發(fā)明領(lǐng)域。

本發(fā)明涉及具有抗微生物性質(zhì)的藥物組合物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有多重抗藥性-抑制性質(zhì)的所述藥物組合物。

相關(guān)技術(shù)概述

抗生素代表了歷史上醫(yī)學(xué)的最偉大進(jìn)步之一。不幸的是，在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)中某些抗生素的過(guò)度使用已導(dǎo)致出現(xiàn)抵抗許多最常用的抗生素的病理學(xué)微生物，迫使需要尚未對(duì)所述微生物暴露的結(jié)構(gòu)上不同的抗生素。所述抗生素抵抗的一種形式歸因于一些抗生素能夠在不同的細(xì)胞(包括真菌和細(xì)菌)中激活多重抗藥性(MDR)系統(tǒng)。結(jié)果是，這些MDR系統(tǒng)泵出抗生素，從而減少它們?cè)诎屑?xì)胞中的濃度和顯著減少抗生素的抗微生物作用。例如，在許多情況下，病原性真菌具有穩(wěn)健的MDR系統(tǒng)(見(jiàn)參考文獻(xiàn)1和2)。抑制微生物MDR泵的安全、方便和通用方法的開(kāi)發(fā)是尚未解決的問(wèn)題。有效的抗生素，其也是MDR抑制劑，預(yù)期顯示對(duì)MDR-介導(dǎo)的抵抗較不敏感的抗細(xì)菌或抗真菌性質(zhì)，因?yàn)樗ㄟ^(guò)改變這些抗生素的流入/流出的平衡而增加抗生素在靶細(xì)胞中的濃度。進(jìn)而，這種平衡改變和抗生素濃度增加應(yīng)降低靶細(xì)胞的成活力。

在過(guò)去10-15年期間，親脂性陽(yáng)離子作為線粒體靶向藥物已經(jīng)進(jìn)行廣泛地研究。這樣的藥物的主要作用是保護(hù)靶細(xì)胞免于氧化應(yīng)激和其它應(yīng)激因素(見(jiàn)例如Lukashev等, 2014)。對(duì)于SkQ家族的許多化合物(見(jiàn)參考文獻(xiàn)3，WO2011059355)以及對(duì)于缺少抗氧化劑部分的親脂性陽(yáng)離子，例如C12TPP、C12R19等(見(jiàn)WO2011162633和參考文獻(xiàn)15, 16)，已經(jīng)顯示這些保護(hù)性質(zhì)。因?yàn)樵谶@些生物的細(xì)胞的外膜上的電勢(shì)，這些線粒體靶向的(即親脂，同時(shí)帶正電荷)化合物可在細(xì)菌和真菌內(nèi)部蓄積。因此，可預(yù)期用這些化合物處理細(xì)菌或真菌可在應(yīng)激條件下保護(hù)這些生物，和增加它們的成活力。因此，可認(rèn)為這些親脂性陽(yáng)離子化合物不應(yīng)用作細(xì)菌或真菌感染的治療。因此，對(duì)還具有MDR-抑制性質(zhì)的抗生素存在需要。

發(fā)明簡(jiǎn)述

本發(fā)明提供還具有MDR-抑制性質(zhì)的抗生素的藥物制劑，和它們用作抗細(xì)菌和抗真菌劑的方法。本發(fā)明人已出人意料地發(fā)現(xiàn)，之前顯示對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)性質(zhì)的親脂性陽(yáng)離子化合物事實(shí)上具有對(duì)細(xì)菌和真菌的抗生素性質(zhì)，同時(shí)具有MDR-抑制性質(zhì)。

一般來(lái)說(shuō)，這樣的親脂性陽(yáng)離子化合物具有結(jié)構(gòu)式1：

其中A是氫原子(H)或具有以下結(jié)構(gòu)的抗氧化劑部分：

和/或其還原(即，醌醇)形式

其中m是0-3的整數(shù)；各個(gè)Y是甲基；

L是接頭基團(tuán)，其為直鏈或支鏈烴鏈，所述烴鏈可任選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代和任選地含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵；和

B是親脂性陽(yáng)離子。這樣的化合物是帶電荷的(陽(yáng)離子)，因此它們以與任何藥學(xué)上可接受的陰離子(抗衡離子)的鹽的形式存在。

本發(fā)明的方法包括給予具有細(xì)菌或真菌感染的受試者藥學(xué)上有效量的本發(fā)明的一種或多種親脂性陽(yáng)離子化合物，任選地與另外一種或多種抗微生物化合物或一種或多種抗微生物劑。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示Pdr5的表達(dá)水平影響對(duì)C₁₂TPP的抗性。圖1A顯示本研究中使用的十二烷基三苯基膦C₁₂TPP和其葉綠醌衍生物(SkQ1)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖1B顯示用指示濃度的C₁₂TPP或SkQ1處理的葡萄糖培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果。圖1C顯示用指示濃度的C₁₂TPP或SkQ1處理的半乳糖培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果。根據(jù)Wilcoxon符號(hào)秩非配對(duì)檢驗(yàn)，與未處理的WT相比，*P < 0.05。

圖2顯示C₁₂ TPP或能量剝奪增強(qiáng)在酵母細(xì)胞中羅丹明6G蓄積。圖2A顯示酵母細(xì)胞的R6G染色通過(guò)低濃度的C₁₂TPP而非FCCP得到增強(qiáng)。指數(shù)生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞在指示濃度的C₁₂TPP或FCCP存在下用500 nM R6G染色。圖2B顯示加入葡萄糖導(dǎo)致總體熒光降低。從線粒體中保留的R6G觀察到弱信號(hào)(增強(qiáng)對(duì)比)。(代表性圖片；線條，5 μm)。

圖3顯示C₁₂TPP和SkQ1阻止R6G從酵母細(xì)胞流出。圖3A顯示葡萄糖-誘導(dǎo)的R6G從酵母細(xì)胞流出的間接測(cè)量。圖3B顯示葡萄糖-誘導(dǎo)的R6G從AD1-8 (MDR-陰性)細(xì)胞流出可以忽略。圖3C和D顯示FCCP (2 μM)、C₁₂TPP (2 μM)或SkQ1 (2 μM)抑制葡萄糖-誘導(dǎo)的R6G從酵母細(xì)胞流出。圖3E顯示結(jié)果的量化?？v坐標(biāo)對(duì)應(yīng)于a和b的斜率。圖3F顯示FCCP (2 μM)、C₁₂TPP (2 μM)或SkQ1 (2 μM)抑制葡萄糖-誘導(dǎo)的R6G從用10 mM NaN₃預(yù)處理的酵母細(xì)胞流出。根據(jù)Wilcoxon符號(hào)秩非配對(duì)檢驗(yàn)，與未處理的WT相比，*P < 0.05，**P < 0.01。

圖4顯示C₁₂TPP增強(qiáng)Pdr5底物環(huán)己酰亞胺D和克霉唑的作用。圖4A顯示在乙醇(模擬對(duì)照)、C₁₂TPP (1 μM)、環(huán)己酰亞胺D (ChD, 0.05 μM)或兩種化學(xué)品的存在下生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞的加倍時(shí)間。圖4B顯示C₁₂TPP (1 μM)增加克霉唑(CltrA, 60 μM)的抑制作用。根據(jù)Wilcoxon符號(hào)秩配對(duì)檢驗(yàn)，與未處理的WT相比，*P < 0.05。

圖5顯示PDR5基因的過(guò)表達(dá)增加C12R1從酵母細(xì)胞的有效流出。為了測(cè)量C12R1流出的相對(duì)速率，使用如Knorre等2014的熒光測(cè)定法(http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.07.017)，除了改為R6G能量剝奪細(xì)胞用10 μM C12R1染色之外。對(duì)照實(shí)驗(yàn)室菌株W303-1A (WT)和菌株P(guān)GAL-PDR5在含半乳糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(PGAL過(guò)表達(dá)的條件)。為了抑制PDR5基因，細(xì)胞在富含葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(PGAL阻抑的條件)。

圖6顯示C12TPP阻止C12R1從酵母細(xì)胞流出。C12R1流出速率(圖1上熒光增加的斜率)在YPD (酵母蛋白胨葡萄糖；PGAL阻抑的條件)或YPGAL (酵母蛋白胨半乳糖；PGAL過(guò)表達(dá)的條件)上生長(zhǎng)的細(xì)胞中定量。在指出時(shí)，在補(bǔ)充10 μM C12TPP的情況下進(jìn)行測(cè)量。

圖7顯示C₁₂R1促進(jìn)克霉唑(Cltr)和苯扎氯銨(BnzCl)的抗真菌作用。酵母細(xì)胞在含指定的化學(xué)品的液體YPD培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2小時(shí)，然后將細(xì)胞接種在固體YPD上，在2天后計(jì)算出現(xiàn)的菌落形成單位(CFU)的數(shù)量。100%對(duì)應(yīng)于添加化學(xué)品之前酵母懸浮液的CFU，對(duì)照柱對(duì)應(yīng)于在沒(méi)有化學(xué)品進(jìn)行孵育2小時(shí)后CFU的數(shù)量。

圖8顯示在存在和不存在SkQ1的情況下枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和大腸桿菌(E.coli)的生長(zhǎng)曲線，如通過(guò)600納米處吸光度所測(cè)量的。抑制劑在零時(shí)間點(diǎn)以1-100 μM的濃度范圍加入。

圖9顯示不同的C_nTPP濃度對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌生長(zhǎng)的影響。零點(diǎn)表明C_nTPP的MIC。

圖10顯示在LB培養(yǎng)基中不同的式1化合物對(duì)枯草芽孢桿菌的細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，其通過(guò)600納米處的吸光度測(cè)量。抑制劑在零時(shí)間點(diǎn)以1-100 μM的濃度范圍加入。

圖11顯示SkQ1對(duì)細(xì)菌ΔTolC和ΔAcrA和ΔAcrB生長(zhǎng)的抗細(xì)菌活性。抑制劑在零時(shí)間點(diǎn)加入。

圖12顯示C_nTPP對(duì)細(xì)菌ΔTolC菌株生長(zhǎng)的抗細(xì)菌活性。抑制劑在零時(shí)間點(diǎn)加入。

圖13顯示在存在SkQ1的情況下溴乙錠的蓄積。為模擬細(xì)胞膜滲漏，將細(xì)菌細(xì)胞重懸浮于去離子水中。加入溴乙錠(20 μg/ml)和在Fluorat-02-Panorama上記錄熒光強(qiáng)度變化。為了檢測(cè)溴乙錠的蓄積，將SkQ1加至50 μM的濃度。

優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述

本發(fā)明涉及具有抗微生物性質(zhì)的藥物組合物和它們用于治療微生物感染的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有多重抗藥性-抑制性質(zhì)的這樣的藥物組合物。本發(fā)明提供還具有MDR-抑制性質(zhì)的抗生素的藥物制劑，和它們用作抗細(xì)菌劑和抗真菌劑的方法。本發(fā)明人已出人意料地發(fā)現(xiàn)，之前顯示對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)性質(zhì)的親脂性陽(yáng)離子化合物事實(shí)上具有對(duì)細(xì)菌和真菌的抗生素性質(zhì)，同時(shí)具有MDR-抑制性質(zhì)。

一般而言，這樣的親脂性陽(yáng)離子化合物具有結(jié)構(gòu)式1：

其中A是氫原子(H)或具有以下結(jié)構(gòu)的抗氧化劑部分：

和/或其還原(即，醌醇)形式

其中m是0-3的整數(shù)；各個(gè)Y是甲基；

L是接頭基團(tuán)，其為直鏈或支鏈的烴鏈，所述烴鏈可任選地被一個(gè)或多個(gè)取代基取代和任選地含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵或三鍵；和

B是親脂性陽(yáng)離子。這樣的化合物是帶電荷的(陽(yáng)離子)，因此它們以與任何藥學(xué)上可接受的陰離子(抗衡離子)的鹽的形式存在。

本發(fā)明的方法包括給予具有細(xì)菌或真菌感染的受試者藥學(xué)上有效量的一種或多種本發(fā)明的親脂性陽(yáng)離子化合物，任選地與另外一種或多種抗微生物化合物或一種或多種抗微生物劑。

可用于本發(fā)明的化合物包括但不限于以下示例性的化合物：SkQ1、SkQ3、SkQ4、SkQ5、SkQR1、SkQRB、SkQB1、SkQBP1、SkQT、SkQThy、SkQB、C_nTPP (其中n是5-12)、C_nR1 (其中n是4-12)、C_nBerb (其中n是4-12)和C_nPalm (其中n是4-12)。代表性化合物的結(jié)構(gòu)式如下所示。

SkQ1

SkQ3

SkQ4

SkQ5

SkQR1

SkQRB

SkQB1

SkQBP1

SkQT (不同之處在于癸基接頭的位置的異構(gòu)體的混合物，可能的位置用箭頭指出)

在這些SkQT異構(gòu)體中，存在SkQT-對(duì)位：

SkQThy (不同之處在于癸基接頭的位置的異構(gòu)體的混合物，可能的位置用箭頭指出)

SkQB

可用于本發(fā)明的化合物還包括上述化合物的還原(醌醇)形式。在這些還原化合物中，醌部分：

被還原，即用醌醇部分替換：

例如在SkQ1的情況下，還原形式SkQ1H₂具有以下結(jié)構(gòu)：

SkQ1H₂

同樣作為實(shí)例，在SkQ3的情況下，還原形式SkQ3H₂具有以下結(jié)構(gòu)：

SkQ3H₂

C₁₂TPP (即C_nTPP，其中n=12)

C₁₀R1 (即C_nR1，其中n=10)

C₈Berb (即C_nBerb，其中n=8)

C₈Palm (即C_nPalm，其中n=8)

通式1化合物作為抗微生物劑的重要特征是這些化合物的正電荷。帶正電荷部分的精確結(jié)構(gòu)不特別重要，只要所述部分含有足夠的疏水特征以展開(kāi)正電荷，使得總體化合物是親脂的。一旦通過(guò)MDR或其它保護(hù)系統(tǒng)將這樣的化合物從微生物細(xì)胞中逐出，由于微生物外膜上的電荷(細(xì)胞內(nèi)部帶負(fù)電荷)，所述化合物能夠滲透回到細(xì)胞。這一特征使通式1化合物成為可再循環(huán)的抗微生物劑。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們已出人意料地發(fā)現(xiàn)，不同的通式1化合物提供抗微生物(即抗-細(xì)菌或抗-真菌)作用。部分地，該作用可通過(guò)這些化合物抑制細(xì)菌或真菌的MDR系統(tǒng)的能力進(jìn)行解釋。這些發(fā)現(xiàn)提供了通式1化合物的新的應(yīng)用領(lǐng)域。該應(yīng)用領(lǐng)域是治療由真菌、細(xì)菌或一些病毒引起的不同的傳染性疾病。如我們的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例證實(shí)的，通式1化合物的抗微生物性質(zhì)允許這種治療僅通過(guò)通式1化合物進(jìn)行，即單一療法。我們的另一組實(shí)驗(yàn)實(shí)施例證實(shí)了通式1化合物能夠抑制細(xì)菌或真菌的MDR系統(tǒng)。因此，本發(fā)明的另一方面是通式1化合物與另一種抗微生物劑組合的應(yīng)用。這種劑可以是抗生素(抗細(xì)菌劑)、抗真菌藥(抗真菌劑)或防腐劑。

親脂性陽(yáng)離子的之前研究已經(jīng)證實(shí)，這些化合物具有抗炎性質(zhì)(WO2012167236, WO2014116591, WO2011162633, Zinovkin R.A等, Aging (Albany NY). 2014 ;6(8):661-74)。因此，本發(fā)明的另一方面是利用通式1化合物作為提供抗微生物和抗炎作用兩者的劑的益處。本發(fā)明的又一方面是治療患者的方法，所述患者將獲益于感染和炎癥的同時(shí)抑制。

在本發(fā)明的范圍內(nèi)，感染的治療可以是系統(tǒng)的或局部的。系統(tǒng)治療包括但不限于口服給予、靜脈內(nèi)注射、經(jīng)鼻給予、直腸給予通式1化合物至患者。局部治療包括但不限于以滴眼劑、凝膠劑、軟膏劑、洗劑、噴霧劑、繃帶的形式給予。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例和組合物的實(shí)施例在下文提供僅用以說(shuō)明本發(fā)明的適用性，和不能視為限制本發(fā)明的權(quán)利要求的范圍的實(shí)施例。在實(shí)施例中使用以下縮寫(xiě)：

SkQ1 – 塑體醌癸基三苯基膦

C₁₂TPP – 十二烷基三苯基膦

R6G – 羅丹明6G

MDR – 多重抗藥性

FCCP – 氰化物對(duì)三氟甲氧基苯基腙

ABC – ATP結(jié)合盒

MIC – 最小抑制濃度

組合物的實(shí)施例

一般而言，本發(fā)明提供的組合物包括單獨(dú)和/或與另一種抗-細(xì)菌或抗真菌劑一起的有效量的膜滲透陽(yáng)離子。下文是可能的組合物的幾個(gè)非限制性實(shí)施例：

(1) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種麥角固醇合成抑制劑，包括但不限于酮康唑或伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、Posoconazole、雷夫康唑、聯(lián)苯芐唑、布康唑、氯芐甲咪唑、克霉唑、氯康唑、益康唑、芬替康唑、異康唑、咪康唑、奈康唑、奧莫康唑、奧昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑和Hexaconazole的一種或多種。

(2) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種麥角固醇膜破壞劑，包括但不限于兩性霉素B、哈霉素、那他霉素和制霉菌素的一種或多種。

(3) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種鯊烯環(huán)氧酶抑制劑，包括但不限于嗎啉類、阿莫羅芬、特比萘芬和萘替芬的一種或多種。

(4) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種β-葡聚糖合酶抑制劑，包括但不限于阿尼芬凈、卡泊芬凈和米卡芬凈的一種或多種。

(5) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種殼多糖合成抑制劑，包括但不限于尼柯霉素和多氧霉素類。

(6) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種真菌特異性蛋白合成抑制劑，包括但不限于糞殼菌素。

(7) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種胸苷酸合酶抑制劑，包括但不限于氟胞嘧啶。

(8) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種真菌特異性有絲分裂抑制劑，包括但不限于灰黃霉素。

(9) 組合物，其包含有效量的一種或多種本發(fā)明的膜滲透陽(yáng)離子和有效量的一種或多種抗菌劑，包括但不限于溴氯柳苯胺、甲基玫瑰苯胺、三溴間甲酚、十一烯酸、聚諾昔林、Chlorophetanol、氯苯甘醚、替克拉酮、舒苯汀、羥苯乙酯、鹵普羅近、水楊酸、硫化硒、環(huán)吡酮、阿莫羅芬、地馬唑、托萘酯、托西拉酯和?；橇_定的一種或多種。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1. 通式1化合物的抗真菌作用

在本實(shí)驗(yàn)中，我們使用酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為模型真菌。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，ABC-運(yùn)載體Pdr5p保護(hù)細(xì)胞免于C₁₂TPP (通式1化合物)的抗真菌作用。與此一致，我們顯示C₁₂TPP增強(qiáng)Pdr5p底物環(huán)己酰亞胺D和克霉唑的毒性作用，并且還抑制羅丹明6G流出。這證實(shí)了C₁₂TPP是MDR的有效的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。C₁₂TPP和其它滲透親脂性陽(yáng)離子的重要特征是它們由于細(xì)胞的外膜上的電荷而重新進(jìn)入細(xì)胞的能力。因此，C₁₂TPP和其它滲透親脂性陽(yáng)離子作為可再循環(huán)的MDR抑制劑起作用，證實(shí)了高功效。

菌株和生長(zhǎng)條件

在本實(shí)施例中，我們使用W303-1A釀酒酵母菌株和其衍生株：缺失8個(gè)MDR基因的AD1-8 [W303-1A, yor1::hisG, snq2::hisG, pdr5::hisG, pdr10::hisG, pdr11::hisG, ycf1::hisG, pdr3::hisG, pdr15::hisG] [4]?、P_GAL-PDR5 [W303-1A HIS3::P_GAL-PDR5]、P_GAL-SNQ2 [W303-1A HIS3::P_GAL-SNQ2]和P_GAL-MIH1 [W303-1AHIS3::P_GAL-YOR1](本研究)。細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基(2%葡萄糖、1%細(xì)菌用蛋白胨、1%酵母提取物)或YPGal (2%半乳糖、1%細(xì)菌用蛋白胨、1%酵母提取物)中生長(zhǎng)。對(duì)于具有條件表達(dá)的基因的菌株的遺傳篩選和維持，根據(jù)Sherman 2000 [5]，使用合成的漏失培養(yǎng)基YNB-Leu或YNB-His。通過(guò)在液體酵母培養(yǎng)物中光散射(λ = 550 nm)的增加來(lái)測(cè)量生長(zhǎng)速率。

顯微術(shù)

用立式Olympus BX2顯微鏡和U-MNG2濾波器裝置(激發(fā)530–550 nm, 570 nm分光鏡濾波器，發(fā)射>590 nm)觀察用R6G染色的細(xì)胞。

遺傳篩選

已經(jīng)通過(guò)轉(zhuǎn)化構(gòu)建了帶有在BamHI限制位點(diǎn)處含8-10Kb的插入物的多拷貝質(zhì)粒YEp13的釀酒酵母的W303菌株的酵母突變體。對(duì)于C₁₂TPP抗性株，進(jìn)行了三個(gè)周期的突變體收集的富集。在各周期期間，在YNB-LEU培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期的突變體用18 μM C₁₂TPP處理3小時(shí)，然后洗滌，稀釋和在新鮮的固體YNB-LEU上生長(zhǎng)過(guò)夜。在第三個(gè)周期后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到固體YNB-LEU培養(yǎng)基上。將分離的菌落的C₁₂TPP抗性與野生型比較。為了鑒定多拷貝質(zhì)粒攜帶的基因，將選擇的菌株的基因組DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。通過(guò)用引物YEp13-DIR 5'-cgctatatgcgttgatgc YEp13-REV 5'-cctgccaccatacccacg測(cè)序選擇的YEp13-插入質(zhì)粒確定插入位點(diǎn)。

羅丹明6G流出

為了測(cè)量羅丹明6G流出的相對(duì)速率，我們使用Kolaczkowsky等[6]實(shí)施的熒光測(cè)定法，具有很少改進(jìn)。將細(xì)胞以40 ml在液體YPD中生長(zhǎng)過(guò)夜，至0.5-1*10⁷個(gè)細(xì)胞/ml的密度，用冷的無(wú)菌水洗滌兩次，和重懸浮于10 ml補(bǔ)充有5 mM 2-脫氧葡萄糖和2.5 mM 2,4-二硝基苯酚的磷酸鹽緩沖鹽水。將細(xì)胞懸浮液在旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)器上孵育45分鐘，然后通過(guò)兩個(gè)周期的離心/在冷水中重懸浮除去抑制劑。將能量剝奪細(xì)胞重懸浮于10 ml的PBS中，然后用R6G (10 μM)染色30分鐘。然后將細(xì)胞懸浮液沉淀，重懸浮于等體積的PBS和在冰上保存1-5小時(shí)。用FluoroMax-3熒光計(jì)系統(tǒng)以設(shè)定為480 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和設(shè)定為560 nm的發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行流出測(cè)量。通過(guò)加入0.1%葡萄糖起始R6G流出，熒光測(cè)量杯中的細(xì)胞密度是10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。

存活測(cè)定法

獲得指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞并用指定量的C₁₂TPP或SKQ1處理3小時(shí)。然后將細(xì)胞懸浮液接種到固體YPD培養(yǎng)基上，和孵育48小時(shí)，計(jì)算形成的菌落數(shù)。100%是指在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)在酵母懸浮液中菌落形成單位(CFU)的數(shù)量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)

使用R軟件包計(jì)算Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)(n = 3-11)和熒光測(cè)定曲線的斜率。圖上的誤差棒表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

結(jié)果和討論

為了檢查C₁₂TPP是否可抑制MDR泵活性，我們首先決定找到將其從釀酒酵母細(xì)胞中排出的具體的泵。我們使用帶有在多拷貝質(zhì)粒上酵母基因組文庫(kù)的酵母釀酒酵母進(jìn)行遺傳篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有帶有兩個(gè)基因LDB7和PDR3的染色體II片段(坐標(biāo)從216287至222344)的質(zhì)粒提供了對(duì)20 μM C₁₂TPP抗性的顯著增加。Pdr3p是負(fù)責(zé)包括三個(gè)非特異性MDR泵基因：PDR5, SNQ2和YOR1的一組ABC-運(yùn)載體的增量調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子[7–9]。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明，C₁₂TPP是這些泵之一的底物。為了找出負(fù)責(zé)C₁₂TPP去毒化的特定的泵，我們產(chǎn)生了具有在半乳糖可誘導(dǎo)的、葡萄糖可阻抑的GAL啟動(dòng)子控制下的相應(yīng)基因的一組突變體菌株。

似乎PDR5的表達(dá)對(duì)于細(xì)胞抵抗C₁₂TPP是關(guān)鍵的，而SNQ2或YOR1的阻抑未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的作用(圖1B)。因此，PDR5的過(guò)表達(dá)提供了對(duì)高濃度的C₁₂TPP的適度保護(hù)(圖1C)。在SkQ1的情況下，我們未觀察到MDR過(guò)表達(dá)的任何作用?？赡艿氖?，排出SkQ1的泵的表達(dá)的基礎(chǔ)水平足以阻止其毒性。

對(duì)這些結(jié)果，一種可能的解釋是C₁₂TPP通過(guò)Pdr5從酵母細(xì)胞中排出，和C₁₂TPP與其它PDR5底物競(jìng)爭(zhēng)。事實(shí)上，低濃度的C₁₂TPP增強(qiáng)用可能是Pdr5p底物的帶正電荷的熒光染料羅丹明6G的酵母細(xì)胞的染色(圖2A)[6]。因此，在能量剝奪的細(xì)胞中，R6G以高濃度蓄積，和在加入葡萄糖后，細(xì)胞內(nèi)部的熒光降低和大部分保留在極化的線粒體中(圖2B)。我們使用熒光測(cè)定方法測(cè)量了R6G從完整酵母細(xì)胞的流出。通過(guò)熒光光譜觀察流出：羅丹明6G是在細(xì)胞中自淬滅的，因此R6G釋放導(dǎo)致染料的總熒光的可檢測(cè)增加(圖3A)。重要的是，R6G釋放在缺少所有主要PDR基因的MDR-陰性細(xì)胞中被完全廢除(圖3B)。

加入解偶聯(lián)劑FCCP能夠部分地阻止R6G流出(圖3C)，而C₁₂TPP和SkQ1顯得在該方面更加有效(圖3D, E)。顯然的是，親脂性陽(yáng)離子的這種作用可能歸因于直接抑制MDR泵，或者是線粒體解偶聯(lián)的結(jié)果，導(dǎo)致ATP濃度降低。然而，認(rèn)為后者是不可能的，因?yàn)镕CCP是比C₁₂TPP有效得多的解偶聯(lián)劑[10]。此外，C₁₂TPP的這種可能的作用可被排除，因?yàn)槠溥€能抑制在用過(guò)量NaN₃預(yù)處理的細(xì)胞中的R6G流出(圖3F)。NaN₃抑制呼吸鏈[11]和線粒體ATP合酶[12]兩者。同時(shí)，與另一種ATP合酶抑制劑寡霉素對(duì)比，其并非在抑制酵母的MDR活性中同樣有效[6]。因此，在存在10 mM NaN₃的情況下，線粒體在ATP供應(yīng)中的貢獻(xiàn)顯得最小，和C₁₂TPP和SkQ1的作用主要?dú)w因于MDR的抑制。

通過(guò)加入C₁₂TPP誘導(dǎo)其它PDR5底物的攝取是可能的嗎為了測(cè)試此問(wèn)題，在存在蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺D (ChD)的情況下我們測(cè)量了酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，環(huán)己酰亞胺D是眾所周知的Pdr5底物[13]。發(fā)現(xiàn)1 μM的C₁₂TPP顯著提高ChD的抑制作用(圖4A)。此外，C₁₂TPP增強(qiáng)抗真菌劑克霉唑的作用(圖4B)，克霉唑之前也報(bào)道為酵母MDR-泵的底物[14]。重要的是，對(duì)于另一種抗真菌劑 – 兩性霉素B，我們未檢出任何顯著的毒性刺激，所述兩性霉素B作用于質(zhì)膜并且不歸屬于ABC泵底物。

得出結(jié)論，結(jié)合之前的觀察結(jié)果，我們的數(shù)據(jù)顯示C₁₂TPP抑制多重耐藥性和表明這種抑制歸因于其排出接著回到細(xì)胞中的無(wú)用循環(huán)。因此，其可用于增加其它ABC-運(yùn)載體底物(包括其它兩親性化合物)的細(xì)胞攝取。重要的是，早期表明C₁₂TPP促進(jìn)陰離子分子跨膜運(yùn)輸：熒光染料熒光素[15]、脂肪酸[16]和陰離子解偶聯(lián)劑[10]。因此，C₁₂TPP似乎是一種通用的質(zhì)膜滲透劑。因此，我們的發(fā)現(xiàn)使得其成為對(duì)于抗真菌藥的有前景的補(bǔ)充物以阻止它們從細(xì)胞中流出。

在下一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了十二烷基化的羅丹明C₁₂R1 (參見(jiàn)Antonenko等2012; doi: 10.1074/jbc.M110.212837)。我們發(fā)現(xiàn)，該化合物在能量剝奪的酵母細(xì)胞中以類似于羅丹明6G的方式蓄積。加入葡萄糖至所述細(xì)胞中促進(jìn)C₁₂R1流出。通過(guò)熒光信號(hào)的增加，通過(guò)在熒光測(cè)定杯中自淬滅的降低檢測(cè)流出(激發(fā)波長(zhǎng)是480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)是560 nm)。我們發(fā)現(xiàn)，僅在過(guò)表達(dá)PDR5基因的細(xì)胞中可觀察到有效流出(圖5, 6)。該結(jié)果表明，盡管被Pdr5p多藥流出泵輸出，但僅在PDR5過(guò)表達(dá)的條件下C₁₂R1可從細(xì)胞收回。接著，我們表明了C₁₂TPP阻止C₁₂R1流出。這證實(shí)了C₁₂TPP和C₁₂R1是MDR泵Pdr5p的底物。

接著我們測(cè)試了C₁₂R1增加真菌細(xì)胞對(duì)常見(jiàn)抗真菌劑的靈敏性的能力。發(fā)現(xiàn)以無(wú)毒濃度，C₁₂R1增加抗真菌劑克霉唑和苯扎氯銨的毒性(圖7)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2. 通式1化合物的抗-細(xì)菌作用

多藥流出運(yùn)載體在治療細(xì)菌感染和癌癥化療中導(dǎo)致嚴(yán)重問(wèn)題。在革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌中，屬于抗性-小結(jié)化-細(xì)胞分裂(RND)家族的運(yùn)載體在產(chǎn)生抗性中特別有效，因?yàn)樗鼈兣c周質(zhì)蛋白和外膜蛋白通道形成三元復(fù)合物[Du D.等, (2014) Structure of the AcrAB–TolC multidrug efflux pump. Nature, 509, 512–515]。AcrAB–TolC流出泵能夠運(yùn)輸具有很少化學(xué)相似性的大量的化合物，因此賦予對(duì)廣譜抗生素的抗性[Pos K.M. (2009) Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.Biochem. Biophys. Acta, 1794, 782–793; Seeger M.A.等, (2008) The AcrB Efflux Pump: Conformational Cycling and Peristalsis Lead to Multidrug Resistance. Current Drug Targets, 2008, 9, 729-749; Sulavik M.C.等, (2001) Antibiotic Susceptibility Profiles of Escherichia coli StrainsLacking Multidrug Efflux Pump Genes. Antimicrob. Agents Chemother., 45, 4, 1126-1136]。AcrAB–TolC系統(tǒng)由RND運(yùn)載體AcrB、膜融合蛋白AcrA和多功能外膜通道TolC構(gòu)成。TolC是用于運(yùn)輸毒素和藥物流出的通用的外膜通道[Andersen C., Hughes C., Koronakis V. (2001) Protein export and drug efflux through bacterial channel-tunnels. Curr Opin Cell Biol., 13, 412–416]。

TolC與各種內(nèi)膜運(yùn)載體相互作用，和使大腸桿菌能夠?qū)⒔Y(jié)構(gòu)上多樣的分子排出細(xì)胞。在大腸桿菌中，AcrB、AcrD、AcrEF、MdtABC和MdtEF屬于RND運(yùn)載體和需要TolC發(fā)揮作用[Horiyama T.和Nishino K. (2014) AcrB, AcrD, and MdtABC Multidrug Efflux Systems Are Involved in Enterobactin Export in Escherichia coli. PLoS ONE 9, 9, e10864]。

1μM SkQ1的抗細(xì)菌活性

選擇在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的方法作為測(cè)試SkQ1的抗細(xì)菌活性的方法。過(guò)夜的細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋在新鮮的LB培養(yǎng)基中。將細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物(5x10⁶個(gè)細(xì)胞/ml)以200 μl接種至96孔板(Eppendorf, Eppendorf AG, Hamburg, Germany)中，和加入SkQ1或CnTPP以達(dá)到0.5-200 μM范圍內(nèi)的各種終濃度。使細(xì)胞在37°C生長(zhǎng)21小時(shí)。在孵育期間使用AnthosZenyth 3100多模式閱讀器(Anthos Labtec, Austria)測(cè)量600 nm的光密度。

我們選擇大腸桿菌細(xì)胞作為革蘭氏陰性模型生物和枯草芽孢桿菌細(xì)胞作為革蘭氏陽(yáng)性模式生物。選擇SkQ1作為具有抗氧化劑部分的式1的模型化合物。為了選擇式1化合物的合適濃度，我們進(jìn)行對(duì)數(shù)個(gè)SkQ1濃度的生長(zhǎng)抑制測(cè)定法(見(jiàn)圖8A和B)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論，1μM SkQ1是枯草芽孢桿菌細(xì)胞的最小抑制濃度(MIC)。但該濃度不顯著抑制大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)50μM SkQ1是大腸桿菌細(xì)胞的MIC。這些結(jié)果表明，SkQ1具有針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的強(qiáng)抗微生物活性和針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的輕微抗微生物活性。

C_nTPP的抗細(xì)菌活性

我們測(cè)試了枯草芽孢桿菌對(duì)選擇的濃度范圍的三苯基膦衍生物的抗性，例如十二烷基三苯基膦(C₁₂TPP)、癸基三苯基膦(C₁₀TPP)、辛基三苯基膦(C₈TPP)和丁基三苯基膦(C₄TPP)。我們進(jìn)行對(duì)數(shù)個(gè)三苯基膦衍生物濃度的生長(zhǎng)抑制測(cè)定法(見(jiàn)圖9)和對(duì)于所有使用的三苯基膦衍生物找出對(duì)枯草芽孢桿菌的MIC，除了C₄TPP之外。觀察到對(duì)C_n-TPP的抑制濃度逐漸增加，碳?xì)浠衔镂驳拈L(zhǎng)度逐漸變長(zhǎng)。出人意料地，在本實(shí)驗(yàn)中C₄TPP的MIC不能達(dá)到。這些結(jié)果表明，除了C₄TPP之外，C_nTPP具有針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的抗微生物活性。

其它通式1化合物的抗細(xì)菌活性

在以下實(shí)驗(yàn)中，我們使用不同的通式1化合物例如SkQ5、SkQT、SkQThy、SkQT-對(duì)位和SkQ3。我們對(duì)數(shù)個(gè)濃度的選擇化合物進(jìn)行生長(zhǎng)抑制測(cè)定法(見(jiàn)圖10 A和B)和發(fā)現(xiàn)所有選擇的三苯基膦衍生物具有抗微生物活性。這些結(jié)果表明，基于碳?xì)浠衔锝宇^的長(zhǎng)度和抗氧化劑結(jié)構(gòu)(即通式1的變量A、m和n)，所有選擇的通式1化合物具有抗微生物活性。

SkQ1針對(duì)需要TolC的RND流出泵(MDR)的抗細(xì)菌活性

在本實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了TolC-依賴性運(yùn)載體是否負(fù)責(zé)大腸桿菌細(xì)胞對(duì)SkQ1的抗性。在實(shí)驗(yàn)中，我們使用從Keio收集的單基因敲除突變體[Baba T.等, (2006)]. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006.0008.]。我們發(fā)現(xiàn)，TolC-缺失的突變體丟失了對(duì)SkQ1的抗性，證實(shí)了與枯草芽孢桿菌相同的靈敏性，具有約2 μM的最小殺菌濃度。對(duì)AcrA和AcrB缺失突變體觀察到類似的結(jié)果(見(jiàn)圖11)。我們使用編碼需要TolC來(lái)發(fā)揮其功能的運(yùn)載體的蛋白質(zhì)的基因的其它敲除突變體。除了AcrA和AcrB之外，所有運(yùn)載體基因的缺失不影響大腸桿菌細(xì)胞的抗性(數(shù)據(jù)未顯示)。相比之下，基因acrA或acrB的缺失顯著改變大腸桿菌細(xì)胞對(duì)SkQ1的靈敏性。AcrA-或AcrB-缺失的突變體顯示與TolC-缺失的突變體類似的靈敏性(表1)。這些結(jié)果表明，大腸桿菌對(duì)SkQ1的抗性可能是AcrAB-TolC運(yùn)載體活性的結(jié)果。

C_nTPP針對(duì)需要TolC的RND流出泵的抗細(xì)菌活性

我們測(cè)試了TolC-缺失的突變體對(duì)其它通式1化合物，例如十二烷基三苯基膦(C₁₂TPP)、癸基三苯基膦(C₁₀TPP)、辛基三苯基膦(C₈TPP)、丁基三苯基膦(C₄TPP)的抗性。根據(jù)最小濃度會(huì)為大約化合物對(duì)于枯草芽孢桿菌的最小殺菌濃度(圖12)和最大濃度不超過(guò)化合物對(duì)于大腸桿菌細(xì)胞的最小殺菌濃度的一半(數(shù)據(jù)未顯示)的假設(shè)，選擇化合物的濃度。我們觀察到TolC-缺失的突變體也丟失了對(duì)通式1化合物的抗性(圖12)。TolC-缺失的突變體具有與枯草芽孢桿菌類似的對(duì)C_nTPP的靈敏性。這些結(jié)果表明，所有選擇的C_nTPP針對(duì)TolC-缺失的突變體具有抗微生物活性，顯示了AcrAB-TolC運(yùn)載體負(fù)責(zé)C_nTPP從細(xì)胞中流出。

。

表1. 對(duì)編碼需要TolC的流出泵蛋白的基因的缺失突變體的生長(zhǎng)抑制測(cè)定法的結(jié)果。缺失菌株JW5503 (缺少tolC基因)、JW0452 (缺少acrA基因)、JW0451 (缺少acrB基因)、JW2454 (缺少acrD基因)、JW3233 (缺少acrE基因)、JW3234 (缺少acrF基因)、JW5338 (缺少mdtA基因)、JW2060 (缺少mdtB基因)、JW2061 (缺少mdtC基因)、JW3481 (缺少mdtE基因)和JW3482 (缺少mdtF基因)已描述于Baba T.等(2006)。Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006.0008。

溴乙錠蓄積實(shí)驗(yàn)

為了證實(shí)AcrAB-TolC是否是合適的運(yùn)載體，我們使用基于溴乙錠通過(guò)完整細(xì)菌膜滲漏的測(cè)量的測(cè)試。如果SkQ1是AcrAB-TolC運(yùn)載體的底物，則預(yù)期在SkQ1濃度為大約大腸桿菌的最小殺菌濃度時(shí)，溴乙錠通過(guò)細(xì)菌膜滲漏將與在滲透壓休克期間的溴乙錠滲漏是相當(dāng)?shù)摹Ｖ苽浼?xì)菌細(xì)胞和重懸浮于PBS中。為模擬細(xì)胞膜滲漏，將細(xì)菌細(xì)胞重懸浮于去離子水中(Milli-Q水純化系統(tǒng), EMD Millipore, Billerica, MA)。加入溴乙錠(20 μg/ml)和在Fluorat-02-Panorama (Lumex Instruments, Russia)熒光分光計(jì)上記錄熒光強(qiáng)度變化。為增加溴乙錠的蓄積，加入SkQ1達(dá)到50 μM的濃度。通常，野生型大腸桿菌細(xì)胞具有對(duì)至多800 μg/ml溴乙錠的抗性，因此，使用濃度20 μg/ml的溴乙錠，我們未預(yù)期見(jiàn)到溴乙錠通過(guò)細(xì)菌膜滲漏，除了加入耗盡濃度的底物的情況之外。當(dāng)溴乙錠濃度為大腸桿菌細(xì)胞的MIC的1/40時(shí)我們觀察到溴乙錠蓄積，這僅可能是作為AcrAB-TolC運(yùn)載體的底物的溴乙錠和SkQ1同時(shí)作用的結(jié)果。結(jié)果證實(shí)，SkQ1是AcrAB-TolC運(yùn)載體的底物，因?yàn)槲覀冇^察到當(dāng)我們加入SkQ1達(dá)到大腸桿菌的最小殺菌濃度時(shí)，與滲透壓休克期間的溴乙錠滲漏可比較的溴乙錠通過(guò)細(xì)菌膜滲漏(圖13A和B)。

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