本發(fā)明涉及用于評估陰道萎縮的方法，所述方法涉及陰唇和陰道口的感覺傳感器、pH、生物化學(xué)、基因組學(xué)、和/或組織學(xué)。

背景技術(shù)：

絕經(jīng)是影響所有婦女的正常自然老化事件。絕經(jīng)可定義為在無明顯病理原因的情況下，排卵和月經(jīng)停止至少12個月。絕經(jīng)的典型年齡為51歲，并且估計(jì)在當(dāng)今美國(2010人口普查)，多于5300萬婦女具有后絕經(jīng)年齡(50+歲)。其它婦女由于全子宮切除術(shù)(去除子宮和兩個卵巢)而屬于后絕經(jīng)類別。與后絕經(jīng)相關(guān)聯(lián)的是循環(huán)雌二醇急劇下降至小于婦女生育年齡期間的典型水平的10％。減少的雌激素導(dǎo)致主要的解剖學(xué)變化，從而導(dǎo)致獨(dú)特的癥狀和生活質(zhì)量問題。

雖然已經(jīng)報道了雌激素減少對女性的身體、皮膚和毛發(fā)具有全身影響，但該影響也見于泌尿生殖區(qū)，其被診斷為陰道萎縮或VA。VA評估可能需要將窺器插入女性的陰道中。進(jìn)行主觀評估，其包括喪失處女膜硬度、存在尿道展開、可伸縮式前庭、陰道中存在瘀點(diǎn)、并且經(jīng)陰道口處指觸(手指)診斷的彈性喪失。女性報道的主要癥狀包括陰道干燥的感覺、性交疼痛、性交出血、陰道瘙癢、和生殖器皮膚瘙癢等。

VA的客觀測量和測試方法依賴于在陰道中在黏膜表面處的測試。處女膜是圍繞或部分覆蓋外部陰道口的膜(圍繞該開口的組織可被稱為處女膜環(huán))。處女膜是內(nèi)生殖器和外生殖器之間的界限。其由薄纖維膜組成，所述薄纖維膜作為下陰道的襯里，其外表面上由角質(zhì)化分層鱗狀上皮覆蓋并且內(nèi)表面上由具有糖原的非角質(zhì)化分層鱗狀上皮(如陰道上皮)覆蓋。就具有VA的許多女性而言，處女膜可收縮并喪失彈性從而使得客觀上測試VA是困難的或令人不悅的。與陰道口相關(guān)聯(lián)的組織也被稱為陰道口。VA的客觀測量主要限于陰道pH(通常需要窺器以產(chǎn)生足夠的觸及)，其中大于或等于5.5的pH應(yīng)被分類為VA的信號?？蓪ι掀ひr里的陰道刮擦物(也需要窺器插入陰道中)進(jìn)行成熟細(xì)胞的相對豐度(稱為陰道成熟指數(shù)或VMI)分析。然而，VMI與VA之間的關(guān)系在臨床醫(yī)生間變化，并且所述變化可能相當(dāng)寬。類似地，在女性的癥狀和臨床評估，或陰道pH的客觀測量之間沒有明顯的關(guān)系。

用于診斷VA和治療的效果的另一種潛在的客觀方法可包括收集轉(zhuǎn)錄表達(dá)圖的陰道活組織標(biāo)本。獲得陰道活組織標(biāo)本非常困難，需要使用窺器。另外，關(guān)于活組織標(biāo)本來源之處不可能是精確的并且也不能確?；罱M織標(biāo)本的均一特性。例如，活組織標(biāo)本厚度的差異可偏離來源于真皮的數(shù)據(jù)。

用于診斷VA和治療的效果的另一種潛在客觀方法可包括從處女膜環(huán)或大陰唇或小陰唇收集淺表組織用于代謝表達(dá)譜。

另外，除了陰道pH之外，所有其方法均是主觀的并且不可靠。另一個問題是所有陰道程序諸如主觀陰道萎縮評級或收集陰道pH或收集陰道刮擦物用于VMI均需要將窺器插入陰道中。該程序可能非常疼，尤其是在遭受VA的女性中。雖然為了更容易插入可潤滑窺器(通常用商業(yè)超聲凝膠)，但這可不利于pH和VMI的收集。由插入窺器造成的疼痛可能影響婦女是否決定尋求診斷并治療VA。

因此，需要VA診斷方法和評估治療對VA的潛在功效的方法，其不依賴于使用窺器、對陰道組織取樣，并通過使用定量和客觀方法來減少主觀性程度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了用于識別與陰道萎縮相關(guān)聯(lián)的泌尿生殖道變化的一種或多種方法的系列。所述方法系列包括：測量大陰唇、小陰唇、陰道口或它們的組合處的pH；測定陰道口處的刷敏感性；評估陰道口處的糖原量；采集陰道口處的活組織標(biāo)本并分析陰道口處的上皮細(xì)胞；評估陰道口或大陰唇或小陰唇處測試的蛋白質(zhì)量；評估陰道口或大陰唇或小陰唇處的代謝物及其量；評估陰道口或大陰唇或小陰唇處的組胺量；在大陰唇或小陰唇或陰道口處轉(zhuǎn)錄組熱成像；以及對于一組基因探針組評估大陰唇處的基因表達(dá)。

本發(fā)明還公開了評估陰道萎縮治療方案的功效的方法。用于評估陰道萎縮治療方案的功效的方法包括：使用一種或多種診斷方法進(jìn)行陰道萎縮的治療前評估；將一種或多種局部治療施用于大陰唇、小陰唇、陰道口、陰道或它們的組合；使用與用于陰道萎縮的治療前評估中相同的診斷方法進(jìn)行陰道萎縮狀態(tài)的治療后評估；以及測定陰道萎縮的治療前評估和治療后評估之間的差異以評估局部治療的總體效果。用于治療前和治療后的一種或多種診斷方法包括：測量大陰唇、小陰唇、陰道口或它們的組合處的pH；測定陰道口處的刷敏感性；評估陰道口處的糖原測試；陰道口處上皮細(xì)胞的活組織檢查分析；評估得自陰道口、大陰唇、小陰唇、或它們的組合的代謝物；評估陰道口處測試的蛋白質(zhì)；在大陰唇或小陰唇處轉(zhuǎn)錄組熱成像；對于一組基因探針評價大陰唇處的基因表達(dá)；使用與用于陰道萎縮的治療前評估中相同的診斷方法進(jìn)行陰道萎縮狀態(tài)的治療后評估；以及測定陰道萎縮的治療前評估和治療后評估之間的差異以評估局部治療的總體效果。

一種用于評估陰道萎縮治療方案的功效的試劑盒，該試劑盒包括：用于陰道萎縮的治療前評估方法，該試劑盒包括：施用于大陰唇、小陰唇、陰道口、陰道或它們的組合的局部治療；用于陰道萎縮狀態(tài)的治療后評估方法，其包括與用于陰道萎縮的治療前評估相同的診斷方法；以及測定陰道萎縮的治療前評估和治療后評估之間的差異以評估局部治療的總體效果的方式。用于治療前和治療后的一種或多種診斷方法包括：測量大陰唇、小陰唇、陰道口或它們的組合處的pH；測定陰道口處的刷敏感性；評估陰道口處的糖原測試；評估大陰唇、小陰唇、陰道口或它們的組合處的代謝物；陰道口處的上皮細(xì)胞的活組織檢查分析；評估陰道口處測試的蛋白質(zhì)；大陰唇或小陰唇處的轉(zhuǎn)錄組熱成像；或?qū)τ谝唤M基因探針評價大陰唇處的基因表達(dá)。

附圖說明

雖然本說明書通過特別指出并清楚地要求保護(hù)本發(fā)明主題的權(quán)利要求書作出結(jié)論，但據(jù)信由以下與附圖有關(guān)的說明可更容易理解本發(fā)明，其中：

圖1示出在陰道口處進(jìn)行活組織檢查的圖像。

圖2示出用于上皮組織的測量中的圖像。

圖3為在絕經(jīng)后女性中增加的那些基因探針的維恩圖。

具體實(shí)施方式

用于評估陰道萎縮和評估用于陰道萎縮的治療的功效的本發(fā)明方法系列中所包括的方法不需要使用窺器也不需要觸及陰道。以下方法系列通過使用定量且客觀的方法降低主觀性程度。應(yīng)當(dāng)理解，可僅依賴單個方法或下述方法的組合。以下方法利用不是陰道腔的位點(diǎn)，其容易觸及并且可用于客觀地測量與泌尿生殖器萎縮相關(guān)聯(lián)的變化并且不需要侵入式工具諸如窺器。另外，這些位點(diǎn)可與女性報道的癥狀和治療的功效密切相關(guān)聯(lián)。這些位點(diǎn)包括陰唇(其包括大陰唇或小陰唇)和泌尿生殖器區(qū)的處女膜環(huán)。兩個位點(diǎn)由于其可觸及性而特別有吸引力。類似于陰道，處女膜環(huán)是黏膜表面，其不同于陰唇的分層上皮。

利用陰唇和處女膜環(huán)(或者陰道口)的以下方法可包括pH、組織學(xué)、對刷涂搽的敏感性、代謝物的表達(dá)譜、以及基因轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)譜。

如本文所用，術(shù)語代謝物或蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄物的“不同含量”可包括任何增加或減小的含量。出于該討論的目的，代謝物的不同含量也可延伸至意指蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄物。在一個實(shí)施方案中，不同含量是指增加下列百分比的含量：至少5％；至少10％；至少20％；至少30％；至少40％；至少50％；至少60％；至少70％；至少80％；至少90％；至少100％；至少110％；至少120％；至少130％；至少140％；至少150％；或更多。在另一個實(shí)施方案中，不同含量是指減小下列百分比的含量：至少5％；至少10％；至少20％；至少30％；至少40％；至少50％；至少60％；至少70％；至少80％；至少90％；至少100％(即，代謝物不存在)。代謝物以統(tǒng)計(jì)意義上顯著的不同含量表達(dá)(即，p-值小于0.05和/或q-值小于0.10，如使用t檢驗(yàn)、Welch T檢驗(yàn)或Wilcoxon秩和檢驗(yàn)法測定的)。

如本文所用，術(shù)語代謝物(或蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄物)的“參考含量”是指指示萎縮或未萎縮、表型、或其缺失，以及萎縮狀態(tài)、表型或其缺失的組合的代謝物含量。在一個實(shí)施方案中，萎縮參考含量或代謝物是指指示受檢者中的VA的陽性診斷的代謝物含量。在另一個實(shí)施方案中，代謝物的“健康參考含量”是指指示受檢者中未萎縮狀態(tài)的陽性診斷的代謝物含量。

在一個實(shí)施方案中，代謝物(或蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)錄物)的“參考含量”可以為下列中的一種或多種：代謝物的絕對或相對量或濃度；代謝物的存在或缺失；代謝物的量或濃度的范圍；代謝物的最小和/或最大量或濃度；代謝物的平均量或濃度；和/或代謝物的中值量或濃度。在另一個實(shí)施方案中，代謝物的組合的“參考含量”還可以為彼此相關(guān)的兩種或更多種代謝物的絕對或相對的量或濃度的比率。對于特定萎縮狀態(tài)、表型或其缺失的代謝物的適當(dāng)陽性和陰性參考含量可以通過測量一個或多個合適的受檢者中的期望代謝物的含量來測定，并且可對特定受檢者人群定制此類參考含量(例如，參考含量可以為年齡匹配的或與自上次月經(jīng)周期以來的年數(shù)匹配的，使得可在來自特定年齡的受檢者的樣品中的代謝物含量與特定年齡組中的具體萎縮狀態(tài)、表型或其缺失的參考水平之間進(jìn)行比較)。在另一個實(shí)施方案中，可對用于測量生物樣品中的代謝物含量的特定技術(shù)(例如，LC-MS、GC-MS等)定制參考含量，其中代謝物的含量可基于所用的特定技術(shù)不同。

在另一個此類實(shí)施方案中，“參考代謝物”可包括選自下列的至少一種化合物：由氨基酸代謝生成的化合物、由尿素循環(huán)生成的化合物；在谷胱甘肽轉(zhuǎn)化中生成的化合物；在脂質(zhì)代謝中生成的化合物；在烴代謝中生成的化合物；由核酸代謝生成的化合物；維生素；和輔因子。在另一個實(shí)施方案中，“參考代謝物”可包括下列氨基酸中的一種或多種：丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯乙酸、N-乙酰甲硫氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、和兩種氨基酸的組合的二肽。

在另一個實(shí)施方案中，“參考代謝物”可包括選自下列的化合物中的一種或多種：由嘌呤或嘧啶代謝生成的化合物、腺嘌呤、腺苷、胞苷、胞嘧啶、胸腺嘧啶、肌苷、次黃嘌呤、尿苷、鳥苷、鳥嘌呤、鳥氨酸和胸腺嘧啶核苷。

另一個實(shí)施方案中，“參考代謝物”可包括選自下列的至少一種化合物：由鞘脂類和溶血脂代謝生成的化合物、二氫鞘氨醇、鞘氨醇、N-棕櫚酰鞘氨醇、棕櫚酰鞘磷脂、硬脂酰鞘磷脂、1-硬脂酰甘油磷酸乙醇胺、1-亞油酰甘油磷酸絲氨酸、1-油酰甘油磷酸甘油、1-棕櫚油酰甘油磷酸膽堿、還原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、膽堿和尿酸。

在另一個此類實(shí)施方案中，“參考代謝物”可包括選自下列的至少一種化合物：由煙堿(煙酰胺)代謝生成的化合物；由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)代謝生成的化合物；由煙酰胺單核苷酸(NMN)代謝生成的化合物；煙酸單核苷酸(NaMN)代謝物；以及維生素B3。測量結(jié)果可表達(dá)為NAD與其還原形式NADH的比率，或者NADPH與其氧化形式NADP(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯)的比率。

在另一個此類實(shí)施方案中，“參考代謝物”可包括選自下列的至少一種化合物：由果糖、半乳糖和半乳糖代謝生成的化合物，諸如山梨醇、甘露糖醇、甘露糖醇-1-磷酸。

在另一個此類實(shí)施方案中，“參考代謝物”可包括選自下列的至少一種化合物：由糖原代謝生成的化合物，諸如麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽四糖、麥芽三糖或麥芽糖。

在另一個此類實(shí)施方案中，“參考代謝物”可包括選自下列的至少一種化合物：由葡萄糖代謝生成的化合物，諸如乳酸、丙酮酸、葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、或3-磷酸甘油酸。

代謝技術(shù)可用于鑒定新型且化學(xué)上未命名的化合物。所述方法可描述于至少美國專利7,884,318；Evans等人，2009，Analytical Chemistry 81：6656-6667；以及Lawton等人，2008，Pharmacogenomics 9：383-397中。

代謝表達(dá)譜技術(shù)可更詳細(xì)地描述于下文所示的實(shí)施例以及美國專利7,005,255、US7,329,489、US7,550,258、US7,550,260、US7,553,616、US7,635,556、US7,682,783、US7,682,784、US7,910,301和US7,947,453中，其全部內(nèi)容以引用方式并入本文。

代謝物可使用所述分析方法鑒定并由來源于刷樣品和條帶的提取物定量。

代謝組學(xué)是指代謝物在活生物體中的表達(dá)。如本文所用，術(shù)語“代謝物”是指由代謝產(chǎn)生的或用于或參與具體代謝過程所必需的任何物質(zhì)。所述術(shù)語不包括大分子，諸如大蛋白質(zhì)(例如，分子量超過2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的蛋白質(zhì))；大核酸(例如分子量超過2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的核酸)；或者大多糖(例如分子量超過2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000的多糖)。術(shù)語代謝物包括將來源于食物的能量轉(zhuǎn)化成可用形式的化學(xué)反應(yīng)中的信號分子和中間體，其包括但不限于：糖、脂肪酸、氨基酸、核苷酸、抗氧化劑、維生素、輔因子、脂質(zhì)、在細(xì)胞過程中形成的中間體、和其它小分子。

測量大陰唇、小陰唇和處女膜環(huán)處的pH

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以不受本說明書的限制。

可使用可商購獲得的pH試紙或平頭pH探針來測量pH。pH試紙或pH條的非限制性示例包括pHydrion試紙(3.0-5.5范圍；Hydrion MicroEssentials Laboratory Inc.，New York，New York，USA)和pHion診斷測試條(4.5-9.0范圍，iHerb.com)。平頭pH探針的非限制示例包括，例如，SkinCheck HI-98109(Hanna Instruments，Woonsocket，Rhode Island，USA)。

可使用pH條，通過使用鑷子固定pH條以將所述pH條與期望區(qū)域接觸30秒來測量pH。

使用pH探針的程序如下。

1.在使用pH探針之前，移除保護(hù)性頂蓋并且通過將頂端浸泡(優(yōu)選地，離開底部邊緣5cm/2英寸，更優(yōu)選地離開底部邊緣3cm/1.5英寸)在新鮮的pH 7緩沖溶液(例如得自Hanna Instruments的溶液HI7007P)中并持續(xù)1小時至長達(dá)24小時來調(diào)理電極。在調(diào)理期間，探針應(yīng)當(dāng)在“關(guān)閉”位置。

2.校準(zhǔn)pH探針。打開pH探針。首先，在蒸餾水，優(yōu)選地去離子蒸餾水中沖洗經(jīng)調(diào)理的探針。將探針電極頂端浸漬在pH 7緩沖液中(即小于30天的緩沖液，優(yōu)選地新鮮緩沖液)。使得讀數(shù)至穩(wěn)定(即，優(yōu)選小于1小時，更優(yōu)選地小于15分鐘)。在讀數(shù)穩(wěn)定之后，使用小螺絲刀以利用微調(diào)器(左上角的螺絲，如在電極顯示處所看到的)調(diào)節(jié)至pH 7.00+/-0.02，至讀數(shù)7.00。用水(即，蒸餾水，優(yōu)選地去離子蒸餾水)沖洗電極端部，甩掉過量水，并使用新鮮pH 4.0緩沖液(例如得自Hanna Instruments的溶液HI70004P)重復(fù)過程。使得讀取至穩(wěn)定(即，優(yōu)選小于1小時，更優(yōu)選地小于15分鐘)。在讀數(shù)穩(wěn)定之后，使用小螺絲刀以利用微調(diào)器(右上角，如在電極顯示處可見)調(diào)節(jié)至pH 4.00+/-0.02，至讀數(shù)4.00。pH計(jì)準(zhǔn)備好進(jìn)行測量?？蓪⑻结橅敹肆粼诰彌_溶液(優(yōu)選離開底部邊緣5cm/2英寸內(nèi)，更優(yōu)選地離開底部邊緣3cm/1.5英寸內(nèi))并持續(xù)至多2小時。

3.測量。pH計(jì)開關(guān)應(yīng)當(dāng)為開。用蒸餾水，優(yōu)選地去離子蒸餾水，沖洗電極頂端，并且使得過量水滴落或溫和甩去過量水。將電極頂端保持離皮膚表面45-135度，優(yōu)選地離皮膚表面60-120度，更優(yōu)選地離皮膚表面75-105度。使得pH探針顯示器穩(wěn)定小于15分鐘，優(yōu)選地小于5分鐘，更優(yōu)選地小于1分鐘。使用之后，用水(即，蒸餾水，優(yōu)選地去離子蒸餾水)沖洗電極頂端，甩去過量水，并且開始在相同受檢者的另一泌尿生殖位點(diǎn)處進(jìn)行測量。如果不立即使用探針，則探針可用水(即，蒸餾水，優(yōu)選地去離子蒸餾水)沖洗并轉(zhuǎn)移到pH 4.0或7.0緩沖液浴中直至使用并持續(xù)最多達(dá)2小時。

4.使用后或在受檢者之間。在已經(jīng)使用pH計(jì)之后，將pH計(jì)開關(guān)轉(zhuǎn)到關(guān)閉位置。為儲存pH探針或在另一個受檢者上使用，需要凈化或消毒pH探針。這以兩種優(yōu)選方法之一來實(shí)現(xiàn)。一種方式通過將探針浸入(優(yōu)選地離底部邊緣5cm/2英寸內(nèi)，更優(yōu)選地離底部邊緣3cm/1.5英寸內(nèi))70％異丙醇中，優(yōu)選地持續(xù)20至40分鐘，更優(yōu)選地25至35分鐘。然后，用水(即，蒸餾水，優(yōu)選地去離子蒸餾水)沖洗探針并重新校正。另選地，可使用殺菌手部擦拭物(Sani-Cloth HB，無乙醇，得自PDI(Orangeburg，New York，USA)或噴霧(Citrex醫(yī)院噴霧消毒劑，得自Cardinal Health(Columbus，Ohio，USA)。在施用之后，等待3至5分鐘，優(yōu)選地3-4分鐘，更優(yōu)選地2.5至4分鐘。這之后利用水(即，蒸餾水，優(yōu)選地去離子蒸餾水)沖洗，并重新校正。為在去污之后儲存pH探針，用水(即，蒸餾水，優(yōu)選地去離子蒸餾水)沖洗探針，甩去過量水，并且將保護(hù)性頂蓋放在探針頂端上，或在放在探針頂端上之前，將一至10滴HI 70300儲存溶液(Hanna Instruments)加入保護(hù)性頂蓋中。

pH探針或pH條可用于測量外大陰唇、內(nèi)大陰唇、小陰唇、和處女膜環(huán)處的pH。對于陰唇和處女膜環(huán)處的測量而言，優(yōu)選pH探針，然而在陰道中優(yōu)選pH條。對于在陰唇處的測量而言，可將探針或條置于解剖位點(diǎn)的終點(diǎn)處(后面和前面之間)。為在處女膜區(qū)處測量，pH探針幾乎垂直于解剖位點(diǎn)或可偏離解剖位點(diǎn)45°至135°。

利用軟刷和生物化學(xué)分析測量陰道口的敏感性

本方法還可包括使用軟工具例如刷測量陰道口的敏感性的方法。刷的示例包括圓形刷，例如得自Epicentre Biotechnologies(Madison，Wisconsin，USA)的MasterAmp頰黏膜刷。刷應(yīng)當(dāng)對于組織是柔軟的，如由刷毛邊緣、刷毛長度、和刷毛硬度所定義的?？蓪⑺⒎胖贸膳c處女膜環(huán)接觸，作為測量敏感性的方式和/或作為收集刷毛上的生物學(xué)組織樣品的方式。

所述方法包括使刷與處女膜環(huán)接觸。與處女膜環(huán)接觸進(jìn)行至少1秒。

使刷與處女膜環(huán)接觸可包括以下步驟：將受檢者置于適當(dāng)位置使得測試探針可正確定位，使處女膜環(huán)暴露，保持刷柄并將刷放置成在介于1psi和0.01psi之間(諸如小于1psi、小于0.5psi、或小于0.1psi)的力下與處女膜組織輕微接觸，并且在期望的組織區(qū)域上移動刷用于組織收集。

在使刷與處女膜環(huán)接觸之前，應(yīng)當(dāng)將受檢者置于適當(dāng)位置使得測試探針可正確定位。在許多情況下，但不受限制，這可以為婦科檢查椅。該椅具有調(diào)節(jié)受檢者的位置的能力。

一旦將受檢者正確地定位，就擴(kuò)張陰唇，使得處女膜區(qū)暴露。

下一步驟是抓握刷的柄部，插入并將刷(得自Epicentre Biotechnologies的MasterAmp頰黏膜刷)靜置于沿處女膜環(huán)的任何位置，優(yōu)選地在3點(diǎn)鐘或6點(diǎn)鐘或9點(diǎn)鐘或12點(diǎn)鐘位置處。

為測定對刷的敏感性，可將塑料柄部端保持在食指和拇指之間，并且在捻轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動情況下，將刷在組織表面上旋轉(zhuǎn)1至25個循環(huán)，優(yōu)選地2至15個循環(huán)，更優(yōu)選地3至10個循環(huán)。每次循環(huán)將花費(fèi)小于5秒，優(yōu)選地小于2秒。

一旦刷與處女膜環(huán)接觸，就應(yīng)當(dāng)移除刷并且切割使得刷落入收集小瓶中(Bio Plas微離心管(Bio Plas 4204)和具有O形環(huán)的螺紋頂蓋(Bio Plas4215R)，得自VWR(VWR International LLC，Radnor Pennsylvania，USA)，#20170-710，有緣錐形管和VWR 20170-770)，并且利用螺紋頂蓋將所述小瓶密封。

然后可將小瓶置于干冰中，并且可儲存在-70℃(或更低)的冷凍機(jī)中至多六個月。

可收集一個或多個刷樣品，例如可重復(fù)所述方法2-10次，優(yōu)選地2至5次。

可提取刷樣品以測量蛋白質(zhì)、DNA、糖原、組胺、細(xì)胞因子、和代謝物。

所述方法還可包括讓消費(fèi)者填寫與體驗(yàn)相關(guān)的問卷調(diào)查。所述問卷調(diào)查可包括與陰道干燥度相關(guān)的問題。所述問卷調(diào)查可確認(rèn)消費(fèi)者是否感覺到刷和所述接觸是否令人不悅。所述問卷調(diào)查可要求消費(fèi)者描述感覺。所述問卷調(diào)查還可詢問消費(fèi)者關(guān)于下列主題的問題，例如：生殖器皮膚干燥度、陰道干燥度、生殖器皮膚瘙癢、陰道騷癢、性交困難、以及它們的組合所述問卷調(diào)查可要求消費(fèi)者評價與刷接觸的各方面，例如不愉悅度的等級。所述等級可基于1至10的分?jǐn)?shù)，其中一表示體驗(yàn)到無感覺，并且10表示最大感覺。

如上所述，可分析刷以測量蛋白質(zhì)、DNA、糖原、組胺、細(xì)胞因子、和代謝物?？墒褂肊nzyChrom^TM糖原測定試劑盒(BioAssay Systems，Hayward，California，USA)來分析刷的糖原含量。EnzyChrom^TM糖原測定試劑盒利用單一工作試劑，其將經(jīng)由α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶酶促分解(水解)糖原和通過葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖以及經(jīng)由比色/熒光染料試劑檢測過氧化氫(得自EnzyChrom^TM糖原測定試劑盒所附的材料安全數(shù)據(jù)表)進(jìn)行組合。反應(yīng)產(chǎn)物在570nm的波長下的顏色強(qiáng)度，或在λ_ex/em＝530/585nm的熒光強(qiáng)度與樣品中的糖原濃度成正比(Zhou M等人Analytical Biochem 253:162-168，1997)。樣品中的葡萄糖濃度通過將包含葡萄糖氧化酶和染料但不具有水解酶的試劑加入空白樣品中來測定。糖原含量通過從總葡萄糖(糖原+游離的葡萄糖)中減去游離的葡萄糖來測定。使用原液來制備逐漸增加濃度的葡萄糖(以微克/毫升(μg/mL)為單位表達(dá))生成校準(zhǔn)曲線。將由原液制備的三種質(zhì)量對照樣品(高QC、中QC和低QC)用于在樣品分析期間監(jiān)測測定性能。

收集活組織標(biāo)本

方法系列還可包括從大陰唇、小陰唇或陰道口采集活組織標(biāo)本?；罱M織標(biāo)本可用于組織學(xué)分析、生物化學(xué)分析、轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。為收集活組織標(biāo)本，首先用聚維酮碘清潔皮膚表面，并且然后用局部麻醉劑，諸如約0.05至4ml/cm²的利多卡因麻醉。麻醉劑應(yīng)位于待活組織檢查的區(qū)域正下方。一旦麻醉劑麻醉所述區(qū)域，就用乙醇清潔表面。皮膚活組織標(biāo)本可通過受訓(xùn)練的醫(yī)生使用Tischler Morgan活組織檢查儀(購自Gynex Corporation，Redmond，Washington，USA)，使用標(biāo)準(zhǔn)無菌技術(shù)，之后如果需要的話進(jìn)行縫合閉合來收集。如果需要的話，可使用附加措施用于止血。在該程序中可使用鉻縫合線并且期望自然吸收使得將不需要移除縫合線?；罱M織檢查區(qū)域可用Polysporin處理并用醫(yī)用紗布墊或傷口繃帶覆蓋。可為每位受檢者安排術(shù)后訪問以注意活組織檢查位點(diǎn)的愈合。

應(yīng)當(dāng)理解可采集多于一個活組織標(biāo)本?；罱M織檢查樣品可根據(jù)以下程序進(jìn)行處理?？赏ㄟ^首先將活組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移到預(yù)標(biāo)記的含福爾馬林瓶中(10％中性緩沖福爾馬林，VWR 89370-094或等同物)，將活組織檢查樣品用于組織學(xué)評價。樣品可保持在福爾馬林中過夜并且然后轉(zhuǎn)移到包含70％乙醇的塑料盒中，用于最終的石蠟包埋、切片和染色(例如但不限于蘇木精/曙紅)。還可將活組織標(biāo)本冷凍用于最終的冷凍切片和染色。

可首先通過將活組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移到RNALater溶液(Life Technologies目錄號AM7021，Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA)中，之后浸入磷酸鹽緩沖鹽水(Life Technologies目錄號10010031或等同物)中，并且然后用(由Kimberly Clark Corporation生產(chǎn)，Irving，Texas，USA)芯吸干燥，將活組織檢查樣品用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。然后可將樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml Eppendorf管(VWR目錄號#022363204)中并且頂蓋閉合并置于干冰-乙醇浴中或置于–70C(或更冷的)冷凍機(jī)中，直至RNA處理。

可將活組織檢查樣品用于組織學(xué)評價和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。

組織學(xué)評價可通過以下程序來進(jìn)行：

1.在福爾馬林和乙醇處理之后，組織可用二甲苯(VWR目錄號MK866802或等同物)清潔并且然后在基礎(chǔ)模具中包埋于石蠟中并使其固化。

然后在冷卻板上冷卻組織塊，并從基礎(chǔ)模具中移除，將其置于冷凍機(jī)中(約-4C)直至切片。

從冷凍機(jī)中移除組織并在冰上的冰盤(或等同物)中保持冷卻。使用超薄切片機(jī)(Leica RM2125RTS，Leica Microsystems GmbH，Wetzlar，Germany或等同物)修剪所述塊并切割成3-4μ厚度的切片。將所述切片置于水浴中并且移除任何折疊和褶皺。

可將切片置于帶正電荷的顯微鏡載玻片(VWR目錄號89500-498或等同物)上，并使過量的水從載玻片排出或芯吸。

將載玻片加載到Ventana Symphony染色盤中并對蘇木精和曙紅(H&E)染色，或者其它期望的組織學(xué)染色(諸如PAS、Trichrome等)，或者使用Ventana Symphony體系(Ventana Medical Systems,Inc.，Tucson，Arizona，USA)進(jìn)行免疫染色(諸如Ki67、CD3、S100等)。

可提取活組織檢查樣品、刷樣品或條帶樣品以測量蛋白質(zhì)、DNA、糖原、組胺、和代謝物。

糖原的測量

可使用EnzyChrom^TM糖原測定試劑盒(BioAssay Systems，Hayward，California，USA)分析刷的糖原含量。EnzyChrom^TM糖原測定試劑盒利用單一工作試劑，其將經(jīng)由α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶酶促分解(水解)糖原和通過葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖以及經(jīng)由比色/熒光染料試劑檢測過氧化氫(得自EnzyChrom^TM糖原測定試劑盒所附的材料安全數(shù)據(jù)表)進(jìn)行組合。反應(yīng)產(chǎn)物在570nm的波長下的顏色強(qiáng)度，或在λ_ex/em＝530/585nm的熒光強(qiáng)度與樣品中的糖原濃度成正比(Zhou M.等人Analytical Biochem 253:162-168，1997)。樣品中的葡萄糖濃度通過將包含葡萄糖氧化酶和染料但不具有水解酶的試劑加入空白樣品中來測定。糖原含量通過從總葡萄糖(糖原+游離的葡萄糖)中減去游離的葡萄糖來測定。使用原液來制備逐漸增加濃度的葡萄糖(以微克/毫升(μg/mL)為單位表達(dá))生成校準(zhǔn)曲線。將由原液制備的三種質(zhì)量對照樣品(高QC、中QC和低QC)用于在樣品分析期間監(jiān)測測定性能。

可將以下試劑用于糖原的分析：

1)EnzyChrom^TM糖原測定試劑盒，BioAssaySystems，目錄號：E2-GN-100。儲存在-20℃下冷凍的試劑盒至多6個月。所述試劑盒包含以下試劑：

a)測定緩沖液，12mL

b)染色試劑，120μL

c)酶A(α-淀粉酶，淀粉葡糖苷酶)，干燥的

d)酶B(葡萄糖氧化酶)，120μL

e)淀粉標(biāo)準(zhǔn)品，50mg/mL，50μL；

2)水，用Millipore Milli-Q過濾體系(Merck Millipore，Billerica，Massachusetts，USA)純化；或等同物；

3)5M氯化鈉(NaCl)，Sigma-Aldrich目錄號：S5150，Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，Missouri，USA)；或等同物；

4)蛋白酶抑制劑混合片，COMPLETE^TM，Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，Germany)，目錄號：11-697-498-001；

5)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖液包，Sigma-Aldrich Corp.，目錄號：P3813。將1PBS緩沖液包稀釋于1升水中。在室溫下儲存PBS溶液至多1個月；或者

6)提取緩沖液(“EB”，PBS+0.25M NaCl+蛋白酶抑制劑)。將50mL 5M NaCl(試劑#3)加入950mL PBS中以制備0.25MNaCl。使用0.2μm過濾瓶(真空過濾器單元，無菌，Nalgene目錄號：567-0020或等同物，Nalge Nunc International Corporation(Rochester，New York，USA)過濾試劑。向該溶液中，溶解20個蛋白酶抑制劑片(試劑#4)/1000mL。在室溫下儲存至多1個月。

制備刷樣品以測量糖原

可使用以下步驟制備樣品從而測量糖原。

1.從-70℃冷凍機(jī)中移除容納刷樣品的聚丙烯管。

2.向每個聚丙烯管中添加提取緩沖液(EB，試劑#6)：

a)等分1.5mL EB到每個管。

b)重置每個螺紋頂蓋，牢固擰緊頂蓋。

3.在冰浴(4-10℃)中超聲處理小瓶約30分鐘(超聲波清潔器，Branson Ultrasonics Corporation(Danbury，Connecticut，USA)；或等同物)。

4.使用多管渦旋器(多管渦旋器，VWR目錄號：VX2500；或等同物)將管渦旋10秒。

5.使用已經(jīng)用殺菌擦拭物(Plus，PDI,Inc.，目錄號：Q89072；或等同物)清潔的鑷子，從每個管中抓取并取出刷樣品，同時將刷壓向管內(nèi)部以避免任何殘余的流體。用滅菌一次性布擦拭鑷子，并且在處理下一個刷樣品之前風(fēng)干。

6.在3000rpm下將提取物離心5分鐘(室溫；Allegra X-12R，Beckman-Coulter(Fullerton，California，USA)；或等同物)。

7.將提取物轉(zhuǎn)移到深孔板：

a)將每個提取物管開蓋。

b)根據(jù)板模板，將管按順序置于(自動液體處理器的)液體處理器管架中。

c)使用自動液體處理器(JANUS，Perkin-Elmer，PackardMultiPROBE；或等同物)，將上清液的等分試樣(在離心步驟后，等分試樣應(yīng)該接近足夠測量糖原所需的量，例如可以為250μL等分試樣)轉(zhuǎn)移到用于糖原的空的96孔2ml深孔板中(Axygen Scientific，目錄號：P-DW-20-C；或等同物，Corning Inc.，Corning New York，USA)。取決于結(jié)果，即，過高濃度的糖原，可能需要稀釋上清液樣品。

d)將蓋墊牢固緊固于深孔板上(滴定板振蕩器，Lab-lineInstruments,Inc.，VWR目錄號：57019-0600或等同物)。

e)使用多管渦旋器將深孔板渦旋10秒。

f)在-70℃或更低下，將深孔板和容納提取物的管冷凍，以用于將來的分析。

8.如果進(jìn)行第二次提取，則將提取的刷置于其它聚丙烯管中，并且重復(fù)步驟2-7。

糖原測定

1)在工作臺上使測定試劑和研究樣品提取物平衡至室溫(20-25℃)。**在實(shí)驗(yàn)期間，將從EnzyChrom^TM測定試劑盒中解凍的酶保持在冰上或冷藏(2-8℃)。

2)重組酶A。

a.將120μL測定緩沖液加入干燥酶A的小瓶中。

b.使小瓶渦旋以完全溶解。

3)制備工作標(biāo)準(zhǔn)品。如下將50mg/mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)品稀釋于提取緩沖液(EB)中以制備工作標(biāo)準(zhǔn)品。在每次稀釋之后渦旋以混合溶液。

Std1＝200μg/ml糖原＝10μL淀粉標(biāo)準(zhǔn)品(50mg/mL)+2.49mL EB

Std2＝150μg/ml糖原＝300μL的200μg/ml糖原+100μL EB

Std3＝100μg/ml糖原＝200μL的200μg/ml糖原+200μL EB

Std4＝50μg/ml糖原＝200μL的100μg/ml糖原+200μL EB

Std5＝25μg/ml糖原＝200μL的50μg/ml糖原+200μL EB

Std6＝12.5μg/ml糖原＝200μL的25μg/ml糖原+200μL EB

Std7＝6.25μg/ml糖原＝200μL的12.5μg/ml糖原+200μL EB

Std8＝3.125μg/ml糖原＝200μL的6.25μg/ml糖原+200μL EB

空白＝EB

4)制備糖原測定QC

HQC＝80μg/ml糖原＝80μL的200μg/ml糖原+120μL EB

MQC＝40μg/ml糖原＝40μL的200μg/ml糖原+160μL EB

LQC＝10μg/ml糖原＝50μL的MQC+150μL EB

5)使用多管渦旋器將樣品提取物的深孔板渦旋(30秒，速度#7)

6)根據(jù)96孔板模板，使用單通道10μL移液器，將10μL標(biāo)準(zhǔn)品，測定QC或研究樣品一式兩份加入測定板(透明的聚苯乙烯96孔平底板；Becton Dickinson，目錄號3072(Becton Dickinson and Company，F(xiàn)ranklin Lakes，New Jersey，USA)或等同物)的每個孔中。

7)通過向6.3mL測定緩沖液中加入70μL酶A+70μL酶B+70μL染色試劑，制備工作試劑(足以用于64孔)。

8)通過向3.6mL測定緩沖液中加入40μL酶B+40μL染色試劑，制備樣品空白試劑(足以用于32孔)。

9)使用電子多通道移液器以多分配模式(2×90μL)，向每個標(biāo)準(zhǔn)的測定QC和測定板的樣品孔加入90μL工作試劑。

10)使用電子多通道移液器以多分配模式(2×90μL)，向每個樣品空白孔(無酶A)(如在測定板模板上以紅色指示的)加入90μL樣品空白試劑。

11)在設(shè)定為速度5的滴定板振蕩器上將測定板混合并持續(xù)10秒。

12)用塑料蓋覆蓋板；在室溫(20-25℃)下在工作臺上培養(yǎng)30min。

13)測量光學(xué)密度：利用計(jì)算機(jī)控制的酶標(biāo)儀(SpectraMax340PC³⁸⁴，Molecular Devices Corporation(Sunnyvale，California，USA)；或等同物)在570nm的波長下讀取所述板。使用對應(yīng)的讀板器軟件(用于酶標(biāo)儀的PRO軟件，用于Windows的PRO，Molecular Devices Corporation(Sunnyvale，California，USA)；或等同物)生成數(shù)據(jù)。推薦以下讀板器設(shè)置：

儀器參數(shù)：

模式：Endpt L1

波長：L1:570nm

自動混合：開啟

數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)計(jì)算：

在兩個孔中測定標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量對照，產(chǎn)生兩個光學(xué)密度值(OD)。OD結(jié)果記錄為兩個OD值的均值(平均值)。用于數(shù)據(jù)分析的回歸算法是校準(zhǔn)基準(zhǔn)的標(biāo)稱濃度和平均OD值的二次擬合。

％CV(變異系數(shù))＝(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均OD)*100％

％偏差(僅適用于標(biāo)準(zhǔn)品和QC)＝((計(jì)算的濃度-標(biāo)稱濃度)/標(biāo)稱濃度)*100％

糖原測定：

如果存在樣品包含葡萄糖的可能性，則應(yīng)當(dāng)制備獨(dú)立的樣品空白孔，其不包含酶A試劑。為計(jì)算每個樣品中的糖原濃度，從在對應(yīng)的樣品孔(酶A+酶B)中測定的糖原+葡萄糖的總濃度中減去在每個樣品空白孔(無酶A)中測定的葡萄糖濃度：

[糖原]_樣品＝[糖原+葡萄糖]_樣品–[葡萄糖]_樣品

蛋白質(zhì)的測量

可使用以下試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)的測量：

1)Pierce BCA^TM蛋白質(zhì)測定試劑A，Thermo Scientific，目錄號：23223，1000mL，其包含碳酸鈉、碳酸氫鈉、二辛可寧酸和酒石酸鈉的0.1M氫氧化鈉溶液。

2)Pierce BCA^TM蛋白質(zhì)測定試劑B，Thermo Scientific，目錄號：23224，25mL，其包含4％硫酸銅。

3)白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，2mg/mL，Thermo Scientific，目錄號：#23210，50mL，其包含2.0mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)的0.9％生理鹽水和0.05％疊氮化鈉的溶液。

4)水，用Millipore Milli-Q過濾體系純化；或等同物。

5)5M氯化鈉(NaCl)，Sigma目錄號：S5150；或等同物。

6)蛋白酶抑制劑混合片，COMPLETE^TM，Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，Germany)，目錄號：11-697-498-001。

7)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖液包，Sigma.，目錄號：P3813。將1PBS緩沖液包稀釋于1升水中。在室溫下儲存PBS溶液至多1個月。

8)牛血清白蛋白(BSA)，30％Sigma，目錄號：A8577；或等同物。

9)提取緩沖液(“EB”，PBS+0.25M NaCl+蛋白酶抑制劑)。制備PBS溶液(試劑#5)。將50mL 5M NaCl(試劑#3)加入950mL PBS以制備0.25M NaCl。使用0.2μm過濾瓶過濾。向該溶液中，溶解20個蛋白酶抑制劑片(試劑#4)/1000mL。在室溫下儲存至多1個月。

程序

重復(fù)自“制備刷樣品以測量糖原”以上的步驟1至6。在“制備刷樣品以測量糖原”的步驟6之后，將提取物轉(zhuǎn)移到深孔板：

1.將每個提取物管開蓋。

2.根據(jù)板模板，將管按順序置于MultiPROBE架中。

3.使用自動液體處理器，將上清液的等分試樣(在離心步驟后，等分試樣應(yīng)該接近足夠測量蛋白質(zhì)所需的量，例如可以為250μL等分試樣)轉(zhuǎn)移到空的96孔2ml深孔板中。取決于結(jié)果，即，過高濃度的蛋白質(zhì)，可能需要稀釋上清液樣品。

4.將蓋墊牢固緊固于深孔板上。

5.使用多管渦旋器將深孔板渦旋10秒。

6.在-70℃或更低下，將深孔板冷凍，以用于將來的分析。

測定

1)制備牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品

a)通過將12mL的2mg/mL白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(試劑#3)加入12mL提取緩沖液(EB，試劑#9)中制備1mg/mLBSA原液。

b)如下制備400μg/mL中間BSA原液：中間原液，400μg/mL＝16mL 1mg/mL BSA+24mL EB。

將1mL體積等分到預(yù)標(biāo)記的管中并在-80℃下冷凍直至分析那天。

c)為制備BSA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行中間原液(400μg/mL)的2倍系列稀釋。每次稀釋后將孔渦旋。每個標(biāo)準(zhǔn)品的500μL剩余體積足以在兩個孔中運(yùn)行4個板。

Std1，200μg/mL＝500μL 400μg/mL+500μL EB

Std2，100μg/mL＝500μL 200μg/mL+500μL EB

Std3，50μg/mL＝500μL 100μg/mL+500μL EB

Std4，25μg/mL＝500μL 50μg/mL+500μL EB

Std5，12.5μg/mL＝500μL 25μg/mL+500μL EB

Std6，6.25μg/mL＝500μL 12.5μg/mL+500μL EB

Std7，3.125μg/mL＝500μL 6.25μg/mL+500μL EB

Std8，1.56μg/mL＝500μL 3.125μg/mL+500μL EB

空白＝500μL EB

*注意：Std 8用作校準(zhǔn)曲線的錨點(diǎn)，并且將不被認(rèn)為是校準(zhǔn)

物。方法的LLOQ為3.125μg/mL。

2)制備牛血清白蛋白(BSA)測定QC

a)如下制備HQC、MQC和LQC溶液：

HQC，75μg/mL＝3mL 1mg/mL BSA+37mL EB

MQC，40μg/mL＝1.6mL 1mg/mL BSA+38.4mL EB

LQC，20μg/mL＝800μL 1mg/mL BSA+39.2mL EB

b)將300μL的每種QC等分到預(yù)標(biāo)記管中并且在-80℃下冷凍儲存直至分析那天。

3)制備BCA^TM工作試劑。

a)將240μL BCA^TM試劑B與12mL BCA^TM試劑A/96孔板(透明的聚苯乙烯96孔平底板；Becton Dickinson目錄號：#3072，或等同物)混合。

b)將孔渦旋。

4)根據(jù)板圖，使用單通道電子移液器以多分配模式將50μL/孔標(biāo)準(zhǔn)品和QC一式兩份加入測定板中。在添加之前，將每個管渦旋。

5)使用多管渦旋器，將樣品的深孔板渦旋30秒。

6)根據(jù)板圖，使用8通道電子移液器以反向移液模式將50μL/孔未知樣品從深孔板單倍加入測定板中。

7)使用8通道電子移液器以多分配模式添加100μL/孔BCA^TM工作試劑(在步驟#3中制備的)。用塑料蓋覆蓋。

8)在干燥塊加熱器上在39℃下將板培養(yǎng)45分鐘。(注意：測定板中的溶液的實(shí)際溫度為約37℃)

9)測量光學(xué)密度：利用計(jì)算機(jī)控制的酶標(biāo)儀在562nm的波長下讀取所述板。使用對應(yīng)的板讀取軟件生成數(shù)據(jù)。推薦以下酶標(biāo)儀設(shè)置：

儀器參數(shù)：

模式：Endpt L1

波長：L1:562nm

自動混合：開啟

數(shù)據(jù)分析：

統(tǒng)計(jì)計(jì)算：

在兩個孔中測定標(biāo)準(zhǔn)和對照，產(chǎn)生兩個光學(xué)密度值(OD)。OD結(jié)果記錄為兩個OD值的均值(平均值)。用于數(shù)據(jù)分析的回歸算法是校準(zhǔn)基準(zhǔn)的標(biāo)稱濃度和平均OD值的二次擬合。

％CV(變異系數(shù))＝(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均OD)*100％

％偏差(僅適用于標(biāo)準(zhǔn)品和QC)＝((計(jì)算的濃度-標(biāo)稱濃度)/標(biāo)稱濃度)*100％

驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：

1)兩個孔(％CV)

介于兩個OD值之間的％CV必須滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：

a)就標(biāo)準(zhǔn)品1-6和未知樣品而言(如果以一式兩份分析)，％CV必須為≤20.0％。

b)LLOQ的％CV(標(biāo)準(zhǔn)品7，3.125μg/mL)將從驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)中排除；參見％偏差的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)(部分2a)。

c)不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的任何未知的樣品將被記錄為“NR”，并且必須在后續(xù)運(yùn)行中重新分析。

d)在每個QC含量下，對于至少50％的測定QC而言，％CV必須為≤20.0％。對于至少67％的測定QC而言，％CV必須為≤20.0％。

2)％偏差

a)標(biāo)準(zhǔn)品：就偏差％而言，最少75％的校準(zhǔn)物必須滿足以下驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：

i)標(biāo)準(zhǔn)品1-6的反算濃度必須在標(biāo)稱濃度的20％以內(nèi)(偏差±20.0％)。

ii)LLOQ(標(biāo)準(zhǔn)品7，3.125μg/mL)的反算濃度必須在標(biāo)稱濃度的25％內(nèi)(偏差±25.0％)。標(biāo)準(zhǔn)品8(1.56μg/mL)用作校準(zhǔn)曲線的錨點(diǎn)，并且將不被認(rèn)為是校準(zhǔn)物。

b)測定QC：在每個QC含量下，至少50％的測定QC值必須在標(biāo)稱濃度的20％內(nèi)(偏差±20.0％)。至少67％的測定QC的反算濃度必須在標(biāo)稱濃度的20％內(nèi)(偏差±20.0％)。

3)只有在方法執(zhí)行期間發(fā)生記錄的技術(shù)錯誤，并且該錯誤證明隱藏了一個或多個空白孔時，才允許隱藏一個或多個空白孔。

4)對于標(biāo)準(zhǔn)品1-7的每個孔而言，在平板空白校正之后的光學(xué)密度(OD)值必須≥0.001。如果在任何標(biāo)準(zhǔn)孔中的OD值小于0.001，則應(yīng)當(dāng)在后續(xù)運(yùn)行中重新分析樣品。

組胺的測量

該測定是基于：(1)US 8420054(其是指來自分層上皮且不是黏膜上皮組織的測量)以及(2)Kerr,K.，Schwartz,J.R.，F(xiàn)illoon,T.，F(xiàn)ieno,A.，Wehmeyer,K.，Szepietowski,J.C.和Mills,K.J.；Scalp Stratum Corneum Histamine Levels：Novel Sampling Method Reveals Association with Itch Resolution in Dandruff/Seborrhoeic Dermatitis Treatment，Acta Derm Venereol91：404-408，2011)。

程序

在“制備刷樣品以測量糖原”的步驟6之后，將提取物轉(zhuǎn)移到深孔板中。

1.將每個提取物管開蓋。

2.根據(jù)板模板，將管按順序置于MultiPROBE架中。

3.使用自動液體處理器，將上清液的等分試樣(在離心步驟后，等分試樣應(yīng)該接近足夠測量組氨所需的量，例如可以為100μL等分試樣)轉(zhuǎn)移到空的96孔深孔板(Axygen板)中。取決于結(jié)果，即，過高濃度的組氨，可能需要稀釋上清液樣品。

4.可用常規(guī)試劑諸如白蛋白補(bǔ)充樣品，以有助于防止分析物到實(shí)驗(yàn)室器皿壁的損失。

5.將蓋墊牢固緊固于深孔板上。

6.使用多管渦旋器將深孔板渦旋10秒。

7.在-80℃下，將深孔板冷凍，以用于將來的分析。

檢測結(jié)果

1.可通過常規(guī)方法制備組胺標(biāo)準(zhǔn)品和對照物。組氨將利用組胺酶免疫測定(EIA)試劑盒(Histamine EIA Kit(美國分銷商，Cayman Chem Co.#589651/Histamine EIA kit Manufacture(France)，SPbio#A05890)來定量。

2.洗滌緩沖液、衍生化試劑、組胺ACHe示蹤劑和Ellman試劑可以通過常規(guī)方法制備。

3.將標(biāo)準(zhǔn)品、對照和樣品在深孔板中衍生化。

4.利用緩沖液和標(biāo)準(zhǔn)品洗滌所述板，將空白、樣品和質(zhì)量對照加入板中并且在4℃下培養(yǎng)24小時。

5.然后洗滌所述板，然后添加Elman試劑并且在室溫下在黑暗中培養(yǎng)。

6.可通過標(biāo)準(zhǔn)分光光度法讀板。通過標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法和計(jì)算進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

在另一個實(shí)施方案中，將從刷獲得的提取物置于96孔板中。每個孔添加穩(wěn)定同位素標(biāo)記的組胺(Dsub.4-組胺)內(nèi)標(biāo)(ISTD)并用酸化水稀釋。在96-孔聚丙烯板中用加入ISTD的酸化水制備一組組胺標(biāo)準(zhǔn)品，其包括合適的校準(zhǔn)范圍。使用反相梯度高效液相色譜法與串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC/MS/MS)分析標(biāo)準(zhǔn)品和刷提取物。通過正離子電噴霧(ESI)監(jiān)測組胺和ISTD。通過給信號繪圖構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，本文將其定義為每個標(biāo)準(zhǔn)品與對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的組胺質(zhì)量的峰面積比率(峰面積組胺/峰面積ISTD)。然后使用生成的回歸公式返算在校準(zhǔn)基準(zhǔn)和刷提取物樣品中的組胺質(zhì)量?？蓪⒔Y(jié)果報告為組胺的質(zhì)量，或者可通過除以也存在于刷提取物中的蛋白質(zhì)的量將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。

細(xì)胞因子的測量

雖然本文所述的程序詳細(xì)描述了白介素1α(IL-1α)和白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(IL-1ra)的測定，但是對于其它白介素諸如IL-6、IL-8、IL-10等(不受限制)的類似測定可以類似的方式進(jìn)行。

試劑

1.Bio-Plex Pro^TM人細(xì)胞因子IL-1α測定，Bio-Rad Laboratories,Inc.Hercules，California，USA，目錄號：YF0001DVXM。試劑盒包含以下組分，其全部在2–8℃下儲存：

a)人細(xì)胞因子23-Plex標(biāo)準(zhǔn)品，第II組(目錄號：171-D60001)，凍干的。

b)IL-1α偶合磁串珠(10X，目錄號：171-B6001M)，600μL

c)IL-1α檢測抗體(10X)，320μL

d)鏈霉親和素-藻紅蛋白，100X；光敏的，儲存在黑暗中。

e)測定緩沖液，50mL

f)洗滌緩沖液，130mL(目錄號：171-304500，1.5L)

g)檢測抗體稀釋劑，5mL

2.人細(xì)胞因子27-Plex標(biāo)準(zhǔn)品，第I組(目錄號：171-D50001)，凍干的。

3.Bio-Plex Pro^TM人細(xì)胞因子IL-1ra組，Bio-Rad Laboratories,Inc.，目錄號：171B5002M。儲存在2–8℃下：

a)IL-1α偶合磁串珠(10X，目錄號：171-B5002M)，600μL

b)IL-1ra檢測抗體(10X)，320μL

4.水，用Millipore Milli-Q過濾體系純化；或等同物。

5.5M氯化鈉(NaCl)，Sigma目錄號：S5150；或等同物。

6.蛋白酶抑制劑混合片，COMPLETE^TM，Roche Diagnostics GmbH(Mannheim，Germany)，目錄號：11-697-498-001。

7.磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)緩沖液包，Sigma.，目錄號：P3813。將1PBS緩沖液包稀釋于1升水中。在室溫下儲存PBS溶液至多1個月。

8.牛血清白蛋白(BSA)，30％Sigma，目錄號：A8577；或等同物。

9.提取緩沖液(“EB”，PBS+0.25M NaCl+蛋白酶抑制劑)。制備PBS溶液(試劑#7)。將50mL 5M NaCl(試劑#6)加入950mLPBS中以制備0.25M NaCl。使用0.2μm過濾瓶過濾。向該溶液中，溶解20個蛋白酶抑制劑片(試劑#6)/1000mL。在室溫下儲存至多1個月。

10.細(xì)胞因子樣品緩沖液(“CSB”，PBS+0.25M NaCl+蛋白酶抑制劑+2％BSA)。將2mL的30％BSA(試劑#8)加入28mL細(xì)胞因子提取緩沖液(試劑#9)中。在2–8℃下儲存至多一周。

11.Bio-Rad鞘液，20L，目錄號：171-000055，或等同物。

12.Bio-Rad校準(zhǔn)試劑盒，目錄號：171-203060。

設(shè)備和材料：

1.自動液體處理器，Packard MultiPROBE，Perkin-Elmer；Waltham，Massachusetts，USA，或等同物。

2.Bio-Plex懸浮液測定體系，Bio-Rad Laboratories,Inc.；或等同物。

3.Bio-Plex Workstation，Bio-Rad Laboratories,Inc.的Bio-Plex管理軟件；或等同物。

4.Bio-Plex Pro II清洗站(用于基于磁性和聚苯乙烯串珠的測定)，目錄號：300-34377，Bio-Rad Laboratories,Inc.；或等同物。

5.超聲波清洗機(jī)，Branson Ultrasonics Corporation(Danbury，Connecticut，USA)；或等同物。

6.離心機(jī)，Allegra X-12R，Beckman-Coulter(Fullerton，California，USA)；或等同物。

7.渦旋攪拌器，Vortex Genie-2，VWR Scientific Products Inc.，目錄號：58815-178；或等同物。

8.滴定板振蕩器，Lab-line Instruments,Inc.(VWR目錄號：57019-0600)，或等同物。

9.96-孔黑色平底微型板，目錄號：171-025001，Bio-Rad Laboratories,Inc.。

10.96-孔V型底微型板，目錄號：651261，Greiner Bio-One International AG(Kremsmünster，Austria)；或等同物。

11.鋁密封膜，目錄號：PCR-AS-200，Axygen Scientific；或等同物。

12.粘合劑微型板密封膜，VWR目錄號：60941-062；或等同物。

13.一次性試劑貯存器，Vista Lab，50mL，VWR目錄號：802026-350；或等同物。

14.電子多通道和單通道分配移液器，具有對應(yīng)的一次性移液端的手動移液器；或等同物。

15.聚丙烯微離心管，2.0mL，Bio-Plas,Inc.，San Rafael，CA，目錄號：4204；或等同物。

16.微離心管，1.7mL，Sorenson BioScience，目錄號：11700；或等同物。

17.聚丙烯錐形離心管(15ml，目錄號：352097和50mL，目錄號：352098)，Becton Dickinson，或等同物。

18.Nunc 96孔2mL深孔板，VWR目錄號：73520-474；或等同物。

19.密封墊96深圓孔收集板(2.0mL)，目錄號：AM-2ML-RD Axygen Scientific；或等同物。

20.真空過濾器單元，PES膜，0.2μm孔徑，無菌，NALGENE目錄號：567-0020；或等同物。

程序：

在“制備刷樣品以測量糖原”的步驟6之后，將提取物轉(zhuǎn)移到深孔板中。

1.將每個提取物管開蓋。

2.根據(jù)板模板，將管按順序置于MultiPROBE架中。

3.將40μL/孔的30％BSA(試劑#8)加入96孔深孔板中。

4.使用自動液體處理器，將上清液的等分試樣(在離心步驟后，等分試樣應(yīng)該接近足夠測量細(xì)胞因子所需的量，例如可以為250μL等分試樣)轉(zhuǎn)移到空的96孔深孔板(Axygen板)中。取決于結(jié)果，即，過高濃度的蛋白質(zhì)，可能需要稀釋上清液樣品。

5.將蓋墊牢固緊固于深孔板上。

6.使用多管渦旋器將深孔板渦旋10秒。

7.在-80℃下，將深孔板冷凍，以用于將來的分析。

測定

1)在工作臺上使測定試劑、基質(zhì)QC和研究樣品平衡至室溫(20-25℃)。

2)通過將2mL的30％BSA(試劑#8)加入28mL細(xì)胞因子提取緩沖液(試劑#9)中來制備細(xì)胞因子樣品緩沖液(CSB，試劑#10)。

3)制備人細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品。

a)利用250μL CSB重構(gòu)每瓶人細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品：組I(試劑#2)和組II(試劑#1a)。將每個小瓶溫和渦旋3秒。使小瓶在冰上培養(yǎng)30分鐘。

b)為制備工作標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行組I/II標(biāo)準(zhǔn)混合物的系列稀釋。每次稀釋后將孔渦旋。對于工作Std 1的濃度，參考每個批次的標(biāo)準(zhǔn)值卡。

Std 1＝190μL組I Std混合物+190μL組II Std混合物+215μL CSB

Std 2＝150μL Std 1+450μL CSB

Std 3＝150μL Std 2+450μL CSB

Std 4＝150μL Std 3+450μL CSB

Std 5＝150μL Std 4+450μL CSB

Std 6＝150μL Std 5+450μL CSB

Std 7＝150μL Std 6+450μL CSB

Std 8＝150μL Std 7+450μL CSB

Std 9＝150μL Std 8+450μL CSB

空白＝CSB

*將標(biāo)準(zhǔn)品1從IL-1α校準(zhǔn)曲線中排除(隱藏)，并且將不認(rèn)為是IL-1α的校準(zhǔn)物。標(biāo)準(zhǔn)品2是IL-1α的方法的ULOQ(定量的上限)。

**將標(biāo)準(zhǔn)品9從IL-1ra校準(zhǔn)曲線中排除(隱藏)，并且將不認(rèn)為是IL-1ra的校準(zhǔn)物。標(biāo)準(zhǔn)品8是IL-1ra的方法的LLOQ(定量的下限)。

人細(xì)胞因子校準(zhǔn)品濃度(pg/mL)–示例：批號：5023535、5015357

4)制備人類細(xì)胞因子測定QC

a)為制備測定QC-1(AQC-1)，向900μL CSB中加入100μLStd 1，渦旋。

b)通過向900μL CSB中加入100μL AQC-1，渦旋，來制備Std1的100倍稀釋液。

c)為制備測定QC-2(QC-2)，向400μL CSB中加入100μL步驟4b中制備的溶液，渦旋。

5)向200μL的CSB中加入200μL每種新鮮解凍的HQC和LQC，渦旋來制備基質(zhì)QC的2倍稀釋液。

6)制備1X抗體固定化串珠，避光。

a)在中等速度下將所述串珠瓶渦旋30秒。將任何滯留液體從頂蓋中移除。

b)將串珠稀釋10倍：575μL IL-1α_串珠(試劑#1b)+575μLIL-1ra串珠(試劑#3a)+4.6ml測定緩沖液(試劑#1e)；渦旋。

c)在使用之前，在室溫下平衡20min。

7)制備經(jīng)稀釋的樣品提取物。

a)樣品提取物的深孔板在多管渦旋器上渦旋30秒。

b)以3000rpm將深孔板離心以移除碎片。

c)通過使用8通道移液器(反向移液模式)，根據(jù)96孔板模板，將50μL樣品提取物加入50μL CSB中到V型底附加板中，來制備2倍樣品稀釋物。

8)加載附加的板

a)使用單通道移液器(多分配模式，2×100μL)，根據(jù)板模板，將100μL標(biāo)準(zhǔn)品、測定QC和經(jīng)稀釋的基質(zhì)QC加入V型底附加板的每個孔中。

b)利用塑料板密封器密封。

9)Prime Bio-Plex Pro II清洗站。

a)利用DI水填充液體瓶2；Prime通道2。

b)將容納足夠的Bio-Plex洗滌緩沖液的液體瓶1附接到清洗站；Prime通道1。

10)將1X抗體固定化串珠加入黑色的平底測定板中。

a)以中等速度將稀釋的串珠渦旋30秒。

b)將經(jīng)稀釋的串珠倒入試劑貯存器中并且使用8通道移液器(多分配模式)將50μL加入黑色平底板的每個孔中。

11)使用Bio-Plex Pro II清洗站將測定板洗滌兩次。

a)使得板位于磁鐵上15秒。

b)使用MAG X2程序?qū)⒖紫礈靸纱巍?/p>

c)利用洗滌緩沖液–通道1沖洗一白天。

12)加載黑色平底測定板

a)將附加板在板振蕩器上(300rpm)溫和渦旋3秒。

b)使用8通道移液器(反向移液模式)，根據(jù)板膜板，將50μL標(biāo)準(zhǔn)品、測定QC、經(jīng)稀釋的基質(zhì)QC、和經(jīng)稀釋的樣品提取物加入黑色平底測定板的每個孔中。

13)利用箔板密封器將測定板密封，并且在室溫(20-25℃)下在板振蕩器上培養(yǎng)40分鐘。

a)利用箔粘合劑板密封器密封板以避光。

b)緩慢增加板振蕩器速度直至1100rpm(速度10)；振搖30秒。

c)緩慢降低板振蕩器速度直至300rpm(速度3)

d)在室溫(20-25℃)下在板振蕩器上培養(yǎng)40分鐘。

14)制備1X檢測抗體(DAb)

a)以中等速度將10X DAb渦旋20s，之后，進(jìn)行30秒快速旋轉(zhuǎn)。

b)添加300μL的10X IL-1α_DAb(試劑#1c)+300μL的10XIL-1ra DAb(試劑#3b)+2.4ml檢測抗體稀釋劑(試劑#1g)。

15)使用Bio-Plex Pro II清洗站將測定板洗滌三次。

a)使得板位于磁鐵上15秒。

b)使用MAG X3程序?qū)⒖紫礈靸纱巍?/p>

c)利用洗滌緩沖液–通道1沖洗一白天。

16)將1X檢測抗體加入黑色的平底測定板中。

a)將1X檢測抗體溫和渦旋3秒。

b)倒入試劑貯存器中并且使用8通道移液器(多分配模式)將25μL 1X檢測抗體加入每個孔中。

17)利用箔板密封器將測定板密封，并且在室溫(20-25℃)下在板振蕩器上培養(yǎng)30分鐘。

a)利用箔粘合劑板密封器密封板以避光。

b)緩慢增加板振蕩器速度直至1100rpm(速度10)；振搖30秒。

c)緩慢降低板振蕩器速度直至300rpm(速度3)

d)在室溫(20-25℃)下在板振蕩器上培養(yǎng)30分鐘。

18)制備1X鏈霉親和素-PE。優(yōu)選在使用之前10min，制備鏈霉親和素-PEP并避光。

a)以中等速度將100X鏈霉親和素-PE(試劑#1d)渦旋20秒，之后，進(jìn)行30秒快速旋轉(zhuǎn)。

b)將60μL的100X鏈霉親和素-PE加入5.94ml測定緩沖液中。將孔渦旋。

19)使用Bio-Plex Pro II清洗站將測定板洗滌三次。

a)使得板位于磁鐵上15秒。

b)使用MAG X3程序?qū)⒖紫礈靸纱巍?/p>

c)利用洗滌緩沖液–通道1沖洗一白天。

20)將1X鏈霉親和素-PE加入黑色平底測定板中。

a)以中等速度將1X鏈霉親和素-PE渦旋5秒。

b)倒入試劑貯存器中并且使用8通道移液器(多分配模式)將50μL 1X鏈霉親和素-PE加入每個孔中。

21)利用箔板密封器將測定板密封，并且在室溫(20-25℃)下在板振蕩器上培養(yǎng)10分鐘。

a)利用箔粘合劑板密封器密封板以避光。

b)緩慢增加板振蕩器速度直至1100rpm(速度10)；振搖30秒。

c)緩慢降低板振蕩器速度直至300rpm(速度3)

d)在室溫(20-25℃)下在板振蕩器上培養(yǎng)10分鐘。

22)使用Bio-Plex Pro II清洗站將測定板洗滌三次。

a)使得板位于磁鐵上15秒。

b)使用MAG X3程序?qū)⒖紫礈靸纱巍?/p>

c)利用水–通道2的沖洗過夜。

23)將串珠重新懸浮于測定緩沖液中。

a)使用8通道移液器將120微升測定緩沖液加入每個孔中。

b)利用箔粘合劑板密封器密封板以避光。

c)緩慢增加板振蕩器速度直至1100rpm(速度10)；振搖30秒。

24)在Bio-Plex懸浮液測定讀數(shù)器中運(yùn)行板。每個區(qū)域讀取50個串珠，樣品體積：50μl。DD門：5,000至25,000

25)在分析第二測定板時，重復(fù)步驟3–25。

96-孔板模板

數(shù)據(jù)分析：

統(tǒng)計(jì)計(jì)算：

在兩個孔中測定標(biāo)準(zhǔn)品，產(chǎn)生兩個熒光強(qiáng)度(FI)值。使用5-參數(shù)邏輯擬合(5-PL)非線性回歸曲線擬合法，將每個細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)品的兩個FI值的均值(平均值)作圖并分析。從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推每個細(xì)胞因子的濃度。

％CV(變異系數(shù))＝(標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均FI)*100％

％偏差(僅適用于標(biāo)準(zhǔn)品和測定QC)＝((計(jì)算的濃度-標(biāo)稱濃度)/標(biāo)稱濃度)*100％

％回收率(僅適用于標(biāo)準(zhǔn)品和測定QC)＝(計(jì)算的濃度/標(biāo)稱濃度)*100％

計(jì)算的濃度＝觀察到的濃度；從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推

標(biāo)稱濃度＝預(yù)期的濃度

驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)：

1)兩個孔(％CV)

介于兩個FI值之間的％CV必須滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：

a)對于每個細(xì)胞因子的至少75％的標(biāo)準(zhǔn)品，％CV必須為μ_20％(或者對于LLOQ(定量的下限)為μ_25％)。

b)對于樣本，％CV必須為μ_20％(如果以一式兩份運(yùn)行)。不滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的任何未知的樣品將被記錄為“NR”，并且必須在后續(xù)運(yùn)行中重新分析。

2)％偏差(％回收率)

代謝物的測量

在“制備刷樣品以測量糖原”的步驟6之后，將上清液的等分試樣轉(zhuǎn)移到新鮮管中并冷凍至-70℃或以下，用于將來的分析。將樣品運(yùn)輸至Metabolon,Inc.(Durham，NC)用于鑒定和量化代謝物。進(jìn)行功能元件的Heirarchal圖譜繪制，其包括與下列相關(guān)聯(lián)的代謝物：(1)氧化應(yīng)激反應(yīng)(示例不限于谷胱甘肽、S-甲基谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸)，(2)蛋白質(zhì)代謝(示例不限于甲硫氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、丙氨酰谷氨酸、蘇氨酰亮氨酸)，(3)糖原分解(示例不限于麥芽六糖、麥芽五糖、麥芽糖、麥芽三糖)，(4)戊糖磷酸化途徑或PPP(示例不限于阿糖醇、山梨醇、甘露醇)，(5)炎癥(示例不限于12-羥基二十碳四烯酸或12-HETE、花生四烯酸酯、亞油酸酯)，煙酰胺代謝和膜成形(示例不限于磷酸膽堿、磷酸乙醇胺、甘油磷酸乙醇胺)。

除了處女膜區(qū)之外，還可使用帶條收集程序，之后進(jìn)行提取和分析，從陰唇區(qū)獲得淺表組織樣品?？蓪⒌米訡uderm的D-Squame帶用于收集樣品。

申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)陰道口的黏膜組織經(jīng)歷類似于陰道腔的顯著變化。如圖1中所示，組織學(xué)圖像示出類似于陰道的陰道口處的顯著解剖學(xué)和組織學(xué)變化。例如，從絕經(jīng)后組獲取的樣品中的上皮組織相對于從絕經(jīng)前組或絕經(jīng)后+HRT組獲取的樣品看起來顯著更薄。通常由糖原填充的上皮細(xì)胞是扁平的。與陰道口相關(guān)聯(lián)并且受絕經(jīng)狀態(tài)影響的新的特征結(jié)構(gòu)是網(wǎng)嵴或網(wǎng)釘?shù)某霈F(xiàn)(由白色箭頭表示)。這些是侵入真皮中并用于穩(wěn)定或提供與下面真皮的強(qiáng)結(jié)合的上皮組織。該特征結(jié)構(gòu)通常對于暴露于空氣的分層鱗狀上皮觀察到。在絕經(jīng)情況下，相對于絕經(jīng)前，存在網(wǎng)釘?shù)乃p或縮短/消失。在HRT治療的情況下，上皮組織的厚度和網(wǎng)釘?shù)某叽鐑烧呔黾?絕經(jīng)后+HRT圖)。

在圖2中，可使用下式(使用4倍或10倍放大倍數(shù)的圖像，優(yōu)選地10倍圖像)測量上皮組織的相對厚度和網(wǎng)釘?shù)南鄬ωS度：

曲線“O”是指介于上皮組織和空氣或石蠟界面之間的界面。曲線“U”是指介于上皮組織和真皮組織之間的邊界。形成組織圖像的邊界線使得在沒有網(wǎng)釘?shù)膮^(qū)域中穿過“O”和“U”線繪制垂直線(或幾乎這種線)。測定邊界之間的線“O”和“U”的長度(以像素測量)。為測定網(wǎng)釘豐度的近似值，將“U”的長度除以“O”。形成跨“O”和“U”線繪制的附加垂直線(或幾乎此類線；d1,d2,…dn)，并測量上皮厚度“d”(以像素測量)。為測定上皮厚度的近似值，使用下式。

E_th＝上皮厚度

O＝上皮-空氣界面的以像素計(jì)的測量線。

U＝上皮-真皮界面的以像素計(jì)的測量線。

d₁,d₂,…d_n＝穿過上皮組織的線

類似地，申請人已發(fā)現(xiàn)使用轉(zhuǎn)錄組熱圖可用于確定處女膜區(qū)和大陰唇中的變化。

基因活性分析(也被稱為轉(zhuǎn)錄組學(xué))可對于從陰唇或處女膜區(qū)獲得的活組織標(biāo)本進(jìn)行，以確定與絕經(jīng)和治療效果相關(guān)聯(lián)的變化。轉(zhuǎn)錄圖譜是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，如Cotreau等人所示(Cotreau MM，Chennathukuzhi VM，Harris HA，Han L，Dorner AJ，Apseloff G，Varadarajan U，Hatstat E，Zakaria M，Strahs AL，Crabtree JS，Winneker RC，和Jelinsky SA.Maturitas 58：366-376，2007)，其中轉(zhuǎn)錄圖譜源自陰道活組織檢查以確定雌激素的皮膚貼片對陰道萎縮的影響。其中分析數(shù)據(jù)以分級群聚從而使全局模式可視化的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的更普遍方法可使用OmniViz 6.1.4版軟件(Instem Scientific，Cambridge，UK)來進(jìn)行?？墒褂门cDAVID生物信息學(xué)資源(http://david.abcc.ncifcrf.gov)相似并且還可存在于以下參考文件中的基因本體論術(shù)語和方法來進(jìn)行生物學(xué)主題分析以鑒定調(diào)節(jié)的生物過程，(1)Huang da,W.,B.T.Sherman，和R.A.Lempicki，Systematic and integrative analysis of large gene lists using DA VID bioinformatics resources.Nat Protoc，2009。4(1)：第44-57頁，和(2)Huang da,W.，B.T.Sherman，和R.A.Lempicki，Bioinformatics enrichment tools：paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists。Nucleic Acids Res 25，33892009。37(1)：第1-13頁。轉(zhuǎn)錄組圖譜還可得自來自大陰唇或小陰唇的淺表上皮收集物，其得自條帶。

使用Affymetrix HT 3’IVT表達(dá)盒(目錄號#901253，Santa Clara，California，USA)和由Affymetrix提供的方案，將從提取的活組織標(biāo)本獲得的純化RNA轉(zhuǎn)換成生物素標(biāo)記的cRNA副本，如在BeckmanFX^p實(shí)驗(yàn)室自動化工作站(Beckman目錄號#A31842，Beckman Coulter，Brea，California，USA)上進(jìn)行的。通過有限的堿解將生物素化的cRNA片段化并且然后使用Affymetrix儀和由Affymetrix提供的方案雜交過夜至AffymetrixHG-U219陣列板。在處理之后，使用PLIER算法將芯片圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)值數(shù)據(jù)，如在Affymetrix基因芯片表達(dá)控制臺中所執(zhí)行的。

具體地，申請人發(fā)現(xiàn)在對應(yīng)于約22,000個基因的大約49,000個基因探針組中，可預(yù)期大約2500個探針組或約5％僅在p<0.05下是偶然顯著的(t檢驗(yàn)比較)。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，女性的雌激素狀態(tài)(絕經(jīng)前對絕經(jīng)后，或絕經(jīng)后對絕經(jīng)后+HRT)導(dǎo)致基因探針表達(dá)的顯著變化多于偶然性(表1)。

表1：

就在處女膜環(huán)處(上表中的陰道口)獲得的樣品而言，利用HRT治療絕經(jīng)后女性導(dǎo)致基因探針的約18％變化(其活性變化(8787/49293))，即轉(zhuǎn)錄活性增加或減小。就在大陰唇處獲得的樣品而言，利用HRT治療絕經(jīng)后女性導(dǎo)致約8％的基因組受到HRT顯著影響(4032/49293)。當(dāng)在更嚴(yán)格的p<0.01(t-檢驗(yàn)比較)下過濾數(shù)據(jù)時，從絕經(jīng)后對絕經(jīng)前女性獲得的處女膜環(huán)樣品的分級基因簇分析示出共計(jì)9060個基因探針組滿足該標(biāo)準(zhǔn)。維恩圖分析示出(圖3)在絕經(jīng)后女性中增加的那些基因探針(5610個基因探針組)中，93.7％(5256個)通過HRT治療絕經(jīng)后女性逆轉(zhuǎn)。在絕經(jīng)后女性中減少的那些基因探針(3450個)中，97.1％(3349)通過HRT治療絕經(jīng)后女性逆轉(zhuǎn)。就從絕經(jīng)后對絕經(jīng)前女性的大陰唇處獲得的樣品，和以p<0.01的相同嚴(yán)格性類似地過濾的數(shù)據(jù)而言，共計(jì)1620個基因探針組滿足該變化標(biāo)準(zhǔn)。在絕經(jīng)后女性中增加的來自大陰唇的那些基因探針(846個基因探針組)中，89.4％(756個)通過HRT治療絕經(jīng)后女性逆轉(zhuǎn)。在絕經(jīng)后女性中減少的那些基因探針(774個)中，84.9％(657個)通過HRT治療絕經(jīng)后女性逆轉(zhuǎn)。

具體地講，申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在處女膜區(qū)調(diào)節(jié)膠原相關(guān)的基因，這是與利用絕經(jīng)治療逆轉(zhuǎn)的絕經(jīng)相關(guān)聯(lián)的變化(增加或減少)。其活性通過絕經(jīng)改變并通過絕經(jīng)治療逆轉(zhuǎn)的膠原相關(guān)的基因的示例包括：I型膠原蛋白、III型膠原蛋白、V型膠原蛋白、VIII型膠原蛋白、XVI型膠原蛋白、XVII型膠原蛋白、賴氨酰氧化酶、原纖蛋白、纖調(diào)蛋白、整聯(lián)蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、組織蛋白酶L1、光蛋白聚糖、皮連蛋白、微原纖締締合的蛋白4、結(jié)締組織生長因子、基質(zhì)金屬肽酶10。另外，衰老相關(guān)的基因類似地通過絕經(jīng)萎縮治療以及絕經(jīng)前和經(jīng)歷陰道萎縮的那些之間的變化來調(diào)節(jié)。其它線粒體結(jié)構(gòu)蛋白、核糖體RNA和與能量產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的酶(包括電子傳輸鏈和細(xì)胞呼吸)類似地通過絕經(jīng)萎縮治療以及絕經(jīng)前和經(jīng)歷陰道萎縮的那些之間的變化來調(diào)節(jié)。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于評估萎縮的基因探針組的變化可限于與膠原表達(dá)相關(guān)聯(lián)的基因探針。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于評估萎縮的基因探針組的變化可限于細(xì)胞周期進(jìn)展。

申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷陰道萎縮的絕經(jīng)前女性對絕經(jīng)后女性在其臨床萎縮等級、陰道干燥度和性交疼痛等級方面不同。申請人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)處女膜區(qū)處的pH與陰道腔處的pH最密切相關(guān)。申請人還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，大陰唇的pH隨絕經(jīng)的開始增加可測量的量并且隨著絕經(jīng)萎縮治療逆轉(zhuǎn)。

在大陰唇、小陰唇、和/或陰道口處測試允許評估陰道萎縮，但不需要在陰道腔內(nèi)插入窺器。上述方法系列允許使用下列方法來評估：pH、刷敏感性、來自刷或活組織標(biāo)本的糖原水平評估、來自刷或活體組織標(biāo)本的蛋白質(zhì)評估、分析從活體組織標(biāo)本獲取的上皮細(xì)胞、使用熱圖、用于測定基因表達(dá)的基因活性、或它們的組合。

申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)上述方法可用于評估治療方案之前和之后的陰道萎縮程度。

在一個實(shí)施方案中，方法系列可用于評估治療。所述治療可以使pH相對于萎縮降低0.1至2.0個pH單位或0.3個單位至1.5個單位。在一個實(shí)施方案中，方法系列可用于評估治療。所述治療可導(dǎo)致陰道口具有3.5至5.8個單位的pH。

在一個實(shí)施方案中，方法系列可用于通過分析陰道口處的上皮細(xì)胞和處女膜環(huán)處的網(wǎng)釘豐度來評估治療。所述治療可示出使網(wǎng)釘豐度增加10至100％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析陰道口處的上皮細(xì)胞的方法還可包括測量治療之前和之后的處女膜上皮的厚度。治療可示出使厚度相對于萎縮增加10至300％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析陰道口處糖原的方法還可包括測量治療之前和之后的糖原量。所述治療可示出使糖原的量增加10至300％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析陰道口處的蛋白質(zhì)合成的組分諸如N-甲酰甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的方法還可包括測量治療之前和之后的N-甲酰甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的量。治療可示出使蛋白質(zhì)合成的組分諸如N-甲酰甲硫氨酸和/或甲硫氨酸增加10至1000％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析陰道口處的糖原代謝的組分諸如麥芽六糖、和/或麥芽五糖、和/或麥芽三糖、和/或麥芽四糖、和/或麥芽糖的方法還可包括測量治療之前和之后的麥芽六糖、和/或麥芽五糖、和/或麥芽三糖、和/或麥芽四糖、和/或麥芽糖的量。治療可示出使糖原代謝的組分諸如麥芽六糖、和/或麥芽五糖、和/或麥芽三糖、和/或麥芽糖增加10至1000％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析糖酵解的組分諸如葡萄糖、乳酸鹽和丙酮酸鹽的方法。治療可示出使糖酵解的組分諸如葡萄糖、和/或乳酸鹽和/或丙酮酸鹽增加10-500％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析陰道口處的果糖、半乳糖和半乳糖代謝的組分諸如山梨醇、甘露醇和甘露醇-1-磷酸酯的方法還可包括測量治療之前和之后山梨醇、甘露醇、和甘露醇-1-磷酸酯的量。治療可示出使果糖、半乳糖和半乳糖代謝的組分諸如山梨醇、甘露醇和甘露醇-1-磷酸酯降低10-200％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析陰道口處的蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)代謝的組分(包括如上所述的氨基酸和二肽)的方法還可包括測量治療之前和之后的氨基酸和二肽的量。治療可示出使氨基酸和二肽的量增加10-5000％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析陰道口處的炎癥的組分諸如12-HETE、和/或花生四烯酸、和/或亞油酸酯的方法還可包括測量治療之前和之后的12-HETE、和/或花生四烯酸、和/或亞油酸酯的量。治療可示出使炎癥的組分諸如12-HETE、和/或花生四烯酸、和/或亞油酸酯減小10至400％的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析陰道口處基因探針活性的方法還可包括測量治療之前和之后的轉(zhuǎn)錄基因探針變化。治療可示出使總基因探針組的1至90％的轉(zhuǎn)錄基因探針活性增加的效果。

治療可示出使總基因探針組的1至90％的轉(zhuǎn)錄基因探針活性減小的效果。

在一個實(shí)施方案中，分析處女膜環(huán)處膠原相關(guān)基因的活性的方法還可包括測量治療之前和之后的轉(zhuǎn)錄變化。治療可示出使膠原相關(guān)基因的活性增加10至400％的效果。

治療可示出使膠原相關(guān)基因的活性減小10至400％的效果。

治療物可以包括陰唇或陰道施用的潤膚劑，其包含：雌激素化合物、異黃酮或植物甾醇、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和皮膚治療劑(諸如但不限于煙酰胺和/或泛醇)、透明質(zhì)酸、脂肪油、緩沖酸、保濕劑、以及它們的混合物。治療物還可包括口服或皮膚遞送體系，其包含雌激素。通常經(jīng)由口服或皮膚給藥的雌激素治療，也被稱為激素替代療法或HRT。

在一個實(shí)施方案中，油物質(zhì)選擇成在110℃或120℃下具有至少約10小時、至少約14小時，或至少約18小時的油穩(wěn)定性指數(shù)(“OSI”)。用于監(jiān)測氧化穩(wěn)定性的常用措施是隨時間推移氫過氧化物的形成(過氧化物值或PV)。氧化穩(wěn)定性還可以在高溫下使樣品通氣時獲得二次氧化產(chǎn)物所需的時間來表示。該時間(稱為油穩(wěn)定性指數(shù)或OSI)通常使用Rancimat儀(Brinkmann Instruments,Inc.)或OSI儀(Omnion,Inc.)在110C或20C下測量[Amer Oil Chem Soc Oil Stability Index Method Cd 12b-92]。據(jù)信，包含相對高含量的油酸的油物質(zhì)在本發(fā)明的情況下趨于更穩(wěn)定。在一個實(shí)施方案中，油物質(zhì)包含按所述油物質(zhì)的重量計(jì)至少約10％，約10％至約80％，或約15％至約70％的油酸。在一個實(shí)施方案中，所述洗劑組合物包含按所述洗劑組合物的重量計(jì)約0.0005％至約16％，約0.005％至約8％，或約0.01％至約2.4％的油酸。表現(xiàn)出本文所述適宜特性的適宜油物質(zhì)的非限制性示例包括油酸卡諾拉油(蕓苔、油菜，蕪菁；特征在于具有大于70％的油酸含量，例如高油酸卡諾拉油、非常高的油酸卡諾拉油、或部分氫化的卡諾拉油)、馬魯拉仁油(伯爾硬胡桃)、棕櫚油(油棕油)、棕油、棕櫚硬脂、精制棕櫚油、山核桃油、南瓜籽油、油酸紅花油(草紅花；特征在于具有大于約30％的油酸含量，和小于約50％的ω-6脂肪酸含量，例如高油酸紅花油)、芝麻油(芝麻，東方大蒜芥)、大豆油(大豆，例如高油酸大豆、低亞麻酸大豆油，部分氫化的)、油酸向日葵油(向日葵；特征在于具有大于約40％的油酸含量，例如中等油酸向日葵或高油酸向日葵油)、以及它們的混合物。油酸卡諾拉油、棕櫚油、芝麻油、高油酸紅花油、高油酸大豆油、中等油酸向日葵油、和高油酸向日葵油是常見的育種植物衍生的油，并且還可衍生自未經(jīng)基因修飾的生物體(non-GMO)。油物質(zhì)的非限制性示例可從許多供應(yīng)商商購獲得，包括提供部分氫化的大豆油(即110W大豆油或300高度穩(wěn)定大豆油)、中等油酸向日葵油(即中等油酸向日葵油)、高油酸向日葵油(即Clear高油酸向日葵油)、高油酸卡諾拉油、超高油酸卡諾拉、以及部分氫化的低芥酸油菜籽油(即Clear65高油酸卡諾拉油和Clear75高油酸卡諾拉油)的Cargill；提供高油酸卡諾拉油(即Oleocal C104)的Lambert Technology；提供馬魯拉仁油的Arch Personal Care；提供高油酸大豆油(即)的Pioneer；提供低亞麻酸大豆油的Asoyia(即Ultra Low Linolenic Soybean)；以及提供精制芝麻油的Dipasa，Inc.。

皮膚處理劑還可包含輔助性皮膚處理劑，如煙酰胺、氧化鋅、去氧苯比妥、泛醇等、以及它們的混合物。適宜的皮膚處理劑描述于US2003/0082219A1中。

在一個實(shí)施方案中，保濕劑通常以0.1-20％(重量/重量)，優(yōu)選地1-15％(重量/重量)，且更優(yōu)選地2-12％(重量/重量)的質(zhì)量存在。合適的保濕劑為，例如氨基酸、吡咯烷酮羧酸、乳酸及其鹽、乳糖醇、尿素和尿素衍生物、尿酸、葡糖胺、肌酸酐、膠原的裂解產(chǎn)物、脫乙酰殼多糖或脫乙酰殼多糖鹽/衍生物，并且具體地多元醇和多元醇衍生物(例如乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、赤蘚糖醇、1,2,6-己三醇、聚乙二醇諸如PEG-4、PEG-6、PEG-7、PEG-8、PEG-9、PEG-10、PEG-12、PEG-14、PEG-16、PEG-18，PEG-20，PEG-135、PEG 150)、糖和糖衍生物(例如果糖、葡萄糖、麥芽糖、麥芽糖醇、甘露糖醇、肌醇、山梨醇、山梨醇硅烷二醇、蔗糖、海藻糖、木糖、木糖醇、葡萄糖醛酸及其鹽、乙氧基化山梨醇(Sorbeth-6、Sorbeth-20、Sorbeth-30、Sorbeth-40)、蜂蜜和氫化蜂蜜、氫化淀粉水解物、以及氫化小麥蛋白的混合物、水解乳蛋白、卵磷脂、植烷三醇、透明質(zhì)酸及其鹽、和PEG-20-乙酸酯聚合物。特別優(yōu)選的保濕劑是甘油、甘油二酯和甘油三酯。

在一個實(shí)施方案中，雌激素物質(zhì)通常以0.001-10％，優(yōu)選的0.01-8％，更優(yōu)選的0.05-5％的量存在。合適的雌激素物質(zhì)是雌二醇、雌酮和雌三醇。

植物甾醇表示從植物中提取的物質(zhì)。代表性成分可包括甾族和非甾族結(jié)構(gòu)，兩者均具有甾體化合物樣生物活性。甾體物質(zhì)的示例包括植物油衍生的甾體化合物，即谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇。非甾體結(jié)構(gòu)包括異黃酮、黃酮、和香豆酸。異黃酮(其包括染料木黃酮、黃豆苷原、芒柄花黃素和牛尿酚)已經(jīng)被鑒定為與下列相關(guān)聯(lián)的癥狀的有用治療劑：絕經(jīng)和停經(jīng)期前癥候(1996年3月12日授予GORBACH的美國專利5498631)、抑郁癥和癡呆(1998年3月31日授予GORBACH的美國專利US 5733926，2000年7月4日授予GORBACH的美國專利US 6083526)、皮膚皺紋(2000年5月9日授予GORBACH的美國專利6060070)、以及癌癥(授予NOVOGEN的WO 2004022023)。

在一個實(shí)施方案中，異黃酮物質(zhì)通常以0.001％至約40％的異黃酮，優(yōu)選的0.001％至約4％，更優(yōu)選的0.01％至約2％異黃酮的量存在。異黃酮可以選自大豆異黃酮、三葉草異黃酮、染料木黃酮、黃豆甙原、芒柄花素、鷹嘴豆素A、S-牛尿酚、R-牛尿酚或模擬植物提取物。所謂模擬植物提取物，在本申請上下文中是指能夠模擬所識別的異黃酮作用的任何植物提取物。

在一個實(shí)施方案中，所述方法系列中的一種或多種方法可被包括在用于評估陰道萎縮治療方案的功效的試劑盒中，該試劑盒包括治療前評估方法；施用于大陰唇、小陰唇、陰道口、陰道或它們的組合的局部治療；用于陰道萎縮的治療后評估方法；以及確定陰道萎縮的治療前評估和治療后評估之間的差異以評估局部治療的總體效果的方式。治療前評估方法和治療后評估方法可以為用于評估陰道萎縮的任何上述方法中的一種或多種，其包括但不限于：測量大陰唇、小陰唇、陰道口或它們的組合處的pH；測定陰道口處的刷敏感性；評估陰道口處的糖原；陰道口處上皮細(xì)胞的活組織檢查分析；評估陰道口處測試的蛋白質(zhì)；在大陰唇或小陰唇處的轉(zhuǎn)錄組熱成像；或評價對大陰唇、小陰唇、陰道口、陰道或它們的組合的基因表達(dá)。

試劑盒還可包括與評估方法組合使用的一種或多種吸收制品。如本文所使用的，吸收制品可包括女性衛(wèi)生制品、女性衛(wèi)生墊、陰唇間制品、女性衛(wèi)生襯里、成人失禁墊、成人失禁褲、成人失禁尿布、無菌紗布、濕擦拭物、和傷口敷料。

本文所公開的量綱和值不應(yīng)理解為嚴(yán)格限于所引用的精確數(shù)值。相反，除非另外指明，否則每個這樣的量綱旨在表示所述值以及圍繞該值功能上等同的范圍。例如，公開為“40mm”的量綱旨在表示“約40mm”。

本文所公開的作為范圍端值的數(shù)值不應(yīng)被理解為嚴(yán)格限于所引用的精確值。相反，除非另外指明，每個數(shù)值范圍均旨在表示所引用的值和所述范圍內(nèi)的任何整數(shù)。例如，公開為“1至10”的范圍旨在表示“1，2，3，4，5，6，7，8，9和10”。

在發(fā)明詳述中引用的所有文件都在相關(guān)部分中以引用方式并入本文中。對于任何文件的引用不應(yīng)當(dāng)解釋為承認(rèn)其是有關(guān)本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。當(dāng)本發(fā)明中術(shù)語的任何含義或定義與以引用方式并入的文件中術(shù)語的任何含義或定義矛盾時，應(yīng)當(dāng)服從在本發(fā)明中賦予該術(shù)語的含義或定義。

雖然已經(jīng)舉例說明和描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，在不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍的情況下可做出多個其它改變和修改。因此，本文旨在于所附權(quán)利要求中涵蓋屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些改變和變型。