本發(fā)明涉及一種包含類病毒顆粒的疫苗。本發(fā)明涉及一種包含類病毒顆粒的疫苗，其中，相對于全顆粒病毒，所述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量減少。
背景技術(shù)：
：由于流感病毒及日本腦炎病毒等病毒所導(dǎo)致的感染病有時會隨著病毒的種類、所感染的對象不同而重癥化。作為針對像這樣由病毒引起的感染病的防御方法，已知可接種疫苗等?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)(非專利文獻(xiàn))非專利文獻(xiàn)1：J.Infect.Dis.2009200(6)841-848非專利文獻(xiàn)2：Vaccine200927(5)786-791技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的課題針對流感病毒及日本腦炎病毒等病毒的疫苗已制造、市售有滅活疫苗與活性疫苗兩種。其中，滅活疫苗大致分為：全病毒疫苗(wholevirusvaccine)，其是以福爾馬林等滅活劑來處理精制后的病毒顆粒而進(jìn)行制備；及，裂解疫苗(splitvaccine)，其是以有機(jī)溶劑或表面活性劑來破壞精制后的病毒顆粒而進(jìn)行制備。全病毒疫苗的免疫原性(immunogenicity)較高，因而在預(yù)防感染的效果方面較優(yōu)異。然而，全病毒疫苗會有出現(xiàn)較強(qiáng)的局部反應(yīng)和發(fā)熱等副反應(yīng)的傾向。另一方面，裂解疫苗是一種為了解決此副反應(yīng)的問題而包含以有機(jī)溶劑或表面活性劑來破壞(裂解化)病毒而得到的物質(zhì)的疫苗。裂解疫苗因為局部反應(yīng)減少并且也幾乎無發(fā)熱反應(yīng)，所以安全性優(yōu)異。然而，若是未建立基礎(chǔ)免疫的孩童或免疫反應(yīng)衰弱的老年人，則會有裂解疫苗的免疫原性較低的傾向。因此，正在期待開發(fā)一種疫苗，其能夠顯示比裂解疫苗更優(yōu)異的有效性(免疫原性)，進(jìn)一步更佳是能夠顯示與全病毒疫苗匹敵的有效性，并且安全性較高。本發(fā)明是有鑒于上述事由而完成，其目的在于提供一種疫苗，該疫苗的免疫原性較高，并且副反應(yīng)得到抑制。用于解決課題的方法本發(fā)明者們?yōu)榱私鉀Q上述問題而進(jìn)行了深入研究，結(jié)果令人驚訝的是發(fā)現(xiàn)：不破壞(裂解化)病毒的顆粒結(jié)構(gòu)，而只減少病毒包膜的脂質(zhì)成分，除此之外具有與原病毒相同的成分和結(jié)構(gòu)的類病毒顆粒在免疫原性試驗和發(fā)熱試驗的成績方面優(yōu)異，從而完成了本發(fā)明。亦即，本發(fā)明提供以下[1]～[15]。[1]一種疫苗，其是含有類病毒顆粒的疫苗，所述類病毒顆粒源自具有包膜的病毒顆粒，其中，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量相對于上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量減少。[2]如[1]所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量以上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量為基準(zhǔn)，小于50質(zhì)量％。[3]如[1]或[2]所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量以上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量為基準(zhǔn)，小于20質(zhì)量％。[4]如[1]～[3]中任一項所述的疫苗，其中，上述脂質(zhì)成分是膽固醇。[5]如[1]～[4]中任一項所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒包含：上述病毒顆粒的表面抗原、上述病毒顆粒的基質(zhì)蛋白或膜蛋白、及上述病毒顆粒的核蛋白。[6]如[1]～[5]中任一項所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒包含源自上述病毒顆粒的基因組核酸。[7]如[1]～[6]中任一項所述的疫苗，其中，上述病毒顆粒是正粘病毒顆粒、黃病毒顆粒、或B型肝炎病毒顆粒。[8]如[7]所述的疫苗，其中，上述病毒顆粒是流感病毒顆粒、日本腦炎病毒顆粒、或B型肝炎病毒表面抗原即HBs顆粒。[9]如[8]所述的疫苗，其中，上述病毒顆粒是流感病毒顆粒。[10]如[9]所述的疫苗，其中，上述流感病毒顆粒是A型流感病毒顆?；駼型流感病毒顆粒。[11]如[9]或[10]所述的疫苗，其中，上述流感病毒顆粒是被分類為下述亞型株的流感病毒顆粒：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株。[12]如[8]～[11]中任一項所述的疫苗，其中，上述表面抗原包含血凝素即HA或神經(jīng)胺酸酶即NA。[13]如[8]～[12]中任一項所述的疫苗，其中，上述基質(zhì)蛋白或膜蛋白包含M1蛋白或M2蛋白。[14]如[1]～[13]中任一項所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒具有下述平均粒徑：上述病毒顆粒的粒徑的70～130％。[15]如[1]～[14]中任一項所述的疫苗，其中，上述類病毒顆粒是下述類病毒顆粒：以蔗糖密度梯度離心法來進(jìn)行測定時，在蔗糖濃度35％以上檢測到峰。進(jìn)一步，本發(fā)明提供以下[16]～[50]。[16]一種疫苗的制造方法，其是含有類病毒顆粒的疫苗的制造方法，該制造方法包含下述工序：進(jìn)行固定化的工序，其對具有包膜的病毒顆粒的顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行固定化；及，進(jìn)行脫脂處理的工序，其對被固定化后的上述病毒顆粒進(jìn)行脫脂處理。[17]如[16]所述的制造方法，其中，上述固定化工序包含下述工序：在懸浮液A中添加固定劑的工序，該懸浮液A包含上述病毒顆粒。[18]如[17]所述的制造方法，其中，上述固定劑包含醛類。[19]如[17]所述的制造方法，其中，上述固定劑包含1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽即EDC。[20]如[18]所述的制造方法，其中，上述醛類是選自由甲醛、聚甲醛、戊二醛、及這些醛類的組合所構(gòu)成的組。[21]如[20]所述的制造方法，其中，上述醛類包含甲醛。[22]如[21]所述的制造方法，其中，上述甲醛的濃度以上述懸浮液A和上述固定劑的總量為基準(zhǔn)，是0.007～0.076w/v％。[23]如[20]所述的制造方法，其中，上述醛類包含戊二醛。[24]如[23]所述的制造方法，其中，上述戊二醛的濃度以上述懸浮液A和上述固定劑的總量為基準(zhǔn)，是0.002～0.05w/v％。[25]如[16]～[24]中任一項所述的制造方法，其中，上述進(jìn)行脫脂處理的工序包含下述工序：在懸浮液B中添加脫脂劑的工序，該懸浮液B包含被固定化后的上述病毒顆粒。[26]如[25]所述的制造方法，其中，上述脫脂劑是選自由二乙醚、二異丙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯、及這些脫脂劑的組合所構(gòu)成的組。[27]如[26]所述的制造方法，其中，上述脫脂劑包含二乙醚。[28]如[27]所述的制造方法，其中，上述二乙醚的濃度以上述懸浮液B和上述脫脂劑的總量為基準(zhǔn)，是10vol％以上。[29]如[25]～[28]中任一項所述的制造方法，其中，上述脫脂劑進(jìn)一步包含表面活性劑。[30]如[16]～[29]中任一項所述的制造方法，其中，上述病毒顆粒是使培養(yǎng)細(xì)胞或雞蛋感染并回收而得的病毒顆粒。[31]如[30]所述的制造方法，其中，上述培養(yǎng)細(xì)胞是非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞或馬丁達(dá)比犬腎(MDCK)細(xì)胞。[32]一種預(yù)防由病毒引起的感染病的方法，其中，該方法包含投予工序，該工序是將含有類病毒顆粒的疫苗投予至對象，而所述類病毒顆粒源自具有包膜的病毒顆粒；并且，相對于上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量減少。[33]如[32]所述的方法，其中，上述對象是哺乳動物。[34]如[32]所述的方法，其中，上述對象是人。[35]如[32]～[34]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量以上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量為基準(zhǔn)，小于50質(zhì)量％。[36]如[32]～[35]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量以上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量為基準(zhǔn)，小于20質(zhì)量％。[37]如[32]～[36]中任一項所述的方法，其中，上述脂質(zhì)成分是膽固醇。[38]如[32]～[37]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒包含：上述病毒顆粒的表面抗原、上述病毒顆粒的基質(zhì)蛋白或膜蛋白、及上述病毒顆粒的核蛋白。[39]如[32]～[38]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒包含源自上述病毒顆粒的基因組核酸。[40]如[32]～[39]中任一項所述的方法，其中，上述病毒顆粒是正粘病毒顆粒、黃病毒顆粒、或B型肝炎病毒顆粒。[41]如[40]所述的方法，其中，上述病毒顆粒是流感病毒顆粒、日本腦炎病毒顆粒、或B型肝炎病毒表面抗原即HBs顆粒。[42]如[41]所述的方法，其中，上述病毒顆粒是流感病毒顆粒。[43]如[42]所述的方法，其中，上述流感病毒顆粒是A型流感病毒顆粒或B型流感病毒顆粒。[44]如[42]或[43]所述的方法，其中，上述流感病毒顆粒是被分類為下述亞型株的流感病毒顆粒：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株。[45]如[41]～[44]中任一項所述的方法，其中，上述表面抗原包含血凝素即HA或神經(jīng)胺酸酶即NA。[46]如[41]～[45]中任一項所述的方法，其中，上述基質(zhì)蛋白或膜蛋白包含M1蛋白或M2蛋白。[47]如[32]～[46]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒具有下述平均粒徑：上述病毒顆粒的粒徑的70～130％。[48]如[32]～[47]中任一項所述的方法，其中，上述類病毒顆粒是下述類病毒顆粒：以蔗糖密度梯度離心法來進(jìn)行測定時，在蔗糖濃度35％以上檢測到峰。[49]類病毒顆粒在制造針對病毒的疫苗時的用途，所述類病毒顆粒源自具有包膜的病毒顆粒，其中，相對于上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量減少。[50]一種類病毒顆粒，其是源自具有包膜的病毒顆粒的類病毒顆粒，所述類病毒顆粒用來預(yù)防由病毒引起的感染病，其中，相對于上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量減少。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種疫苗，其免疫原性較高且副反應(yīng)得到抑制。附圖說明圖1是以電子顯微鏡拍攝流感病毒顆粒和源自該病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(福爾馬林處理)。圖2是表示Slot-blot法的結(jié)果的照片，該結(jié)果表示在源自流感病毒顆粒的類病毒顆粒中有無基質(zhì)蛋白(M1)和核蛋白(NP)。圖3是表示W(wǎng)estern-blot法的結(jié)果的照片，該結(jié)果表示在源自流感病毒顆粒的類病毒顆粒中有無血凝素(HA)、基質(zhì)蛋白(M1)及核蛋白(NP)。圖4是瓊脂糖凝膠電泳(agarosegelelectrophoresis)的照片，該瓊脂糖凝膠電泳是確認(rèn)在源自流感病毒顆粒的類病毒顆粒中有無基因組RNA。圖5是以電子顯微鏡拍攝流感病毒顆粒和源自該病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(戊二醛處理)。圖6是以電子顯微鏡拍攝流感病毒顆粒和源自該病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(EDC處理)。圖7是以電子顯微鏡拍攝日本腦炎病毒顆粒和源自該病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(戊二醛處理)。圖8是以電子顯微鏡拍攝重組沉降B型肝炎類病毒顆粒和源自所述類病毒顆粒的類病毒顆粒的照片(福爾馬林處理)。具體實施方式以下，詳細(xì)說明本發(fā)明的適合的實施方式。但是本發(fā)明并未受限于以下實施方式。(含有類病毒顆粒的疫苗)本實施方式的疫苗是一種含有類病毒顆粒的疫苗，所述類病毒顆粒源自具有包膜(envelope)的病毒顆粒(以下有時稱為“包膜病毒顆?！?，其中，相對于上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量減少。上述疫苗的免疫原性是在裂解疫苗的免疫原性以上，也可以是與全病毒疫苗的免疫原性相同程度或以上。上述疫苗能夠以與裂解疫苗相同或以上的程度來抑制局部反應(yīng)及發(fā)熱等副反應(yīng)?！霸醋跃哂邪さ牟《绢w粒的類病毒顆?！?以下有時僅稱為“類病毒顆?！?意指一種結(jié)構(gòu)體，其是通過改變具有包膜的病毒顆粒而獲得的，且具有與上述病毒顆粒類似的外部結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。本實施方式的類病毒顆粒，其顆粒結(jié)構(gòu)可被固定化，以維持與成為所述類病毒顆粒的來源的原病毒顆粒相同程度的顆粒性。作為包膜病毒顆粒所含的脂質(zhì)成分，可列舉例如：膽固醇、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、神經(jīng)鞘磷脂(sphingomyelin)等。上述脂質(zhì)成分可以是膽固醇。上述脂質(zhì)成分的含量，可通過公知的方法來測定。可列舉例如：膽固醇氧化酶-DAOS(3,5-二甲氧基-N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-苯胺鈉鹽)法、熒光色素法、質(zhì)譜分析法等。例如以熒光色素法進(jìn)行測定時，上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量以上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量為基準(zhǔn)，可以是80質(zhì)量％以下，也可以是75質(zhì)量％以下，也可以是70質(zhì)量％以下，也可以是60質(zhì)量％以下，也可以是50質(zhì)量％以下，也可以小于50質(zhì)量％，也可以是40質(zhì)量％以下，也可以是30質(zhì)量％以下，也可以是20質(zhì)量％以下，也可以小于20質(zhì)量％。若上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量以上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量為基準(zhǔn)，是在上述范圍內(nèi)，以類病毒顆粒作為疫苗進(jìn)行接種時，會有更容易抑制發(fā)熱反應(yīng)等副反應(yīng)的傾向。上述類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量的下限并無特別限制，例如，以上述病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量為基準(zhǔn)，可以是1質(zhì)量％以上，也可以是5質(zhì)量％以上，也可以是10質(zhì)量％以上，也可以是15質(zhì)量％以上。作為具有包膜的病毒顆粒，可列舉例如：痘病毒顆粒、皰疹病毒顆粒、正粘病毒顆粒、副粘病毒顆粒、棒狀病毒顆粒、冠狀病毒顆粒、沙狀病毒顆粒、披膜病毒顆粒、黃病毒顆粒、布尼亞病毒(bunyavirus)顆粒、反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒、嗜肝DNA病毒顆粒(hepadnavirus)、及B型肝炎病毒顆粒。上述病毒顆?？梢允窍率霾《绢w粒：使顆粒結(jié)構(gòu)固定化，并且具有表面抗原和基質(zhì)蛋白或膜蛋白。作為像這樣的病毒顆粒，可列舉例如：正粘病毒顆粒、副粘病毒顆粒、棒狀病毒顆粒、及黃病毒顆粒。上述正粘病毒顆?？梢允橇鞲胁《绢w粒。上述黃病毒顆粒可以是日本腦炎病毒顆粒。上述B型肝炎病毒顆?？梢允荁型肝炎病毒表面抗原(HBs)顆粒。作為流感病毒顆粒，可列舉例如：A型流感病毒顆粒和B型流感病毒顆粒。若為A型流感病毒顆粒，可列舉被分類為下述亞型株的流感病毒顆粒：H1N1亞型株、H2N2亞型株、H3N2亞型株、H3N8亞型株、H5N1亞型株、H5N2亞型株、H5N6亞型株、H6N1亞型株、H7N3亞型株、H7N7亞型株、H7N9亞型株、H9N2亞型株、或H10N8亞型株。類病毒顆?？砂翰《绢w粒的表面抗原、病毒顆粒的基質(zhì)蛋白或膜蛋白、及病毒顆粒的核蛋白。通過采取像這樣的構(gòu)成，會有免疫原性更加提升的傾向。病毒顆粒是流感病毒顆粒時，作為上述表面抗原，可列舉例如：血凝素(HA)、神經(jīng)胺酸酶(NA)。病毒顆粒是流感病毒顆粒時，作為上述基質(zhì)蛋白，可列舉例如M1蛋白。作為膜蛋白，可列舉例如M2蛋白。類病毒顆粒可包含源自病毒顆粒的基因組核酸。上述類病毒顆粒的上述基因組核酸的含量以上述病毒顆粒(或滅活全顆粒病毒)的上述基因組核酸的含量為基準(zhǔn)，可以是50質(zhì)量％以上，也可以是80質(zhì)量％以上，也可以是85質(zhì)量％以上，也可以是90質(zhì)量％以上，也可以是95質(zhì)量％以上，也可以是100質(zhì)量％。上述類病毒顆粒的上述基因組核酸的含量的上限并無特別限制，以上述病毒顆粒的上述基因組核酸的含量為基準(zhǔn)，可以是100質(zhì)量％以下，也可以是99質(zhì)量％以下，也可以是95質(zhì)量％以下。上述基因組核酸的含量可通過公知的方法來測定。可列舉例如：熒光法、吸光度法、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction，PCR)法等。過去已知一種類病毒顆粒(virus-likeparticle，VLP)的制作方法，其是將編碼構(gòu)成病毒顆粒發(fā)表面抗原、基質(zhì)蛋白、或膜蛋白的基因?qū)胨拗鲀?nèi)(例如酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等)，使這些蛋白在宿主內(nèi)表達(dá)，之后形成病毒顆粒。以像這樣的基因重組技術(shù)所獲得的VLP不含源自病毒的基因組核酸和核蛋白。另一方面，本實施方式的類病毒顆粒如后所述，是通過下述方式制作的：使病毒顆粒本身感染宿主、增殖，之后對所獲得的病毒顆粒施加后述的固定化處理和脫脂處理。因此，本實施方式的類病毒顆粒與以基因重組技術(shù)所制作的VLP不同，能夠包含源自病毒顆粒的基因組核酸和核蛋白。源自病毒顆粒的基因組核酸能夠作為佐劑(adjuvant)來發(fā)揮作用。例如，在滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗中有下述抗原：包含病毒基因組RNA的D抗原和不含病毒基因組RNA的C抗原。C抗原的免疫原性較弱，無法顯現(xiàn)作為疫苗抗原的效果。作為疫苗抗原而具有效果的分子種類只有D抗原。此啟示疫苗所內(nèi)含的病毒基因組RNA對于該效果的表現(xiàn)是重要的。因此，本實施方式的類病毒顆粒從使疫苗的免疫原性更加提升的觀點出發(fā)，可含有源自病毒顆粒的基因組核酸。核蛋白能夠誘導(dǎo)針對病毒的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTcell)等的細(xì)胞性免疫、且顯示對排除病毒有效，因此本實施方式的類病毒顆粒可包含核蛋白。本實施方式的類病毒顆粒能夠誘導(dǎo)Th1型應(yīng)答。與裂解流感疫苗誘導(dǎo)Th2型應(yīng)答是相對的。在小鼠中通過Th1型應(yīng)答所誘導(dǎo)的IgG2a亞型的抗體比通過Th2型應(yīng)答所誘導(dǎo)的IgG1亞型的抗體對流感病毒的感染防御性能更優(yōu)異。因此，可期待上述類病毒顆粒的有效性更加提升。亦即，在小鼠中，比起誘導(dǎo)抗原特異性IgG1，上述類病毒顆粒更可誘導(dǎo)抗原特異性IgG2a。類病毒顆粒在通過蔗糖密度梯度離心法、高速液相層析(highspeedliquidchromatography)、和/或動態(tài)光散射法來進(jìn)行測定時，可以是與成為來源的原病毒顆粒實質(zhì)上相同的參數(shù)(例如分子量、平均粒徑、密度、血凝素(HA)含量等)。例如，類病毒顆粒可以是具有下述平均粒徑的類病毒顆粒：成為來源的原病毒顆粒的粒徑的70～130％；也可以是具有下述平均粒徑的類病毒顆粒：成為來源的原病毒顆粒的粒徑的80～120％。類病毒顆粒源自流感病毒顆粒時，類病毒顆粒的平均粒徑，在以動態(tài)光散射法進(jìn)行測定時，可以是120nm左右，也可以是110～130nm，也可以是120～130nm。在其它方面，類病毒顆粒源自流感病毒顆粒時，類病毒顆粒的平均粒徑在以動態(tài)光散射法進(jìn)行測定時，可以是95nm以上，也可以是100nm以上，也可以是110nm以上，也可以是120nm以上，也可以是130nm以上。上述平均粒徑可以是145nm以下，也可以是140nm以下，也可以是130nm以下。類病毒顆粒源自日本腦炎病毒顆粒時，類病毒顆粒的平均粒徑在以動態(tài)光散射法進(jìn)行測定時，可以是95nm左右，也可以是80～120nm。類病毒顆粒源自B型肝炎病毒表面抗原(HBs)顆粒時，類病毒顆粒的平均粒徑在以動態(tài)光散射法進(jìn)行測定時，可以是100nm左右，也可以是90～160nm。類病毒顆粒在以蔗糖密度梯度離心法進(jìn)行測定時，可以是在蔗糖濃度35％以上檢測到峰的類病毒顆粒，也可以是在蔗糖濃度45％以上且55％以下檢測到峰的類病毒顆粒，也可以是在蔗糖濃度49％以上且52％以下檢測到峰的類病毒顆粒。上述蔗糖濃度可通過公知的方法求得。例如，可通過下述方式來求得上述蔗糖濃度：將包含類病毒顆粒的試樣疊加于15～60％的蔗糖密度梯度上，以4℃、18000rpm進(jìn)行離心分離16小時。疫苗所含的類病毒顆粒的量可視病毒的種類或投予對象來適當(dāng)選擇。例如，疫苗所含的類病毒顆粒的量(濃度)以血凝素濃度計，可以是每病毒株1～40μg/ml。疫苗可以是單價疫苗(monovalentvaccine)，其包含源自同種病毒或細(xì)菌的抗原。疫苗也可以是混合疫苗，其包含源自多種病毒或細(xì)菌的抗原。疫苗也可以是多價疫苗(multivalentvaccine)，其包含源自同屬病毒或細(xì)菌且多種的型的抗原。例如，疫苗是流感病毒疫苗時，可包含A型流感類病毒顆?；駼型流感類病毒顆粒中的任一者，亦可包含這兩者。上述流感病毒疫苗或日本腦炎病毒疫苗可包含源自其它病毒或細(xì)菌的抗原。例如，可混合有白喉-百日咳-破傷風(fēng)-滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒混合疫苗(DPT-IPV疫苗)。疫苗的劑型可以是例如：液狀、粉末狀(冷凍干燥粉末、干燥粉末)、膠囊狀、片劑、冷凍狀態(tài)。疫苗可包含作為醫(yī)藥而能夠被容許的載體。作為上述載體，可無限制地使用在制造疫苗時一般所使用的載體。具體而言，上述載體可列舉：鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、等張水性緩沖溶液及這些載體的組合。疫苗可進(jìn)一步適當(dāng)摻合有乳化劑、防腐劑(例如硫柳汞(thimerosal))、等滲劑(isotonicifier)、pH調(diào)節(jié)劑、滅活劑(例如福爾馬林)等。疫苗的投予途徑可以是例如：經(jīng)皮投予、舌下投予、點眼投予、皮內(nèi)投予、肌內(nèi)投予、經(jīng)口投予、經(jīng)腸投予、經(jīng)鼻投予、靜脈內(nèi)投予、皮下投予、腹腔內(nèi)投予、自口至肺的吸入投予。疫苗的投予方法可以是通過例如下述手段來進(jìn)行投予的方法：注射器、經(jīng)皮貼劑、微針、可移植的緩釋性裝置、附有微針的注射器、無針裝置、或噴劑。為了更加提高疫苗的免疫原性，疫苗除了包含類病毒顆粒以外，也可包含佐劑。作為佐劑，可列舉例如：鋁佐劑或包含角鯊烯(squalene)的水包油型乳化佐劑(AS03、MF59等)；CpG和3-O-去酰化4’-單磷?；|(zhì)A(3-O-deacylatedmonophosphoryllipidA，MPL)等Toll樣受體(toll-likereceptor)的配體(ligand)；皂素系佐劑；聚γ-谷氨酸等聚合物系佐劑；殼聚糖(chitosan)和菊糖(inulin)等多醣類。作為成為對象的哺乳動物，可列舉例如：小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、馬、山羊、猴、人等。本實施方式的疫苗可對于人使用，亦可對于未滿5歲的孩童、65歲以上的老年人使用。疫苗會隨著投予目的、投予方法、投予對象的狀況(性別、年齡、體重、病情等)的不同而不同，在對人投予時，可以每一次投予3.8μgHA～30μgHA的有效成分(類病毒顆粒)的方式來使用。(疫苗的制造方法)本實施方式的含有類病毒顆粒的疫苗的制造方法，其包含下述工序：進(jìn)行固定化的工序，其對具有包膜的病毒顆粒的顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行固定化；及，進(jìn)行脫脂處理的工序，其對被固定化后的上述病毒顆粒進(jìn)行脫脂處理。作為提高疫苗安全性的技術(shù)，過去以來，已知一種方法，其使用表面活性劑或有機(jī)溶劑來破壞(裂解化)具有包膜的病毒顆粒。然而，這些方法會有伴隨顆粒崩壞而疫苗的有效性(免疫原性)下降的傾向。上述制造方法則是在進(jìn)行脫脂處理前已將病毒顆粒固定化，因此，即使通過脫脂處理也能夠維持病毒顆粒結(jié)構(gòu)，就結(jié)果而言，能夠一邊維持疫苗的有效性一邊提高安全性。上述制造方法可進(jìn)一步包含下述工序：培養(yǎng)宿主的工序、使病毒感染宿主的工序、在宿主內(nèi)使病毒增殖的工序、或自宿主回收病毒顆粒的工序。病毒顆?？梢允窍率霾《绢w粒：使病毒顆粒感染宿主、增殖，之后自宿主回收而得到的。宿主可視病毒顆粒的種類來適當(dāng)選擇。病毒顆粒是流感病毒顆粒時，作為宿主，可列舉例如：培養(yǎng)細(xì)胞、雞蛋。作為培養(yǎng)細(xì)胞，可列舉例如：Vero細(xì)胞及MDCK細(xì)胞。作為流感病毒的感染、增殖方法，使用雞蛋或Vero細(xì)胞作為宿主的方法(Vaccine.1998May-Jun；16(9-10)：960-8.)、使用Vero細(xì)胞作為宿主的方法(Vaccine.2007August10；25(32)：6028-6036.)、使用MDCK細(xì)胞作為宿主的方法(JVirol.2012Nov；86(22)：12341-50)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的方法。＜將具有包膜的病毒顆粒的顆粒結(jié)構(gòu)固定化的工序＞在本實施方式中，“固定化”意指使表面抗原彼此之間、表面抗原與基質(zhì)蛋白(或膜蛋白)、或基質(zhì)蛋白彼此之間(或膜蛋白彼此之間)發(fā)生化學(xué)鍵合，而保持病毒顆粒的顆粒結(jié)構(gòu)。本發(fā)明者們認(rèn)為，類病毒顆粒通過保持病毒原本的顆粒結(jié)構(gòu)，而使類病毒顆粒的免疫原性為裂解疫苗的免疫原性以上，并且隨著制作條件不同而能夠成為與滅活全顆粒病毒的免疫原性相同程度或以上。顆粒結(jié)構(gòu)的保持可通過下述方法來確認(rèn)：電子顯微鏡解析、蔗糖密度梯度分離、或動態(tài)光散射法、使用針對HA、NP或M1的抗體的檢測法(Slotblot、Westernblot等)。上述進(jìn)行固定化的工序，可例示以固定劑對病毒顆粒進(jìn)行處理的方法，可列舉例如：在懸浮液A中添加固定劑的工序，該懸浮液A包含上述病毒顆粒。固定劑的種類可視病毒的種類來適當(dāng)變更。上述固定劑，可列舉例如：有機(jī)溶劑、醛類、二亞胺酸酯、富馬酸雙(3,5-二溴水楊酸)酯(DBBF)、1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、及這些固定劑的組合。作為有機(jī)溶劑，可列舉例如：甲醇、乙醇、丙酮及這些有機(jī)溶劑的組合。作為醛類，可列舉例如：甲醛(例如福爾馬林)、聚甲醛、戊二醛及這些醛類的組合。固定劑的濃度可視病毒的種類、固定劑的種類來適當(dāng)變更。固定劑包含甲醛時，甲醛的濃度，以懸浮液A和固定劑的總量為基準(zhǔn)，可以是0.007～0.076w/v％。上述甲醛的濃度小于0.007w/v％時，有固定化變?nèi)?、有不易保持顆粒結(jié)構(gòu)的傾向。上述甲醛的濃度超過0.076w/v％時，有固定化較強(qiáng)、交聯(lián)所產(chǎn)生的化學(xué)修飾(chemicalmodification)過度進(jìn)行的傾向。從使HA活性更加提升的觀點出發(fā)，甲醛的濃度以懸浮液A和固定劑的總量為基準(zhǔn)，可以是0.0175～0.076w/v％，也可以是0.028～0.076w/v％。使用包含甲醛的固定劑的方法，在病毒顆粒是流感病毒顆粒時亦可使用。固定劑是福爾馬林時(35～38％甲醛水溶液)，福爾馬林濃度以懸浮液A和固定劑的總量為基準(zhǔn)，可以是0.02～0.2vol％，也可以是0.05～0.2vol％，也可以是0.08～0.2vol％。固定劑包含戊二醛時，戊二醛的濃度以懸浮液A和固定劑的總量為基準(zhǔn)，可以是0.002～0.05w/v％，也可以是0.005～0.01w/v％。上述濃度小于0.002w/v％時，在使用了日本腦炎病毒顆粒作為病毒顆粒時，有顆粒凝聚的傾向。上述濃度超過0.05w/v％時，在使用了日本腦炎病毒顆粒作為病毒顆粒時，會有主要結(jié)構(gòu)蛋白即E蛋白的抗原表位(epitope)失去活性的傾向。使用戊二醇作為固定劑的方法，在病毒顆粒是流感病毒顆粒、日本腦炎病毒顆粒時亦可使用。固定劑包含1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)時，EDC的濃度以懸浮液A的總量為基準(zhǔn)，可以是0.005～0.5M，也可以是0.005～0.05M。使用包含EDC的固定劑的方法，在病毒顆粒是流感病毒顆粒時亦可使用。以固定劑進(jìn)行處理時的溫度可視病毒的種類、固定劑的種類、固定劑的濃度等來適當(dāng)變更。上述溫度可以是4℃～37℃，也可以是25℃～37℃。以固定劑進(jìn)行處理時的期間(處理時間)可視病毒的種類、固定劑的種類、固定劑的濃度、固定化處理的溫度等來適當(dāng)變更。上述期間可以是1天至6周，也可以是1周至4周。使用EDC作為固定劑時，上述期間可以是0.5小時～4小時，也可以是1.5小時～2.5小時。＜對被固定化后的病毒顆粒進(jìn)行脫脂處理的工序＞進(jìn)行脫脂處理的工序可例示以脫脂劑對被固定化后的病毒顆粒進(jìn)行處理的方法，可列舉例如：在包含被固定化后的病毒顆粒的懸浮液B中添加脫脂劑的工序。脫脂劑的種類可視病毒的種類來適當(dāng)變更。上述脫脂劑可列舉例如：二乙醚、二異丙醚、乙酸甲酯、乙酸乙酯及這些脫脂劑的組合。以脫脂劑進(jìn)行處理時的濃度可視病毒的種類或脫脂劑的種類來適當(dāng)變更。脫脂劑的濃度以懸浮液B和脫脂劑的總量為基準(zhǔn)，可以是10vol％以上且400vol％以下。上述脫脂劑的濃度小于10vol％時，有脫脂不完全的傾向。上述脫脂劑的濃度超過400vol％時，有變成無法保持病毒顆粒的結(jié)構(gòu)的傾向。脫脂劑包含二乙醚時，二乙醚的濃度以懸浮液B和脫脂劑的總量為基準(zhǔn)，可以是10vol％以上，也可以是12.5vol％～50vol％，也可以是33vol％～50vol％。脫脂劑可包含表面活性劑。有類病毒顆粒彼此之間的凝聚得到抑制、收率提升的傾向。作為表面活性劑，可列舉例如：聚氧乙烯辛基苯基醚、聚山梨醇酯80及這些表面活性劑的組合。脫脂劑所含的表面活性劑的濃度可以是0.002vol％～0.3vol％，也可以是0.005vol％～0.1vol％。以脫脂劑進(jìn)行處理時的溫度可視病毒的種類、脫脂劑的種類、脫脂劑的濃度等來適當(dāng)變更。上述溫度可以是4℃至常溫(25℃)。以脫脂劑進(jìn)行處理時的期間(處理時間)可視病毒的種類、脫脂劑的種類、脫脂劑的濃度、脫脂劑的溫度等來適當(dāng)變更。上述期間可以是1小時至2小時。在上述制造方法中，可進(jìn)一步包含在脫脂處理后去除脫脂劑的工序。脫脂劑是二乙醚時，可列舉例如下述方法：以4℃、3000rpm將懸浮液B與脫脂劑的混合液進(jìn)行離心5分鐘，之后回收水相?？梢曅枰M(jìn)一步包含對所回收的類病毒顆粒進(jìn)行精制的工序。作為對類病毒顆粒進(jìn)行精制的方法，可依公知的方法來適當(dāng)進(jìn)行，可列舉例如：使用超濾膜(ultrafiltrationmembrane)進(jìn)行過濾的方法。疫苗接種較佳是能夠?qū)ο筚x予與實際感染時相同的免疫的質(zhì)和量，而由疫苗所誘導(dǎo)的免疫對由實際感染所引起的免疫的模仿性能夠決定其效果。疫苗中可以包含所有作為用來防御感染的抗原的病毒蛋白?？紤]到用來提高病毒蛋白的免疫原性的源自病毒的基因組核酸的存在、病毒顆粒的大小、形狀等，分別在免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，本發(fā)明者們認(rèn)為，最佳的疫苗是指具有與實際的病毒更接近的成分和結(jié)構(gòu)的疫苗。本實施方式的類病毒顆粒僅減少病毒包膜的脂質(zhì)成分，除此以外則具有與原本的病毒顆粒相同程度的成分和結(jié)構(gòu)，因此可提供一種免疫原性較高、并且副反應(yīng)得到抑制的疫苗。實施例以下，通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但是本發(fā)明不受這些實施例的任何限定。[實施例1]＜制備流感類病毒顆粒＞1.福爾馬林處理(將病毒顆粒的顆粒結(jié)構(gòu)固定化的工序)將B型流感病毒(B/Wisconsin/1/2011株，以下有時記載為“B/WC株”)接種至11日齡的受精雞蛋的絨毛尿囊腔內(nèi)，并在34℃培養(yǎng)2天。將所獲得的尿囊液進(jìn)行澄清化，之后通過離心分離使流感病毒顆粒沉淀。通過下述方式精制上述流感病毒：以磷酸緩沖生理鹽水(PBS)再度使其漂浮，并以蔗糖密度梯度離心法來回收蔗糖濃度為33％～50％的部分。以精制后的流感病毒顆粒的蛋白的濃度達(dá)到終濃度500μg/mL的方式，來稀釋所獲得的級分，獲得懸浮液A。之后，以終濃度達(dá)到0.02～0.2vol％(以甲醛換算為0.007～0.076w/v％)的方式，將福爾馬林(35～38w/v％甲醛水溶液，固定劑)添加至懸浮液A中，并且在4℃使其反應(yīng)4周或6周，或在25℃使其反應(yīng)1周。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS對反應(yīng)液進(jìn)行透析以去除福爾馬林，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化后的流感病毒顆粒。2.醚處理(對被固定化后的病毒顆粒進(jìn)行脫脂處理的工序)在進(jìn)行福爾馬林處理后的包含流感病毒顆粒的懸浮液B中，以終濃度達(dá)到0.1vol％的方式添加聚山梨醇酯80。之后，以終濃度達(dá)到50vol％的方式添加與上述懸浮液B相同容量的二乙醚(脫脂劑)，并在4℃攪拌2小時。之后，以4℃、3000rpm對所獲得的混合液進(jìn)行離心分離5分鐘，回收水相，藉此去除醚相。通過以上工序，制備試樣即流感類病毒顆粒。作為預(yù)備實驗，以膽固醇氧化酶-3,5-二甲氧基-N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-苯胺鈉鹽(DAOS)法測定所獲得的流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量。其結(jié)果啟示，相對于流感病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，所獲得的流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量至多是80質(zhì)量％以下。以下，通過熒光色素法來詳細(xì)研究流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量。已有報告指出流感病毒的包膜包含大量的膽固醇，因此將膽固醇作為脂質(zhì)成分的代表來進(jìn)行定量。3.脂質(zhì)成分的含量對A型流感病毒中的H1N1亞型株(A/California/07/2009(X-179A)株，以下有時記載為“A/CA株”)和H3N2亞型株(A/NewYork/39/2012(X-233A)株，以下有時記載為“A/NY株”)依照上述方法制作類病毒顆粒。對其它的B型流感病毒中的B/Brisbane/60/2008株(以下有時記載為“B/BR株”)和B/Massachusetts/2/2012(BX-51B)株(以下有時記載為“B/MA株”)依照上述方法制作類病毒顆粒。作為代表，使用AmplexRedCholesterolAssayKit(Invitrogen公司制造的商品名)測定流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，所述類病毒顆粒是以0.08％的福爾馬林濃度在25℃進(jìn)行反應(yīng)1周，之后進(jìn)行醚處理而得到的。首先，對包含流感類病毒顆粒的試樣進(jìn)行超高速離心分離(24000rpm，2hr，4℃)，將其分離成上清液與沉淀成分。用PBS將所獲得的沉淀成分進(jìn)行再懸浮。在再懸浮后的沉淀成分中添加熒光物質(zhì)試鹵靈(resorufin)，使其反應(yīng)。測定反應(yīng)后的熒光物質(zhì)試鹵靈的熒光強(qiáng)度，藉此對流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量進(jìn)行定量。其結(jié)果啟示，相對于流感病毒全顆粒(以下有時記載為“全顆粒抗原”)的脂質(zhì)成分的含量，流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量至多是40質(zhì)量％以下(表1)。表1類病毒顆粒與全顆?？乖哪懝檀己康谋壤?％)4.脂質(zhì)成分的含量(研究醚容量比)以源自H1N1亞型株(A/CA株)的類病毒顆粒作為代表，研究改變醚容量比對脫脂處理的影響。首先，以蛋白濃度達(dá)到終濃度2500μg/mL的方式用PBS稀釋類病毒顆粒，并以0.08％的福爾馬林濃度在25℃使其反應(yīng)1周。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS對反應(yīng)液進(jìn)行透析以去除福爾馬林，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化后的流感病毒顆粒。之后，除了改變醚的容量以外，通過與上述“2.醚處理”同樣的方法進(jìn)行醚處理(脫脂處理)，獲得流感類病毒顆粒。使用所獲得的流感類病毒顆粒，并使用AmplexRedCholesterolAssayKit(Invitrogen公司制造的商品名)來測定脂質(zhì)成分的含量。對包含流感類病毒顆粒的試樣進(jìn)行超高速離心分離(24000rpm，2hr，4℃)，將其分離成上清液與沉淀成分。用PBS將所獲得的沉淀成分進(jìn)行再懸浮。在再懸浮后的沉淀成分中添加熒光物質(zhì)試鹵靈，使其反應(yīng)。測定反應(yīng)后的熒光物質(zhì)試鹵靈的熒光強(qiáng)度，藉此對流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量進(jìn)行定量。比較對照是使用滅活全顆粒病毒(以下有時記載為“全顆?？乖?，該全顆粒病毒是以福爾馬林濃度0.02％在4℃使其反應(yīng)6周而得到的。其結(jié)果啟示，在將醚：懸浮液B(vol比)設(shè)為1：1來進(jìn)行醚處理時，流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量相對于流感病毒全顆粒的脂質(zhì)成分的含量，是約70質(zhì)量％。在將醚：懸浮液B(vol比)設(shè)為1：2或1：6來進(jìn)行醚處理時，流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量相對于流感病毒全顆粒的脂質(zhì)成分的含量，是約30質(zhì)量％。另一方面，在將醚：懸浮液B(vol比)設(shè)為1：12來進(jìn)行醚處理時，流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量與全顆?？乖瑯?，其脂質(zhì)成分幾乎未被去除而殘留有約100％(表2)。由上述結(jié)果，本發(fā)明者們認(rèn)為，脫脂的效果不僅取決于醚的量，也取決于聚山梨醇酯80的濃度。亦即，隨著“醚：懸浮液B”由1：1改變成1：6，相對地聚山梨醇酯80的濃度變高，因此脫脂能夠進(jìn)行。然而，本發(fā)明者們認(rèn)為，當(dāng)“醚：懸浮液B”變成1：12，即使相對地聚山梨醇酯80的濃度較高，醚的濃度過低仍會造成影響，使脫脂的效果減少。表2A/CA株(H1N1亞型株)：類病毒顆粒與全顆粒抗原的膽固醇含量的比例(％)＜源自流感病毒顆粒的裂解抗原＞作為比較對照的裂解流感病毒(以下有時記載為“裂解抗原”)使用流感HA疫苗(化學(xué)及血清療法研究所制造，商品名稱”流感HA疫苗”化血研”“)。[實施例2]物性評價利用以下方法來評價上述實施例1所獲得的類病毒顆粒(試樣)的物性。再者，在以下實驗中，除非另有說明，作為比較對照使用的全顆?？乖且愿栺R林濃度0.02％在4℃使其反應(yīng)6周而得到的。1.通過蔗糖密度梯度離心法來進(jìn)行分析通過蔗糖密度梯度離心法對實施例1所制備的類病毒顆粒進(jìn)行分析。將試樣疊加在15～60％的蔗糖密度梯度上，并以4℃、18000rpm進(jìn)行離心分離16小時。離心后，每一級分(fraction)各提取0.6ml，并測定各級分的蔗糖濃度、HA價及蛋白濃度。H1N1亞型株的結(jié)果示于表3。在裂解抗原中，蛋白廣泛分布于蔗糖濃度25～50％，顯示病毒顆粒已分解。相對于此，類病毒顆粒作為單峰而被分級在高蔗糖濃度(49～51.4％)，因此顯示具有與滅活全顆粒同樣的形狀(顆粒性)。關(guān)于HA活性，福爾馬林處理時的福爾馬林濃度是0.02以上時，是2560倍。將B型株(B/WC株)的結(jié)果示于表4。在裂解抗原中，其蛋白同樣地廣泛分布于蔗糖濃度25～50％，顯示病毒顆粒已分解。相對于此，類病毒顆粒作為單峰而被分級在高蔗糖濃度(50.6～52.2％)，因此顯示具有與滅活全顆粒同樣的形狀(顆粒性)。關(guān)于HA活性，福爾馬林處理時的福爾馬林濃度愈高，HA價就愈高，0.05％時是2560倍，0.08％以上時則是5120倍。表3A/AC株(H1N1亞型株)：醚處理后的試樣(類病毒顆粒)、及裂解抗原的蔗糖密度梯度離心分析和HA活性表4B/WC株(B型株)：醚處理后的試樣(類病毒顆粒)及裂解抗原的蔗糖密度梯度離心分析和HA活性2.通過電子顯微鏡進(jìn)行解析為了進(jìn)一步詳細(xì)調(diào)查類病毒顆粒(源自B型株即B/WC株)的形狀，實施通過電子顯微鏡所進(jìn)行的觀察。使用戊二醇在室溫對約500μg/mL的上述試樣進(jìn)行固定20分鐘。之后，在觀察用的經(jīng)離子鍍膜的sheetmesh(日新EM公司制造)上，放置固定后的試樣并靜置約60秒，然后以2％磷鎢酸水溶液進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡(FEICompany制造的TecnaiG2：加速電壓為120kV)對染色后的試樣進(jìn)行觀察、攝影。圖1的(B)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結(jié)果，所述類病毒顆粒是以0.05％的福爾馬林濃度在25℃進(jìn)行反應(yīng)1周，之后進(jìn)行醚處理而得到的。圖1的(A)表示作為比較對照的全顆?？乖挠^察結(jié)果，該全顆?？乖且?.02％的福爾馬林濃度在4℃使其反應(yīng)6周而得到的。進(jìn)一步，對H1N1亞型株(A/CA株)和H3N2亞型株(A/NY株)依照上述方法制作類病毒顆粒。對其它的B型流感病毒即B/BR株和B/MA株依照上述方法制作類病毒顆粒。圖1的(C)～(F)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結(jié)果，所述類病毒顆粒是以0.08％的福爾馬林濃度在25℃進(jìn)行反應(yīng)1周，之后進(jìn)行醚處理而得到的。類病毒顆粒與全顆?？乖瑯拥乇３至祟w粒結(jié)構(gòu)。在通過醚處理對包膜進(jìn)行脫脂的觀察圖像中，并未確認(rèn)到類病毒顆粒彼此相互結(jié)合而成的凝聚體。3.動態(tài)光散射使用ParticleSizingSystem：NICOMP380ZLS-S對類病毒顆粒(源自B型株即B/WC株)的平均粒徑進(jìn)行解析。將通過動態(tài)光散射法所測得的液體中的平均粒徑示于表5。裂解抗原是雙峰性，在110nm附近與400nm附近確認(rèn)到峰。另一方面，除該裂解抗原以外的所有試樣的平均粒徑是120nm左右、為單峰性。由此可知，醚處理后的平均粒徑是與病毒顆粒相同的顆粒大小。亦即，可知即使通過醚處理進(jìn)行脫脂，類病毒顆粒的平均粒徑仍是單一且不變的。由動態(tài)光散射實驗可知，類病毒顆粒保持了顆粒結(jié)構(gòu)，且未確認(rèn)到像凝聚體這樣的雜質(zhì)。表5B/WC株(B型株)：通過動態(tài)光散射法所測得的液體中的平均粒徑4.高速液相層析(尺寸排阻層析(sizeexclusionchromatography，SEC))測定作為代表的源自H1N1亞型株(A/CA株)的類病毒顆粒、全顆?？乖傲呀饪乖姆肿恿糠植?。上述測定是使用TSKgelG6000PWXL(TOSOH)來進(jìn)行。使用PBS作為洗脫液。將洗脫模式(elutionpattern)示于表6。裂解抗原在洗脫時間19～29分鐘附近確認(rèn)到三峰性的峰。另一方面，類病毒顆粒和全顆粒抗原則在洗脫時間17分鐘附近確認(rèn)到單峰性的峰。由此可知，進(jìn)行了醚處理的類病毒顆粒的分子量分布是與未進(jìn)行醚處理的病毒顆粒(全顆?？乖?相同程度的分子量分布。由此結(jié)果啟示，即使通過醚處理進(jìn)行脫脂，分子量分布仍是單一且不變的。表6A/AC株(H1N1亞型株)：SEC的洗脫模式5.分析病毒蛋白為了研究類病毒顆粒(源自B型株即B/WC株)的構(gòu)成蛋白，通過Slot-blot來進(jìn)行抗體染色。對于裂解抗原、僅進(jìn)行福爾馬林處理而得到的試樣、或在福爾馬林處理后進(jìn)行醚處理而得到的各試樣，分別準(zhǔn)備下述組：未進(jìn)行SDS(十二烷基硫酸鈉)處理和加熱處理的組(A組)、及進(jìn)行了SDS處理和加熱處理的組(B組)。將試樣的種類示于表7。表7B/WC株(B型株)：試樣的種類(Slot-blot法)將上述組的各試樣涂敷至PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)上，并使其干燥。在染色、脫色后，對PVDF膜進(jìn)行封閉(blocking)，并使其與一抗(小鼠單克隆抗體：抗NP抗體或抗M1抗體)、二抗(抗小鼠IgG-HRP復(fù)合物，anti-MouseIgG-HRPConjugate)反應(yīng)，以LAS-3000(富士膠片株式會社制造的商品名)進(jìn)行拍攝。圖2表示M1、NP的Slot-blot結(jié)果。SDS處理和加熱處理皆未進(jìn)行的組(A組)，在顆粒結(jié)構(gòu)已被破壞的裂解抗原(第1條帶)和福爾馬林固定較弱的試樣(在0.02％福爾馬林濃度反應(yīng)后進(jìn)行醚處理而得到的試樣：第3、第4條帶)中，檢測到NP和M1。相對于此，在全顆?？乖?第2條帶)和比0.02％高的福爾馬林濃度的試樣(第5、第6、第7條帶)中，幾乎未檢測到NP和M1。另一方面，在SDS處理和加熱處理皆進(jìn)行的組(B組)中，類病毒顆粒受到破壞，且任一試樣皆檢測到M1和NP。由此顯示，類病毒顆粒的內(nèi)部存在M1和NP。(Westernblot法)對H1N1亞型株(A/CA株)依照上述方法制作類病毒顆粒。以不同的福爾馬林濃度(0.02％～0.14％)將病毒顆粒固定化，之后進(jìn)行醚處理而獲得類病毒顆粒。所獲得的類病毒顆粒在進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。使上述PVDF膜與一抗(小鼠單克隆抗體：抗HA抗體、抗NP抗體或抗M1抗體)和二抗(anti-MouseIgG-HRPConjugate)反應(yīng)，以LAS-3000(富士膠片株式會社制造的商品名)進(jìn)行拍攝。此時，使用RPN2209ECLWesternBlottingDetectionReagents(GEHealthcare公司制造的商品名)作為顯色基質(zhì)(chromogenicsubstrate)。圖3的A、圖3的B、圖3的C表示HA、M1、NP的Westernblot結(jié)果。相對于未進(jìn)行福爾馬林處理，顯示福爾馬林處理后的各病毒構(gòu)成蛋白會高分子化而泳動至高分子側(cè)。亦即，相對于未進(jìn)行福爾馬林處理，顯示福爾馬林處理后的各病毒構(gòu)成蛋白在0.05％以上的濃度時會產(chǎn)生250kDa以上的高分子聚合物而阻塞在凝膠上端。若為小于0.05％的弱交聯(lián)，在醚處理時則無法保持顆粒，而如圖2所示，檢測到NP和M1。6.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定性分析)研究類病毒顆粒(源自B型株即B/WC株)中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為“源自病毒的基因組核酸”)。對僅進(jìn)行福爾馬林處理而得到的試樣、或在福爾馬林處理后進(jìn)行醚處理而得到的各試樣，分別準(zhǔn)備進(jìn)行了超高速離心的組或未進(jìn)行超高速離心的組。使用QIAampViralRNAMiniKit(QIAGENN.V.制造的商品名)，自上述組的上清液提取RNA。提取RNA后，使用OneStepRNAPCRKit(AMV)(寶生物株式會社制造的商品名)、PCRSystem(商品型號：GeneAmpR9700)進(jìn)行RT-PCR，將編碼HA的DNA區(qū)域擴(kuò)增。進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，確認(rèn)DNA產(chǎn)物的條帶圖形(bandpattern)。圖4表示RT-PCR后的DNA產(chǎn)物的條帶圖形的結(jié)果。圖4的結(jié)果整理于表8。未進(jìn)行超高速離心時，在所有條件下通過RT-PCR都檢測到源自病毒的RNA。另一方面，進(jìn)行了超高速離心時，在裂解抗原和通過福爾馬林進(jìn)行的固定化為最弱的試樣(以0.02％的福爾馬林濃度在4℃進(jìn)行反應(yīng)4周，之后進(jìn)行醚處理而得到的試樣)中，亦自其超高速離心后的上清液檢測到RNA。除該條件以外的試樣則未檢測到RNA。由此顯示，以0.02％以上的福爾馬林濃度在25℃進(jìn)行福爾馬林處理1周并進(jìn)行醚處理后的抗原的顆粒內(nèi)包含有RNA。表8B/WC株(B型株)：通過RT-PCR所進(jìn)行的源自病毒的基因組核酸的分析結(jié)果7.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定量分析)研究類病毒顆粒中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為“源自病毒的基因組核酸”)的定量。用PBS稀釋類病毒顆粒、全顆粒抗原、裂解抗原，并添加SDS和ProteinaseK，然后以55℃、24小時使其反應(yīng)。之后，使用TRIzolLSReagent和PureLinkRNAMiniKit、PureLinkDNase(Invitrogen公司制造的商品名)來提取RNA。所提取的RNA的含量是以Quant-iTRiboGreenRNAReagentandKit進(jìn)行測定(Invitrogen公司制造的商品名)的。表9表示類病毒顆粒和裂解抗原與全顆?？乖腞NA含量的比例。相對于全顆粒抗原，類病毒顆粒的RNA殘留約90％，而裂解抗原是10～40％。由此結(jié)果啟示，在類病毒顆粒中RNA幾乎都?xì)埩簟１?類病毒顆粒和裂解抗原相對于全顆?？乖腞NA含量的比例(％)8.免疫原性1對A型流感病毒中的H3N2亞型株(A/Texas/50/2012(X-223)株，以下有時記載為“A/TX株”)也依照實施例1的方法制作類病毒顆粒。使用小鼠評價類病毒顆粒的免疫原性。以蛋白量0.8μg的接種量對ddY小鼠(雌性，8周齡)在肌內(nèi)接種裂解抗原、全顆?？乖蝾惒《绢w粒(每一組16只)。免疫3周后使小鼠安樂死，然后進(jìn)行全血采集(wholebloodcollection)。通過離心分離獲得血清，測定HI抗體價。將作為代表的試樣的免疫原性(HI抗體價(GMT))的結(jié)果示于表10，該試樣是以0.08％的福爾馬林在25℃進(jìn)行反應(yīng)1周，之后進(jìn)行醚處理而得到的。若為H1N1亞型株、H3N2亞型株的情況，相較于裂解抗原，類病毒顆粒為顯著較高的免疫原性(H1N1亞型株：P＜0.05；H3N3亞型株：P＜0.01)，且為與全顆粒抗原相同程度的免疫原性。若為B型株的情況，相較于裂解抗原，類病毒顆粒為較高的免疫原性，且為與全顆?？乖嗤潭鹊拿庖咴浴１?0免疫原性(HI抗體價(GMT))的結(jié)果9.免疫原性2對H1N1亞型株(A/NewCaledonia/20/99，以下有時記載為“A/NC株”)、H3N2亞型株(A/Wyoming/3/2003，以下有時記載為“A/WY株”)及B型株(B/Shanghai/361/2002，以下有時記載為“B/SG株”)依照實施例1的方法制作類病毒顆粒。使用小鼠評價所獲得的流感顆粒的免疫原性。使用ddY小鼠(雌性，8周齡)，以1μgHA的接種量且以3周的間隔對每一組8只小鼠在皮下接種裂解抗原或類病毒顆粒2次。進(jìn)行1次免疫，且在3周后進(jìn)行部分血液采集，并進(jìn)行2次免疫，在2周后進(jìn)行全血采集。通過離心分離獲得血清，測定HI抗體價。將作為代表的試樣的免疫原性(HI抗體價(GMT))的結(jié)果示于表11(1次免疫后)、表12(2次免疫后)，該試樣是以0.2％的福爾馬林在5℃進(jìn)行反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。若為1次免疫后的A/NC株、A/WY株的情況，相較于裂解抗原，類病毒顆粒為顯著較高的免疫原性。表11免疫原性(HI抗體價(GMT)(1次免疫后))的結(jié)果*1：P＜0.05；*2：P＜0.01表12免疫原性(HI抗體價(GMT)(2次免疫后))的結(jié)果10.免疫原性3使用食蟹獼猴(雌性，21～29個月齡)評價裂解抗原、全顆?？乖?、及類病毒顆粒的免疫抗原性。以相當(dāng)于7.5μgHA(相當(dāng)于裂解抗原的HA量的蛋白量)的接種量、且以28天的間隔對每一組5只食蟹獼猴在皮下接種裂解抗原、全顆粒抗原或類病毒顆粒2次。在2次免疫前和2次免疫后的28天后進(jìn)行部分血液采集。通過離心分離獲得血清，測定HI抗體價和中和抗體價。將作為代表的試樣(類病毒顆粒)的免疫原性的結(jié)果示于表13(2次免疫后的HI抗體價(GMT))、表14(2次免疫后的中和抗體價(GMT))，該試樣是以0.08％的福爾馬林在25℃進(jìn)行反應(yīng)7天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。由HI抗體價可知，相較于裂解抗原，類病毒顆粒具有較高的免疫原性。尤其，H1N1亞型株的免疫原性顯著較高。由中和抗體亦可知，相較于裂解抗原，類病毒顆粒具有較高的免疫原性。尤其，H1N1亞型株和B型株的免疫原性顯著較高。表132次免疫后的HI抗體價(GMT)*1：P＜0.05；*2：P＜0.01表142次免疫后的中和抗體價(GMT)*1：P＜0.05；*2：P＜0.0111.抗體亞型解析1作為抗體亞型解析，測定上述“8.免疫原性1”中獲得的小鼠的血清中所含的病毒抗原特異性的IgG1和IgG2a抗體價。作為比較對照，同樣地將下述試樣對小鼠進(jìn)行免疫：以0.02％的福爾馬林在25℃進(jìn)行反應(yīng)1周，之后進(jìn)行醚處理而得到的試樣。測定所獲得的小鼠的血清中所含的病毒抗原特異性的IgG1和IgG2a的抗體價。其結(jié)果顯示，相對于裂解抗原，類病毒顆粒(福爾馬林濃度：0.08％)與全顆粒抗原同樣地，比起誘導(dǎo)抗原特異性的IgG1，更能夠誘導(dǎo)抗原特異性的IgG2a。另一方面顯示，即使是相同的類病毒顆粒，以0.02％的福爾馬林進(jìn)行固定化后的試樣與裂解抗原同樣地，比起誘導(dǎo)抗原特異性的IgG2a，仍更能夠誘導(dǎo)抗原特異性的IgG1(表15～表17)。由于由Th1型應(yīng)答誘導(dǎo)的IgG2a亞型的抗體比由Th2型應(yīng)答誘導(dǎo)的IgG1亞型的抗體對流感病毒的感染防御性能更優(yōu)異，因此可期待通過類病毒顆粒(福爾馬林濃度：0.08％)帶來的有效性更加提升。表15A/CA株(H1N1亞型株)：亞型解析的結(jié)果(EU/mL)將以裂解疫苗進(jìn)行免疫而得到的小鼠血清分別稀釋25600倍時的值設(shè)為1EU/mL。表16A/TX株(H3N2亞型株)：亞型解析的結(jié)果(EU/mL)將以裂解疫苗進(jìn)行免疫得到的小鼠血清分別稀釋25600倍(IgG1)、51200倍(IgG2a)時的值設(shè)為1EU/mL。表17B/MA株(B型株)：亞型解析的結(jié)果(EU/mL)將以裂解疫苗進(jìn)行免疫得到的小鼠血清分別稀釋25600倍時的值設(shè)為1EU/mL。12.免疫原性4為了解析類病毒顆?？乖拿庖咴詸C(jī)制，使用Tolllikereceptor7knock-out(TLR7KO)小鼠(Backborne：BALB/c)來進(jìn)行解析。所使用的小鼠購自O(shè)rientalBioService,Inc.。使用雌性、5周齡的小鼠，以蛋白量2μg/各株的接種量、且以3周的間隔對每一組5～6只小鼠在肌內(nèi)接種全顆?？乖㈩惒《绢w?？乖?、裂解抗原2次。進(jìn)行1次免疫、且在3周后進(jìn)行部分血液采集，進(jìn)行2次免疫、在2周后進(jìn)行全血采集。通過離心分離獲得血清，測定HI抗體價。疫苗株使用H1N1亞型株(A/CA株)、H3N2亞型株(A/NY株)、B型株(B/BR株和B/MA株)。關(guān)于全顆?？乖?、類病毒顆粒抗原、及裂解抗原的制備方法，參照實施例1。將進(jìn)行1次免疫3周后的血清中的HI抗體價的幾何平均值(GMT)示于表18。在野生型小鼠(+/+)中，相較于裂解抗原，類病毒顆粒顯示較高的HI抗體價。另一方面，在基因敲除小鼠(－/－)中，對應(yīng)于類病毒顆粒的HI抗體價則降低至與裂解抗原相同程度為止。此結(jié)果啟示，類病毒顆粒所內(nèi)含的病毒單鏈RNA非常有助于類病毒顆粒的免疫原性。表18免疫原性(HI抗體價(GMT))的結(jié)果13.抗體亞型解析2作為抗體亞型解析，測定上述“12.免疫原性4”中獲得的小鼠的血清中所含的病毒抗原特異性的IgG1和IgG2a抗體價。將其結(jié)果示于表19～表21。顯示即使在容易誘導(dǎo)Th2優(yōu)勢免疫應(yīng)答的BALB/c野生型小鼠(+/+)中，相對于裂解抗原，比起誘導(dǎo)抗原特異性的IgG1，類病毒顆粒仍更能夠誘導(dǎo)抗原特異性的IgG2a。相對于此，在基因敲除小鼠(－/－)中，IgG2a的抗體價顯著下降。此結(jié)果啟示，病毒單鏈RNA對于Th1優(yōu)勢免疫的誘導(dǎo)是必要的。表19A/AC株(H1N1亞型株)：亞型解析的結(jié)果(EU/mL)將以裂解疫苗進(jìn)行免疫而得到的小鼠血清分別稀釋25600倍時的值設(shè)為1EU/mL。表20A/NY株(H3N2亞型株)：亞型解析的結(jié)果(EU/mL)將以裂解疫苗進(jìn)行免疫而得到的小鼠血清分別稀釋25600倍時的值設(shè)為1EU/mL。表21B/MA株(B型株)：亞型解析的結(jié)果(EU/mL)將以裂解疫苗進(jìn)行免疫而得到的小鼠血清分別稀釋25600倍時的值設(shè)為1EU/mL。14.產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞數(shù)解析為了計量上述“12.免疫原性4”中獲得的小鼠的脾臟中所含的抗原特異性的產(chǎn)生INF-γ的細(xì)胞數(shù)，進(jìn)行ELISPOT解析。解析使用MouseIFNgammaELISPOTReady-SET-Go！(eBioscience,Inc.制造的商品名)，并依照附加的概要說明書中記載的方法來進(jìn)行。將其結(jié)果示于表22～表25。確認(rèn)到在接種有全顆粒抗原或類病毒顆粒的小鼠中，比在接種有裂解抗原的小鼠中，能夠更強(qiáng)烈地誘導(dǎo)由樹突細(xì)胞、Th1細(xì)胞及NK細(xì)胞等與細(xì)胞性免疫相關(guān)的細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-γ。在基因敲除小鼠(－/－)中，類病毒顆粒抗原所誘導(dǎo)的產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)顯著下降。由此啟示，通過病毒單鏈RNA能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞，從而激發(fā)Th1優(yōu)勢免疫應(yīng)答。表22A/CA株(H1N1亞型株)：抗原特異性的產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)(在1×106脾臟細(xì)胞中)TLR7裂解抗原全顆?？乖惒《绢w粒+/+1214283－/－4525表23A/NY株(H3N2亞型株)：抗原特異性的產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)(在1×106脾臟細(xì)胞中)TLR7裂解抗原全顆粒抗原類病毒顆粒+/+109558－/－4404表24B/MA株(B型株)：抗原特異性的產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)(在1×106脾臟細(xì)胞中)TLR7裂解抗原全顆?？乖惒《绢w粒+/+105752－/－6495表25B/BR株(B型株)：抗原特異性的產(chǎn)生IFN-γ細(xì)胞數(shù)(在1×106脾臟細(xì)胞中)TLR7裂解抗原全顆?？乖惒《绢w粒+/+44347－/－838315.記憶B細(xì)胞數(shù)解析為了計量“上述12.免疫原性4”中獲得的小鼠的脾臟中所含的抗原特異性的記憶B細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT解析。在進(jìn)行ELISPOT前，為了使記憶B細(xì)胞分化成產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，利用促分裂原(mitogen)(源自Phytolaccaamericana的凝聚素；源自S.aureus的ProteinAsoluble、CpGODN；及源自Escherichiacoli的LPS)進(jìn)行刺激。將其結(jié)果示于表26～表29。確認(rèn)到在接種有全顆?？乖蝾惒《绢w粒的小鼠中，比在接種有裂解抗原的小鼠中，能夠更強(qiáng)烈地誘導(dǎo)脾臟細(xì)胞中的記憶B細(xì)胞。在接種有類病毒顆?？乖幕蚯贸∈?－/－)中，脾臟中的記憶B細(xì)胞數(shù)下降。由此啟示，病毒單鏈RNA與類病毒顆粒抗原的誘導(dǎo)記憶B細(xì)胞的性能有很大的關(guān)聯(lián)。表26A/CA株(H1N1亞型株)：抗原特異性的記憶B細(xì)胞數(shù)(在1×106脾臟細(xì)胞中)TLR7裂解抗原全顆?？乖惒《绢w粒+/+48126117－/－489855表27A/NY株(H3N2亞型株)：抗原特異性的記憶B細(xì)胞數(shù)(在1×105脾臟細(xì)胞中)TLR7裂解抗原全顆粒抗原類病毒顆粒+/+45123115－/－508548表28B/MA株(B型株)：抗原特異性的記憶B細(xì)胞數(shù)(在1×106脾臟細(xì)胞中)TLR7裂解抗原全顆?？乖惒《绢w粒+/+304562－/－183330表29B/BR株(B型株)：抗原特異性的記憶B細(xì)胞數(shù)(在1×106脾臟細(xì)胞中)TLR7裂解抗原全顆粒抗原類病毒顆粒+/+486585－/－18631816.發(fā)熱試驗(pyrogentest)1將以下所述者作為試樣：用PBS稀釋裂解抗原、全顆?？乖蝾惒《绢w粒，使1mL中的蛋白含量達(dá)到240μg。類病毒顆粒是使用下述試樣作為代表：以0.08％的福爾馬林在25℃進(jìn)行反應(yīng)1周，之后進(jìn)行醚處理而得到的試樣。將上述試樣，以每1kg體重1ml對兔進(jìn)行接種，觀察發(fā)熱的上升情形。將3只兔的發(fā)熱反應(yīng)總和(℃)示于表30。只有未進(jìn)行醚處理的全顆?？乖_認(rèn)到1.3℃以上的發(fā)熱總和。進(jìn)行醚處理后的裂解抗原、類病毒顆粒皆未確認(rèn)到1.3℃以上的發(fā)熱總和。表303只兔的發(fā)熱反應(yīng)的總和(℃)17.發(fā)熱試驗2以蛋白濃度達(dá)到終濃度250μg/mL的方式稀釋H1N1亞型株(A/CA株)的病毒顆粒，以0.08％的福爾馬林濃度在25℃使其反應(yīng)1周。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS對反應(yīng)液進(jìn)行透析以去除福爾馬林，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化后的流感病毒顆粒。之后，除了改變醚容量及改變聚山梨醇酯80濃度為0.05vol％以外，通過與上述“2.醚處理”相同的方法進(jìn)行醚處理，獲得膽固醇的含量各自不同的流感類病毒顆粒。將以下所述者作為試樣：用PBS稀釋所獲得的流感類病毒顆粒，使1mL中的蛋白含量達(dá)到240μg。將每1kg體重1mL的上述試樣對兔進(jìn)行接種，觀察發(fā)熱的上升情形。將3只兔的發(fā)熱反應(yīng)總和(℃)示于表31。包括相對于全顆?？乖瓪埩粲屑s70％膽固醇的含量的類病毒顆粒(醚：懸浮液B(vol比)為1：1的試樣)在內(nèi)的所有試樣中，并未確認(rèn)到1.3℃以上的發(fā)熱總和。表31A/CA株(H1N1亞型株)：3只兔對類病毒顆粒的發(fā)熱反應(yīng)的總和(℃)18.細(xì)胞因子(cytokine)定量1作為發(fā)熱試驗的替代方法，通過炎癥性細(xì)胞因子(inflammatorycytokine)測定系統(tǒng)評價細(xì)胞因子的量，該測定系統(tǒng)使用了人PBMC。作為炎癥性細(xì)胞因子，進(jìn)行關(guān)于代表性的IL-1β、IL-6的測定。使人末梢血單核細(xì)胞(PBMC)懸浮于FCS-MEM中，并稀釋成4×106cells/mL。96孔板中各添加100μL，并添加等量的裂解抗原、全顆粒抗原或類病毒顆粒(終濃度為50μg/mL)。之后，以37℃在CO2氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)24小時，并以ELISA法對上清液中的IL-1β和IL-6進(jìn)行定量。將作為代表的試樣的細(xì)胞因子定量(IL-1β)的結(jié)果示于表32，將細(xì)胞因子定量(IL-6)的結(jié)果示于表33，該試樣是以0.08％的福爾馬林在25℃進(jìn)行反應(yīng)1周，之后進(jìn)行醚處理而得到的?？芍噍^于使用了全顆?？乖那闆r，使用類病毒顆粒時的炎癥性細(xì)胞因子的量較少。由此啟示，相較于全顆?？乖?，類病毒顆粒較易抑制副反應(yīng)。表32細(xì)胞因子定量(IL-1β)的結(jié)果(pg/mL)表33細(xì)胞因子定量(IL-6)的結(jié)果(pg/mL)[實施例3]＜制備流感類病毒顆粒＞1.戊二醇(GA)處理(不像福爾馬林這樣形成亞甲基交聯(lián)，而是通過不可逆的交聯(lián)反應(yīng)對病毒顆粒進(jìn)行固定化的工序)以與實施例1相同的方式對A型流感病毒(H3N2亞型株(A/NY株))和B型流感病毒(B/BR株)進(jìn)行精制。將精制后的流感病毒顆粒進(jìn)行β-丙內(nèi)酯(BPL)滅活，之后以蛋白濃度達(dá)到終濃度1000μg/mL的方式進(jìn)行稀釋，獲得懸浮液A1(A/NY株)和懸浮液A2(B/BR株)。繼而，使用1w/v％GA溶液，以GA濃度達(dá)到0.016w/v％或0.008w/v％的方式進(jìn)行稀釋。將懸浮液A1或懸浮液A2與稀釋后的GA溶液(0.016w/v％或0.008w/v％)等量混合，在4℃使其反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS對反應(yīng)液進(jìn)行透析以去除GA，藉此獲得懸浮液B1(A/NY株)和懸浮液B2(B/BR株)(全顆?？乖?GA固定))，這些懸浮液包含被固定化后的流感病毒顆粒。2.醚處理(對被固定化后的病毒顆粒進(jìn)行脫脂處理的工序)在進(jìn)行GA處理后的上述包含流感病毒顆粒的懸浮液B1和懸浮液B2中，以終濃度達(dá)到0.05vol％的方式添加聚山梨醇酯80。之后，在上述懸浮液B1或懸浮液B2中，以終濃度達(dá)到33vol％的方式添加二乙醚(脫脂劑)，在25℃攪拌1小時。之后，以4℃、3000rpm對所獲得的混合液進(jìn)行離心分離5分鐘，回收水相，藉此去除醚相。通過上述工序制備試樣即流感類病毒顆粒。使用AmplexRedCholesterolAssayKit(Invitrogen公司制造的商品名)測定所獲得的流感類病毒的脂質(zhì)成分的含量。對包含流感類病毒顆粒的試樣進(jìn)行超高速離心分離(24000rpm，2hr，4℃)，將其分離成上清液與沉淀成分。用PBS對所獲得的沉淀成分進(jìn)行再懸浮。在再懸浮后的沉淀成分中添加熒光物質(zhì)試鹵靈，使其反應(yīng)。測定反應(yīng)后的熒光物質(zhì)試鹵靈的熒光強(qiáng)度，藉此對流感類病毒顆粒相對于全顆?？乖?GA固定)的脂質(zhì)成分的含量進(jìn)行定量。其結(jié)果啟示，相對于流感病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量至多是50質(zhì)量％以下(表34)。表34類病毒顆粒與全顆?？乖哪懝檀己康谋壤?％)[實施例4]＜物性評價＞利用以下方法評價上述實施例3中獲得的類病毒顆粒(試樣)。1.通過電子顯微鏡進(jìn)行解析為了進(jìn)一步詳細(xì)研究類病毒顆粒(源自A/NY株)的形狀，實施通過電子顯微鏡所進(jìn)行的觀察。使用戊二醇在室溫將約500μg/mL的上述試樣固定20分鐘。之后，在觀察用的經(jīng)離子鍍膜的sheetmesh(日新EM公司制造)上，放置固定后的試樣并靜置約60秒，然后以2％磷鎢酸水溶液進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡(FEICompany公司制造的TecnaiG2：加速電壓120kV)對染色后的試樣進(jìn)行觀察、攝影。圖5的(B)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結(jié)果，所述類病毒顆粒是以0.008w/v％的GA濃度在4℃進(jìn)行反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。圖5的(A)表示作為比較對照的全顆?？乖挠^察結(jié)果，該全顆?？乖且?.008w/v％的GA濃度在4℃進(jìn)行反應(yīng)3天而得到的。類病毒顆粒與全顆粒抗原同樣地保持了顆粒結(jié)構(gòu)。在觀察圖像中并未確認(rèn)到類病毒顆粒彼此相互結(jié)合而得到的凝聚體，該觀察圖像是通過醚處理破壞包膜而使染色液滲入而得到的。2.動態(tài)光散射使用ZetasizerNanoZS(Malvern公司制造)對類病毒顆粒的平均粒徑進(jìn)行解析。將通過動態(tài)光散射法所測得的液體中的平均粒徑示于表35。類病毒顆粒的平均粒徑是130nm左右且為單峰性。由此可知，醚處理后的平均粒徑是與病毒顆粒相同程度的顆粒大小。亦即可知，即使通過醚處理進(jìn)行脫脂，類病毒顆粒的平均粒徑仍是單一且不變的。由動態(tài)光散射實驗可知，類病毒顆粒保持了顆粒結(jié)構(gòu)、且未確認(rèn)到像凝聚體這樣的雜質(zhì)。表35通過動態(tài)光散射法所測得的液體中的平均粒徑(體積加權(quán)平均粒徑(主峰)(nm))全顆?？乖?福爾馬林固定)是以福爾馬林濃度0.02％在4℃使其反應(yīng)6周而得到的。3.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定量分析)研究類病毒顆粒中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為“源自病毒的基因組核酸”)的定量。用PBS稀釋類病毒顆粒、全顆?？乖砑覵DS和ProteinaseK，然后以55℃使其反應(yīng)18～57小時。之后，使用TRIzolLSReagent和PureLinkRNAMiniKit、PureLinkDNase(Invitrogen公司制造的商品名)來提取RNA。所提取的RNA的含量以Quant-iTRiboGreenRNAReagentandKit進(jìn)行測定(Invitrogen公司制造的商品名)。表36中表示類病毒顆粒相對于全顆?？乖腞NA含量的比例。相對于全顆?？乖惒《绢w粒殘留有約80％RNA。顯示即使在GA處理的情況，也與福爾馬林處理的情況同樣地，RNA幾乎都?xì)埩粼陬惒《绢w粒中。表36類病毒顆粒相對于全顆粒抗原的RNA含量的比例(％)4.免疫原性1使用小鼠評價類病毒顆粒的免疫原性。以蛋白量0.8μg的接種量對ddY小鼠(雌性，8周齡)在肌內(nèi)接種裂解抗原(福爾馬林滅活)或類病毒顆粒(每一組16只)。免疫3周后使小鼠安樂死，然后進(jìn)行全血采集。通過離心分離獲得血清，測定中和抗體價。將作為代表的試樣的免疫原性(中和抗體價(GMT))的結(jié)果示于表37，該試樣是以0.004w/v％的GA在4℃進(jìn)行反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。若為B型株的情況，相較于裂解抗原，類病毒顆粒為較高的免疫原性。表37免疫原性(中和抗體價(GMT))的結(jié)果5.免疫原性2對B型株即B/WC株依照實施例1的方法制作類病毒顆粒。使用小鼠評價所獲得的流感顆粒的免疫原性。以蛋白量0.8μg的接種量對ddY小鼠(雌性，8周齡)在肌內(nèi)接種裂解抗原(福爾馬林滅活)、類病毒顆粒(每一組16只)。免疫3周后使小鼠安樂死，然后進(jìn)行全血采集。通過離心分離獲得血清，測定HI抗體價。將作為代表的試樣的免疫原性(HI抗體價(GMT))的結(jié)果示于表38，該試樣是以0.010w/v％的GA在4℃進(jìn)行反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。相較于裂解抗原，類病毒顆粒為較高的免疫原性。表38免疫原性(HI抗體價(GMT))的結(jié)果6.發(fā)熱試驗將以下所述者作為試樣：用PBS稀釋類病毒顆粒，使1mL中的蛋白含量達(dá)到240μg。將上述試樣以每1kg體重1ml對兔進(jìn)行接種，觀察發(fā)熱的上升情形。將3只兔的發(fā)熱反應(yīng)總和(℃)示于表39。進(jìn)行醚處理后的類病毒顆粒皆未確認(rèn)到1.3℃以上的發(fā)熱反應(yīng)總和。表39類病毒顆粒的3只兔的發(fā)熱反應(yīng)的總和(℃)7.細(xì)胞因子定量依照實施例2的“18.細(xì)胞因子定量1”對細(xì)胞因子進(jìn)行定量。將類病毒顆粒A/NY株的細(xì)胞因子定量(IL-1β和IFN-α)的結(jié)果示于表40，將B/BR株的細(xì)胞因子定量的結(jié)果示于表41。可知比起使用全顆?？乖?福爾馬林固定)的情況，使用類病毒顆粒時炎癥性細(xì)胞因子的量較少。由此啟示，相較于全顆粒抗原，類病毒顆粒較易抑制副反應(yīng)。表40A/NY株(H3N2亞型株)：細(xì)胞因子定量的結(jié)果(pg/mL)表41B/BR株(B型株)：細(xì)胞因子定量的結(jié)果(pg/mL)[實施例5]＜制備流感類病毒顆粒＞1.1-乙基-3-[3-二甲胺丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)處理(使氨基與病毒顆粒的羧基反應(yīng)而生成酰胺鍵來進(jìn)行固定化的工序)以濃度達(dá)到4～0.1M的方式用PBS稀釋EDC。以與實施例1相同的方式對A型流感病毒(H3N2亞型株(A/NY株))和B型流感病毒(B/BR株)進(jìn)行精制。對精制后的流感病毒顆粒進(jìn)行BPL滅活，之后添加EDC溶液，在4℃使其反應(yīng)2小時，該EDC溶液是以EDC濃度達(dá)到0.5～0.005M的方式稀釋而得到的。此時，使反應(yīng)液中的蛋白濃度達(dá)到2500μg/mL。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS對反應(yīng)液進(jìn)行透析以去除EDC，藉此獲得懸浮液B1(A/NY株)和懸浮液B2(B/BR株)，這些懸浮液包含被固定化后的流感病毒顆粒。2.醚處理(對被固定化后的病毒顆粒進(jìn)行脫脂處理的工序)在進(jìn)行EDC處理后的上述包含流感病毒顆粒的懸浮液B1和懸浮液B2中，以終濃度達(dá)到0.05vol％的方式添加聚山梨醇酯80。之后，在上述懸浮液B1和懸浮液B2中，以終濃度達(dá)到33vol％的方式添加二乙醚(脫脂劑)，在25℃攪拌1小時。之后，以4℃、3000rpm對所獲得的混合液進(jìn)行離心分離5分鐘，回收水相，藉此去除醚相。通過以上工序，制備試樣即流感類病毒顆粒。使用AmplexRedCholesterolAssayKit(Invitrogen公司制造的商品名)來測定所獲得的流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量。對包含流感類病毒顆粒的試樣進(jìn)行超高速離心分離(24000rpm，2hr，4℃)，將其分離成上清液與沉淀成分。用PBS對所獲得的沉淀成分進(jìn)行再懸浮。在再懸浮后的沉淀成分中添加熒光物質(zhì)試鹵靈，使其反應(yīng)。測定反應(yīng)后的熒光物質(zhì)試鹵靈的熒光強(qiáng)度，藉此對流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量進(jìn)行定量。其結(jié)果啟示，相對于流感病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，流感類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量至多是50質(zhì)量％以下(表42)。表42類病毒顆粒與全顆?？乖哪懝檀己康谋壤?％)[實施例6]＜物性評價＞利用以下方法來評價上述實施例5中獲得的類病毒顆粒(試樣)的物性。1.通過蔗糖密度梯度離心法來進(jìn)行分析通過蔗糖密度梯度離心法對源自H3N2亞型株(A/NY株)的類病毒顆粒進(jìn)行分析。將作為代表的試樣(全顆?？乖皖惒《绢w粒)疊加在15～60％的蔗糖密度梯度上，以4℃、18000rpm進(jìn)行離心分離16小時，該試樣是以0.05M的EDC濃度進(jìn)行EDC處理而得到的。離心后，每一級分各提取0.6ml，并測定各級分的蔗糖濃度、HA價及蛋白濃度。將結(jié)果示于表43。類病毒顆粒作為單峰而被分級在高蔗糖濃度(約50％)，因此顯示所述類病毒具有與滅活全顆粒同樣的形狀(顆粒性)。HA的活性是1280倍。表43A/NY株(H3N2亞型株)：類病毒顆粒和全顆粒抗原的蔗糖密度梯度離心分析與HA活性2.通過電子顯微鏡進(jìn)行解析為了進(jìn)一步詳細(xì)研究類病毒顆粒(源自A/NY株)的形狀，實施通過電子顯微鏡所進(jìn)行的觀察。使用戊二醇在室溫將約500μg/mL的上述試樣固定20分鐘。之后，在觀察用的經(jīng)離子鍍膜的sheetmesh(日新EM公司制造)上放置固定后的試樣并靜置約60秒，然后以2％磷鎢酸水溶液進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡(FEICompany制造的TecnaiG2：加速電壓120kV)對染色后的試樣進(jìn)行觀察、攝影。圖6的(B)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結(jié)果，所述類病毒顆粒是以0.5M的EDC濃度在4℃反應(yīng)2小時，之后進(jìn)行醚處理而得到的。圖6的(A)表示作為比較對照的全顆?？乖挠^察結(jié)果，該全顆?？乖且?.5M的EDC濃度在4℃反應(yīng)2小時而得到的。類病毒顆粒與全顆?？乖瑯拥乇３至祟w粒結(jié)構(gòu)。在觀察圖像中并未確認(rèn)到類病毒顆粒彼此相互結(jié)合而形成的凝聚體，該觀察圖像是通過醚處理破壞包膜而使染色液滲入而成的。3.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定量分析)研究類病毒顆粒中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為“源自病毒的基因組核酸”)的定量。用PBS稀釋類病毒顆粒或全顆?？乖砑覵DS和ProteinaseK，然后以55℃使其反應(yīng)6小時。之后，使用TRIzolLSReagent和PureLinkRNAMiniKit、PureLinkDNase(Invitrogen公司制造的商品名)提取RNA。所提取的RNA的含量是用Quant-iTRiboGreenRNAReagentandKit進(jìn)行測定的(Invitrogen公司制造的商品名)。表44中表示類病毒顆粒相對于全顆粒抗原的RNA含量的比例。相對于全顆?？乖惒《绢w粒的RNA殘留約90％，啟示即使在EDC處理的情況下，也與福爾馬林處理的情況同樣地，在類病毒顆粒中RNA幾乎都?xì)埩?。?4類病毒顆粒相對于全顆?？乖腞NA含量的比例(％)4.免疫原性1使用小鼠評價類病毒顆粒的免疫原性。以蛋白量0.8μg的接種量對ddY小鼠(雌性，8周齡)在肌內(nèi)接種裂解抗原(福爾馬林滅活)或類病毒顆粒(每一組16只)。免疫3周后使小鼠安樂死，進(jìn)行全血采集。通過離心分離獲得血清，測定中和抗體價。將作為代表的類病毒顆粒的免疫原性(中和抗體價(GMT))的結(jié)果示于表45，該試樣是以0.05M的EDC在4℃反應(yīng)2小時，之后進(jìn)行醚處理而得到的。若為H3N2亞型株的情況，相較于裂解抗原，類病毒顆粒為較高的免疫原性。若為B型株的情況，相較于裂解抗原，類病毒顆粒為顯著較高的免疫原性(P＜0.05)。表45免疫原性(中和抗體價(GMT))的結(jié)果5.發(fā)熱試驗將以下所述者作為試樣：用PBS稀釋類病毒顆粒，使1mL中的蛋白含量達(dá)到240μg。將上述試樣以每1kg體重1ml對兔進(jìn)行接種，觀察發(fā)熱的上升情形。將3只兔的發(fā)熱反應(yīng)總和(℃)示于表46。進(jìn)行醚處理后的類病毒顆粒皆未確認(rèn)到1.3℃以上的發(fā)熱總和。表46類病毒顆粒的3只兔的發(fā)熱反應(yīng)的總和(℃)6.細(xì)胞因子定量依照實施例2的“18.細(xì)胞因子定量1”對細(xì)胞因子進(jìn)行定量。將類病毒顆粒A/NY株的細(xì)胞因子定量(IL-1β和IFN-α)的結(jié)果示于表47，將B/BR株的細(xì)胞因子定量的結(jié)果示于表48?？芍绕鹗褂萌w粒抗原(福爾馬林固定)的情況，使用類病毒顆粒時炎癥性細(xì)胞因子的量較少。由此啟示，相較于全顆?？乖?，類病毒顆粒較易抑制副反應(yīng)。表47A/NY株(H3N2亞型株)：細(xì)胞因子定量的結(jié)果(pg/mL)表48B/BR株(B型株)：細(xì)胞因子定量的結(jié)果(pg/mL)[實施例7]＜制備日本腦炎類病毒顆粒＞1.戊二醛處理(將病毒顆粒的顆粒結(jié)構(gòu)固定化的工序)在Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥(化學(xué)及血清療法研究所制造，商品名“ENCEVAC”(已以0.08％福爾馬林進(jìn)行滅活)，懸浮液A)中以終濃度達(dá)到0.002～0.05vol％的方式添加戊二醛，在4℃使其反應(yīng)3天。反應(yīng)結(jié)束后，用添加有活化劑即乳糖(終濃度5w/v％)的PBS對獲得的反應(yīng)液進(jìn)行透析。通過透析以去除戊二醛，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化后的日本腦炎病毒顆粒。2.醚處理(對被固定化后的病毒顆粒進(jìn)行脫脂處理的工序)在上述懸浮液B中添加相同容量的二乙醚和以終濃度達(dá)到0.01vol％的方式添加聚山梨醇酯80，在常溫下攪拌1小時。以4℃、3000rpm進(jìn)行離心5分鐘，之后回收水相，去除醚相。通過以上工序制備試樣即日本腦炎類病毒顆粒。[實施例8]＜物性評價＞利用以下方法評價上述實施例7中獲得的類病毒顆粒(試樣)的物性。1.通過電子顯微鏡進(jìn)行解析為了進(jìn)一步詳細(xì)研究類病毒顆粒的形狀，實施通過電子顯微鏡所進(jìn)行的觀察。在觀察用的經(jīng)離子鍍膜的sheetmesh(日新EM公司制造)上放置約70μg/mL的上述試樣并靜置約60秒，然后以2％磷鎢酸水溶液進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡(FEICompany制造的TecnaiG2：加速電壓120kV)對染色后的試樣進(jìn)行觀察、攝影。圖7的(C)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結(jié)果，所述類病毒顆粒是以0.01w/v％的戊二醛濃度在4℃反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。圖7的(B)、圖7的(A)分別表示作為比較對照的類病毒顆粒、Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥的觀察結(jié)果，所述類病毒顆粒是未用戊二醛固定，之后進(jìn)行醚處理而得到的。類病毒顆粒通過用戊二醛固定而與Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥同樣地保持了顆粒結(jié)構(gòu)。另一方面，未用戊二醛固定的類病毒顆粒則觀察到有凝聚的情形。2.動態(tài)光散射使用ParticleSizingSystem：NICOMP380ZLS-S對類病毒顆粒的平均粒徑進(jìn)行解析。將通過動態(tài)光散射法所測得的液體中的平均粒徑示于表49。類病毒顆粒的平均粒徑是約90nm且?guī)缀鯙閱畏逍?。另一方面，Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥是約80nm且?guī)缀鯙閱畏逍?。由此可知，醚處理后的平均粒徑是比未進(jìn)行醚處理的病毒顆粒稍大，因而即使通過醚處理進(jìn)行脫脂，該平均粒徑仍幾乎不變。由動態(tài)光散射實驗可知，類病毒顆粒保持了顆粒結(jié)構(gòu)且未確認(rèn)到像凝聚體這樣的雜質(zhì)。表49通過動態(tài)光散射法所測得的液體中的平均粒徑(體積加權(quán)平均粒徑(主峰(％)(nm)))3.抗原的含量通過SandwichELISA法測定抗原的含量(抗原含量)，該分析法使用了抗日本腦炎病毒抗體。試樣中所含的E抗原被捕獲于鍵合有抗日本腦炎病毒的兔IgG(一抗：多株抗體)的微量盤中。之后，使抗日本腦炎病毒B蛋白單克隆抗體(二抗：單克隆抗體)與其進(jìn)行反應(yīng)，藉此形成鍵合于微量盤的抗E抗原抗體/E抗原/二抗的復(fù)合物，該抗日本腦炎病毒B蛋白單克隆抗體鍵合有源自辣根(horseradish)的過氧化酶(HRP)。通過洗滌將未反應(yīng)而殘留的試劑和試樣去除，使其與酶基質(zhì)液(鄰苯二胺溶液：OPD溶液)反應(yīng)時，E抗原復(fù)合物上的HPR會發(fā)生反應(yīng)而顯色。OPD的顯色強(qiáng)度會復(fù)合物的量(反映E抗原量)成比例，利用這樣的特性測定E抗原含量。將作為代表的下述各試樣的抗原含量示于表50：用0.01w/v％的戊二醛濃度在4℃進(jìn)行反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒(添加0.005％聚山梨醇酯80而進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒、及不添加聚山梨醇酯80而進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒)；未用戊二醛固定、之后進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒；及，Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥。在未添加聚山梨醇酯80的試樣和未用戊二醛固定的試樣中，抗原含量小于6.25μg/mL，相對于此，添加有0.005％聚山梨醇酯80的類病毒顆粒，則包含與Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥相同程度的抗原。表50抗原含量的結(jié)果(μg/mL)顯示作為構(gòu)成日本腦炎病毒的膜的脂質(zhì)，膽固醇最多。因此，類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量以膽固醇為代表來進(jìn)行定量。使用AmplexRedCholesterolAssayKit(Invitrogen公司制造的商品名)測定所獲得的日本腦炎類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量。對包含日本腦炎類病毒顆粒的試樣進(jìn)行超高速離心分離(24000rpm，6hr，4℃)，將其分離成上清液與沉淀成分。用PBS對所獲得的沉淀成分進(jìn)行再懸浮。在再懸浮后的沉淀成分中添加熒光物質(zhì)試鹵靈，使其反應(yīng)。測定反應(yīng)后的熒光物質(zhì)試鹵靈的熒光強(qiáng)度，藉此對日本腦炎類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量進(jìn)行定量。其結(jié)果啟示，相對于日本腦炎病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量，日本腦炎類病毒顆粒的脂質(zhì)成分的含量至多是20質(zhì)量％以下(表51)。表51類病毒顆粒與全顆粒抗原的膽固醇含量的比例(％)4.分析源自病毒顆粒的基因組核酸(定量分析)研究類病毒顆粒中源自病毒顆粒的基因組核酸(有時稱為“源自病毒的基因組核酸”)的定量。用PBS稀釋類病毒顆?；蛉w粒抗原，添加SDS和ProteinaseK，然后以55℃使其反應(yīng)54小時。之后，使用TRIzolLSReagent和PureLinkRNAMiniKit、PureLinkDNase(Invitrogen公司制造的商品名)提取RNA。所提取的RNA的含量是以Quant-iTRiboGreenRNAReagentandKit進(jìn)行測定的(Invitrogen公司制造的商品名)。表52中表示類病毒顆粒相對于全顆?？乖腞NA含量的比例。啟示：相對于全顆?？乖?，類病毒顆粒殘留有約70％RNA(表52)。表52類病毒顆粒相對于全顆?？乖腞NA含量的比例(％)5.細(xì)胞因子定量作為發(fā)熱試驗的替代方法，通過炎癥性細(xì)胞因子測定系統(tǒng)評價細(xì)胞因子的量，該測定系統(tǒng)使用了人PBMC。作為炎癥性細(xì)胞因子，進(jìn)行關(guān)于代表性的IL-1β、IL-6的測定。使人末梢血單核細(xì)胞(PBMC)懸浮于FCS-MEM中，稀釋成4×106cells/mL。各添加100μL至96孔板中，并添加等量的類病毒顆粒或Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥(終濃度為25μg/mL)。之后，以37℃在CO2氣氛下進(jìn)行培養(yǎng)24小時，并用ELISA法對上清液中的IL-1β和IL-6進(jìn)行定量。將作為代表的試樣的細(xì)胞因子定量(IL-1β和IL-6)的結(jié)果示于表53，該試樣是以0.01w/v％的戊二醛濃度在4℃反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。類病毒顆粒的IL-1β、IL-6皆比Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥更少。由此啟示，相較于Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥，類病毒顆粒較易抑制副反應(yīng)。表53細(xì)胞因子定量的結(jié)果(pg/mL)6.免疫原性(小鼠)以4μg或1μg的接種量對ddY小鼠(雌性，4周齡)在腹腔內(nèi)接種作為代表的類病毒顆粒(添加0.005％聚山梨醇酯80并進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒)或Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥(每一組10只)，所述類病毒顆粒是以0.01w/v％的戊二醛濃度在4℃反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。在免疫1周后再次進(jìn)行免疫，且在1周后使小鼠安樂死，進(jìn)行全血采集。通過離心分離獲得血清，每一組分別以等量儲存，然后測定中和抗體價。將由50％溶斑(plaque)減少率計算出的結(jié)果示于表54。相較于Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥，進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒為相同程度或以上的中和抗體價。表54免疫原性(中和抗體價)的結(jié)果7.免疫原性(食蟹獼猴)以4μg的接種量對食蟹獼猴(雌性，約8歲齡)在腹腔內(nèi)接種作為代表的類病毒顆粒(添加0.01％聚山梨醇酯80并進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒)或Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥(每一組3只)，所述類病毒顆粒是以0.01w/v％的戊二醛濃度在4℃反應(yīng)3天、之后進(jìn)行醚處理而得到的。在免疫3周后再次進(jìn)行免疫，且在4周后進(jìn)行部分血液采集。通過離心分離獲得血清，每一組分別以等量來儲存，然后測定中和抗體價。將由50％溶斑減少率計算出的結(jié)果示于表55。相較于Vero細(xì)胞培養(yǎng)日本腦炎疫苗原料藥，進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒同樣地誘導(dǎo)充分的中和抗體。表55免疫原性(中和抗體價)的結(jié)果(食蟹獼猴)[實施例9]＜制備HBs類病毒顆粒＞1.甲醛處理(對病毒顆粒的顆粒結(jié)構(gòu)進(jìn)行固定化的工序)一面攪拌HBs抗原液(懸浮液A)一面以終濃度達(dá)到0.018～0.162w/v％的方式添加甲醛，使其反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS透析反應(yīng)液，去除甲醛，藉此獲得懸浮液B，該懸浮液B包含被固定化后的HBs顆粒。2.醚處理(對被固定化后的病毒顆粒進(jìn)行脫脂處理的工序)在上述懸浮液B中以終濃度達(dá)到0.05vol％的方式添加聚山梨醇酯80。之后，以終濃度達(dá)到50vol％的方式添加與上述懸浮液B相同容量的二乙醚(脫脂劑)，在25℃攪拌1小時。之后，以4℃、3000rpm對所獲得的混合液進(jìn)行離心分離5分鐘，回收水相(懸浮液C)，藉此去除醚相。3.添加鋁鹽在上述懸浮液C中混合鋁鹽。通過上述工序制備試樣即HBs類病毒顆粒。[實施例10]＜物性評價＞利用以下方法評價上述實施例9中獲得的類病毒顆粒(試樣)。1.通過電子顯微鏡進(jìn)行解析為了進(jìn)一步詳細(xì)研究類病毒顆粒的形狀，實施通過電子顯微鏡所進(jìn)行的觀察。在觀察用的經(jīng)離子鍍膜的sheetmesh(日新EM公司制造)上放置約25μg/mL的上述試樣并靜置約60秒，然后以2％磷鎢酸水溶液進(jìn)行負(fù)染色。使用透射型電子顯微鏡(FEICompany制造的TecnaiG2：加速電壓120kV)對染色后的試樣進(jìn)行觀察、攝影。圖8的(B)表示作為代表的類病毒顆粒的觀察結(jié)果，所述類病毒顆粒是以0.05w/v％的甲醛濃度在37℃反應(yīng)96小時、之后進(jìn)行醚處理而得到的。圖8的(A)表示作為比較對照的全病毒顆粒的觀察結(jié)果，所述類病毒顆粒在福爾馬林固定后未進(jìn)行醚處理。類病毒顆粒通過用甲醛固定，而與HBs全顆粒同樣地保持了顆粒結(jié)構(gòu)。2.抗原的含量通過一步夾心酶免疫分析法法(one-stepsandwichenzymeimmunoassay)測定抗原的含量(抗原含量)，該分析法使用了高親和性抗HBs的小鼠單克隆抗體。上述測定使用全自動酶免疫分析裝置AIA(AutomatedEnzymeImmunoassayanalyzerAIA，東曹株式會社制造的商品名)來進(jìn)行。在測定所使用的試劑杯中，裝有作為冷凍干燥物的被固定化于磁性小珠上的抗體與堿性磷酸酶標(biāo)記抗體。在上述試劑杯中添加試樣，藉此以固定時間、固定溫度進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。反應(yīng)后，以洗滌水洗滌上述磁性小珠，藉此去除游離的酶標(biāo)記抗體和試樣成分。之后，為了測定鍵合于磁性小珠上的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的酶活性，添加磷酸4-甲基傘形基酯(4-methylumbelliferylphosphate)作為酶基質(zhì)。作為酶反應(yīng)的結(jié)果，測定所獲得的熒光物質(zhì)(4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone))的生成速度，藉此測定試樣中的HBs抗原濃度。使用類病毒顆粒作為代表，以及使用重組重組沉降B型肝炎疫苗作為比較對照(化學(xué)及血清療法研究所制造，商品名”Bimmugen”)，所述類病毒顆粒是以0.05w/v％的甲醛濃度在37℃反應(yīng)96小時、之后進(jìn)行醚處理而得到的。將各抗原含量(ng/mL)除以蛋白濃度(ng/mL)而得的比活性值示于表56。添加有0.005％聚山梨醇酯80的類病毒顆粒包含與重組沉降B型肝炎疫苗相同程度的抗原。表56抗原含量除以蛋白濃度而得的比活性的結(jié)果3.動態(tài)光散射使用ZetasizerNanoZS(Malvern公司制造)對類病毒顆粒的平均粒徑進(jìn)行解析。將對作為代表的類病毒顆粒和作為比較對照的重組沉降B型肝炎疫苗進(jìn)行測定的結(jié)果示于表57，所述類病毒顆粒是以0.05w/v％的甲醛濃度在37℃反應(yīng)96小時、之后進(jìn)行醚處理而得到的。任一試樣的平均粒徑皆是100nm左右且為單峰性。由此可知，醚處理后的類病毒顆粒的平均粒徑是與病毒顆粒相同程度的顆粒大小，并且為單一且不變的。由動態(tài)光散射實驗可知，類病毒顆粒保持了顆粒結(jié)構(gòu)且未確認(rèn)到像凝聚體這樣的雜質(zhì)。表57通過動態(tài)光散射所測得的液體中的平均粒徑4.磷脂酰膽堿的含量試驗在HBs抗原所含的脂質(zhì)成分中，80％以上是磷脂酰膽堿。因此，HBs抗原的脂質(zhì)成分的含量以磷脂酰膽堿的含量為代表進(jìn)行定量。使用PhosphatidylcholineAssayKit(CellBiolabs,Inc.制造的商品名)進(jìn)行測定。在源自辣根(horseradish)的過氧化酶(HRP)的催化作用下，利用高靈敏度熒光探針來檢測到在反應(yīng)過程中產(chǎn)生的過氧化氫，測定其熒光強(qiáng)度，藉此測定磷脂酰膽堿的含量。將對作為代表的類病毒顆粒和作為比較對照的重組沉降B型肝炎疫苗進(jìn)行測定的結(jié)果示于表58，所述類病毒顆粒是以0.05w/v％的甲醛濃度在37℃反應(yīng)96小時、之后進(jìn)行醚處理而得到的。啟示：相對于比較對照，類病毒顆粒的磷脂酰膽堿的含量至多是59質(zhì)量％以下。表58類病毒顆粒相對于重組沉降B型肝炎疫苗的磷脂酰膽堿的含量的比例5.免疫原性(小鼠)以2μg或0.5μg的接種量對BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠(雌性，5周齡)在腹腔內(nèi)接種類病毒顆粒(添加0.005％聚山梨醇酯80并進(jìn)行醚處理而得到的類病毒顆粒)或重組沉降B型肝炎疫苗(每一組8只)，所述類病毒顆粒是以0.05w/v％的甲醛濃度在37℃反應(yīng)96小時、之后進(jìn)行醚處理而得到的。在免疫4周后再次進(jìn)行免疫，在4周后使小鼠安樂死，然后進(jìn)行全血采集。通過離心分離獲得血清，使用全自動酶免疫分析裝置AIA(東曹株式會社制造的商品名)測定血清中的抗體價。通過一步夾心酶免疫分析法法進(jìn)行測定，該分析法使用了HBs抗原作為固相層和酶標(biāo)記抗原。在測定所使用的試劑杯中，裝有作為冷凍干燥物的被固定化于磁性小珠上的抗原和堿性磷酸酶標(biāo)記抗原。在上述試劑杯中添加試樣，藉此以固定時間、固定溫度進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。反應(yīng)后，以洗滌水洗滌上述磁性小珠，藉此去除未反應(yīng)的酶標(biāo)記抗原。之后，為了測定鍵合于磁性小珠上的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體的酶活性，添加磷酸4-甲基傘形基酯作為酶基質(zhì)。作為酶反應(yīng)的結(jié)果，測定所獲得的熒光物質(zhì)(4-甲基傘形酮)的生成速度，藉此測定試樣中的抗HBs抗體濃度。將結(jié)果示于表59。相較于重組沉降B型肝炎疫苗，醚處理后的類病毒顆粒為相同程度或以上的免疫原性。表59免疫原性(抗體價GMT)的結(jié)果產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明在醫(yī)藥品的領(lǐng)域，尤其是在疫苗的領(lǐng)域中是有用的。當(dāng)前第1頁1 2 3