細(xì)胞內(nèi)酶p38MAPKα已被充分表征為由巨噬細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子(IL-1β和TNFα)的調(diào)控劑，并且被視為阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s disease)中的治療靶標(biāo)(Munoz,2010)；主要基本原理是降低來自小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥性介體以及它們?cè)贏β下游的影響：興奮毒性、突觸功能障礙和τ蛋白磷酸化。IL-1β-p38MAPKα也可通過影響長(zhǎng)期增強(qiáng)/抑制來直接調(diào)節(jié)記憶形成和認(rèn)知功能(MacAfoose,2009；Barrientos,2012)。然而，由于血腦屏障(BBB)穿透性化合物先前不可用，所以尚未開發(fā)針對(duì)AD的p38MAPKα拮抗劑。鑒于P38MAPK抑制劑對(duì)促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生所具有的已知作用，它們另外已作為消炎劑在廣泛范圍的非CNS疾病(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、COPD)中加以評(píng)估。因此，對(duì)開發(fā)穿透BBB，作為AD和其他神經(jīng)病狀的治療劑的p38MAPKα拮抗劑仍然存在重要未滿足需要。

附圖說明

圖1描繪莫里斯水迷宮測(cè)試的潛伏時(shí)間結(jié)果的變化，在高齡大鼠中比較0.5mg/kg、1.5mg/kg和4.5mg/kg劑量的VX-745。

圖2描繪莫里斯水迷宮測(cè)試的距離結(jié)果的變化，在高齡大鼠中比較0.5mg/kg、1.5mg/kg和4.5mg/kg劑量的VX-745。

圖3描繪VX-745的蛋白質(zhì)水平。

圖4描繪在0.5mg/kg、1.5mg/kg和4.5mg/kg劑量的VX-745下，VX-745的中值血漿濃度。

圖5描繪在缺血性中風(fēng)之后肢體放置以及7分和20分神經(jīng)評(píng)分的功能恢復(fù)結(jié)果，在高齡大鼠中比較0.5mg/kg、1.5mg/kg和4.5mg/kg劑量的VX-745。

圖6描繪在缺血性中風(fēng)之后圓筒測(cè)試的功能恢復(fù)結(jié)果，在高齡大鼠中比較0.5mg/kg、1.5mg/kg和4.5mg/kg劑量的VX-745。

具體實(shí)施方式

定義

載體：術(shù)語“載體”是指可并入含有活性劑(例如p38抑制劑)的組合物中而不顯著干擾所述藥劑的穩(wěn)定性和/或活性(例如所述藥劑的生物活性)的任何化學(xué)實(shí)體。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“載體”是指藥學(xué)上可接受的載體。本文中的一示例性載體是水。

組合。如本文所用，術(shù)語“組合(combination/combined)”和相關(guān)術(shù)語是指受試者同時(shí)暴露于兩種或更多種本發(fā)明的治療劑。舉例來說，本發(fā)明的藥劑(例如p38抑制劑)可與另一治療劑同時(shí)或依序以單獨(dú)單位劑型或一起以單一單位劑型加以施用。因此，本發(fā)明尤其提供涉及施用至少本發(fā)明的藥劑(例如p38抑制劑)、另一治療劑和藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或媒介物(所述藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或媒介物通常與所述p38抑制劑和所述另一治療劑中的一者或兩者締合)的給藥方案。

制劑。術(shù)語“制劑”是指用于向患者施用的包括至少一種活性劑(例如VX-745)以及一種或多種載體、賦形劑或其他藥物添加劑的組合物。一般來說，特定載體、賦形劑和/或其他藥物添加劑是根據(jù)本領(lǐng)域中的知識(shí)加以選擇以實(shí)現(xiàn)活性劑的所需穩(wěn)定性、釋放、分布和/或活性，并且其應(yīng)適于特定施用途徑。

中等劑量。如本文所用的術(shù)語“中等劑量”是指VX-745的向血流中遞送，足以抑制在細(xì)胞因子和其他受體活化之后p38MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件，但低于VX-745的治療有效量以對(duì)通過降低細(xì)胞因子產(chǎn)生達(dá)成的消炎作用產(chǎn)生抑制的劑量。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“中等劑量”是指實(shí)現(xiàn)血液濃度是為減輕炎癥和治療除本發(fā)明的神經(jīng)病癥以外的病癥所需的血液濃度的一半、三分之一、四分之一、五分之一、六分之一、七分之一、八分之一的劑量。舉例來說，VX-745在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)的平均血液濃度是約75ng/mL，這與VX-745抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生(消炎活性)的全血IC50是65-80ng/mL一致。在一些實(shí)施方案中，VX-745的“中等劑量”提供血液濃度在約15與45ng/mL之間，或在20與約40ng/mL之間，或在約25與約35ng/mL之間，或在約30與約40ng/mL之間，其中所述血液濃度實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的抑制而非對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制。

胃腸外。如本文所用的術(shù)語“胃腸外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、病變內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。優(yōu)選地，口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用組合物。本發(fā)明組合物的無菌可注射形式可為水性或油性混懸液。這些混懸液可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，使用適合分散劑或濕潤(rùn)劑和混懸劑配制。無菌可注射制劑也可為于無毒胃腸外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或混懸液，例如呈于1,3-丁二醇中的溶液形式。在可采用的可接受的媒介物和溶劑之中的是水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等張氯化鈉溶液。此外，無菌不揮發(fā)性油常規(guī)用作溶劑或混懸介質(zhì)。

患者。如本文所用的術(shù)語“患者”意指向其施用制劑或包含制劑的組合物的哺乳動(dòng)物，并且在一些實(shí)施方案中包括人。

藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或媒介物。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或媒介物”是指不破壞它與其一起配制的化合物的藥理學(xué)活性的無毒載體、佐劑或媒介物?？捎糜诒景l(fā)明組合物中的藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或媒介物包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白質(zhì)(諸如人血清白蛋白)、緩沖物質(zhì)(諸如磷酸鹽)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)(諸如硫酸魚精蛋白(protamine sulfate))、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

治療劑。如本文所用，短語“治療劑”是指在向生物體施用時(shí)引發(fā)所需生物或藥理學(xué)作用的任何藥劑。

治療有效量和有效量。如本文所用，并且除非另外規(guī)定，否則術(shù)語藥劑的“治療有效量”和“有效量”是指足以在治療、預(yù)防和/或管理疾病、病癥或病狀方面提供治療益處，例如用以使一種或多種與待治療的所述疾病、病癥或病狀相關(guān)的癥狀的發(fā)作延遲或使所述癥狀最小化(例如降低所述癥狀的發(fā)生和/或等級(jí))的量。在一些實(shí)施方案中，如果組合物含有在治療方案的情形下在以單次劑量形式施用時(shí)有效的量，那么它可被稱為含有“治療有效量”的藥劑。在一些實(shí)施方案中，治療有效量是在作為給藥方案的一部分施用時(shí)，在統(tǒng)計(jì)上有可能使疾病、病癥或病狀的一種或多種癥狀或副作用的發(fā)作延遲或使所述癥狀或副作用最小化(降低所述癥狀或副作用的發(fā)生和/或等級(jí))的量。

治療(Treat/Treating)。如本文所用的術(shù)語“治療”是指部分或完全緩和、抑制病癥、疾病或病狀或所述病癥、疾病或病狀的一種或多種癥狀或表現(xiàn)形式，延遲其發(fā)作，降低其發(fā)生，對(duì)其產(chǎn)生防治，對(duì)其進(jìn)行改善和/或減輕。

單位劑量。如本文所用的表述“單位劑量”是指制劑的適于待治療的受試者的物理離散單元(例如用于單次劑量)；各單元含有被選擇用以在根據(jù)治療方案，任選連同可以預(yù)定量提供的藥學(xué)上可接受的載體一起施用時(shí)產(chǎn)生所需治療作用的預(yù)定量的活性劑(應(yīng)了解多次劑量可能為實(shí)現(xiàn)所需或最優(yōu)作用所需)。單位劑量可為例如一定體積的含有預(yù)定量的一種或多種治療劑的液體(例如可接受的載體)、預(yù)定量的一種或多種呈固體形式的治療劑(例如片劑或膠囊)、含有預(yù)定量的一種或多種治療劑的持續(xù)釋放制劑或藥物遞送裝置等。應(yīng)了解除治療劑之外，單位劑量也可含有多種組分。舉例來說，可接受的載體(例如藥學(xué)上可接受的載體)、稀釋劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、防腐劑等可如下文所述加以包括。然而，應(yīng)了解，本發(fā)明制劑的總每日用量將由主治醫(yī)師在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)決定。用于任何特定受試者或生物體的特定有效劑量水平可取決于多種因素，包括所治療的病癥和病癥的嚴(yán)重性；所用特定活性化合物的活性；所用特定組合物；受試者的年齡、體重、總體健康、性別和膳食；所用特定活性化合物的施用時(shí)間和排泄速率；治療的持續(xù)時(shí)間；與所用特定化合物組合或同時(shí)使用的藥物和/或額外療法；以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中熟知的類似因素。在一些實(shí)施方案中，VX-745的單位劑量是約1mg、3mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg或50mg。

VX-745-一種p38MAPK抑制劑

許多細(xì)胞外刺激物，包括促炎性細(xì)胞因子和其他炎癥性介體，通過活化有絲分裂原活化的蛋白質(zhì)激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)路徑來引發(fā)特定細(xì)胞應(yīng)答。MAPK是靶向脯氨酸的絲氨酸-蘇氨酸激酶，其將環(huán)境刺激物轉(zhuǎn)導(dǎo)至核。一旦被活化，MAPK即通過磷酸化來活化其他激酶或核蛋白質(zhì)，包括潛在轉(zhuǎn)錄因子和底物。新型哺乳動(dòng)物再活化蛋白質(zhì)激酶(p38/RK)MAPK是應(yīng)激活化的蛋白質(zhì)激酶，其介導(dǎo)對(duì)細(xì)胞應(yīng)激和炎癥性信號(hào)的應(yīng)答。

新近人遺傳學(xué)數(shù)據(jù)指示阿爾茨海默氏病的主要驅(qū)動(dòng)因素是調(diào)控異常的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)炎癥。因?yàn)轶w外數(shù)據(jù)指示IL-1β-p38MAPK系統(tǒng)是小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞/炎癥的關(guān)鍵調(diào)控因素，所以p38MAPK被認(rèn)定為重要治療靶標(biāo)(Munoz,2010)。P38MAPK也在神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生，并且似乎在調(diào)節(jié)與神經(jīng)功能相關(guān)的神經(jīng)元內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件方面具有直接作用(McAfoose,2009；Correa,2012)。然而，由于血腦屏障(BBB)穿透性p38MAPK拮抗劑先前不可用，所以在慢性阿爾茨海默氏病模型中抑制p38MAPK的作用未知(Munoz,2010)。因此，先前也未知的是相對(duì)于抑制p38MAPK的其他作用，諸如對(duì)IL-1β或TNFα的神經(jīng)元內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的作用，抑制炎癥的相對(duì)重要性和作用。

p38MAPK在炎癥的各個(gè)階段中的作用已促使發(fā)現(xiàn)能夠抑制p38的若干化合物(SB203580、RWJ 67657、L-167307、VX-745、RPR200765A和其他化合物)。參見例如Kumar等,“p38MAP Kinases:Key Signaling Molecules as Therapeutic Targets for Inflammatory Diseases,”Nature Reviews,2:717-726(2003)；Brown等,“p38MAP kinase inhibitors as potential therapeutics for the treatment of joint degeneration and pain associated with osteoarthritis,”J.Inflammation 5:22(2008)，其各自的整體以引用的方式并入本文。這些藥理學(xué)抑制劑是導(dǎo)致體外和體內(nèi)抑制脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)產(chǎn)生的細(xì)胞因子抑制性消炎藥物，并且已根據(jù)假定是減輕炎癥的主要藥理學(xué)作用來開發(fā)；例如在臨床研究中，施用各劑量以實(shí)現(xiàn)血液濃度滿足或超過抑制細(xì)胞因子(IL-1β或TNFα)的全血IC50(用于達(dá)成50％最大作用的抑制濃度)。

VX-745是p38MAPK的選擇性小分子抑制劑，先前由Vertex Pharmaceuticals開發(fā)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。

VX-745對(duì)MAPK的抑制會(huì)阻斷炎癥性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的下游合成。VX-745的全血IC50是150至180nM，或在65與80ng/mL之間(Duffy,2011)。因?yàn)閂X-745在嚙齒動(dòng)物關(guān)節(jié)炎模型中展現(xiàn)顯著消炎活性，所以Vertex啟動(dòng)在人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的情況下的臨床研究。在用實(shí)現(xiàn)約75ng/m的平均血漿藥物濃度的250mg VX-745(b.i.d)治療的2期臨床中，顯著炎癥性標(biāo)志物降低和臨床改進(jìn)得以證明。然而，患者經(jīng)歷不利事件，包括胃腸影響(諸如腹瀉和腹部疼痛)和肝轉(zhuǎn)氨酶升高。此外，已知VX-745會(huì)穿透動(dòng)物中的血腦屏障(BBB)。實(shí)際上，VX-745實(shí)現(xiàn)的腦濃度是血漿中的1.7倍。經(jīng)受極高劑量的VX-745的動(dòng)物經(jīng)歷不利神經(jīng)影響，但這些不利事件未在人中觀察到。盡管確認(rèn)作為針對(duì)RA的治療劑用于抑制p38MAPK的概念驗(yàn)證，但VX-745被中斷以讓位于非血腦屏障穿透性化合物VX-702，其將允許針對(duì)諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病在腦外部更大抑制p38MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生，而不招致神經(jīng)副作用的風(fēng)險(xiǎn)。

在關(guān)節(jié)炎模型中利用VX-745作為參照化合物進(jìn)行的另一研究證明10mg/kg劑量的VX-745在抑制爪腫脹方面不如同其他測(cè)定化合物一樣有效。參見Chopra等,“Pharmacological profile of AW-814141,a novel,potent,selective and orally active inhibitor of p38MAP kinase,”International Immunopharmacology,10:467-473(2010)，其整體以引用的方式并入本文。

在一骨關(guān)節(jié)炎模型中，當(dāng)在50mg/kg下向大鼠施用時(shí)，相較于對(duì)照動(dòng)物，VX-745顯示統(tǒng)計(jì)顯著抑制膝部退化。也在痛覺過敏模型中測(cè)定VX-745，并且顯示當(dāng)在30mg/kg、10mg/kg和3mg/kg的劑量下向大鼠施用時(shí)，顯著抑制痛覺過敏應(yīng)答。研究者發(fā)現(xiàn)在3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg劑量下，小鼠展現(xiàn)痛覺過敏。然而，研究者在3mg/kg劑量下觀察到最小作用。參見Brown等,“p38MAP kinase inhibitors as potential therapeutics for the treatment of joint degeneration and pain associated with osteoarthritis,”J.Inflamm.,5:22(2008)，其整體以引用的方式并入本文。

在不希望受理論束縛下，據(jù)信p38抑制劑用以治療諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性炎癥性病狀的臨床失敗是由于炎癥性(細(xì)胞因子產(chǎn)生)路徑的冗余。所述冗余導(dǎo)致當(dāng)p38MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生被長(zhǎng)期抑制時(shí)，反饋環(huán)路被上調(diào)，從而導(dǎo)致總體缺乏功效。

本發(fā)明方法

在高齡26個(gè)月大的Tg2576小鼠中進(jìn)行的2周探索性研究中，以VX-745治療的小鼠比對(duì)照動(dòng)物具有更低淀粉狀蛋白斑塊載荷，但另外不能評(píng)估藥物作用，因?yàn)樯僭S炎癥是明顯的。這個(gè)信息與轉(zhuǎn)基因Aβ小鼠顯示代償性吞噬(消炎)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞表型的報(bào)道相結(jié)合，決定不在小鼠中進(jìn)行進(jìn)一步研究。作為替代，對(duì)于用以預(yù)測(cè)人劑量的深入劑量-響應(yīng)研究，選擇高齡大鼠模型；其中促炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加得以明確確定，并且因此更好反映人衰老和AD中的炎癥性環(huán)境(Barrientos,2012)。大鼠模型的另一優(yōu)勢(shì)是先前已確定在大鼠與人之間具有VX-745極其良好藥物動(dòng)力學(xué)-藥力學(xué)關(guān)聯(lián)(在大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎模型中的研究與人RA臨床試驗(yàn)之間)。在缺血性中風(fēng)后的功能恢復(fù)模型中進(jìn)行大鼠第二劑量-響應(yīng)研究。

驚人地，在兩個(gè)研究中，對(duì)神經(jīng)功能的最佳作用均處于中等劑量水平下，所述中等劑量水平實(shí)現(xiàn)血液濃度低于為抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生所需的血液濃度，并且因此不能產(chǎn)生消炎作用，但足以抑制p38MAP介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)事件。更驚人地，發(fā)現(xiàn)在腦中確實(shí)產(chǎn)生明顯消炎作用的較高劑量下對(duì)神經(jīng)功能的作用小于中等劑量水平的神經(jīng)功能作用。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涵蓋了解到VX-745用于抑制在細(xì)胞因子受體活化之后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的效能是用于抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生的效能的約兩倍；從而提供一種用以施用VX-745以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的抑制，以及與此相伴改進(jìn)神經(jīng)功能，而不抑制導(dǎo)致全身性消炎狀態(tài)的細(xì)胞因子產(chǎn)生的手段。

如上所述，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療有需要的患者的神經(jīng)病癥的方法，其包括向所述患者施用足以抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞因子產(chǎn)生的量的VX-745。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過施用足以抑制IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響IL-1β產(chǎn)生的量的VX-745來治療神經(jīng)病癥的方法。

如本文所用，術(shù)語“神經(jīng)病癥”是指以下中的任何一個(gè)或多個(gè)：阿爾茨海默氏病、輕度認(rèn)知障礙、血管性癡呆、路易體癡呆(Lewy Body Dementia)和癡呆；帕金森氏病(Parkinson’s Disease)；中風(fēng)后的功能恢復(fù)；額顳葉癡呆(FTD)和陣發(fā)性痙攣性截癱(PSP)和其他τ蛋白病變；認(rèn)知衰弱；慢性耳鳴；和亨廷頓氏病(Huntington's Disease)。在某些實(shí)施方案中，通過提供的方法來治療的神經(jīng)病癥選自阿爾茨海默氏病、輕度認(rèn)知障礙、血管性癡呆、路易體癡呆和癡呆癥；帕金森氏??；中風(fēng)后的功能恢復(fù)；額顳葉癡呆(FTD)和陣發(fā)性痙攣性截癱(PSP)和其他τ蛋白病變；認(rèn)知衰弱；慢性耳鳴；和亨廷頓氏病。

如本文所用，短語“足以抑制細(xì)胞因子(即IL-1β)信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞因子(即IL-1β)產(chǎn)生的量”是指VX-745的導(dǎo)致患者血液濃度小于為抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生所需的血液濃度的一半的劑量。在一些實(shí)施方案中，“足以抑制細(xì)胞因子(即IL-1β)信號(hào)傳導(dǎo)，不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞因子(即IL-1β)產(chǎn)生的量”是VX-745的導(dǎo)致患者血液濃度比為抑制細(xì)胞因子(即IL-1β)產(chǎn)生所需的血液濃度低50％，低60％，低70％，低80％或低90％的劑量。

如本文所用，短語“同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞因子(即IL-1β)產(chǎn)生”意指提供的方法導(dǎo)致VX-745的血液濃度不以可測(cè)量程度抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生。

在不希望受任何特定理論束縛下，本發(fā)明的一個(gè)方面是了解到VX-745在比為抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生所需的血液濃度低得多的血液濃度下實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。本發(fā)明的另一方面是了解到VX-745在其中細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)受抑制，但細(xì)胞因子產(chǎn)生不受影響的較低濃度下實(shí)現(xiàn)正性神經(jīng)影響。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種改進(jìn)認(rèn)知的方法，其包括施用足以抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞因子產(chǎn)生的量的VX-745。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過施用足以抑制IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響IL-1β產(chǎn)生的量的VX-745來改進(jìn)認(rèn)知的方法。

如本文所用，術(shù)語“改進(jìn)認(rèn)知”是指在任何神經(jīng)病癥的認(rèn)知衰退或其他認(rèn)知癥狀方面的任何可測(cè)量改進(jìn)，所述神經(jīng)病癥諸如阿爾茨海默氏病、輕度認(rèn)知障礙、血管性癡呆、路易體癡呆和癡呆癥；帕金森氏??；中風(fēng)后的功能恢復(fù)；額顳葉癡呆(FTD)和陣發(fā)性痙攣性截癱(PSP)和其他τ蛋白病變；認(rèn)知衰弱；慢性耳鳴；和亨廷頓氏病。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過施用足以抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞因子產(chǎn)生的量的VX-745來改進(jìn)神經(jīng)功能的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種通過施用足以抑制IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響IL-1β產(chǎn)生的量的VX-745來改進(jìn)神經(jīng)功能的方法。

在一些實(shí)施方案中，提供的方法包括在足以實(shí)現(xiàn)血液濃度導(dǎo)致抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的劑量下向有此需要的患者施用VX-745，但其中所述血液濃度不足以導(dǎo)致抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，提供的方法包括在足以實(shí)現(xiàn)血液濃度導(dǎo)致抑制IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)的劑量下向有此需要的患者施用VX-745，但其中所述血液濃度不足以導(dǎo)致抑制IL-1β產(chǎn)生。

在某些實(shí)施方案中，提供的方法包括在提供在約15與約45ng/mL之間的血液濃度的劑量下向有此需要的患者施用VX-745或其藥學(xué)上可接受的組合物。在一些實(shí)施方案中，提供的方法包括向有此需要的患者施用一定劑量的VX-745或其藥學(xué)上可接受的組合物，從而提供在約20與約40ng/mL之間，或在約25與約35ng/mL之間，或在約30與約40ng/mL之間的血液濃度。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療神經(jīng)病狀的方法，其包括向有此需要的患者施用一定劑量的VX-745或其藥學(xué)上可接受的組合物，從而提供在約15與45ng/mL之間，或在約20與約40ng/mL之間，或在約25與約35ng/mL之間，或在約30與約40ng/mL之間的血液濃度。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療神經(jīng)病狀的方法，其包括向有此需要的患者施用一定劑量的VX-745或其藥學(xué)上可接受的組合物，從而提供在約15與45ng/mL之間，或在約20與約40ng/mL之間，或在約25與約35ng/mL之間，或在約30與約35ng/mL之間的血液濃度，其中所述血液濃度實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的抑制而非對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制。

組合療法

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療神經(jīng)病癥的方法，其包括向受試者施用低劑量的VX-745以及一種或多種另一治療劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療神經(jīng)病癥的方法，其包括與一種或多種另一治療劑組合向受試者施用足以抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞因子產(chǎn)生的治療有效量的VX-745，所述治療劑選自膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸拮抗劑、維生素E、抗抑郁劑、抗焦慮劑、抗精神病藥、情緒穩(wěn)定劑和睡眠助劑。

代表性膽堿酯酶抑制劑包括不限于多奈哌齊(donepezil)利伐斯的明(rivastigmine)加蘭他敏(galantamine)和塔克林(tacrine)

代表性抗抑郁劑包括不限于丁氨苯丙酮(bupropion)西酞普蘭(citalopram)費(fèi)洛克汀(fluoxetine)米氮平(mirtazapine)帕羅西汀(paroxetine)舍曲林(sertraline)曲唑酮(trazodone)文拉法辛(venlafaxine)去甲替林(nortriptyline)和去甲丙咪嗪(desipramine)

代表性抗焦慮劑包括不限于勞拉西泮(lorazepam)和奧沙西泮(oxazepam)

代表性抗精神病藥包括不限于阿立哌唑(aripiprazole)氯氮平(clozapine)氟哌啶醇(haloperidol)奧氮平(olanzapine)喹硫平(quetiapine)利培酮(risperidone)和齊拉西酮(ziprasidone)

代表性情緒穩(wěn)定劑包括不限于卡馬西平(carbamazepine)和雙丙戊酸鹽(divalproex)

代表性睡眠助劑包括不限于唑吡旦(zolpidem)、扎來普隆(zaleplon)和水合氯醛(chloral hydrate)。

代表性N-甲基-D-天冬氨酸拮抗劑包括不限于美金剛胺(memantine)

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療神經(jīng)病癥的方法，其包括與一種或多種另一治療劑組合向受試者施用足以抑制細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，同時(shí)不實(shí)質(zhì)上影響細(xì)胞因子產(chǎn)生的治療有效量的VX-745，所述治療劑選自由以下組成的組：艾塞那肽(exenatide)伐侖克林(varenicline)、PF-04360365、利伐斯的明、LY450139、ST101、苔蘚抑素(bryostatin)、EVP-6124、阿托西汀(atomoxetine)、HF0220、白藜蘆醇(resveratrol)、加蘭他敏、PF-01913539、塞美司他(semagacestat)、3APS、免疫球蛋白、代姆博(dimebon)、α-生育酚、BAY85-8101、雌激素、孕酮、ACC-001、銀杏(ginko biloba)、尼麥角林(nicergoline)、吡乙酰胺(piracetam)、NIC5-15、扎利羅登(xaliproden)(SR57746A)、吲哚美辛(indomethacin)、DMXB-A、LY2062430、11-C PIB、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、依那西普(etanercept)、雷米普利(ramipril)、干擾素β-1a、辛伐他汀(simvastatin)、硫辛酸(lipoic acid)、魚油、姜黃素(curcumin)、PF-04447943、葉酸鹽、維生素B6、維生素B12、亮脯利特(leuprolide)、INM-176、AH110690、色氨酸、SK-PC-B70M、BMS-708163、依地普侖(escitalopram)、TRx0014、BAY94-9172、腦活素(cerebrolysin)、沒食子酸表沒食子兒茶素(epigallocatechin-galate)、SB-742457、鋰、羅格列酮(rosiglitazone)、雙丙戊酸鹽、SAR110894D、PRX-03140、CX516(安帕來斯(Ampalex))、煙酰胺、雷沙吉蘭(rasagiline)、AC-1202吲度酰胺(enduramide)、奈拉美仙(neramexane)、拉扎達(dá)恩(razadyne)、NS 2330他米巴羅汀(tamibarotene)、阿維A(acitretin)、哌甲酯(methylphenidate)、米非司酮(mifepristone)、ZT-1、AFFITOPE AD01、AFFITOPE AD02、GSK239512、GSK933776、SR57667B、PPI-1019、MPC-7869、AZD3480、PAZ-417、蘇蘭珠單抗(solanezumab)、馬賽替尼(masitinib)(AB1010)、BAY1006578、二十二碳六烯酸、QS-21、MNI-558、利憶靈緩釋劑(reminyl retard)、氟美他芬(flutemetamol)、雌二醇、甲孕酮、丙戊酸鹽、T-817MA、AZD1446、AAB-003(PF-05236812)、莫達(dá)非尼(modafinil)、雷洛昔芬(raloxifene)、阿托伐他汀(atorvastatin)、多西環(huán)素(doxycycline)、曲唑酮(trazadone)、羥丁酸鈉、石杉?jí)AA(huperzine A)、葉黃素(lutein)、玉米黃質(zhì)(zeaxanthin)、AC-3933、右旋安非他明(dextroamphetamine)、EPAX 1050TG、SRA-333、MNI-168、CAD106、SGS742、NP031112、SSR180711C、GSI-953、哌唑嗪(prazosin)、MEM 1003、AndroGel、AVE1625、環(huán)磷酰胺酯(cyclophosphamate)、TC-5619-238、MK0249、來考佐坦(lecozotan)、舍卡丁(circadin)、MEM 3454、PPI-1019、UB 311、PF-04494700、ABT-089、LY451395、E2020、羅非昔布(Rofecoxib)、PF-03654746、EHT 0202依地唑酯(etazolate)、DCB-AD 1、ONO-2506PO、甘特如單抗(gantenerumab)、氟貝塔帕(florbetapir)、ELND005、潑尼松(prednisone)、諾瓦索(novasoy)、人參、匹格列酮(pioglitazone)、辛炔、ABT-288、ABT-384、奈非西坦(nefiracetam)、AQW051、匹伐他汀(Pitavastatin)、萘普生鈉(naproxen sodium)氯諾昔康(lornoxicam)、AN-1792、SR57667B、褪黑素(melatonin)、SAM-531、MK0952、MK0677、IFN-α2A、BAY 94-9172、PYM50028、來考佐坦SR、沙利度胺(thalidomide)、曲米沙特(tramiprosate)、FK962、IVIG、RO5313534、聯(lián)苯蘆諾(bifeprunox)、LNK-754、ELND005、NSA-789、雷美爾通(ramelteon)、氟比他班(Florbetaben)、SRA-444、VP4896、塞來昔布(celecoxib)、氫可酮(hydrocodone)、GSI-136、唑吡旦(Zolpidem)、MK3328、二甲雙胍(metformin)、CTS21166、依隆曲(elontril)、布洛芬(ibuprofen)、酒石酸泊斯芬(posiphen tartrate)、JNJ-39393406、睪固酮(testosterone)、BRL-049653、BMS-708163、SAM-315、酮康唑(ketoconazole)、氟康唑(fluconazole)、華法林(warfarin)、E2609、AZD0328、LY2886721、CHF 5074、E2212、乙酰胺酚(acetaminophen)、LY2811376、ABT-126、褪黑素、GSK1034702、阿莫達(dá)非尼(armodafinil)、德巴科特(depakote)、吉非羅齊(gemfibrozil)、AL-108、左乙拉西坦(levetiracetam)和奎納克林(quinacrine)。

藥物組合物

在一些實(shí)施方案中，提供的方法包括向患者施用包含VX-745以及一種或多種治療劑和藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或媒介物的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含一定劑量的VX-745以及一種或多種治療劑和藥學(xué)上可接受的載體、佐劑或媒介物的藥物組合物，其中所述劑量的VX-745導(dǎo)致血液濃度在約5與45ng/mL之間，在約10與45ng/mL之間，在約15與45ng/mL之間，或在約20與約40ng/mL之間，或在約25與約35ng/mL之間，或在約30與約40ng/mL之間。在一些實(shí)施方案中，VX-745的劑量導(dǎo)致血液濃度在約5與35ng/mL之間，在約10與30ng/mL之間，在約10與25ng/mL之間，在約5與20ng/mL之間，或在約10與20ng/mL之間。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物被配制供口服施用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物可以任何口服可接受的劑型口服施用，所述劑型包括但不限于膠囊、囊片、片劑、水性混懸液或溶液。在供口服使用的片劑的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常也添加諸如硬脂酸鎂的潤(rùn)滑劑。對(duì)于以膠囊形式口服施用，適用稀釋劑包括乳糖和干燥玉米淀粉。當(dāng)水性混懸液為口服使用所需時(shí)，使活性成分與乳化劑和混懸劑組合。必要時(shí)，也可添加某些甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。

與載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生呈單一劑型的組合物的本發(fā)明化合物的量將視患者和特定施用模式而變化。優(yōu)選地，應(yīng)配制提供的組合物以使可向接受這些組合物的患者施用1-50mg/天之間的劑量的VX-745。組合物的實(shí)例包括被配制以向接受這些組合物的患者施用每天1-10mg、10-25mg或25-50mg之間的劑量的VX-745的組合物。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，組合物包括被配制以向接受這些組合物的患者施用每天3-5mg、5-10mg、10-20mg、20-30mg、30-40mg或40-50mg之間的劑量的抑制劑的組合物。在一些實(shí)施方案中，將組合物配制成含有1mg、3mg、5mg、10mg、20mg、25mg、30mg或50mg活性組分的劑量。用于這些制劑的給藥方案可包括但不限于單次施用給藥、每日一次、兩次或三次給藥、每周給藥和每月給藥。在一些實(shí)施方案中，配制提供的組合物以提供40mg/天的VX-745。

也應(yīng)了解用于任何特定患者的特定劑量和治療方案將取決于多種因素，包括所用特定化合物的活性、年齡、體重、總體健康、性別、膳食、施用時(shí)間、排泄速率、藥物組合、以及治療醫(yī)師的判斷和所治療特定疾病的嚴(yán)重性。本發(fā)明化合物在組合物中的量也將取決于組合物中的特定化合物。

例示

實(shí)施例1-莫里斯水迷宮(Morris Water Maze)

背景

新近人遺傳學(xué)數(shù)據(jù)指示阿爾茨海默氏病的主要驅(qū)動(dòng)因素是調(diào)控異常的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)炎癥。此外，體外數(shù)據(jù)指示IL-1β-p38MAPK系統(tǒng)可通過影響神經(jīng)元中的長(zhǎng)期增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)期抑制(LTD)來影響記憶(McAfoose,2009)；并且p38MAPK已被鑒定為寡聚Aβ抑制LTP的介體(Li,2011)。然而，由于血腦屏障(BBB)穿透性p38MAPK拮抗劑先前不可用，所以在慢性阿爾茨海默氏病模型中抑制p38MAPK的作用未知(Munoz,2010)。此外，未知的是相對(duì)于神經(jīng)元內(nèi)p38MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)，p38MAPK在以下方面的相對(duì)重要性以及抑制p38MAPK對(duì)以下方面的作用：p38MAPK介導(dǎo)由小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-1β和TNFα)。

VX745(BBB穿透選擇性p38MAPKα拮抗劑)抑制IL-1β產(chǎn)生與信號(hào)傳導(dǎo)兩者，其中對(duì)于信號(hào)傳導(dǎo)的效能要高兩倍。為在先前非CNS臨床經(jīng)驗(yàn)之后關(guān)于阿爾茨海默氏病進(jìn)行重新定位，在高齡大鼠模型中；以及在大鼠缺血性中風(fēng)后的功能恢復(fù)模型中進(jìn)行的第二支持性研究中測(cè)試VX-745。

目的

這個(gè)研究的主要目標(biāo)在于探究用化合物VX-745預(yù)治療是否緩和高齡大鼠的認(rèn)知缺陷。在研究結(jié)束時(shí)，用LC-MS/MS測(cè)定在給藥后1小時(shí)收集的樣品的VX-745血漿濃度。此外，通過特異性ELISA測(cè)定來分析腹側(cè)皮質(zhì)和海馬中的PSD95蛋白質(zhì)水平以及海馬中的IL-1β水平以評(píng)估VX-745在腦中的潛在消炎作用。

方法

總共60只雌性高齡(20-24個(gè)月)和15只幼小成體雌性Fischer大鼠(2-3個(gè)月)用于實(shí)驗(yàn)。1天兩次以口服管飼用媒介物或0.5、1.5或4.5mg/kg VX-745治療大鼠直至取樣(23天)。在開始治療之后1周，用莫里斯水迷宮(MWM)分析學(xué)習(xí)和記憶缺陷。

測(cè)試動(dòng)物

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都根據(jù)國立衛(wèi)生研究院(National Institute of Health，NIH)關(guān)于護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的指導(dǎo)方針進(jìn)行，并且由芬蘭國立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)(Animal Experiment Board,Finland)核準(zhǔn)。總共60只雌性高齡(20-24個(gè)月)和15只幼小(2-3個(gè)月)成體雌性Fischer大鼠(Charles River,France)用于實(shí)驗(yàn)。在標(biāo)準(zhǔn)溫度(22±1℃)下以及在控制光照環(huán)境(從7am至8pm開啟光照)中舍飼動(dòng)物，其中隨意獲取食物和水。如下將動(dòng)物分組：

●組1：15只高齡大鼠，用媒介物口服治療(BID)

●組2：15只高齡大鼠，用VX-745(0.5mg/kg)口服治療(BID)

●組3：15只高齡大鼠，用VX-745(1.5mg/kg)口服治療(BID)

●組4：15只高齡大鼠，用VX-745(4.5mg/kg)口服治療(BID)

●組5：15只幼小成體對(duì)照大鼠，用媒介物口服治療(BID)

藥物遞送和大鼠標(biāo)識(shí)

將大鼠基于它們的體重和可見平臺(tái)預(yù)訓(xùn)練表現(xiàn)同等分配至治療組中以確保良好學(xué)習(xí)者與不良學(xué)習(xí)者兩者均同等存在于所有治療組中。1天兩次通過口服管飼來給與治療直至取樣。媒介物是1％普洛尼克(Pluronic)F108，并且給藥體積是5ml/kg。在測(cè)試前時(shí)期，在7-9am和3-5pm進(jìn)行媒介物和測(cè)試化合物的施用。在行為測(cè)試當(dāng)天，至少在第一測(cè)試試驗(yàn)之前1小時(shí)給與治療。根據(jù)由發(fā)起人提供的指示配制和儲(chǔ)存測(cè)試化合物。將大鼠用永久性標(biāo)記對(duì)尾部進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記。關(guān)于治療組和每日治療時(shí)間做記錄。

莫里斯水迷宮

水迷宮任務(wù)最初由Morris等人(J Neurosci Methods.1984；11:194 47–60)設(shè)計(jì)。測(cè)試在填充有清水的大型深色槽(直徑是200cm)中在25.0±1.0℃的溫度下進(jìn)行。將浸沒平臺(tái)(正方形平臺(tái)：10x 10cm；水面下1.5cm)放置在NW象限的中部。在池邊緣上任意定位標(biāo)以N、NE、E、SE、S、SW、W、NW的起始位置。將大鼠以它們的鼻部指向一個(gè)起始點(diǎn)處的池壁的方式下降至池中。不使用鄰近于平臺(tái)位置的釋放點(diǎn)(NW)。

在開始化合物治療之前，進(jìn)行可見平臺(tái)預(yù)訓(xùn)練以確定是否存在可能影響在定位或探索試驗(yàn)時(shí)的表現(xiàn)的任何非認(rèn)知表現(xiàn)損害(例如視覺損害和/或游泳困難)。在完成可見平臺(tái)預(yù)訓(xùn)練之后，分析數(shù)據(jù)，并且將大鼠基于它們的預(yù)訓(xùn)練表現(xiàn)分配至不同治療組中。進(jìn)行這個(gè)程序以確保在暗示形式的水迷宮任務(wù)中，各治療組同等地由良好表現(xiàn)者與不良表現(xiàn)者兩者組成。

采集訓(xùn)練–第1周(第8-11天)和第2周(第15-18天)：在完成暗示試驗(yàn)之后，執(zhí)行采集(定位)試驗(yàn)以確定大鼠學(xué)習(xí)遠(yuǎn)端暗示與對(duì)于所有定位試驗(yàn)都保持在相同位置中的浸沒逃離平臺(tái)之間的空間關(guān)系的能力。起始點(diǎn)是隨機(jī)的(不使用NW)。大鼠持續(xù)4天/周每天接受4次試驗(yàn)(相隔15分鐘，各次試驗(yàn)最多60秒)。評(píng)估潛伏時(shí)間和路徑長(zhǎng)度(距離)。

探索實(shí)驗(yàn)(第19天)：在最后的定位試驗(yàn)之后24小時(shí)進(jìn)行單次探索實(shí)驗(yàn)以評(píng)估記憶保留。將平臺(tái)從池移除，并且將大鼠放置至池中與之前放置平臺(tái)的象限相對(duì)的象限中。使大鼠在無平臺(tái)的情況下游泳60秒。在探索實(shí)驗(yàn)期間，測(cè)量在目標(biāo)象限和目標(biāo)平臺(tái)環(huán)形區(qū)(在平臺(tái)周圍的直徑36cm的環(huán)狀區(qū)域)中花費(fèi)的時(shí)間以及跨越目標(biāo)平臺(tái)位置的次數(shù)。VX-745治療在任何探索參數(shù)方面都不存在正性或負(fù)性作用，并且因此另外不在本申請(qǐng)中討論。

關(guān)于PK 257的終點(diǎn)、血液樣品和組織處理

在末次媒介物或VX-745早晨給藥之后1小時(shí)，用戊巴比妥(pentobarbital)使動(dòng)物(每個(gè)給藥組10個(gè)動(dòng)物)深度麻醉，并且通過心臟穿刺來收集血液樣品。將500μl血液收集至EDTA微管中，離心并收集血漿。用肝素化鹽水灌注腦，并且收集腦。通過在含4％PFA的0.1M PB中浸漬24小時(shí)來后固定右側(cè)半球。在用磷酸鹽緩沖液短暫洗滌之后，將半球低溫保護(hù)在含30％蔗糖的PB中2-3天，此后在液氮的情況下將它冷凍并儲(chǔ)存在-80℃下以供任選未來免疫組織化學(xué)分析。解剖左側(cè)半球以獲得腹側(cè)和背側(cè)皮質(zhì)、海馬和剩余腦部分，并且在干冰的情況下新鮮冷凍。

使用ELISA試劑盒(Cusabio Biotech Ltd.，#CSB-EL006938RA，批號(hào)O31154387)分析皮質(zhì)和海馬可溶性提取物中的PSD95含量，同時(shí)僅分析來自海馬的Il-1β的水平(R&D Systems，#RLB00，批號(hào)308544)。

使用乙腈沉淀來處理血漿樣品，接著通過LC-MS/MS來分析VX745藥物濃度。

結(jié)果

以媒介物治療的幼小大鼠顯示有效學(xué)習(xí)，其中在依序測(cè)試的情況下，MWM潛伏時(shí)間/距離快速降低。以媒介物治療的高齡大鼠似乎在認(rèn)知方面受損害，在研究期間展現(xiàn)比幼小大鼠更久的時(shí)間和更長(zhǎng)的距離以及少許改進(jìn)。以VX-745治療的高齡大鼠展現(xiàn)較大漸進(jìn)性游泳時(shí)間和距離縮短，這是認(rèn)知表現(xiàn)改進(jìn)的跡象。對(duì)于潛伏時(shí)間與距離兩者，1.5mg/kg劑量的VX-745具有最大作用，其中在最后的第17測(cè)試日，這組大鼠的表現(xiàn)近似等于以媒介物治療的幼小大鼠的表現(xiàn)。相較于以媒介物治療的高齡大鼠，1.5mg/kg劑量組在第17天關(guān)于潛伏時(shí)間與距離兩者均顯示統(tǒng)計(jì)顯著更好表現(xiàn)(p分別＝0.013和0.0.019)。參見圖1。此外，就距離而言，在第一測(cè)試日存在顯著較糟表現(xiàn)(p＝0.018)，此外也在通過比較從第一測(cè)試日至最后一個(gè)測(cè)試日在潛伏時(shí)間和距離方面的變化進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之后分析數(shù)據(jù)；同樣通過這個(gè)分析，以1.5mg/kg治療的高齡大鼠表現(xiàn)顯著好于以媒介物治療的高齡大鼠，其中對(duì)于潛伏時(shí)間變化，p＝0.007，并且對(duì)于距離變化，p＝0.012。參見圖2。

PSD95是一種存在于突觸后結(jié)構(gòu)中，被認(rèn)為促進(jìn)保證突觸后應(yīng)答的受體和離子通道的群集的蛋白質(zhì)。已顯示PSD95水平在阿爾茨海默氏病中降低，并且當(dāng)用消炎劑治療時(shí)，在動(dòng)物模型中增加(Frautchy,2001)。對(duì)PSD95蛋白的分析顯示相較于以媒介物治療的高齡組，存在VX-745高劑量(4.5mg/kg)組中PSD95水平較高的統(tǒng)計(jì)趨勢(shì)(根據(jù)曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)(Mann-Whitney rank sum test)，p＝0.063)。

對(duì)海馬中IL-1β水平的分析指示存在在高齡大鼠中水平較高的趨勢(shì)。在VX-745高劑量(4.5mg/kg)組中，IL-1β水平類似于幼小大鼠的水平，并且相對(duì)于以媒介物治療的高齡組較低(根據(jù)曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)，p＝0.038)。

1.5mg/kg劑量水平對(duì)PSD95或IL-1β不存在明顯影響，所述水平另外顯示在莫里斯水迷宮測(cè)試中的表現(xiàn)顯著改進(jìn)；從而指示在這個(gè)劑量水平下在莫里斯水迷宮測(cè)試層面上的作用不由抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生介導(dǎo)(即不通過消炎作用介導(dǎo))。參見圖3。

在末次劑量之后1小時(shí)的VX-745血漿藥物水平以劑量比例方式增加。參見圖4?；谟上惹芭R床前研究獲得的已知大鼠中血漿藥物概況，在穩(wěn)態(tài)下，給藥后1小時(shí)水平應(yīng)接近穩(wěn)態(tài)C平均值(C_AVG)。作為先前事項(xiàng)，先前未公開的研究指示VX-745在人系統(tǒng)中用于抑制IL-1β產(chǎn)生的IC50約為用于抑制IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)的IC50的一半，1.5mg/kg達(dá)到為阻斷IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)所需的藥物濃度；僅4.5mg/kg達(dá)到超過針對(duì)IL-1β產(chǎn)生的全血IC50的濃度。

結(jié)論

本發(fā)明部分涉及發(fā)現(xiàn)在不足以產(chǎn)生消炎作用的劑量水平下，在慢性阿爾茨海默氏病動(dòng)物模型中抑制p38MAPK具有正性認(rèn)知作用。與那個(gè)研究結(jié)果一致，PK/PD關(guān)聯(lián)指示所述作用由抑制IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)，而非由遏制IL-1β產(chǎn)生介導(dǎo)。

實(shí)施例2

大鼠短暫MCAO–功能恢復(fù)

這個(gè)研究的目標(biāo)在于探究在阻塞后48小時(shí)開始用VX-745長(zhǎng)期1天兩次治療是否在于第0天經(jīng)受120分鐘大腦中動(dòng)脈阻塞(tMCAO)的大鼠中提供感覺-運(yùn)動(dòng)恢復(fù)和神經(jīng)保護(hù)。在缺血后第1、3、7、14、21、28、35和42天進(jìn)行7分和20分神經(jīng)評(píng)分測(cè)試以研究感覺-運(yùn)動(dòng)缺陷和一般狀況。在缺血后第7、14、21和35天進(jìn)行圓筒測(cè)試，并且在第1、3、7、14、21、28、35和42天進(jìn)行肢體放置測(cè)試。

在缺血后24小時(shí)通過T2-MRI評(píng)估梗塞體積，并且在第2天基于病變數(shù)據(jù)將大鼠分配至治療組中并在MRI之后在第2天開始治療。

方法–在120分鐘tMCAO之后48小時(shí)開始，使雄性Sprague-Dawley大鼠經(jīng)受用VX-745 1天兩次長(zhǎng)期治療。在24小時(shí)用MRI測(cè)量病變尺寸，并且在第2天(在第0天進(jìn)行tMCAO)基于病變尺寸和肢體放置結(jié)果將大鼠分配至給藥組中。將大鼠用2種不同劑量治療，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)受感覺運(yùn)動(dòng)行為測(cè)試。在阻塞之前以及在缺血后第1、3、7、14、21、28、35和42天進(jìn)行7分和20分神經(jīng)評(píng)分和肢體放置測(cè)試以研究感覺-運(yùn)動(dòng)缺陷和一般狀況。在阻塞之前以及在缺血后第7、14、21和35天進(jìn)行圓筒測(cè)試。

動(dòng)物。購自Charles River Laboratories(Sulzfeld,Germany)，并且稱重250-300g的總共45只成體雄性Sprague Dawley大鼠用于實(shí)驗(yàn)。在標(biāo)準(zhǔn)溫度(22±1℃)下以及在控制光照環(huán)境(從7am至8pm開啟光照)中舍飼動(dòng)物，其中隨意獲取食物和水。

如下將動(dòng)物分組：

■組A：15個(gè)tMCAO動(dòng)物從第2天至第42天用媒介物1天兩次治療(5ml/kg，口服)

■組B：15個(gè)tMCAO動(dòng)物從第2天至第42天用VX-745 1天兩次治療(1.5mg/kg，口服)。

■組C：15個(gè)tMCAO動(dòng)物從第2天至第42天用VX-745 1天兩次治療(4.5mg/kg，口服)。

短暫MCAO

在第0天根據(jù)Koizumi，在修改的情況下通過MCA阻塞來在雄性Sprague-Dawley大鼠中產(chǎn)生短暫灶性腦缺血(Koizumi等Jpn.J.Stroke 8:1-8,1986)。用5％異氟烷(于70％N₂O和30％O₂中；流速300ml/min)使大鼠麻醉。在手術(shù)期間，使麻醉劑的濃度降低至1.0-2.0％。用恒溫毯系統(tǒng)使直腸溫度維持在37.0±1.0℃下。在中線皮膚切開之后，使右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)暴露，并且遠(yuǎn)離頸動(dòng)脈分叉結(jié)扎頸外動(dòng)脈(ECA)。將具有鈍化尖端的0.22mm直徑單絲尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)中22-23mm直至MCA的起點(diǎn)。在單絲插入之后，用縫合線阻塞CCA 2小時(shí)。在缺血120分鐘之后，通過移除絲線和縫合線來恢復(fù)MCA血流。將創(chuàng)傷閉合，消毒，并且使動(dòng)物從麻醉恢復(fù)。在tMCAO之后，仔細(xì)監(jiān)測(cè)大鼠的可能手術(shù)后并發(fā)癥。在tMCAO之后，將大鼠用混懸在自來水中的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室膳食喂養(yǎng)。為防止脫水，所有大鼠都根據(jù)需要給與1天一次或兩次腹膜內(nèi)注射鹽水(每只大鼠4mL)。

藥物遞送。在MRI之后在缺血后48小時(shí)(即第2天)開始口服施用(5ml/kg)VX-745或媒介物，并且繼續(xù)1天兩次(早晨和下午)直至第42天終點(diǎn)。

總體健康狀態(tài)和人道終點(diǎn)。由實(shí)驗(yàn)室人員1天兩次監(jiān)測(cè)動(dòng)物。在動(dòng)物的總體健康狀態(tài)顯著惡化的情況下，用過度劑量的CO2終結(jié)大鼠，并且斬首?？山邮艿慕K點(diǎn)的定義包括：在24小時(shí)觀察時(shí)期中不自發(fā)運(yùn)動(dòng)以及不能飲用或進(jìn)食、大量流血、自發(fā)炎癥、解剖結(jié)構(gòu)缺失、腫脹或腫瘤大于20mm、以及不能在30秒時(shí)期中恢復(fù)常態(tài)。

治療分配

在tMCAO之后24小時(shí)(即第1天)對(duì)所有大鼠進(jìn)行體內(nèi)MRI采集。使用絕對(duì)T2-MRI確定病變尺寸、組織活力(T2在數(shù)毫秒內(nèi))和腦水腫。在第2天基于病變數(shù)據(jù)將大鼠分配至治療組中，并且在第2天開始治療。

20分神經(jīng)評(píng)分

20分神經(jīng)評(píng)分測(cè)試用于評(píng)估缺血后運(yùn)動(dòng)和行為缺陷。在中風(fēng)前(基線)以及在缺血后第1、3、7、14、21、28、35和42天由不知情的研究者進(jìn)行神經(jīng)測(cè)試。

分析以下參數(shù)：

●爪放置(最高4分)

●翻正反射(最高1分)視覺前爪伸展(最高2分)

●轉(zhuǎn)圈(最高4分)

●對(duì)側(cè)(最高1分)

●抓握強(qiáng)度(最高2分)

●運(yùn)動(dòng)性(最高3分)

●一般狀況(最高3分)

●正常大鼠的最高評(píng)分是20分。

7分神經(jīng)評(píng)分

同時(shí)，7分神經(jīng)評(píng)分測(cè)試用于評(píng)估缺血后運(yùn)動(dòng)和行為缺陷(根據(jù)Zausinger等,2000修改)。在中風(fēng)前(基線)以及在缺血后第1、3、7、14、21、28、35和42天由不知情的研究者進(jìn)行神經(jīng)測(cè)試。

●6級(jí)：當(dāng)通過尾部溫和提升時(shí)，兩個(gè)前肢均朝向地面正常延伸。

●5級(jí)：受損半球?qū)?cè)的前肢始終彎曲，從輕度腕彎曲和肩部?jī)?nèi)收至呈現(xiàn)以完全腕、肘彎曲和肩部的內(nèi)收伴內(nèi)旋的重度姿態(tài)進(jìn)行變化。

●4級(jí)：對(duì)朝向局部麻痹側(cè)的側(cè)向推動(dòng)具有始終降低的抗性的功能異常大鼠。

●3級(jí)：如果通過尾部牽拉和提升，那么朝向局部麻痹側(cè)轉(zhuǎn)圈的大鼠。

●2級(jí)：如果通過尾部牽拉，那么朝向局部麻痹側(cè)轉(zhuǎn)圈的大鼠。

●1級(jí)：朝向局部麻痹側(cè)自發(fā)轉(zhuǎn)圈的大鼠。

●0級(jí)：不自發(fā)運(yùn)動(dòng)的大鼠。

肢體放置測(cè)試

肢體放置測(cè)試用于評(píng)估前肢和后肢對(duì)觸覺和本體感受性刺激的應(yīng)答的感覺-運(yùn)動(dòng)統(tǒng)合(de Ryck等,1989；Jolkkonen等,2000)。在tMCAo之前(基線)以及在缺血后第1、5、7、14、21、28和35天由不知情的研究者進(jìn)行肢體放置測(cè)試。

測(cè)試具有7個(gè)肢體放置任務(wù)，其被如下評(píng)分：

●2分，大鼠正常表現(xiàn)；

●1分，大鼠延遲(>2秒)和/或不完全表現(xiàn)

●0分，大鼠不正常表現(xiàn)

●身體的兩側(cè)均加以測(cè)試。

在第一任務(wù)中，將大鼠懸吊在工作臺(tái)表面上方10cm處。非病變大鼠朝向工作臺(tái)伸出兩個(gè)前肢。在第二任務(wù)的情況下，將大鼠面向工作臺(tái)固持，使它的前肢擱置在工作臺(tái)邊緣上。向下溫和牽拉前肢，離開工作臺(tái)，并且檢查隨后復(fù)原和肢體放置。非病變大鼠將兩個(gè)肢體重新放置在工作臺(tái)上。第三任務(wù)與第二任務(wù)相同，例外之處是大鼠不能看見工作臺(tái)或進(jìn)行觸須接觸，因?yàn)橄蛏弦?5°角固持頭部。接著沿工作臺(tái)邊緣放置大鼠以檢查前肢(第四任務(wù))和后肢(第五任務(wù))的側(cè)向放置。如任務(wù)2中所述向下牽拉肢體，并且對(duì)肢體復(fù)原相應(yīng)評(píng)分。在第六任務(wù)中，將大鼠以它們的后端處于工作臺(tái)的邊緣加以放置，其中后肢擱置在工作臺(tái)邊緣上。向下溫和牽拉后肢(1次1個(gè))并離開工作臺(tái)。必要時(shí)，可通過朝向工作臺(tái)邊緣推動(dòng)動(dòng)物來刺激肢體復(fù)原至工作臺(tái)邊緣上的原始擱置位置。在第七任務(wù)中，將大鼠放置在工作臺(tái)邊緣，背向工作臺(tái)表面。將大鼠的前肢放置在工作臺(tái)的邊緣上，并且從后面朝向邊緣溫和推動(dòng)大鼠。受損大鼠不能保持它們的抓握，并且受損肢體從邊緣滑脫。正常大鼠的最高評(píng)分是14分。

圓筒測(cè)試。

圓筒測(cè)試(根據(jù)Schallert和Tillerson,Innovative models of CNS disease:from molecule to therapy.Clifton,NJ,Humana,1999修改)用于定量當(dāng)動(dòng)物對(duì)著舍籠壁站立時(shí)前肢使用不對(duì)稱性。在tMCAO之前以及在tMCAO之后第7、14和21天進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)大鼠在它們的舍籠中自由移動(dòng)時(shí)對(duì)它們監(jiān)測(cè)。由不知情的觀察者對(duì)當(dāng)站立時(shí)由各前爪與籠壁進(jìn)行的接觸評(píng)分。記錄各動(dòng)物總計(jì)15-20次接觸，并且以總接觸的百分比形式計(jì)算損害(左側(cè))和非損害前肢接觸的數(shù)目。

結(jié)果

分析功能恢復(fù)，分析從基線(第3天)至終點(diǎn)(第42天)的肢體放置和7分和20分變化。參見圖5。在圓筒測(cè)試中，分析從第7天至第35天的變化。1.5mg/kg VX-745劑量組似乎始終好于4.5mg/kg VX-745組。此外，相對(duì)于媒介物治療動(dòng)物，1.5mg/kg VX-745劑量組顯示朝向從第7天至第35天圓筒測(cè)試表現(xiàn)變化的改進(jìn)增加的趨勢(shì)(p＝0.088，雙側(cè)t檢驗(yàn))；這是在4.5mg/kg劑量組中不明顯的趨勢(shì)。參見圖6。

結(jié)論

關(guān)于在這個(gè)研究中用肢體放置、7分或20分神經(jīng)評(píng)分衡量的功能恢復(fù)的結(jié)果顯示在媒介物治療動(dòng)物中在tMCAO之后存在實(shí)質(zhì)性功能改進(jìn)，并且施用1.5mg/kg VX-745或4.5mg/kg不進(jìn)一步改進(jìn)根據(jù)這些量度的功能恢復(fù)。在圓筒測(cè)試中在以媒介物治療的情況下，最小功能恢復(fù)是明顯的，并且在1.5mg/kg VX-745的情況下，相較于媒介物治療，朝向在關(guān)于圓筒測(cè)試的從第7天至第35天的表現(xiàn)變化方面的改進(jìn)的趨勢(shì)(p＝0.088)是明顯的。對(duì)于所有量度，在變化分析中，1.5mg/kg VX-745劑量組似乎始終好于4.5mg/kg VX-745組，從而進(jìn)一步支持以下觀念：VX-745對(duì)神經(jīng)功能的任何正性作用都發(fā)生在不具有可測(cè)量消炎作用的劑量水平下，與此一致的是那個(gè)劑量水平不實(shí)現(xiàn)影響細(xì)胞因子產(chǎn)生的血液濃度；而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生的血液濃度，并且因此具有消炎性的劑量水平對(duì)神經(jīng)功能的作用較小。