié)痛。疼痛通常是持久的并且可局限于受影響的關(guān)節(jié)。來(lái)自關(guān)節(jié)炎的疼痛是由關(guān)節(jié)周?chē)l(fā)生的炎癥、因疾病對(duì)關(guān)節(jié)的損傷、關(guān)節(jié)的日常磨損、炎癥引起的肌肉緊張而導(dǎo)致的。為了評(píng)估重組人精氨酸酶I在治療關(guān)節(jié)炎中的作用，我們測(cè)量了用重組蛋白治療的關(guān)節(jié)炎小鼠的若干臨床參數(shù)。圖7描繪了測(cè)量用重組人精氨酸酶I治療的關(guān)節(jié)炎小鼠的多個(gè)臨床參數(shù)的圖。圖7中的小圖A示出了接受鹽水、1mg/kg/w或10mg/kg/w重組人精氨酸酶I的小鼠的體重變化百分比。圖7中的小圖B是標(biāo)繪接受先前所述治療的小鼠的II型α-膠原抗體滴度(任意單位)的圖。圖7中的小圖C和小圖D是上述相同小鼠的兩個(gè)不同臨床參數(shù)即爪腫脹和握力的測(cè)量值。結(jié)果表明，用重組人精氨酸酶I每周治療關(guān)節(jié)炎小鼠減輕了疾病但不阻止疾病進(jìn)展。圖8是示出用人重組人精氨酸酶I減輕關(guān)節(jié)炎小鼠的爪腫脹的照片。圖8中的小圖A示出了僅接受鹽水處理的關(guān)節(jié)炎小鼠的腫脹。圖8中的小圖B示出了接受10mg/kg聚乙二醇化的人重組精氨酸酶I治療的關(guān)節(jié)炎小鼠的腫脹。如通過(guò)腕關(guān)節(jié)直徑的減小所測(cè)得的，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)定量表明，以1mg/kg和10mg/kg的重組人精氨酸酶I治療關(guān)節(jié)炎小鼠均減輕了爪腫脹。

圖9對(duì)應(yīng)于示出關(guān)節(jié)炎小鼠中不同細(xì)胞因子的定量的圖。圖9和圖10中的動(dòng)物用膠原免疫進(jìn)行處理，這促進(jìn)小鼠中的關(guān)節(jié)炎。圖9中的小圖A和小圖B顯示在用重組人精氨酸酶I治療的小鼠中僅觀察到IL17A和IL12/23水平的適度降低。圖9中的小圖C示出了在用重組人精氨酸酶I治療的關(guān)節(jié)炎小鼠中炎性細(xì)胞因子白介素6(IL-6)的全身性釋放的減少。圖10中的-小圖A-C表明在DBA小鼠的膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎(CIA)中促炎性細(xì)胞因子的水平?jīng)]有改變。作為與關(guān)節(jié)炎治療的比較，圖11示出了用人重組人精氨酸酶I治療的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠模型的臨床評(píng)分(關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)實(shí)施例1)。結(jié)果表明純化的重組人精氨酸酶I可以有效地治療免疫系統(tǒng)的病況。

為了測(cè)試重組精氨酸酶在包括抗原呈遞、細(xì)胞因子釋放和T細(xì)胞極化的體內(nèi)環(huán)境中的作用，采用熒光激活細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)來(lái)表征EAE小鼠中免疫細(xì)胞的群體。在疾病進(jìn)展為部分后肢癱瘓的表型之后進(jìn)行精氨酸酶治療，并且表明了至少用SEQ ID NO.9的重組精氨酸酶治療可以促進(jìn)較快的恢復(fù)。圖12描繪了在用重組人精氨酸酶I治療的EAE小鼠中免疫細(xì)胞群體的熒光激活細(xì)胞分選分析。圖13描繪了熒光激活細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明用重組人精氨酸酶I治療防止了T細(xì)胞增殖。

實(shí)施例6.聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I制劑

體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)指出細(xì)胞外精氨酸酶I的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)。為了配制、在體內(nèi)評(píng)估和優(yōu)化用于施用重組人精氨酸酶I的藥物組合物，進(jìn)行了表征重組精氨酸酶I的聚乙二醇化的若干實(shí)驗(yàn)。聚乙二醇化是聚乙二醇(PEG)聚合物鏈共價(jià)附接至另一個(gè)分子的過(guò)程。PEG共價(jià)附接至藥物或治療性蛋白質(zhì)可以降低來(lái)自受試者的免疫系統(tǒng)的重組精氨酸酶I的免疫原性和抗原性，并且增大重組精氨酸酶的流體動(dòng)力學(xué)大小，這可以延長(zhǎng)聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I的體內(nèi)半衰期。

圖14是用于優(yōu)化包含重組人精氨酸酶I的藥物組合物的過(guò)程的示意圖。測(cè)試了不同大小的PEG分子共價(jià)附接至重組精氨酸酶I分子的三種不同方法。出于說(shuō)明性的目的，圖14描述了不同PEG分子通過(guò)不同方法附接至SEQ ID NO:1，但是應(yīng)當(dāng)理解，聚乙二醇化的優(yōu)化策略適用于SEQ ID NOS.1-16中的任何一個(gè)。圖14示出了將PEG聚合物鏈共價(jià)附接至例如SEQ ID No.1的三種方法，即胺-NH₂綴合、半胱氨酸(-SH)綴合和N-末端修飾。如圖14所述，優(yōu)化了多種突變重組人精氨酸酶在特定殘基處的聚乙二醇化。

表5總結(jié)了多種突變重組人精氨酸酶通過(guò)半胱氨酸(-SH)綴合的聚乙二醇化。圖15顯示了以3mg/kg的單次靜脈內(nèi)劑量用表5所示聚乙二醇化的精氨酸酶獲得的Spragus Dawley大鼠中的血清精氨酸消耗水平。

半衰期T_1/2，藥物施用之后的峰值血漿濃度C_max，和施用單劑量之后的濃度-時(shí)間曲線的積分，聚乙二醇化的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.9的AUC。表6中顯示了在六只不同的大鼠中-SH修飾的聚乙二醇化的精氨酸酶。在施用3mg/kg的單次靜脈內(nèi)劑量之后獲得每個(gè)測(cè)量值(平均值±SD；n＝6)。

表7總結(jié)了多種突變重組人精氨酸酶通過(guò)胺(–NH₂)綴合的聚乙二醇化。圖16是示出采用在Lys殘基上聚乙二醇化的多種精氨酸酶通過(guò)重組人精氨酸酶I消耗血清精氨酸的圖。圖17是示出多種重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)通過(guò)胺(–NH₂)綴合的聚乙二醇化程度的圖。

表8中顯示了在六只不同大鼠中的半衰期T_1/2，藥物施用之后的峰值血漿濃度C_max，和施用單劑量之后的濃度-時(shí)間曲線的積分，多種胺(–NH₂)修飾的聚乙二醇化的精氨酸酶的AUC。在施用3mg/kg的單次靜脈內(nèi)劑量之后獲得每個(gè)測(cè)量值(平均值±SD；n＝6)。大鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明，重組人精氨酸酶I在多個(gè)位點(diǎn)處用低分子量PEG如甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)進(jìn)行聚乙二醇化可以在體內(nèi)提供有效的精氨酸消耗。

此外，如表9所述測(cè)量了多種突變精氨酸酶的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。總之，用小分子量PEG修飾重組人精氨酸酶未導(dǎo)致酶活性的降低。

圖18是示出聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I的表位分析的圖。

實(shí)施例7.重組精氨酸酶I在人自身免疫病況的治療中的作用

如在前面的實(shí)施例中所公開(kāi)的，精氨酸酶I用作細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外水平上的免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)。在本領(lǐng)域公認(rèn)的多發(fā)性硬化和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型中，精氨酸酶介導(dǎo)的L-精氨酸消耗的藥理學(xué)干預(yù)可以有效地減輕腫脹、疼痛和關(guān)節(jié)僵直(實(shí)施例4和5)。

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的特征為慢性的炎性疾病，其中免疫系統(tǒng)破壞滑膜關(guān)節(jié)和附屬結(jié)構(gòu)。由于RA的進(jìn)行性性質(zhì)，該自身免疫病況可在若干器官系統(tǒng)內(nèi)導(dǎo)致關(guān)節(jié)外的并發(fā)癥。本公開(kāi)內(nèi)容的重組精氨酸酶I的施用可以用于治療人類(lèi)中的類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

SEQ ID NO:1至16中公開(kāi)的任意一種重組人精氨酸酶可以用于治療人類(lèi)中的自身免疫病況，諸如多發(fā)性硬化或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。所述純化的精氨酸酶可以被聚乙二醇化。在一些實(shí)施方案中，所述純化的精氨酸酶經(jīng)由胺與分子量約5kDa的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)寡聚體綴合而被聚乙二醇化(實(shí)施例6)。在其他實(shí)施方案中，所述純化的精氨酸酶可以采用任何其他合適的PEG寡聚體來(lái)聚乙二醇化。

純化的精氨酸酶的聚乙二醇化可以提供具有低免疫原性的用于治療RA的藥物組合物，例如，重組人精氨酸酶I用低分子量PEG如(5kDa mPEG-SPA寡聚體)在多個(gè)位點(diǎn)處的聚乙二醇化有效地降低了表位的暴露，從而導(dǎo)致具有低免疫原性的有效治療。本文公開(kāi)的各種PEG寡聚體可以用來(lái)有效地降低本公開(kāi)內(nèi)容的精氨酸酶的表位的暴露。

實(shí)施例8.重組精氨酸酶I在器官移植中的作用

免疫抑制減少在自身免疫疾病中的異常免疫應(yīng)答，但是它也可以降低正常免疫應(yīng)答以防止移植的器官或細(xì)胞的排斥。免疫調(diào)節(jié)藥物在器官移植的控制中是重要的。SEQ ID NO:1-16中公開(kāi)的任意一種重組人精氨酸酶可以在器官移植控制中用作免疫調(diào)節(jié)藥。在一些實(shí)施方案中，所述重組精氨酸酶被聚乙二醇化。在一些實(shí)施方案中，所述重組精氨酸酶經(jīng)由胺與分子量約5kDa的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)寡聚體綴合而被聚乙二醇化。在其他實(shí)施方案中，所述純化的精氨酸酶可以用任何其他合適的PEG寡聚體來(lái)聚乙二醇化。重組精氨酸酶的聚乙二醇化可以提供具有低免疫原性的用于治療RA的藥物組合物：重組人精氨酸酶I用低分子量PEG如(5kDa mPEG-SPA寡聚體)在多個(gè)位點(diǎn)處的聚乙二醇化可以有效地降低表位的暴露，從而導(dǎo)致免疫原性的降低。本文公開(kāi)的各種PEG寡聚體可以用來(lái)有效地降低本公開(kāi)內(nèi)容的精氨酸酶的表位的暴露。

實(shí)施例9.用重組人精氨酸酶I治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠是本領(lǐng)域公認(rèn)的多發(fā)性硬化模型。EAE還廣泛地用作T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病的動(dòng)物模型。

為了研究用治療有效量的重組精氨酸酶治療受試者中的炎性疾病的有效性，研究了聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I SEQ ID NO:9在調(diào)節(jié)受刺激的T細(xì)胞中干擾素γ和IL-17A的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)中的有效性(治療方案和T細(xì)胞分離如實(shí)施例1中所述)。圖19示出了用純化的人精氨酸酶I抑制的來(lái)自髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)再刺激的T細(xì)胞的IFNγ和IL-17A mRNA表達(dá)水平。圖20示出了用純化的人精氨酸酶I抑制的來(lái)自髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)再刺激的T細(xì)胞的IFNγ和IL-17A蛋白質(zhì)表達(dá)水平。圖19和20示出了在MOG刺激的T細(xì)胞中IFNγ和IL-17A的mRNA和蛋白質(zhì)水平的顯著降低。

圖21示出了用重組人精氨酸酶I治療的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠的臨床評(píng)分的改善。在該實(shí)驗(yàn)中，抗原呈遞細(xì)胞用聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I SEQ ID NO:9進(jìn)行離體處理并被移植回EAE小鼠中。圖21中的小圖A示出了在接受離體刺激的抗原呈遞細(xì)胞之前未受到CFA和百日咳毒素攻擊的EAE小鼠的臨床評(píng)分。圖21中的小圖A示出了未受到CFA和百日咳毒素攻擊的小鼠的臨床評(píng)分的延遲改善。圖21中的小圖B示出了在接受離體刺激的抗原呈遞細(xì)胞之前受到CFA和百日咳毒素攻擊的EAE小鼠的臨床評(píng)分。圖21中的小圖B示出了更迅速的臨床評(píng)分改善。

實(shí)施例10.用重組人精氨酸酶I調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化

在健康的骨中，骨形成和骨吸收是正常的骨重建所涉及的過(guò)程。在重建的過(guò)程中，稱(chēng)為破骨細(xì)胞的細(xì)胞再吸收骨組織，而稱(chēng)為成骨細(xì)胞的細(xì)胞則沉積新的骨組織。破骨細(xì)胞在脊椎動(dòng)物(vertebral)骨骼的骨的重建、維護(hù)和修復(fù)中是重要的。例如，破骨細(xì)胞功能障礙與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)。

采用破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)來(lái)評(píng)估SEQ ID NO:9中公開(kāi)的重組人精氨酸酶調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的能力。圖22是破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)的示意圖。在分化試驗(yàn)的第0天，采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從雄性小鼠中分離出骨髓細(xì)胞，即，用PBS從脛骨(fibia)中沖洗出骨髓細(xì)胞，將其接種在10cm組織培養(yǎng)皿中并用100ng/ml的M-CSF處理。在用M-CSF誘導(dǎo)分化3天后，收獲細(xì)胞并以100,000個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種。隨后用50ng/ml RANKL和30ng/ml M-CSF處理所接種的細(xì)胞。在分化方案的第7-8天，對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色并計(jì)數(shù)。圖23中的小圖A是列舉在破骨細(xì)胞分化試驗(yàn)中計(jì)數(shù)的具有至少三個(gè)細(xì)胞核的破骨細(xì)胞的數(shù)目的圖。如圖23中的小圖A所示，在分化方案的第3天和第6天以及與RANKL一起溫育，用重組精氨酸酶I處理骨髓細(xì)胞。圖23中的小圖B是示出用酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶(TRAP)染色對(duì)照培養(yǎng)皿中的細(xì)胞(未處理的)和用300ng/ml的重組人精氨酸酶SEQ ID NO:9處理的細(xì)胞的代表性顯微鏡照片。TRAP染色是破骨細(xì)胞的標(biāo)記。數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示且每組n＝兩只小鼠，并且數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)。*表示p<0.05，***表示p<0.001。B.

在分化方案過(guò)程中的不同時(shí)間點(diǎn)，通過(guò)qPCR監(jiān)測(cè)內(nèi)源性精氨酸酶I mRNA的表達(dá)水平。圖24是示出與管家控制基因HPRT的水平相比，在分化方案的第3天和第7天在對(duì)照細(xì)胞中的精氨酸酶I表達(dá)水平的圖。表3中公開(kāi)了精氨酸酶引物的序列。圖24示出了在破骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中精氨酸酶I的表達(dá)損失。精氨酸酶I的信使RNA水平在破骨細(xì)胞分化的第3天添加RANKL之后降低。圖24的數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示且每組n＝5只小鼠，并且是兩個(gè)組合的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。*表示p<0.05。

為了評(píng)估重組精氨酸酶I調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的能力，在分化方案的第3天和第6天將劑量增加的重組人精氨酸酶SEQ ID NO:9添加至不同的培養(yǎng)皿。使用的實(shí)驗(yàn)方案如下(最少三個(gè)不同的培養(yǎng)皿接受每一種處理)：a)對(duì)照培養(yǎng)皿不用重組人精氨酸酶處理；b)第一實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿在分化方案的第3天和第6天用1ng/ml劑量的重組人精氨酸酶處理；c)第二實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿在分化方案的第3天和第6天用10ng/ml劑量的重組人精氨酸酶處理；d)第三實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿在分化方案的第3天和第6天用100ng/ml劑量的重組人精氨酸酶處理；e)第五實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)皿在分化方案的第3天和第6天用1,000ng/ml(1μg/ml)劑量的重組人精氨酸酶處理。圖25示出了在破骨細(xì)胞分化的第3天和第6天添加重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)可以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成。圖25中的小圖A顯示了添加1,000ng/ml的重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)抑制破骨細(xì)胞形成。圖25中的小圖B示出用a)-e)所述的重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)的劑量處理的細(xì)胞的代表性顯微鏡照片。在100至300ng/ml的濃度下，重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)可以以劑量依賴(lài)性方式阻斷破骨細(xì)胞發(fā)生。圖25中的小圖B示出了不管是否與RANKL一起溫育，與1,000ng/ml一起溫育的細(xì)胞在形態(tài)上均呈現(xiàn)為T(mén)RAP陰性巨噬細(xì)胞。圖25的數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示且每組n＝6只小鼠，并且是三個(gè)組合的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，***表示p<0.001。

為了評(píng)估重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)在調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化中的直接作用，在添加未處理的、變性的和酶促滅活的重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)的情況下進(jìn)行上述分化方案。該試驗(yàn)評(píng)估變性的和酶促滅活的精氨酸酶I在促進(jìn)或抑制破骨細(xì)胞形成中的能力。該精氨酸酶I酶為a)熱變性的(70℃10min)或b)用300μM的抑制劑nor-NOHA酶促滅活的。隨后在分化方案的第3天添加精氨酸酶以分離培養(yǎng)皿。圖26示出了與未處理的對(duì)照培養(yǎng)皿相比，在補(bǔ)充有變性的和N(ω)-羥基-去甲-精氨酸(nor-NOHA)處理的重組人精氨酸酶I(SEQ ID NO.9)的分化試驗(yàn)中可以列舉的分化破骨細(xì)胞的數(shù)目。觀察到正常的破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)，這表明精氨酸的可用度是破骨細(xì)胞形成的先決條件。圖26的數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示且每組n＝2只小鼠，并且代表一個(gè)實(shí)驗(yàn)。圖26證實(shí)，破骨細(xì)胞發(fā)生的阻斷依賴(lài)于精氨酸酶I的催化功能。

破骨細(xì)胞通過(guò)自血液中的循環(huán)單核細(xì)胞衍生的許多細(xì)胞的融合而形成，所述循環(huán)單核細(xì)胞衍生自造血干細(xì)胞。為了評(píng)估精氨酸酶I在造血干細(xì)胞的分化中的作用，在第0天添加1μg/ml的重組人精氨酸酶I的情況下進(jìn)行上述分化方案。圖27證實(shí)在分化方案的第0天將1μg/ml劑量的重組人精氨酸酶I添加至造血干細(xì)胞未影響破骨細(xì)胞形成。圖27的數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示且每組n＝4只小鼠。數(shù)據(jù)顯示兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的組合。

為了評(píng)估10μg/ml劑量的重組人精氨酸酶I在造血干細(xì)胞中的作用，在第0天和第6天添加10μg/ml的重組人精氨酸酶I的情況下進(jìn)行上述分化方案。圖28示出了在造血干細(xì)胞中添加10μg/ml劑量的重組人精氨酸酶I(分化的第0天；“d0”)可干擾破骨細(xì)胞形成。此外，在已經(jīng)分化6天(分化的第6天；“d6”)的細(xì)胞中添加1μg/ml劑量的重組人精氨酸酶I仍可干擾破骨細(xì)胞形成。圖28的數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示且每組n＝2只小鼠，并且代表一個(gè)實(shí)驗(yàn)。

為了評(píng)估不同劑量的重組人精氨酸酶I在破骨細(xì)胞發(fā)生所涉及的基因的表達(dá)水平中的作用，(在與重組人精氨酸酶I一起溫育以及不溫育的情況下)在分化7天后測(cè)定破骨細(xì)胞發(fā)生的相關(guān)基因的mRNA水平。圖29示出了在有和沒(méi)有重組人精氨酸酶I的情況下，在分化過(guò)程中TRAP、RANK、NFAT c1和c-FOS基因的表達(dá)水平的變化。在添加100ng/ml重組人精氨酸酶I之后，RANK、NFATc1和c-FOS的信使RNA水平增加，這表明較低精氨酸酶I濃度的刺激作用。1,000ng/ml重組人精氨酸酶I的添加與TRAP、RANK、NFAT c1和c-FOS基因的有力下調(diào)有關(guān)。圖29的數(shù)據(jù)以平均值±SEM顯示且每組n＝4只小鼠，并且是兩個(gè)組合的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例11.用重組人精氨酸酶I對(duì)骨病況的體內(nèi)調(diào)節(jié)

通過(guò)去除10周齡的雌性小鼠的卵巢建立骨質(zhì)疏松癥的小鼠模型。該手術(shù)在小鼠中誘發(fā)人工絕經(jīng)和骨損失并提供了用于研究骨質(zhì)疏松癥的體內(nèi)模型。將高至30mg/kg的SEQ ID NO:9中公開(kāi)的重組人精氨酸酶每周兩次施用于所述小鼠。在處理開(kāi)始后的4周處死小鼠并進(jìn)行評(píng)價(jià)。進(jìn)行脛骨的組織學(xué)分析以評(píng)估骨容量和骨破壞。利用OsteoMeasure軟件(OsteoMetrics Inc.,Atlanta)評(píng)估該疾病模型中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的存在。

實(shí)施方案

實(shí)施方案1.一種治療有需要的受試者中的炎性疾病的方法，該方法包括向所述受試者施用治療有效量的純化精氨酸酶或其功能性片段。

實(shí)施方案2.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述炎性疾病是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

實(shí)施方案3.根據(jù)實(shí)施方案1所述的方法，其中所述炎性疾病是多發(fā)性硬化。

實(shí)施方案4.根據(jù)實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶是重組精氨酸酶。

實(shí)施方案5.根據(jù)實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組精氨酸酶是聚乙二醇化的。

實(shí)施方案6.根據(jù)實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重組精氨酸酶是重組人精氨酸酶I。

實(shí)施方案7.根據(jù)實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。

實(shí)施方案8.根據(jù)實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量為約1mg/Kg至約10mg/Kg。

實(shí)施方案9.根據(jù)實(shí)施方案1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量為約10mg/Kg至約100mg/Kg。

實(shí)施方案10.根據(jù)實(shí)施方案1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量大于100mg/Kg。

實(shí)施方案11.根據(jù)實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶在受試者中提供低于120μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案12.根據(jù)實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶在受試者中提供低于80μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案13.根據(jù)實(shí)施方案1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶在受試者中提供低于10μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案14.根據(jù)實(shí)施方案1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用是靜脈內(nèi)施用。

實(shí)施方案15.根據(jù)實(shí)施方案1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療有效量的純化重組精氨酸酶是單位劑型。

實(shí)施方案16.根據(jù)實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人。

實(shí)施方案17.根據(jù)實(shí)施方案1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述精氨酸酶是部分純化的。

實(shí)施方案18.根據(jù)實(shí)施方案1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述精氨酸酶基本上是純的。

實(shí)施方案19.根據(jù)實(shí)施方案1-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述精氨酸酶為至少95％純。

實(shí)施方案20.根據(jù)實(shí)施方案19所述的方法，其中所述精氨酸酶為至少99％純。

實(shí)施方案21.一種調(diào)節(jié)炎癥的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的純化精氨酸酶或其功能性片段，其中所述施用調(diào)節(jié)所述炎癥。

實(shí)施方案22.根據(jù)實(shí)施方案21所述的方法，其中所述純化精氨酸酶是重組精氨酸酶。

實(shí)施方案23.根據(jù)實(shí)施方案21和22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組精氨酸酶是聚乙二醇化的。

實(shí)施方案24.根據(jù)實(shí)施方案21-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重組精氨酸酶是聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I。

實(shí)施方案25.根據(jù)實(shí)施方案21-24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶抑制T細(xì)胞極化。

實(shí)施方案26.根據(jù)實(shí)施方案21-25中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放。

實(shí)施方案27.根據(jù)實(shí)施方案21-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞因子是白介素6。

實(shí)施方案28.根據(jù)實(shí)施方案21-26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞因子是干擾素γ。

實(shí)施方案29.根據(jù)實(shí)施方案21-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶I包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16。

實(shí)施方案30.根據(jù)實(shí)施方案21-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述炎癥與自身免疫病癥相關(guān)。

實(shí)施方案31.根據(jù)實(shí)施方案30所述的方法，其中所述自身免疫病癥是多發(fā)性硬化。

實(shí)施方案32.根據(jù)實(shí)施方案30所述的方法，其中所述自身免疫病癥是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

實(shí)施方案33.根據(jù)實(shí)施方案21-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的施用在所述受試者中提供不大于10μM的精氨酸血漿水平。

實(shí)施方案34.根據(jù)實(shí)施方案31或32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量為約1mg/kg受試者體重至約10mg/kg受試者體重。

實(shí)施方案35.根據(jù)實(shí)施方案31或32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量為約10mg/kg受試者體重至約100mg/kg受試者體重。

實(shí)施方案36.根據(jù)實(shí)施方案31或32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量大于100mg/kg受試者體重。

實(shí)施方案37.根據(jù)實(shí)施方案21-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中在24小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)向受試者施用至少一次治療有效量的所述純化精氨酸酶。

實(shí)施方案38.根據(jù)實(shí)施方案21-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中在48小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)向受試者施用至少一次治療有效量的所述純化精氨酸酶。

實(shí)施方案39.根據(jù)實(shí)施方案21-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中在1周的時(shí)間段內(nèi)向受試者施用至少一次治療有效量的所述純化精氨酸酶。

實(shí)施方案40.根據(jù)實(shí)施方案21-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中在2周的時(shí)間段內(nèi)向受試者施用至少一次治療有效量的所述純化精氨酸酶。

實(shí)施方案41.根據(jù)實(shí)施方案21-40中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人。

實(shí)施方案42.一種調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的純化精氨酸酶或其功能性片段，其中所述施用調(diào)節(jié)所述免疫應(yīng)答。

實(shí)施方案43.根據(jù)實(shí)施方案42所述的方法，其中所述純化精氨酸酶是重組精氨酸酶。

實(shí)施方案44.根據(jù)實(shí)施方案43所述的方法，其中所述重組精氨酸酶是聚乙二醇化的。

實(shí)施方案45.根據(jù)實(shí)施方案44所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重組精氨酸酶是聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I。

實(shí)施方案46.根據(jù)實(shí)施方案42-45中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15或SEQ ID No.16。

實(shí)施方案47.根據(jù)實(shí)施方案42-46中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答抑制受試者的免疫系統(tǒng)。

實(shí)施方案48.根據(jù)實(shí)施方案47所述的方法，其中所述受試者的免疫系統(tǒng)的抑制有助于細(xì)胞、組織或器官移植到該受試者中。

實(shí)施方案49.純化的重組精氨酸酶或其功能性片段在制備用于治療受試者中的炎性疾病的藥物中的用途。

實(shí)施方案50.根據(jù)實(shí)施方案49所述的用途，其中所述炎性疾病是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

實(shí)施方案51.根據(jù)實(shí)施方案49所述的用途，其中所述炎性疾病是多發(fā)性硬化。

實(shí)施方案52.根據(jù)實(shí)施方案49所述的用途，其中所述純化的重組精氨酸酶是聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I。

實(shí)施方案53.根據(jù)實(shí)施方案52所述的用途，其中所述藥物包含少于1000mg的所述純化的重組精氨酸酶。

實(shí)施方案54.根據(jù)實(shí)施方案53所述的用途，其中所述藥物包含少于100mg的所述純化的重組精氨酸酶。

實(shí)施方案55.根據(jù)實(shí)施方案54所述的用途，其中所述藥物包含少于10mg的所述純化的重組精氨酸酶。

實(shí)施方案56.根據(jù)實(shí)施方案55所述的用途，其中所述藥物包含少于1mg的所述純化的重組精氨酸酶。

實(shí)施方案57.根據(jù)實(shí)施方案49所述的用途，其中所述藥物在受試者中提供低于120μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案58.根據(jù)實(shí)施方案49所述的用途，其中所述藥物在受試者中提供低于80μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案59.根據(jù)實(shí)施方案49所述的用途，其中所述藥物在受試者中提供低于10μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案60.根據(jù)實(shí)施方案49所述的用途，其中所述施用是靜脈內(nèi)施用。

實(shí)施方案61.根據(jù)實(shí)施方案49所述的用途，其中所述受試者是人。

實(shí)施方案62.一種包含純化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)或其功能性片段以及至少一個(gè)聚乙二醇寡聚體的藥物組合物。

實(shí)施方案63.根據(jù)實(shí)施方案62所述的藥物組合物，其中所述聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)包含至少兩個(gè)聚乙二醇寡聚體。

實(shí)施方案64.根據(jù)實(shí)施方案62所述的藥物組合物，其中每一個(gè)聚乙二醇寡聚體的分子量為約20千道爾頓至約40千道爾頓。

實(shí)施方案65.根據(jù)實(shí)施方案63所述的藥物組合物，其中所述聚乙二醇化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)包含約4個(gè)聚乙二醇寡聚體至約13個(gè)聚乙二醇分子。

實(shí)施方案66.根據(jù)實(shí)施方案62所述的藥物組合物，其中所述聚乙二醇寡聚體的分子量為約5千道爾頓。

實(shí)施方案67.根據(jù)實(shí)施方案62所述的藥物組合物，其中所述聚乙二醇寡聚體與所述純化的重組人精氨酸酶I的半胱氨酸殘基綴合。

實(shí)施方案68.根據(jù)實(shí)施方案62所述的藥物組合物，其中所述聚乙二醇寡聚體與所述純化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)的胺殘基綴合。

實(shí)施方案69.根據(jù)實(shí)施方案62所述的藥物組合物，其中所述聚乙二醇寡聚體與所述純化的重組人精氨酸酶I蛋白質(zhì)的N-末端綴合。

實(shí)施方案70.根據(jù)實(shí)施方案62所述的藥物組合物，其中將所述藥物組合物包裝為試劑盒。

實(shí)施方案71.一種治療有需要的受試者中的骨疾病的方法，該方法包括向所述受試者施用治療有效量的純化精氨酸酶或其功能性片段。

實(shí)施方案72.根據(jù)實(shí)施方案71所述的方法，其中所述骨疾病是骨質(zhì)疏松癥。

實(shí)施方案73.根據(jù)實(shí)施方案71和72所述的方法，其中所述骨質(zhì)疏松癥與破骨細(xì)胞功能障礙相關(guān)。

實(shí)施方案74.根據(jù)實(shí)施方案71-73中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶是重組精氨酸酶。

實(shí)施方案75.根據(jù)實(shí)施方案71-74中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組精氨酸酶是聚乙二醇化的。

實(shí)施方案76.根據(jù)實(shí)施方案71-75中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重組精氨酸酶是重組人精氨酸酶I。

實(shí)施方案77.根據(jù)實(shí)施方案76所述的方法，其中所述聚乙二醇化的重組人精氨酸酶包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16。

實(shí)施方案78.根據(jù)實(shí)施方案71-77中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量為約1mg/Kg至約10mg/Kg。

實(shí)施方案79.根據(jù)實(shí)施方案78所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量為約10mg/Kg至約100mg/Kg。

實(shí)施方案80.根據(jù)實(shí)施方案79所述的方法，其中所述純化精氨酸酶的治療有效量大于100mg/Kg。

實(shí)施方案81.根據(jù)實(shí)施方案71-79中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述純化精氨酸酶在受試者中提供低于120μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案82.根據(jù)實(shí)施方案81所述的方法，其中所述純化精氨酸酶在受試者中提供低于80μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案83.根據(jù)實(shí)施方案82所述的方法，其中所述純化精氨酸酶在受試者中提供低于10μM的精氨酸血漿濃度。

實(shí)施方案84.根據(jù)實(shí)施方案71-83中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述施用是靜脈內(nèi)施用。

實(shí)施方案85.根據(jù)實(shí)施方案71-84中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述治療有效量的純化重組精氨酸酶是單位劑型。

實(shí)施方案86.根據(jù)實(shí)施方案71-85中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人。

實(shí)施方案87.根據(jù)實(shí)施方案71-86中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述精氨酸酶是部分純化的。

實(shí)施方案88.根據(jù)實(shí)施方案71-87中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述精氨酸酶基本上是純的。

實(shí)施方案89.根據(jù)實(shí)施方案71-88中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述精氨酸酶為至少95％純。

實(shí)施方案90.根據(jù)實(shí)施方案89所述的方法，其中所述精氨酸酶為至少99％純。