本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求于2014年7月3日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/020,684的優(yōu)先權(quán)，該申請通過引用以其整體并入本文。

關(guān)于聯(lián)邦贊助的研究或開發(fā)的聲明

本發(fā)明是通過政府支持在由國立衛(wèi)生研究院授予的基金CA132317下進(jìn)行的。美國政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。

發(fā)明背景

癌癥是全世界的主要健康問題。每年，世界各地有數(shù)千萬人被診斷為癌癥，并且超過一半的患者最終死于癌癥。在美國大約一半的所有男性和所有女性的三分之一將在其一生中的某一時間被診斷為癌癥，并且四分之一的死亡是由癌癥引起的(Jemal等人，CA Cancer J.Clin.，2002，52：23-47；Howlader等人，SEER Cancer Statistics Review，1975-2010，National Cancer Institute)。最常識別的人癌癥包括由器官和實體組織產(chǎn)生的癌癥，例如，結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和子宮內(nèi)膜癌。結(jié)腸癌影響西半球二十分之一的人群(Henderson，Nature Cell Biology，2000，2(9)：p.653-60)。在全球，每年有100萬新患者被診斷患有結(jié)腸癌，并且其中一半死于該疾病(Liu等人，Cell，2002，108(6)：p.837-47)。

在過去幾十年中，癌癥治療和診斷方面取得了顯著進(jìn)步。癌癥的治療選擇包括手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法和免疫療法。最近的免疫療法治療，旨在刺激免疫系統(tǒng)，特別引起了大量的研究。盡管免疫療法可以是高度有效的，但是僅有小部分患者，而不管腫瘤起源器官，通常對治療有反應(yīng)。這一領(lǐng)域的新發(fā)現(xiàn)顯然需要提高免疫療法的療效和特異性。

Wnt信號傳導(dǎo)控制多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞命運(yùn)決定、分化、極性、增殖和遷移。分泌蛋白的Wnt家族結(jié)合幾類受體，例如低密度脂蛋白受體相關(guān)(LRP)蛋白5和6(LRP5/6)，從而導(dǎo)致幾種不同的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)級聯(lián)的活化，包括Wnt/β-聯(lián)蛋白、Wnt/鈣和Wnt/Jnk途徑。Wnt與LRP5/6的結(jié)合通過阻斷多蛋白復(fù)合物的功能特異性激活Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑，所述多蛋白復(fù)合物引發(fā)β-聯(lián)蛋白的降解，導(dǎo)致β-聯(lián)蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的積累。核β-聯(lián)蛋白與Lef/TCF家族轉(zhuǎn)錄因子的成員復(fù)合并激活基因表達(dá)。

可能由干細(xì)胞功能改變引起的病理狀態(tài)，例如退行性疾病和癌癥，通常與Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑活性的變化相關(guān)。事實上，Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的過度活化被認(rèn)為誘導(dǎo)干細(xì)胞的過早衰老和年齡相關(guān)的干細(xì)胞功能喪失(Brack等人，Science，2007，第317卷，第5839期，第807-810頁；Liu等人，Science，2007，第317卷，第5839期，第803-806頁)。在癌癥中，Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的過度活化，其通常與其他細(xì)胞生長調(diào)節(jié)基因的突變結(jié)合，可導(dǎo)致異常細(xì)胞生長(Reya和Clevers，Nature，2005，434(7035)：843-50)。因此，許多正在進(jìn)行的研究集中在Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑作為癌癥中的潛在治療靶標(biāo)(Breuhahn等人，Oncogene，2006，25：3787-3800；Greten等人，Br J Cancer，2009，100：19-23)。特別地，包括癌癥基因組測序項目的幾個研究揭示，超過80％的結(jié)腸癌具有突變或甚至喪失腺瘤性結(jié)腸息肉病(adenomatosis polyposis coli)(APC)基因，所述基因是Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑的主要抑制劑(Kinzler和Vogelstein，Cell.1996，Oct 18；87(2)：159-70.Review；Sjoblom等人，Science，2006，Oct 13；314(5797)：268-74；Mann等人，Proc Natl Acad Sci U S A，1999.96(4)：第1603-8頁)。APC和蛋白質(zhì)如GSK3β和Axin形成標(biāo)記β-聯(lián)蛋白降解的復(fù)合物。APC中的突變破壞這種復(fù)合物，并導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)β-聯(lián)蛋白水平增加及其核易位。由于β-聯(lián)蛋白是Wnt信號傳導(dǎo)的最重要的銜接子，它促進(jìn)致癌因子響應(yīng)于Wnt配體的表達(dá)。

Wnt信號傳導(dǎo)也受許多分泌的多肽拮抗劑調(diào)節(jié)。這些包括四種分泌的Dickkopf(Dkk)蛋白(Monaghan等人，Mech Dev，1999.87：45-56；Krupnik等人，Gene，1999.238：301-13)。在這四種Dkk蛋白中，已經(jīng)證明DKK1、2和4是經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)的有效拮抗劑(Mao等人，Nature，2001.411：321-5；Semenov等人，Curr Biol，2001.11：951-61；Bafico等人，Nat Cell Biol，2001.3：683-6；Niehrs，Nature，2006.25：7469-81)，通過以高親和力直接結(jié)合至Wnt共同受體LRP 5/6(Mao等人，Nature，2001.411：321-5；Semenov等人，Curr Biol，2001.11：951-61；Bafico等人，Nat Cell Biol，2001.3：683-6)。雖然DKK1據(jù)報道在脊椎動物發(fā)育中的頭和心形成中起關(guān)鍵作用(Niida等人，Oncogene，2004年11月4日；23(52)：8520-6)，但是Dkk2似乎不在脊椎動物發(fā)育中發(fā)揮皮層作用。缺乏Dkk2的小鼠具有較低的血糖(Li等人，Proc Natl Acad Sci U S A，2012.109：11402-7)、降低的骨骼質(zhì)量(Li等人，Nat Genet，2005.37：945-52)和缺陷性眼表上皮(Gage等人，Dev Biol，2008.317：310-24；Mukhopadhyay等人，Development，2006.133：2149-54)。鑒于DKK蛋白是Wnt拮抗劑，常規(guī)的認(rèn)識是DKK的失活將增加Wnt活性并因此加速癌癥形成。然而，他們在癌癥形成中的作用還沒有直接研究。

Dkk分子含有兩個保守的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(Niehrs，Nature，2006.25：7469-81)。以前，顯示DKK1和DKK2的第二個富含Cys的結(jié)構(gòu)域在抑制經(jīng)典Wnt信號傳導(dǎo)中起更重要的作用(Li等人，J Biol Chem，J Biol Chem，2002.277：5977-81；Brott和Sokol，Mol.Cell.Biol.，2002.22：6100-10)。最近，解構(gòu)了DKK2的第二個富含Cys結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，并描繪了DKK與LRP5/6和Kremen的相互作用所需的結(jié)構(gòu)域上的氨基酸殘基(Chen等人，J Biol Chem，2008.283：23364-70；Wang等人，J Biol Chem，2008.283：23371-5)。Dkk與LRP5/6的相互作用是Dkk介導(dǎo)的Wnt抑制的主要機(jī)制的基礎(chǔ)。盡管Dkk與Kremen(也是跨膜蛋白)的相互作用顯示促進(jìn)Wnt信號傳導(dǎo)的Dkk拮抗作用，但是這種相互作用可能具有其他未解構(gòu)的功能。Ala掃描誘變鑒定了LRP5的第三個YWTD重復(fù)結(jié)構(gòu)域上的氨基酸殘基對結(jié)合DKK1和DKK2是重要的(Zhang等人，Mol.Cell.Biol.，2004.24：4677-84)。這些結(jié)果已經(jīng)通過DKK1/LRP6的第三個和第四個YWTD重復(fù)結(jié)構(gòu)域復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究證實(Cheng等人，Nat Struct Mol Biol，2011.18：1204-10；Chen等人，Dev Cell，2011.21：848-61；Ahn等人，Dev Cell，2011.21：862-73.；Bourhis等人，Structure，2011.19：1433-42)。結(jié)構(gòu)研究之一還揭示了DKK的N末端與LRP的第一個YWTD重復(fù)結(jié)構(gòu)域之間的第二個DKK-LRP相互作用位點(diǎn)(Bourhis等人，Structure，2011.19：1433-42)。

雖然Wnt信號傳導(dǎo)由于其在早期胚胎發(fā)育中的作用和其促進(jìn)腫瘤發(fā)生最初被發(fā)現(xiàn)，但是最近的研究已經(jīng)揭示其在廣泛的生物過程中起重要作用。本發(fā)明源自Wnt拮抗劑與常規(guī)觀點(diǎn)相反對腫瘤促進(jìn)作用的意外發(fā)現(xiàn)。這種Wnt抑制劑的中和，其將導(dǎo)致Wnt信號傳導(dǎo)的改變，可能通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境抑制腫瘤形成。顯然，需要新的方法來減少癌細(xì)胞增殖，觸發(fā)癌細(xì)胞死亡并治療癌癥。本發(fā)明滿足了這種需要。此外，本發(fā)明滿足改善抗癌免疫療法和癌癥診斷的需要。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及在有需要的對象中治療癌癥的組合物和方法。治療癌癥的方法包括給對象施用有效量的在藥學(xué)上可接受的載體中的Dickkopf2(DKK2)基因消耗劑(depleting agent)。

在另一方面，本發(fā)明包括在有需要的對象中治療或減少血管生成的方法。方法包括給對象施用有效量的在藥學(xué)上可接受的載體中的DKK2基因消耗劑。在一些實施方式中，血管生成是與癌癥相關(guān)的腫瘤血管生成。在其他實施方式中，血管生成是與缺血性和炎性疾病相關(guān)的病理性血管生成。在還其他實施方式中，血管生成與心血管疾病相關(guān)。

在另一方面，本發(fā)明包括用于治療對象中的癌癥的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包含DKK2消耗劑和藥學(xué)上可接受的載體。

在又另一方面，本發(fā)明提供了在對象中提供抗腫瘤免疫性的方法。方法包括給對象施用有效量的DKK2抗體或其片段與藥學(xué)上可接受的載體。在另一方面，本發(fā)明提供了在對象中刺激對細(xì)胞群體或組織的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。方法包括給對象施用有效量的DKK2抗體或其片段與藥學(xué)上可接受的載體。在一些實施方式中，T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是CD8⁺細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。

本發(fā)明還提供了診斷對象中癌癥或發(fā)展癌癥的傾向的方法。方法包括測定來自該對象的生物樣品中DKK2基因的表達(dá)水平，其中與來自沒有癌癥的對象的對照生物樣品的DKK2表達(dá)水平相比，來自該對象的生物樣品中DKK2表達(dá)水平的增加是對象具有癌癥或發(fā)展癌癥的傾向的指示，并且其中當(dāng)在對象中檢測到癌癥或發(fā)展癌癥的傾向時，為該對象推薦進(jìn)行治療。

本發(fā)明還提供了一種用于確定對有需要的對象的癌癥治療的功效的方法。方法包括測定來自該對象的生物樣品中DKK2基因的表達(dá)水平，其中與來自不具有癌癥的對象的對照生物樣品中DKK2表達(dá)水平相比，來自該對象的生物樣品中DKK2表達(dá)水平的增加是治療有效的指示，并且其中當(dāng)治療被確定為有效的時，為對象推薦進(jìn)額外的治療。在一些實施方式中，治療包括選自化學(xué)療法、放射療法、免疫療法和癌癥疫苗療法中的至少一種。

在進(jìn)一步方面，本發(fā)明包括包含靶向DKK2表位的中和性DKK2抗體的組合物，所述DKK2表位包含選自SEQ ID NO：1、5和7的氨基酸序列中的至少一種。

在還進(jìn)一步方面，本發(fā)明包括用于診斷對象中癌癥或發(fā)展癌癥或轉(zhuǎn)移的傾向的試劑盒。試劑盒包括選自以下的試劑：用于檢測DKK2基因的mRNA的試劑、用于檢測DKK2蛋白的試劑和用于檢測DKK2蛋白的生物活性的試劑。

在一些實施方式中，癌癥包括包含表達(dá)腺瘤性結(jié)腸息肉病(APC)突變的細(xì)胞的腫瘤。在一些實施方式中，DKK2消耗劑選自DKK2抗體、siRNA、核酶、反義分子、適配體、肽模擬物(peptidomimetic)、小分子及其組合。在一些實施方式中，DKK2消耗劑具有中和活性。在其他實施方式中，DKK2抗體包括選自以下的抗體：多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、合成抗體、重鏈抗體、人抗體、抗體的生物活性片段、抗體模擬物及其任何組合。在還其他實施方式中，DKK2抗體靶向DDK2中和表位，所述中和表位包含選自SEQ ID NO：1、5和7的氨基酸序列中的至少一種。在進(jìn)一步的實施方式中，DKK2抗體是包含選自以下的氨基酸序列中的至少一種的合成抗體：YAL008-5-1A10(SEQ ID NO 8和9)、YAL008-7-1A10(SEQ ID NO 12和13)和YAL008-1-5F8(SEQ ID NO 10和11)。

在一些實施方式中，癌癥選自結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、胃癌、腸癌、胰腺癌和食管癌。在一些實施方式中，癌癥是轉(zhuǎn)移性的。

在一些實施方式中，本發(fā)明的組合物和方法還包括給對象施用另外的藥劑，所述另外的藥劑選自化學(xué)治療劑、抗細(xì)胞增殖劑、免疫治療劑及其任何組合。在一些實施方式中，另外的藥劑是程序性細(xì)胞死亡1(PD-1)抗體。在其他實施方式中，DKK2消耗劑和另外的藥劑共同施用至對象。在又其他實施方式中，DKK2消耗劑和另外的藥劑是共同配制的并且共同施用至對象。

在一些實施方式中，給藥途徑選自吸入、口服、直腸、陰道、胃腸外、外部、經(jīng)皮、肺部、鼻內(nèi)、含服、眼部、鞘內(nèi)施用及其任何組合。

在一些實施方式中，來自對象的生物樣品中DKK2基因的表達(dá)水平比正常對照水平高至少10％。在一些實施方式中，通過選自以下的方法測定表達(dá)水平：檢測基因的mRNA、檢測由基因編碼的蛋白質(zhì)、以及檢測由基因編碼的蛋白質(zhì)的生物活性。

在一些實施方式中，本發(fā)明的治療包含至少DKK2消耗劑。

在一些實施方式中，對象是哺乳動物。在其他實施方式中，哺乳動物是人。

在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的試劑盒的試劑包含靶向DKK2表位的中和性DKK2抗體，所述DKK2表位包含選自SEQ ID NO：1、5和7的氨基酸序列中的至少一種。

附圖說明

為了說明本發(fā)明的目的，在附圖中描繪了本發(fā)明的某些實施方式。然而，本發(fā)明并不限于圖中描繪的實施方式的精確安排和機(jī)構(gòu)。

圖1A-1C是說明APCKO(APCminDKK2^-/-)小鼠中減少的腫瘤負(fù)荷的一系列直方圖和圖像。將同窩仔小鼠(雄性)在常規(guī)食物飲食中飼養(yǎng)在SPF動物飼養(yǎng)箱中18周。圖1A：腫瘤/息肉數(shù)目。圖1B：腫瘤/息肉大?。篈PCKO腫瘤傾向于小于APC小鼠的腫瘤。圖1C：代表性的H和E染色顯示APCKO小鼠中較小并且較少頻率的腫瘤。

圖2A-2B是直方圖，其證明DKK2不調(diào)節(jié)MC38細(xì)胞中的增殖。圖2A：平板接種50K細(xì)胞。在血清饑餓過夜后，將重組(r)DKK2加入到培養(yǎng)基中。24小時后，使用ATPlite試劑盒測量增殖。圖2B：在相似的設(shè)置中，收集細(xì)胞并使用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。兩個實驗n＝3，P＞0.05。

圖3A-3B是描繪來自18周齡APC或APCKO小鼠的息肉(圖3A)和派伊爾淋巴集結(jié)(PP)(圖3B)的CTL的流式細(xì)胞術(shù)分析的圖。CD69和粒酶B(GZMB)是CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)活化標(biāo)記物。此分析強(qiáng)調(diào)DKK2失活導(dǎo)致息肉和PP中CD8+CTL的過度活化。PP是腸淋巴結(jié)。

圖4是一系列曲線圖和直方圖，其展示了在11周時來自APCKO小鼠的派伊爾淋巴集結(jié)的CD8細(xì)胞的增加的粒酶B(gzmb)表達(dá)，其中息肉幾乎不可見。APC和APKCKO是同籠/窩仔。

圖5是證明DKK2缺失的腫瘤、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的超活化和凋亡增加之間的關(guān)系和一致性的一系列圖像。腸上皮細(xì)胞通過脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)染色。

圖6A和6B是展示由非造血細(xì)胞產(chǎn)生的DKK2主要有助于CD8細(xì)胞上GZMB表達(dá)增加的圖。同籠仔WT和KO(DKK2^-/-)(圖6A)以及APC和APCKO(圖6B)小鼠被致死照射并用WT CD45.1骨髓細(xì)胞移植。將小鼠用復(fù)方新諾明(sulfatrim)治療4周。照射后8周，將它們安樂死并收獲它們的PP，并使用流式細(xì)胞術(shù)分析GZMB表達(dá)。在DKK KO小鼠中觀察到在移植的CD8細(xì)胞上增加的GZMB表達(dá)，而不管APC狀態(tài)如何。

圖7是一系列曲線圖，其證明上皮細(xì)胞中DKK2的缺失導(dǎo)致來自APC小鼠的派伊爾淋巴集結(jié)(PP)的CD8細(xì)胞的活化增加。在5周齡時用他莫昔芬(tamoxifen)治療同籠和同窩仔。研究11周齡小鼠的CD8細(xì)胞。在來自在上皮細(xì)胞中缺乏DKK2的APC小鼠的樣品的PP中檢測到增加的gzmb和CD69表達(dá)。

圖8A-8B是一系列直方圖，其展示了DKK2抗體YAL008-1-5F8(5F8)和YAL008-5-1A10(1A10)的兩個克隆。圖8A：示出了識別rDKK2(3nM)，但不識別rDKK1的5F8和1A10的ELISA。圖8B：在293T細(xì)胞上的Wnt報道分子測定中，24小時，通過1A10和5F8逆轉(zhuǎn)DKK2的Wnt抑制功能。

圖9A-9C展示了通過新型a-DKK2Ab(5F8＝Y(jié)AL008-1-5F8和1A10＝Y(jié)AL008-5-1A10)的DKK2中和導(dǎo)致APCmin小鼠的腫瘤負(fù)荷的顯著降低。8周齡APC小鼠用200μg 5F8、1A10和IgG每72小時治療持續(xù)8周。通過福爾馬林固定的腸的亞甲基藍(lán)染色測量腫瘤負(fù)荷。a-Dkk2ab(抗體，ab)治療的小鼠的腫瘤數(shù)目(圖9A)和腫瘤體積(圖9B)二者都較低。體重沒有顯著差異(圖9C)。n＝5，*P＜0.05。

圖10是一系列曲線圖和直方圖，其證明抗DKK2抗體增加派伊爾淋巴集結(jié)(PP)中的CTL活化。n＝5，*P＜0.05。

圖11是列出用于免疫小鼠的抗原及其序列的表。兩種主要抗體是特別關(guān)注的(由*或**標(biāo)記)：抗YAL008-1抗原(SEQ ID NO 1)的抗體YAL008-1-5F8顯示對全長DKK2蛋白的最高親和力并且進(jìn)一步針對中和活性進(jìn)行表征。抗YAL008-5抗原(SEQ ID NO 5)的抗體YAL008-5-1A10和抗YAL008-7抗原(SEQ ID NO 7)的抗體YAL008-7-1A10識別全長DKK2蛋白并具有中和活性。抗體由AbMax(京天成生物技術(shù)有限公司(AbMax Biotechnology Co.，Ltd.)，中國)的合成肽產(chǎn)生。雖然YAL008-5-1A10和YAL008-7-1A10由在人和小鼠DKK2二者中相同的序列制成，YAL008-1-5F8由人序列制成，其具有與小鼠的序列不同的兩個殘基。YAL008-1-5F8仍然對小鼠DKK2蛋白具有交叉反應(yīng)性?；诿嘎?lián)免疫吸附測定(ELISA)，兩種抗體對小鼠DKK2蛋白的親和力為0.1-1nM范圍。符號“#”表示加入用于綴合的半胱氨酸殘基。YAL008-1-5F8、YAL008-5-1A10和YAL008-7-1A10(SEQ ID NO：8-13)的CDR的氨基酸序列也列在下表中。

圖12是說明DKK-LRP6胞外域相互作用而提出的機(jī)制的圖像。在此圖示中示出了LRP6胞外域的所有四種β-螺旋。示出了DKK(包括N末端肽和DKK1C)。YAL008-1-5F8(5F8)和YAL008-5-1A10(1A10)Dkk2中和抗體的抗原由箭頭表示。

圖13A-13B是一系曲線圖和圖像，其示出了在同種異體移植腫瘤模型中DKK2中和降低腫瘤負(fù)荷，伴隨著粒酶B陽性細(xì)胞增加和腫瘤細(xì)胞死亡。將小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞(MC38)皮下移植到免疫活性的C57BL小鼠，并在移植后6天開始用抗DKK2抗體(5F8＝Y(jié)AL-008-1-5F8)治療。示出了腫瘤生長曲線(圖13A)以及凋亡細(xì)胞和粒酶B陽性細(xì)胞的腫瘤切片的免疫染色(圖13B)。n＝5。

圖14是一系列直方圖，其描繪了中和抗DKK2抗體增加粒酶B陽性NK和CD8細(xì)胞。來自圖13的同種異體移植腫瘤中的細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析揭示，DKK2中和不影響CD45造血細(xì)胞、NK或CD8⁺細(xì)胞的數(shù)目，但增加腫瘤中粒酶B陽性造血細(xì)胞、NK和CD8⁺細(xì)胞的百分比。n＝5。

圖15是一系曲線圖，其表明DKK2中和在較長期治療方案中以劑量依賴性方式延緩腫瘤進(jìn)展。5F8＝Y(jié)AL-008-1-5F8。

圖16是一系列直方圖和圖像，其描繪了來自圖15的腫瘤的免疫染色分析證實DKK2中和增加GZMB陽性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞死亡。此圖還揭示，更長的DKK2中和抗體的治療誘導(dǎo)次級抗腫瘤效應(yīng)，包括CD8細(xì)胞數(shù)目的增加以及腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖的減少。

圖17是一系列曲線圖和直方圖，其描繪了腫瘤細(xì)胞中DKK2表達(dá)的減少延緩腫瘤進(jìn)展，伴隨著GZMB陽性細(xì)胞的增加和腫瘤細(xì)胞死亡。MC38中的DKK2表達(dá)被shRNA沉默并且表達(dá)較低水平的DKK2的MC38細(xì)胞在同種異體移植模型中形成較小的腫瘤。與先前實驗中所揭示的作用機(jī)制一致，DKK2的表達(dá)降低與腫瘤細(xì)胞死亡和粒酶B陽性細(xì)胞的增加相關(guān)。

圖18是一系列曲線圖和直方圖，其描繪了宿主DKK2的失活也延緩了腫瘤進(jìn)展，伴隨著GZMB陽性細(xì)胞的增加和腫瘤細(xì)胞死亡。此圖和圖19中的數(shù)據(jù)表明可能存在DKK2的兩個來源，一個是宿主，而另一個是腫瘤細(xì)胞。二者對于促進(jìn)腫瘤生長都是重要的。

圖19是一系列曲線圖和直方圖，其描繪了使用同種異體移植小鼠腫瘤模型，DKK2中和減少肺癌形成，伴隨著增加GZMB陽性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡。5F8＝Y(jié)AL-008-1-5F8。

圖20A-20C是一系列曲線圖，其展示了當(dāng)單獨(dú)施用或與其他抗體(σIgG；PD-1抗體)組合施用時，YAL-008-1-5F8對腫瘤形成的對比作用。圖20A顯示在Lewis肺癌(LLC)同種異體移植肺腫瘤模型中，YAL-008-1-5F8對腫瘤延緩具有與PD-1抗體類似的作用；并且YAL-008-1-5F8和PD-1抗體的組合顯示比單獨(dú)的PD-1抗體更高的腫瘤進(jìn)展抑制。圖20B顯示使用LLC同種異體移植腫瘤模型，當(dāng)單獨(dú)施用或與其他抗體(σIgG；PD-1抗體)組合施用時，YAL-008-1-5F8對小鼠存活的對比作用。圖20C說明當(dāng)在MC38結(jié)腸癌模型中單獨(dú)施用或與其他抗體組合施用時，YAL-008-1-5F8對腫瘤形成的對比作用。在這種MC38模型中，PD-1抗體對腫瘤形成沒有顯著影響。

具體實施方式

本發(fā)明涉及意想不到的發(fā)現(xiàn)，即抑制Dickkopf2(DKK2)導(dǎo)致抑制腫瘤形成，伴隨著包括中性殺傷(NK)細(xì)胞和CD8⁺細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的免疫效應(yīng)細(xì)胞的增加的細(xì)胞毒性活性，以及增加的腫瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤血管生成的減少。因此，在本文所述的各種實施方式中，本發(fā)明的方法涉及通過給患者施用有效量的DKK2基因消耗劑來治療癌癥的方法，在對象中提供抗腫瘤免疫性的方法，在對象中刺激對細(xì)胞群體或組織的免疫效應(yīng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。另外，本發(fā)明包括診斷癌癥或發(fā)展癌癥的傾向的方法，以及確定使用免疫療法治療來治療癌癥的方法。此外，本發(fā)明包括用于治療癌癥的藥物組合物以及用于實施上述方法的試劑盒。

定義

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述相似或等同的任何方法和材料可以用于本發(fā)明的測試的實踐中，但是本文描述了優(yōu)選的材料和方法。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明時，將使用以下術(shù)語。

還應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述特定實施方式的目的，而不意在限制。

如本文所使用的，冠詞“一種”和“一個”用于指該冠詞的一個或多于一個(即，至少一個)語法對象。作為實例，“一個要素”是指一個要素或多于一個要素。

如本文所用，當(dāng)提及可測量的值例如量、時間持續(xù)等時，術(shù)語“約”意在涵蓋從規(guī)定值的±20％或±10％，更優(yōu)選地±5％，甚至更優(yōu)選地±1％，并且還更優(yōu)選地±0.1％的變化，因為這樣的變化適于執(zhí)行所披露的方法。

如本文所用，“高10％”是指表達(dá)水平為比對照高至少10％或更多，例如高20％、30％、40％、或50％、60％、70％、80％、90％或更多，和/或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2.0倍或更多，以及其間的任何和所有全部或部分增量。

如本文所用，術(shù)語“對照”或“參考”可互換使用，并且是指用作比較標(biāo)準(zhǔn)的值(例如，健康對象中DKK2表達(dá)水平)。

如本文中使用的“對象”或“患者”可以是人或非人哺乳動物。非人哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如羊、牛、豬、犬、貓和鼠哺乳動物。優(yōu)選地，對象是人。

如在本文使用的“突變”是DNA序列的變化，導(dǎo)致從其天然狀態(tài)的改變。突變可以包括至少一個脫氧核糖核酸堿基例如嘌呤(腺嘌呤和/或胸腺嘧啶)和/或嘧啶(鳥嘌呤和/或胞嘧啶)的缺失和/或插入和/或重復(fù)和/置換。

突變可能或可能不產(chǎn)生在生物體(對象)的可觀察特征(表型)中可辨別的變化。

本文所用的術(shù)語“免疫原性”是特定物質(zhì)例如抗原或表位在哺乳動物體內(nèi)引起免疫應(yīng)答的能力。這種免疫應(yīng)答可以是體液和/或細(xì)胞介導(dǎo)的。

本文所用的術(shù)語“活化”是指細(xì)胞在足夠的細(xì)胞表面部分連接以誘導(dǎo)顯著的生物化學(xué)或形態(tài)變化之后的狀態(tài)。在T細(xì)胞的上下文中，這種活化是指已經(jīng)被充分刺激以誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的T細(xì)胞的狀態(tài)。T細(xì)胞的活化還可以誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生及調(diào)節(jié)性能或細(xì)胞溶解效應(yīng)子功能。在其他細(xì)胞的上下文中，此術(shù)語推斷特定物理化學(xué)過程的上調(diào)或下調(diào)。術(shù)語“活化的T細(xì)胞”表示目前正在進(jìn)行細(xì)胞分裂、細(xì)胞因子產(chǎn)生、調(diào)節(jié)性能或細(xì)胞溶解效應(yīng)子功能的，和/或最近經(jīng)歷了“活化”的過程的T細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語“肽”、“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用，并且是指由通過肽鍵共價連接的氨基酸殘基組成的化合物。蛋白質(zhì)或肽必須含有至少兩個氨基酸，并且沒有限制可包含蛋白質(zhì)或肽序列的氨基酸的最大數(shù)目。多肽包括包含通過肽鍵彼此連接的兩個或更多個氨基酸的任何肽或蛋白質(zhì)。如本文所用，該術(shù)語是指短鏈(其在本領(lǐng)域中通常也稱為例如肽、寡肽和寡聚體)以及較長鏈(其在本領(lǐng)域中通常稱為蛋白質(zhì)，其存在很多類型)?！岸嚯摹卑ɡ缟锘钚云巍⒒旧贤吹亩嚯?、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

在本發(fā)明的上下文中，使用通常出現(xiàn)的核酸堿基的以下縮寫?！癆”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鳥苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

本文所用的術(shù)語“RNA”定義為核糖核酸。

本文所用的術(shù)語“免疫治療劑”意在包括調(diào)節(jié)患者免疫系統(tǒng)的任何藥劑。“免疫療法”是指改變患者免疫系統(tǒng)的治療。

本文所用的術(shù)語“治療的”是指治療和/或預(yù)防。通過抑制、緩解或根除疾病狀態(tài)獲得治療效果。

在本發(fā)明的上下文中使用的術(shù)語“治療”意在包括用于疾病或病癥的治療性治療以及預(yù)防性或抑制性措施。因此，例如，術(shù)語治療包括在疾病或病癥發(fā)作之前或之后施用藥劑，從而預(yù)防或消除疾病或病癥的所有征兆。作為另一個實例，在疾病的臨床表現(xiàn)后施用藥劑以對抗疾病的癥狀包括疾病的“治療”。這包括預(yù)防癌癥。

術(shù)語“生物樣品”是指從生物體或從生物體的組分(例如，細(xì)胞)獲得的樣品。樣品可以是任何生物組織或流體。通常，樣品將是“臨床樣品”，其是源自患者的樣品。這樣的樣品包括但不限于骨髓、心臟組織、痰、血液、淋巴液、血細(xì)胞(例如，白細(xì)胞)、組織或細(xì)針活檢樣品、尿、腹膜液和胸膜液或來自它們的細(xì)胞。生物樣品也可包括組織切片例如用于組織學(xué)目的的冷凍切片。

“DKK蛋白”是指含有一個或多個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域的Dkk蛋白家族的蛋白質(zhì)。Dkk蛋白家族包括Dkk1、Dkk2、Dkk3和Dkk4，以及在序列水平、結(jié)構(gòu)或功能上與這些蛋白質(zhì)中的一種或多種充分相關(guān)的任何其他蛋白質(zhì)。這種蛋白家族描述于例如Krupnik等人，(1999)Gene 238：301中。此定義也包括Dkk蛋白的等位基因變體和突變體，例如本文所述的那些。

當(dāng)用于提及核苷酸序列時，術(shù)語“等同的”應(yīng)理解為是指編碼在功能上等同的多肽的核苷酸序列。等同的核苷酸序列將包括通過一個或多個核苷酸置換、添加或缺失而不同的序列，例如等位基因變體；并且因此將包括由于遺傳密碼的簡并性而與本文所述的核酸的核苷酸序列不同的序列。

“雜交”是指核酸鏈通過堿基配對與互補(bǔ)鏈結(jié)合的任何過程。兩個單鏈核酸在形成雙鏈雙鏈體時“雜交”。雙鏈性(double-strandedness)區(qū)域可以包括單鏈核酸中的一個或兩個的全長，或者一個單鏈核酸的全部和另一個單鏈核酸的子序列，或雙鏈性區(qū)域可以包括每個核酸的子序列。雜交還包括形成含有某些錯配的雙鏈體，條件是兩條鏈仍然形成雙鏈螺旋?！皣?yán)格雜交條件”是指導(dǎo)致基本上特異性雜交的雜交條件。術(shù)語探針與模板核酸的靶位點(diǎn)的“特異性雜交”是指探針主要與靶標(biāo)的雜交，使得可以清楚地解釋雜交信號。如本文進(jìn)一步描述的，導(dǎo)致特異性雜交的這些條件根據(jù)同源性區(qū)域的長度、區(qū)域的GC含量、雜化物的解鏈溫度“Tm”而變化。因此雜交條件將在雜交溶液的鹽含量、酸度和溫度以及洗滌中變化。

本文所用的關(guān)于核酸例如DNA或RNA的術(shù)語“分離的”是指分別與存在于天然來源的大分子中的其他DNA或RNA分離的分子。本文使用的術(shù)語“分離的”還指當(dāng)通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時基本上不含細(xì)胞材料、病毒材料或培養(yǎng)基，或當(dāng)化學(xué)合成時基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品的核酸或肽。此外，“分離的核酸”意在包括不是作為片段天然存在的并且不會在天然狀態(tài)中發(fā)現(xiàn)的核酸片段。術(shù)語“分離的”在本文中也用于指從其他細(xì)胞蛋白分離的多肽并且意在包括純化的和重組的多肽二者?！胺蛛x的細(xì)胞”或“分離的細(xì)胞群體”是不存在于其天然環(huán)境中的細(xì)胞或細(xì)胞群體。

如本文所用，術(shù)語“核酸”是指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)，和在適當(dāng)時，核糖核酸(RNA)。該術(shù)語還應(yīng)當(dāng)理解為包括作為等同物的由核苷酸類似物制備的RNA或DNA的類似物，和如適用于所述的實施方式的單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸。EST、染色體、cDNA、mRNA和rRNA是可以稱為核酸的分子的代表性實例。

“干細(xì)胞”是指能夠分化成所需細(xì)胞類型的細(xì)胞。干細(xì)胞包括胚胎干(ES)細(xì)胞；成人干細(xì)胞；和體干細(xì)胞，例如來自未定型中胚層的SP細(xì)胞?！叭堋备杉?xì)胞能夠分化成所有組織類型，包括中胚層、內(nèi)胚層和外胚層的細(xì)胞。“多能(multipotent/pluripotent)”干細(xì)胞是能夠分化成幾種命運(yùn)中的至少兩種的細(xì)胞。

當(dāng)在多核苷酸序列的上下文中使用時，術(shù)語“變體”可以包括與基因或其編碼序列的多核苷酸序列相關(guān)的多核苷酸序列。此定義還可以包括例如“等位基因”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)”變體。多肽通常將相對于彼此具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)性變體是給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變異。多態(tài)性變體可包括其中多核苷酸序列變化一個堿基的“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)。SNP的存在可以指示例如某種群體、疾病狀態(tài)或疾病狀態(tài)的傾向。

術(shù)語“Wnt拮抗劑”或“Wnt抑制劑”是指下調(diào)(例如，遏制或抑制)通過Wnt途徑的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子或組合物。下調(diào)可以直接發(fā)生，例如通過抑制Wnt信傳導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)的生物活性，或間接發(fā)生，例如通過抑制Wnt信號傳導(dǎo)的下游介體(例如TCF3)或通過降低β-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定性等。Wnt拮抗劑的實例包括但不限于Dkk多肽(Glinka等人，Nature，1998，391：357-62；Niehrs，Trends Genet，1999，15(8)：314-9)、crescent多肽(Marvin等人，Genes&Dev.，2001，15：316-327)、cerberus多肽(美國專利號6,133,232)、WISE/Sclerostin(Li等人，J Biol Chem，2005.280：19883-7)、軸蛋白多肽(Zeng等人，Cell，1997，90(1)：181-92；Itoh等人，Curr Biol，1998，8(10)：591-4；Willert等人，Development，1999，126(18)：4165-73)、Frzb多肽(Cadigan等人，Cell，1998，93(5)：767-77；美國專利號6,133,232；美國專利號6,485,972)、糖原合酶激酶(GSK)多肽(He等人，Nature，1995)374(6523)：617-22)、T細(xì)胞因子(TCF)多肽(Molenaar等人，Cell，1996，86(3)：391-9)、顯性失活散亂蛋白(dishevelled)多肽(Wallingford等人，Nature，2000，405(6782)：81-5)、顯性失活N鈣黏著蛋白多肽(美國專利號6,485,972)、顯性失活β-聯(lián)蛋白多肽(美國專利號6,485,972)、下游轉(zhuǎn)錄因子(例如TCF等)的顯性失活突變體(dominant negatives)、Wnt多肽的顯性失活突變體、破壞LRP-卷曲蛋白(frizzled)-Wnt復(fù)合物的藥劑和螯合Wnt的藥劑(例如，crescent和Wnt的抗體)。Wnt拮抗劑多肽可以是哺乳動物來源的，例如人、小鼠、大鼠、犬、貓、?；蜓?，或非哺乳動物來源，例如來自非洲蟾蜍、斑馬魚、果蠅、雞或鵪鶉。Wnt拮抗劑還包括各種多肽的片段、同系物、衍生物、等位基因變體和肽模擬物，包括但不限于Dkk、crescent、cerberus、軸蛋白、Frzb、GSK、TCF、顯性失活散亂蛋白、顯性失活N-鈣黏著蛋白、和顯性失活β-聯(lián)蛋白多肽。在其他實施方式中，Wnt拮抗劑還包括抗體(例如，Wnt特異性抗體)、多核苷酸和小分子。

本文所用的術(shù)語“癌癥”包括任何惡性腫瘤，包括但不限于癌、肉瘤。癌癥起因于細(xì)胞的不受控制和/或異常分裂，然后侵入并破壞周圍組織。如本文所用，“增殖(proliferating和proliferation)”是指經(jīng)歷有絲分裂的細(xì)胞。如本文所用，“轉(zhuǎn)移”是指惡性腫瘤從其原始見到位置的遠(yuǎn)處擴(kuò)散。癌細(xì)胞可通過血流、通過淋巴系統(tǒng)、穿過體腔或其任何組合轉(zhuǎn)移。

術(shù)語“癌”是指由上皮細(xì)胞組成的趨向于浸潤周圍組織并產(chǎn)生轉(zhuǎn)移的惡性新生長。

術(shù)語“癌癥疫苗”是指刺激免疫系統(tǒng)以抵抗癌癥或抵抗有助于癌癥發(fā)展的藥劑的疫苗。存在兩種廣泛類型的癌癥疫苗：預(yù)防性癌癥疫苗，其旨在預(yù)防健康對象中的癌癥發(fā)展；以及治療性癌癥疫苗，其旨在通過增強(qiáng)身體對抗癌癥的天然防御來治療現(xiàn)有癌癥(Lollini等人，Nature Reviews Cancer，2006；6(3)：204-216)。如本文所用，術(shù)語“癌癥疫苗”應(yīng)解釋為包括預(yù)防性和治療性癌癥疫苗二者。

術(shù)語“轉(zhuǎn)移”是指癌癥從一個器官或部分到另一個不相鄰的器官或部分的擴(kuò)散。

術(shù)語“血管生成”是指新血管的產(chǎn)生，通常圍繞或進(jìn)入組織或器官。在正常生理條件下，人或動物僅在非常特定的限制情況下經(jīng)歷血管生成。例如，血管生成通常在傷口愈合、胎兒和胚胎發(fā)育和黃體、子宮內(nèi)膜和胎盤的形成中觀察到。不受控制的(持續(xù)的和/或非調(diào)節(jié)的)血管生成與多種疾病狀態(tài)相關(guān)，并且在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移期間發(fā)生。

術(shù)語“改善”或“治療”意指與癌癥或黑素瘤相關(guān)的臨床征兆和/或癥狀由于所進(jìn)行的動作而減輕。待監(jiān)測的征兆或癥狀將是特定癌癥或黑素瘤的特征，并且對于臨床醫(yī)師來說是熟知的，如監(jiān)測征兆和病癥的方法。例如，熟練的臨床醫(yī)生將知道可以使用通常用于特定腫瘤的診斷成像方法(例如，使用超聲或磁共振圖像(MRI)監(jiān)測腫瘤)來監(jiān)測腫瘤生長的大小或生長速率。

如本文所用，術(shù)語“藥物組合物”是指在本發(fā)明中有用的至少一種化合物與其他化學(xué)組分例如載體、穩(wěn)定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑和/或賦形劑的混合物。藥物組合物有助于將該化合物施用至生物體。本領(lǐng)域中存在施用化合物的多種技術(shù)，包括但不限于：靜脈內(nèi)、口服、氣霧劑、腸胃外、眼部、肺部和外部施用。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”包括藥學(xué)上可接受的鹽、藥學(xué)上可接受的材料、組合物或載體，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或封裝材料，其涉及在對象內(nèi)攜帶或輸送本發(fā)明的化合物(一種或多種)或攜帶或輸送本發(fā)明的化合物(一種或多種)至對象，使得其可以執(zhí)行其預(yù)期功能。通常，這種化合物從身體的一個器官或部分?jǐn)y帶或輸送至身體的另一器官或部分。每種鹽或載體在與制劑的其他成分相容的意義上必須是“可接受的”，并且不對對象有害?？梢杂米魉帉W(xué)上可接受的載體的材料的一些實例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉末黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟類；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩沖溶液；稀釋劑；造粒劑；潤滑劑；粘合劑；崩解劑；潤濕劑；乳化劑；著色劑；脫模劑；涂層劑；甜味劑；調(diào)味劑；加香劑；防腐劑；抗氧化劑；增塑劑；膠凝劑；增稠劑；硬化劑；固化劑；懸浮劑；表面活性劑；保濕劑；載體；穩(wěn)定劑；和在藥物制劑中使用的其他無毒的相容性物質(zhì)，或其任何組合。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”還包括與化合物的活性相容并且對于對象是生理上可接受的任何和所有的包衣、抗菌劑和抗真菌劑，以及吸收延遲劑等。補(bǔ)充性活性化合物也可以摻入組合物中。

如本文所用的術(shù)語“抗體”或“Ab”是指衍生自特異性結(jié)合到抗原上的特異性表位的免疫球蛋白分子的蛋白質(zhì)或多肽序列?？贵w可以是源自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分。用于本發(fā)明的抗體可以以多種形式存在，包括例如多克隆抗體、單克隆抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體(“胞內(nèi)抗體”)、Fv、Fab和F(ab)₂，以及單鏈抗體(scFv)和人源化抗體(Harlow等人，1998，使用抗體：實驗室手冊(Using Antibodies：A Laboratory Manual)，紐約冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)；Harlow等人，1989，抗體：實驗室手冊(Antibodies：A Laboratory Manual)，紐約冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor，New York)；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988，Science 242：423-426)。抗體可以源自天然來源或源自重組來源。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚體。

本文所用的術(shù)語“合成抗體”是指使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體，例如本文所述的由噬菌體表達(dá)的抗體。該術(shù)語還應(yīng)解釋為是指通過合成編碼抗體的DNA分子產(chǎn)生的抗體，并且該DNA分子表達(dá)抗體蛋白或規(guī)定抗體的氨基酸序列，其中使用以下合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得DNA或氨基酸序列，所述技術(shù)是本領(lǐng)域可獲得的和熟知的。

術(shù)語“抗體片段”是指完整抗體或其重組變體的至少一部分，并且是指完整抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如完整抗體的抗原決定可變區(qū)，其足以賦予抗體片段對靶標(biāo)例如抗原的識別和特異性結(jié)合。抗體片段的實例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv片段、scFv抗體片段、線性抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體例如sdAb(VL或VH)、VHH結(jié)構(gòu)域、和由抗體片段形成的多特異性抗體。術(shù)語“scFv”是指包含至少一個包含輕鏈可變區(qū)的抗體片段和至少一個包含重鏈可變區(qū)的抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈和重鏈可變區(qū)通過短的柔性多肽連接體連續(xù)連接，并且能夠表達(dá)為單鏈多肽，并且其中scFv保留其來源的完整抗體的特異性。除非特別說明，如本文所使用的scFv可以具有任何順序的VL和VH可變區(qū)，例如相對于多肽的N末端和C末端，scFv可以包含VL-連接體-VH或可以包含VH-連接體-VL。

本文所用的“抗體重鏈”是指存在于其天然存在的構(gòu)象中的抗體分子中的兩種類型多肽鏈中的較大者，并且其通常決定抗體所屬的類別。

本文所用的“抗體輕鏈”是指存在于其天然存在的構(gòu)象中的抗體分子中的兩種類型的多肽鏈中的較小者。κ和λ輕鏈?zhǔn)侵竷煞N主要的抗體輕鏈同種型。

本文所用的術(shù)語“重組抗體”是指使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體，例如由噬菌體或酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的抗體。該術(shù)語也應(yīng)解釋為是指通過合成編碼抗體的DNA分子產(chǎn)生的抗體，所述DNA分子表達(dá)抗體蛋白或規(guī)定抗體的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列使用本領(lǐng)域可獲得和熟知的重組DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得。

本文使用的術(shù)語“抗原”或“Ag”定義為引發(fā)免疫應(yīng)答的分子。這種免疫應(yīng)答可涉及抗體產(chǎn)生，或特異性免疫活性細(xì)胞的活化，或二者。技術(shù)人員將理解，任何大分子，包括實際上所有的蛋白質(zhì)或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因組DNA。技術(shù)人員將理解，包含編碼引發(fā)免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此編碼如本文所使用的術(shù)語“抗原”。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，抗原不需要僅由基因的全長核苷酸序列編碼。顯而易見的是，本發(fā)明包括但不限于使用多于一個基因的部分核苷酸序列，并且這些核苷酸序列以各種組合排列以引發(fā)所需的免疫應(yīng)答。此外，技術(shù)人員將理解，抗原根本不需要由“基因”編碼。顯而易見的是，抗原可以是合成的或可以源自生物樣品。這樣的生物樣品可以包括但不限于組織樣品、腫瘤樣品、細(xì)胞或生物流體。

術(shù)語“施用器”，如本文所用的術(shù)語，是指用于施用本發(fā)明的化合物和組合物的任何裝置，包括但不限于皮下注射器、移液管等。

如本文所用，“適配體”是指可以與另一個分子特異性結(jié)合的小分子。適配體通常是基于多核苷酸或肽的分子。多核苷酸適配體是通常包含幾條核酸鏈的DNA或RNA分子，其采用高度特異性的三維構(gòu)象，所述構(gòu)象被設(shè)計為對特異性靶分子(例如肽、蛋白質(zhì)、藥物、維生素，以及其他有機(jī)和無機(jī)分子)具有合適的結(jié)合親和力和特異性。這樣的多核苷酸適配體可以通過使用通過指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)演化而從大量隨機(jī)序列中選擇。肽適配體通常是連接到結(jié)合特異性配體的蛋白質(zhì)支架的約10至約20個氨基酸的環(huán)?？梢允褂美缃湍鸽p雜交系統(tǒng)的方法從組合文庫鑒定和分離肽適配體。

本文所用的術(shù)語“抗腫瘤效應(yīng)”是指可以通過多種手段表現(xiàn)的生物效應(yīng)，包括但不限于，例如，腫瘤體積的減少、腫瘤細(xì)胞數(shù)目的減少、轉(zhuǎn)移的數(shù)目減少，預(yù)期壽命的增加、腫瘤細(xì)胞增殖的減少、腫瘤細(xì)胞存活的減少、或與癌性病癥相關(guān)的各種生理癥狀的改善?！翱鼓[瘤效應(yīng)”也可以通過本發(fā)明的肽、多核苷酸、細(xì)胞和抗體首先預(yù)防腫瘤發(fā)生的能力來證明。

本文所用的術(shù)語“異種移植物”是指取自一個物種的供體并移植到另一個物種的受體中的組織的移植物。

本文所用的術(shù)語“同種異體移植物”是指取自一個物種的供體并移植到同一物種的受體中的組織的移植物。

范圍：貫穿本公開內(nèi)容，本發(fā)明的各個方面可以以范圍格式呈現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)理解，在范圍格式的描述僅為了方便和簡明，并且不應(yīng)當(dāng)解釋為是對本發(fā)明的范圍的硬性限制。因此，一個范圍的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是具有確切披露的所有可能的子范圍以及該范圍內(nèi)的單獨(dú)數(shù)值。例如，諸如從1至6的范圍的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為已經(jīng)確切披露子范圍，例如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3到6等，以及在所述范圍內(nèi)的單個數(shù)字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。無論范圍的寬度，此均適用。

描述

免疫系統(tǒng)在激活和抑制之間平衡。逃避免疫監(jiān)視是腫瘤形成的先決條件之一。腫瘤逃避免疫監(jiān)視的方法之一是產(chǎn)生升高量的免疫抑制分子。多年來已經(jīng)確定了越來越多的免疫抑制分子和機(jī)理。已經(jīng)表明這些免疫抑制分子的中和在治療各種惡性腫瘤中是有效的。

本發(fā)明涉及抑制中性殺傷(NK)細(xì)胞和CD8⁺細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)活性并刺激腫瘤血管生成的分泌型腫瘤形成增強(qiáng)劑DKK2的發(fā)現(xiàn)。DKK2是一種分泌蛋白，其可以抑制β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的Wnt信號傳導(dǎo)，改變非β-聯(lián)蛋白介導(dǎo)的Wnt活性，并且還可以具有Wnt非依賴性功能。它還顯示具有促血管生成活性(Park等人，Angiogenesis，2014.17：221-34；Min等人，J Clin Invest，2011.121：1882-93)。DKK2在許多組織中表達(dá)，并在人結(jié)腸直腸癌、胃腸癌、肝癌、腎癌和胰腺癌中上調(diào)。下面描述的實驗證據(jù)表明DKK2抑制劑和中和抗體是用于治療其中表達(dá)DKK2的癌癥的腫瘤血管生成的關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)劑和抑制劑。因此DKK2是治療這些癌癥的有希望的靶標(biāo)。

本發(fā)明的方法

本發(fā)明涉及在有需要的對象中治療癌癥的方法，并且方法包括給對象施用有效量的在藥學(xué)上可接受的載體中的DKK2基因消耗劑。術(shù)語“DKK2基因消耗劑”是指抑制或減少DKK2表達(dá)或抑制或降低細(xì)胞、組織或體液中DKK2活性的任何藥劑。

小干擾RNA(siRNA)：

在一個實施方式中，消耗劑是小干擾RNA(siRNA)。siRNA是包含靶向感興趣的基因或多核苷酸的一組核苷酸的RNA分子。如本文所用，術(shù)語“siRNA”包括所有形式的siRNA，包括但不限于(i)雙鏈RNA多核苷酸，(ii)單鏈多核苷酸，和(iii)(i)或(ii)的多核苷酸，其中這樣的多核苷酸在其中具有一個、兩個、三個、四個或更多個核苷酸改變或置換。siRNA及其用于抑制基因表達(dá)的用途是本領(lǐng)域眾所周知的(Elbashir等人，Nature，2001，411(6836)：494-988)。在本發(fā)明中，siRNA能夠干擾所關(guān)注的基因例如DKK2的表達(dá)和/或活性。

核酶：

在進(jìn)一步的實施方式中，消耗劑是核酶。核酶及其用于抑制基因表達(dá)的用途也是本領(lǐng)域眾所周知的(Cech等人，1992，J.Biol.Chem.267：17479-17482；Hampel等人，1989，Biochemistry 28：4929-4933；Eckstein等人，國際公開號WO 92/07065；Altaian等人，美國專利號5,168,053)。核酶是具有以類似于DNA限制性內(nèi)切核酸酶的方式特異性切割其他單鏈RNA的能力的RNA分子。通過修飾編碼這些RNA的核苷酸序列，可以設(shè)計分子以識別RNA分子中的特定核苷酸序列并切割它(Cech，1988，J.Amer.Med.Assn.260：3030)。此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是以下事實：核酶是序列特異性的。存在兩種基本類型的核酶，即四膜蟲型(Hasselhoff，1988，Nature 334：585)和錘頭型。四膜蟲型核酶識別長度為四個堿基的序列，而錘頭型核酶識別長度為11-18個堿基的堿基序列。序列越長，序列將僅在靶mRNA種類中發(fā)生的可能性越大。因此，錘頭型核酶優(yōu)于用于滅活特定mRNA種類的四膜蟲型核酶，并且18個堿基的識別序列優(yōu)于在各種不相關(guān)的mRNA分子內(nèi)隨機(jī)出現(xiàn)的較短識別序列。用于抑制目標(biāo)基因(即DKK2)表達(dá)的核酶可以通過將靶序列摻入與所需基因的mRNA序列互補(bǔ)的堿性核酶結(jié)構(gòu)中來設(shè)計。靶向感興趣的基因的核酶可以使用市售的試劑(美國加利福尼亞州福斯特城應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA))合成，或者它們可以從編碼它們的DNA進(jìn)行遺傳表達(dá)。

反義分子：

在另一個實施方式中，消耗劑是反義核酸序列。反義分子及其用于抑制基因表達(dá)的用途是本領(lǐng)域眾所周知的(Cohen，1989，寡脫氧核苷酸反義基因表達(dá)的抑制劑(Oligodeoxyribonucleotides，Antisense Inhibitors of Gene Expression)，CRC出版社)。反義核酸是與特定mRNA分子的至少一部分互補(bǔ)的DNA或RNA分子，如該術(shù)語在本文別處定義的(Weintraub，1990，Scientific American 262：40)。在細(xì)胞中，反義核酸與相應(yīng)的mRNA雜交，形成雙鏈分子，從而抑制基因的翻譯?？梢允褂镁幋a反義分子的DNA通過遺傳表達(dá)向細(xì)胞提供反義分子，如Inoue，1993，美國專利號5,190,931所教導(dǎo)的。可選地，可以合成制備反義分子，然后提供給細(xì)胞。約10至約30之間的反義寡聚體是優(yōu)選的，因為它們?nèi)菀缀铣刹⒁氚屑?xì)胞中。本發(fā)明考慮的合成的反義分子包括本領(lǐng)域已知的與未修飾的寡核苷酸相比具有改善的生物活性的寡核苷酸衍生物(美國專利號5,023,243)。

小分子抑制劑

本領(lǐng)域眾所周知，位于人LRP5的第三個YWTD重復(fù)結(jié)構(gòu)域的β-螺旋結(jié)構(gòu)的頂部空腔處的一些氨基酸殘基對于DKK結(jié)合和DKK介導(dǎo)的Wnt拮抗作用是重要的(Zhang等人，Mol Cell Biol.2004；24：4677-4684)(圖12)。在本發(fā)明的一個實施方式中，可以結(jié)合至此空腔并破壞DKK和LRP5/6之間的相互作用的小分子作為DKK2抑制劑。在具體的實施方式中，DKK2抑制劑是類似于本領(lǐng)域已知的參與DKK結(jié)合的LRP5的任何氨基酸殘基的任何小分子。那些殘基的非限制性實例是Glu721、Trp863、Tyr719、Arg764、Asp887、Phe888、Gly781、Trp780和Met890(Zhang等人，Mol Cell Biol.2004；24：4677-4684)。在進(jìn)一步的實施方式中，作為DKK2抑制劑的小分子是棓花青化合物(例如IIC8和IIIC3)(Li等人，Proc Natl Acad Sci U S A，2012.109：11402-7)。

抗體

本發(fā)明考慮使用包含抗DKK2抗體的組合物。在一個實施方式中，抗體包含選自多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、合成抗體、重鏈抗體、人抗體和抗體的生物活性片段及其任何組合的抗體。在具體的實施方式中，合成抗體由京天成生物技術(shù)有限公司(AbMax Biotechnology Co.Ltd.)(中國)生產(chǎn)，例如抗體YAL008-1-5F8(抗原肽序列為5′-KLNSIKSSLGGETPG-3′，SEQ ID NO 1，位于DKK2的N末端)、抗體YAL008-5-1A10(抗原肽序列為5′-CKVWKDATYSSKAR-3′，SEQ ID NO 5，位于DKK2的第二個富含Cys的結(jié)構(gòu)域)、和抗體YAL008-7-1A10(抗原肽序列為5′-CARHFWTKIC-3′，SEQ ID NO 7，位于DKK2的第二個富含Cys的結(jié)構(gòu)域)(圖11和12)。在進(jìn)一步的實施方式中，在抗原肽的3′末端添加半胱氨酸(“C”)用于綴合。

產(chǎn)生抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。本文描述了用于生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的示例性技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，抗體包括能夠特異性結(jié)合存在于靶分子上的表位的任何免疫球蛋白分子，無論是源自天然來源還是源自重組來源。在一個實施方式中，靶分子包括

當(dāng)用于本發(fā)明的組合物和方法中的靶分子的抗體是多克隆抗體(IgG)時，抗體通過用包含全長靶蛋白或其片段、上游調(diào)節(jié)子、或其片段的肽接種適當(dāng)?shù)膭游锒a(chǎn)生。這些多肽或其片段可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法獲得，包括化學(xué)合成和生物合成。

然后從獲得自動物的流體中分離在接種的動物中產(chǎn)生的特異性結(jié)合靶分子或其片段的抗體?？梢砸赃@種方式在幾種非人哺乳動物例如但不限于山羊、綿羊、馬、駱駝、兔和驢中產(chǎn)生抗體。用于產(chǎn)生多克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且描述于例如Harlow等人，1998，In：Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY中。

針對全長靶分子或其片段的單克隆抗體可以使用任何公知的單克隆抗體制備方法制備，例如在Harlow等人(1998，抗體：實驗室手冊(In：Antibodies，A Laboratory Manual)，紐約冷泉港(Cold Spring Harbor，NY))和Tuszynski等人(1988，Blood，72：109-115)中描述的那些。人單克隆抗體可以通過美國專利公開號2003/0224490中描述的方法制備。針對抗原的單克隆抗體從使用本文提及的標(biāo)準(zhǔn)程序用抗原免疫的小鼠產(chǎn)生。可以使用本領(lǐng)域可獲得的技術(shù)克隆和測序編碼使用本文所述的程序獲得的單克隆抗體的核酸，并且描述于例如Wright等人，1992，Critical Rev.Immunol.12(3，4)：125-168，及其中引用的參考文獻(xiàn)中。

當(dāng)用于本發(fā)明方法的抗體是對應(yīng)于全長靶分子或其片段的抗體的生物活性抗體片段或合成抗體時，抗體如下制備：將編碼所需抗體或片段的核酸克隆到合適的載體中。將載體轉(zhuǎn)染到適于產(chǎn)生大量抗體或其片段的細(xì)胞中。然后在細(xì)胞中表達(dá)編碼所需抗體的DNA，從而產(chǎn)生抗體。編碼所需肽的核酸可以使用本領(lǐng)域可獲得的技術(shù)克隆和測序，并描述于例如Wright等人，1992，Critical Rev.in Immunol.12(3，4)：125-168及其中引用的參考文獻(xiàn)中。可選地，所需抗體或其片段的量也可以使用化學(xué)合成技術(shù)合成。如果抗體的氨基酸序列是已知的，則可以使用本領(lǐng)域已知的方法化學(xué)合成所需的抗體。

本發(fā)明還可以包括使用與存在于靶分子上的表位特異性反應(yīng)的人源化抗體。這些抗體能夠結(jié)合靶分子。用于本發(fā)明的人源化抗體具有人架構(gòu)并具有來自與靶細(xì)胞表面分子特異性反應(yīng)的抗體(通常為小鼠抗體)的一個或多個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。YAL008-1-5F8、YAL008-5 1A10和YAL008-7-1A10的CDR序列的氨基酸序列列于圖11中。

當(dāng)用于本發(fā)明的抗體是人源化的時，抗體可以如Queen等人(美國專利號6,180,370)、Wright等人，1992，Critical Rev.Immunol.12(3，4)：125-168及其中引用的參考文獻(xiàn)中、或在Gu等人，1997，Thrombosis&Hematocyst 77(4)：755-759中描述，或使用本領(lǐng)域已知的產(chǎn)生人源化抗體的其他方法產(chǎn)生。Queen等人披露的方法部分地涉及設(shè)計通過表達(dá)編碼來自能夠結(jié)合所需抗原的供體免疫球蛋白的重鏈和輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的重組DNA區(qū)段而產(chǎn)生的人源化免疫球蛋白，其連接到編碼受體人構(gòu)架區(qū)的DNA區(qū)段上。一般來說，Queen專利中的發(fā)明適用于基本上任何人源化免疫球蛋白的設(shè)計。Queen解釋，DNA區(qū)段將通常包括與人源化免疫球蛋白編碼序列可操作地連接的表達(dá)控制DNA序列，包括天然相關(guān)或異源啟動子區(qū)。表達(dá)控制序列可以是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)，或者表達(dá)控制序列可以是能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染原核宿主細(xì)胞的載體中的原核啟動子系統(tǒng)。一旦載體被摻入合適的宿主中，將宿主保持在適合于高水平表達(dá)引入的核苷酸序列的條件下，并且根據(jù)需要收集和純化人源化輕鏈、重鏈、輕鏈/重鏈二聚體或完整的抗體、結(jié)合片段或其他免疫球蛋白形式(Beychok，細(xì)胞免疫球蛋白的合成(Cells of Immunoglobulin Synthesis)，紐約學(xué)院出版社(Academic Press，New York)，1979，將其通過引用并入本文)。

可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法分離人抗體的DNA序列，特別是互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。優(yōu)選地，如國際專利申請公開號WO 1987/02671中所述，從永生化的B細(xì)胞分離人CDR DNA序列。可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的CDR可以類似地源自編碼能夠結(jié)合靶分子的單克隆抗體的DNA。這樣的人源化抗體可以使用熟知的方法在能夠產(chǎn)生抗體的任何方便的哺乳動物來源中產(chǎn)生，包括但不限于小鼠、大鼠、駱駝、駱馬、兔或其他脊椎動物。用于恒定區(qū)和框架DNA序列的合適細(xì)胞和其中表達(dá)和分泌抗體的宿主細(xì)胞可以從許多來源獲得，例如維吉尼亞州馬納薩斯美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。

產(chǎn)生對DKK2有反應(yīng)性的特異性抗體或抗體片段的另一種方法包括篩選編碼在具有DKK2蛋白或肽的細(xì)菌中表達(dá)的免疫球蛋白基因或其部分的表達(dá)文庫。例如，可以使用噬菌體表達(dá)文庫在細(xì)菌中表達(dá)完整的Fab片段、VH區(qū)和Fv區(qū)。參見例如Ward等人，Nature，1989，341：544-546；Huse等人，Science，1989，246：1275-1281；和McCafferty等人，Nature，1990，348：552-554。用例如DKK2肽篩選這樣的文庫可以鑒定與DKK2反應(yīng)的免疫球蛋白片段。可選地，SCID-hu小鼠(可獲自Genpharm)可用于產(chǎn)生抗體或其片段。

在進(jìn)一步的實施方式中，可以從使用在McCafferty等人，Nature，1990，348：552-554中描述的技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫分離抗體或抗體片段。Clackson等人，Nature，1991，352：624-628和Marks等人，1991，222：581-597描述了使用噬菌體文庫分別分離鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通過鏈改組(Marks等人，BioTechnology，1992，10：779-783)，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大噬菌體文庫(Waterhouse等人，Nuc.Acids.Res.，1993，21：2265-2266)產(chǎn)生高親和力(nM范圍)的人抗體。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代物。

還可以修飾DNA，例如，通過用人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列代替同源鼠序列(美國專利號4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1984，81：6851)，或通過使免疫球蛋白編碼序列共價連接非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或部分。通常，這種非免疫球蛋白多肽置換抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或者它們置換抗體的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)的可變結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生嵌合二價抗體，所述嵌合二價抗體具有對第一抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點(diǎn)和對不同抗原具有特異性的另一抗原結(jié)合位點(diǎn)。

已經(jīng)開發(fā)了用于產(chǎn)生功能性抗體片段的各種技術(shù)?？贵w片段可以包括抗體的可變區(qū)或抗原結(jié)合區(qū)。傳統(tǒng)上，通過完整抗體的蛋白水解消化得到這些片段(參見例如Morimoto等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods，1992，24：107-117以及Brennan等人，Science，1985，229：81)。然而，現(xiàn)在可以通過重組宿主細(xì)胞直接產(chǎn)生這些片段。例如，可以從上述抗體噬菌體文庫中分離抗體片段?？蛇x地，可以從大腸桿菌直接回收Fab′-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab′)2片段(Carter等人，Bio/Technology，1992，10：163-167)。根據(jù)另一種方法，可以直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中分離F(ab′)2片段。用于產(chǎn)生抗體片段的其他技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在其他實施方式中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利號5,571,894；美國專利號5,587,458?？贵w片段也可以是“線性抗體”，例如，例如，美國專利號5,641,870中描述的。這樣的線性抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。

抗體模擬物或“非抗體結(jié)合蛋白”通過使用非免疫球蛋白支架作為抗體可變區(qū)的替代蛋白框架，使用非免疫球蛋白支架，包括adnectins、高親和性多聚體(avimers)、單鏈多肽結(jié)合分子和抗體樣結(jié)合肽模擬物。(美國專利號5,260,203；5,770,380；6,818,418和7,115,396)。已經(jīng)開發(fā)了以類似于抗體的方式靶向和結(jié)合靶標(biāo)的其他化合物。這些“抗體模擬物”中的某些使用非免疫球蛋白支架作為抗體可變區(qū)的替代蛋白框架?？梢允褂梅Q為“抗體樣結(jié)合肽模擬物”(ABiP)的用于將抗體減小為較小肽模擬物的方法，用于將抗體減小為較小肽模擬物的方法也可用作抗體的替代方案(Murali等人，Cell Mol Bio1.，2003，49(2)：209-216)。融合蛋白是單鏈多肽，包括稱為“高親和性多聚體”的多個結(jié)構(gòu)域，通過體外外顯子改組和噬菌體展示從人細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域開發(fā)，并且是一類在各種靶分子的親和力和特異性方面與抗體有些相似的結(jié)合蛋白(Silverman等人，Nat Biotechnol，2005，23：1556-1561)。得到的多結(jié)構(gòu)域蛋白可以包括多個獨(dú)立的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與單表位結(jié)合蛋白相比可以表現(xiàn)出改善的親和力(在一些情況下亞納摩爾)和特異性。關(guān)于高親和性多聚體的構(gòu)建和使用的方法的其他細(xì)節(jié)公開于例如美國專利申請公開號20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384中。

除了非免疫球蛋白框架外，還在包括但不限于RNA分子和非天然寡聚體(例如，蛋白酶抑制劑、苯并二氮雜類、嘌呤衍生物和β-轉(zhuǎn)角模擬物)的化合物中模擬抗體性質(zhì)，所有這些都合適用于本發(fā)明。這些的目的是通過開發(fā)用于設(shè)計定制特異性的抗體的完全體外技術(shù)來規(guī)避在動物中開發(fā)抗體的限制。

如本領(lǐng)域已知的，適配體是由與特定分子靶標(biāo)緊密結(jié)合的核酸組成的大分子。Tuerk和Gold(Science，1990，249：505-510)披露了用于選擇適配體的SELEX(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment))方法。在SELEX方法中，產(chǎn)生和/或用靶分子篩選核酸分子的大文庫(例如，1015個不同分子)。然后可以進(jìn)一步精制分離的適配體，以消除對靶標(biāo)結(jié)合和/或適配體結(jié)構(gòu)無貢獻(xiàn)的任何核苷酸(即，截短到其核心結(jié)合結(jié)構(gòu)域的適配體)。參見，例如Jayasena，1999，Clin.Chem.45：1628-1650對于適配體技術(shù)的綜述。

關(guān)于本發(fā)明的抗DKK2抗體的術(shù)語“中和”或短語“中和DKK2活性的抗體”意指與DKK2結(jié)合或與DKK2接觸的抗體導(dǎo)致抑制細(xì)胞增殖活性、癌癥轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞侵入或癌細(xì)胞遷移，抑制Wnt信號傳導(dǎo)、血管生成、促進(jìn)DKK2誘導(dǎo)的微環(huán)境的腫瘤形成的建立。因為DKK2分泌到細(xì)胞外并且作為癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵入和轉(zhuǎn)移的必要因子起作用，一些抗DKK2抗體可以中和這些活性。本發(fā)明中的中和抗體特別適用于治療應(yīng)用：以預(yù)防或治療頑固性疾病癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移。本發(fā)明中的中和抗體可以施用至患者或與細(xì)胞接觸以抑制特征在于DKK2過表達(dá)的癌癥的轉(zhuǎn)移。

本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法評估免疫特異性結(jié)合?？墒褂玫拿庖邷y定包括但不限于使用以下的技術(shù)的競爭性和非競爭性測定系統(tǒng)：例如，蛋白質(zhì)印跡、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、凝集測定、補(bǔ)體固定測定、免疫放射測定、熒光免疫測定、蛋白A免疫測定，僅舉幾個例子。這種測定是常規(guī)的并且是本領(lǐng)域熟知的(參見例如分子生物學(xué)現(xiàn)代方法(Current Protocols in Molecular Biology)(Ausubel等人編輯)，格林出版協(xié)會(Greene Publishing Associates)和紐約約翰威立(Wiley-Interscience，New York)，2002)。

聯(lián)合療法

當(dāng)與用于治療癌癥的至少一種另外的化合物組合時，本文所述方法中鑒定的化合物也可用于本發(fā)明的方法中。另外的化合物可以包含本文鑒定的化合物或已知用于治療、預(yù)防或減少癌癥的癥狀和/或轉(zhuǎn)移的化合物，例如市售化合物。

在一個方面，本發(fā)明考慮本發(fā)明中有用的藥劑可以與治療劑組合使用，所述治療劑例如抗腫瘤劑，包括但不限于化學(xué)治療劑、免疫治療劑、抗細(xì)胞增殖劑或其任何組合。例如，以下非限制性示例性類別的任何常規(guī)化學(xué)治療劑包括在本發(fā)明中：烷化劑；亞硝基脲；抗代謝物；抗腫瘤抗生素；植物生物堿；紫杉烷；激素藥；和混合式(miscellaneous)藥劑。

烷化劑是這樣命名的，因為它們能夠在細(xì)胞中存在的條件下向許多電負(fù)性基團(tuán)添加烷基，從而干擾DNA復(fù)制以阻止癌細(xì)胞繁殖。大多數(shù)烷化劑是細(xì)胞周期非特異性的。在具體方面，它們通過交聯(lián)DNA雙螺旋鏈中的鳥嘌呤堿基來停止腫瘤生長。非限制性實例包括白消安、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、異環(huán)磷酰胺、鹽酸氮芥、鹽酸美沙拉秦、丙卡巴肼、塞替派和尿嘧啶芥。

抗代謝物阻止在細(xì)胞周期的合成(S)期期間將堿基并入DNA，從而禁止正常發(fā)育和分裂?？勾x物的非限制性實例包括例如5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、卡培他濱、阿糖胞苷、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、吉西他濱、甲氨蝶呤和硫鳥嘌呤的藥物。

抗腫瘤抗生素通常通過干擾細(xì)胞分裂所需的酶或通過改變細(xì)胞周圍的膜來阻止細(xì)胞分裂。此類中包括蒽環(huán)類，例如多柔比星，其通過破壞DNA的結(jié)構(gòu)并終止其功能來阻止細(xì)胞分裂。這些藥劑是細(xì)胞周期非特異性的。抗腫瘤抗生素的非限制性實例包括阿克拉霉素、放線菌素、安定霉素、重氮絲氨酸、博萊霉素、松節(jié)霉素、加利車霉素、卡霉素、卡莫西霉素、卡西林素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地柔紅霉素、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、阿霉素、伊達(dá)比星、馬賽洛霉素、絲裂霉素、米托蒽醌、霉酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈脲菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星。

植物生物堿抑制或停止有絲分裂或抑制阻止細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞生長所需的蛋白質(zhì)的酶。常用的植物生物堿包括長春花堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞濱。然而，本發(fā)明不應(yīng)被解釋為僅限于這些植物生物堿。

紫杉烷影響在細(xì)胞功能中是重要的稱為微管的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在正常的細(xì)胞生長中，當(dāng)細(xì)胞開始分裂時形成微管，但是一旦細(xì)胞停止分裂，則微管被分解或破壞。紫杉烷禁止微管分解，使得癌細(xì)胞變得如此被微管堵塞，以致它們不能生長和分裂。非限制性的示例性紫杉烷包括紫杉醇和多西紫杉醇。

激素劑和類激素藥物用于某些類型的癌癥，包括例如白血病、淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。它們常常與其他類型的化學(xué)療法藥物一起使用以增強(qiáng)其有效性。性激素用于改變雌性或雄性激素的作用或產(chǎn)生，并用于減緩乳腺癌、前列腺癌和子宮內(nèi)膜癌的生長。抑制這些激素的產(chǎn)生(芳香酶抑制劑)或作用(他莫昔芬)通?？捎米髦委煹妮o助。一些其他腫瘤也是激素依賴性的。他莫昔芬是激素劑的非限制性實例，其干擾促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長的雌激素的活性。

混合式藥劑包括化學(xué)治療劑，例如博萊霉素、羥基脲、L-天冬酰胺酶和丙卡巴肼。

化學(xué)治療劑的其他實例包括但不限于以下及其藥學(xué)上可接受的鹽、酸和衍生物：氮芥例如苯丁酸氮芥、氯氮平、氯磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氮芥氧化物、美法侖、新恩比興、苯芥膽甾醇、潑尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶芥子；亞硝基脲例如卡莫司汀、氯卓卡星、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；嘌呤類似物例如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫柳寧、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物例如阿扎他濱、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、脫氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷、5-FU；雄激素例如卡魯斯特、丙酸色丙酸托烷酯、表薄甾烷醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑例如亞葉酸；醋葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；貝伐單抗；比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依洛尼塞；依利醋銨(elliptinium acetate)；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹達(dá)莫；硝唑蘭；噴司他丁；苯來美特；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；PSK@雷佐生；西佐呋喃；鍺螺胺；絲裂酸；三唑酮；2，2′，2″-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；塞替哌；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇(TAXOLO，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他賽(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物例如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾維本；諾安托；替尼泊苷；道諾霉素；氨基蝶呤；塞羅達(dá)；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波霉素；和卡培他濱。

抗細(xì)胞增殖劑可以進(jìn)一步定義為凋亡誘導(dǎo)劑或細(xì)胞毒性劑。凋亡誘導(dǎo)劑可以是粒酶、Bcl-2家族成員、細(xì)胞色素C、半胱天冬酶或其組合。示例性粒酶包括粒酶A、粒酶B、粒酶C、粒酶D、粒酶E、粒酶F、粒酶G、粒酶H、粒酶I、粒酶J、粒酶K、粒酶L、粒酶M、粒酶N或其組合。在其他具體方面，Bcl-2家族成員是例如Bax、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bik、Hrk、Bok或其組合。

在另外的方面，半胱天冬酶為半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶-13、半胱天冬酶-14或其組合。在具體方面，細(xì)胞毒性劑是TNF-α、白樹毒素、促紅細(xì)胞生成素、核糖體抑制蛋白(RIP)、假單胞菌外毒素、艱難梭菌毒素B、幽門螺桿菌VacA、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌YopT、維生素E、二亞乙基三胺五乙酸、伊洛福芬(Irofulven)、白喉毒素、米托潔林(mitogillin)、蓖麻毒素、肉毒桿菌毒素、霍亂毒素、皂草素6或其組合。

免疫治療劑可以是但不限于白細(xì)胞介素-2或其他細(xì)胞因子，程序性細(xì)胞死亡蛋白1(PD-1)信號傳導(dǎo)的抑制劑，例如結(jié)合PD-1的單克隆抗體，易普利姆瑪。免疫治療劑還可以阻斷細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原A-4(CTLA-4)信號傳導(dǎo)，并且其還可以涉及癌癥疫苗和基于樹突狀細(xì)胞的治療。

免疫治療劑還可以是通過細(xì)胞因子治療或通過過繼細(xì)胞療法和/或通過造血干細(xì)胞移植轉(zhuǎn)移外源細(xì)胞而被活化和擴(kuò)增的NK細(xì)胞。適合于過繼細(xì)胞療法的NK細(xì)胞可以源自不同來源，包括自體NK細(xì)胞的離體擴(kuò)增，來自外周血的未刺激或擴(kuò)增的同種異體NK細(xì)胞，來自外周血和臍帶血的CD34+造血祖細(xì)胞和NK細(xì)胞系。表達(dá)嵌合抗原受體或細(xì)胞因子的遺傳修飾的NK細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。用于本發(fā)明的另一種免疫治療劑是基于過繼T細(xì)胞療法(ACT)的藥劑，其中給患者施用腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(TIL)。施用的T細(xì)胞可以被遺傳工程化以表達(dá)腫瘤特異性抗原受體，例如以非主要組織相容性(MHC)限制的方式識別細(xì)胞表面抗原的嵌合抗原受體(CAR)或者它們可以是傳統(tǒng)的αβTCR，其識別由MHC分子呈遞的細(xì)胞內(nèi)抗原的表位。

藥物組合物和制劑

本發(fā)明設(shè)想了包含DKK2消耗劑的藥物組合物用于本發(fā)明方法的用途。

這樣的藥物組合物是處于適于施用至對象的形式，或者藥物組合物可以進(jìn)一步包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、一種或多種另外的成分或這些的一些組合。藥物組合物的各種組分可以以生理學(xué)上可接受的鹽的形式存在，例如與生理上可接受的陽離子或陰離子組合，如本領(lǐng)域所熟知的。

在一個實施方式中，可以施用可用于實施本發(fā)明的方法的藥物組合物以遞送1ng/kg/天和100mg/kg/天之間的劑量。在另一個實施方式中，可以施用可用于實施本發(fā)明的藥物組合物以遞送1ng/kg/天和500mg/kg/天之間的劑量。

本發(fā)明的藥物組合物中活性成分、藥學(xué)上可接受的載體和任何另外的成分的相對量將根據(jù)所治療的對象的身份、大小和狀況而變化，并且還取決于施用組合物的途徑而變化。舉例來說，組合物可以包含在0.1％與100％(w/w)之間的活性成分。

可用于本發(fā)明方法的藥物組合物可適當(dāng)?shù)亻_發(fā)用于吸入、口服、直腸、陰道、腸胃外、外部、經(jīng)皮、肺部、鼻內(nèi)、含服、眼部、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)或其他給藥途徑。其他考慮的制劑包括投射的納米顆粒(projected nanoparticle)、脂質(zhì)體制劑、含有活性成分的再密封的紅細(xì)胞和基于免疫的制劑。給藥途徑(一種或多種)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且取決于許多因素，包括所治療的疾病的類型和嚴(yán)重性、所治療的獸醫(yī)或人患者的類型和年齡等。

本文所述的藥物組合物的制劑可以通過藥理學(xué)領(lǐng)域已知的或以后開發(fā)的任何方法制備。通常，這種制備方法包括使活性成分與載體或一種或多種其他輔助成分締合的步驟，然后如果必要或需要，將產(chǎn)品成形或包裝成所需的單劑量或多劑量單位。

如本文所用，“單位劑量”是包含預(yù)定量的活性成分的藥物組合物的離散量?；钚猿煞值牧客ǔ５扔趯⑹┯弥翆ο蟮幕钚猿煞值膭┝炕蜻@種劑量的合宜分?jǐn)?shù)，例如這樣劑量的一半或三分之一。單位劑型可以是單日劑量或多日劑量之一(例如，每天約1至4次或更多次)。當(dāng)使用多日劑量時，對于每個劑量，單位劑型可以相同或不同。

盡管本文提供的藥物組合物的描述主要涉及適合于對人進(jìn)行倫理給藥的藥物組合物，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這樣的組合物通常適于施用至各種動物。對適于施用至人的藥物組合物修飾以使該組合物適于施用至各種動物是眾所周知的，且普通技術(shù)的獸醫(yī)藥理學(xué)家可以僅使用普通(如果有的話)實驗設(shè)計和進(jìn)行這種修飾?？紤]施用本發(fā)明的藥物組合物的對象包括但不限于人和其他靈長類動物、哺乳動物，包括商業(yè)上相關(guān)的哺乳動物，例如牛、豬、馬、綿羊、貓和狗。

在一個實施方式中，使用一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體配制組合物。在一個實施方式中，藥物組合物包含治療有效量的DKK2消耗劑和藥學(xué)上可接受的載體?？捎玫乃帉W(xué)上可接受的載體包括但不限于甘油、水、鹽水、乙醇和其他藥學(xué)上可接受的鹽溶液，例如磷酸鹽和有機(jī)酸鹽。這些和其他藥學(xué)上可接受的載體的實例描述于雷明頓藥學(xué)大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，1991，新澤西馬克出版有限公司(Mack Publication Co.，New Jersey)中。

載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、它們適當(dāng)?shù)幕旌衔镆约爸参镉?。恰?dāng)?shù)牧鲃有钥梢员痪S持，例如通過應(yīng)用包衣例如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑。阻止微生物的作用可以通過不同的抗菌劑以及抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等等來實現(xiàn)。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如糖、氯化鈉或多元醇例如甘露醇和山梨醇。可注射的組合物的延長吸收可以通過將延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁或明膠包括在組合物中而造成。

制劑可以與常規(guī)賦形劑，即適合于口服、胃腸外、鼻部、靜脈內(nèi)、皮下、腸內(nèi)或本領(lǐng)域已知的任何其他合適的給藥方式的藥學(xué)上可接受的有機(jī)或無機(jī)載體物質(zhì)的混合物一起使用?？梢詫⑺幬镏苿缇?，并且如果希望的話，與助劑混合，所述助劑例如潤滑劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、用于影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香物質(zhì)等。它們也可以根據(jù)需要與其他活性劑例如其他止痛劑組合。

本發(fā)明的組合物可包含占組合物總重量約0.005％至2.0％的防腐劑。防腐劑用于阻止在暴露于環(huán)境中的污染物的情況下的腐敗。根據(jù)本發(fā)明有用的防腐劑的實例包括但不限于選自芐醇、山梨酸、對羥基苯甲酸酯、亞胺脲及其組合的那些。特別優(yōu)選的防腐劑是約0.5％至2.0％的芐醇和0.05％至0.5％的山梨酸的組合。

組合物優(yōu)選包含抑制化合物降解的抗氧化劑和螯合劑。對于一些化合物，優(yōu)選的抗氧化劑是BHT、BHA、α-生育酚和抗壞血酸，其優(yōu)選范圍為組合物總重量的約0.01％至0.3％，更優(yōu)選BHT范圍為0.03％至0.1％。優(yōu)選地，螯合劑以組合物總重量的0.01％至0.5％的量存在。特別優(yōu)選的螯合劑包括按組合物總重量計約0.01-0.20％，更優(yōu)選0.02-0.10％重量范圍的依地酸鹽(例如依地酸二鈉)和檸檬酸。螯合劑可用于螯合組合物中可能對制劑的保存期限有害的金屬離子。雖然BHT和乙二胺四乙酸二鈉是分別對于一些化合物特別優(yōu)選的抗氧化劑和螯合劑，但是如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，其他合適和等效的抗氧化劑和螯合劑因此可能被置換。

施用/給藥

施用方案可影響有效量的組成。例如，治療制劑可在與癌癥相關(guān)的外科手術(shù)之前或之后，或在患者被診斷患有癌癥之后不久施用至患者。此外，可以每天施用或者順序地施用若干分次劑量以及交錯劑量，或者劑量可以連續(xù)地輸注、或者可以是單次快速靜脈注射。此外，治療制劑的劑量可按比例地增加或減少，如治療或預(yù)防情況的緊急情況所指示的。

給患者，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人施用本發(fā)明的組合物可以使用已知的程序，以有效治療患者癌癥的劑量和時間進(jìn)行。實現(xiàn)治療效果所需的治療化合物的有效量可以根據(jù)以下因素而變化：例如所使用的具體化合物的活性；給藥時間；化合物的排泄速率；治療的持續(xù)時間；其他藥物，與化合物組合使用的化合物或材料；所治療患者的疾病或病癥的狀態(tài)、年齡、性別、體重、狀況、一般健康和在先病史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類似因素?？蓪┝糠桨讣右哉{(diào)節(jié)，以提供最優(yōu)治療應(yīng)答。例如，可每日施用數(shù)個分開的劑量或可按治療情形緊迫程度所指示的成比例減少劑量。本發(fā)明的治療化合物的有效劑量范圍的非限制性實例為約0.01至50mg/kg體重/每天。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將能夠研究相關(guān)因素并且在不進(jìn)行過度實驗的情況下確定治療化合物的有效量。

化合物可以以每天幾次的頻率施用至動物，或者可以更低頻率地施用，例如每天一次，每周一次，每兩周一次，每月一次或甚至更低頻率，例如每幾個月一次或甚至每年一次或更少。應(yīng)當(dāng)理解，在非限制性實例中，可以每天，每隔一天，每2天，每3天，每4天或每5天施用每天劑量化合物的量。例如，對于每隔一天的給藥，可以在周一開始5mg/天的劑量，在周三施用第一后續(xù)的5mg/天劑量，在周五施用第二后續(xù)5mg/天劑量，等等。劑量的頻率對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且取決于許多因素，例如但不限于所治療的疾病的類型和嚴(yán)重性，以及動物的類型和年齡。在本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分的實際劑量水平可以改變以此獲得用于具體患者、組合物，以及施用模式的有效達(dá)到所希望的治療應(yīng)答的活性成分的量，不對患者具有毒性。具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的醫(yī)生，例如醫(yī)師或獸醫(yī)，可以容易地確定和開出所需的藥物組合物的有效量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以以水平低于為了實現(xiàn)所需療效需要的劑量開始在藥物組合物中采用的本發(fā)明的化合物的劑量，且逐步增加劑量直至實現(xiàn)所需效果。

在具體實施方式中，特別有利的是以容易施用和劑量均勻性的劑量單位形式配制化合物。如本文所用的劑量單位形式指適宜作為待治療患者的單一劑量的物理上分離的單位；每個單位含有經(jīng)計算產(chǎn)生與所需藥用載體相關(guān)的所需治療效應(yīng)的藥物化合物的預(yù)先確定的量。本發(fā)明的劑量單位形式由以下因素決定并直接取決于以下因素：(a)治療化合物的獨(dú)特特征和要實現(xiàn)的特定治療效果，以及(b)混配/配制這樣的用于治療患者的癌癥的治療化合物領(lǐng)域固有的限制。

給藥途徑

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，盡管可以使用多于一種途徑用于給藥，但是特定途徑可以提供比另一種途徑更直接和更有效的反應(yīng)。

本發(fā)明的任何組合物的給藥途徑包括吸入、口服、鼻部、直腸、腸胃外、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜(例如，舌下、舌部、(經(jīng))頰部、(經(jīng))尿道、陰道(例如，經(jīng)陰道和陰道內(nèi))、(經(jīng))鼻部和(經(jīng))直腸)、膀胱內(nèi)、肺內(nèi)、十二指腸內(nèi)、胃內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、皮膚內(nèi)、動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、支氣管內(nèi)、吸入和外部給藥。合適的組合物和劑型包括例如片劑、膠囊、囊劑、丸劑、軟膠囊(gel cap)、含片、分散體、懸浮液、溶液、糖漿、顆粒、珠粒、經(jīng)皮貼劑、凝膠、粉末、彈丸劑、漿劑、錠劑、乳霜、糊劑、膏劑、洗劑、盤劑、栓劑、用于鼻或口服給藥的液體噴霧劑、用于吸入的干粉或氣霧化制劑、用于膀胱內(nèi)給藥的組合物和制劑等。應(yīng)當(dāng)理解，可用于本發(fā)明的制劑和組合物不限于本文所述的具體制劑和組合物。

控釋制劑和藥物遞送系統(tǒng)

本發(fā)明的藥物組合物的控釋或緩釋制劑可以使用常規(guī)技術(shù)制備。在一些情況下，待使用的劑型可以作為一種或多種活性成分的緩釋或控釋而提供，其中使用例如羥丙基甲基纖維素、其他聚合物基質(zhì)、凝膠、可滲透膜、滲透系統(tǒng)、多層包衣、微粒、脂質(zhì)體或微球體或其組合，以提供不同比例的所需釋放曲線。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的合適的控釋制劑，包括本文所述的那些，可以容易地選擇用于本發(fā)明的藥物組合物。因此，適合于口服給藥的單一單位劑型，例如適于控釋的片劑、膠囊、軟膠囊和囊劑，包括在本發(fā)明中。

大多數(shù)控釋藥品都具有相對其非控釋相應(yīng)物改進(jìn)藥物治療的共同目標(biāo)。理想的是，在醫(yī)學(xué)治療中所設(shè)計的最佳的控釋制劑的用途其特征為采用最小量的藥物物質(zhì)在最少量的時間內(nèi)治愈或控制病況?？蒯屩苿┑膬?yōu)點(diǎn)包括延長藥物活性、減少給藥頻率和增加患者順應(yīng)性。此外，控釋制劑可用于影響作用開始的時間或其他特征，例如藥物的血液水平，因此可影響副作用的發(fā)生。

免疫應(yīng)答刺激

在一個實施方式中，本發(fā)明包括通過給對象施用有效量的DKK2抗體或其片段與藥學(xué)上可接受的載體來提供抗腫瘤免疫性和刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。

活化T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)及其在免疫療法中用于治療癌癥和感染性疾病的用途是本領(lǐng)域眾所周知的(Melief等人，Immunol.Rev.，1995，145：167-177；Riddell等，Annu.Rev.Immunol.，1995，13：545-586)。如本發(fā)明中所披露的，DKK2的消除導(dǎo)致CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的活化和腫瘤的抑制。

用于CTL活化的標(biāo)記物可以是但不限于細(xì)胞毒素例如穿孔素、粒酶和顆粒溶素、細(xì)胞因子、IL-2、IL-4、CD25、CD54、CD69、CD38、CD45RO、CD49d、CD40L、CD137、CD134。如本文實施例部分所述，樣品中這些標(biāo)記物中至少一種的水平的測量可用于評估CTL活化。T細(xì)胞或通常本發(fā)明的任何細(xì)胞的分選可以使用多種市售的細(xì)胞分選機(jī)中的任何一種進(jìn)行，分選機(jī)包括但不限于MoFlo分選機(jī)(DakoCytomation，F(xiàn)ort Collins，Colo.)、FACSAria^TM、FACSArray^TM、FACSVantage^TM、BD^TM LSR II、和FACSCalibur^TM(BD Biosciences，San Jose，Calif.)。

血管生成

血管生成是生長和發(fā)育中以及傷口愈合和肉芽組織形成中的正常且重要的過程。血管生成的正常調(diào)節(jié)由誘導(dǎo)血管形成的因素和停止或抑制該過程的因素之間的精細(xì)平衡決定。當(dāng)這種平衡被破壞時，其通常導(dǎo)致病理性血管生成，這導(dǎo)致血管形成增加。病理性血管生成是癌癥和各種缺血性和炎性疾病(例如心血管疾病)的標(biāo)志。由于腫瘤不能生長超過一定大小或沒有血液供應(yīng)而擴(kuò)散，阻斷腫瘤血管生成是抗癌療法中的有效方法。還使用本領(lǐng)域已知為與治療缺血性和炎性疾病相關(guān)的血管生成抑制劑，也稱為抗血管生成劑。在本發(fā)明的一個實施方式中，DKK2消耗劑是阻止或減緩癌癥生長的血管生成抑制劑。在另一個實施方式中，DKK2消耗劑是預(yù)防或治療缺血性和炎性疾病的抗血管生成劑。炎性疾病的非限制性實例是心血管疾病、動脈粥樣硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

診斷和治療

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及診斷對象中癌癥或發(fā)展癌癥或轉(zhuǎn)移的傾向的方法。方法包括測定來自對象的生物樣品中DKK2基因的表達(dá)水平，其中與正常對照DKK2表達(dá)水平相比，DKK2表達(dá)水平的增加表明對象患有癌癥或具有發(fā)展癌癥或轉(zhuǎn)移的傾向。

在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于測定免疫療法治療在有需要的對象中治療癌癥的功效的方法。方法包括測定來自對象的生物樣品中DKK2基因的表達(dá)水平，其中與正常對照中DKK2的表達(dá)水平相比，DKK2的表達(dá)水平的增加是免疫療法有效的表示。在本發(fā)明的一些方面，癌癥的治療可以包括實體瘤的治療或轉(zhuǎn)移的治療。轉(zhuǎn)移是癌癥的一種形式，其中轉(zhuǎn)化的或惡性的細(xì)胞將癌癥從一個位點(diǎn)傳播并擴(kuò)散到另一個位點(diǎn)。這些癌癥包括皮膚、乳腺、腦、宮頸、睪丸等的癌癥。更具體地、癌癥可包括但不限于以下器官或系統(tǒng)：心臟、肺、胃腸、泌尿生殖道、肝、骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)、婦科、血液、皮膚和腎上腺。更具體地，本文的方法可用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤(神經(jīng)鞘瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、腦膜瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、腎癌、各種類型的血管癌、成骨細(xì)胞性骨癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮平滑肌瘤、唾液腺癌、脈絡(luò)叢癌、乳腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和巨核細(xì)胞白血病。皮膚癌包括惡性黑素瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、卡波氏肉瘤、發(fā)育異常性痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕疙瘩和牛皮癬。

所關(guān)注基因(DKK2)的表達(dá)的對照標(biāo)準(zhǔn)量

本發(fā)明的方法包括將來自對象的生物樣品中測量的DKK2表達(dá)量與DKK2表達(dá)的對照量(即，參比)進(jìn)行比較。

在一個實施方式中，DKK2的標(biāo)準(zhǔn)對照表達(dá)水平可以通過測量健康對象中DKK2的表達(dá)水平來獲得。優(yōu)選地，健康對象是相似年齡、性別和種族的對象，并且從未被診斷有任何類型的嚴(yán)重疾病，特別是任何類型的癌癥。

在另一個實施方式中，DKK2的表達(dá)的對照量是本領(lǐng)域接受的DKK2的表達(dá)的值。此參比值可以是基于DKK2表達(dá)的平均值通過應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計學(xué)方法對一組對象計算的基線值。

在一個實施方式中，通過選自以下的方法測定表達(dá)水平：檢測基因的mRNA、檢測由基因編碼的蛋白質(zhì)、以及檢測由基因編碼的蛋白質(zhì)的生物活性。

在本發(fā)明的某些方面，在來自對象的樣品中測定DKK2的表達(dá)水平。樣品優(yōu)選包括腫瘤細(xì)胞、來自腫瘤細(xì)胞周圍的任何流體(即，白血病血液、腫瘤組織等)或與腫瘤生理接觸或接近的任何流體，或除了本文所述那些之外的任何其他體液也應(yīng)被認(rèn)為包括在本發(fā)明中。

測量方法

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來測定DKK2表達(dá)的水平。例如，可以使用微陣列。微陣列在本領(lǐng)域中是已知的，并且由與基因產(chǎn)物(例如mRNA、多肽、其片段等)在序列上對應(yīng)的探針可以特異性雜交或結(jié)合到已知位置的表面組成。為了檢測至少一種關(guān)注基因，通過使測試樣品與至少一種核酸探針接觸來形成雜交樣品。用于檢測DKK2的優(yōu)選探針是能夠與DKK2mRNA雜交的標(biāo)記的核酸探針。核酸探針可以是例如全長核酸分子或其部分，例如長度為至少10、15或20個核苷酸的寡核苷酸，并且足以在嚴(yán)格條件下與合適的靶標(biāo)特異性地雜交。將雜交樣品保持在足以允許核酸探針與感興趣的靶標(biāo)特異性雜交的條件下。特異性雜交可以在高嚴(yán)格條件或中等嚴(yán)格條件下進(jìn)行，視情況而定。在優(yōu)選的實施方式中，用于特異性雜交的雜交條件是高嚴(yán)格性條件。然后使用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測特異性雜交(如果存在的話)。如果在核酸探針和測試樣品中的基因之間發(fā)生特異性雜交，則存在于核酸探針中的序列也存在于對象的mRNA中。也可以使用多于一種核酸探針。由掃描儀檢測的雜交強(qiáng)度數(shù)據(jù)由Affymetrix微陣列套件(Affymetrix Microarray Suite)(MASS)軟件自動獲取和處理。使用150的目標(biāo)強(qiáng)度將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為表達(dá)水平。測量少量不同基因的mRNA表達(dá)譜的替代方法是通過例如經(jīng)典的基因表達(dá)分析或低密度陣列-微流體卡(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems))。特別地，本發(fā)明優(yōu)選利用qPCR系統(tǒng)。非限制性實例包括商業(yè)試劑盒，例如可從伯樂公司(Bio-rad)(加利福尼亞州伯克利(Berkley，California))商購的

樣品——特別是mRNA——的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)也可以通過本領(lǐng)域已知的其他核酸表達(dá)技術(shù)測量。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法從樣品中分離mRNA。非限制性實例包括商業(yè)試劑盒，例如可從Qiagen(荷蘭)購得的或可從分子研究中心有限公司(Molecular Research Center，Inc.)(俄亥俄州辛辛那提(Cincinnati，Ohio))購得的Mini Kit the TRI其可用于分離RNA。通常，可以使用本領(lǐng)域已知的方法擴(kuò)增所分離的mRNA。利用例如PCR或RT-PCR方法的擴(kuò)增系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對于擴(kuò)增技術(shù)的一般概述，參見例如Dieffenbach等人，PCR引物：實驗室手冊(PCR Primer：A Laboratory Manual)，紐約冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)(1995)。

另一種用于分析mRNA表達(dá)的精確方法可以使用下一代測序(NGS)，包括第一、第二、第三以及后續(xù)的下一代測序技術(shù)。

在本發(fā)明的其他方面，通過本領(lǐng)域中用于測定樣品中肽或多肽的量的所有已知方法，可以實現(xiàn)測定肽、多肽的量或檢測其生物活性。這些裝置包括可以利用各種夾心、競爭或其他測定形式的標(biāo)記分子的免疫測定裝置和方法。這樣的測定將產(chǎn)生指示肽或多肽的存在或不存在的信號。此外，信號強(qiáng)度可以優(yōu)選地與樣品中存在的多肽的量直接或間接(例如反比例)相關(guān)。進(jìn)一步合適的方法包括測量肽或多肽特異性的物理或化學(xué)性質(zhì)，例如其精確的分子質(zhì)量或NMR譜。所述方法優(yōu)選包括生物傳感器、與免疫測定偶聯(lián)的光學(xué)裝置、生物芯片、分析裝置例如質(zhì)譜儀、NMR分析儀或色譜裝置。此外，方法包括基于微板ELISA的方法、全自動或機(jī)器人免疫測定(例如可在Elecsys^TM分析儀上獲得)、CBA(酶促鈷結(jié)合測定，例如可在Roche-Hitachi^TM分析儀上獲得)和乳膠凝集測定(例如可在Roche-Hitachi^TM分析儀上獲得)。

試劑盒

本發(fā)明包括一組優(yōu)選的抗體，被標(biāo)記(例如，熒光劑，淬滅劑等)或未標(biāo)記的，其可用于檢測至少DKK2。

在某些實施方式中，提供了試劑盒。鑒于本說明書，用于這些方法的市售試劑盒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。通常，試劑盒將包含適合于檢測所關(guān)注的多肽或核酸或mRNA的存在的檢測試劑。

在另一個實施方式中，存在一組探針組或抗體。在一些實施方式中，該組抗體包含靶向DKK2表位的中和性DKK2抗體，所述DKK2表位包含選自KLNSIKSSLGGETPG(SEQ ID NO 1)、CKVWKDATYSSKAR(SEQ ID NO 5)和CARHFWTKIC(SEQ ID NO 7)的氨基酸序列中的至少一種。在一些實施方式中，探針組的組被設(shè)計為檢測DKK2的水平并提供關(guān)于癌癥診斷或發(fā)展癌癥或轉(zhuǎn)移的傾向的信息。探針組是特別有用的，因為它們比意欲在特定基因組中檢測盡可能多的肽的探針組更小且更便宜。在本發(fā)明中，探針組靶向于檢測對癌基因有信息的多肽。探針組還可以包含大量或少量探針，其檢測對于癌癥沒有信息的肽。此類探針可用作對照和用于標(biāo)準(zhǔn)化(例如，摻入標(biāo)記物)。探針組可以是干混合物或溶液中的混合物。在一些實施方式中，探針組可以固定在固體基底上以形成探針陣列。探針可以是抗體或核酸(例如，DNA、RNA、DNA和RNA的化學(xué)修飾形式)、LNA(鎖定的核酸)或PNA(肽核酸)或能夠與關(guān)注的肽或核酸序列特異性相互作用的任何其他聚合化合物。

考慮試劑盒可以設(shè)計用于分離和/或檢測基本上任何樣品(例如，白血病血液、腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織等)中的肽(例如DKK2、已知的癌癥標(biāo)記物、免疫激活劑或凋亡蛋白)或核酸序列，并且鑒于本說明書，多種試劑和方法是本領(lǐng)域已知的。

實施例

現(xiàn)在參考以下實施例描述本發(fā)明。提供這些實施例僅是出于說明的目的，并且本發(fā)明決不應(yīng)該被解釋為局限于這些實施例，而是應(yīng)該被解釋為涵蓋由于在此所提供的教導(dǎo)而變得明顯的任何以及所有變化。

無需進(jìn)一步描述，相信本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用前述說明和以下說明性實施例制備和利用本發(fā)明的化合物并實施要求保護(hù)的方法。因此以下工作實施例特別指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，且不應(yīng)理解為以任何方式限制本公開的其余部分。

實施例1：遺傳DKK2缺失導(dǎo)致APC^Min/+小鼠中腫瘤負(fù)荷降低。

將APC^Min/+小鼠(稱為APC)和APC^Min/+DKK2^-/-(APCKO)小鼠飼養(yǎng)在無特定病原體的動物房中。在不存在DKK2的情況下，腫瘤進(jìn)展顯著減少，如由較低的腫瘤數(shù)目和大小所指示的(圖1A和1B)。相應(yīng)地，腫瘤誘導(dǎo)的異常，例如脾腫大、胸腺萎縮和淋巴細(xì)胞減少(You，S.，等人，Int J Exp Pathol，2006.87(3)：p.227-36)在APCKO小鼠中顯著較低。這種現(xiàn)象在高和低脂肪飲食的雄性和雌性小鼠組中觀察到，具有一致的結(jié)果?？傊?，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈地表明，在DKK2不存在的情況下，結(jié)腸癌進(jìn)展顯著更低。由于一些研究已將DKK2與腫瘤細(xì)胞增殖的增加或減少相關(guān)聯(lián)(Hirata，H.，等人，Clin Cancer Res，2009.15(18)：p.5678-87；Hauer，K.，等人，Cancer Res，2013.73(2)：p.967-77)，針對潛在參與促進(jìn)增殖，測試DKK2。在該研究中，在24小時后用重組DKK2(rDKK2)治療小鼠結(jié)腸癌MC38細(xì)胞(Mayo Clinic)，然后使用ATPlite試劑盒(PerkinElmer)和血細(xì)胞計數(shù)器(圖2)測量對細(xì)胞增殖的影響。數(shù)據(jù)顯示rDKK2不影響MC38細(xì)胞的增殖。用其中和抗體的DKK2中和也不改變MC38增殖(未示出)。APC和APCKO小鼠對Ki67表達(dá)(與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白質(zhì))的組織學(xué)分析也顯示腫瘤或正常區(qū)域的增殖沒有顯著差異。

實施例2：缺乏DKK2增加CD8⁺活化，而對其他白細(xì)胞亞群或標(biāo)記物沒有顯著影響。

為了測試DKK2表達(dá)是否可以改變腫瘤微環(huán)境以產(chǎn)生適當(dāng)?shù)目鼓[瘤免疫應(yīng)答，分析腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)的水平和抗腫瘤活性。由于它們的腫瘤的性質(zhì)，APC小鼠提供了研究腫瘤區(qū)域并將其與鄰近正常區(qū)域進(jìn)行比較的獨(dú)特機(jī)會。包括測量CD4(IL-2、IFNg、TNFa、CD25、CD69、FoxP3)細(xì)胞的水平、活化標(biāo)記物和細(xì)胞因子產(chǎn)生以及MDSC的一些抑制性質(zhì)(精氨酸酶和iNOS功能)的分析顯示APC與APCKO小鼠沒有差異。還分析了其他器官例如派伊爾淋巴集結(jié)(PP)、脾、腸系膜淋巴結(jié)(MLN)、固有膜、胸腺和骨髓，并且沒有觀察到顯著差異。

免疫系統(tǒng)的主要抗腫瘤活性之一包括腫瘤反應(yīng)性CD8⁺T細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性(Waldner等人，World J Gastroenterol，2006.12(45)：第7233-8頁)。CTL通過在MHC I內(nèi)識別它們的同源抗原，靶向腫瘤細(xì)胞并釋放細(xì)胞毒性化合物例如gzmb(Naito，Y等人，Cancer Res，1998.58(16)：第3491-4頁)。作為絲氨酸蛋白酶的gzmb的攝取導(dǎo)致半胱天冬酶的蛋白水解活化、Bid的切割、DNA的斷裂和靶細(xì)胞中凋亡的誘導(dǎo)(Thomberry等人，J Biol Chem，1997.272(29)：第17907-11頁；Heusel等人，Cell，1994.76(6)：第977-87頁)。APC和APCKO小鼠中的TIL的分析揭示了gzmb⁺和CD69⁺(另一種CD8⁺活化標(biāo)記物)CD8細(xì)胞的百分比的顯著增加(圖3A)。幾種亞型的CD8⁺T細(xì)胞浸潤腸腫瘤；發(fā)現(xiàn)CD8 ab⁺細(xì)胞在gzmb表達(dá)中具有最顯著的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。APCKO的CD8 TIL中增加的gzmb表達(dá)與在TUNEL測定中檢測到的其腫瘤中較高水平的凋亡細(xì)胞一致(圖5)。對APC小鼠的淋巴系統(tǒng)的進(jìn)一步分析顯示在18周齡的PP的CD8⁺細(xì)胞中顯著更高水平的gzmb表達(dá)(圖3B)。還分析了其中幾乎不可見息肉的11周齡小鼠的PP中的CD8⁺活化。觀察到來自APCKO的PP中的gzmb表達(dá)比來自APC的PP中的顯著增加(圖4)。還分析了幾個其他淋巴器官的gzmb表達(dá)(即MLN、脾和腹股溝LN)，但沒有觀察到差異。

實施例3：腸、非造血DKK2主要負(fù)責(zé)KO小鼠中的表型。

先前報道DKK2在腸上皮細(xì)胞中表達(dá)(Li等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2012.109(28)：p.11402-7)。為了確定DKK2在腸上皮細(xì)胞中而不是在免疫/造血細(xì)胞中的表達(dá)是否可能是來自PP的CD8⁺活性降低的主要原因，進(jìn)行了兩個以下實驗：

A)腸特異性、條件性DKK2.KO小鼠的產(chǎn)生：產(chǎn)生在DKK2兩側(cè)加入loxP位點(diǎn)的(DKK2-floxed)小鼠并將其與APC小鼠(指定為APC-V-KO和APC的后代)育種的他莫昔芬誘導(dǎo)性絨毛-cre小鼠雜交。實際上，與PP CD8細(xì)胞中的APC小鼠相比，在他莫昔芬治療的11周齡APC-V-KO上檢測到增加的gzmb和CD69表達(dá)(圖7)。

B)BM過繼轉(zhuǎn)移：為了排除免疫細(xì)胞中DKK2表達(dá)調(diào)節(jié)CD8⁺T細(xì)胞活性的可能性，照射WT/KO小鼠并進(jìn)行來自CD45.1⁺小鼠的BM過繼轉(zhuǎn)移。在APCKO小鼠的PP的CD45.1⁺CD8⁺細(xì)胞中增加的gzmb表達(dá)水平(圖6)與DKK2來源是非造血的可能性一致。

實施例4：靶向腸/結(jié)腸癌中的DKK2具有治療益處。

DKK2是分泌的，并且是用抗體(Ab)靶向以減少腫瘤負(fù)荷的合適候選物。雖然DKK2對于眼瞼發(fā)育是重要的(Gage等人，Dev Biol，2008.317(1)：p.310-24)，但不知道在成年小鼠中具有生命攸關(guān)的功能。本發(fā)明披露了三種新的Ab的克隆(YAL008-1-5F8、YAL008-5-1A10和YAL008-7 1A10；圖11)，其對DKK2而非DKK1(圖8A)具有高度特異性，其中和DKK2并抑制其Wnt拮抗劑功能(圖8B)。在初步測試中，APC小鼠(8周齡)腹膜內(nèi)注射YAL008-1-5F8、YAL008-5-1A10、YAL008-7 1A10或IgG。8周后，評價其腸腫瘤，觀察到a-Dkk2ab治療的小鼠的腫瘤數(shù)目和體積的顯著減少，伴隨較低的腫瘤誘導(dǎo)的免疫異常(圖9A和9B)。治療對體重幾乎沒有影響，表明其可能不引起顯著的副作用(圖9C)。結(jié)果表明在結(jié)腸癌小鼠模型中在所有DKK2缺失時顯著的腫瘤/息肉減少。這與這些小鼠中PP CD8⁺細(xì)胞中增加的gzmb表達(dá)一致(圖10)。同時，這些結(jié)果表明開發(fā)了功能抗體(Ab)，其可以靶向及中和DKK2并降低APC小鼠中的腫瘤負(fù)荷，為靶向DKK2的治療應(yīng)用提供主要證據(jù)的證明。gzmb表達(dá)的這種差異是APCKO小鼠中減少的腫瘤/息肉負(fù)荷的重要促成因素。因此，本文提供的數(shù)據(jù)突出了DKK2在腸/結(jié)腸癌進(jìn)展中的關(guān)鍵作用。

實施例5：在結(jié)腸癌細(xì)胞的移植小鼠模型中靶向DKK2顯示DKK2是調(diào)節(jié)腫瘤性狀和微環(huán)境的重要參與者。

來源于C57BL小鼠中的小鼠結(jié)腸癌的MC38細(xì)胞在移植到具有免疫活性的WT C57BL小鼠時進(jìn)展非?？臁Ｒ虼?，此異種移植模型充當(dāng)侵略性晚期腫瘤模型的良好替代物，其可用于測試a-Dkk2 Ab用于治療晚期癌癥的潛力。在一項研究中，用MC38細(xì)胞移植C57BL小鼠(每組n＝5)。六天后，通過腹膜內(nèi)(IP)途徑用小鼠IgG或a-Dkk2 Ab(YAL008-1-5F8)以8mg/kg治療小鼠。圖13A顯示YAL008-1-5F8顯著抑制腫瘤生長。腫瘤切片的免疫染色揭示YAL008-1-5F8增加腫瘤細(xì)胞凋亡和粒酶B陽性細(xì)胞(圖13B)。重要的是，浸潤到這些移植的腫瘤中的白細(xì)胞的流式細(xì)胞分析顯示CD45、NK、CD8⁺、骨髓細(xì)胞或CD4的數(shù)目沒有差異，但是YAL008-1-5F8治療導(dǎo)致粒酶B陽性CD45陽性白細(xì)胞——包括粒酶B陽性NK和CD8⁺細(xì)胞——的顯著增加(圖14)。這些結(jié)果與遺傳模型研究一致，DKK2中和通過涉及效應(yīng)子免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)的機(jī)制抑制腫瘤形成。

圖15顯示，抗DKK2抗體的較長期治療導(dǎo)致使用MC38細(xì)胞的同種異體移植模型中腫瘤形成的進(jìn)一步減少。此外，所述抗體顯示對抑制腫瘤形成的依賴于ose的效應(yīng)。除了用抗體(YAL008-1-5F8)治療的腫瘤中的粒酶B陽性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡的增加之外，較長的治療還導(dǎo)致CD8⁺T細(xì)胞的增加以及腫瘤血管生成和增殖的減少(圖16)。

實施例6：在晚期結(jié)腸直腸癌模型中靶向DKK2。

雖然APC小鼠是最成熟的小鼠模型之一，但是它們的息肉很少轉(zhuǎn)化為癌。為了研究在具有產(chǎn)生腫瘤而不僅是息肉的更強(qiáng)致癌突變的結(jié)腸癌模型中靶向DKK2，培育了幾種小鼠品系：C57BL/6APC^tm1TyJ/J小鼠、B6.129S4-Kras^tm4Tyj/J小鼠和villin-CreER2小鼠。他莫昔芬在5周齡時注射。3組小鼠(n＝5)用200μg YAL008-1-5F8/YAL008-5-1A10/IgG從第9周開始每72小時治療直到第18周。將它們的腸固定，分離PP用于FACS分析和腫瘤負(fù)荷評估。還收集脾臟、胸腺和血液，用于分析淋巴細(xì)胞減少(B/T細(xì)胞)。腫瘤評估后，處理腸以進(jìn)行組織學(xué)評估。與IgG治療的小鼠相比，結(jié)果應(yīng)該顯示在YAL008-1-5F8和YAL008-5-1A10治療的小鼠中腫瘤數(shù)目和體積減少。此外，檢測到PP的CD8細(xì)胞中更高水平的gzmb。

實施例7：在具有確立的息肉和腫瘤的APC小鼠中靶向DKK2。

用200μg YAL008-1-5F8、YAL008-5-1A10或IgG，對16周齡的購買的APC小鼠(完全發(fā)育的息肉/腫瘤)進(jìn)行治療，每72小時，持續(xù)5周。在終點(diǎn)天，如先前在實施例7中所述收集數(shù)據(jù)。應(yīng)觀察到用a-DKK2 Ab治療的小鼠的腫瘤負(fù)荷(數(shù)量和體積)的顯著降低。也應(yīng)檢測到其PP CD8細(xì)胞中更高水平的gzmb。

實施例8：促進(jìn)腫瘤生長的DKK2來源的研究。

為了研究腫瘤產(chǎn)生的DKK2在腫瘤形成中的作用，對一組小鼠注射DKK2-shRNA-MC38細(xì)胞，而另一組注射對照-ShRNA-MC38細(xì)胞。DKK2 shRNA將DKK2表達(dá)降低超過一半(圖17，左圖)。DKK2-shRNA-MC38細(xì)胞在移植模型中比對照-ShRNA-MC38細(xì)胞顯示顯著較慢的腫瘤形成(圖17，中間圖)。重要的是，在用DKK2-shRNA-MC38細(xì)胞移植的腫瘤中，粒酶B陽性細(xì)胞和凋亡細(xì)胞增加(圖17，右圖)。

為了研究來自宿主的DKK的作用，我們將MC38細(xì)胞移植到WT C57BL或DKK2缺失的C57BL小鼠中。圖18顯示在DKK2缺失小鼠上腫瘤形成較慢。此外，在移植到DKK2缺失小鼠上的腫瘤中的粒酶B⁺細(xì)胞和凋亡細(xì)胞增加。

總之，這些數(shù)據(jù)表明腫瘤細(xì)胞和宿主產(chǎn)生的DKK2在支持腫瘤生長中都是重要的。

實施例9：YAL008-1-5F8治療的APC小鼠中T細(xì)胞在減少的腫瘤負(fù)荷中的作用。

本文先前描述的結(jié)果顯示在APCKO和在YAL008-1-5F8治療的APC小鼠中腫瘤負(fù)荷的顯著降低伴隨著APCKO的腫瘤和YAL008-1-5F8治療的小鼠的PP中更高水平的gzmb表達(dá)。為了研究是否T細(xì)胞負(fù)責(zé)這樣的現(xiàn)象或檢測到更高的gzmb，因為使用更少的腫瘤誘導(dǎo)的抑制T細(xì)胞缺失的小鼠。將Rag2缺陷小鼠飼養(yǎng)至APC小鼠。用YAL008-1-5F8或IgG治療T/B細(xì)胞敲除APC小鼠(n＝5)8周。在終點(diǎn)天，對小鼠實施安樂死并研究其腫瘤負(fù)荷。應(yīng)該檢測不到這兩組的腫瘤負(fù)荷的顯著差異。因此，缺乏DKK2導(dǎo)致浸潤腸腫瘤和殺死癌細(xì)胞的T細(xì)胞中更高的gzmb表達(dá)。

實施例10：DKK2在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化中的作用。

重要的是知道DKK2是否直接影響T細(xì)胞中的gzmb表達(dá)，或者它是否影響調(diào)節(jié)其表達(dá)的其他細(xì)胞/因子。為了研究此問題，從脾臟、MLN、上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和PP中分離出幼稚CD8⁺T細(xì)胞。將這些細(xì)胞在涂布CD3/CD28的平板中培養(yǎng)，在其培養(yǎng)基中有或沒有rDKK2和rWnt3a。在48和72小時后，分別對應(yīng)于早期和中期活化，收集樣品并通過FACS分析gzmb表達(dá)。在48小時處將另外劑量的rDKK2施用于孔，這是因為rDKK2在長時間培養(yǎng)中失去其生物活性。一旦將rDKK2加入到培養(yǎng)基中，應(yīng)當(dāng)檢測到gzmb表達(dá)的降低，這支持DKK2直接影響gzmb表達(dá)的觀點(diǎn)。

實施例11：上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(iel)在調(diào)節(jié)腫瘤負(fù)荷中的作用：在存在和不存在rDKK2和YAL008-1-5F8的情況下上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的殺傷能力。

CD8細(xì)胞中增加的gzmb表達(dá)與其細(xì)胞毒性能力和抗腫瘤特性密切相關(guān)。包括本發(fā)明的幾個研究已經(jīng)表明，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞實際上可以殺死結(jié)腸癌細(xì)胞(Arvonen等人，Clin Exp Rheumatol，2010，28(1)：第128-34頁；Ebert Immunology，2009.127(2)：第206-15；Di Sabatino等人，Gut，2006，55(4)：第469-77頁；Lundqvist等人，J Immunol，1996.157(5)：第1926-34頁；Melgar等人，Immunology，2002.106(4)：第476-85頁和Nussler等人，Langenbecks Arch Surg，2000.385(3)：第218-24頁)。到目前為止，本文披露的結(jié)果顯示APCKO的CD8⁺Til中的gzmb表達(dá)特別地升高，并且這些細(xì)胞的來源可能是腸的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞。這些細(xì)胞的表型與上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的表型一致，因為它們是高度gzmb⁺，＞95％CD69⁺，并且觀察到顯著的CD4⁺CD8⁺群體(活化的CD4⁺上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的標(biāo)志)(Pahar等人，Eur J Immunol，2006.36(3)：第583-92頁)。

為了研究DKK2或其抑制是否可以直接調(diào)節(jié)上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的殺傷能力，通過FACS分選來自11周齡APC小鼠的CD8⁺上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞，并用10∶1和5∶1E∶T比例的10K MC38細(xì)胞孵育。將rDKK2(15nM)和YAL008-1-5F8/IgG(3nM)加入培養(yǎng)基中以研究DKK2是否可以直接影響上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的殺傷能力。24小時后，通過FACS分析MC38細(xì)胞的AnnexinV和PI染色。該實驗重復(fù)3次(每次n＝3)并且在YAL008-1-5F8治療的細(xì)胞中應(yīng)顯示增加的殺傷并且在DKK2治療的孔中顯示減少的殺傷。該實驗還在源自APC小鼠的APCI0.1細(xì)胞上進(jìn)行(De Giovanni等人，Int J Cancer， 2004，109(2)：p.200-6)，并且應(yīng)該顯示類似的結(jié)果。加入gzmb抑制劑(例如25-100μM的Z-AAD-CMK(Biovision公司，CA))以確保gzmb在上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能中的作用。

實施例12：上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞在調(diào)節(jié)腫瘤負(fù)荷中的作用：來自APC/APCKO和APC/APC-V-KO的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的殺傷能力。

通過FACS分選來自11周齡APC/APCKO和APC/APC-V-KO小鼠的CD8⁺上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞以比較其CTL活性。小鼠是年齡/性別相匹配的同窩幼仔。如本文之前實施例11所述進(jìn)行實驗。應(yīng)該檢測到APCKO或APC-V-KO小鼠的更高的細(xì)胞毒性能力。還進(jìn)行了對24周齡APC/APCKO和APC/APC-V-KO小鼠的Til CD8的類似實驗。在該實驗中，小心收集腸腫瘤并在FACS分選CD8細(xì)胞之前消化。由于腫瘤非常小，每組匯集兩只小鼠。對于該實驗，使用5∶1的E∶T比。

實施例13：Wnt信號傳導(dǎo)在CD8細(xì)胞中調(diào)節(jié)gzmb的作用。

許多研究已經(jīng)將Wnt信號傳導(dǎo)與T細(xì)胞功能相關(guān)聯(lián)，并且記憶細(xì)胞中的Wnt信號傳導(dǎo)是特別值得注意的(Xue和Zhao Ann N Y Acad Sci，2012.1247：第16-33頁；Jeannet等人，Proc Natl Acad Sci U S A，2010.107(21)：第9777-82頁；Barker等人，Adv Cancer Res，2000.77：第1-24頁和Zhou等人，Immunity，2010.33(2)：第229-40頁)。DKK2的Wnt拮抗性可能負(fù)責(zé)下調(diào)gzmb。為了研究Wnt在gzmb表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用，使用珠粒從LRP5/6KO小鼠中分選幼稚胸腺CD8⁺T細(xì)胞，從而選擇缺乏Wnt信號傳導(dǎo)的細(xì)胞。然后將細(xì)胞用CFSE標(biāo)記并靜脈內(nèi)注射到11周齡的APC和APC-v-KO小鼠(同籠/同窩出生)中。由于先前的結(jié)果顯示，遷移至PP的注射的幼稚細(xì)胞在注射后24-96小時開始產(chǎn)生gzmb，48小時后收集PP，并且通過FACS測量CFSE+細(xì)胞中g(shù)zmb的水平。由于LRP5/6KO T細(xì)胞不能對Wnt配體應(yīng)答，因此它們在APC/APC-v-KO小鼠中不應(yīng)顯示gzmb表達(dá)的任何差異。因此，本文提供的結(jié)果應(yīng)該確定CD8⁺細(xì)胞中g(shù)zmb表達(dá)的DKK2減少可能是由于Wnt信號傳導(dǎo)的抑制。

實施例14：用于癌癥治療的DKK2和抗DKK2用于改善癌癥免疫療法的用途。

本發(fā)明披露了DKK2在結(jié)腸癌中的作用。本文提供的數(shù)據(jù)提供關(guān)于DKK2在結(jié)腸癌促進(jìn)中的顯著和未被評價的作用的強(qiáng)烈和令人信服的論點(diǎn)。此外，如本發(fā)明所示，DKK2在調(diào)節(jié)gzmb中的作用也是非常出乎意料的。因此調(diào)節(jié)結(jié)腸癌中的DKK2表達(dá)為患者的新的治療選擇打開了大門。包括將各種敲除T細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到APC/APCKO小鼠中和使用老化APC/APC-V-KO小鼠研究它們的腫瘤負(fù)荷的幾個實驗正在進(jìn)行。盡管DKK2中和似乎不阻止腫瘤發(fā)展，但是其可以增加TIL上的gzmb表達(dá)的事實使其成為用于改善癌癥疫苗或其他不是100％有效的免疫療法的極好的工具。如本發(fā)明中提出的抗DKK2抗體的使用對于改善癌癥免疫療法例如改善結(jié)腸癌治療中的MUC1疫苗和PD-1靶向是理想的。

實施例15：DKK2抗體抑制同種異體移植模型中的肺腫瘤形成。

將小鼠LLC肺癌細(xì)胞移植到C57BL小鼠中并用抗DKK2抗體(YAL008-1-5F8)治療?？贵w抑制腫瘤形成，伴隨著粒酶B陽性細(xì)胞和凋亡腫瘤細(xì)胞的增加(圖19)。

實施例16：DKK2和Wnt對NK細(xì)胞活化的影響。

在DKK2、Wnt3a、Wnt5A和DKK1的重組蛋白存在或不存在并且存在或不存在Wnt抑制劑(包括LGK-974)和GSK抑制劑(包括CHIR 99021)下，測試來自脾和MC38移植腫瘤的人NK細(xì)胞系NK-92和原代小鼠NK細(xì)胞的粒酶和細(xì)胞毒性活性的表達(dá)。以這種方式，可以評估DKK2和Wnt對NK細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)。

實施例17：當(dāng)與PD-1抗體締合時，DKK2抗體最佳地抑制腫瘤形成。

用LLC或MC38細(xì)胞移植C57BL小鼠(每組n＝5)。六天后，通過腹膜內(nèi)(IP)途徑用小鼠IgG、a-Dkk2抗體(YAL008-1-5F8)和/或PD-1抗體以16mg(8mg/抗體)/kg治療小鼠。將YAL-008-1-5F8對腫瘤形成的作用與PD-1抗體的進(jìn)行對比(Cancer Res.2005Feb 1；65(3)：1089-96)。在LLC同種異體移植肺腫瘤模型中，YAL-008-1-5F8對腫瘤延緩的作用與PD-1抗體相似，YAL-008-1-5F8和PD-1抗體的組合顯示出比單獨(dú)的PD-1抗體更高的抑制腫瘤進(jìn)展(圖20A)；YAL-008-1-5F8對小鼠存活具有與PD-1抗體相似的效果，并且YAL-008-1-5F8和PD-1抗體的組合顯示出比單獨(dú)使用PD-1抗體提高的存活率(圖20B)。圖20C說明當(dāng)在MC38結(jié)腸癌模型中單獨(dú)施用或與其他抗體組合施用時，YAL-008-1-5F8對腫瘤形成的對比作用。在這種MC38模型中，PD-1抗體不顯示對腫瘤形成的顯著影響。

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雖然本發(fā)明參照具體實施方式進(jìn)行披露，清楚的是在不偏離本發(fā)明的真實精神和范圍下本發(fā)明的其他實施方式和變更可以由其他的本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來設(shè)計。所附權(quán)利要求書意欲解釋為包括所有這類實施方式和等效變化方式。